KR100807643B1

KR100807643B1 - 인공수정용 돼지정액 희석액 및 그를 이용한 돼지 액상정액

Info

Publication number: KR100807643B1
Application number: KR1020060129277A
Authority: KR
Inventors: 박창식; 이영주
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2008-02-28

Abstract

본 발명은 인공수정용 돼지정액 희석액 및 그를 이용한 돼지 액상정액에 관한 것으로, 보다 상세하게는 조성물 1,000㎖ 수용액 당 글루코스 30~40g, TES(N-tris[Hydroxymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 10~15g, Tris[hydroxymethyl]aminomethane 1~3g, 염화칼륨(KCl) 0.1~2g, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 0.1~2g, 난황 150-250㎖ 및 소혈청알부민(BSA, Bovine serum albumin) 2~5g을 함유하는 인공수정용 돼지정액 희석액 및 그를 이용한 돼지 액상정액에 관한 것이다.

본 발명에 의한 인공수정용 돼지정액 희석액 및 그에 의한 돼지 액상정액은 제조공정이 간단하고 4℃의 일반 냉장고에 보관할 수 있는 간편성을 가지고 있으며 5일간 수시 이용이 가능하므로 양돈 농가에서의 인공수정과 실험실에서의 체외수정이 용이하여 우수 종모돈을 이용한 돼지의 품종개량과 생명공학분야의 연구에 크게 기여할 수 있다.

인공수정, 돼지, 정액, 희석액, 보존

Description

인공수정용 돼지정액 희석액 및 그를 이용한 돼지 액상정액{Diluent for boar semen and liquid boar semen using the diluent}

본 발명은 인공수정용 돼지정액 희석액 및 그를 이용한 돼지 액상정액에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 의한 돼지정액 희석액을 사용하여 돼지 액상정액을 제조하는 경우, 4℃에서 5일간 보관하여도 정자의 운동성, 정삼첨체율 및 생존능이 우수한 인공수정용 돼지정액 희석액 및 그를 이용한 돼지 액상정액에 관한 것이다.

인공수정은 자연종부에 비해 우수한 품질의 종모돈의 이용효율을 증대시키므로 양돈장의 생산성을 증가시킬 수 있으나, 수태율이 저조하고 산자수가 적다는 고정 관념으로 인하여 많은 양돈 농가들이 인공수정을 기피하여 왔다. 그러나 최근에는 양돈사육 규모가 확대되고 사육 형태가 협업 또는 단지화하면서 인공수정의 필요성이 높아지고 있으며 대부분의 양돈 농가들이 인공수정을 실시하고 있다.

인공수정 시에 채취된 정액을 희석하지 않고 원정액을 그대로 이용하는 경우 에는 정액의 채취 후 2시간 이내에 인공수정을 실시하여야 하는 제한이 있으므로, 일반적으로 사람이 인위적으로 추출한 정액을 희석하여 액상정액 또는 동결정액 상태로 보관하였다가 필요할 때 이를 이용하여 수정을 행하게 된다. 동결정액은 장기간 정액을 보관할 수 있는 장점이 있으나, 분만율 및 산자수가 낮기 때문에 액상정액이 일반적으로 사용된다. 액상정액은 보관 온도나 기간뿐만 아니라, 액상정액의 제조 시에 사용한 희석액의 종류에 따라서도 분만율과 산자수가 크게 달라지므로, 인공수정의 성공률을 높일 수 있는 희석액에 관한 연구와 개발이 많이 이루어지고 있다.

전 세계적으로 여러 종류의 돼지 액상정액(liquid semen)이 상업적 인공수정소(artificial insemination center)에 의하여 이용되고 있다. 대표적으로 Modena (Moretti, 1981, In Proceedings of the 8th International Pig Veterinary Society Congress, Ghent, Belgium, p. 293)는 가장 많이 이용되는 희석액 중 하나이다. Summermatter(1984, Verterinar-Humanmedizinische Gemeinschaftstagung, Hannover, FRG, pp. 72-75)은 Modena를 변형시켜 시스테인(cysteine)과 bovine serum albumin(BSA)를 첨가하고, glucose의 비율을 증가시킨 Butschwiler라는 희석액을 개발하였다. 상기의 희석액들은 일반적으로 15-18℃에서 보존되는 희석액들이다.

이와 같은 돼지의 인공수정에 필요한 희석액은 대부분 외국산으로 이를 도입하여 이용하고 있거나 희석액 제조기술을 전수받아서 국내에서 제조하는 복제사용에 의존하고 있는 실정이다. 또한 보관 상의 어려움이 있어 간단한 제조공정에 의 해 제조할 수 있고 일반 냉장고(4℃)에서 보관할 수 있는 희석액이 요구되어 진다.

정 등(1989, Korean J. Anim. Sci. 31:58-161)은 BF5 희석액을 이용하여 5 ml 스트로우(straw)에 주입하여 5℃에서 9일간 보존될 수 있는 액상정액을 보고하였다. 박 등(2004. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 17(10):1369-1373)이 0.05% N-acetyl-D-glucosamine을 첨가함으로써 lactose-난황(LEY)을 변형시킨 4℃ 보존 액상정액 희석액인 LEN을 보고하였다.

일반적으로 포유류(mammalian)의 사출된 원정액(ejaculated semen)은 고농도의 정자(spermatozoa)가 일정 지속시간 동안 배양된 후 난모세포(oocyte)의 침입에 대한 능력을 얻는다(수정능 획득: capacitation). 성공적인 수정을 위한 사출된 원정액의 배양시간은 4-8시간이다(Hamano와 Toyoda, 1996, Jpn. J. Anim. Reprod. 32:177-183; Suzuki 등 1986, Anim. Sci. Tech. Jpn. 67:24-27). 그러나 동결-융해된 정자의 체외수정(in vitro fertilization)에 있어서의 정자침입은 배양시간이 없어도 나타났다(Wang 등, 1991, J. Reprod. Fertil. 93:491-496). Watson (1995, Reprod. Fertil. Dev. 7:871-891)은 동결-융해된 정자는 이미 수정능 획득이 시작된 것이라고 보고하였는데, 즉 동결-융해된 정자의 세포막은 동결되지 않고 수정능 획득이 일어난 정자와 유사하고, 이것은 정자가 난모세포의 침입을 위하여 일어나는 첨체반응(acrosome reaction)과도 유사하다고 보고하였다. 또한, 수정능 획득 정자가 실온에서부터 5℃까지 냉각하는 동안 증가하였고, 이러한 수정능 획득 정자는 난모세포 침입을 위한 동결-융해 후 배양시간이 필요하지 않다. 그러나, 배양시간 없이 수정능 획득 결과의 기전을 알려진 바가 없다(Martinez 등, 1996, Reprod. Dom. Anim. 31:317-320, 1996).

그러나 LEN은 배양시간에 따라 액상정액의 정자의 운동성, 정상첨체비율 및 생존능이 크게 저하되어 인공수정과 체외수정 시 성공률이 낮아지는 문제가 있었다. 따라서, 보존 기간 뿐 아니라 수정능 획득을 위한 배양 시에도 액상정액의 안정성을 확보할 수 있는 희석액 및 그에 의한 액상정액이 요구된다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 제조공정이 간단하고 4℃에서 보관하여도 정자의 운동성, 정상첨체율 및 정자 생존능이 우수하여 일반 냉장고에 보관하면서 수시 이용이 가능하므로 양돈 농가에서의 인공수정과 실험실에서의 체외수정이 용이하도록 하는 돼지 액상정액 희석액 및 그에 의한 액상정액을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인공수정용 돼지정액 희석액은 조성물 1,000㎖ 수용액 당 글루코스 30~40g, TES(N-tris[Hydroxymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 10~15g, Tris[hydroxymethyl]aminomethane 1~3g, 염화칼륨(KCl) 0.1~2g, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 0.1~2g, 난황 150-250㎖ 및 소혈청알부민(BSA, Bovine serum albumin) 2~5g을 함유하는 조성물인 것을 특징으로 한다.

실시예에 구체적으로 데이터를 기술하지는 않았으나, 상기 조성물 중 각 성분의 함량을 결정하기 위하여 100㎖ 용액 중 N-아세틸-D-글루코사민의 농도를 변화시켜 돼지 정액을 희석한 후 정상첨체율을 조사한 결과 0.1~2g 투입 시 효율이 높고, 특히 0.5g 투입 시 정상첨체율이 가장 높았으며 첨가량이 증가할수록 정상첨체율은 점점 낮아지지만 첨가하지 않은 경우보다 좋았다.

난황의 범위를 결정하기 위해 N-아세틸-D-글루코사민이 함유된 용액에 난황의 농도를 0~25%로 변화시키면서 정상첨체율을 검정한 결과 난황의 농도가 증가할수록 정상첨체율이 높아져 20%에서 가장 높았으며 20%이상인 경우 첨가하지 않은 경우보다는 효과가 있었으나, 그 효율이 다시 감소하였다.

전술한 방법과 마찬가지 방법으로 조성물 중 글루코스, TES, Tris, KCl 및 소혈청알부민을 차례로 첨가하며 각 성분의 조성 범위를 결정하였다.

본 발명의 조성물에서 글루코스는 대사기질과 에너지원으로 작용하며, TES, Tris, KCl은 정자의 완충작용과 산도(pH) 및 삼투압을 조절하는 역할을 한다.

실시예에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 의한 인공수정용 돼지정액 희석액에 의해 제조된 액상정액은 기존의 희석액에 의한 액상정액에 비해 정자의 운동성, 정상첨체율 및 생존능이 우수하므로 인공수정의 성공률을 높일 수 있다. 종래의 액상정액은 보관의 어려움이 있으나, 본 발명은 4℃의 일반냉장고에 보관할 수 있는 간편성을 가지고 있으며 5일간 수시 이용이 가능하므로 그 효용성이 크다.

이하, 실시예를 통하여 종래기술에 의한 돼지정액 희석액 LEN과 본 발명의 희석액 GPL4를 사용한 액상정액의 정자의 운동성 및 정상첨체율 및 생존능을 비교하여 검정하였다.

실시예

실시예 1 : 인공수정용 돼지정액 희석액(GPL4)

하기 표 1에 기재한 성분과 함량을 이용하여 본 발명에 의한 인공수정용 돼지정액 희석액을 제조하였다. 표 1에 기재된 성분 이외의 나머지 분량은 정제수를 사용하여 그 부피를 조절하였다. GPL4의 제조 시 BSA는 첨가 시 교반에 의한 거품 발생으로 인하여 BSA 특성의 변화를 일으킬 수 있으므로, 맨 마지막에 첨가하고 용해 시 교반하지 않고 그대로 녹여서 제조하였다.

실시예 2 : GPL4 돼지 액상정액

수압법에 의하여 채취된 37℃의 농후정액을 채취 후 2시간 이내에 실온(20~23℃)으로 냉각시킨 후 실시예 1에서 제조한 GPL4 용액을 사용하여 실온에서 5x10⁹ 정자/10ml가 되도록 희석하여 돼지 액상정액을 제조하였다. 15ml 시험관에 10ml씩 제조된 액상정액은 4℃ 냉장고에 5일간 보관하며 하기 실시예의 정자의 운동성, 정상첨체율 및 생존능을 각각 조사하였다.

비교예 : LEN 돼지 액상정액

희석액으로서 LEN(1,000㎖ 수용액 중 락토오스 수화물 110.0 g, N-아세틸-D-글루코사민 0.5 g, 난황 200㎖ 함유)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 돼지 액상정액을 제조하였다. 제조된 액상정액은 실시예 2의 액상정액과 함께 4℃ 냉장고에 5일간 보관하며 하기 실시예의 정자의 운동성, 정상첨체율 및 생존능을 각각 조사하였다.

실시예 3 : 돼지 액상정액의 특성

1) 액상정액의 항온배양

실시예 2와 비교예의 액상정액을 각각 4℃에서 5일간 보관하면서 1일마다 샘플 100 ㎕ 채취하고, 2 ml의 BTS(Beltsville thawing solution)에 희석하고 38.5℃ 에 항온배양시키면서 각 표에 기재된 시간별로 샘플을 채취하여 특성을 검정하였다.

본 발명에 의한 인공배양용 돼지정액 희석액을 사용하여 제조된 액상정액의 특성을 알아보기 위하여 1)에서 항온배양된 액상정액을 이용하여 정자의 운동성, 정상첨체율 및 생존능을 비교예와 대비하여 검정하였다. 각 실험은 5회 반복하여 통계처리하였으며, 하기 모든 표에서 위첨자로 나타낸 알파벳문자 중 abcd는 동일한 행에서, xyz는 동일한 열에서 각각 동일한 문자로 표시하는 경우 평균간에 0.05% 수준에서 유의성이 인정되는 것을 의미한다.

2) 정자 운동성 검정

1)에서 항온배양된 샘플을 각각 항온배양 0.5, 3, 5시간 만에 채취하여 운동성(%)을 일반 현미경(250x)으로 검정하면서 비디오 테이프로 기록한 후 텔레비전 스크린에서 계산하였다. 그 결과를 표 2와 표 3에 기재하였다. 표 2는 GPL4 액상정액, 표 3은 LEN 액상정액에 대한 결과를 나타낸다. 표 2와 표 3의 비교에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 의한 GPL4 액상정액 중 정자의 운동성은 4℃에서 5일간 보관한 후에도 우수하여 LEN 액상정액에 비해 5배 이상 높은 운동성을 보였다. 또한, 종래기술에 의한 LEN 액상정액에 비해 배양시간이 경과하여도 정자의 운동성이 유지되어 수태율 및 산자수를 크게 높일 수 있을 것으로 기대된다.

3) 정상첨체율 검정

1)에서 항온배양된 샘플을 각각 항온배양 0, 3, 5시간 만에 채취하여 1% 글루탈알데하이드(glutaradehyde)로 고정하고 위상차 현미경 (1,000x)으로 정상첨체율을 조사하여 그 결과를 표 4 및 표 5에 기재하였다. 표 4는 GPL4 액상정액, 표 5은 LEN 액상정액에 대한 결과를 나타낸다. 표 4와 표 5의 비교에서 확인할 수 있듯이 정자의 운동성과 마찬가지로 본 발명에 의한 GPL4 액상정액의 정상첨체율은 4℃에서 5일간 보관 시 및 항온배양 후에도 LEN 액상정액에 현저히 우수하였다.

4) 정자 생존능 검정

1)에서 항온배양된 샘플을 각각 항온배양 0, 3, 5시간 만에 채취하여 살아있는 정자를 표지하는 SYBR-14와 죽은 정자를 표지하는 propidium iodide 형광염색을 실시하고 현미경으로 생존능을 조사하여 그 결과를 표 6 및 표 7에 기재하였다. 표 6은 GPL4 액상정액, 표 7은 LEN 액상정액에 대한 결과를 나타낸다. 표 6와 표 7의 비교에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 의한 GPL4 액상정액 중 정자의 생존능은 4℃에서 5일간 보관 시 및 항온배양 후에도 LEN 액상정액에 우수하였다.

이상과 같이 본 발명에 의한 인공수정용 돼지정액 희석액 및 그에 의한 돼지 액상정액은 제조공정이 간단하고 4℃의 일반 냉장고에 보관할 수 있는 간편성을 가지고 있으며 5일간 수시 이용이 가능하므로 양돈 농가에서의 인공수정과 실험실에서의 체외수정이 용이하여 우수 종모돈을 이용한 돼지의 품종개량과 생명공학분야의 연구에 크게 기여할 수 있다.

Claims

조성물 1,000㎖ 수용액 당 글루코스 30~40g, TES (N-tris[Hydroxymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 10~15g, Tris[hydroxymethyl]aminomethane 1~3g, 염화칼륨(KCl) 0.1~2g, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 0.1~2g, 난황 150-250㎖ 및 소혈청알부민(BSA, Bovine serum albumin) 2~5g을 함유하는 것을 특징으로 하는 인공수정용 돼지정액 희석액.
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