CN102093978A - 猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪早期胚胎（适用于猪孵化囊胚前的胚胎）发育前期培养液（前60h）和一种猪早期胚胎发育后期培养液（培养60h后至孵化囊胚阶段），其在不含CaCl₂的NCSU23培养液基础上添加了乳酸钙、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、dbcAMP.Na、非必需氨基酸和发情第7d猪血清。另外，本发明的猪早期胚胎发育前期培养液与猪早期胚胎发育后期培养液的区别在于前者不含有葡萄糖，后者含有葡萄糖，具体对猪早期胚胎进行培养时，先使用本发明的猪早期胚胎发育前期培养液进行培养，60h后再换成本发明的猪早期胚胎发育后期培养液。如此一来，可大大提高囊胚发育率和囊胚质量。

Description

猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液

技术领域

本发明涉及发育生物学，具体涉及一种猪早期胚胎发育前期培养液及猪胚胎后期培养液。

背景技术

早期胚胎培养是胚胎生物技术的基础和关键环节，对于体外受精、胚胎分割、胚胎嵌合、核移植和转基因动物的构建都具有重要的意义。现有的早期胚胎培养系统能够成功地支持重构胚发育到囊胚阶段，但是发育至囊胚比率没有体内高，而且体外培养系统培养的胚胎质量也差于体内胚胎。人们对早期胚胎发育的机制仍知之甚少，同时体外培养也不能完全模拟体内环境：一方面，体内胚胎处于微量的液体环境中，而在体外培养的胚胎多置于较多的培养液中，使得胚胎自分泌产生的因子均被稀释而无效果。另一方面体内胚胎始终处于一种动态的环境中，胚胎通过输卵管到达子宫的过程中周围的营养环境持续变化，以满足胚胎不同发育阶段的营养需求；而在体外培养时，许多传统胚胎培养系统是一个静止的环境，在整个植入前时期只有一种培养基。此外，体外培养系统中也缺乏任何雌性生殖道旁分泌因子。总的来说，现阶段体外培养的胚胎在数量上和质量上都不如体内胚胎，这告诉我们胚胎的体外培养体系还不十分完美，还需要继续深入研究并建立更好更接近生理环境的培养系统。

目前猪的胚胎从合子到囊胚在体外有以下几种体外培养液：如改良的Whitten培养液、北卡罗来纳州立大学研制的培养液(North Carolina State University (NCSU23/NCSU37)、改良的Chatot, Ziomek, Bavister 培养液、Beltsville embryo culture medium (BECM)培养液和PZM系列(PZM-3/PZM- 4/PZM-5)培养液。其中NCSU23是公认的这其中最成功的培养液，它基本能满足其发育至囊胚的代谢和营养需要。然而这些经体外培养后的胚胎经胚胎移植后，其妊娠率和窝均产仔数均很低，发育至囊胚的细胞数也显著低于体内胚胎，我们还需要对体外培养液进行改进，以提高猪早期胚胎体外生产效率。

发明内容

发明人经大量深入研究，在NCSU23猪胚胎培养液的基础上，通过在猪早期胚胎（即猪孵化囊胚前的胚胎）发育前期阶段和后期阶段添加及删减某些营养物质或抗氧化剂，大大提高了猪克隆胚胎和孤雌激活胚胎的体外发育效果。两种胚胎利用本发明的猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液培养后，囊胚率和内细胞团数均要显著高于NCSU23和NCSU37。

本发明的目的之一在于提供一种pH值为7.3±0.02的猪早期胚胎发育前期培养液，用于猪早期胚胎发育的前期培养，即前60h的培养，具体成份包括：NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、NaHCO₃、BSA（牛血清白蛋白），其特征在于还包括：乳酸钙和丙酮酸钠。研究表明，高浓度的葡萄糖对猪4细胞前的胚胎有抑制其体外发育作用，而在4细胞以后，一定浓度的葡萄糖则可以促进囊胚的形成。本发明中，NaCl的主要作用是维持整个培养液的渗透压（当然其他物质也提供渗透压）；KCL为K离子主要来源（KH₂PO₄也部分提供K离子），且生理状态下Na离子和K离子通常维持在一定比例，通常为20:1。KH₂PO₄和NaHCO₃为一对缓冲体系，主要起维持培养液pH值的作用。BSA起到营养细胞的作用。在猪早期胚胎发育的前期用低浓度的Na-pyruvate（丙酮酸钠）和Ca-(lactate)₂·5H₂O（乳酸钙）代替葡萄糖作为能量物质，60h后恢复葡萄糖，部分提高了胚胎的发育效果。同时乳酸钙中的钙代替氯化钙作为钙源。

较佳地，本发明的猪早期胚胎发育前期培养液中，NaCl的浓度为108.62 mmol/L、KCl的浓度为4.78mmol/L、KH₂PO₄的浓度为1.19 mmol/L、MgSO₄的浓度为1.2mmol/L、NaHCO₃的浓度为25.07mmol/L、牛血清白蛋白的浓度为4 g/L、乳酸钙的浓度为2mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.2~0.4mmol/L，优选0.34mmol/L。其中本发明的猪早期胚胎发育前期培养液还可包括NCSU23培养液中的其他成份，但不包括CaCl₂和葡萄糖，具体为：1mmol/L的Glutamine（谷氨酰胺）、7mmol/L的Taurine（牛磺酸）、5mmol/L Hypotaurine （亚牛磺酸）、0.075g/L的青霉素G和0.05g/L的链霉素。

在本发明一较佳实施例中，本发明的猪早期胚胎发育前期培养液还包括浓度为0.5~1.5mmol/L，优选1mmol/L的dbcAMP.Na（Dibutyryl cAMP.Na，双丁酰环腺苷酸钠盐）和1%的MEM-NEAA（非必需氨基酸）。双丁酰环腺苷酸钠盐（dbcAMP.Na）的添加用于提高克隆或孤雌激活胚胎的囊胚率。非必需氨基酸的添加对胚胎的发育具有协同促进作用。

在本发明另一较佳实施例中，本发明的猪早期胚胎发育前期培养液还包括浓度为5%的发情第7d猪血清，以部分模拟体内发育激素环境，提高胚胎培养效率。

在本发明再一较佳实施例中，本发明的猪早期胚胎发育前期培养液还包括浓度为30~50μmol/L，优选40μmol/L的β-ME（β-巯基乙醇），可促进细胞内还原性谷胱甘肽（GSH）的形成，降低胚胎培养过程中氧自由基的形成，减少液体对胚胎的毒副作用。

本发明的目的之二在于提供一种pH值为7.3±0.02的猪早期胚胎发育后期培养液，用于猪早期胚胎发育的后期培养，即培养60h后至孵化囊胚阶段，具体成份包括：NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、NaHCO₃、牛血清白蛋白、葡萄糖，其特征在于还包括：乳酸钙和丙酮酸钠。

较佳地，本发明的猪早期胚胎发育后期培养液中，NaCl的浓度为108.62 mmol/L、KCl的浓度为4.78mmol/L、KH₂PO₄的浓度为1.19 mmol/L、MgSO₄的浓度为1.2mmol/L、NaHCO₃的浓度为25.07mmol/L、牛血清白蛋白的浓度为4 g/L、葡萄糖的浓度为4.55 mmol/L、乳酸钙的浓度为2mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.2~0.4mmol/L，优选0.34mmol/L。其中，本发明的猪早期胚胎发育后期培养液还可包括NCSU23培养液中的其他成份，但不包括CaCl₂，具体为：浓度为1mmol/L的谷氨酰胺、7mmol/L的牛磺酸、5mmol/L亚牛磺酸、0.075g/L的青霉素G和0.05g/L的链霉素。

在本发明一较佳实施例中，本发明的猪早期胚胎发育后期培养液还包括浓度为0.5~1.5mmol/L，优选1mmol/L的双丁酰环腺苷酸钠盐（dbcAMP.Na）和1%的非必需氨基酸，dbcAMP.Na的添加用于提高克隆或孤雌激活胚胎的囊胚率。非必需氨基酸的添加对胚胎的发育具有协同促进作用。

在本发明另一较佳实施例中，本发明的猪早期胚胎发育后期培养液还包括浓度为5%的发情第7d猪血清，以部分模拟体内发育激素环境，提高胚胎培养效率。

在本发明再一较佳实施例中，本发明的猪早期胚胎发育后期培养液还包括浓度为30~50μmol/L，优选40μmol/L的β-巯基乙醇，可促进细胞内还原性谷胱甘肽（GSH）的形成，降低胚胎培养过程中氧自由基的形成，减少液体对胚胎的毒副作用。

本发明的目的之三在于提供一种猪胚早期胎的培养方法，其特征在于，先使用猪早期胚胎发育前期培养液对猪胚胎进行培养，60小时后再使用猪早期胚胎发育后期培养液对猪胚胎进行培养。

本发明的优点在于：

1、合并使用本发明的猪早期胚胎发育前期及后期培养液于核移植和孤雌激活胚胎上，可获得高于NCSU23和NCSU37囊胚发育率；

2、利用本发明的猪早期胚胎发育前期及后期培养液所获得的囊胚质量要好于NCSU23和NCSU37，具体表现在囊胚细胞数高于NCSU23和NCSU37。

具体实施方式

实施例1 本发明的猪早期胚胎前期培养液及后期培养液

 表1 NCSU23、NCSU37和本发明的猪早期胚胎发育前、后期培养液的成份

注：上述液体按照100mL体积进行配制，单位为克。（括号外数字的单位为克，括号内的数字是换算后的浓度，单位为mmol/L）

表1中的培养液按照本领域普通技术人员所熟知的常规方法以胚胎测试级超纯水为溶剂进行配制。其中，发情第7d猪血清按照如下方法制得：从经产繁殖母猪中选择体况良好，身体健康且发情周期正常的母猪进行采血。以第一次配种几位0d，从配种第7d的母猪耳静脉无菌采血10mL，不同母猪所采集的血液可以相互混合。在4℃下静置4h，3500rpm离心10min，然后56℃灭活30min，0.22μm滤膜过滤即得。其他物质均为市售。

效果实施例的实验步骤中相同之处总结如下，不同之处具体见各效果实施例处

A1、猪胚胎的液滴法培养

液滴法培养猪核移植胚胎或孤雌激活胚胎的具体使用方法与本领域普通技术人员所熟知的方法相同，即先做成覆盖石蜡油的50μL液滴，放入猪早期胚胎发育前期培养液，在CO₂培养箱中孵育2h以上。每滴放入胚胎15~25枚。培养60h后，用已在CO₂培养箱中孵育过的猪早期胚胎发育后期培养液进行洗涤，再放入孵育过的猪早期胚胎发育后期培养液继续进行孵育。

A2、猪胚胎的四孔板培养

四孔板培养法培养猪核移植胚或孤雌激活胚胎的具体使用方法与本领域普通技术人员所熟知的方法相同，即先做成覆盖石蜡油的四孔板，然后放入猪早期胚胎发育前期培养液，在CO₂培养箱中孵育2h以上。每孔放入40枚胚胎。培养60h后，用已在CO₂培养箱中孵育过的猪早期胚胎发育后期培养液进行洗涤，再放入孵育过的猪早期胚胎发育后期培养液继续进行孵育。

B1、核移植胚的制备

验证核移植胚体外发育效果的胚胎按照本领域技术人员所熟知的方法进行制备。猪MII期卵母细胞去核时，采用Oocytes系统进行纺锤体观察以辅助去核，然后将经饥饿处理的供体细胞注入去核的卵母细胞的卵周隙中，重构胚经融合和激活后进行胚胎培养。

B2、孤雌激活胚的制备

验证孤雌激活胚体外发育效果的胚胎按照本领域技术人员所熟知的方法进行制备。将MII期卵母细胞移入已经平衡好的融合液中，洗涤三次，然后移入融合槽中进行电击，电击参数为120V/mm，时长60μs。电激活后，将卵移入含6-DAMP和CHX的化学激活滴中继续激活4h。

C、囊胚细胞计数

培养第7d的囊胚，经4%多聚甲醛固定后，在含10μg/mL的Hoechst 33342的DPBS中避光中孵育10min，将染色处理的胚胎转移到干净的载玻片上，尽量少带原液。在以胚胎为中心，在盖玻片大小范围内的四角做4个凡士林柱，盖上盖玻片，再轻轻压盖玻片，将胚胎压至原直径的1.2倍。将做好的片子利用荧光显微镜进行观察，照相，记录计数。 

效果实施例1  不同浓度的Na-pyruvate在培养液中的添加对孤雌激活胚胎发育的影响

本试验使用的猪早期胚胎发育前、后期培养液与实施例1中的猪早期胚胎发育前、后期培养液的区别仅在于Na-pyruvate的浓度，分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/L。按照B2点所述方法制得的孤雌激活胚胎分别用含有不同浓度的Na-pyruvate猪胚胎发育前期培养液洗涤3次后按照A1的液滴法进行培养。最后按照C的方法进行囊胚细胞计数。结果如表2。

表2  Na-pyruvate对孤雌激活胚胎发育的影响

结果表明：培养前60h以Na-pyruvate代替葡萄糖有助提高胚胎发育，且以0.4mmol/L的浓度达到最高，继续提高Na-pyruvate浓度则发育率有所下降。Na-pyruvate的最佳添加浓度是0.2~0.4mmol/L。

效果实施例2 全程添加葡萄糖对猪孤雌激活和核移植胚胎发育的影响

为了验证葡萄糖对猪孤雌激活和核移植胚胎发育前后期的影响，全程添加葡萄糖的对照组中按照B2点所述方法制得的孤雌激活胚胎以及B1点所述方法制得的核移植胚胎在孵育过程中分别一直使用实施例1中的猪胚胎发育后期培养液。试验组中的猪孤雌激活和核移植胚胎前期分别使用猪早期胚胎发育前期培养液，培养60h，分别使用猪早期胚胎发育后期培养液。具体试验步骤与效果实施例1相同。结果如表3。

表3葡萄糖的全程添加与60h后添加对猪孤雌激活和

核移植胚胎发育的影响

结果表明，葡萄糖在胚胎发育早期添加对胚胎发育无促进作用，在胚胎发育的前60h去除葡萄糖，能提高体外发育效果。

效果实施例3  DbcAMP·Na的浓度对猪孤雌激活胚胎发育的影响

本试验中使用的猪早期胚胎发育前、后期培养液与实施例1中的猪早期胚胎发育前、后期培养液的区别仅在于DbcAMP·Na的浓度，分别为0、0.5、1、1.5mmol/L。按照B2点所述方法制得的孤雌激活胚胎分别用含有不同浓度的DbcAMP·Na猪早期胚胎发育前期培养液洗涤3次后按照A2的四孔板法进行培养。最后按照C的方法进行囊胚细胞计数。结果如表4。

表4  DbcAMP·Na对猪孤雌激活胚胎发育的影响

结果显示，添加DbcAMP·Na部分提高了卵裂和囊胚率，其中以1mmol/L浓度时卵裂率最高，继续提高添加浓度，则发育率没有增加，合理的DbcAMP·Na添加浓度为0.5~1.5mmol/L。

效果实施例4  β-ME添加与否对孤雌激活和核移植胚胎发育的影响

本试验观察β-ME添加与否对猪孤雌激活和核移植胚胎发育的影响。在对照组中使用的猪早期胚胎发育前、后期培养液与实施例1中的猪早期胚胎发育前、后期培养液的区别仅在于不添加β-ME，试验组中即为实施例1中的猪早期胚胎发育前、后期培养液。具体试验步骤与效果实施例1相同。结果如表5。

表5  β-ME添加与否对孤雌激活和核移植胚胎发育的影响

结果β-ME无论是对孤雌激活胚胎，还是对核移植胚胎，均能一定程度提高体外发育效果。

效果实施例5  β-ME不同添加浓度对猪孤雌激活胚胎发育的影响

本试验中使用的猪早期胚胎发育前、后期培养液与实施例1中的猪早期胚胎发育前、后期培养液的区别仅在于β-ME的浓度，分别为0、20、30、40、50μmol/L。按照B2点所述方法制得的孤雌激活胚胎分别用含有不同浓度的β-ME猪早期胚胎发育前期培养液洗涤3次后按照A2的四孔板法进行培养。最后按照C的方法进行囊胚细胞计数。结果如表6。

表6  β-ME对猪孤雌激活胚胎发育的影响

结果表明，添加β-ME可逐步提高孤雌激活胚的体外发育率，当浓度达到40μmol/L时效果最佳，继续提高浓度则不能提高其发育率，合理的β-ME添加浓度为30~50μmol/L。 

效果实施例6  MEM-NEAA和第7d发情猪血清添加对孤雌激活和核移植胚胎发育的影响

本试验观察MEM-NEAA和第7d发情猪血清添加与否对猪孤雌激活和核移植胚胎发育的影响。在对照组中使用的早期猪胚胎发育前、后期培养液与实施例1中的猪早期胚胎发育前、后期培养液的区别仅在于不添加MEM-NEAA和第7d发情猪血清，试验组中即为实施例1中的猪早期胚胎发育前、后期培养液。具体试验步骤与效果实施例1相同。并按照B1点所述方法制得的核移植胚胎，结果如表7。

表7  MEM-NEAA和第7d发情猪血清对猪孤雌激活胚胎发育的影响

结果表明，共同添加这两种物质对孤雌激活胚胎发育无明显变化，但对核移植胚胎发育有明显促进作用。 

效果实施例7 本发明的猪胚胎发育前、后期培养液对孤雌激活胚胎发育的影响

本试验使用的猪早期胚胎发育前、后期培养液、NCSU23和NCSU37胚胎培养液如表1所示，试验方法如效果实施例1。结果如表8。

表8  猪胚胎发育前、后期培养液与NCSU23和NCSU37胚胎培养液对孤雌激活胚胎发育的影响，

结果表明：本发明的培养液无论是从卵裂率，还是囊胚率和囊胚细胞数上均显著高于NCSU23和NCSU37。NCSU37不适合用于孤雌激活胚胎的体外培养。

效果实施例8 本发明的猪胚胎发育前、后期培养液对核移植胚胎发育的影响

本试验使用的猪早期胚胎发育前、后期培养液、NCSU23和NCSU37胚胎培养液如表1所示，试验方法如效果实施例1，不同之处在于按照B1点所述方法制得的核移植胚胎，结果如表9。

表9 本发明的培养液与NCSU23和NCSU37

胚胎培养液对核移植胚胎发育的影响

结果表明，本发明的培养液同样在核移植胚上有较好的培养效果，其卵裂率、囊胚率以及囊胚质量均要好于NCSU23。 

Claims (10)

1.一种猪早期胚胎发育前期培养液，其pH值为7.3±0.02，包括如下成份： NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、NaHCO₃、牛血清白蛋白，其特征在于还包括：乳酸钙和丙酮酸钠。

2.如权利要求1所述的猪早期胚胎发育前期培养液，其特征在于NaCl的浓度为108.62 mmol/L、KCl的浓度为4.78mmol/L、KH₂PO₄的浓度为1.19 mmol/L、MgSO₄的浓度为1.2mmol/L、NaHCO₃的浓度为25.07mmol/L、牛血清白蛋白的浓度为4 g/L、乳酸钙的浓度为2mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.2~0.4mmol/L，优选0.34mmol/L，其中还包括浓度为1mmol/L的谷氨酰胺、7mmol/L的牛磺酸、5mmol/L亚牛磺酸、0.075g/L的青霉素G和0.05g/L的链霉素。

3.如权利要求2所述的猪早期胚胎发育前期培养液，其特征在于还包括浓度为0.5~1.5mmol/L，优选1mmol/L的双丁酰环腺苷酸钠盐和1%的非必需氨基酸。

4.如权利要求2所述的猪早期胚胎发育前期培养液，其特征在于还包括浓度为5%的发情第7天猪血清。

5.如权利要求2所述的猪早期胚胎发育前期培养液，其特征在于还包括浓度为30~50μmol/L，优选40μmol/L的β-巯基乙醇。

6.一种猪早期胚胎发育后期培养液，其pH值为7.3±0.02，包括如下成份： NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、NaHCO₃、牛血清白蛋白、葡萄糖，其特征在于还包括：乳酸钙和丙酮酸钠。

7.如权利要求6所述的猪早期胚胎发育后期培养液，其特征在于NaCl的浓度为108.62 mmol/L、KCl的浓度为4.78mmol/L、KH₂PO₄的浓度为1.19 mmol/L、MgSO₄的浓度为1.2mmol/L、NaHCO₃的浓度为25.07mmol/L、牛血清白蛋白的浓度为4 g/L、葡萄糖的浓度为4.55 mmol/L、乳酸钙的浓度为2mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.2~0.4mmol/L，优选0.34mmol/L，其中还包括浓度为1mmol/L的谷氨酰胺、7mmol/L的牛磺酸、5mmol/L亚牛磺酸、0.075g/L的青霉素G和0.05g/L的链霉素。

8.如权利要求7所述的猪早期胚胎发育后期培养液，其特征在于还包括浓度为0.5~1.5mmol/L，优选1mmol/L的双丁酰环腺苷酸钠盐和1%的非必需氨基酸。

9.如权利要求7所述的猪早期胚胎发育后期培养液，其特征在于还包括浓度为5%的发情第7天猪血清。

10.如权利要求7所述的猪早期胚胎发育后期培养液，其特征在于还包括浓度为30~50μmol/L，优选40μmol/L的β-巯基乙醇。