CN113564103A

CN113564103A - 4,4’-二甲氧基查耳酮在延缓卵母细胞体内外老化中的应用

Info

Publication number: CN113564103A
Application number: CN202110532702.4A
Authority: CN
Inventors: 霍然; 李明芮; 刘露; 黄婕; 何安澜
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-05-17
Also published as: CN113564103B

Abstract

本发明公开了4,4’‑二甲氧基查耳酮在延缓卵母细胞体内外老化中的应用。4，4’‑二甲氧基查尔酮在制备延缓卵母细胞体外老化进程的试剂中的应用。4，4’‑二甲氧基查尔酮在制备改善生殖衰老的药物中的应用。本发明结果都表明DMC能够有效改善体外老化MII期卵母细胞质量，且体外受精实验验证培养基内添加DMC能有效提高老化MII期卵母细胞受精率和囊胚发育率。小鼠体外老化MII卵母细胞培养液中加入DMC，可有效延缓MII期卵母细胞体外老化进程，提高卵母细胞质量，高龄小鼠口服DMC能有效提高排卵数。

Description

4,4’-二甲氧基查耳酮在延缓卵母细胞体内外老化中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及4,4’-二甲氧基查耳酮在延缓卵母细胞体内外老化中的应用。

背景技术

卵母细胞的质量受到许多因素的影响，包括生活方式、环境和年龄等，其中年龄所致的卵母细胞质量下降是最主要且无法抗拒的因素。在女性晚婚晚育的社会大背景的推动下，与年龄有关的生育问题的影响越来越普遍。众所周知，女性生育力随着年龄增长显著下降，到35岁左右生育力急剧下降，这种与年龄有关的女性不育以卵巢功能逐渐下降为特征，与卵巢内卵母细胞数量的减少和质量的下降密切相关。高龄女性卵子质量的下降不仅导致不孕症发生率增加，还会导致染色体异常、胚胎停育、自然流产以及出生缺陷等发生率显著增高，严重危害了女性生殖健康。

卵母细胞老化存在两种形式，一种为体内老化，一种为成熟后(排卵后)卵母细胞老化。卵母细胞存在于卵巢中，由于卵巢衰老引起的卵母细胞老化为体内老化，体现为年龄相关的卵母细胞质量下降，该老化卵母细胞包括衰老卵巢内的未成熟卵母细胞和从衰老卵巢中排出的成熟卵母细胞；排卵后卵母细胞老化是由于在哺乳动物中，排卵后的成熟卵母细胞阻滞在第二次减数分裂的中期等待受精。卵母细胞受精存在一个最佳的时间窗，若排卵后卵母细胞长时间未受精，即会发生成熟后(排卵后)卵母细胞老化(Postovulatory aging，POA)，会损害卵母细胞的质量和受精后的胚胎发育，该类型的体外卵母细胞老化与年龄无关，而与排卵后的体外存放时间有关。一方面，在人和某些灵长动物中，由于没有可见的排卵迹象，因而没有适当的机制来确保精子输送到雌性生殖道和排卵的同步性，进而增加了体内老化的卵母细胞和新鲜的精子受精的可能性；另一方面，更多的情况是在体外环境下的辅助生殖技术(assisted reproductive technologies，ART)过程中，卵母细胞在受精前往往不可避免地要经过长时间的培养。比如，对受精失败的卵母细胞进行补救性ICSI(Intracytoplasmic sperm injection，卵胞浆内单精子显微注射技术)。POA会引起一系列生化和分子的改变，如活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累、抗凋亡蛋白BCL2表达的减少、caspase的激活、成熟促进因子(maturation-promoting factor，MPF)的表达降低等，此外，这一过程还会引起一系列类似于与年龄相关的卵巢衰老所致卵母细胞质量下降的功能结构缺陷，如纺锤体形态异常，染色体完整性缺失、线粒体功能障碍等，这些变化都会严重损害卵母细胞质量，导致受精能力下降、胚胎质量低下，增加早期妊娠丢失的风险，甚至影响子代的健康，ART的不良结局也常与POA 有关。

虽然卵巢衰老和排卵后卵母细胞老化导致的一系列卵母细胞质量改变的表现已基本确定，目前也仅发现少数有效的饮食或药理学干预措施能够部分缓解/逆转老化造成的卵母细胞质量改变，而且这些干预措施的安全性和临床应用前景还有待考量。比如，一项单中心、横切性的回顾性研究结果显示，在胚胎移植周期补充白藜芦醇与临床怀孕率下降和流产风险增加密切相关。因此目前迫切需要开发安全且有效延缓/逆转卵母细胞老化的新方法。

4，4’-二甲氧基查尔酮(4,4’-dimethoxychalcone，DMC)是一种从天然中草药明日叶中提取的黄酮类化合物，其化学式为C₁₇H1₆O₃。在一项研究中曾报道不仅能延长酵母、蠕虫和果蝇的寿命，还能减少人类培养细胞的年龄相关性细胞衰退。DMC能在长期心肌缺血(心脏血流减少)的情况下保护小鼠心脏细胞，减少组织死亡面积。但4,4’-二甲氧基查耳酮目前在哺乳动物生殖系统中抗老化的功能和机制研究尚属空白。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供4,4’-二甲氧基查耳酮在延缓卵母细胞体内外老化中的应用。

本发明的另一目的是提供一种延缓卵母细胞体外老化的培养试剂。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

4，4’-二甲氧基查尔酮在制备延缓卵母细胞体外老化进程的试剂中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的卵母细胞体外老化为成熟后卵母细胞老化，即排卵后卵母细胞老化。

4，4’-二甲氧基查尔酮在制备改善生殖衰老的药物中的应用。

作为本发明的一种优选，4，4’-二甲氧基查尔酮在制备改善卵巢衰老的药物中的应用。

作为本发明的一种优选，4，4’-二甲氧基查尔酮在制备改善体内卵母细胞老化的药物中的应用。

一种延缓卵母细胞体外老化的培养试剂，包含4，4’-二甲氧基查尔酮。

作为本发明的一种优选，所述的培养试剂中4，4’-二甲氧基查尔酮的浓度为10-1000μM。

作为本发明的进一步优选，所述的培养试剂中4，4’-二甲氧基查尔酮的浓度为10μM。

有益效果：

本发明生物学实验结果显示：①小鼠MII期卵母细胞体外培养老化12小时后，通过DCFH-DA 探针荧光显微镜测定细胞内ROS水平，发现培养基内添加DMC能够有效减少老化MII卵母细胞内 ROS的积累。②对体外老化卵母细胞通过Annexin V-FITC染色荧光显微镜检测凋亡情况，发现培养基内添加DMC能够有效抑制老化卵母细胞凋亡的发生。③利用Mitotracker检测老化MII期卵母细胞线粒体分布情况，发现培养基内添加DMC可以有效改善线粒体异常聚集的情况。④通过鬼笔环肽染色荧光显微镜检测老化MII期卵母细胞微丝帽结构完整性，发现培养基内添加DMC 可以保护老化MII期卵母细胞微丝帽结构完整。以上结果都表明DMC能够有效改善体外老化MII 期卵母细胞质量，且体外受精实验验证培养基内添加DMC能有效提高老化MII期卵母细胞受精率和囊胚发育率。小鼠体外老化MII卵母细胞培养液中加入DMC，可有效延缓MII期卵母细胞体外老化进程，提高卵母细胞质量；高龄小鼠口服DMC能有效提高排卵数。因此，DMC可以在制备延缓MII期卵母细胞老化和/或提高卵母细胞质量的药物、培养液中应用。

12月龄ICR高龄小鼠500mg/kg连续14天每日口服DMC能有效提高高龄小鼠排卵数，因此口服DMC 能够改善因年龄增长造成的生育力减退，可见，DMC可在制备改善雌性生殖衰老的药物/保健品中应用。

附图说明

图1DMC化学结构示意图

图2DMC培养液中添加最适浓度的选择

图3DMC降低小鼠排卵后老化的卵母细胞ROS水平并抑制细胞凋亡

图4DMC能够改善小鼠排卵后老化的卵母细胞线粒体分布状态

图5DMC改善小鼠排卵后老化的卵母细胞微丝帽异常缺失

图6DMC提高小鼠排卵后老化的卵母细胞受精率及囊胚发育率

图7DMC体内给药延缓高龄小鼠生殖衰老最佳浓度

具体实施方式

实施例1对DMC最适有效浓度进行筛选

我们选择卵母细胞排卵后老化的经典指标ROS水平作为评判老化发生的标准，通过体外老化培养12小时模拟MII卵母细胞体外老化发生进程，并由低到高设置DMC不同浓度梯度(DMC 溶于DMSO)：1，10，50，100，1000μM添加到M2培养基(购自Sigma，货号M7167,下同) 中，并设置新鲜(Fresh)组，老化(POA)组作为对照，老化组添加与给药组用于溶解DMC的等量DMSO。结果显示，当向培养体系中补充10-1000μM DMC时能够有效抑制ROS的积累，为降低药物对细胞的毒副作用，我们选择最低有效浓度为10μM(图2A，2B)。

实施例2DMC降低小鼠排卵后老化的卵母细胞ROS水平并抑制细胞凋亡

在培养液中加入10μM DMC体外培养MII期卵母细胞12小时后，收集体外老化卵母细胞，放入氧化敏感性荧光探针DCFH-DA(1：250)37℃5％CO2培养箱孵育30min，通过荧光倒置显微镜下观察发现DMC添加后能够有效降低体外老化MII期卵母细胞ROS的积累(图3A，3B)，高水平的ROS会诱导细胞早期凋亡的发生，利用AnnexinV-FITC对体外老化MII卵母细胞的凋亡水平进行了检测，结果发现，DMC添加组卵母细胞凋亡水平明显降低(图3C，3D)。

实施例3DMC能够改善小鼠排卵后老化的卵母细胞线粒体分布状态

在M2培养基中加入10μM DMC体外培养MII期卵母细胞12小时后，收集体外老化卵母细胞，放入MitoTracker(1:5000)染色液，37℃5％CO2培养箱孵育1小时，荧光共聚焦显微镜下观察线粒体分布，结果显示，DMC添加后线粒体异常分布的概率降低(图4A，4B)。

实施例4

在M2培养基中加入10μM DMC体外培养MII期卵母细胞12h小时后，收集体外老化卵母细胞，4℃固定过夜，鬼笔环肽(1：250)4℃孵育过夜，以标记微丝帽，染色结束后染核10min，荧光共聚焦显微镜下观察微丝帽形态，结果表明，DMC添加可以改善微丝帽异常缺失的情况(图 5A，5B)。

实施例5

上述实验结果表明，通过添加DMC，小鼠体外老化MII期卵母细胞质量得到明显改善。在 M2培养基中加入10μM DMC体外培养MII期卵母细胞12小时后，收集体外老化卵母细胞，进行体外受精及胚胎培养试验，体外受精6小时后，在M2培养基中清洗受精卵，将受精卵移入事先在37℃5％CO₂培养箱中平衡过夜的KSOM培养液中，在受精后的E1.5天观察二细胞的形成情况，对形成2-cell的数目进行统计，发育至2-cell的卵母细胞数/形态完好的细胞总数即为受精率，受精后的E4.5观察囊胚形成情况，以明显形成囊胚腔为标准，统计囊胚数目，囊胚数/总胚胎数即为囊胚率。这些结果表明，DMC提高了老化卵母细胞的受精能力，并促进了早期的胚胎发育(图6A，6B)。

实施例6DMC体内给药延缓高龄小鼠生殖衰老最佳浓度

将DMC溶于1％羧甲基纤维素钠胶体悬浊液中，设置DMC不同给药浓度梯度，0mg/kg、 10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg、2000mg/kg，对10-12月龄的雌性高龄小鼠进行连续14天的口服给药，14天给药结束后，通过对小鼠给药前后体重变化情况进行统计分析，评估该药物安全性，并对不同组小鼠卵母细胞获得数量进行评估，结果显示，14天连续口服给药结束后，各组小鼠体重均未发生显著差异变化(图7B)，说明DMC是一种相对安全无毒的大分子化合物。并在连续14天给药后，口服剂量为500mg/kg/每日的高龄小鼠排卵数相较于口服剂量为0mg/kg/每天的空白对照组小鼠明显上升(图7A，7C)。以上结果提示， DMC口服给药的安全性及延缓小鼠生殖衰老最佳有效口服剂量为500mg/kg/每天。

Claims

1.4，4’-二甲氧基查尔酮在制备延缓卵母细胞体外老化进程的试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的卵母细胞体外老化为成熟后卵母细胞老化。

3.4，4’-二甲氧基查尔酮在制备改善生殖衰老的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，4，4’-二甲氧基查尔酮在制备改善卵巢衰老的药物中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，4，4’-二甲氧基查尔酮在制备改善体内卵母细胞老化的药物中的应用。

6.一种延缓卵母细胞体外老化的培养试剂，其特征在于，包含4，4’-二甲氧基查尔酮。

7.根据权利要求6所述的培养试剂，其特征在于，所述的培养试剂中4，4’-二甲氧基查尔酮的浓度为10-1000μM。

8.根据权利要求7所述的培养试剂，其特征在于，所述的培养试剂中4，4’-二甲氧基查尔酮的浓度为10μM。