CN114874977B - Thonningianin A在延缓哺乳动物卵母细胞体外老化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Thonningianin A(TA)在制备延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养试剂中的应用，并公开了一种添加有TA的用于改善哺乳动物卵母细胞体外老化的培养液，以及延缓卵母细胞体外老化的培养方法。细胞实验表明，通过向体外培养的卵母细胞培养基中加入TA，可以延缓卵母细胞体外老化，改善卵母细胞质量和发育潜能。

Description

Thonningianin A在延缓哺乳动物卵母细胞体外老化中的 应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及化合物的生物医学用途，具体涉及Thonningianin A在延缓哺乳动物卵母细胞体外老化中的应用。

背景技术

卵母细胞在排卵时恢复减数分裂，排出第一极体，完成第一次减数分裂并停滞在第二次减数分裂中期，等待受精或激活。成熟卵母细胞若未及时受精或激活，会呈现依赖时间的成熟后衰老，被称为排卵后老化(postovulatory aging)。人的卵母细胞受精窗口期一般为取卵后6h，超出该时间窗卵母细胞发育潜能开始下降。小鼠的受精窗口期为排卵后12以内，若超出12h卵母细胞会急剧老化，卵母细胞的质量及发育潜能迅速下降。在辅助生殖技术中，在时间窗内及时受精是辅助生殖成功的关键，然而不少病人存在体外受精(invitro fertilization，IVF)失败需行补救单精子卵胞浆显微注射(Intracytoplasmicsperm injection，ICSI)的情况，IVF受精失败的卵子需在早期行补救ICSI，许多晚期补救ICSI会在IVF受精后18-24h小时进行，这时候由于体外老化，受精率和发育潜能急剧下降。

现有的研究表明，卵母细胞老化相关性状包括胞内氧化应激水平提高、线粒体功能障碍、DNA损伤等，这些改变影响卵母细胞发育能力，最终激活凋亡相关通路引起卵子死亡。专利文献CN109897820B公开了一种延缓体外培养卵子老化的方法，通过在体外培养卵子的过程中添加虾青素的方法显著延缓了体外培养卵子老化的速度，提高了老化卵子早期胚胎发育率，比常规培养液培养下老化卵子的发育率提高了15％。

Thonningianin A(TA)是一种鞣花素，从四川道地药材赶黄草的提取物中分离得到，有清除自由基、抗超氧化物形成的抗氧化作用。然而，已发现的具有抗氧化作用的天然和合成化合物众多，目前绝大多数这类化合物并不像虾青素一样，具有改善卵母细胞体外老化的作用。TA是否能够延缓卵母细胞体外老化尚不明确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Thonningianin A的一种用途。

其技术方案如下：

Thonningianin A(TA)在制备延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养试剂中的应用。

在一种实施方式中，所述培养试剂用在辅助生殖医学技术中，为用于卵母细胞体外培养的医药试剂。

在一种实施方式中，所述培养试剂作为研究用生化试剂，用于卵细胞相关生物学的体外研究。

本发明的目的之二在于提供一种延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养液。

其技术方案如下：

一种延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养液，其关键在于，所述培养液中含有TA。

作为优选，TA的浓度为8～15μM。

作为优选，TA的浓度为10μM。

作为优选，所述培养液通过向卵母细胞基础培养基中添加TA制得。

作为优选，所述卵母细胞基础培养基为CZB培养基。

本发明的目的之三在于提供一种上述培养液的制备方法。

其技术方案如下：

任意一项如上所述培养液的制备方法，其关键在于，将TA溶于二甲基亚砜(DMSO)制备成浓储液，再用基础培养基稀释至使用浓度。

本发明的目的之四在于提供一种延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养方法。

其技术方案如下：

一种延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养方法，其关键在于，采用如上任意一项所述的培养液进行培养。

附图说明

图1为不同培养组的卵母细胞体外老化培养再进行孤雌激活后二细胞率和囊胚率比较，其中：(A)各培养组二细胞率和囊胚率比较，(B)各培养组细胞光镜照片；

图2为体外常规老化培养与TA处理后卵母细胞有丝分裂相关指标比较，其中：(A)细胞核和α微管蛋白(α-tubulin)染色荧光照片，(B)DNA正常分布率比较，(C)纺锤体正常分布率比较，(D)线粒体膜电位检测荧光照片，(E)线粒体膜电位正常率比较，(F)活性氧(ROS)染色荧光照片，(G)活性氧(ROS)染色荧光强度比较。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

(一)实验材料

小鼠：6-8周雌性ICR小鼠，200只，体重25-30g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

胚胎培养液：M2操作液(Sigma，货号：M7167)；CZB培养基(Sigma，货号：MR-019-D)；KSOM培养基(Sigma，货号：MR-212-D)。

抗体及染料：JC-1染料(碧云天，货号：C2006-1)；Mitotracker染料(碧云天，货号：C1094)；FITC-α-tublin直标抗体(Sigma，货号：F2168)；FLUO-4AM染料(碧云天，S1060)；LC3A抗体(，货号：)；MitoSOX(invitrogen，货号：M36008)；ROS(碧云天，货号：S0063)；GSH(invitrogen，货号：T10095)。

其他试剂：透明质酸酶(Sigma，货号：H4272)；细胞松弛素B(Sigma，货号：14930-96-2)；SrCl₂(sigma，货号：10025-70-4)。

(二)卵母细胞体外培养

成熟MII期卵母细胞获取

小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素10IU，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素10IU，13-14h后小鼠断颈处死，取下输卵管，置于M2操作液中，在体式镜下划破输卵管膨大部，让卵丘复合物流出。用移卵针将卵移入透明质酸酶中消化脱颗粒细胞2min，用M2终止消化，然后用移卵针将卵置于M2操作液中清洗3遍，得到MII期卵母细胞(Fresh细胞)。

培养液配置

含TA的培养液：称取TA溶解于DMSO试剂中，配置20mM浓储液，使用时用CZB培养基稀释至终浓度。

孤雌液：将细胞松弛素B和SrCl₂用不含钙离子的CZB培养基稀释得到，培养液中细胞松弛素B终浓度为10μM，SrCl₂终浓度为1.68μM，现用现配。

实施例1

将20mM的TA浓储液用CZB培养基稀释至TA终浓度为2μM的培养液。将Fresh细胞按照常规方式培养于含有2μM TA的CZB培养基中，培养24h。

再将培养后的细胞置于孤雌液中激活6h，然后捞出放入KSOM培养基中培养，统计和计算二细胞率和囊胚率。

实施例2

采用如实施例1中的方法进行培养，不同之处在于，用CZB培养基将20mM的TA浓储液稀释至终浓度8μM，Fresh细胞于含有8μM TA的CZB培养基中培养24h。

实施例3

采用如实施例1中的方法进行培养，不同之处在于，用CZB培养基将20mM的TA浓储液稀释至终浓度10μM，Fresh细胞于含有10μM TA的CZB培养基中培养24h。

实施例4

采用如实施例1中的方法进行培养，不同之处在于，用CZB培养基将20mM的TA浓储液稀释至终浓度15μM，Fresh细胞于含有15μM TA的CZB培养基中培养24h。

实施例5

采用如实施例1中的方法进行培养，不同之处在于，用CZB培养基将20mM的TA浓储液稀释至终浓度50μM，Fresh细胞于含有50μM TA的CZB培养基中培养24h。

对照例1

采用如实施例1中的方法进行培养，不同之处在于，将Fresh细胞于CZB培养基中培养24h。

对照例2

采用如实施例1中的方法进行培养，不同之处在于，将Fresh细胞直接置于孤雌液中激活6h，然后捞出放入KSOM培养基中培养，统计和计算二细胞率和囊胚率。

活细胞荧光染色

①荧光染料配置：用M2操作液稀释染料，置于培养箱中平衡30min。

②染色：取实施例1～5和对照例1～2的各组培养后的MII期卵母细胞以及Fresh细胞，置于相应染色液中，于培养箱中染色30min后，PBS-PVA清洗3遍，置于PBS-PVA中进行免疫荧光拍照。

免疫荧光染色

收集各组MII期卵母细胞，用含有0.2％聚乙烯醇的PBS洗涤3次，每次5min，然后置于40g/L多聚甲醛中室温条件下固定1h；再将胚胎转移至含有0.1％ TritonX-100的PBS母液中透膜处理30min，转移前洗涤3次，每次5min；然后将胚胎转移至封闭液(含3％牛血清白蛋白)中封闭处理，室温下孵育1h；洗涤3次，每次5min，4℃冰箱过夜进行一抗(LC3A，FITC-α-tublin)孵育；PBS-PVA洗涤3次，每次5min，室温下孵育二抗2h，过程中要注意避光，其中FITC-α-tublin不需要二抗孵育；PBS-PVA洗涤3次后，用hoechst染核15min，转移至载玻片上，封片后在共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)下拍照，利用ImageJ软件统计荧光平均强度。

(三)体外培养卵母细胞的状态

发育潜能

对实施例1～5、对照例1培养后的卵母细胞和Fresh细胞，于显微镜下观察并统计二细胞及囊胚数量。如图1所示，对照例2中孤雌激活后的二细胞和囊胚比例均较高，表现出较好的发育潜能，而对照例1的细胞囊胚比例急剧下降。经TA处理后，实施例1和3培养后的卵母细胞，其囊胚比例与对照例1中相当。然而，实施例2～4培养后的卵母细胞，囊胚比例虽不及对照例2，但较对照例1有显著改善。其中实施例2和4培养后的卵母细胞，囊胚比例低于实施例3培养后的卵母细胞。对比实施例1～5的结果，推测TA在较低浓度时对卵母细胞老化几乎没有改善，而高浓度的TA对卵母细胞可能存在毒性，因此TA改善体外老化12h卵母细胞的发育潜能的有效浓度为8～15μM，最适浓度为10μM。

卵母细胞状态

对实施例3和对照例1培养后的卵细胞，用α-tubing对纺锤体染色，hoechest对染色体染色，统计纺锤体及染色体排布正常的细胞数量并计算比例，结果显示，实施例3培养后的卵细胞染色体排布正常率为70％左右，纺锤体排布正常率为60％左右，远高于对照例1(P<0.05)，表明TA可改善老化卵母细胞纺锤体及染色体的排布。

用JC-1线粒体膜电位染色，评估线粒体功能，发现实施例2培养后的卵母细胞线粒体膜电位较对照例1中正常比例更高(P<0.05)，表明TA可改善老化卵母细胞的线粒体功能。

用Dihydroethidium(DHE)对卵母细胞超氧化物阴离子进行染色，发现实施例2培养后的超氧化物阴离子水平远低于对照例1(P<0.05)，表明TA可改善老化卵母细胞过氧化(P<0.005)。

体外培养的卵母细胞发生老化时，伴随着线粒体功能降低和氧化应激增强，采用低浓度TA进行处理后，可改善老化卵母细胞的线粒体功能，并减轻卵母细胞过氧化，延缓卵母细胞的老化状态。

氧化应激水平增高、线粒体功能障碍等生物学性状异常在各种衰老的细胞中均可出现，并非老化的卵母细胞所独有，已报道的一些具有抗氧化、抗衰老的物质或许对改善衰老细胞的状态有一定作用，但对于生殖细胞来说，与有丝分裂相关的生物学性状异常意味着卵母细胞发育潜能的降低，仅有少量具有抗氧化性的化合物才具备改善卵母细胞发育潜能的作用。上述试验结果表明，适宜浓度的TA具有这种改善作用。

由于小鼠卵细胞与人类卵细胞具有高度相近的生物医学性质，因此添加有TA的培养液既具有作为人或其他哺乳动物的生殖医学用培养液的潜能，也可以作为进行体外卵母细胞相关生物医学研究用试剂。

本发明的有益效果：通过向体外培养的卵母细胞培养基中加入TA，可以延缓卵母细胞体外老化，改善卵母细胞质量和发育潜能。

最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.Thonningianin A在制备延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述培养试剂用在辅助生殖医学技术中，为用于卵母细胞体外培养的医药试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述培养试剂作为研究用生化试剂，用于卵细胞相关生物学的体外研究。

4.一种延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养液，其特征在于：所述培养液中含有Thonningianin A，其浓度为8～15μM。

5.根据权利要求4所述的培养液，其特征在于：Thonningianin A的浓度为10μM。

6.根据权利要求4或5所述的培养液，其特征在于：所述培养液通过向卵母细胞基础培养基中添加Thonningianin A制得。

7.根据权利要求6所述的培养液，其特征在于：所述卵母细胞基础培养基为CZB培养基。

8.如权利要求4～7任意一项所述培养液的制备方法，其特征在于：将Thonningianin A溶于DMSO制备成浓储液，再用基础培养基稀释至使用浓度。

9.一种延缓哺乳动物卵母细胞体外老化的培养方法，其特征在于采用如权利要求4～7任意一项所述的培养液进行培养。

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