CN111117950A - 一种用于促进小鼠冷冻精液受精的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于促进小鼠冷冻精液受精的组合物，其在m HTF液中加入0.01mg/ml PVA和0.75mM甲基‑β‑环化糊精作为精子获能液，在m HTF液中加入1.0mM还原型谷胱甘肽作为精子体外受精液。本发明中使用的精子获能液可以显著保护质膜和顶体完整性，减少ROS的影响，显著提高精子存活率、活动力，结合本发明的含有还原性谷胱甘肽的体外受精液，可显著提高以近交系C57BL/6J为背景的基因修饰小鼠冻融后精子的体外受精成功率，受精后二细胞发育率在60～65％之间。

Description

一种用于促进小鼠冷冻精液受精的组合物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于促进小鼠冷冻精液受精的组合物。
背景技术
实验小鼠(Laboratory mouse)是自18世纪被用做实验动物，是目前应用最广泛、被研究的最清楚，最深入的实验动物。小鼠具有较短的生长期，繁殖维持相对容易，且小鼠基因组与人基因组中相应基因中的对应率也在98％以上。随着近年来基因修饰技术领域的突破性进展，基因编辑技术的发展和应用，利用基因修饰构建的疾病模型小鼠数正以惊人的速度增加。这些疾病动物模型成为科研人员研究疾病的发生机制、预防和治疗措施以及生物药品的研究和筛选的重要工具，是生物医学研究一个不可缺少的组成部分。
由于基因修饰小鼠模型可能只是研究某一段时间，后期或许会再次使用。若是采用传统活体保种方法，消耗大量人力物力资源，而且自然灾害、意外微生物污染都可能使这些品系毁于一旦。另外，特殊的遗传形状在繁育过程中也可能因遗传漂变而丧失。精子冷冻保种是一种应用于基因修饰小鼠的保种方法。复苏后的精子通过体外受精，获得受精卵后移植到假孕母鼠体内。
精子冷冻技术方便、快速，无需特殊仪器设备，其应用前景相当广阔，但是根据国内外相关实验室结果显示：小鼠精子冷冻复苏效率与遗传背景关系很大，近交系小鼠C57BL/6J的冻融精子复苏受精效率最差，不采用辅助受精技术，几乎不能达到保种要求。而C57BL/6J作为是一种常规的近交品系实验鼠。因其基因序列清楚，品系稳定和易于繁殖，是基因修饰小鼠疾病模型构建中的广泛使用背景鼠。冻融后精子受精率差主要是由于复苏后其形态、大小、顶体膜通透性发生变化，ROS的影响、精子存活率、活动力给体外受精过程带来极大障碍。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于促进小鼠冷冻精液受精的组合物。
本发明的第一个目的是提供一种精子获能液。
本发明的第二个目的是提供一种精子体外受精液。
本发明的第三个目的是提供一种用于促进C57BL/6小鼠冷冻精液受精的组合物。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明要求保护一种精子获能液，所述精子获能液为在mHTF液中加入0.01～0.05mg/ml PVA和0.5～0.75mM甲基-β-环化糊精。
PVA普遍作为血清替代品，常规血清中含有许多不明物质，而且不同批次和来源也直接影响培养的效果。在该无血清的系统中，PVA作为一种人工合成大分子物质，可以避免精子在无蛋白或表面活性剂的情况下彼此发生黏连或贴于培养皿底壁的作用。
MBCD(methyl-beta-cyclic dextrin，MBCD)作为一种胆固醇受体，它是一种由7个β(1，4)-吡喃糖单元组成的环化寡聚多糖，能够选择性吸取精子质膜中的胆固醇，在精子获能过程中支持信号传导作用。同时胆固醇的外流使质膜中的胆固醇与磷脂比率明显降低，刺激膜上的跨膜信号通路，激活腺苷酸环化酶催化ATP形成cAMP和激活络氨酸激酶，引起鞭毛蛋白质络氨酸磷酸化，增强精子运动能力并引起了顶体反应，从而使精子获得了完整的受精能力。
优选地，所述精子获能液为mHTF液中加入0.01mg/ml PVA和0.75mM甲基-β-环化糊精。
更优选地，所述mHTF液(常规体外受精液)含有以下成分：100～120mM NaCl；4.0～6.0mM KCl；0.2～0.5mM KH2PO4；0.1～0.3mM MgSO4·7H2O；20～30mM NaHCO3；1～5mMCaCl2·2H2O；2～3.5mM Glucose；0.1～0.5mM Na pyruvate；20～25mM Na Lactate(60％)；0.1～0.2mg/ml Hypotaurine；0.1～0.2mg/ml PenicillinG·K salt；1～3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
更优选地，所述精子获能液为：0.01～0.05mg/ml PVA、0.5～0.75mM甲基-β-环化糊精、100～120mM NaCl；4.0～6.0mM KCl；0.2～0.5mM KH2PO4；0.1～0.3mM MgSO4·7H2O；20～30mM NaHCO3；1～5mM CaCl2·2H2O；2～3.5mM Glucose；0.1～0.5mM Na pyruvate；20～25mM Na Lactate(60％)；0.1～0.2mg/ml Hypotaurine；0.1～0.2mg/ml PenicillinG·K salt；1～3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
进一步更优选地，所述mHTF液(常规体外受精液)含有以下成分：101.6mM NaCl；4.7mM KCl；0.4mM KH2PO4；0.2mM MgSO4·7H2O；25mM NaHCO3；2mM CaCl2·2H2O；2.8mMGlucose；0.3mM Na pyruvate；23.3mM Na Lactate(60％)；0.11mg/ml Hypotaurine；0.1mg/ml PenicillinG·K salt；3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
进一步更优选地，所述所述精子获能液为：0.01mg/ml PVA、0.75mM甲基-β-环化糊精、101.6mM NaCl；4.7mM KCl；0.4mM KH2PO4；0.2mM MgSO4·7H2O；25mM NaHCO3；2mMCaCl2·2H2O；2.8mM Glucose；0.3mM Na pyruvate；23.3mM Na Lactate(60％)；0.11mg/mlHypotaurine；0.1mg/ml PenicillinG·K salt；3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
更优选地，精子获能液还含有青霉素G，青霉素为抗生素，用于抑制细菌等微生物的生长。
进一步更优选地，青霉素G的用量为0.1mg/ml。
本发明还要求保护一种精子体外受精液，所述精子体外受精液为在mHTF液中加入1.0～2.0mM还原型谷胱甘肽。
GSH具有抗氧化作用，能显著提高小鼠冷冻解冻精子质膜、顶体膜和DNA的完整性。通过清除精细胞中的ROS(活性氧自由基)和减少精细胞内抗氧化酶泄露来达到保护精细胞免受过多氧化物质损害的目的。另一方面受精过程中，适当浓度的还原型谷胱甘肽可提高小鼠卵母细胞的精子穿透率、精子头部的解压缩和卵母细胞质中精子染色质的分散以及雄原核的形成。GSH能促进卵母细胞体外受精和胚胎早期发育，显著提高囊胚发育率。
优选地，所述精子体外受精液为在mHTF液中加入1.0mM还原型谷胱甘肽。
更优选地，所述mHTF液(常规体外受精液)含有以下成分：100～120mM NaCl；4.0～6.0mM KCl；0.2～0.5mM KH2PO4；0.1～0.3mM MgSO4·7H2O；20～30mM NaHCO3；1～5mMCaCl2·2H2O；2～3.5mM Glucose；0.1～0.5mM Na pyruvate；20～25mM Na Lactate(60％)；0.1～0.2mg/ml Hypotaurine；0.1～0.2mg/ml PenicillinG·K salt；1～3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
更优选地，所述精子体外受精液为：1.0～2.0mM还原型谷胱甘肽、100～120mMNaCl；4.0～6.0mM KCl；0.2～0.5mM KH2PO4；0.1～0.3mM MgSO4·7H2O；20～30mM NaHCO3；1～5mM CaCl2·2H2O；2～3.5mM Glucose；0.1～0.5mM Na pyruvate；20～25mM Na Lactate(60％)；0.1～0.2mg/ml Hypotaurine；0.1～0.2mg/ml PenicillinG·K salt；1～3mg/mlBSA，pH值为7.34±0.10。
进一步更优选地，所述mHTF液(常规体外受精液)含有以下成分：101.6mM NaCl；4.7mM KCl；0.4mM KH2PO4；0.2mM MgSO4·7H2O；25mM NaHCO3；2mM CaCl2·2H2O；2.8mMGlucose；0.3mM Na pyruvate；23.3mM Na Lactate(60％)；0.11mg/ml Hypotaurine；0.1mg/ml PenicillinG·K salt；3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
更优选地，所述精子体外受精液为：1.0mM还原型谷胱甘肽、101.6mM NaCl；4.7mMKCl；0.4mM KH2PO4；0.2mM MgSO4·7H2O；25mM NaHCO3；2mM CaCl2·2H2O；2.8mM Glucose；0.3mM Na pyruvate；23.3mM Na Lactate(60％)；0.11mg/ml Hypotaurine；0.1mg/mlPenicillinG·K salt；3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
所述精子体外受精液的配制方法，其配制方法是：称量3mg GSH，加入130μL mHTF制成25mM GSH浓储液，在使用当天稀释，至GSH为1.0mM。
本发明还要求保护一种用于促进小鼠冷冻精液受精的组合物，包括所述的精子获能液和述的精子体外受精液。
优选地，所述小鼠为C57BL/6J小鼠。
其使用包括以下步骤：
S1.预平衡待受精精液滴：
S11.制作精子获能液液滴、体外受精液(GSH/mHTF)液滴、常规体外受精液(mHTF液)液滴，37℃，5％CO2培养箱预平衡30～40min，其中各种液滴均为100～150μL/滴。
S12.取冻融精子37℃水浴复苏后，置入平衡后的精子获能液液滴中获能1～1.5h。
S2.卵子超排和收集
S21.每只供卵鼠2:00pm～6:00pm腹腔注射7.5IU-10IU孕马血清促性腺激素；48h后腹腔注射7.5IU-10IU绒毛膜促性腺激素，这一操作无需考虑动物房光周期，应根据采卵时间安排注射时间。
S22.注射HCG后15～17h采卵进行受精：取雌鼠处死，撕开输卵管的卵丘团放入预平衡好的体外受精液(GSH/mHTF)液滴中(一般每个受精滴中放置3个卵丘团)。
S3.体外受精
用移液器吸取获能后的精子悬液6～8μl，加入到含有卵细胞的体外受精滴(GSH/mHTF)液滴中，37℃，5％CO2培养箱受精4～6h。用胚胎转移管清洗受精卵，转移到常规体外受精滴(mHTF液)中过夜培养，继续受精。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中使用的精子获能液可以显著保护质膜和顶体完整性，减少ROS的影响，显著提高精子存活率、活动力，结合本发明的含有还原性谷胱甘肽的体外受精液，显著提高以近交系C57BL/6J为背景的基因修饰小鼠冻融后精子的体外受精成功率，受精后二细胞发育率在60～65％之间。
附图说明
图1为利用计算机辅助分析技术对小鼠冻融复苏后精子在不同的培养液中获能后，随着时间变化不同时间平均曲线速度统计图。
图2为利用计算机辅助分析技术对小鼠冻融复苏后精子在不同的培养液中获能后，随着时间变化不同时间平均直线速度统计图。
图3为利用计算机辅助分析技术对小鼠冻融复苏后精子在不同的培养液中获能后，随着时间变化不同时间平均运动路径速度统计图。
图4为通过计算机辅助分析系统(CASA)分析精子在不同培养的培养中，不同的获能时间的运动参数。
图5为金霉素荧光染色法检测小鼠精子获能状态结果图(1000×，标尺＝10μm)，A为未发生顶体反应的精子，精子显示均匀明亮的绿色荧光；B为获能的精子，头部显示无荧光，精子后端显示绿色荧光；C已反应性顶体，只有顶体赤道面呈现绿色荧光；精子头部无或低荧光。
图6为小鼠体外受精4小时后受精情况观察，其中A为低倍镜下体外受精成功的卵可见第二极体排出，该指征可作为判断是否受精成功的标准之一(200×，标尺＝100μm)；B为高倍镜观测受精成功的卵，可见雄原核和雌原核(400×，标尺＝50μm)；C为体外受精过夜培养后第二天低倍镜观察二细胞发育情况(200×，标尺＝100μm)。
图7为不同浓度的GSH(0mmol/L作为对照组，1.0mmol/L实验组，2.0mmol/L实验组)作为体外受精培养液的受精率，二细胞率，卵裂率统计图。
图8为不同浓度的GSH(0mmol/L作为对照组，1.0mmol/L实验组，2.0mmol/L实验组)作为体外受精培养液的受精率，二细胞率，卵裂率统计图
图9为不同浓度的GSH(0mmol/L作为对照组，1.0mmol/L实验组，2.0mmol/L实验组)作为体外受精培养液的受精率，二细胞率，卵裂率统计图
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明中所用的SPF级C57BL/6J种鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0006】，饲养于中山大学实验动物中心(东校区)二楼SPF繁育区【SYXK(粤)2016-0112】。在实验过程中严格遵照动物实验的伦理要求,并按实验动物使用的3R原则设计方案。动物饲养设施光照周期为每天光周期为7:00～19:00。屏障SPF小鼠饲料为辐照料，饮用超滤水、笼器具、垫料等均经121℃高压灭菌,饲养环境温度20-26℃,湿度40％～70％。
矿物油(Lot.M-8140sigma)；孕马血清促性腺激素(PMSG，宁波第二激素厂)；绒毛绒毛膜促性腺激素(HCG宁波第二激素厂)；还原型谷胱甘肽GSH(Lot.M-8140sigma)；
CO2培养箱(Labotect C16)；计算机辅助精液分析系统(CASA)；体视显微镜(zeissSteREO Discovery.V8)；高级全自动数字显微镜(zeiss Observer D1)；培养皿(BD Falcon351008)。
实施例1一种精子获能液
101.6mM NaCl；4.7mM KCl；0.4mM KH2PO4；0.2mM MgSO4·7H2O；25mM NaHCO3；2mMCaCl2·2H2O；0.01mg/ml PVA(polyvinyl alcohol聚乙烯醇)；2.8mM葡萄糖(Glucose)；0.3mM丙酮酸钠(Na pyruvate)；23.3mM 60％乳酸钠(60％Na Lactate)；0.11mg/ml亚牛磺酸(Hypotaurine)；0.1mg/ml青霉素G(PenicillinG·K salt)；0.75mM MBCD(Methyl-β-cyclodextrin甲基-β-环糊精)，pH值为7.34±0.10。
实施例2一种精子获能液
120mM NaCl；6.0mM KCl；0.5mM KH2PO4；0.3mM MgSO4·7H2O；30mM NaHCO3；5mMCaCl2·2H2O；0.05mg/ml PVA(polyvinyl alcohol聚乙烯醇)；3.5mM葡萄糖(Glucose)；0.3mM丙酮酸钠(Na pyruvate)；25mM 60％乳酸钠(60％NaLactate)；0.2mg/ml亚牛磺酸(Hypotaurine)；0.2mg/ml青霉素G(PenicillinG·K salt)；0.75mM MBCD(Methyl-β-cyclodextrin)，pH值为7.34±0.10。
实施例3一种精子获能液
100mM NaCl；4.0mM KCl；0.2mM KH2PO4；0.1mM MgSO4·7H2O；20mM NaHCO3；1mMCaCl2·2H2O；0.05mg/ml PVA(polyvinyl alcohol聚乙烯醇)；2mM葡萄糖(Glucose)；01mM丙酮酸钠(Na pyruvate)；20mM 60％乳酸钠(60％Na Lactate)；0.1mg/ml亚牛磺酸(Hypotaurine)；0.1mg/ml青霉素G(PenicillinG·K salt)；0.5mM MBCD(Methyl-β-cyclodextrin)，pH值为7.34±0.10。
实施例4一种体外受精液(GSH/mHTF)
101.6mM NaCl；4.7mM KCl；0.4mM KH2PO4；0.2mM MgSO4·7H2O；25mM NaHCO3；2mMCaCl2·2H2O；2.8mM Glucose；0.3mM Na pyruvate；23.3mM Na Lactate(60％)；0.11mg/mlHypotaurine；0.1mg/ml PenicillinG·K salt；1.0mmol/L还原型谷胱甘肽；3mg/ml BSA，pH值为7.34。
实施例5一种体外受精液(GSH/mHTF)
100mM NaCl；4.0mM KCl；0.2mM KH2PO4；0.1mM MgSO4·7H2O；20mM NaHCO3；1mMCaCl2·2H2O；2mM Glucose；0.1mM Na pyruvate；20mM Na Lactate(60％)；0.1mg/mlHypotaurine；0.1mg/ml PenicillinG·K salt；1.5mmol/L还原型谷胱甘肽；1mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
实施例6一种体外受精液(GSH/mHTF)
120mM NaCl；6.0mM KCl；0.5mM KH2PO4；0.3mM MgSO4·7H2O；30mM NaHCO3；5mMCaCl2·2H2O；3.5mM Glucose；0.5mM Na pyruvate；25mM Na Lactate(60％)；0.2mg/mlHypotaurine；0.2mg/ml PenicillinG·K salt；2.0mmol/L还原型谷胱甘肽；3mg/ml BSA，pH值为7.34±0.10。
对比例常规体外受精液(mHTF)
101.6mM NaCl；4.7mM KCl；0.4mM KH2PO4；0.2mM MgSO4·7H2O；25mM NaHCO3；2mMCaCl2·2H2O；2.8mM Glucose；0.3mM Na pyruvate；23.3mM Na Lactate(60％)；0.11mg/mlHypotaurine；0.1mg/ml PenicillinG·K salt；1.0mmol/L还原型谷胱甘肽；3mg/ml BSA，pH值为7.34。
实施例7
一、实验方法
利用计算机辅助精液分析系统(CASA)对C57BL/6J为背景的基因修饰小鼠精子在配制的体外预孵液中，不同培养时间下的精子运动参数，目的在于探究C57BL/6J背景小鼠冷冻精子复苏后最佳预孵培养液以及最佳获能时间，以筛选精子获能过程最佳培养液。
共设置三种培养液包括：商品化的HTF培养液(HTF)、对比例的常规体外受精液(mHTF)、和实施例1的精子获能液。
精子复苏过程的具体做法为：
(1)用镊子从液氮罐中取出保存有精子的麦管，在空气中静置5～7秒钟。
(2)将麦管中有冻存精子位置一端朝下立刻置入37℃恒温水浴杯中，确保恒温水浴杯温度始终保持37℃，由于复苏后精子至少在37℃加热5min以上运动能力才能很好恢复，要保证麦管静置温浴至少10min。
(3)从37℃恒温水浴杯中取出麦管，用吸水纸把麦管表面水分擦干。
(4)剪开麦管内保存精子位置远端的封口，将断口位置连接注射器装置。
(5)切断精子悬液与封口中间位置，慢慢按下注射器内筒。把精子悬浊液推进预孵培养液中。
复苏后的精子放入37℃，5％CO2培养箱中，分别设置0h、0.5h、1h、1.5h四个时间比较不同培养时间，筛选精子最佳获能时间。其中0h为空白对照。利用计算机辅助精液分析系统(CASA)分析精子在不同体外培养液中，不同培养时间下的精子运动参数。
二、实验结果
实验结果：检测的小鼠精子运动速度参数有平均曲线速度(curvilinear-velocity，VCL)，平均直线速度(straight-line velocity，VSL)和平均运动路径速度(average path velocity，VAP)，照相速度60帧秒，数据为10帧连续照片的平均值。用SPSSV16.0软件进行统计学分析，数据以平均数±标准差
Figure BDA0002288157380000081
表示，数据检验采用单因素方差分析，n＝5，**/&&P﹤0.01表示差异显著。
根据CASA测定的在不同条件下精子获能各时间段运动参数分析，以近交系C57BL/6J为背景的基因修饰小鼠冻融后精子获能时间为1h左右。
精子获能的过程是一个超级激活的过程，主要表现为鞭毛的摆动幅度逐渐加大。呈现一种非常“强有力”的运动方式，频率逐渐降低，运动轨迹表现出不对称，这种强有力的激烈的摆动与前向运动方式，使得这些获能精子能够在受精的时候可以从被覆的大量粘附物中解脱出来。
根据CASA获得的数据分析小鼠精子获能过程中运动模式以及运动参数的变化，进一步研究培养液中各种成分是否参与了精子激活运动的调节。检测获得的数据主要有精子运动速度参数有VCL(平均曲线速度)、VSL(平均直线速度)和VAP(运动路径速度)，三者均是以精子头部活动值作为参照，具有高度的相关性。其中VCL(平均曲线速度)为衡量精子活动的重要关键指标，用来测定单位时间内精子头部运动距离或者相对位移。
利用实施例1的精子获能液进行获能反应，各时间段内检测预孵液实验组的精子运动相关参数VCL、VSL和VAP相较于同时段HTF和mHTF实验组数据显著提高，有统计学差异(n＝5，&&P<0.01)。
如图1到图3所示，同个培养液根据培养时间的增加，在商品化HTF和配制的mHTF培养液中，精子运动的相关参数VCL、VSL和VAP未呈现出显著差异(n＝5，P>0.05)，表明商品化HTF和配制的mHTF培养液，精子未产生顶体反应和超激活反应。这两种培养液均不适合作为精子获能液使用。
利用实施例1的精子获能液进行获能反应，小鼠精子的运动参数VCL数值呈现出先上升再下降的趋势。0h和0.5h的数据显示有统计学差异(n＝5，**P<0.01)，0h和1h的数据显示有统计学差异(n＝5，**P<0.01)，0h和1.5h的数据显示有统计学差异(n＝5，**P<0.01)。说明使用实施例1的精子获能液进行获能反应，小鼠精子运动参数发生了变化，并随着培养时间的增加，主要表现在精子头部运动能力显著增加，表现出获能和超激活反应。
根据CASA检测获得的数据分析，表明该配方精子获能液可以显著保护质膜和顶体完整性，减少ROS的影响，显著提高精子存活率、活动力。
实施例8
一、实验方法
利用计算机辅助精液分析系统(CASA)对C57BL/6J为背景的基因修饰小鼠精子在实施例1的精子获能液中，不同的培养时间下检测精子运动参数，照相速度60帧/秒，收集的数据为8帧连续照片的平均值。
精子运动参数包括VCL(曲线运动速度)、VSL(直线运动速度)、VAP(平均运动速度)、LIN(线性指数)、STR(直线指数)、ALH(侧摆幅度)和BCF(鞭打频率)。
(1)直线运动速度VSL(straight-line velocity，μm/s)，主要是单位时间内精子从运动起点到运动终点的直线距离。
(2)曲线运动速度VCL(curvilinear-velocity，μm/s)，主要是精子在单位时间内所经过的实际运动轨迹距离总和。
(3)平均运动速度VAP(average path velocity，μm/s)，主要是精子在单位时间内的平均轨迹距离总和。
(4)直线性LIN(linearity，LIN＝VSL/VCL)，主要是精子实际运动路径的直线程度，数值越大代表运动路径趋向直线，范围在0-1之间。
(5)前向性STR(straightness，STR＝VSL/VAP)，主要是精子向前运动的程度，数值越大表示精子前向能力越好，值越小表示精子在原地打转，范围在0-1之间。
(6)侧摆幅度ALH(lateral amplitude，μm)，主要是精子在运动过程中实际运动轨迹相对其平均移动轨迹的偏移幅度。
(7)鞭打频率BCF(beat cross frequency)，主要是单位时间内精子曲线运动轨迹越过其平均路径轨迹的次数。
二、实验结果
使用实施例1的精子获能液，通过计算机辅助分析系统(CASA)结果表明，以C57BL/6J为背景的基因修饰小鼠精子最佳获能时间为1h左右，该培养时间范围平均曲线运动速度VCL最快，数据为(155.8±1.38)μm/s。具体参数见表1。
表1不同孵育时间复苏后精子在获能液中的运动参数：
Figure BDA0002288157380000101
Figure BDA0002288157380000111
根据计算机辅助分析系统(CASA)运动参数对复苏后精子获能孵育1h后运动能力进行分级，见图4。
精子在获能液中获能后，会产生生理性改变，包括钙离子浓度变化，蛋白磷酸化，顶体基质和膜重组，从而有利于精子穿透卵细胞。其中顶体反应，是指当精子接近卵子实施授精时，精子头部前半端的帽状结构顶体，释放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。获能/顶体反应测试是一项稳定的精子功能参数，可以用于预测受精成功率。因此顶体的结构完整性是评价的主要标志，利用金霉素(chlortetracycline；CTC)荧光染料染色技术，是检测精子获能状态，以及精子头部顶体状态分析的最常用的方法。通过常用的荧光显微镜便可清晰观察到绿色顶体状态(status)。精子顶体反应结果分析见表2，染色结果见图5。
表2精子顶体形态/获能金霉素(CTC)荧光染色：
Figure BDA0002288157380000112
实施例9一种提高冷冻精子复苏获能反应和体外受精率方法的优化
一、实验方法
1、预平衡待受精精液滴
(1)制作精子获能液液滴、体外受精液(GSH/mHTF)液滴、常规体外受精液(mHTF)液滴，37℃，5％CO2培养箱预平衡30～40min，其中各种液滴均为100～150μL/滴。
(2)取冻融精子37℃水浴复苏后，置入平衡后的精子获能液液滴中获能1～1.5h。
2、卵子超排和收集
(1)每只供卵鼠2:00pm～6:00pm腹腔注射7.5IU-10IU孕马血清促性腺激素；48h后腹腔注射7.5IU-10IU绒毛膜促性腺激素，这一操作无需考虑动物房光周期，应根据采卵时间安排注射时间。
(2)注射HCG后15～17h采卵进行受精：取出输卵管的卵丘团放入预平衡好的体外受精液(GSH/mHTF)液滴中(一般每个受精滴中放置3个卵丘团)。
3、体外受精
(1)用移液器吸取获能后的精子悬液6～8μl，加入不同浓度的GSH作为体外受精培养液中(0mmol/L作为对照组，1.0mmol/L实验组，2.0mmol/L实验组)，筛选合适浓度的GSH/mHTF作为培养液，37℃，5％CO2培养箱受精4～6h。用胚胎转移管清洗受精卵，转移到常规体外受精滴(mHTF)中过夜培养，继续受精。
(2)受精成功的胚胎可以观察到第二极体排出(图6A)，在显微镜下看到雄原核和雌原核(图6B)。第二天检测受精卵是否进入二细胞(图6C)。
二、实验结果
用SPSS V16.0软件进行统计学分析，数据以平均数±标准差
Figure BDA0002288157380000121
表示，各组间差异比较采用单因素方差分析，**P﹤0.01表示差异显著。统计各对照组和实验组体外受精率(100％×第二极体排出的卵数/总的卵数)(图7)、二细胞分裂率(100％×二细胞数/总的卵数)(图8)、培养2.5d卵裂情况并记录胚胎卵裂分化率(100％×卵裂胚胎数/总的卵数)(图9)。
根据统计结果分析，添加GSH的两个实验组的体外受精率和二细胞率均显著高于未添加GSH的对照组(n＝5，**P<0.01)。
因此表明本发明中含有还原性谷胱甘肽的体外受精液，显著提高以近交系C57BL/6J为背景的基因修饰小鼠冻融后精子的体外受精成功率。其中mHTF中添加入适量浓度1.0mmol/L的GSH(即实施例4的体外受精液(GSH/mHTF)，其体外受精率相较未添加对照组组显著提高(n＝5，**P<0.01)由30.0％增至65.9％，二细胞率由27.3％增至60.7％，卵裂率由21.0％增至58.1％。
然而添加高浓度的GSH(2.0mmol/L)可能造成相反作用，与添加1.0mmol/L的GSH实验组相比卵裂率由58.1％降至36.0％，这是由于体外受精过程中精子浓度很高，高浓度的GSH容易造成多精受精，胚胎受精后也可观察到极体和雄原核，部分可以正常发育到二细胞，但随后发育过程会出现异常卵裂，发育阻滞等情况。
因此认为在体外受精液中添加1.0mmol/L GSH更有利于冻融小鼠精子复苏后体外受精的精卵结合，提高受精率，卵裂率以及受精后胚胎发育能力。
实施例10一种提高冷冻精子复苏获能反应和体外受精率的方法
1、预平衡待受精精液滴
(1)制作精子获能液液滴、体外受精液(GSH/mHTF)液滴、常规体外受精液(mHTF)液滴，37℃，5％CO2培养箱预平衡30～40min，其中各种液滴均为100～150μL/滴。
(2)取冻融精子37℃水浴复苏后，置入平衡后的精子获能液液滴中获能1～1.5h。
2、卵子超排和收集
(1)每只供卵鼠2:00pm～6:00pm腹腔注射7.5IU-10IU孕马血清促性腺激素；48h后腹腔注射7.5IU-10IU绒毛膜促性腺激素，这一操作无需考虑动物房光周期，应根据采卵时间安排注射时间。
(2)注射HCG后15～17h采卵进行受精：
取雌鼠处死，撕开输卵管的卵丘团放入预平衡好的体外受精液(GSH/mHTF)液滴中(一般每个受精滴中放置3个卵丘团)。
3、体外受精
用移液器吸取获能后的精子悬液6～8μl，加入到含有卵细胞的体外受精滴(GSH/mHTF)液滴中，37℃，5％CO2培养箱受精4～6h。用胚胎转移管清洗受精卵，转移到常规体外受精滴(mHTF)中过夜培养，继续受精。

Claims (5)

1.一种精子获能液，其特征在于，所述精子获能液为在mHTF液中加入0.01～0.05mg/mlPVA和0.5～0.75mM甲基-β-环化糊精。
2.根据权利要求1所述的精子获能液，其特征在于，所述精子获能液为mHTF液中加入0.01mg/ml PVA和0.75mM甲基-β-环化糊精。
3.一种精子体外受精液，其特征在于，所述精子体外受精液为在mHTF液中加入1.0～2.0mM还原型谷胱甘肽。
4.根据权利要求3所述的精子体外受精液，其特征在于，所述精子体外受精液为在mHTF液中加入1.0mM还原型谷胱甘肽。
5.一种用于促进小鼠冷冻精液受精的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的精子获能液和权利要求3所述的精子体外受精液。
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