CN108384751A - 卵母细胞体外成熟培养方法和培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在辅助生殖中卵母细胞体外成熟培养的方法和用于卵母细胞体外成熟培养的培养基。具体的，本发明提供了对接受辅助生殖技术的高育龄哺乳动物的卵母细胞进行体外培养促使其发育的方法，其中包括在卵母细胞体外培养的培养液中加入白藜芦醇。本发明还提供用于高育龄哺乳动物的卵母细胞体外培养基组合物，其包含白藜芦醇。

Description

卵母细胞体外成熟培养方法和培养基
技术领域
本发明涉及辅助生殖技术领域。具体的，本发明涉及用于在辅助生殖中卵母细胞体外成熟培养的方法和用于卵母细胞体外成熟培养的培养基。
背景技术
哺乳动物中，卵母细胞在卵巢内卵泡中生长和发育。卵母细胞的成熟(细胞质和核成熟)对于成功受精、胚胎发育、以及对于胚胎植入的能力至关重要，最终影响妊娠结果。线粒体在卵母细胞的细胞能量代谢中发挥重要作用。三磷酸腺苷(ATP)通过氧化磷酸化在卵母细胞中产生，是维持细胞稳态，细胞凋亡减数分裂调节和钙信号传递等几种功能所必需的。
与年龄有关的雌性生殖力随着产妇年龄的增加而下降。这种生殖老化似乎主要归因于卵巢功能的年龄相关变化和卵母细胞质量的平行衰减。减少的卵母细胞数量与质量下降，决定了生殖老化的逐渐变化以及最终发生的自然不育。
随着女性年龄的增加成熟卵母细胞数量的显着减少，卵巢中生长的卵泡构成了胚胎的资源。卵母细胞质量(细胞质和细胞核)降低是导致育龄期女性不孕的主要效应因子之一。在临床上，许多辅助生殖技术的方法已被用于改善/挽救老年女性的生育力，包括体外受精(in-vitro fertilization，IVF)和卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperminjection，ICSI)。目前，辅助生殖技术主要使用成熟卵子进行IVF或者ICSI。同时，卵巢中有许多小的未成熟卵泡可以作为胚胎资源，特别是对于高龄女性。在改进的体外培养技术，将卵母细胞从早期卵泡滤泡(early antral follicles，EAF)发育到完全生长的卵泡是重要的。然而，从生发泡阶段(GV阶段)卵母细胞到胚泡成熟和形成的比率很低。由于提高胚泡的成熟度和早期卵泡滤泡的发育能力对于促进生育力非常重要，需要进一步探索培养技术。
白藜芦醇，(3,5,4'-三羟基二苯乙烯)，是一种来自植物的天然潜在抗衰老多酚化合物，并且最显着地存在于红葡萄酒中。据报道，白藜芦醇增强Sirt1的活性，抑制磷酸二酯酶并促进线粒体功能。在过去的几十年中，体外和体内研究了白藜芦醇从抗氧化，抗炎，抗致癌到抗增殖作用等多种生物学特性。然而，白藜芦醇在生殖发育中的作用，包括在卵母细胞发育中的作用仍有待深入研究，特别是对白藜芦醇是否在GV期卵母细胞成熟中发挥作用以及老年动物胚胎和囊胚形成的发育潜力。
发明内容
本发明提供了对接受辅助生殖技术的高育龄哺乳动物的卵母细胞进行体外培养促使其发育的方法，其中包括在体外培养卵母细胞的培养液中加入白藜芦醇。在本发明的其中有一个方面，白藜芦醇在卵母细胞体外培养的培养液中的浓度为约0.5-5μM/L，优选为约1.0μM/L。
本发明中，术语“辅助生殖技术”为在人类和动物中进行的，其中涉及分离的卵母细胞和/或分离的精子的任意受精技术，包括使用体外培养的卵母细胞发育成胚胎的技术(例如卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation，IVM))、体外受精(IVF：抽取卵母细胞、在实验室受精及移植胚胎至受体)、配子输卵管内移植(GIFT；放置卵母细胞和精子入输卵管)、合子输卵管内转移(ZIFT；放置受精卵入输卵管)、输卵管胚胎移植(TET；放置分裂胚胎入输卵管)、腹膜卵母细胞和精子转移(POST；放置卵母细胞和精子入盆腔)、胞浆内精子注射(ICSI)、睾丸精子提取(TESE)及显微外科附睾精子抽吸术(MESA)；或用于在人和/或动物内生产胚胎的任意其他体外技术，如核转移、孤雌生殖激活和全能细胞的使用。在本发明的其中一个方面，本发明的方法可用于卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation，IVM)，对卵母细胞进行体外培养，可使其发育到胚泡或胚胎。
在本发明的其中又一个方面，所述卵母细胞是未成熟卵母细胞。例如，所述卵母细胞是生发泡期(GV期)卵母细胞。
本发明的方法中，所述哺乳动物包括灵长类(包括人类女性)、牲畜(如马、牛、绵羊、猪或山羊)、伴侣动物如(狗或猫)、实验室试验动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)等。高育龄哺乳动物是指年龄大于一般生育年龄或最佳生育年龄的哺乳动物。
在本发明的其中一个方面，所述高育龄哺乳动物为人类女性，特别是高育龄人类女性。高育龄人类女性是指受孕时年龄超过34岁的人类女性。在本发明的其中又一个方面，所述高育龄哺乳动物是年龄超过38岁的人类女性。
在本发明的其中一个方面，所述高育龄哺乳动物为小鼠。在本发明的其中一个方面，所述小鼠是大于10月龄的小鼠。
在本发明的其中又一个方面，本发明方法培养的卵母细胞出现以下的一种或多种现象：
a.线粒体功能的改善；
b.MI-和MII-期卵母细胞纺锤体形态的改善；
c.MI-和MII-期卵母细胞染色体排列的改善；或
d.SIRT1，CAT，GPX4和SOD1中的一个或多个表达上调。
在本发明的其中一个方面，提供了一种用于高育龄哺乳动物的卵母细胞体外培养基组合物的白藜芦醇。在本发明的其中一个方面，提供了白藜芦醇在制备用于高育龄哺乳动物的卵母细胞体外培养基组合物的用途。
在本发明的其中又一个方面，所述卵母细胞体外培养基组合物包含约0.5-5μM/L，最优选为约1.0μM/L的白藜芦醇。
在本发明中，卵母细胞体外培养基是指在辅助生殖技术中用于体外培养卵母细胞，促进卵母细胞发育，例如发育为胚胎或胚泡的培养基(或培养液)。卵母细胞体外培养基可含有NaCl、KCl、Mg2SO4、KH2PO4、Ca乳酸盐、NaHCO3、氨基酸及衍生物、蛋白质(如血清白蛋白)、葡萄糖、丙酮酸和抗生素等。另外，卵母细胞体外培养基还可含有PDE抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂。在本发明的其中又一个方面，所述卵母细胞体外培养基组合物中还包括用于说明所述培养基用途和/或用法的说明书。
本发明提供的对高育龄哺乳动物的卵母细胞进行体外培养促使其发育的方法能够有效地促进老龄哺乳动物的卵母细胞的成熟，受精和胚泡形成。在本发明保护范围不受以下理论限制的情况下，发明人认为本发明包括以下益处或得益于以下途径：1.改善线粒体功能；2.改善MI‐和MII‐期卵母细胞纺锤体形态；3.改善MI‐和MII‐期卵母细胞染色体排列；4.上调卵母细胞的SIRT1，CAT，GPX4和SOD1的表达。SIRT1的激活可改善线粒体功能和卵母细胞的发育潜能。在本研究中，评估了三种不同浓度的IVM培养基中白藜芦醇对来自老年小鼠和人的卵母细胞的影响。免疫荧光染色实验证实1.0μM/L白藜芦醇组线粒体的免疫反应性高于对照组，说明白藜芦醇可以增强线粒体功能。这可以说明至少部分原因是白藜芦醇改善了来自老年小鼠和人的卵母细胞的质量。另外，白藜芦醇提高了老龄小鼠的卵母细胞分裂和胚泡发育率。非整倍体是老年哺乳动物早期不孕的主要原因。它是由卵母细胞第二次减数分裂期间染色体分离失调引起的。纺锤体作为细胞骨架是防止或减少非整倍性的通用途径。白藜芦醇有效地改善了MI-和MII-期卵母细胞中纺锤体的形成和染色体的表达。本研究的数据显示，用1.0μM/L白藜芦醇处理后的MII期卵母细胞中的正常纺锤体形态和染色体比对在小鼠中与对照相比显着增强，这在人类中进一步验证。同时，卵母细胞和胚胎在体外培养系统中易受氧化应激和任何其他不利因素的影响。因此，各种抗氧化剂被添加到IVM培养物中。这项研究表明，白藜芦醇可能通过上调SRIT1和其他抗氧化基因如CAT，SOD1和GPX4对卵母细胞成熟和胚胎发育产生显着的有益作用。
附图说明
图1小鼠卵母细胞体外培养效果图。其中A为用1.0μM/L白藜芦醇处理108小时后的受精率和囊胚形成。(a-d)2PN(对照)，2PN(白藜芦醇)，胚泡(对照)，胚泡(白藜芦醇)。比例尺＝25μm。(B)显示对照和加入白藜芦醇处理的2PN和囊胚的百分比。
图2小鼠卵母细胞体外培养效果图。其中(A)为纺锤体，染色体和线粒体的免疫荧光图像。纺锤体用α-微管蛋白抗体(绿色)染色。染色体用Hoechst 33342(蓝色)染色。线粒体用FM(绿色)染色。a-c：来自对照组的纺锤体，染色体，线粒体(形态异常的纺锤体，不整齐的染色体，线粒体的免疫荧光强度较弱)。d-f：来自白藜芦醇处理组的纺锤体，染色体，线粒体。比例尺＝25μm。(B)对照和白藜芦醇处理组中异常纺锤体和染色体的百分比。(*P<0.01，*P<0.05，分别)。(C)两个组中线粒体的免疫荧光强度。(*P<0.01)。
图3不同浓度的白藜芦醇(0.1μM/L，1.0μM/L，10μM/L)处理对卵母细胞中SIRT1，CAT，SOD1和GPX4表达的影响图。(分别为P<0.05)
图4高龄人类女性进行IVM时1.0μM/L白藜芦醇存在下MII期卵母细胞成熟的图。其中(A)为纺锤体，染色体和线粒体的免疫荧光图像。纺锤体用α-微管蛋白抗体(绿色)染色。染色体用Hoechst 33342(蓝色)染色。线粒体用FM(绿色)染色。Aa：纺锤体与染色体的合并(对照组)；Ab：纺锤体形态异常(对照组)；Ac：染色体错位(对照组)；Ad：线粒体免疫荧光强度(对照组)e：纺锤体与染色体合并(白藜芦醇处理组)f：正常纺锤体形态(白藜芦醇处理组)；g：染色体排列(白藜芦醇处理组)；h：线粒体(白藜芦醇处理组)的免疫荧光强度。比例尺＝35μm。(B)纺锤体形态异常，染色体排列的比较。(C)线粒体免疫荧光强度的比较。*P<0.05。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1材料和方法
溶液和化学品
除非另有说明，研究中的所有化学品和试剂均购自Sigma-Aldrich ChemicalCompany(USA)。将白藜芦醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)中并储存于-20℃直至使用。用于IVM培养的M199培养基补充有10％人血清白蛋白(HSA)，50IU/mL青霉素，5μg链霉素，0.29mmol/L丙酮酸钠，0.15IU/ml人绒毛膜促性腺激素(HCG)，0.075U/mL重组卵泡刺激素，10ng/mL重组人表皮生长因子(EGF)和10μg/ml雌二醇-17β(E2)。
统计分析
对每种治疗至少评估三次重复。数据(平均值±SEM)使用SPSS软件(IBM Corp，USA)通过ANOVA进行分析，随后进行Pearson卡方检验。P<0.05被认为有统计学意义。
实施例2白藜芦醇促进老年小鼠卵母细胞成熟和受精，以及囊胚形成
通过用无菌针穿刺老龄小鼠(C57BL/6J，购自维通利华，48～52W)的卵巢来获得GV期卵母细胞，并在M199培养基中彻底洗涤。通过在透明质酸酶培养基中轻轻用移液枪吹打卵丘细胞。老龄小鼠(48～52W)的1138个卵母细胞随机分为4组。在三种不同浓度的白藜芦醇(0.1，1.0和10μM/L)或DMSO空白对照的IVM培养基存在下，在含有5％CO2的环境中，37℃下培养脱除卵丘的卵母细胞。在16小时后评估MI和MII期卵母细胞。从8周龄以上的雄性小鼠的输精管中取得精子，用体外受精培养基清洗，并在37℃，6％的二氧化碳培养箱中按2～5×106/mL密度温育2小时。将产生的MII阶段卵母细胞移入精子液滴中。5～6小时后评估受精情况；24小时后评估两细胞阶段，108小时后评估胚泡。
结果如表1和图1所示。
表1.用不同浓度白藜芦醇处理的高龄小鼠
RSVL:白藜芦醇。GV：生发泡期；GVBD:生发泡破裂期。*P<0.01.
结果表明，白藜芦醇对IVM培养中小鼠卵母细胞成熟有显著影响。对来自老年小鼠的卵母细胞，1.0μM/L白藜芦醇处理组的卵母细胞在GV期成熟率(即GV期转化为GVBD期比例)高于对照组(1.0μM/L DMSO)：82.31±1.37％比93.15±1.46％)(P<0.01)。
另外，如图1中A和B所示，1.0μM/L白藜芦醇处理组中培养的卵母细胞在108h后的受精率和囊胚形成率显着增加(分别P<0.01)。
实施例3白藜芦醇提高老年小鼠的卵母细胞质量
卵母细胞的质量通过纺锤体形态，染色体排列和线粒体功能来反映。
通过免疫荧光和共聚焦分析方法进行检测：将MII期卵母细胞在37℃下在2％多聚甲醛中固定10分钟，并用0.2％Triton X-100透性化45分钟。接下来，将卵母细胞与单克隆抗小鼠α-微管蛋白抗体(在PBS中为1/100；Sigma)一起温育90分钟，并用在PBS中稀释1/300的FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Sigma)孵育60分钟。为了具体评估线粒体的分布，将MII-卵母细胞与用PBS稀释的400nmol/L Mito Tracker Green FM温育30分钟，并在2％多聚甲醛中固定10分钟(所有步骤在37℃)。将MII-卵母细胞中的染色质用Ho echst(B-2261，Sigma)染色10分钟。最后，在LSM780共焦扫描显微镜(Zeiss，德国)下检查卵母细胞。
正常的染色体主轴是纺锤形的，对称的，两侧都有突出的杆。正常染色体排列在赤道板上，与对称分布的主轴连接。异常主轴为非纺锤形，主轴长度缩短，主轴有一些溶解或不存在。异常染色体的特征包括从赤道板分离，染色体过度疏松或凝集，甚至染色体无序杂乱分布。
结果如图2所示。与对照组(1.0μM/L DMSO)相比，用1.0μM/L白藜芦醇处理的卵母细胞的MII期中形态异常和染色体畸变的纺锤体的百分比降低(如图2Aa，图2Ad；图2Ab，图2Ae。以及如图2B)。免疫荧光染色进一步证实(如图2C)，白藜芦醇处理组线粒体的免疫反应性(93.01±19.34)高于对照组(1.0μM/L DMSO)(63.06±13.11)(P<0.01)。
实施例4白藜芦醇增加老龄小鼠MII期卵母细胞中SRIT1和抗氧化基因CAT，SOD1和GPX4的mRNA水平
评估了用三种浓度的白藜芦醇处理的小鼠卵母细胞中SRIT1和抗氧化基因CAT，SOD1和GPX4的基因表达水平。通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)进行基因表达分析。
使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA，并使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)进行cDNA合成。在iCycler iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad)上用FastStartUniversal SYBR Green Master(Roche)一式两份进行PCR反应。20μL的最终PCR反应体积包含10μLSYBR Green PCR Master Mix，1.0μLcDNA模板，3.0μL引物混合物和6μL水。
针对各基因的RT-PCR的引物对如下：
结果如图3所示。用1.0μM/L白藜芦醇处理导致老龄小鼠卵母细胞中SRIT1水平增加和CAT，SOD1和GPX4基因表达上调(分别为P<0.05)(图3A-D)。低浓度或高浓度(0.1μM/L或10μM/L)白藜芦醇处理对CAT，SOD1和GPX4的基因表达水平没有明显影响。
实施例5白藜芦醇处理促进高龄人类女性卵母细胞成熟
伦理批准
本研究经山东大学生殖医学研究所审查委员会(IRB)批准。本研究中涉及人类参与者的所有程序符合机构研究委员会的伦理标准以及1964年赫尔辛基宣言及其后期修正案或类似的道德标准。所有参试人都提供书面知情同意书。
卵巢刺激和卵母细胞收集
64名进行卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的患者于2014年2月至2015年2月在山东大学附属山东省立医院提供未成熟卵母细胞。患者的年龄从38-45岁不等。从患者中取回GV卵母细胞的临床方案按已知方法进行(16)。简而言之，使用标准卵巢刺激方案为患者准备ICSI，包括用GnRH激动剂(Decapeptyl；Ferring，Kiel，Germany)下调垂体素，然后用外源FSH(Gonal-F；Serono Laboratories，Aubonne，瑞士)刺激卵巢。10,000IU hCG(Profasi；Serono Laboratories)给药36小时后进行超声引导的卵泡钻孔和抽吸，通过超声检查观察直径为18-20mm的两个/三个卵泡。用透明质酸酶和移液方式机械除去冠状细胞后，评估卵母细胞的减数分裂状态。未成熟的卵母细胞分别被定义为生发泡(GV)阶段：代表在减数分裂I前期被捕获的卵母细胞；或中期I(MI)阶段，以极性体的缺乏和无可辨别的GV细胞核为特征。从64名患者收集到75个GV阶段卵母细胞。
将上述75个人GV卵母细胞随机分为两组：1.0μM/L白藜芦醇或DMSO的IVM培养基两组，并在37℃下在含5％CO2的潮湿气体中孵育。分别在24小时和36小时后评估MI-和MII-阶段卵母细胞。
结果如表2所示。含1.0μM/L白藜芦醇的培养液中MII期卵母细胞的形成率(24h：55.26％；36h：71.05％)高于对照组(24h：37.84％；36h：51.35％)。
表2.用不同浓度白藜芦醇处理的高龄人类女性的MII期卵母细胞
RSVL:白藜芦醇,*P<0.05.
实施例61.0μM/L白藜芦醇处理改善高龄人类女性的卵母细胞质量
如图4所示，来自高龄人类女性的MII阶段卵母细胞的免疫荧光染色进一步证实了白藜芦醇处理组线粒体的免疫反应性(1.0μM/L：53.02±15.10)与对照组(31.14±6.05)相比较高(P<0.05)(图4C)。正常纺锤体呈典型的梭形，位于卵母细胞周围(图4Af)。异常纺锤体没有突出的极，呈圆形，部分或全部纺锤体分裂或缺失(图4Ab)。与赤道板上有序排列的正常染色体(图4Ag)相比，异常染色体显示距离赤道板较远，过于疏松或过度凝集(图4Ac)，甚至与纺锤体无关。用1.0μM/L白藜芦醇处理的MII期卵母细胞中具有异常形态和染色体不规则排列的纺锤体的百分比显着降低(P<0.05)(图4B)。
本发明人出乎意料地发现，在对来自高龄人类女性和老龄小鼠的卵母细胞的IVM培养中，用白藜芦醇处理，特别是特定浓度的白藜芦醇处理显著增强了卵母细胞成熟和受精，以及胚泡的形成。本发明为改善IVM培养条件和在高龄哺乳动物，特别是高龄人类女性中使用未成熟的卵母细胞提供了重要的方法。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。

Claims (10)

1.对接受辅助生殖技术的高育龄哺乳动物的卵母细胞进行体外培养促使其发育的方法，其中包括在体外培养卵母细胞的培养液中加入白藜芦醇。
2.权利要求1的方法，其中白藜芦醇在卵母细胞体外培养的培养液中的浓度为约0.5-5μM/L，优选为约1.0μM/L。
3.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是高育龄人类女性。高育龄人类女性是指受孕时年龄超过34岁的女性，优选是年龄超过38岁的女性。
4.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是小鼠，优选是大于10月龄的小鼠。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述卵母细胞是未成熟卵母细胞，例如生发泡期卵母细胞。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中进行体外培养的所述卵母细胞出现以下的一种或多种现象：
a.线粒体功能的改善；
b.MI-和MII-期卵母细胞纺锤体形态的改善；
c.MI-和MII-期卵母细胞染色体排列的改善；或
d.SIRT1，CAT，GPX4和SOD1中的一个或多个表达上调。
7.用于高育龄哺乳动物的卵母细胞体外培养基组合物，其包含白藜芦醇。
8.权利要求7的卵母细胞体外培养基组合物，其中白藜芦醇的浓度为约0.5-5μM/L，优选为约1.0μM/L。
9.权利要求8的卵母细胞体外培养基组合物，其中还含有NaCl、KCl、Mg2SO4、KH2PO4、Ca乳酸盐、NaHCO3、氨基酸及衍生物、蛋白质、葡萄糖、丙酮酸或抗生素中的一种或多种。
10.权利要求7-9中任一项的卵母细胞体外培养基组合物，其中所述卵母细胞是未成熟卵母细胞，例如生发泡期卵母细胞。
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CN113564103A (zh) * 2021-05-17 2021-10-29 南京医科大学 4,4’-二甲氧基查耳酮在延缓卵母细胞体内外老化中的应用
CN113564103B (zh) * 2021-05-17 2023-01-06 南京医科大学 4,4’-二甲氧基查耳酮在延缓卵母细胞体内外老化中的应用

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