KR20030081350A - 난포들의 시험관 내 배양 방법 - Google Patents
난포들의 시험관 내 배양 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생물학적 약효 검사의 목적으로, 순차적으로
- 시험관 내 배양을 위한 적절한 용기를 제공하는 단계,
- 포유 동물의 난소로부터 적어도
- 협막 또는 전-협막 세포,
- 과립막 세포 및
- 난모 세포를 포함하는 난포를 선택하는 단계,
- 오일이 없는 제1 배지를 억제시키는 부착물을 사용하는 임의의 제1 배양 단계,
- 오일이 없는 제2 배지를 촉진시키는 부착물을 사용하는 제2 배양 단계, 및
- 숙성된 난포를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법에 관한 것이다.
Description
인간들 및 인간 이외의 포유 동물들을 위한 난포 발생(folliculogenesis) 연구, 및 난모 세포 성숙 분야에서 여러 가지 문제점들이 확인될 수 있다.
동물 번식 및 인간의 시험관 내 수정을 위한 난모 세포 성숙의 광범위한 허용 및 사용에 따라, 대량의 정자가 통상적으로 장래 사용을 위해 수집되어 저장되고, 본질적으로 정자의 무한한 공급을 창출한다. 그러나, 지금까지, 여성들로부터 많은 수정 가능한 난자들을 수집하고 저장하는 실질적인 방법은 존재하지 않는다. 그 이유는 여성들의 생식적인 생물학에 관한 것이다. 여성 포유 동물들에 있어서, 난소들에서 특정 세포들만이 난자로 성숙할 수 있다. 모든 포유 동물들에서 출생 시에 제한된 양으로 존재하는 생식 세포들은 난소에 유지되고, 감수 분열의 초기 단계에서 저지되고, 그 단계에서 수정되고 정상적인 자식으로 발육된다. 정상적인 환경 하에서, 많은 이들 세포들은 동물의 생식 주기에 따라 조율되는 주기성에 따라 난소 내에서 발육되기 시작한다. 주기의 적절한 시점에, 이들 세포들중 하나 또는 소수가 배란이라고 알려진 프로세스에 따라 난소로부터 방출될 것이다. 배란이 일어나는 지점까지 개개의 생식 세포가 진행하는 복잡한 프로세스는 난포 발생으로서 공지되어 있다. 난포 발생은 여러 가지 주요 단계들 및 난소 뿐만 아니라 뇌하수체의 다른 세포들 및 난소 호르몬들의 공동 작용 활성들을 포함한다. 그러나 생체 내 난포 발생은 비효율적인 프로세스이다.
난포 배양은 전신의 영향들로부터 손상되지 않은 난포들을 단리시키도록 설계된 실험적인 기술이므로 이들의 대사는 과학적으로 조사될 수 있다. 난포 배양을 사용함으로써, 난포 발생은 시뮬레이션되거나 또는 최적화될 수 있다. 그러나, 지금까지 원시 난포들로부터 성숙한 난포들 및 난모 세포들에 이르기까지 전체 난포 개발 단계들을 효율적으로 제공할 수 있는 어떠한 난포 배양 방법도 공지되어 있지 않다. 이용할 수 있는 방법들의 설명은 문헌["In vitro culture of ovarian follicles", G.M. Hartshorne, Reviews of Reproduction(1997) 2, 94-104]에 주어져 있다.
더욱이, 지금까지 거의 모든 성공적인 난포 배양 방법들은 외부 영향물들로부터 배양액을 보호할 배리어를 제공하기 위해 오일을 사용한다. 이러한 시행은 반포 발생에 대한 화학 약품들, 특히 친유성 화합물들의 영향력을 시험할 가능성들을 제한한다. 상기 화학 약품들은 파괴적일 수 있거나(난포 발생에 대해 부정적인 영향) 건설적일 수 있다(긍정적인 영향 - 안간 또는 인간 이외의 동물들에서 결함있는 난포 발생의 처리에 가능한 약물 검출). 그러한 시험은 난포 발생에 대한 전자기 또는 이온화 방사선, 초음파 등의 물리적 영향들, 예를 들면 방사선 의학/방사선요법의 영향을 평가하도록 고안될 수도 있었다. 당업계의 현실은 난포 발생의 임의의 불연속 단계에서의 시험을 허용하지 않고, 통상적으로 특이적인 발달 단계에서 난포 세포들에 대한 외부 영향의 충격을 평가하기가 불가능하고, 마찬가지로 통상적으로 난포 배양은 상이한 발달 단계들에서 난포들을 포함함으로써 천연 상태를 모방하려 시도한다.
존재하는 다른 요구는 난포들의 보존 필요성이고, 예를 들면 인간인 여성인 화학요법 또는 방사선요법 또는 난소척제술을 시행해야 하는 경우, 상기 보존된 난포들로부터 유도된 난모 세포들의 시험관 내 이식 또는 수정은 그녀 자신의 난모 세포들로부터 그녀가 아이를 갖는 것을 가능케 할 수 있고, 그렇지 않을 때 이는 불가능할 것이다.
더욱이, 인공 수정과 조합되어 보다 효율적인 난포 발생을 초래하는 난포들을 위한 그러한 보존 방법은 여러 가지 드물고 위험에 빠진 종들의 생존 기회에 이로울 것이다.
바꾸어 말하면, 포유 동물의 난소 조직으로부터 수많은 성숙하거나 반성숙한 난포들 및(또는) 난모 세포들을 발생시키는 신규한 방법이 필요하다.
본 발명은 난포들의 시험관 내 배양 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 포유 동물의 난소 조직으로부터 수많은 성숙하거나 반성숙한 난포들 및(또는) 난모 세포들의 생산 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따라 포유 동물의 난소 조직으로부터 수많은 성숙하거나 반성숙한 난포들 및(또는) 난모 세포들을 발생시키는 방법의 개략적인 개관을 나타내는 도면.
도 2a 및 2b는 발육의 제1차 및 초기 프리앤트럴(제2차) 스테이지에서 난포를 각각 보여주는 도면.
도 3a 및 3b는 모두 본 발명의 방법을 실시하기 위한 바람직한 배양 플레이트 셋업을 보여주는 도면.
도 4a 내지 4e는 본 발명의 방법에 따라 배양된 난포들의 발육을 나타내는 도면.
본 발명은 포유 동물의 난소 조직으로부터 성숙하거나 반성숙한 난포들 또는 난모 세포들을 발생시키는 신규한 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 포유 동물의 난소 조직으로부터 단리된 제1차 또는 제2차 난포들로부터 성숙하거나 또는 반성숙한 난포들 및(또는) 난모 세포들을 발생시키는 방법을 제공하는 것이다.
다른 목적은 난포 발생 및 난자 발생에 대해, 보다 상세하게는 난포 발생 및 난자 발생에 개별적으로 포함된 모든 단계들에 대해서 또는 특이적인 발육 스테이지에서 통상의 전신 영향물들로부터 단리된 난포들 및 난모 세포들에 대한 화학 약품들 및 물리적 영향들(전자기 또는 이온화 방사선, 초음파 등) 등의 외부 영향들을 시험하기 위한 생물학적 약효 검사 환경을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 보존된 난소 조직으로부터 성숙한 난모 세포들을 발생시키는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 순차적으로
- 시험관 내 배양을 위한 적절한 용기를 제공하는 단계,
- 포유 동물의 난소로부터 적어도
- 협막 또는 전-협막 세포,
- 과립막 세포 및
- 난모 세포를 포함하는 난포를 선택하는 단계,
- 오일이 없는 제1 배지를 억제시키는 부착물을 사용하는 임의의 제1 배양 단계,
- 오일이 없는 제2 배지를 촉진시키는 부착물을 사용하는 제2 배양 단계, 및
- 숙성된 난포를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법에 관한 것이다.
상기 난소 난포는 제1차 또는 제2차 난포일 수 있다. 더욱이, 상기 난소 난포는 난소 난포들의 원료로부터 또는 난소 조직으로부터 냉동되고 해동되는 난소 난포일 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 제2 배양 단계 후에 오일이 없는 성숙화 유도 제3 배지를 사용하여 수행되고 점액성의 누적 난모 세포 착물을 초래하는 제3 배양 단계를 추가로 포함한다. 상기 제3 단계는 난모 세포의 성숙화 및 상기 난모 세포의 배란형 박리를 포함하는 것이 바람직하다.
임의의 제1 배양 단계는 제1차 난포들의 제2차 난포들로의 분화를 포함하는 것이 바람직하다.
제2 배양 단계는 적절한 용기의 표면에 대한 난포의 부착 및 난포의 배란전 난포 또는 배란전형 난포로의 분화를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 적절한 용기는 축소된 면적의 96-웰 편평 바닥 배양 플레이트인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 국면은 하기
- 적어도 하나의 세포 발육 스테이지 동안 화학 약품 또는 물리적 영향의 존재 하에 본 발명에 따른 난포 배양을 실행하는 단계, 및
- 그 효과들을 평가하는 단계를 포함하는, 난포 발생에 대한 화학 약품 또는 물리적 영향의 효과들을 평가하는 방법이다.
난포 배양 동안 특이적인 짧은 기간에만 화학 약품 또는 물리적 영향을 적용시키는 것은 난포의 분화의 임계 지점들에서 그 영향을 평가하게 한다(예, 프리앤트럴, 앤트럴 페이스, 배란의 유도 등). 상기 화학 약품 또는 물리적 영향의 존재는 난포 배양의 기간 전반에 계속될 수도 있다.
상기 효과들은 예를 들면 IVF 평가, 수정 및 이식 후 발육 적성 평가, 스핀들 착색, 세포 기관 분석, 염색체 분석 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 확인 방법에 의해 난모 세포의 품질을 확인함으로써 또는 증식 분석, 분화 분석, 스테로이드 생산, 점액화 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 확인 방법에 의해 난포 발생 품질을 분석함으로써 편리하게 평가받을 수 있다. 그러나, 본 발명은 난모 세포들 및 난포 발생 품질을 평가하기 위해 이들 시험의 사용에 관련되지는 않는다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 포유 동물의 난소 조직으로부터 수많은 성숙하거나 또는 반성숙한 난포들 및(또는) 난모 세포들을 발생시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 포유 동물의 난소 조직으로부터 회수된 생식 세포들을 성숙하거나 또는 반성숙한 난포들 및(또는) 난모 세포들로 시험관 내에서 발육 또는 성숙시키는 방법들에 관한 것이다.
본 발명은 여러 가지 비제한적인 실시예들을 사용하여 추가로 명시될 것이다.
포유 동물의 난소 조직으로부터 단리된 난포들로부터 성숙한 난포들 및 난모 세포들을 얻기에 필요한 모든 단계들 개략적으로 나타내는 본 발명에 따른 방법의 개관은 도 1에 나타나 있다.
모든 이들 단계들은 하기 실시예들에서 더욱 상세히 기재될 것이다.
실시예 1
제2차 난소의 난포들의 단리 및 예비 배양
(도 1에서 단계 1)
난소 조직은 12 내지 14일령의 F1 하이브리즈 C57B1/j6 x CBAca 생쥐들로부터 단리시키고 ClutaMAX ITM(Gibco BRL 31415-029), 10% HIA FBS (가열 불활성화된 태아 송아지 혈청) 및 0.1% 페니실린-스트렙토마이신-혼합액 (Gibco BRL 3032908)과 함께 Leibovitz의 L15 배지를 포함하는 배양 접시에 둔다. 난소들은 난관 및 지방이 없어야 한다.
바늘로, 난소의 표면을 긁고, 난포들을 L15 배지 중의 현탁액으로 방출한다. 통상의 조건 하에, 하나의 난소당 약 30 내지 40개의 적절한 난포들이 이러한 단리 방법에 따라 얻어져야 한다.
제1차 난포들을 단리시키고자 할 때, 7 내지 8일령의 생쥐들을 사용할 수 있다. 이러한 경우에 하나의 난소당 약 10 내지 15개의 적절한 난포들이 얻어질 수 있다.
실시예 2
본 발명의 방법을 위한 난포들의 선택
(도 1에서 단계 2)
실시예 1에서 얻은 현탁액 중의 모든 난포들은 난포 배양에 적절치 못하다. 모든 난포들이 거의 동일한 속도로 성장하는 것을 확인하기 위해, 선택된 난포들은 유사한 직경을 가져야 한다. 이와 같이 특이적인 경우, 100 내지 130㎛의 직경이 적절하고, 초기 프리앤트럴(제2차) 스테이지에 이르기까지 난포의 발육을 지시한다. 이 경우에, 난포들(11)은 도 2b에 도시된 바와 같이 2개 층의 과립막 세포들(13) 및 둥근 형상의 난모 세포(15)를 가져야 한다. 상기 난포 세포들은 추가로 협막-간질성 세포들(17), 기저막(19) 및 띠모양 펠루시다(21)를 포함한다. 난포들은 입체 현미경으로 관찰되고, 인버트된 현미경으로 측정된다. 적절한 난포들은 적절히 배열된 파스퇴로 피펫들을 사용하여 채집되고 크리오바이알(저장을 위해, 실시예 3 참조)로 또는 배양 플레이트(난포 배양을 위해, 실시예 4)로 수송된다.
제2차보다 초기인 발육 스테이지의 난포들 역시 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 난포들이 충분히 분화되었는지 여부를 결정하는 가장 중요한 인자는 도 2a에 도시된 바와 같이 제1차 스테이지 난포의 외부 표면에 존재하는 협막 세포들(17) 또는 전-협막 세포들(23)의 존재이다. 전-협막 세포들은 이들의 표면 상에 LH 수용체를 아직 발현시키지 못할 수도 있다. 실시예들에 사용된 쥐 모델에서, 그러한 1차 스테이지 난포들의 크기는 약 70 내지 100㎛이다. 그러나, 이러한 크기는 쥐 시스템에 대해 특이적이고, 다른 종들에 대해 적절한 크기는 상기 세포 발육 스테이지에 관련시킴으로써 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
실시예 3
난포 저장물의 생성 및 사용 (도 1에서 단계 3)
난포 저장물은 숙련자들에게 공지된 냉동 보존 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 그러한 기술의 예는 다음 단락에 기재되어 있다.
실시예 2에서 얻은 난포들은 플라스틱 크리오바이알들(캐나다, 퀘벡 소재 Simport 제품)에 수집한다. 하나의 바이알당 25개의 난포들이 10% 가열-불활성화된 FCS 및 1.5M DMSO와 함께 L15 배지 150μL에 현탁된다. 통제 프로그램된 냉동기(Cell Freezer R204, 플래너, 영국, 선버리온 탬즈)를 사용하여 저속 냉동을 수행한다. 난포들은 4℃에서 15분 동안 냉동 혼합물 중에서 평형이 되고, 2℃/분의 속도로 -7℃까지 냉각된다. 수동 살포 후, 온도는 -0.3℃/분의 속도로 -40℃까지강하된다. 액체 질소에 저장하기 전에, 난포들은 -50℃/분의 속도로 -110℃로 급속 냉각된다.
난포들은 37℃로 크리오바이알들을 가온시킴으로써 초고속으로 해동된다. 임신 예방 보호제(cyoprotectant)의 희석은 실온에서 15분 동안 3단계로 (DMSO의 농도를 1.5M에서 1M으로, 이어서 0.5M로 감소시키면서) 행해진다. 배양 전에, 난포들은 37℃에서 단리 배지 중에서 15분 동안 평형으로 된다. 이 지점으로부터, 난포들은 신선하게 얻어진 난포들로 처리될 수 있다.
실시예 4
난포 배양 (도 1에서 단계 4)
난포 배양은 분화된 난포들을 제공할 수 있는 적어도 하나의 배양 단계를 포함한다. 분화는 적절한 배지들을 사용함으로써 자극된다. 본 발명의 방법에서, 배지들은 3개의 군들: 즉, 제1 배지, 제2 배지 및 제3 배지로 나뉠 수 있다. 적절한 분화 스테이지에서 적절한 배지의 이용은 본 발명의 방법을 성공적으로 구현하는데 결정적이다.
2개의 실시예들은 상이한 분화 스테이지의 난포들에 본 발명의 방법을 어떻게 사용할 수 있을지를 예시할 것이다.
인큐베이션 기간들을 언급할 때, 달리 지시할 때를 제외하고는 다음 조건들이 적용된다:
°온도: 37℃
°공기 혼합물: 공기중 5% CO2
°습도: 100% 포화
또한, 인큐베이션 기간들은 생쥐 이외의 다른 종들을 사용할 때 동등한 결과들을 얻기 위해 변화시킬 수 있다. 실시예들은 생쥐 시스템에 대해 최적화된다.
특이적 배지의 기능들의 개관 뿐만 아니라 이들의 조성의 예는 다음 표에 도시되어 있다.
| 기능 | 제 1 배지 | 제 2 배지 | 제 3 배지 |
| 분화 | 난포를 포함하는 전-협막 세포에서 협막 세포로(1차에서 2차 난포로) | 2차 난포에서 배란전(PO) 난포로 | PO 난포에서 시험관내 배란된 메타페이스II 또는 성숙난 난모 세포로 |
| 고정 | 용기 표면으로 억제된 고정 | 용기 표면으로 촉진된 고정 | 점액화된 누적-난모 세포 착물의 방출 |
| 조성 예 | α-mem(Gibco BRL 32571-028)1% FCSITSFSHLH | α-mem(Gibco BRL 32571-028)5% FCSITSFSHLH | α-mem(Gibco BRL 32571-028)5% FCSITSFSHLHHCGEGF |
FCS = 태아 송아지 혈청, ITS = 인슐린-트랜스페린 소듐 셀레나이트(1ml당 5μg/5μg/5ng), FSH = 난포 자극 호르몬 (10mIU/ml - 100 mIU/ml), LH = 루테인니싱 호르몬(0 - 10mIU/ml), HCG = 인체 융모막 고나도트로핀 (1.5 IU/ml), 및 EGF = 표피 성장 인자(10ng/ml).
α-mem은 Waymouth 배지 등의 임의의 적절한 기저 세포 배양 배지로 대체될 수 있다.
4.A.: 제1차 난포들을 사용하는 실시예
제1차 난포들(즉, 협막 세포들로 아직 완전히 분화되지 않고 이들의 표면 상에 LH 수용체들을 발현시킬 수 없을지도 모르는 전-협막 세포들을 갖는 난포들)이 사용되는 경우에, 제1 배양 배지에 의한 제1 배양 단계는 반드시 필요하다.
이 단계에서, 상기 제1 배지가 사용된다. 이 배지는 전-협막 세포들을 성장시키고, 추가로 협막 세포들로 분화시킨다. 난포들은 예를 들면 4일의 기간 동안 배지 75㎕ 중에서 배양된다. 4일 후, 50 내지 100㎛의 시작 크기였던 난포들은 통상적으로 그들의 발육의 제2 스테이지(프리앤트럴 스테이지)에 도달할 것이다(보다 작은 크기의 1차 난포들은 프리앤트럴 스테이지에 도달하는 데 8일 가량을 필요로 할 것이다). 난포 크기는 약 100 - 130㎛가 될 것이고, 크기의 증가는 주로 과립막 세포 증식 및 난모 세포 성장에 기인한다. 이후의 공정에 대해서는 제2차 난포들로부터 시작할 때와 동일하다.
4.B.: 제2차 난포들을 사용하는 실시예
제2차 난포들로부터 시작할 때, 누구나 제2 배지를 사용하는 배양으로 즉시 시작할 수 있다. 이 배지는 배양 수령 표면으로의 접착을 촉진시킬 것이다. 배양 배지는 4일 마다 새로이 공급된다. 12일 째에, 배양 배지는 제2 배지 대신에 제3 배지를 사용하여 새로이 공급된다. 이 배지는 난포로부터 점액화된 난모 세포 누적 착물의 방출을 철야 야기시킬 것이고, 그 동안 난모 세포는 성숙화를 종결시킨다.
바람직하게는, 96-웰 축소된 표면 영역 플레이트(A2, Costar)가 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용된다. 배양은 배양 배지 75㎕에서 행해진다. 배지를 새롭게 공급할 때, 사용된 배지 30㎕는 제거하고 새로운 배지 30㎕가 부가된다.개략적으로, 모든 공정은 다음과 같이 요약될 수 있다:
| 일 | 제1차 | 제2차 |
| 0 | 플레이팅(배지1) | 플레이팅(배지2) |
| 4 | 30㎕제거배지 2의 30㎕부가 | 30㎕제거배지 2의 30㎕ |
| 8 | 30㎕제거배지 2의 30㎕부가 | 30㎕제거배지 2의 30㎕부가 |
| 12 | 30㎕제거배지 2의 30㎕부가 | 30㎕제거배지 3의 30㎕부가 |
| 13 | - | 난모 세포 회수 |
| 16 | 30㎕제거배지 3의 30㎕부가 | |
| 17 | 난모 세포 회수 |
바람직한 셋업은 도 3에 나타낸다. 96-웰 축소된 표면 영역 편평 바닥 배양 플레이트들(Costar)이 사용된다. 도 3a는 첫 번째로 가능한 셋업을 보여준다. 검은 원들은 배양 웰들을 나타내고, 하얀 원들은 물로 채워진 웰들을 지정한다.
다른 가능한 셋업은 도 3b에 주어진다. 여기서, E열은 배양을 위해 사용되는 한편, 모든 다른 웰들은 물로 채워져 있다. 물은 플레이트 레벨에서 적절한 마이크로환경 (100% 습도)을 창출하기 위해 부가된다.
도 4는 본 발명에 따른 방법을 사용할 때 난포의 발육을 보여준다. 제1차 또는 제2차 난포들을 (a) 배양액에 넣는다. 제2 배지 중에서 배양될 때, 배양 용기 표면으로의 부착이 촉진된다. 협막-간질 세포 증식(31)이 촉진되고, 수용체 표면으로의 부착을 초래한다(b, c). 12일의 배양 기간 동안, 난포는 추가로 발육 및 성장한다(b, c, d). 난포의 성장은 구조의 단절 및 난포내 공동들의 형성을 유도한다(d)(33). 상기 공동들 및 단절들은 양호한 배지 순환을 제공하고, 따라서 생존율의 증가는 난모 세포에 대해 변화하고, 따라서 영양분과 산소를 충분히 공급받을 것이다. 제3 배지의 부가는 난모 세포-누적 착물의 방출을 유도할것이다(e)(35).
실시예 5
탁솔의 화학적 충격을 시험하기 위한 본 발명에 따라 얻어진 난포들의 용도
실시예 4에서와 동일한 방법이 사용된다. 제2차 난포들이 사용된다. E열의 난포 배양물들을 갖는 10개의 96-웰 플레이트들이 난포 발생에 대한 탁솔의 영향을 시험하기 위해 사용된다(웰당 75㎕). 배양 단계들에 사용된 모든 배지는 다음과 같이 구성된다:
| 플레이트 번호 | 탁솔 농도 |
| 1 및 2 | -(대조군) |
| 3 및 4 | 0.01nM |
| 5 및 6 | 0.1nM |
| 7 및 8 | 1nM |
| 9 | 10nM |
배양 배지는 30㎕를 제거하고 새로운 배지 30㎕를 추가함으로써 4일마다 새롭게 공급된다.
13일 후, 난포들은 생존률, 점액화, 극체(PB)의 존재, 및 난모 세포 직경에 대해 점수가 매겨진다. 표준 편차(sd)를 갖는 평균값들이 주어진다:
| 플레이트 번호 | 생존율 | 점액화 | PB | 직경 | ||||
| 평균 | 편차 | 평균 | 편차 | 평균 | 편차 | 평균 | 편차 | |
| 1+2 | 100% | 0% | 96% | 0.06% | 78% | 0.07 | 72.9 | 0.57 |
| 3+4 | 87% | 0.19 | 100% | 0 | 75% | 0 | 72.9 | 0.42 |
| 5+6 | 100% | 0 | 96% | 0.06 | 75% | 0.11 | 71.6 | 0.14 |
| 7+8 | 92% | 0 | 96% | 0.06 | 55% | 0.13 | 71.7 | 0.14 |
| 9 | 0% | - | 0 | - | 0 | - | 0 | - |
실시예 6
본 발명에 따라 얻어진 난모 세포들을 사용한 시험관 내 수정(IVF) 및 배 수송(ET):
IVF를 위해 사용된 배지는 KSOM을 포함하고, 이는 물 중에 다음 성분들을 포함한다:
| 농도(mM) | 농도(g/l) | 농도(ml/l) | |
| Nacl | 95.00 | 5.552 | |
| KCl | 2.50 | 0.185 | |
| 포도당 | 5.56 | 1 | |
| KH2PO4 | 0.35 | 0.047 | |
| MgSO4 | 0.20 | 0.24 | |
| 락테이트 | 10.00 | 2.270 | |
| 피루베이트 | 0.20 | 0.022 | |
| NaHCO3 | 25.00 | 2.1 | |
| CaCl2˙2H2O | 1.71 | 0.25 | |
| L-글루타민 | 1.0 | 0.146 | |
| EDTA | 0.01 | 0.029 | |
| 스트렙토마이신 | 0.05 | ||
| 페니실린 | 0.06 | ||
| 페놀레드 | 0.01 |
KSOM 배지에 3% 비결정질 송아지 혈청 알부민(BSA)이 보충된다.
실시예 4에서 얻어진 바의 누적 형성을 포함하는 완전히 성숙된 난모 세포들이 선택된다. 정자는 부고환 제거 및 절개에 의해 수집된다. 이어서, 정자는 KSOM + 3% BSA 중에서 2시간 동안 인큐베이션될 수 있고, 카운트되고, 운동성에 대해 점수가 매겨진다. 필요할 경우, 농도는 2.106/ml의 타겟 농도로 조절된다.
선택된 난모 세포-누적 착물들은 KSOM + 3% BSA 30㎕로 전송되고, 능력있는 정자 10㎕가 부가되고, 2:30h의 인큐베이션 단계가 이어진다.
인큐베이션 단계 후, 난모 세포들은 배아 배양 접시들 (KSOM + 0.5% BSA)로 옮겨진다. 난모 세포들은 먼저 20㎕ 피펫으로 여러 차례 피페팅함으로써 세정되고, 난모 세포로부터 정자 세포들 및 누적 세포들의 분리를 초래한다.
추가로 24시간 더 인큐베이션시킨 후, 난모 세포들은 2-세포 배아 스테이지의 검출에 의해 수정에 대해 평가받을 수 있다.
72%에 이르는 수정율 및 90%에 이르는 배아낭포(blastocyst) 발육율이 본 발명의 방법에 의해 제공되는 난모 세포들에 의해 얻어졌다.
Claims (12)
- 순차적으로- 시험관 내 배양을 위한 적절한 용기를 제공하는 단계,- 포유 동물의 난소로부터 적어도- 협막 또는 전-협막 세포,- 과립막 세포 및- 난모 세포를 포함하는 난포를 선택하는 단계,- 오일이 없는 제1 배지를 억제시키는 부착물을 사용하는 임의의 제1 배양 단계,- 오일이 없는 제2 배지를 촉진시키는 부착물을 사용하는 제2 배양 단계, 및- 숙성된 난포를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 난소 난포는 제1차 또는 제2차 난포인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 난소 난포는 냉동되고 해동되는 난소 난포인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 단계 후에 오일이 없는 성숙화 유도 제3 배지를 사용하여 수행되고 점액성의 누적 난모 세포 착물을 초래하는 제3 배양 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 임의의 제1 배양 단계는 제1차 난포들의 제2차 난포들로의 분화를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 배양 단계는 적절한 용기의 표면에 대한 난포의 부착 및 난포의 배란전 난포 또는 배란전형 난포로의 분화를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 제3 단계는 난모 세포의 성숙화 및 상기 난모 세포의 배란형 박리를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적절한 용기는 축소된 면적의 96-웰 편평 바닥 배양 플레이트인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 난포들의 시험관 내 배양 방법.
- - 적어도 하나의 세포 발육 스테이지 동안 화학 약품 또는 물리적 영향의 존재 하에 제1항에 청구된 바의 난포 배양을 실행하는 단계, 및- 그 효과들을 평가하는 단계를 포함하는, 난포 발생에 대한 화학 약품 또는 물리적 영향의 효과들을 평가하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 효과들은 IVF 평가, 수정 및 이식 후 발육 적성 평가, 스핀들 착색, 세포 기관 분석, 염색체 분석 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 확인 방법에 의해 난모 세포의 품질을 확인함으로써 평가되는 것을 특징으로 하는 난포 발생에 대한 화학 약품 또는 물리적 영향의 효과들을 평가하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 효과들은 증식 분석, 분화 분석, 스테로이드 생산, 점액화 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 확인 방법에 의해 난포 발생 품질을 분석함으로써 평가되는 것을 특징으로 하는, 난포 발생에 대한 화학 약품 또는 물리적 영향의 효과들을 평가하는 방법.
- 제9항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 약품 또는 물리적 영향의 존재는 난포 배양 기간 전반에 계속될 수 있거나 계속되지 않는 것을 특징으로 하는, 난포 발생에 대한 화학 약품 또는 물리적 영향의 효과들을 평가하는 방법.
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