CN102586178A - 山羊颗粒冻精稀释液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液，所述的稀释液由葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.6g，甘油5ml，卵黄20ml，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0.1g，青霉素10IU，链霉素10IU，并用蒸馏水将上述物质定溶至100ml组成。本发明在常规的冷冻精液稀释液中加入羟乙基哌嗪乙磺酸、二甲基甲酰胺和十二烷基硫酸钠，组成优化配方；经检测，采用优化的稀释液配方制作的安徽白山羊颗粒冻精复苏活力达到0.65，通过用该配方制作的颗粒冻精对55只发情正常的安徽白山羊进行人工授精实验，经统计人工授精受胎率为76.4％。由此可见，该配方制作的冷冻精液具有较好的实际应用效果。

Description

山羊颗粒冻精稀释液

[技术领域]

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液。

[背景技术]

精液冷冻保存技术，就是将精子置于超低温环境中，使其新陈代谢几乎停止，升温后又恢复受精能力。该技术是人工授精技术的一大革新，具有很明显的优势：可以不受时间、地域和种公畜年限的限制，发挥和提高优良种公畜的利用率，加速品种的改良步伐。山羊精液冷冻保存技术的研究始于50年代。直到20世纪60年代，一些国家才开始应用羊冻精进行人工授精试验。J.M.Corteel报道，在非繁殖季节，利用同期发情技术，对同期发情效果较好的一千多只母羊进行冷冻精液的人工授精，获得了38.7％的分娩率。这是关于羊的冷冻精液技术人工授精结果较早的报道。90年代以来，山羊冻精制作和应用的研究，虽然取得了一定成绩，但存在的问题也很多，特别是没有有效地把受胎率稳定在50％以上，说明这一方面的研究还有待取得更大的突破。

山羊的精液保存是一个复杂的物理化学过程，稀释液的组成成分、渗透压、PH值及精液的稀释倍数、保存温度对精液的保存效果都有重要的影响。目前，在精液冷冻稀释液中，其主要成分可以划分为缓冲剂、营养剂、抗冷冻剂以及添加剂四个组成部分。

目前报道的精液稀释液配方，按缓冲剂、营养剂、抗冷冻剂以及添加剂四个组成部分主要有以下几种：柠檬酸钠-糖类-甘油-卵黄、Tris-柠檬酸-糖类-甘油-卵黄、EDTA-柠檬酸钠-糖类-甘油-卵黄和Tris-柠檬酸-糖类-甘油-卵黄，但各自对精子的冷冻保护效果，不同的研究者结论不同，差异较大，未形成定论。到目前为止，尚未形成公认的最适技术参数，因此，人们对其仍在不断的优化和提高。

山羊精液在冻前的平均损伤率为19.4％，冻后平均损伤率为17.1％。由此可见山羊精液在冻前和冻后损伤较大。因此，就降低精子损伤率而言，我们有必要对冷冻精液的稀释液配方进行研究和改进。在受胎率方面，目前，我国山羊冻精的受胎率为45.5～60％。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种用于保存安徽白山羊颗粒冻精的稀释液，其可提高山羊颗粒冻精的品质，相应提高山羊冻精的受胎率。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液，所述的稀释液由葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.6g，甘油5ml，卵黄20ml，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0.1g，青霉素10IU，链霉素10IU，并用蒸馏水将上述物质定溶至100ml组成。

山羊的精液保存是一个复杂的物理化学过程，稀释液的组成成分、渗透压、PH值及精液的稀释倍数、保存温度对精液的保存效果都有重要的影响。目前，在精液冷冻稀释液中，其主要成分可以划分为营养剂、缓冲剂、抗冷冻剂以及其他添加剂四个组成部分。

缓冲剂作为冷冻稀释液的重要组成部分，对于精液冷冻的效果发挥着重要作用。柠檬酸钠无毒性、具有pH调节性能及良好的稳定性。柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以在钙离子的情况下不能使用。羟乙基哌嗪乙磺酸作为一种缓冲剂，受外界因素影响小，缓冲功能强大，并且不易形成缓冲剂-金属离子复合物。本发明将柠檬酸钠和两性离子羟乙基哌嗪乙磺酸的组合添加于稀释液中达到了很好的效果。

抗冻剂是精液冷冻稀释液中不可缺少的部分，发挥着至关重要的作用。相对于非渗透性抗冻剂而言，渗透性抗冻剂的作用又更加重要。目前，最常用的渗透性抗冻剂是甘油。甘油对于精液冷冻过程中的精子具有很好的保护作用，但也存在缺点，一是甘油对精子有毒性作用，会影响冻后精液的存活时间；二是可能具有抑制受孕的负作用。二甲基甲酰胺(DMF)属于一种低分子量酰胺类化合物，分子量为73.1，能够通过渗入精细胞内，平衡精细胞内外渗透压，降低其冰点而起保护作用。与甘油相比，二甲基甲酰胺的分子量小，更容易穿过细胞膜进入到精子内部，但其缺点是粘性小，抑制水结晶能力较弱，并且也具有一定毒性。因此，本发明以二甲基甲酰胺和甘油组成一种混合冷冻保护剂，得到更加有效的山羊精液冷冻稀释液配方。

十二烷基硫酸钠(SDS)是一类表面活性剂，对精子膜结构有保护、修补作用，提高解冻后精液的活力、质膜完整率及存活率。在本发明中，添加适当的十二烷基硫酸钠对于冷冻精液品质有显著的改善(P＜0.05)。因此，不管十二烷基硫酸钠是自身作用于精膜起到抗冷冻效果还是通过作用于卵黄间接作用于精膜，十二烷基硫酸钠对于冷冻精液的确实起到了保护作用。

本发明的有益效果是，在常规的冷冻精液稀释液中加入羟乙基哌嗪乙磺酸、二甲基甲酰胺和十二烷基硫酸钠，组成如下配方：100ml稀释液中含葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.6g，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，甘油5ml，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0.1g，卵黄20ml。经检测，采用上述稀释液配方制作的安徽白山羊颗粒冻精复苏活力达到0.65，用该配方制作的颗粒冻精对55只发情正常的安徽白山羊进行人工授精实验，经统计人工授精受胎率为76.4％。由此可见，该配方制作的冷冻精液具有较好的实际应用效果。

[具体实施方式]

本实施例所使用的材料、试剂及其来源：

1)材料

采精公羊：安徽白山羊，6只，2～3岁，体质健壮，繁殖性能良好；合肥博大牧业科技公司种羊场提供；采精公羊饲养管理：舍饲，每天户外运动4h～6h；日粮：精料0.75kg/d·只，干花生秧、青绿饲料自由采食，采精期补喂鸡蛋4枚/d·只。

2)主要器材

精子品质自动分析仪(南宁松景天伦生物科技有限公司，CASA，Windows XP)；生物光学显微镜(XSJ-2型，重庆光学仪器厂)；相差显微镜(Olympus，日本)；渗透压计(ADVANCED，美国)；精密PH计(上海双赢科学仪器有限公司)；液氮灌(北京信康亿达科技发展有限公司)。

3)主要试剂

葡萄糖(Sigma公司)、柠檬酸纳(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O，上海试剂公司)、羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(hepes，Sigma公司)、甘油(天津市化学试剂三厂)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，沈阳市试剂三厂)、十二烷基磺酸钠(SDS，上海双龙化学品厂)、卵黄(鸡蛋黄，本地)、青霉素、链霉素(上海新亚药业有限公司)。

本实施例具体做法如下：

1稀释液配制

将表1所列各组分物质用蒸馏水定溶至100ml配制成稀释液。

表1

2颗粒冻精制作

用假阴道法采精实验羊精液。按原精液∶稀释液为1∶4比例一步法稀释鲜精，4℃冰箱平衡3h后，铜纱网上滴冻、熏蒸5min后浸入液氮，制作0.1ml/粒的颗粒冻精。

3冻精颗粒解冻

从液氮中取出冻精颗粒后放入经维生素B₁₂液润湿过的试管，在40℃水浴中解冻。

4解冻精液的品质检测

4.1精子活率测定：用精子品质分析仪测定。精子运动参数主要包括：精子活率、直线运动精子活率、精子直线运动速度和曲线速率。

4.2精子生存指数的检测：在37℃水浴中保存解冻的精液，每隔1h进行1次活力检测，直至4h。精子生存指数为2次检查精子活力的平均数与间隔时间(h)的乘积和。

4.3精子质膜完整性检测：采用低渗肿胀试验(HOST)法检测。解冻冻精颗粒，用精子低渗液调整精子密度至2×10⁶个精子/ml，37℃孵育30min～60min，取其中一滴精液制作抹片，经福尔马林磷酸盐液固定、苏木素染液染色后，在400倍相差显微镜下观察精子肿胀情况，统计弯尾精子百分率。

4.4精子顶体完整率的检测：解冻冻精颗粒，制作抹片，经福尔马林磷酸盐液固定、姬姆萨染液染色后，在1000倍油镜下观察精子顶体的完整和受损情况，统计顶体完整型精子数(率)。

4.5用本实施例的稀释液配方制作的山羊颗粒冻精的品质检测结果见表2。

表2

5冷冻精液人工授精试验

用表1的稀释液配方(100ml稀释液中含葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.6g，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，甘油5ml，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0.1g，卵黄20ml)制作的颗粒冻精对55只发情正常的安徽白山羊进行人工授精实验，经统计人工授精受胎率为76.4％。由此可见，本实施例制作的冷冻精液具有较好的实际应用效果。

Claims (1)

1.一种用于保存山羊颗粒冻精的稀释液，其特征在于，所述的稀释液由葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.6g，甘油5ml，卵黄20ml，羟乙基哌嗪乙磺酸1.6g，二甲基甲酰胺1ml，十二烷基硫酸钠0.1g，青霉素10IU，链霉素10IU，并用蒸馏水将上述物质定溶至100ml组成。