CN109913405B

CN109913405B - 腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂中的应用

Info

Publication number: CN109913405B
Application number: CN201910238141.XA
Authority: CN
Inventors: 钱云; 王晖; 杨继虹; 冯婷
Original assignee: 2nd Affiliated Hospital of Nanjing Medical University
Current assignee: 2nd Affiliated Hospital of Nanjing Medical University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2039-03-27
Also published as: CN109913405A

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂中的应用。将腺苷应用于制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂和制备胚胎培养液中，卵母细胞ROS水平下降、减数分裂缺陷减少，胚胎质量提高、囊胚质量改善，表明在胚胎形成的过程中加入腺苷，具有促进胚胎形成或提高胚胎质量的生物学功能。

Description

腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及腺苷的应用，具体涉及一种腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂中的应用。

背景技术

常规体外受精-胚胎移植技术经过30多年的发展和改善，从技术上解决了不孕不育等长期困惑的医学难题，然而体外受精-胚胎移植常规治疗中，为了保证一定的临床妊娠率，实行2-3枚卵裂期胚胎移植已是惯例。因此，近30年来人群总体双胎妊娠率增加了50％-70％，三胎妊娠率增加了400％，而多胎妊娠已严重威胁了母婴安全，近年来母体妊娠期并发症上升了3-7倍，新生儿死亡率及发病率上升了4-10倍，大大增加患者及社会的经济负担。因此提高IVF临床妊娠率的同时又能避免多胎妊娠的问题一直是世界各国辅助生殖工作者共同面临的挑战。

多年研究表明，规避多胎妊娠风险又能保证临床妊娠率有效的方法就是减少移植胚胎数量，优选胚胎已经成为胚胎实验室迫切而重要的临床工作。形态学评估直观简便，最常参照仍是以碎片、卵裂球均一度为指标的形态学分级标准，是胚胎选择最为常用的方法。这些方法往往主观性太强，限制了胚胎评估的精度；而胚胎植入前遗传学筛查技术又具有侵入性，因此寻找一种非侵入性的、可信的、快速的胚胎评估方法至关重要。已有的许多研究表明，卵泡液及胚胎培养液中的代谢组份变化在一定程度上能够评估及预测胚胎的发育潜能及妊娠结局。颗粒细胞与卵母细胞密切相关，通过缝隙连接可向卵母细胞提供其生长发育所需要的离子、小分子物质以及抗氧化物，间接反映卵母细胞状态，其内的某些代谢物质也有可能成为反映卵母细胞质量的分子标记物。然而对于颗粒细胞的代谢研究甚少，因此寻找并建立一种可信的代谢组学胚胎评估及预测模型，用以提高胚胎形成、改善胚胎质量是辅助生殖研究者一直追求的目标，将大大推进代谢组学分析在IVF中的应用。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供了腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂中的应用，将腺苷应用于制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂和制备胚胎培养液中，卵母细胞ROS水平下降、减数分裂缺陷减少，胚胎质量提高、囊胚质量改善，表明在胚胎形成的过程中加入腺苷，具有促进胚胎形成或提高胚胎质量的生物学功能。

本发明的第二个目的是提供一种胚胎培养液，该胚胎培养液中含有腺苷。

本发明的第三个目的是提供一种能促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物组合物，该药物组合物以腺苷为活性成分，辅以药学上可接受的辅料。

本发明的技术方案如下：

腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂中的应用。例如，药物可以制成固体制剂或者液体制剂。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，药物可以制成粉剂、颗粒剂或注射剂。腺苷粉剂和腺苷颗粒剂的差别较小，可以与溶剂直接配成液体在药物或培养液中直接使用。

本发明可以提供一种胚胎培养液，该胚胎培养液中含有腺苷。例如，在一种优选方案中，在M2培养液中添加腺苷。本发明可以在胚胎细胞形成过程中，增加M2培养液中腺苷的浓度，改善卵母细胞质量和促进胚胎发育。在一种优选方案中，胚胎培养液中腺苷的浓度为5～40μM。优选的，胚胎培养液中腺苷的浓度为5～20μM。特别优选的，胚胎培养液中腺苷的浓度为10μM。

腺苷是一种核糖核苷，普遍存在于细胞内和细胞外液，可作为DNA和RNA的组成成分、辅酶因子及第二信使在许多代谢过程中发挥重要作用，而在生殖细胞中尚无其相关功能报道。生物信息学分析及实验结果显示：①人群样本研究显示，在胚胎质量低下的颗粒细胞中腺苷含量出现堆积，对应的卵泡液中出现腺苷含量下降；②由于卵泡液即卵母细胞的外环境中腺苷含量下降，在动物实验中卵母细胞体外培养液中添加腺苷后，卵母细胞 ROS水平下降、减数分裂缺陷减少，胚胎质量提高、囊胚质量改善。可以表明小鼠卵母细胞体外培养液中加入腺苷，有促进胚胎形成的生物学功能。因此，腺苷可以在制备促进胚胎形成和/或提高胚胎质量的药物、制备胚胎培养液中应用；③由于腺苷主要通过转运载体ENTs和CNTs转运进出细胞，其中，ENTs(ENT1，ENT2，ENT3和ENT4)顺浓度梯度转运，CNTs(CNT1，CNT2和CNT3)则逆浓度梯度通过钠离子通道转运，对细胞内外腺苷浓度的调节起关键作用，尤其是ENT1和ENT2。我们在卵母细胞体外培养液中添加腺苷，12小时后检测卵母细胞中的腺苷含量和转运载体无明显变化，表明外源性腺苷不是通过进入细胞增加腺苷含量发挥作用；④而细胞表面存在腺苷受体，研究表明腺苷可通过结合不同受体，发现不同的生物学作用。我们在胚胎培养液中添加腺苷的同时添加腺苷受体拮抗剂咖啡因，作用一段时间后进行体外受精，结果显示咖啡因降低了腺苷对胚胎发育的作用，间接证明了腺苷是通过其表面受体发挥作用的。

本发明提及的胚胎为哺乳动物的胚胎，例如人的胚胎或小鼠的胚胎。

本发明提供腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物中的应用。例如，药物可以制成固体制剂或者液体制剂。将腺苷制备成多种形态的固体制剂，方便运输和存储，使给药方式更简便，给药过程更省时、省力，保证给药剂量准确；此外还可以拓宽腺苷的给药途径，增强腺苷的使用效果。腺苷作为药物，可以制成固体制剂或者液体制剂，主要由腺苷和药学上可接受的辅料制备得到，其制备方法具有制备工艺简单、耗时短、成本低等优点，便于后期进行批量生产。进一步的，在本发明提供的技术方案的基础上，上述腺苷固体制剂的剂型包括粉剂或颗粒剂。

在一种方案中，在本发明提供的技术方案的基础上，上述腺苷固体制剂为腺苷粉剂，包括以下重量份数的原料：腺苷0.1-80份和粉剂助剂60.2-110.5份。本发明提及的粉剂助剂包括但不局限于抗氧化剂和分散载体。在一种优选方案中，腺苷粉剂包括以下重量份数的原料：腺苷0.1-80份、抗氧化剂0.3-5份和分散载体81-97.9份。优选地，抗氧化剂包括聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、维生素E油、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、亚硫酸钠或抗坏血酸棕榈酯中的一种或几种。优选地，分散载体包括淀粉、玉米粉、麦麸、小麦次粉、蔗糖、葡萄糖、肉骨粉、鱼粉或青草粉中的一种或几种。

在一种方案中，在本发明提供的技术方案的基础上，上述腺苷固体制剂为腺苷颗粒剂，包括以下重量份数的原料：腺苷0.2-70份和颗粒剂助剂50.2-140.5份。本发明提及的颗粒剂助剂包括但不局限于粘合剂、抗氧化剂和分散载体。在一种优选方案中，腺苷颗粒剂包括以下重量份数的原料：腺苷0.2-70份、粘合剂0.5-18份、抗氧化剂0.2-8份和分散载体61-94.4 份。优选地，粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮、糊精、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素、低聚果糖、预胶化淀粉、甲基纤维素或乙基纤维素中的一种或几种；优选地，抗氧化剂包括聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯、维生素E油、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、亚硫酸钠或抗坏血酸棕榈酯中的一种或几种；优选地，分散载体包括淀粉、玉米粉、麦麸、小麦次粉、蔗糖、葡萄糖、肉骨粉、鱼粉或青草粉中的一种或几种。

本发明提供的腺苷固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

将腺苷和药学上可接受的辅料混合，制备得到腺苷固体制剂；

优选地，腺苷粉剂的制备方法包括以下步骤：将配方量的腺苷和抗氧化剂加入溶剂溶解，再加入配方量的分散载体混合均匀后干燥，得到腺苷粉剂；

优选地，所述溶剂包括低碳醇，优选包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇、DMSO或甘油中的一种或几种，进一步优选为DMSO。

进一步的，在本发明提供的技术方案的基础上，上述腺苷液体制剂的剂型可以制成腺苷注射剂，包括以下原料：腺苷、渗透压调节剂和无菌注射用水。优选地，渗透压调节剂选自：氯化钠、氯化钾、硫酸钠、山梨醇、甘露醇中的一种或多种的组合。优选地，pH 调节剂选自枸橼酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种。在一种优选方案中，其中每支注射剂含有腺苷5mg～40mg，渗透压调节剂2.5mg～10.5mg， pH调节剂调节pH至4.5～6.5。

在一种方案中，在本发明提供的技术方案的基础上，上述腺苷液体制剂为腺苷注射剂，该注射剂的制备方法为将渗透压调节剂和腺苷溶解在注射用水中，搅拌至溶解，然后添加 pH调节剂将pH调节至4.5～6.5，无菌过滤、灌装，制成0.5ml至20ml的灭菌小容量注射剂。

本发明提供一种能促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物组合物，该药物组合物以腺苷为活性成分，辅以药学上可接受的辅料。该药物组合物可以为固体制剂或液体制剂，特别是粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、气雾剂或注射剂。药学上可接受的辅料在整个制剂技术发展过程中起到关键的作用，许多制剂中辅料占到大部分，因而很大程度上辅料的性质决定了制剂的性质。优良的辅料可以增强主药的稳定性，延长药剂的有效期；可以调控主药在体内外的释放速度；可以改变药物在体内的吸收，增加生物利用度，对具体的辅料类型不作限定。

采用本发明的技术方案，优势如下：

本发明将腺苷应用于制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂和制备胚胎培养液中，卵母细胞ROS水平下降、减数分裂缺陷减少，胚胎质量提高、囊胚质量改善，表明在胚胎形成的过程中加入腺苷，具有促进胚胎形成或提高胚胎质量的生物学功能。因此，腺苷可以在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或试剂、制备胚胎培养液中应用。外源性腺苷不是通过进入细胞增加腺苷含量发挥作用，而是与卵母细胞表面的腺苷受体结合降低ROS的产生和减数分裂缺陷，从而改善卵母细胞质量和胚胎发育。

附图说明

图1是腺苷对小鼠胚胎发育的影响(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；

其中，(a)腺苷对胚胎发育过程的影响；(b)腺苷对囊胚细胞总数的提高；(c)腺苷对囊胚凋亡细胞率的降低；

Fresh为新鲜对照组；Aged为对照组；Aged+D为溶剂对照组；Aged+A为实验组；

图2是外源性添加腺苷后细胞内腺苷含量及转运载体的变化(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；

其中，(a)腺苷含量变化；(b)腺苷转运载体的变化；(c)咖啡因的作用；

Fresh为新鲜对照组；Aged+D为溶剂对照组；Aged+A为实验组1；Aged+A+C为实验组2；

图3是人群颗粒细胞和卵泡液中腺苷含量的检测结果；

其中，(a)颗粒细胞中的腺苷含量；(b)卵泡液中的腺苷含量；

图4是腺苷对卵母细胞的作用(*P<0.05)；

其中，(a)腺苷对ROS的减弱作用；(b)腺苷对减速分裂缺陷的改善作用；

Fresh为新鲜对照组；Aged为对照组；Aged+D为溶剂对照组；Aged+A为实验组。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对腺苷在制备促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物或者试剂中的应用作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

以下实施例在培养液中添加的腺苷为腺苷粉剂，溶于DMSO，然后再用培养液进行稀释，37℃平衡后使用。

实施例1 腺苷对小鼠胚胎发育的影响

取8周ICR小鼠，注射PMSG，48h后注射hCG，16h后取材；在显微镜下于输卵管壶腹部取得卵团透明质酸酶消化颗粒细胞，清洗裸卵后平均分配放置事先于37℃，5％ CO₂中平衡好的M2(Aged：对照组)；、添加有DMSO的M2(Aged+D(Aged+DMSO)：溶剂对照组)以及添加有溶于DMSO中10μM腺苷的M2(Aged+A(Aged+Adenosine)：实验组)培养液中，12小时后进行体外受精。同时进行体外受精的还有即时取出的新鲜的卵母细胞(Fresh：新鲜对照组)。4组进行体外受精的精子均来源于同一只雄鼠。观察其胚胎发育过程，并对囊胚进行荧光染色统计，结果发现早期胚胎形成增多且囊胚质量改善(图1)。可见腺苷对小鼠胚胎发育具有明显的改善作用。

实施例2 外源性添加腺苷后细胞内腺苷含量及转运载体的变化

取8周ICR小鼠，注射PMSG，48h后注射hCG，16h后取材；在显微镜下于输卵管壶腹部取得卵团透明质酸酶消化颗粒细胞，清洗裸卵后平均分配放置事先于37℃，5％CO₂中平衡好的添加有DMSO的M2(Aged+D(Aged+DMSO)：溶剂对照组)、添加有溶于DMSO中10μM腺苷的M2(Aged+A(Aged+Adenosine)：实验组1)以及添加有溶于 DMSO中10μM腺苷和咖啡因的M2(Aged+A+C(Aged+Adenosine+Caffeine)：实验组2) 培养液中，12小时后PBS清洗裸卵收集。同时Fresh组(Fresh：新鲜对照组)卵母细胞即时取出用透明质酸酶消化颗粒细胞、PBS清洗后收集。4组样本均保存于-80℃，等待进行代谢组学检测。结果显示卵母细胞内腺苷含量无明显增加，腺苷转运载体也无明显变化。同时在培养液中添加腺苷和腺苷受体拮抗剂咖啡因，结果显示腺苷对胚胎发育的作用被减弱，表明腺苷是通过其受体发挥作用(图2)。

实施例3 人群颗粒细胞和卵泡液中腺苷含量的检测及腺苷对卵母细胞质量的作用

收集流行病学信息正常范围的IVF人群的颗粒细胞和卵泡液，按照其第三天胚胎质量进行分组，以优质胚胎率40％分为高质量组和低质量组，代谢组学检测其内的腺苷含量，显示低质量组腺苷含量在颗粒细胞内增加而卵泡液内下降(图3)。

由于低质量组卵泡液中腺苷含量下降，鉴于卵泡液为卵母细胞的外环境，我们在动物实验卵母细胞体外培养液中添加腺苷(适宜浓度为10μM)。取8周ICR小鼠，注射PMSG，48h后注射hCG，16h后取材；在显微镜下于输卵管壶腹部取得卵团透明质酸酶消化颗粒细胞，清洗裸卵后平均分配放置事先于37℃，5％CO₂中平衡好的M2(Aged：对照组)、添加有DMSO的M2(Aged+D(Aged+DMSO)：溶剂对照组)以及添加有溶于DMSO中 10μM腺苷的M2(Aged+A(Aged+Adenosine)：实验组)培养液中12小时后进行ROS 荧光染色，同时Fresh组(Fresh：新鲜对照组)卵母细胞即时取出用透明质酸酶消化颗粒细胞、PBS清洗后直接进行ROS荧光染色，统计其荧光强度、α-tublin染色统计显示ROS 减弱、减数分裂缺陷减少(图4)。

可见腺苷对卵母细胞的质量有显著提升。

实施例4 腺苷粉剂

一种腺苷粉剂，包括以下重量份数的原料：腺苷56.6份、抗氧化剂(维生素E油)1.8份、抗氧化剂(没食子酸丙酯)0.6份、分散载体(玉米粉)24.5份和分散载体(肉骨粉) 44.5份。

上述腺苷粉剂的制备方法如下：将配方量的腺苷和抗氧化剂加入乙醇溶解，再加入配方量的分散载体混合均匀后干燥，得到腺苷粉剂。

实施例5 腺苷颗粒剂

一种腺苷颗粒剂，包括以下重量份数的原料：腺苷65.4份、粘合剂(羟丙甲纤维素)1.4份、粘合剂(预胶化淀粉)8.2份、抗氧化剂(二丁基羟基甲苯)0.4份、抗氧化剂(丁基羟基茴香醚)0.6份和分散载体(玉米粉)84.5份。

上述腺苷颗粒剂的制备方法如下：将配方量的腺苷和抗氧化剂加入甘油溶解，再加入配方量的分散载体和粘合剂混合均匀后制粒，干燥、整粒后、得到腺苷颗粒剂。

实施例6 腺苷注射剂

一种腺苷注射剂，单瓶剂量：总体积：1ml/瓶，腺苷量：10mg/瓶，如下所示：

腺苷10mg、渗透压调节剂(氯化钠)4.4mg、盐酸调节pH至4.5，注射用水适量。

上述腺苷液体制剂为腺苷注射剂，该注射剂的制备方法为将渗透压调节剂和腺苷溶解在注射用水中，搅拌至溶解，然后添加pH调节剂将pH调节至4.5，无菌过滤、灌装，制成1ml的灭菌小容量注射剂。

实施例7 腺苷注射剂

一种腺苷注射剂，单瓶剂量：总体积：5ml/瓶，腺苷量：20mg/瓶，如下所示：

腺苷20mg、渗透压调节剂(氯化钠)8.7mg、磷酸调节pH至6.5，注射用水适量。

上述腺苷液体制剂为腺苷注射剂，该注射剂的制备方法为将渗透压调节剂和腺苷溶解在注射用水中，搅拌至溶解，然后添加pH调节剂将pH调节至6.5，无菌过滤、灌装，制成5ml的灭菌小容量注射剂。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种能促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物组合物，其特征在于，该药物组合物为腺苷粉剂，包括以下重量份数的原料：腺苷56.6份、抗氧化剂维生素E油1.8份、抗氧化剂没食子酸丙酯0.6份、分散载体玉米粉24.5份和分散载体肉骨粉44.5份；上述腺苷粉剂的制备方法如下：将配方量的腺苷和抗氧化剂加入乙醇溶解，再加入配方量的分散载体混合均匀后干燥，得到腺苷粉剂。

2.一种能促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物组合物，其特征在于，该药物组合物为腺苷颗粒剂，包括以下重量份数的原料：腺苷65.4份、粘合剂羟丙甲纤维素1.4份、粘合剂预胶化淀粉8.2份、抗氧化剂二丁基羟基甲苯0.4份、抗氧化剂丁基羟基茴香醚0.6份和分散载体玉米粉84.5份；上述腺苷颗粒剂的制备方法如下：将配方量的腺苷和抗氧化剂加入甘油溶解，再加入配方量的分散载体和粘合剂混合均匀后制粒，干燥、整粒后、得到腺苷颗粒剂。

3.一种能促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物组合物，其特征在于，该药物组合物为腺苷注射剂为单瓶剂量，总体积为1 ml/瓶，腺苷量为10 mg/瓶，如下所示：腺苷10 mg、渗透压调节剂氯化钠4.4 mg、盐酸调节pH至4.5，注射用水适量；该注射剂的制备方法为将渗透压调节剂和腺苷溶解在注射用水中，搅拌至溶解，然后添加盐酸将pH调节至4.5，无菌过滤、灌装，制成1 ml的灭菌小容量注射剂。

4.一种能促进胚胎形成或提高胚胎质量的药物组合物，其特征在于，该药物组合物为腺苷注射剂为单瓶剂量，总体积为5 ml/瓶，腺苷量为20 mg/瓶，如下所示：腺苷20 mg、渗透压调节剂氯化钠8.7 mg、磷酸调节pH至6.5，注射用水适量；该注射剂的制备方法为将渗透压调节剂和腺苷溶解在注射用水中，搅拌至溶解，然后添加磷酸将pH调节至6.5，无菌过滤、灌装，制成5 ml的灭菌小容量注射剂。