CN115119833B - 一种精液冷冻保存稀释液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种精液冷冻保存稀释液及其应用，包括野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物。与现有技术相比，本发明在精液冷冻保存稀释液中添加野菊花和贯叶金丝桃提取物，有效降低了精子质膜不饱和脂肪酸冷冻损伤，显著提高冻融精子活力、运动、顶体完整性和受精能力，明显改善精子冷冻保存效果，适用于绵羊精液超低温长期保存和人工授精，效果可靠、易于推广、操作简单，对精子无副作用。

Description

一种精液冷冻保存稀释液及其应用

技术领域

本发明属于人工授精技术领域，尤其涉及一种精液冷冻保存稀释液及其应用。

背景技术

冷冻技术在精液上的应用是人工授精技术体系的重大革新，该技术使精液的利用不再受时间、地域和种畜寿命的限制。一直以来，绵羊精液冷冻保存以牛精液冷冻保存技术为参照，没有开发出专门适合绵羊精子的冷冻稀释液，导致冻精品质低和受胎率低，导致至今无法产业化应用。因此，在绵羊精子本身的结构和生理特性无法改变的事实下，有必要筛选外源保护剂，通过降低精子结构和功能冷冻损伤提高保存效果。该技术对实现绵羊种质资源高效保存，以及推动良种繁育进程至关重要。

绵羊精子冷冻耐受性差，主要原因是质膜不饱和脂肪酸含量高，质膜胆固醇在冷冻过程中流失导致胆固醇/磷脂比降低。胆固醇是哺乳动物精子质膜上的主要成分，对质膜的功能特性起关键性调节作用，同时它是精子保持活性状态所必需的物质。精子质膜是精子内外环境的屏障，膜脂代谢和膜特性的变化是精子对冷冻应激产生效应的典型变化，亦是精子不良反应的启动信号，它们与精子的信号接收、跨信号传递以及后续的精子代谢和功能的变化密切相关。因此，通过抑制冷冻导致的质膜中胆固醇流失，稳定质膜稳定性和流动性是提高冻融精子质量的有效途径。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种适用于绵羊精液超低温长期保存和人工授精的精液冷冻保存稀释液及其应用。

本发明提供了一种精液冷冻保存稀释液，包括野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物。

优选的，所述野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物的质量比为（3~7）：（2~6）。

优选的，还包括基础冷冻稀释液；

所述野菊花提取物与基础冷冻稀释液的比例为（15~35）mg：100 mL。

优选的，所述基础冷冻稀释液包括营养物质、抗菌物质与精子质膜保护剂；所述基础冷冻稀释液中营养物质的含量为1.4~3.7 g/100 mL；所述基础冷冻稀释液中抗菌物质的含量为8.6~23.2万IU/100 mL；所述基础冷冻稀释液中精子质膜保护剂的含量为9~29.1mL/100 mL。

优选的，所述营养物质选自葡萄糖、蔗糖与海藻糖中的一种或多种；

所述抗菌物质选自青霉素和/或链霉素;

所述精子质膜保护剂选自卵黄和/或卵磷脂。

优选的，所述基础冷冻稀释液还包括缓冲物质与冷冻保护剂；所述基础冷冻稀释液中缓冲物质的含量为1.5~4 g/100 mL；所述基础冷冻稀释液中冷冻保护剂的含量为3~9mL/100 mL。

优选的，所述缓冲物质选自柠檬酸钠、柠檬酸与碳酸氢钠中的一种或多种；

所述冷冻保护剂选自甘油、二甲基亚砜与乙二醇中的一种或多种。

优选的，所述精液冷冻保存稀释液的pH值为7.1；所述精液冷冻保存稀释液的渗透压为300 mosm/L。

本发明还提供了一种精液冷冻保存稀释液的制备方法，包括：

将基础冷冻稀释液、野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物混合，得到精液冷冻保存稀释液。

优选的，所述基础冷冻稀释液按照以下方法制备：

将营养物质、缓冲物质、抗菌物质与水混合，搅拌，得到A液；将所述A液与精子质膜保护剂混合，得到B液；将所述B液与冷冻保护剂混合，得到基础冷冻稀释液。

本发明还提供了一种上述精液冷冻保存稀释液作为绵羊精子冷冻保存稀释液的应用。

本发明提供了一种精液冷冻保存稀释液，包括野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物。与现有技术相比，本发明在精液冷冻保存稀释液中添加野菊花和贯叶金丝桃提取物，有效降低了精子质膜不饱和脂肪酸冷冻损伤，显著提高冻融精子活力、运动、顶体完整性和受精能力，明显改善精子冷冻保存效果，适用于绵羊精液超低温长期保存和人工授精，效果可靠、易于推广、操作简单，对精子无副作用。

实验结果表明，通过在冷冻稀释液中添加野菊花和贯叶金丝桃提取物，与传统冷冻方法比较，冻融精子活力提高约13-15%，达到45%左右，人工授精受胎率提高约28-30%，达到72%左右。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种精液冷冻保存稀释液，包括野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物。

其中，野菊花提取物以菊科植物野菊花的干燥头状花序为原料提取，主要活性成分为黄酮类和酚类化合物，不仅具有消炎抗菌功效，同时也有很好的生殖保护作用。野菊花提取物中的黄酮类化合物可以显著的促进动物生长、提高动物繁殖能力、改善生殖细胞质量。野菊花提取物能抑制大鼠肝微粒体中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的活力，激活胆固醇7-2-羟化酶，起到稳定细胞膜胆固醇含量和分布的作用。贯叶金丝桃提取物是从中药材贯叶金丝桃中提取的小分子化合物，通过作用于靶蛋白-二氢脂酰胺S-乙酰基转移酶对脂肪异常代谢的具有积极调节作用，具有增加脂肪细胞线粒体数量，减小脂肪细胞体积，通过调节细胞膜胆固醇/磷脂比例维持细胞膜稳定性和流动性的作用，其显著特点是无细胞毒副作用。本发明首次将野菊花和贯叶金丝桃提取物配伍作为精子质膜稳定剂用于精子冷冻保存，适用于绵羊精液超低温长期保存和人工授精，效果可靠、易于推广、操作简单，对精子无副作用。

在本发明提供的精液冷冻保存稀释液中所述野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物的质量比优选为（3~7）：（2~6），更优选为（4~6）：（3~5），再优选为（4.5~5.5）：（3.5~4.5），最优选为5：4。

除上述野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物外，所述精液冷冻保存稀释剂还包括基础冷冻稀释液；所述野菊花提取物与基础冷冻稀释液的比例优选为（15~35）mg：100 mL，更优选为（20~30）mg：100 mL，再优选为25 mg：100 mL。

所述基础冷冻稀释液优选包括营养物质、抗菌物质与精子质膜保护剂。

在本发明中，所述基础冷冻稀释液中营养物质的含量优选为1.4~3.7 g/100 mL，更优选为2.0~3.5 g/100 mL，再优选为2.0~3.0 g/100 mL，最优选为2.4~3.0 g/100 mL；所述营养物质为本领域技术人员熟知的营养物质即可，并无特殊的限制，本发明中优选为葡萄糖、蔗糖与海藻糖中的一种或多种，更优选为葡萄糖。

在本发明中，所述基础冷冻稀释液中抗菌物质的含量优选为8.6~23.2万IU/100mL，更优选为10.0~20.0万IU/100 mL，再优选为13.0~16.0万IU/100 mL，最优选为15.0万IU/100 mL；所述抗菌物质的种类为本领域技术人员熟知的抗菌物质即可，并无特殊的限制，本发明中优选为青霉素和/或链霉素，更优选为青霉素与链霉素；所述青霉素与链霉素的效价比优选为1：（0.5~1.5），更优选为1：（0.8~1.2），最优选为1：1。

在本发明中，所述基础冷冻稀释液中精子质膜保护剂的含量优选为9~29.1 mL/100 mL，更优选为12~25 mL/100 mL，再优选为15~20 mL/100 mL，再优选为16~19 mL/100mL，最优选为18.8 mL/100 mL；所述精子质膜保护剂优选为卵黄和/或卵磷脂。

按照本发明，所述基础冷冻稀释液优选还包括缓冲物质与冷冻保护剂。

其中，所述基础冷冻稀释液中缓冲物质的含量优选为1.5~4 g/100 mL，更优选为2.0~3.5 g/100 mL，再优选为2.0~3.0 g/100 mL，最优选为2.4~3.0 g/100 mL；所述缓冲物质的种类为本领域技术人员熟知的缓冲物质即可，并无特殊的限制，本发明中优选为柠檬酸钠、柠檬酸与碳酸氢钠中的一种或多种，更优选为柠檬酸钠；在本发明中，所述缓冲物质同时作为渗透压调节剂，调节冷冻稀释液的渗透压。

所述基础冷冻稀释液中冷冻保护剂的含量为3~9 mL/100 mL，更优选为4~8 mL/100 mL，再优选为5~7 mL/100 mL，最优选为6 mL/100 mL；所述冷冻保护剂优选为甘油、二甲基亚砜与乙二醇中的一种或多种，更优选为甘油。

按照本发明，所述精液冷冻保存稀释液的pH值最优选为7.1；所述精液冷冻保存稀释液的渗透压最优选为300 mosm/L。

本发明在精液冷冻保存稀释液中添加野菊花和贯叶金丝桃提取物，有效降低了精子质膜不饱和脂肪酸冷冻损伤，显著提高冻融精子活力、运动、顶体完整性和受精能力，明显改善精子冷冻保存效果，适用于绵羊精液超低温长期保存和人工授精，效果可靠、易于推广、操作简单，对精子无副作用。

本发明还提供了一种上述精液冷冻保存稀释液的制备方法，包括：将基础冷冻稀释液、野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物混合，得到精液冷冻保存稀释液。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可；所述基础冷冻稀释液、野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物均同上所述，在此不再赘述。

按照本发明，所述基础冷冻稀释液优选按照以下方法制备：将营养物质、缓冲物质、抗菌物质与水混合，搅拌，得到A液；将所述A液与精子质膜保护剂混合，得到B液；将所述B液与冷冻保护剂混合，得到基础冷冻稀释液。

将所述基础冷冻稀释液、野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物混合；混合后优选调节pH值及渗透压，即可得到精液冷冻保存稀释液。

本发明还提供了一种上述精液冷冻保存稀释液作为绵羊精子冷冻保存稀释液的应用。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种精液冷冻保存稀释液及其应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

（1）将葡萄糖（G7021，sigma，美国）3.2 g、柠檬酸钠（PHR1416，sigma，美国）3.2 g、青霉素（P7794，sigma，美国）10万IU、链霉素（S1277，sigma，美国）10万IU溶于100 mL超纯水中，搅拌均匀，得到A液；

（2）取80 mL A液和20 mL新鲜卵黄充分混合，得到B液；

（3）取94 mL B液添加6 mL甘油（G0400007，sigma，美国），得到基础冷冻稀释液；

（4）取野菊花提取物（河南宜新生物科技有限公司产品编号YX-000604），贯叶金丝桃提取物（河南宜新生物科技有限公司产品编号YX-008057）加入基础冷冻稀释液，调整PH至7.1，渗透压为300 mosm/L，即得到绵羊精子冷冻保存稀释液。

为筛选野菊花提取物和贯叶金丝桃提取物联合使用的最佳浓度，设置如表1所示9组浓度梯度的冷冻稀释液。

表1 基础冷冻稀释液中添加不同浓度野菊花和贯叶金丝桃提取物

精液收集

选取膘情中等、体质健康、性欲旺盛、年龄2.5~3.0岁的10只小尾寒羊种公羊，按常规假阴道法进行精液采集，每周采精2次，每次连续两次射精（两次之间至少间隔30 min，第一次丢弃）。精液采集后立即转入实验室，保存于37℃下水浴环境。检测新鲜精子的体积、密度、运动参数，选择体积在0.7~2.0之间、密度＞2.5×10⁹/mL及活率＞80%、无异常气味、色泽乳白的精液样品用于后续实验。

精液冷冻与解冻

稀释：将符合要求的新鲜精液混合后，在25℃下用不同成分冷冻稀释液进行5倍比例的等温稀释。

冷冻：稀释后的精液样品置于10 mL离心管，裹8~10层纱布置于4℃冰箱中平衡2h。然后，用0.25 mL的塑料细管进行分装并封口，放于距液氮面4 cm的高度熏蒸7 min，迅速将细管投入液氮中保存。

解冻：从液氮中至少保存2周（本发明中保存2周）后取出细管精液，迅速平行地浸入40℃水浴12 s，轻轻摇动至融化。

脂肪酸成分分析

1mL精液样本采用等体积PBS稀释，并在室温下以1000 r/min×10分钟除去精浆。精子样本采用1.25 mM EDTA分离质膜。根据说明书，使用检测ELISA试剂盒测量胆固醇（ab285242，abcam，英国）和磷脂（ab273294，abcam，英国）含量。

精子活力检测

精子活力采用PI荧光染色结合流式细胞仪检测，PI染料（GMS14057，Eugene，美国）根据试剂盒说明，使用前用PBS（C0221A，碧云天，中国）进行50倍稀释，作为工作液。取1 mL精子悬液分别加入5 μL PI工作液，充分混匀后，于37℃水浴避光孵育10 min，离心弃上清，用适量的HEPES缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸，PH=7.8，H4034，sigma，美国）调节精子密度为1×10⁶ /mL，进行流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）检测，样本均获取10000个精子。

精子顶体完整性检测

精子活力采用SYBR-14（GMS14057，Eugene，美国）荧光染色结合流式细胞仪检测，SYBR-14溶液根据试剂盒说明，使用前进行50倍稀释，作为工作液。取1 mL精子悬液分别加入5 μL SYBR-14工作液和5 μL PI工作液，充分混匀后，于37℃水浴避光孵育10 min，离心弃上清，用适量的HEPES缓冲液调节精子密度为1 ×10⁶ /mL，进行流式细胞仪检测。

精子运动参数检测

精子的直线运动参数用精子分析仪(CASA, Minitube, Tiefenbach, 德国)进行评估，精液37℃中孵育10 min后稀释检测，取10 μL的精液到预热好的载玻片上，每个样品读取5个视野，分别评估精子的总运动精子数（TM），精子原地转圈数（LM），直线前进精子数（PM），曲线运动速度（VCL，μm/s），平均路径速度（VAP，μm/s），直线速度（VSL，μm/s），直线性（LIN：曲线运动的直线性LIN= VSL/VCL），前向性（STR：空间平均路径的直线性VSL/VAP），鞭打频率（BCF），精子头侧摆幅度（ALH）。

体外受精

将屠宰场摘取的卵巢放入35℃含双抗的生理盐水中，迅速带回实验室。成熟培养液由TCM199（M5017，sigma，美国）+ 10 μg/mL FSH（F-8174，sigma，美国）+ 10 μg/mL LH（R5119B，Lutropin-V，加拿大） + 1 μg/mL E2（E2758，sigma，美国） +20 ng/mL EGF（E4127，sigma，美国）组成。选择胞质均匀、带有三层及其以上完整致密的卵丘颗粒细胞的COCs（卵丘-卵母细胞复合体）在100 μL成熟培养液微滴中培养24 h。将成熟卵母细胞用透明质酸酶消化，以卵母细胞周围留有2~3层颗粒细胞为宜。受精液由SOF（0.172 g/LCaCl₂·2H₂O + 0.0996 g/L MgCl₂·6H₂O + 0.162 g/L KH₂PO_{4 +} 0.5338 g/L KCl + 6.294g/L NaCl + 2.106 g/L NaHCO₃ + 乳酸钠 755.5 μL/L）+20% FBS（胎牛血清，16000，Gibco，美国）+ 10 μg/mL肝素（H3149，sigma，美国）组成，体外成熟的卵母细胞在受精液中洗3次，每15个卵母细胞移入30 μL受精液滴中。通过上游法制备IVF（体外受精）精子，受精液调整精子密度为1×10⁶个/mL(Marienfeld, Germany)，然后将精子和卵母细胞置于5%CO₂、38.5℃和饱和湿度培养箱中培养18~20 h。然后，将受精卵从受精液中取出，在HSOF（SOF+20 mmol/L HEPES+5 mmol/L NaHCO₃+0.3% BSA）中轻轻吹打除去全部卵丘细胞并用发育液洗涤3次，移入50 μL发育液微滴中，每滴10~15枚卵母细胞。采用混合气体即5%CO₂、5%O₂、90%N₂，38.5℃饱和湿度的条件下进行培养。发育液为SOF+1% NEAA（非必需氨基酸，M7145，sigma，美国）+1% EAA（必需氨基酸，B6766，sigma，美国） +10 ng/mL EGF （表皮生长因子，E4127，sigma，美国）+1 mmol/L L-谷氨酰胺（G8540，sigma，美国）+8 mg/mL BSA（牛血清白蛋白，A3311，sigma，美国），每48 h换半液培养，在受精后48h统计卵裂率。

人工授精

采用CIDR（羊用阴道内置孕酮栓，新西兰）+ PMSG（孕马血清，宁波三生，中国）方法开展同期发情。放置CIDR记为第0天，第12天上午8:00-9:00臀部肌肉注射280IU/只 PMSG，同时肌肉注射V_ADE（维生素ADE，北京绿康欣农牧科技有限公司，中国）5 mL/只，第13天晚禁食禁水，第14天上午8:00-10:00利用添加第5组和第1组冻融精子，开展腹腔内窥镜子宫角输精，与配种后45天，利用B超诊断仪对两组受体羊进行早期妊娠检测。

结果和分析

结果如表2~表4所示。

表2 不同浓度野菊花和贯叶金丝桃提取物对冻融精子质膜不饱和脂肪酸的影响（n=10）

注：同行不同的字母肩注（a, b, c, d）上标说明差异显著(P＜0.05)。

表3 不同浓度野菊花和贯叶金丝桃提取物对冻融精子质量的影响（n=10）

注：同行不同的字母肩注（a, b, c, d）上标说明差异显著(P＜0.05)。

表4 不同浓度野菊花和贯叶金丝桃提取物对冻融精子运动性能的影响（n=10）

注：同行不同的字母肩注（a, b, c, d）上标说明差异显著(P＜0.05)。

冷冻稀释液中添加野菊花提取物和贯叶金丝桃提取物，通过分析冻融精子质量评估对冷冻保存效果的影响。实验结果表明，添加0.25 mg/mL野菊花和0.2 mg/mL贯叶金丝桃提取物（第5组）显著抑制冻融精子质膜胆固醇（CH）流失（P＜0.05，表2），提高CH/磷脂（PL）比（P＜0.05，表2），明显改善了精子质膜冷冻耐受性；通过精子质量分析，第5组冻融精子的精子活力、顶体完整性和体外受精卵裂率显著高于其它8组（P＜0.05，表3）；人工授精实验（第5组vs第1组）表明，第5组冻融精子内窥镜输精受胎率显著高于第1组（P＜0.05，表3）；CASA运动分析结果表明，第5组冻融精子的TM、PM、VCL、VAP、VSL、BCF、ALH均显著高于其他8组（P＜0.05，表4）。

综合质膜不饱和脂肪酸、精子活力、顶体完整性、受精能力和运动分析，精液冷冻稀释液中添加0.25 mg/mL野菊花和0.2 mg/mL贯叶金丝桃提取物显著改善绵羊冻融精子的质量，提高了冻融精子的运动和受精能力。本发明应用后，相比未添加组（第1组），冻融精子活力提高约13~15%，达到45%左右；顶体完整性提高约16~18%，达到60%左右；直线运动精子比例提高约10~12%，达到38%左右；人工授精受胎率提高约28~30%，达到72%左右。由此可见，野菊花和贯叶金丝桃提取物协同应用，有效改善绵羊精液冷冻保存效果。

社会效益及经济效益

目前全国从事绵羊生产的企业和机构，普遍存在扩繁速度缓慢，品种改良困难的问题，冻融精子质量和受胎率低是导致其无法产业应用的最主要的限制因素。因此，精液冷冻保存技术的改进，精液稀释液配方的完善势在必行。本专利可实现优秀种质资源高效保存，为科学合理开展绵羊良种繁育提供关键技术支撑，迅速扩大群体规模，迅速改变现有绵羊低产能、低效率、低质量的生产现状，提高了农民的经济收入，节本增效效果显著。本发明经在中国科学院东北地理与农业生态研究所长岭草地农牧实验站，以及吉林省等地多个地方畜牧改良站、企业、养殖户推广应用，具有效率高、操作简单和适用范围广等特点，基层技术人员可迅速完全掌握。因此本发明具有可观的经济效益、良好的社会效益和潜在的应用价值。

Claims (5)

1.一种精液冷冻保存稀释液，其特征在于，包括野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物；

所述野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物的质量比为5：4；

还包括基础冷冻稀释液；

所述野菊花提取物与基础冷冻稀释液的比例为25 mg：100 mL；

所述基础冷冻稀释液包括营养物质、抗菌物质与精子质膜保护剂；所述基础冷冻稀释液中营养物质的含量为2.4~3.0 g/100 mL；所述基础冷冻稀释液中抗菌物质的含量为15.0万IU/100 mL；所述基础冷冻稀释液中精子质膜保护剂的含量为18.8 mL/100 mL；

所述精液冷冻保存稀释液应用于绵羊精子冷冻保存稀释液；

所述营养物质选自葡萄糖、蔗糖与海藻糖中的一种或多种；

所述抗菌物质选自青霉素和链霉素; 所述青霉素与链霉素的效价比为1：1；

所述精子质膜保护剂选自卵黄和/或卵磷脂；

所述基础冷冻稀释液还包括缓冲物质与冷冻保护剂；所述基础冷冻稀释液中缓冲物质的含量为2.4~3.0 g/100 mL；所述基础冷冻稀释液中冷冻保护剂的含量为6 mL/100 mL；

所述缓冲物质选自柠檬酸钠、柠檬酸与碳酸氢钠中的一种或多种；

所述冷冻保护剂选自甘油、二甲基亚砜与乙二醇中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的精液冷冻保存稀释液，其特征在于，所述精液冷冻保存稀释液的pH值为7.1；所述精液冷冻保存稀释液的渗透压为300 mosm/L。

3.一种权利要求1所述的精液冷冻保存稀释液的制备方法，其特征在于，包括：

将基础冷冻稀释液、野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物混合，得到精液冷冻保存稀释液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述基础冷冻稀释液按照以下方法制备：

将营养物质、缓冲物质、抗菌物质与水混合，搅拌，得到A液；将所述A液与精子质膜保护剂混合，得到B液；将所述B液与冷冻保护剂混合，得到基础冷冻稀释液。

5.权利要求1~2任意一项所述的精液冷冻保存稀释液作为绵羊精子冷冻保存稀释液的应用。