JP2004514458A - 卵胞のインビトロ培養方法 - Google Patents

Abstract

本発明は以下の連続ステップを含む、バイオアッセイ目的のための哺乳動物の卵胞のインビトロ培養方法に関する：−　インビトロ培養用の好適な容器を準備し、−　哺乳動物の卵巣から卵胞を選択し、前記卵胞は少なくとも莢膜細胞又は前莢膜細胞、顆粒膜細胞、及び卵母細胞を含んでおり、−　油を含まない付着禁止第一培地を用いた所望の第一培養ステップ、−　油を含まない付着促進第二培地を用いた第二培養ステップ、そして−　成熟した卵胞を得る。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は卵胞のインビトロ培養方法に関する。特に、本発明は哺乳動物の卵巣組織から多数の成熟又は半成熟した卵胞及び／又は卵母細胞を生産する方法に関する。
【０００２】
技術の現状
卵胞生成の研究及びヒト及び非ヒト哺乳動物のための卵母細胞の成熟の分野においてはいくつかの問題が同定されることができる。
【０００３】
インビトロ受精におけるヒトのための及び動物育種のための卵母細胞成熟の幅広い許容及び使用と共に、多量の精子が一般的に採集されてその後の使用のために保存され、実質的に精子の制限のない供給を生成している。しかし、今日に到るまで雌から多数の受精可能な卵を採集して保存する実用的な方法は存在しなかった。この理由は雌の生殖生物学に関する。雌の哺乳動物においては、卵巣中の特定の細胞のみが卵に成熟することができる。これらの胚細胞は全ての哺乳動物において生まれた時に限定的な量で存在しており、卵巣中に保持され、減数分裂の初期段階において拘束されており、その段階では受精されて正常な子孫へと発生することが不可能である。正常な状況下では、これらの細胞のいくつかは動物の生殖サイクルに同調された周期性に従って卵巣内で発生しはじめる。サイクルの適当な時点で、一つ又は少数のこれらの細胞は卵巣から放出される。このプロセスは排卵として知られている。個々の胚細胞が排卵が起こる点まで発生する複雑なプロセスは卵胞生成として知られている。卵胞生成はいくつかの主要なステップ及び卵巣の他の細胞の共同作用並びに下垂体ホルモン及び卵巣ホルモンが関与する。しかし、インビボ卵胞生成は非効率的なプロセスである。
【０００４】
卵胞培養は全身性の影響から無傷の卵胞を単離してそれらの代謝が科学的に調査できるようにすることを意図される実験的技術である。卵胞培養を用いると、卵胞生成は刺激されるか又は最適化されることができる。しかし、原始卵胞から成熟卵胞及び卵母細胞に到るまでの全ての卵胞発生段階を有効に提供することができる卵胞培養方法は今日に至るまで知られていない。利用可能な方法の記述は“Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｏｖａｒｉａｎ　ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ”，Ｇ．Ｍ．Ｈａｒｔｓｈｏｒｎｅ，Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（１９９７）２，９４−１０４に与えられている。
【０００５】
更に、今日に到るまでのほとんど全ての成功的な卵胞培養方法は外部影響から培養を保護するためのバリヤーを与えるために油を用いる。この方法は卵胞生成に対する化学物質（通常生体異物）の影響、特に親油性化合物の影響をテストする可能性を制限する。前記化学物質は破壊的（卵胞生成に対する負の影響）であるかもしれないし、構築的（正の影響−ヒト又は非ヒト哺乳動物における欠陥のある卵胞生成の治療のための可能な医薬検出）であるかもしれない。かかるテストは卵胞生成に対する電磁又はイオン化放射線、超音波の如き物理的影響、例えば放射線医学／放射線治療の影響をアッセイするために工夫されることもできる。技術の現状は卵胞生成のいかなる別個の段階におけるテストをも可能にせず、発生の特定段階における卵胞細胞に対する外部影響の衝撃を評価することは通常不可能である。何故なら卵胞培養は通常、発生の様々な段階における卵胞を含めることによって自然の状況を模倣しようと試みているからである。
【０００６】
存在する他の必要性は卵胞を保存することに対する必要性である。例えばヒトの女性が化学治療又は放射線治療、又は卵巣切除手術を受けなければならない場合、前記保存された卵胞に由来する卵母細胞を用いたインビトロ受精又は着床はこの人が彼女自身の卵母細胞からの子供をなおも持つことができるようにするであろう。このことは卵胞を保存していなければ不可能である。
【０００７】
かかる卵胞保存方法は人工授精と組合わせて一層有効な卵胞生成を生じ、これは幾つかの希少な又は危険にさらされている種が生き残るチャンスに利益をもたらすであろう。
【０００８】
換言すると、哺乳動物の卵巣組織から多数の成熟した又は半成熟の卵胞及び／又は卵母細胞を生成させる新規な方法についての必要性がある。
【０００９】
発明の目的
本発明は哺乳動物の卵巣組織から成熟した又は半成熟の卵胞又は卵母細胞を生成させる新規な方法を提供することを目的とする。特に、本発明の目的は哺乳動物の卵巣組織から単離された一次又は二次卵胞から成熟した又は半成熟の卵胞又は卵母細胞を生成させる方法を提供することである。
【００１０】
更なる目的は卵胞生成及び卵生成に対する化学物質及び物理的影響（例えば電磁又はイオン化放射線、超音波…）の如き外部影響をテストするためのバイオアッセイ環境を提供することであり、特に卵胞生成及び卵生成に含まれる全てのステップの個々のステップに対する、又は特定の発生段階にありかつ正常な全身性影響から単離された卵胞及び卵母細胞に対する外部影響をテストするためのバイオアッセイ環境を提供することである。
【００１１】
他の目的は保存されている卵巣組織から成熟した卵母細胞を生成させる方法を提供することである。
【００１２】
発明の概要
本発明は以下の連続ステップを含むことを特徴とする哺乳動物の卵胞のインビトロ培養方法に関する：
−　インビトロ培養用の好適な容器を準備し、
−　哺乳動物の卵巣から卵胞を選択し、前記卵胞は少なくとも
−　莢膜細胞又は前莢膜細胞
−　顆粒膜細胞、及び
−　卵母細胞
を含んでおり、
−　油を含まない付着禁止第一培地を用いた所望の第一培養ステップ
−　油を含まない付着促進第二培地を用いた第二培養ステップ、そして
−　成熟した卵胞を得る。
【００１３】
前記卵胞は一次又は二次卵胞であることができる。更に、前記卵胞は卵胞ストックから又は卵巣組織から凍結されて解凍された卵胞であることができる。
【００１４】
好ましい実施態様においては、本発明の方法は第二培養ステップの後に行われる第三培養ステップを含み、前記第三培養ステップは油を含まない成熟誘導第三培地を用い、粘液性卵丘−卵母細胞複合体を生ずる。前記第三培養ステップは卵母細胞の成熟及び前記卵母細胞の排卵様分離を含むことが好ましい。
【００１５】
所望の第一培養ステップは一次卵胞から二次卵胞への分化を含むことが好ましい。
【００１６】
第二培養ステップは好適な容器の表面への卵胞の付着及び卵胞の排卵前卵胞又は排卵前様卵胞への分化を含むことが好ましい。
【００１７】
前記好適な容器は減少した面積の９６ウェル平底培養プレートであることが好ましい。
【００１８】
本発明の他の側面は以下のステップを含む卵胞生成に対する化学的又は物理的影響の効果をアッセイする方法である：
・　少なくとも一つの細胞発生段階の間、前記化学的又は物理的影響の存在下で本発明による卵胞培養を実行し、そして
・　効果をアッセイする。
【００１９】
卵胞培養中の特定の短期間のみにおいて化学的又は物理的影響を適用することは卵胞の分化（例えば前腔（ｐｒｅａｎｔｒａｌ）相、腔（ａｎｔｒａｌ）相、排卵の誘導…）における臨界点での影響をアッセイすることを可能にする。前記化学的又は物理的影響の前記存在は卵胞培養の持続中にわたって連続的であることもできる。
【００２０】
前記効果は例えばＩＶＦ評価、受精及び着床後の発生能力の評価、紡錘体染色、細胞小器官分析、染色体分析、又はこれらの組合せからなる群から選択される確認方法による卵母細胞の質の確認によってアッセイされることができるか又は増殖分析、分化分析、ステロイド生産、粘液化、又はこれらの組合せからなる群から選択される確認方法によって卵胞生成の質を分析することによってアッセイされることができることが都合がよい。しかし、本発明は卵母細胞及び卵胞生成の質をアッセイするためのこれらのテストの使用に関連付けられるものではない。
【００２１】
図面の簡単な説明
図１は本発明に従って哺乳動物の卵巣組織から多数の成熟した又は半成熟の卵胞及び／又は卵母細胞を生成させる方法の模式的概要を表す。
【００２２】
図２ａ及び２ｂは発生の一次段階及び発生の初期前腔（二次）段階における卵胞をそれぞれ示す。
【００２３】
図３ａ及び３ｂは本発明の方法を実行するための好ましい培養プレート構成を示す。
【００２４】
図４ａ〜４ｅは本発明の方法に従って培養された卵胞の発生を描写する。
【００２５】
発明の詳細な記述
本発明は哺乳動物の卵巣組織から多数の成熟した又は半成熟の卵胞及び／又は卵母細胞を生成させる方法に関する。特に本発明は哺乳動物の卵巣組織から回収した生殖細胞の成熟した又は半成熟の卵胞及び／又は卵母細胞へのインビトロ発生及び成熟方法に関する。
【００２６】
本発明はいくつかの非限定的実施例を用いて更に明らかにされるであろう。
【００２７】
本発明による方法の概要は図１において見られることができる。図１は哺乳動物の卵巣組織から単離された卵胞から成熟した卵胞及び卵母細胞を得るための全ての必要なステップを模式的に表す。
【００２８】
これらのステップは全て以下の実施例において更に詳細に示されるであろう。
【００２９】
実施例１
二次卵胞の単離及び予備培養（図１中のステップ１）：
卵巣組織は１２〜１４日齢のＦ１ハイブリッドＣ５７Ｂｌ／ｊ６×ＣＢＡｃａマウスから単離され、ＧｌｕｔａＭＡＸ　Ｉ（商標）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　３１４１５−０２９）及び１０％ＨＩＡ　ＦＢＳ（加熱不活性化されたウシ胎仔血清）及び０．１％ペニシリン−ストレプトマイシン−混合物（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　３０３２９０８）を加えたＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ１５培地を含む培養皿中に保持される。卵巣は卵管及び脂肪を除かれる必要がある。
【００３０】
針を用いて、卵巣の表面はひっかかれ、卵胞を懸濁液中へＬ１５培地中へ放出させる。正常な条件下では、一卵巣あたり約３０〜４０の好適な卵胞がこの単離方法を用いて得られるにちがいない。
【００３１】
もし一次卵胞を単離したいならば、７〜８日齢のマウスを用いることができる。この場合、一卵巣あたり約１０〜１５の好適な卵胞を得ることができる。
【００３２】
実施例２
本発明の方法のための卵胞の選択（図１におけるステップ２）：
実施例１からの懸濁液中の卵胞全てが卵胞培養に好適であるわけではない。全ての卵胞がほぼ同じ速度で成長することを確実にするため、選択された卵胞は同様の直径を有するべきである。この特別な例においては、１００〜１３０μｍの直径が好適であり、初期前腔（二次）段階までの卵胞の発生を示す。この場合、卵胞１１は図２ｂにみられる通り、２層の顆粒膜細胞１３及び丸い形状の卵母細胞１５を有するべきである。前記卵胞は莢膜間質細胞１７、基底膜１９及び透明帯２１を更に含む。卵胞は実体顕微鏡下で観察され、倒立顕微鏡下で測定される。好適な卵胞は適切に配置されたパスツールピペットを用いて取り上げられ、凍結容器（保存用。実施例３参照）又は培養プレート（卵胞培養用。実施例４参照）に移される。
【００３３】
二次よりも早い発生段階にある卵胞も本発明を実行するために用いることができる。卵胞が十分に分化しているかどうかを決定する最も重要な要因は莢膜細胞１７又は前莢膜細胞２３の存在である。これらは図２ａにみられる通り一次段階の卵胞の外側表面に存在する。前莢膜細胞はそれらの表面上にＬＨ受容体をまだ発現していないかもしれない。実施例で用いられるマウスモデルにおいては、かかる一次段階の卵胞の大きさは約７０〜１００μｍの間にある。しかし、この大きさはマウスシステムに特異的であり、他の種についての好適な大きさは上述の細胞発生段階に関連づけることによって当業者によって決定されることができる。
【００３４】
実施例３
卵胞ストックの生成及び使用（図１におけるステップ３）：
卵胞ストックは当業者には既知の凍結保存技術を用いることによって生成されることができる。かかる技術の例は以下のパラグラフにおいて記述されている。
【００３５】
実施例２において得られた通りの卵胞はプラスチックの凍結容器（Ｓｉｍｐｏｒｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）中に採取される。一容器あたり２５の卵胞が１０％加熱不活性ＦＣＳ及び１．５Ｍ　ＤＭＳＯを加えたＬ１５培地１５０μｌ中に懸濁される。低速凍結が制御されプログラムされた凍結装置（Ｃｅｌｌ　Ｆｒｅｅｚｅｒ　Ｒ２０４；Ｐｌａｎｅｒ，Ｓｕｎｂｕｒｙ−ｏｎ−Ｔｈａｍｅｓ，ＵＫ）を用いて行われる。卵胞は４℃で１５分間凍結混合物中で平衡され、次に２℃／分の割合で−７℃まで冷却される。手動での接種の後、温度は−０．３℃／分の割合で−４０℃にまで低下され、その後液体窒素中で保存され、卵胞は−５０℃／分の割合で−１１０℃まで極めて迅速に冷却される。
【００３６】
卵胞は凍結容器を３７℃にまで温めることによって極めて迅速に解凍される。凍結保護剤の希釈は室温で１５分の三つのステップ（ＤＭＳＯ濃度を１．５Ｍから１Ｍへ、次に０．５Ｍへ減少させる）で行われた。培養前、卵胞は３７℃で単離培地中で１５分間平衡される。この時点から、卵胞は新しく得られた卵胞として取り扱われることができる。
【００３７】
実施例４
卵胞培養（図１中のステップ４）：
卵胞培養は分化された卵胞を与えることができる少なくとも一つの培養ステップからなる。分化は好適な培地を用いることによって誘発される。本発明の方法においては、培地は第一培地、第二培地及び第三培地という三つのグループに割けることができる。正しい分化段階における正しい培地の使用は本発明の方法を成功して実行させるために重大である。
【００３８】
二つの実施例はいかにして異なる分化段階にある卵胞を用いて本発明の方法を用いることができるかを示すであろう。
【００３９】
インキュベーション期間に言及する場合、特別に指示しない限り以下の条件が適用される：
・　温度：３７℃
・　空気混合物：空気中の５％ＣＯ_２
・　湿度：１００％飽和
【００４０】
また、インキュベーション期間はマウス以外の種を用いる場合、等価な結果を得るために変更されてもよい。実施例はマウスシステムについて最適化されている。
【００４１】
特定の培地の機能の概要及びそれらの組成の例は以下の表に見られることができる：
【表１】

【００４２】
４．Ａ．：一次卵胞を用いた実施例
一次卵胞（即ち、莢膜細胞へとまだ十分に分化していない前莢膜細胞を有する卵胞であって、それらの表面にＬＨ受容体を発現していないことがある卵胞）が用いられる場合には、第一培養倍地を用いた第一培養ステップが必要である。
【００４３】
このステップにおいて上述した第一培地が用いられる。この培地は前莢膜細胞が増殖して莢膜細胞へと更に分化することを可能にするであろう。卵胞は例えば７５μｌの培地中で４日間培養される。４日後、開始時の大きさが９０〜１００μｍである卵胞はそれらの発生の第二段階（前腔段階）に通常到達する（小さい大きさの一次卵胞は前腔段階に到達するのに最大８日を必要とするであろう）。卵胞の大きさはこの時約１００〜１３０μｍである。大きさの増大は主に顆粒膜細胞の増殖及び卵母細胞の成長によるものである。これ以降の更なる手順は二次卵胞から開始する場合と同一である。
【００４４】
４．Ｂ．：二次卵胞を用いた実施例
二次卵胞から開始する場合、第二培地を用いる培養で直ちに開始することができる。この培地は培養容器表面への接着を促進するであろう。培養培地は４日ごとに更新される。１２日目に培養培地は第二培地の代わりに第三培地を用いて更新される。この培地は一晩で卵胞からの粘液性卵丘−卵母細胞複合体の放出を引き起こし、卵母細胞は成熟を完了する。
【００４５】
好ましくは、９６ウェルの減少された表面積のプレート（Ａ２、Ｃｏｓｔａｒ）が本発明の方法を実施するために用いられる。培養は７５μｌの培養培地中で行われる。培地を更新する場合、使用された培地の３０μｌが除去され、３０μｌの新鮮な培地が添加される。模式的には両方の手順は以下のように要約されることができる：
【表２】

【００４６】
好ましい構成は図３に示されている。９６ウェルの減少された表面積の平底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）が用いられる。図３ａは第一の可能な構成を示す。黒丸は培養ウェルを示し、白丸は水で充填されたウェルを示す。
【００４７】
他の可能な構成は図３ｂに与えられている。ここで、列Ｅは培養に用いられ、他のウェルは全て水で充填されている。水はプレートレベルで好適な微小環境（１００％湿潤）を作り出すために添加される。
【００４８】
図４は本発明による方法を用いる場合の卵胞の発生を示す。一次又は二次卵胞（ａ）が培養中にもたらされる。第二培地中で培養された場合、培養容器表面への付着が促進される。莢膜間質細胞の増殖（３１）が促進され、これは容器表面への付着を生ずる（ｂ，ｃ）。１２日の培養中、卵胞は更に発生し、成長する（ｂ，ｃ，ｄ）。卵胞の成長は構造の破壊をもたらし、卵胞内腔の形成をもたらす（ｄ，３３）。前記腔及び破壊は良好な培地循環を与え、かくして卵母細胞に生存可能性の増大を与える。というのは、それは栄養及び酸素を十分に供給されるからである。第三培地の添加は卵母細胞−卵丘複合体の放出をもたらすであろう（ｅ，３５）。
【００４９】
実施例５
タキソールの化学的衝撃をテストするための本発明により得られた卵胞の使用：
実施例４と同じ方法が用いられる。二次卵胞が用いられる。列Ｅ中に卵胞培養を有する９６ウェルプレートが卵胞生成に対するタキソール（１ウェルあたり７５μｌ）の影響をテストするために用いられる。培養ステップで用いられる全ての培地は以下のように構成される：
【表３】

【００５０】
培養培地は３０μｌを除去して３０μｌの新鮮な培地を加えることによって４日ごとに更新される。
【００５１】
１３日後、卵胞は生存、粘液化、極体（ＰＢ）の存在及び卵母細胞の直径について採点される。平均値及び標準偏差（ｓｄ）が与えられる：
【表４】

【００５２】
この方法を用いると、卵胞生成及び卵母細胞成熟に対する化合物の影響をアッセイすることができる。
【００５３】
実施例６
本発明を用いて得られた卵母細胞を用いたインビトロ受精（ＩＶＦ）及び胎芽移植（ＥＴ）：
ＩＶＦのために用いられた培地はＫＳＯＭを含み、水中に以下の成分を含む：
【表５】

【００５４】
ＫＳＯＭ培地は３％の非結晶質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加された。
【００５５】
実施例４で得られたように卵丘形成を含む十分に成熟した卵母細胞が選択される。精子は精巣上体の除去及び切開によって採集される。次に精子はＫＳＯＭ＋３％ＢＳＡ中で２時間インキュベーションすることによって受精能を獲得させられ、計数され、運動性について採点された。もし必要なら、濃度は２×１０^６／ｍｌの標的濃度に調整される。
【００５６】
選択された卵母細胞−卵丘複合体は３０μｌのＫＳＯＭ＋３％ＢＳＡ中に移され、１０μｌの受精能を獲得させられた精子が添加され、２時間３０分のインキュベーションステップが続いて行われる。
【００５７】
インキュベーションステップの後、卵母細胞は胚培養皿（ＫＳＯＭ＋０．５％ＢＳＡ）に移される。卵母細胞は２０μｌピペットで繰り返しピペッティングすることによってまず清浄にされ、卵丘細胞及び精子細胞の卵母細胞からの脱離を生じる。
【００５８】
２４時間の更なるインキュベーション後、卵母細胞は２細胞胚段階の検出によって受精について採点されることができる。
【００５９】
７２％までの受精率及び９０％までの胚盤胞発生率が本発明の方法によって与えられる卵母細胞によって得られている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明に従って哺乳動物の卵巣組織から多数の成熟した又は半成熟の卵胞及び／又は卵母細胞を生成させる方法の模式的概要を表す。
【図２】
図２ａ及び２ｂは発生の一次段階及び発生の初期前腔（二次）段階における卵胞をそれぞれ示す。
【図３】
図３ａ及び３ｂは本発明の方法を実行するための好ましい培養プレート構成を示す。
【図４】
図４ａ〜４ｅは本発明の方法に従って培養された卵胞の発生を描写する。

Claims (12)

1. 以下の連続ステップを含むことを特徴とする哺乳動物の卵胞のインビトロ培養方法：
   −　インビトロ培養用の好適な容器を準備し、
   −　哺乳動物の卵巣から卵胞を選択し、前記卵胞は少なくとも
   −　莢膜細胞又は前莢膜細胞
   −　顆粒膜細胞、及び
   −　卵母細胞
   を含んでおり、
   −　油を含まない付着禁止第一培地を用いた所望の第一培養ステップ、
   −　油を含まない付着促進第二培地を用いた第二培養ステップ、そして
   −　成熟した卵胞を得る。
2. 前記卵胞が一次又は二次卵胞である請求項１記載の方法。
3. 前記卵胞が凍結されて解凍された卵胞である請求項１又は２記載の方法。
4. 方法が第二培養ステップの後に行われる第三培養ステップを含み、前記第三培養ステップが油を含まない成熟誘導第三培地を用い、粘液性卵丘（ｍｕｃｉｆｉｅｄ　ｃｕｍｕｌｕｓ）−卵母細胞複合体を生ずる請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. 所望の第一培養ステップが一次卵胞から二次卵胞への分化を含む請求項１〜４のいずれか一項の方法。
6. 第二培養ステップが好適な容器の表面への卵胞の付着及び卵胞の排卵前卵胞又は排卵前様卵胞への分化を含む請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
7. 第三培養ステップが卵母細胞の成熟及び前記卵母細胞の排卵様分離を含む請求項４記載の方法。
8. 前記好適な容器が減少した面積の９６ウェル平底培養プレートである請求項１記載の方法。
9. 以下のステップを含む卵胞生成に対する化学的又は物理的影響の効果をアッセイする方法：
   ・　少なくとも一つの細胞発生段階の間、前記化学的又は物理的影響の存在下で請求項１に記載の通りの卵胞培養を実行し、そして
   ・　効果をアッセイする。
10. 前記効果がＩＶＦ評価、受精及び着床後の発生能力の評価、紡錘体染色、細胞小器官分析、染色体分析、又はこれらの組合せからなる群から選択される確認方法による卵母細胞の質の確認によってアッセイされる請求項９記載の方法。
11. 前記効果が増殖分析、分化分析、ステロイド生産、粘液化、又はこれらの組合せからなる群から選択される確認方法によって卵胞生成の質を分析することによってアッセイされる請求項９記載の方法。
12. 前記化学的又は物理的影響の前記存在が卵胞培養の持続中にわたって連続的又は不連続的である請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。

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