KR20240010556A - 해산 어류의 난소의 유지 방법 및 배양액의 조정 방법과, 해산 어류의 알 또는 수정란의 생산 방법 - Google Patents
해산 어류의 난소의 유지 방법 및 배양액의 조정 방법과, 해산 어류의 알 또는 수정란의 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
해산 어류의 난소의 유지 방법 및 수정란 취득 방법의 제공. 해산 어류로부터 난소를 적출하여, 난소 또는 단편화된 난소를 배양액 중에서 배양하는 난소의 유지 방법. 또한, 적출 후 유지한 난소를 배란시켜 인공 수정시키는 것을 특징으로 하는, 해산 어류의 수정란 취득 방법. 또한, 상기 배양액을 사용한 해산 어류의 배란 알의 수정능 유지 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 해산 어류의 수정란 취득이 용이해져서, 효율적으로 종묘를 제조할 수 있다.
Description
(우선권 정보)
본 국제 출원은 2015년 3월 26일에 일본 특허청에 출원된 특허 출원인 일본 특허 출원 특원 2015-65124호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 일본 특허 출원 특원 2015-65124호의 전체 내용을 참조로서 본 국제 출원에 원용한다.
본 발명은 해산 어류의 난소의 유지 방법 및 이것에 사용하는 배양액의 조정 방법 및 해산 어류의 알 또는 수정란의 생산 방법에 관한 것이다.
현재, 해산 어류로부터의 알의 생산 방법으로서 천연 또는 양식한 물고기가 자연 산란한 알을 회수하는 방법은 알려져 있다. 일부 양식어에서는, 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬을 수중에서 유영 중인 물고기에게 투여하여, 성숙 및 채란을 유도하는 방법이 개시되어 있다 (비특허 문헌 1). 그러나, 상기 방법에서 얻어지는 알을 상처 없이 회수하는 것은 어렵고, 인공 수정을 실시하여도 성공율이 낮은 경우가 많다.
또한, 낚아올린 물고기로부터 성숙한 수정 가능한 알 및 정자를 채취하여, 인공 수정하기도 한다 (비특허 문헌 2). 인공 수정을 성공시키기 위해서는, 수정에 적합한 시기의 알, 예를 들면, 배란할 알을 가진 개체로부터 알을 얻을 필요가 있다. 그러나, 해산 어류의 생활사에 있어서, 수정에 적합한 시기의 알을 가지고 있는 시기는 짧다. 또한, 해산 어류에 있어서는 수정에 적합한 시기의 알을 가진 개체를 외관으로 구별하기는 어렵다. 물고기를 낚아올린 후에 알의 상태를 조사하는 경우에도, 낚아올려서 알 상태를 조사하는 것으로 인해 쇠약해지거나 또는 폐사하는 경우가 많기 때문에, 물고기를 낚아올려서 이 물고기의 알의 상태를 조사한 후에, 다시 수중으로 돌려보내서 수정에 적합한 시기의 알을 가질 때까지 기다리기도 어렵다. 이 때문에, 상기 방법에서 얻은 알로는 인공 수정을 하더라도 성공율이 낮다. 또한, 낚아올린 물고기로부터 난소를 적출하면, 신속하게 알이 불활성화하기 때문에, 적출한 난소로부터 수정 가능한 알을 얻기가 어려웠다.
C.C. Mylonas et al., Reviews in Fisheries Science, Volume 15, Issue 3, pp183-210(2007)
본 발명은 해산 어류에 있어서, 적출한 난소에 포함되는 알의 수정능을 유지하고, 상기 난소로부터 알을 얻는 것, 특히 수정하여, 부화할 수 있는 능력이 있는 알을 얻는 것에 관한 것이다.
본 발명은 이하의 발명에 관한 것이다.
＜1＞ 해산 어류로부터 난소를 적출하고, 상기 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 배양액 중에서 배양하는 해산 어류의 난소의 유지 방법.
＜2＞ 난소에 포함되는 알을 수정 가능한 상태로 유지하는 ＜1＞에 기재된 방법.
＜3＞ 난소는 난모 세포를 포함하는 난소인 ＜1＞ 또는 ＜2＞에 기재된 방법.
＜4＞ 배양액의 pH는 난소를 적출한 어종의 난소강액의 pH와 비교하여 ＋0.5에서 -0.5의 범위가 되도록 조정한 것인 ＜1＞ 내지 ＜3＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜5＞ 배양액의 침투압이 100 mOsm/kg 이상 6000 mOsm/kg 이하인 ＜1＞ 내지 ＜4＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜6＞ 배양액이 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온으로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 ＜1＞ 내지 ＜5＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜7＞ 배양액의 나트륨 이온 농도가 120 mM 이상 250 mM 이하인 ＜6＞에 기재된 방법.
＜8＞ 배양액의 칼륨 이온 농도가 5 mM 이상 10 mM 이하인 ＜6＞ 또는 ＜7＞에 기재된 방법.
＜9＞ 배양액의 칼슘 이온 농도가 1.5 mM 이상 5.0 mM 이하인 ＜6＞ 내지 ＜8＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜10＞ 배양액의 마그네슘 이온 농도가 1.0 mM 이상 2.0 mM 이하인 ＜6＞ 내지 ＜9＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜11＞ 배양액이 염소 이온 및/또는 황산 이온을 함유하는 ＜1＞ 내지 ＜10＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜12＞ 배양액이 글루코스, 갈락토스, 과당, 자당으로부터 선택되는 1종 이상의 당을 함유하는 ＜1＞ 내지 ＜11＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜13＞ 배양액이 항생 물질을 포함하는 ＜1＞ 내지 ＜12＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜14＞ 난소의 적출 대상인 해산 어류는 양식어인 ＜1＞ 내지 ＜13＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜15＞ 난소의 적출 대상인 해산 어류는 낚아올린 물고기인 ＜1＞ 내지 ＜13＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜16＞ 해산 어류는 고등어과 어류인 것인 ＜1＞ 내지 ＜15＞ 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜17＞ ＜1＞ 내지 ＜16＞ 중 어느 하나에 기재된 방법으로 배양한 난소를 배란시켜서 알을 얻는 해산 어류의 알의 생산 방법.
＜18＞ ＜17＞에 기재된 방법에 의하여 얻은 알과 정자를 교배시켜서 수정란을 얻는 해산 어류의 수정란의 생산 방법.
＜19＞ ＜17＞에 기재된 방법으로 얻은 해산 어류의 알.
＜20＞ ＜18＞에 기재된 방법으로 얻은 해산 어류의 수정란.
＜21＞ ＜18＞에 기재된 방법으로 얻은 수정란으로부터 부화한 자어를 치어, 미성어 또는 성어까지 성육시키는 성육하는 공정을 포함하는 해산 어류의 성육 방법.
＜22＞ ＜18＞에 기재된 방법으로 얻은 수정란으로부터 부화한 자어를 치어, 미성어 또는 성어까지 성육시키는 공정을 포함하는 양식 해산 어류의 생산 방법.
＜23＞ 해산 어류로부터 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 유지하기 위해서 사용되는 배양액의 조정 방법으로,
난소의 적출 대상인 어종의 난소강액의 pH를 측정하는 공정과,
나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온으로부터 선택되는 1종 이상의 농도를 조정하는 것으로, 측정된 난소강액의 pH에 대하여 ＋0.5로부터 -0.5의 범위가 되도록 배양액의 pH 조정하는 공정을 포함하는 방법.
＜24＞ 배양액의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 몰 농도를 난소의 적출에 사용하는 해산 어류의 혈청의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 각각 1/4 내지 4배의 몰 농도로 조정하는 ＜23＞에 기재된 방법.
본 발명에 의하여, 해산 어류에서 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 수정 가능한 상태로 유지할 수 있다. 또한, 상기 난소로부터 알을 얻는 것, 특히 수정하여 부화할 수 있는 능력이 있는 알을 얻을 수 있다. 이로 인해 해산 어류의 수정란의 취득이 용이해지고, 효율적으로 종묘를 제조할 수 있다.
[도 1] 생체 내에서 배란한 알을 무처리의 대조구 및 배양액 중에 담그는 배양액구에 있어서의 각 수정 시간의 부상율을 나타내는 그래프이다. 별표는 0 시간에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 2] 생체 내에서 배란한 알을 무처리의 대조구 및 배양액 중에 담그는 배양액구에 있어서의 각 수정 시간의 수정율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 0 시간에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 3] 생체 내에서 배란한 알을 무처리의 대조구 및 배양액 중에 담그는 배양액구에 있어서의 각 수정 시간의 부화율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 0 시간에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 4] 난소 적출 0, 1, 2, 또는 3 시간 후 실험구 및 대조구에 있어서의 배란율의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 다른 알파벳은 동일한 실험구군 내에서의 유의차를 나타내는 것으로, 알파벳 위의 문자는 군을 나타낸다.
[도 5] 각 실험구에 있어서의 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리의 2 시간 후에 있어서 배란한 알의 형태를 나타내는 사진이며, (A) 난소 적출 0 시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (B) 난소 적출 1 시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (C) 난소 적출 2시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (D) 난소 적출 3 시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (E) 대조구, (F) 별개체에서 얻은 생체 내에서 배란한 알의 형태이다.
[도 6] 실험구 및 대조구에 있어서의 정상적인 또는 이상한 형태를 나타내는 배란한 알의 출현 빈도를 나타내는 그래프이다.
[도 7] 생체 외에서의 배란으로부터 얻은 수정란 및 부화 자어를 보여주는 사진이며, (A)는 수정란, (B)는 부화 자어다.
[도 8] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 배란율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 9] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부상율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 10] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 수정율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 11] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부화율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 12] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 배란율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 13] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부상율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 14] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 수정율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 15] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부화율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 2] 생체 내에서 배란한 알을 무처리의 대조구 및 배양액 중에 담그는 배양액구에 있어서의 각 수정 시간의 수정율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 0 시간에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 3] 생체 내에서 배란한 알을 무처리의 대조구 및 배양액 중에 담그는 배양액구에 있어서의 각 수정 시간의 부화율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 0 시간에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 4] 난소 적출 0, 1, 2, 또는 3 시간 후 실험구 및 대조구에 있어서의 배란율의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 다른 알파벳은 동일한 실험구군 내에서의 유의차를 나타내는 것으로, 알파벳 위의 문자는 군을 나타낸다.
[도 5] 각 실험구에 있어서의 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리의 2 시간 후에 있어서 배란한 알의 형태를 나타내는 사진이며, (A) 난소 적출 0 시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (B) 난소 적출 1 시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (C) 난소 적출 2시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (D) 난소 적출 3 시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구, (E) 대조구, (F) 별개체에서 얻은 생체 내에서 배란한 알의 형태이다.
[도 6] 실험구 및 대조구에 있어서의 정상적인 또는 이상한 형태를 나타내는 배란한 알의 출현 빈도를 나타내는 그래프이다.
[도 7] 생체 외에서의 배란으로부터 얻은 수정란 및 부화 자어를 보여주는 사진이며, (A)는 수정란, (B)는 부화 자어다.
[도 8] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 배란율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 9] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부상율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 10] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 수정율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 11] 1 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부화율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 12] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 배란율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 13] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부상율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 14] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 수정율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
[도 15] 2 개체째의 난소를 사용한 시험에 있어서의 실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구의 각 배양 시간에서의 부화율을 나타내는 그래프이다. 그래프 중의 별표는 표준 배양액구에 대한 유의차를 나타내는 것으로, *：P<0.05, **：P<0.01, ***：P<0.001을 의미한다.
이하, 본 발명에 대하여 예시물 등을 들어 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 예시물 등에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 요지를 일탈하지 않는 범위에서 임의로 변경하여 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「A에서 B」또는 「A 내지 B」란 그 전후의 수치 또는 물리량을 포함하는 표현으로서 사용하는 것으로 한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「A 및/또는 B」라고 하는 표현은 「A 및 B의 어느 하나 또는 쌍방」을 의미한다. 즉, 「A 및/또는 B」에는 「A만」, 「B만」, 「A 및 B의 쌍방」이 포함된다.
본 발명은 해산 어류로부터 난소를 적출하고, 상기 적출한 난소 또는 단편화한 난소를 배양액 중에서 배양하여, 상기 난소에 포함되는 알을 수정 가능한 상태로 유지하는 해산 어류의 난소의 유지 방법 (이하, 「본 발명의 난소 유지 방법」이라고 하는 경우가 있다.)에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 실시 상태는 본 발명의 난소 유지 방법으로 배양한 난소를 배란시켜서 알을 얻는 해산 어류의 알의 생산 방법 (본 발명의 알의 생산 방법)이다.
또한, 본 발명의 다른 실시 상태는 본 발명의 해산 어류의 알의 생산 방법에 따라 얻은 알과 정자를 교배시켜서 수정란을 얻는 해산 어류의 수정란의 생산 방법(본 발명의 수정란의 생산 방법)이다.
또한, 본 발명의 다른 실시 상태는 본 발명의 알의 생산 방법과 관련한 해산 어류의 성육 방법 (본 발명의 해산 어류의 성육 방법), 양식 해산 어류의 생산 방법 (본 발명의 해산 어류의 성육 방법)이다.
또한, 이하에서는 본 발명의 모든 실시 상태를 총칭하여 「본 발명」이라고 기재하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서, 「해산 어류」란, 자연 환경하에서 바다에 서식하는 물고기를 의미하고, 바다에서 성어가 되는 물고기, 알을 성숙시키는 물고기, 바다에서 배란을 하는 물고기 및/또는 바다에서 수정을 하는 물고기가 모두 포함된다.
물고기에는 경골 (硬骨) 어류가 포함된다. 경골 어류에는, 청어목, 홍메치목, 샛비늘치목, 이악어목, 금눈돔목, 대구목, 아귀목, 숭어목, 색줄멸목, 동갈치목, 금눈돔목, 달고기목, 쏨뱅이목, 농어목, 가자미목, 복어목의 어류가 포함된다. 농어목의 물고기에는 농어 아목, 등가시치 아목, 도루묵 아목, 망둑어 아목, 쥐돔 아목, 고등어 아목, 샛돔 아목의 물고기가 포함된다.
고등어 아목의 물고기에는 꽁치과, 점고등어과, 갈치과, 고등어과, 황새치과, 청새치과의 물고기가 포함된다. 물고기에는 양식어가 포함된다. 물고기에는 인공 사육된 것이 포함된다. 물고기에는 특정 종의 물고기 외에 잡종이 포함된다. 물고기에는 인공적으로 작출한 2배체, 3배체, 4배체, 이수배수체를 포함하는 배수체의 물고기가 포함된다. 물고기에는 인공적으로 작출한 키메라, 유전자 도입 개체, 유전자 개변 개체, 유전자 조작 개체, 형질 전환체가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「양식어」란, 활어조 등에서 인공적으로 사육되고 있는 물고기를 말한다. 양식어에는 특히 물고기의 증양식을 목적으로 하여 사육되고 있는 물고기가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「난소」란 자성 생식기로 알을 만들어내는 기관을 말한다. 난소에는 자연 환경하에서 만들어지는 것 외에, 인공적인 환경에서 만들어지는 것도 포함된다. 난소에는 생체 내에서 만들어지는 것이 포함된다. 난소에는 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬으로 예시되는 성 호르몬을 물고기에 투여함으로써 성숙되는 것이 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「알」이란, 난소에서 생성되는 자성 배우자를 말한다. 알에는 난모 세포가 성숙한 알이 포함된다. 알에는 수정 전의 미수정란 및 자연 환경하 또는 인공 환경하에서 수정한 수정란이 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「난모 세포」란 감수 분열에 의해 생기는 자성 생식 세포를 말한다. 난모 세포에는 난소 내의 감수 분열에 의해 생기는 난모 세포가 포함된다. 난모 세포에는, 제1 감수 분열을 실시하기 전의 1차 난모 세포 및 제1 감수 분열을 끝낸 2차 난모 세포가 포함된다.
본 명세서에 있어서,「난소강액」이란 난소를 적출한 어종의 난소 부근의 질액을 말한다. 난소강액에는 배란기에 있는 물고기의 난소강액이 포함된다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 설명에 있어서, 특별한 설명을 하는 경우를 제외하고는,「물고기」는「해산 어류」를 의미한다.
1. 해산 어류의 난소의 유지 방법
본 발명의 난소 유지 방법은 해산 어류로부터 난소를 적출하고, 상기 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 배양액 중에서 배양하는 방법이다.
여기서, 적출이란, 기관 (특히 난소)을 개체로부터 꺼내는 것을 말하며, 기관을 적출하는 개체에는 생체가 포함된다. 적출되는 기관은 다른 기관과 혼합, 접합, 결합 또는 유착된 기관이어도 무방하다.
적출 대상이 되는 난소에는 난소로서의 기능을 유지하고 있는 것이 포함되며 특히 난모 세포를 포함하는 난소가 포함된다.
또한, 본 발명의 난소 유지 방법에서 사용되는 배양액의 상세에 대하여는 후술한다.
난소의 적출 대상이 되는 해산 어류는 난소에 포함되는 알의 수정능이 유지된다면, 어떠한 방법으로 채취하여도 좋으며, 자연 환경하에서 채취된 물고기를 사용하여도 좋고, 인공적으로 사육되고 있는 양식어이어도 좋다. 또한, 자연 환경하에서 채취된 물고기로서는 낚아올린 물고기가 포함된다. 낚아올린 물고기는 손상이 적고, 난소에 포함되는 알의 수정능이 유지되기 쉽기 때문이다.
본 발명의 난소의 적출에 사용하는 물고기는 특히 제한되지 않지만, 방어, 양식 방어로 예시되는 방어류, 잿방어, 부시리로 예시되는 잿방어류, 줄무늬전갱이류, 참돔, 붉돔, 청돔으로 예시되는 돔류, 참다랑어, 대서양 참다랑어, 남방참다랑어, 황다랑어, 눈다랑어, 날개다랑어, 백다랑어, 대서양 다랑어, 가다랑어, 점다랑어, 물치다래, 몽치다래로 예시되는 다랑어류, 참고등어, 망치고등어로 예시되는 고등어류, 줄삼치, 이다랭이로 예시되는 줄삼치류, 삼치, 꼬치삼치로 예시되는 삼치류, 연어, 송어로 예시되는 연어 송어류, 넙치, 가자미, 서대로 예시되는 가자미류 등을 들 수 있다. 이들은 자연 환경하에서 채취된 물고기이어도, 양식어이어도 좋다.
본 발명의 난소 유지 방법의 대상에는 고등어과 어류가 포함된다. 고등어과 어류란, 농어목 고등어아과 고등어과로 분류되는 물고기를 말한다. 고등어과 어류에는 줄삼치족, 삼치족, 고등어족, 다랑어족이 포함된다. 줄삼치족에는 이다랭이속, 줄삼치속이 포함되고, 삼치족에는 꼬치삼치속, 조고등어 (Grammatorcynus bilineatus)속, 삼치속이 포함되고, 고등어족에는 줄무늬고등어속, 고등어속이 포함되고, 다랑어족에는 물치다랑어속, 점다랑어속, 가다랭이속, 다랑어속이 포함된다. 이다랭이속에는 이다랭이가, 줄삼치속에는 줄삼치가, 꼬치삼치속에는 꼬치삼치가, 삼치속에는 삼치가, 고등어속에는 참고등어, 망치고등어가, 물치다랑어속에는 물치다래, 몽치다래가, 점다랑어속에는 점다랑어가, 가다랭이속에는 가다랭이가, 다랑어속에는 참다랑어, 대서양 참다랑어, 남방 다랑어, 황다랑어, 눈다랑어, 날개다랑어, 백다랑어, 대서양다랑어가 포함된다. 고등어과 어류 중에서도 다랑어속은 본 발명의 난소 유지 방법에 있어서의 대상 중 하나이다.
난소의 적출에 사용하는 물고기는 그 종의 최저 성숙년수에 달하고, 성숙한 난소를 가진 물고기를 사용하는 경우가 있다. 성숙한 난소를 가진 물고기에는 난소에 포함되는 알이 수정능을 가진 것이 많기 때문이다.
난소의 적출에 사용하는 물고기로서 성숙한 난소를 가진 물고기 중에서, 산란기의 물고기를 사용하는 경우가 있다. 산란기의 물고기에는 난소에 포함되는 알이 수정능을 가진 것이 많기 때문이다.
난소의 적출에 사용하는 물고기로서 투명화 알을 가진 난소를 가진 물고기를 사용하는 경우가 있다. 투명화 알을 가진 난소를 가진 물고기의 난소에는, 난소에 포함되는 알이 수정능을 가지는 것이 많기 때문이다.
난소에 포함되는 알이 수정능을 가진 것이라면, 난소를 적출하는 물고기는 생체라도 좋고, 심정지에 이른 직후의 물고기라도 좋으며, 냉동 보존한 물고기라도 좋다.
난소의 적출은 난소에 포함되는 알이 수정능을 잃지 않도록 가능한 한 재빠르게 실시한다. 적출에 시간을 들이게 되면, 난소에 포함되는 알이 수정능을 저하시켜버리는 경우가 있기 때문이다.
본 발명의 난소 유지 방법에 있어서의「난소의 유지」란, 난소에 포함되는 알을 수정 가능한 상태로 유지하는 것을 말한다. 난소의 유지에는 적출한 난소를 유지하는 것이 포함된다. 또한, 난소의 유지에는 적출한 난소의 일부를 유지하는 것이 포함되고, 적출한 난소를 절단, 재단, 파쇄 또는 분해하여 유지하는 것 및 절단, 재단, 파쇄 또는 분해한 난소와 다른 세포, 조직 또는 기관을 혼합, 접합, 결합 또는 유착한 상태로 유지하는 것이 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「배양」이란 세포, 조직 또는 기관의 활성을 유지하면서 일정 기간 유지하는 것을 의미하며,「배양액 중에서 배양한다」란 소망하는 활성이 유지되도록 하기 위하여, 세포, 조직 또는 기관을 배양액 중에 유지하는 것을 말한다.
본 발명의 난소 유지 방법에 있어서의 배양에는, 난소의 유지를 위해서, 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 일정 기간 유지하는 것이 포함된다. 유지되는 기간은 소망하는 활성이 유지되고 있는 기간이라면 길고 짧은 것을 묻지 않는다. 배양에는, 소망하는 활성이 유지되는 범위에서 정치하는 것, 진탕하는 것, 회전하는 것 및 교반하는 것이 포함된다.
본 발명의 난소 유지 방법에 있어서, 배양액 중에서 배양하는 것에는, 적출한 난소의 유지를 위하여, 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 배양액 중에서 배양하는 것이 포함된다.
본 발명의 난소 유지 방법에 있어서, 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 배양액 중에서 배양하는 것에는 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 배양 개시 전부터 배양액 중에 유지하는 것, 배양 후에 배양액 중에 유지하는 것, 배양 중에 배양액을 제거하는 것, 배양 중에 배양액을 교환하는 것, 배양중에 배양액을 변환하는 것 및 이들의 조합이 포함된다.
난소의 배양은, 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지한다면, 난소 전체를 배양하여도 좋고, 난소의 단편화를 실시하여, 난소의 일부를 배양하여도 좋다.
난소의 단편화를 실시할 때에는 1 mm각 (角), 2 mm각, 5 mm각, 1 cm각으로부터 10 cm각, 5 cm각, 2 cm각, 1 cm각의 크기로 단편화를 실시하는 경우가 있다. 1 mm각보다 작은 단편을 얻으려고 하면, 난소에 포함되는 알이 파괴될 가능성이 높아져서, 수정능을 저하시켜 버리는 경우가 있기 때문이다. 10 cm각보다 큰 단편을 얻으려고 하면, 배양액을 많이 필요로 하게 되는 것 외에도, 배양액이 난소 또는 단편화된 난소에 닿지 않아서, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 저하시켜 버리는 경우가 있기 때문이다.
난소 또는 단편화된 난소의 배양은 투명화 알이 포함되는 난소 또는 단편화된 난소를 사용하여 실시하는 경우가 있다. 투명화 알이 포함되는 난소 또는 단편화된 난소에는 수정능을 가진 알이 많이 포함되기 때문이다.
난소의 배양은 난소 또는 단편화된 난소에 투명화 알이 10개 이상, 50개 이상 또는 100개 이상, 그리고, 10000개 이하, 1000개 이하 또는 200개 이하로 포함되는 난소 또는 단편화된 난소를 사용하여 실시하는 경우가 있다. 투명화 알이 10개 이상 포함되는 난소 또는 단편화된 난소에는 수정능을 가진 알이 많이 포함되기 때문이다. 투명화 알이 1000개 이상 포함되는 난소 또는 단편화된 난소에서는, 난소 또는 단편화된 난소의 크기가 너무 커져서, 배양액을 많이 필요로 하게 되는 외에, 배양액이 난소 또는 단편화된 난소에 고루 닿지 않고, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 저하시켜 버리는 경우가 있기 때문이다.
난소 또는 단편화된 난소의 배양은 난소 또는 단편화된 난소가 배양액 전체에 덮이도록 배양하는 경우가 있다. 이와 같이 함으로써, 배양액이 난소 또는 단편화된 난소에 고루 닿게 되어, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 저하시켜 버리는 것을 회피할 수 있다.
난소 또는 단편화된 난소의 배양은 난소의 적출 대상인 물고기의 산란 온도 부근의 온도에서 배양하는 경우가 있다. 산란 온도 부근이면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하고, 또한, 배양 후에 배란하기 쉬워지기 때문이다. 산란 온도는 참다랑어의 경우에는 24℃ 이상, 25℃ 이상 또는 26℃ 이상이며, 28℃ 이하, 27℃ 이하 또는 26℃ 이하이다.
난소 또는 단편화된 난소의 배양은 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하는 기간동안 실시한다.
예를 들면, 참다랑어의 경우, 난소 또는 단편화된 난소의 배양은 배양 개시 후 1분 이상, 10분 이상 또는 30분 이상 배양하는 경우가 있다. 배양 기간이 너무 짧으면 배양의 효과를 충분히 얻을 수 없기 때문이다. 참다랑어에서는, 난소 또는 단편화된 난소의 배양은 배양 개시 후 24 시간 이내, 16 시간 이내, 8 시간 이내 또는 5 시간 이내에 종료하는 경우가 있다. 배양 기간이 너무 길면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 어려워지기 때문이다.
본 발명의 난소 유지 방법에 의해, 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하는 것이 가능해지고, 수정능을 가진 알을 배란시키는 것이 가능해진다. 또한, 난소를 유지함으로써, 수정능을 가진 알을 얻을 수 있을 기회를 늘려, 효율적으로 알을 얻을 수 있고 인공 수정을 하기 쉬워진다.
이하, 본 발명의 난소 유지 방법에 사용되는 배양액에 대하여 설명한다.
「배양액」은 세포, 조직 또는 기관의 활성을 유지하기 위하여 사용되는 용액을 말하는데, 본 발명의 난소 유지 방법에 있어서의 배양액 (이하,「본 발명의 배양액」, 또는 단지 「배양액」이라고 한다.)은 난소의 유지에 사용되는 용액을 의미한다.
배양액의 조성이란, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하기 위하여 기여하고 있는 성분의 조성을 말한다. 배양액의 조성은 배양 기간 중의 모든 시점에 있어서 구할 수 있다. 배양액이 만족하여야 할 조성은 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하기 위해서라면, 배양 기간 중의 어느 시점에서 만족하여도 좋다. 배양액이 만족하여야 할 조성은, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지할 수 있는 범위에 있어서, 배양 기간 중에 연속하여 만족하여도 좋고, 배양 기간 중에 단속적으로 만족하여도 좋으며, 배양 기간 중의 일부의 기간만 만족하여도 좋다.
본 발명의 배양액은 배양에 있어서 난소에 포함되는 알의 수정능을 유지하기 위한 성분이면 함유 성분은 한정되지 않는다. 본 발명의 배양액에 있어서의 함유 성분으로서는 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온으로 예시되는 양전하의 금속 이온, 염소 이온 및 황산 이온으로 예시되는 음전하의 이온, 완충제, 당 및/또는 항생 물질을 함유하는 용액이 포함된다. 본 발명의 배양액에는 시판되고 있는 것, 조제된 것, 동결 보존된 것 및/또는 희석 또는 농축된 것이 포함된다.
배양액의 함유 성분의 농도 측정 방법은 대상이 되는 성분 농도를 측정할 수 있는 공지의 방법에 의해 실시하면 된다.
양전하의 금속 이온의 경우에는 원자흡광법을 들 수 있다. 또한, 나트륨 이온 및 칼륨 이온 등의 경우에는 이온 선택 전극법에 의하여 측정하여도 좋다.
나트륨 이온이란 용액 중에서 전리되어 있는 나트륨을 말한다. 용액 중에서 전리되어 있는 나트륨에는 전리되어 있는 나트륨 원자가 포함된다. 본 발명의 나트륨 이온에는 배양액 중에서 전리되어 있는 나트륨 이온이 포함된다. 나트륨 이온은 통상은 배양액 중에서는 1가의 양전하를 가진다.
배양액 중에서 전리되어 있는 나트륨 이온이란, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하기 위해서 기여하고 있는 나트륨 이온을 말한다. 배양액 중에서 전리되어 있는 나트륨 이온에는, 소망하는 활성을 유지하기 위해서 기여할 수 있도록 킬레이트제로 킬레이트되어 있는 나트륨 이온이 포함된다. 배양액 중에서 전리되어 있는 나트륨 이온에는 소망하는 활성을 유지하는 것에 기여하지 않는 석출화, 결정화, 고형화 및 착체화하고 있는 나트륨 이온은 포함되지 않는다.
칼륨 이온은란, 용액 중에서 전리되어 있는 칼륨을 말한다. 용액 중에서 전리되어 있는 칼륨에는 전리되어 있는 칼륨 원자가 포함된다. 칼륨 이온에는 배양액 중에서 전리되어 있는 칼륨 이온은 포함된다. 칼륨 이온은 통상적으로 배양액 중에서는 1가의 양전하를 가진다.
배양액 중에서 전리되어 있는 칼륨 이온은란, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하는 데 기여하고 있는 칼륨 이온을 말한다. 배양액 중에서 전리되어 있는 칼륨 이온에는 소망하는 활성을 유지하기 위해서 기여할 수 있도록 킬레이트제로 킬레이트되어 있는 칼륨 이온은 포함된다. 배양액 중에서 전리되어 있는 칼륨 이온에는, 소망하는 활성을 유지하는 것에 기여하지 않는 석출화, 결정화, 고형화 및 착체화하고 있는 칼륨 이온은 포함되지 않는다.
칼슘 이온이란, 용액 중에서 전리되어 있는 칼슘을 말한다. 용액 중에서 전리되어 있는 칼슘에는 전리되어 있는 칼슘 원자가 포함된다. 칼슘 이온에는 배양액 중에서 전리되어 있는 칼슘 이온이 포함된다. 칼슘 이온은 통상은 배양액 중에서는 2가의 양전하를 가진다.
배양액 중에서 전리되어 있는 칼슘 이온이란, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하는데 기여하고 있는 칼슘 이온을 말한다. 배양액 중에서 전리되어 있는 칼슘 이온에는, 소망하는 활성을 유지하는데 기여할 수 있도록 킬레이트제로 킬레이트되어 있는 칼슘 이온이 포함된다. 배양액 중에서 전리되어 있는 칼슘 이온에는, 소망하는 활성을 유지하는데 기여하지 않는 석출화, 결정화, 고형화 및 착체화하고 있는 칼슘 이온은 포함되지 않는다.
마그네슘 이온이란, 용액 중에서 전리되어 있는 마그네슘을 말한다. 용액 중에서 전리되어 있는 마그네슘에는 전리되어 있는 마그네슘 원자가 포함된다. 마그네슘 이온에는 배양액 중에서 전리되어 있는 마그네슘 이온이 포함된다. 마그네슘 이온은 통상은 배양액 중에서는 2가의 양전하를 가진다.
배양액 중에서 전리되어 있는 마그네슘 이온이란, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하기 위해서 기여하고 있는 마그네슘 이온을 말한다. 배양액 중에서 전리되어 있는 마그네슘 이온에는, 소망하는 활성을 유지하기 위해서 기여할 수 있도록 킬레이트제로 킬레이트되어 있는 마그네슘 이온이 포함된다. 배양액 중에서 전리되어 있는 마그네슘 이온에는, 소망하는 활성을 유지하는 것에 기여하지 않는 석출화, 결정화, 고형화 및 착체화하고 있는 마그네슘 이온은 포함되지 않는다.
염소 이온이란, 용액 중에서 전리되어 있는 염소를 말한다. 용액 중에서 전리되어 있는 염소에는 전리되어 있는 염소 원자가 포함된다. 염소 이온에는 배양액 중에서 전리되어 있는 염소 이온이 포함된다. 염소 이온은 통상은 배양액 중에서는 1가의 음전하를 가진다.
배양액 중에서 전리되어 있는 염소 이온이란, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하기 위해서 기여하고 있는 염소 이온을 말한다. 배양액 중에서 전리되어 있는 염소 이온에는, 소망하는 활성을 유지하는 것에 기여하지 않는 석출화, 결정화, 고형화 및 착체화하고 있는 염소 이온은 포함되지 않는다.
황산 이온이란, 용액 중에서 전리되어 있는 황산을 말한다. 용액 중에서 전리되어 있는 황산에는 유황 원자 1개와 산소 원자 4개로 이루어지는 황산 이온 분자가 포함된다. 황산 이온에는 배양액 중에서 전리되어 있는 황산 이온이 포함된다. 황산 이온은 통상은 배양액 중에서는 2가의 음전하를 가진다.
배양액 중에서 전리되어 있는 황산 이온이란, 배양에 있어서 소망하는 활성을 유지하기 위해서 기여하고 있는 황산 이온을 말한다. 배양액 중에서 전리되어 있는 황산 이온에는 소망하는 활성을 유지하는 것에 기여하지 않는 석출화, 결정화, 고형화 및 착체화하고 있는 황산 이온은 포함되지 않는다.
배양액의 조정은 미리 정한 조성이 되도록 개개의 성분을 혼합하여 조정한다. 난소 또는 단편화된 난소의 배양에 사용하는 배양액의 pH는 난소를 적출한 어종의 난소강액의 pH와 비교하여 ＋0.5로부터 -0.5의 범위, ＋0.3으로부터 -0.3의 범위 또는 ＋0.1로부터 -0.1의 범위가 되도록 조정하는 경우가 포함된다. 난소 또는 단편화된 난소의 배양에 사용하는 배양액의 pH가 난소를 적출한 어종의 난소강액의 pH와 비교하여 ＋0.5로부터 -0.5의 범위, ＋0.3으로부터 -0.3의 범위 또는 ＋0.1로부터 -0.1의 범위가 되도록 조정하는 편이 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알에 부담이 적고, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 쉽기 때문이다. 상기 배양액의 pH의 조정에는 완충제로서 EPPS, MES, HEPES, PIPES, TES, ADA, BES, ACES로 예시되는 굿버퍼를 사용하는 경우가 있다. 굿버퍼를 사용하면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알에 부담이 적고, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 쉽기 때문이다.
배양액에 포함되는 양전하의 금속 이온은 제한되지 않지만, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온이 예시된다. 상기 양전하의 금속 이온은 배양액 중에 존재함으로써 침투압을 높이는 동시에, 양전하의 금속 이온의 생리적인 작용에 의해, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알에 부담을 줄여서, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 쉽게 하고, 및/또는, 배양하고 있는 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 배란되는 것을 재촉하기 때문이다.
나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온로 예시되는 양전하의 금속 이온은 단독으로 포함되는 경우도 있고, 2 이상의 임의의 수를 조합하여 포함되는 경우도 있다. 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능을 유지하기 위해서는, 상기 배양액에, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 또는 마그네슘 이온 중에서 적어도 2종 이상, 3종 이상 또는 4종 모든 것을 포함하는 경우가 있다. 많은 종류의 양전하의 금속 이온을 포함하는 쪽이 밸런스가 좋고, 포함되는 모든 양전하의 금속 이온에 기초한 상승 효과를 기대할 수 있기 때문이다.
나트륨 이온은 나트륨 이온 채널 및/또는 나트륨 결합 단백에 작용하여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능의 유지에 공헌한다. 상기 나트륨 결합 단백에는 아네키신으로 예시되는 칼슘 결합 단백으로서 알려지는 것도 포함된다.
나트륨 이온은 배양액에 10 mM 이상, 50 mM 이상, 100 mM 이상, 120 mM 이상 또는 150 mM 이상의 몰 농도로 포함되고, 500 mM 이하, 300 mM 이하, 250 mM 이하, 200 mM 이하 또는 150 mM 이하의 몰 농도로 포함된다. 예를 들면, 120 mM 이상 250 mM 이하의 범위에서 포함되는 경우가 있다. 나트륨 이온이 너무 적으면 배양액에 나트륨 이온을 첨가한 효과가 희미해지고, 나트륨 이온이 너무 많으면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하는 것이 어려워지기 때문이다.
칼륨 이온은 칼륨 이온 채널 및/또는 칼륨 결합 단백에 작용하여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능의 유지에 공헌한다. 칼륨 결합 단백에는, Emp46p, Emp47p로 예시되는 당쇄 (糖鎖) 인식 부위를 포함하는 단백이 포함된다.
칼륨 이온은 배양액에 1.0 mM 이상, 2.0 mM 이상, 3.0 mM 이상, 5.0 mM 이상 또는 7.0 mM 이상의 몰 농도로 포함되고, 20 mM 이하, 15 mM 이하, 10 mM 이하, 8.0 mM 이하 또는 7.0 mM 이하의 몰 농도로 포함된다. 예를 들면, 5 mM 이상 10 mM 이하의 범위에서 포함되는 경우가 있다. 칼륨 이온은 너무 적으면 배양액에 칼륨 이온을 첨가한 효과가 희미해지고, 칼륨 이온은 너무 많으면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하는 것이 어려워지기 때문이다.
칼슘 이온은 칼슘 이온 채널 및/또는 칼슘 결합 단백에 작용하여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능의 유지에 공헌한다. 상기 칼슘 결합 단백에는 프로테아제, 포스포리파제 A2, 아밀라제를 비롯한 분해 효소, 포스포릴라제 b 키나제, 칼슘 수송 ATP아제, 칼세퀘스트린, 칼렉시틴, 트로포닌이 예시된다.
칼슘 이온은 배양액에 0.1 mM 이상, 0.5 mM 이상, 0.8 mM 이상, 1.0 mM 이상 또는 1.5 mM 이상의 몰 농도로 포함되고, 5.0 mM 이하, 4.0 mM 이하, 3.5 mM 이하, 3.0 mM 이하 또는 2.0 mM 이하의 몰 농도로 포함된다. 예를 들면, 1.5 mM 이상 5.0 mM 이하의 범위에서 포함되는 경우가 있다. 칼슘 이온이 너무 적으면 배양액에 칼슘 이온을 첨가한 효과가 희미해지고, 칼슘 이온이 너무 많으면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하는 것이 어려워지기 때문이다.
마그네슘 이온은 마그네슘 이온 채널 및/또는 마그네슘 결합 단백에 작용하여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능의 유지에 공헌하기 때문이다. 상기 마그네슘 결합 단백에는 RNA 폴리메라제, 파라세린으로 예시되는 RNA 결합 단백 또는 마그네슘 수송체 단백이 포함된다.
마그네슘 이온은 배양액에 0.1 mM 이상, 0.3 mM 이상, 0.5 mM 이상, 1.0 mM 이상 또는 1.5 mM 이상의 몰 농도로 포함되고, 5.0 mM 이하, 3.0 mM 이하, 2.0 mM 이하, 1.8 mM 이하 또는 1.5 mM 이하의 몰 농도로 포함된다. 예를 들면, 1.0 mM 이상 2.0 mM 이하의 범위에서 포함되는 경우가 있다. 마그네슘 이온이 너무 적으면 배양액에 마그네슘 이온을 첨가한 효과가 희미해지고, 마그네슘 이온이 너무 많으면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하는 것이 어려워지기 때문이다.
난소 또는 단편화된 난소의 배양에 사용하는 배양액의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 조성은 난소의 적출에 사용하는 해산 어류 또는 난소의 적출에 사용하는 해산 어류와 동일한 종의 물고기이며, 산란기에 있는 물고기의 혈청의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온에 가까운 것으로 할 수 있다.
배양액의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 몰 농도는 난소의 적출에 사용하는 해산 어류의 혈청의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 각각 1/4로부터 4배의 몰 농도, 각각 1/2로부터 2배의 몰 농도, 각각 2/3로부터 1.5배의 몰 농도로 사용할 수 있다. 배양액의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 몰 농도가 난소의 적출에 사용하는 해산 어류의 혈청 또는 난소의 적출에 사용하는 해산어와 동일한 종의 물고기이며, 산란기에 있는 물고기의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온에 가까울수록 적출 스트레스를 완화시킬 수 있고, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능의 유지에 공헌하기 때문이다.
여기서, 난소의 적출에 사용하는 해산 어류와 동일한 종의 물고기이며 산란기에 있는 물고기로서, 다랑어의 경우에는 체중이 20 kg에서 100 kg인 것, 특히 40 kg에서 80 kg인 것으로부터 선택할 수 있다. 체중이 너무 적게 나가면 산란기에 있어도 알로서의 성질이 충분하지 않은 경우가 있고, 체중이 너무 많이 나가면 낚아올려서 혈청을 얻는 것으로 예시되는 샘플링이 곤란해지기 쉽기 때문이다.
배양액의 나트륨 이온과 칼륨 이온의 몰 농도비는 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼륨 이온을 1/100 이상, 1/50 이상, 1/25 이상으로 할 수 있다. 동시에, 배양액의 나트륨 이온과 칼륨 이온의 비는 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼륨 이온을 1/20 이하, 1/10 이하, 1/5 이하로 할 수 있다. 나트륨 이온：칼륨 이온의 비가 너무 크면, 나트륨 이온의 저해 효과가 강해져서, 상대적으로 칼륨 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 나트륨 이온：칼륨 이온의 비가 너무 작으면, 나트륨 이온의 부족 효과가 강해져서, 칼륨 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액의 나트륨 이온과 칼슘 이온의 몰 농도비는 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼슘 이온을 1/200 이상, 1/100 이상, 또는 1/50 이상으로 할 수 있다. 동시에, 배양액의 나트륨 이온과 칼슘 이온의 비는, 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼슘 이온을 1/40 이하, 1/20 이하, 또는 1/10 이하로 할 수 있다. 나트륨 이온：칼슘 이온의 비가 너무 크면, 나트륨 이온의 저해 효과가 강해지고, 상대적으로 칼슘 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 나트륨 이온：칼슘 이온의 비가 너무 작으면, 나트륨 이온의 부족 효과가 강해져서, 칼슘 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액의 나트륨 이온과 마그네슘 이온의 몰 농도비는, 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 마그네슘 이온을 1/1000 이상, 1/500 이상, 또는 1/250 이상으로 할 수 있다. 동시에, 배양액의 나트륨 이온과 마그네슘 이온의 비는 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 마그네슘 이온을 1/200 이하, 1/100 이하, 또는 1/50 이하로 할 수 있다. 나트륨 이온：마그네슘 이온의 비가 너무 크면, 나트륨 이온의 저해 효과가 강해지고, 상대적으로 마그네슘 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 나트륨 이온：마그네슘 이온의 비가 너무 작으면, 나트륨 이온의 부족 효과가 강해져서, 마그네슘 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액의 칼륨 이온과 칼슘 이온의 몰 농도비는 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 칼슘 이온을 1/10 이상, 1/5 이상, 또는 1/3 이상으로 할 수 있다. 동시에, 배양액의 칼륨 이온과 칼슘 이온의 비는 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 칼슘 이온을 1/2 이하, 1 이하, 또는 2 이하로 할 수 있다. 칼륨 이온：칼슘 이온의 비가 너무 크면, 칼륨 이온의 저해 효과가 강해져서, 상대적으로 칼슘 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 칼륨 이온：칼슘 이온의 비가 너무 작으면, 칼륨 이온의 부족 효과가 강해져서, 칼슘 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액의 칼륨 이온과 마그네슘 이온의 몰 농도비는 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 마그네슘 이온을 1/50 이상, 1/25 이상, 또는 1/10 이상으로 할 수 있다. 동시에, 배양액의 칼륨 이온과 마그네슘 이온의 비는 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 마그네슘 이온을 1/8 이하, 1/4 이하, 1/2 이하로 할 수 있다. 칼륨 이온：마그네슘 이온의 비가 너무 크면, 칼륨 이온의 저해 효과가 강해져서, 상대적으로 마그네슘 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 칼륨 이온：마그네슘 이온의 비가 너무 작으면, 칼륨 이온의 부족 효과가 강해져서, 마그네슘 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액의 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 몰 농도비는, 칼슘 이온을 1로 하였을 때, 마그네슘 이온을 1/25 이상, 1/10 이상, 1/5 이상으로 할 수 있다. 동시에, 배양액의 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 비는, 칼슘 이온을 1로 하였을 때, 마그네슘 이온을 1/4 이하, 1/2 이하, 또는 1 이하로 할 수 있다. 칼슘 이온：마그네슘 이온의 비가 너무 크면, 칼슘 이온의 저해 효과가 강해져서, 상대적으로 마그네슘 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 칼슘 이온：마그네슘 이온의 비가 너무 작으면, 칼슘 이온의 부족 효과가 강해져서, 마그네슘 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액의 나트륨 이온과 칼륨 이온과 칼슘 이온의 몰 농도비는 이하의 (1) 내지 (3)의 어느 하나의 범위에서 설정할 수 있다.
(1) 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼륨 이온은 1/40에서 1/10, 또한 칼슘 이온은 1/100에서 1/25
(2) 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 10에서 40, 또한 칼슘 이온은 1/4에서 1
(3) 칼슘 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 25에서 100, 또한 칼륨 이온은 1에서 4
각 이온의 적절한 몰 농도비는 생체 내의 활동 상태를 반영하여, 스트레스가 적은 상태에서 소망하는 효과를 달성하기 쉽게 할 수 있다.
배양액의 나트륨 이온과 칼륨 이온과 마그네슘 이온의 몰 농도비는 이하의 것 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 범위에서 설정할 수 있다.
(1) 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼륨 이온은 1/40 내지 1/10, 또한 마그네슘 이온은 1/400에서 1/100
(2) 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 10에서 40, 또한 마그네슘 이온은 1/16에서 1/4
(3) 마그네슘 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 100에서 400, 또한 칼륨 이온은 4에서 16
각 이온의 적절한 몰 농도비는 생체 내의 활동 상태를 반영하여, 스트레스가 적은 상태에서 소망하는 효과를 달성하기 쉽게 할 수 있다.
배양액의 나트륨 이온과 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 몰 농도비는 이하의 (1)에서 (3) 중 어느 하나의 범위에서 설정할 수 있다.
(1) 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼슘 이온은 1/100으로부터 1/25, 또한 마그네슘 이온은 1/400에서 1/100
(2) 칼슘 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 25에서 100, 또한 마그네슘 이온은 1/8에서 1/2
(3) 마그네슘 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 100에서 400, 또한 칼슘 이온은 2에서 8
각 이온의 적절한 몰 농도비는 생체 내의 활동 상태를 반영하여, 스트레스가 적은 상태에서 소망하는 효과를 달성하기 쉽게 할 수 있다.
배양액의 칼륨 이온과 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 몰 농도비는 이하의 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 범위에서 설정할 수 있다.
(1) 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 칼슘 이온은 1/4에서 1, 또한 마그네슘 이온은 1/16에서 1/4
(2) 칼슘 이온을 1로 하였을 때, 칼륨 이온은 1에서 4, 또한 마그네슘 이온은 1/8에서 1/2
(3) 마그네슘 이온을 1로 하였을 때, 칼륨 이온은 4에서 16, 또한 칼슘 이온은 2에서 8
각 이온의 적절한 몰 농도비는 생체 내의 활동 상태를 반영하여, 스트레스가 적은 상태에서 소망하는 효과를 달성하기 쉽게 할 수 있다.
배양액의 나트륨 이온과 칼륨 이온과 칼슘 이온과 마그네슘 이온의 몰 농도비는 이하의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 범위에서 설정할 수 있다.
(1) 나트륨 이온을 1로 하였을 때, 칼륨 이온은 1/40 내지 1/10, 칼슘 이온은 1/100 내지 1/25, 또한 마그네슘 이온은 1/400 내지 1/100
(2) 칼륨 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 10에서 40, 칼슘 이온은 1/4 내지 1, 또한 마그네슘 이온은 1/16에서 1/4
(3) 칼슘 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 25에서 100, 칼륨 이온은 1에서 4, 또한 마그네슘 이온은 1/8에서 1/2
(4) 마그네슘 이온을 1로 하였을 때, 나트륨 이온은 100에서 400, 칼륨 이온은 4에서 16, 또한 칼슘 이온은 2에서 8
각 이온의 적절한 몰 농도비는 생체 내의 활동 상태를 반영하여, 스트레스가 적은 상태에서 소망하는 효과를 달성하기 쉽게 할 수 있다.
배양액에 포함되는 음전하의 이온은 제한되지 않지만, 염소 이온 및 황산 이온이 예시된다. 음전하의 이온은 배양액 중에 존재함으로써 침투압을 높이는 동시에, 음전하의 이온의 생리적인 작용에 의해, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알에 부담을 줄여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 쉽게 하고 및/또는 배양하고 있는 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 배란되는 것을 재촉하기 때문이다.
염소 이온 및 황산 이온으로 예시되는 상기 음전하의 이온은 단독으로 포함되는 경우도 있고, 2 이상의 임의의 수를 조합하여 포함되는 경우도 있다. 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능을 유지하기 위해서는, 상기 배양액에 염소 이온 또는 황산 이온의 양쪽을 모두 포함하는 경우가 있다. 많은 종류를 포함한 편이 밸런스가 좋고, 포함되는 모든 음전하의 이온에 기초한 상승 효과를 기대할 수 있기 때문이다.
염소 이온은 염소 이온 채널 및/또는 염소 이온 결합 단백에 작용하여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능의 유지에 공헌한다. 염소 이온 결합 단백에는 염소 이온 채널로 예시되는 염소 이온 결합 단백으로서 알려지는 것도 포함된다.
염소 이온은 배양액에 50 mM, 100 mM, 150 mM 또는 200 mM 이상의 농도로 포함되고, 500 mM, 300 mM, 250 mM 또는 200 mM 이하로 포함된다. 예를 들면, 150 mM 이상 250 mM 이하의 범위에서 포함되는 경우가 있다. 염소 이온이 너무 적으면 배양액에 염소 이온을 첨가한 효과가 희미해지고, 염소 이온이 너무 많으면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기가 어려워지기 때문이다.
황산 이온은 황산 이온 채널 및/또는 황산 이온 결합 단백에 작용하여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능의 유지에 공헌한다. 황산 이온 결합 단백에는, 황산 이온 수송체로 예시되는 황산 이온에 결합하는 단백이 포함된다.
황산 이온은 배양액에 1 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM 또는 200 mM 이상의 농도로 포함되고, 500 mM, 300 mM, 250 mM 또는 200 mM 이하로 포함된다. 예를 들면, 100 mM 이상 250 mM 이하의 범위에서 포함되는 경우가 있다. 황산 이온이 너무 적으면, 배양액에 황산 이온을 첨가한 효과가 희미해지고, 황산 이온이 너무 많으면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기가 어려워지기 때문이다.
난소 또는 단편화된 난소의 배양에 사용하는 배양액의 염소 이온과 황산 이온의 몰 농도비는 염소 이온을 1로 하였을 때, 황산 이온을 10 이상, 25 이상, 또는 50 이상으로 할 수 있다. 동시에, 난소 또는 단편화된 난소의 배양에 사용하는 배양액의 염소 이온과 황산 이온의 비는, 염소 이온을 1로 하였을 때, 황산 이온을 400 이하, 200 이하, 또는 100 이하로 할 수 있다. 염소 이온：황산 이온의 비가 너무 크면, 염소 이온의 저해 효과가 강해져서, 상대적으로 황산 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 염소 이온：황산 이온의 비가 너무 작으면, 염소 이온의 부족 효과가 강해지고, 황산 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액의 양전하의 금속 이온과 음전하의 이온의 몰 농도비는 양전하의 금속 이온을 1로 하였을 때, 음전하의 이온을 0.5 이상, 0.7 이상, 또는 0.9 이상으로 할 수 있다. 동시에, 배양액의 양전하의 금속 이온과 음전하의 이온의 비는 양전하의 금속 이온을 1로 하였을 때, 음전하의 이온을 1.5 이하, 1.3 이하, 또는 1.1 이하로 할 수 있다. 양전하의 금속 이온：음전하의 이온의 비가 너무 크면, 양전하의 금속 이온의 저해 효과가 강해져서, 상대적으로 음전하의 이온의 부족 효과가 강해진다. 반대로, 양전하의 금속 이온：음전하의 이온의 비가 너무 작으면, 양전하의 금속 이온의 부족 효과가 강해지고, 음전하의 이온의 저해 효과가 강해진다.
배양액에 당을 포함하는 경우가 있다. 상기 당은 배양액 중에 존재함으로써 침투압을 높여 에너지원으로서 작용하고, 또는 시그널 분자로서 작용함으로써, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알에 부담을 줄이고, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 쉽게 하고, 및/또는 배양하고 있는 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 배란되는 것을 재촉하기 때문이다.
배양액에 포함되는 당의 종류는 본 발명의 목적을 해치지 않는 한 제한되지 않지만, 글루코스, 갈락토스, 과당, 자당이 예시된다. 글루코스, 갈락토스, 과당, 자당은 세포 내에서 에너지로서의 이용 효율이 높고, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 쉽게 하고 및/또는, 배양하고 있는 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 배란되는 것을 재촉하는 데 있어서, 높은 효과를 기대할 수 있기 때문이다. 당은 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용하는 경우가 있다.
상기 당은 배양액 중에 0.1 mM 이상, 1.0 mM 이상, 3.0 mM 이상, 또는 5 mM 이상의 몰 농도로 포함되고, 100 mM 이하, 50 mM 이하, 20 mM 이하, 10 mM 이하 또는 5.0 mM 이하의 몰 농도로 포함된다. 당이 너무 적으면, 배양액 중에 당을 첨가한 효과가 희미해지고, 당이 너무 많으면, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기가 어려워지기 때문이다.
배양액에 항생 물질을 포함하는 경우가 있다. 상기 항생 물질은 배양액 중에 존재함으로써 잡균의 번식을 약하게 하여, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기 쉽게 하기 때문이다.
배양액에 함유되는 항생 물질의 종류는 본 발명의 목적을 해치지 않는 한 제한되지 않지만, 항생 물질로서는, 벤질 페니실린 칼륨, 암피실린으로 예시되는 페니실린계, 카나마이신, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 네오마이신으로 예시되는 아미노글리코시드계의 항생 물질이 포함된다. 상기 항생 물질은 항생 물질로서의 효과를 얻을 수 있고, 또한 부작용이 생기지 않는 범위에서, 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용한다. 페니실린계 및 아미노글리코시드계의 항생 물질은 수산계의 항생 물질로서 효과를 얻기 쉽기 때문이다.
상기 항생 물질은 각 항생 물질의 적정한 용량에 있어서 배양액 중에 포함된다. 상기 페니실린계 항생 물질로서 벤질 페니실린 칼륨을 사용하는 경우에는, 10 mg/L 이상, 30 mg/L 이상, 50 mg/L 이상 또는 70 mg/L 이상, 그리고, 500 mg/L 이하, 300 mg/L 이하, 150 mg/L 이하 또는 70 mg/L 이하로 사용한다. 벤질 페니실린 칼륨이 너무 적으면, 벤질 페니실린 칼륨을 첨가한 효과를 얻기 어렵고, 벤질 페니실린 칼륨이 너무 많으면, 부작용에 의해 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기가 어려워지기 때문이다.
상기 아미노글리코시드계의 항생 물질로서 카나마이신 황산염을 사용하는 경우에는, 10 mg/L 이상, 20 mg/L 이상, 30 mg/L 이상 또는 50 mg/L 이상, 또한, 500 mg/L 이하, 300 mg/L 이하, 100 mg/L 이하 또는 50 mg/L 이하에서 사용한다. 카나마이신이 너무 적으면, 카나마이신을 첨가한 효과를 얻기 어렵고, 카나마이신이 너무 많으면, 부작용에 의해 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기가 어려워지기 때문이다.
상기 아미노글리코시드계의 항생 물질로서 스트렙토마이신 황산염을 사용하는 경우에는, 10 mg/L 이상, 30 mg/L 이상, 60 mg/L 이상 또는 100 mg/L 이상, 또한, 500 mg/L 이하, 300 mg/L 이하, 150 mg/L 이하 또는 100 mg/L 이하로 사용한다. 스트렙토마이신이 너무 적으면, 스트렙토마이신을 첨가한 효과를 얻기 어렵고, 스트렙토마이신이 너무 많으면, 부작용에 의해 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알이 수정능을 유지하기가 어려워지기 때문이다.
배양액의 침투압은 100 mOsm/kg 이상, 200 mOsm/kg 이상 또는 350 mOsm/kg 이상으로 할 수 있고, 6000 mOsm/kg 이하, 5000 mOsm/kg 이하 또는 4500 mOsm/kg 이하로 할 수 있다. 침투압이 너무 낮으면 세포에 저침투압 스트레스가 가해지고, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능이 저하하는 경우가 있다. 침투압이 너무 높으면, 세포에 고침투압 스트레스가 가해져서, 난소 또는 단편화된 난소에 포함되는 알의 수정능이 저하하는 경우가 있다.
배양액의 침투압을 담당하는 성분으로서 양전하의 금속 이온, 음전하의 이온 및 당으로 침투압 전체의 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상을 구성하는 경우가 있다. 당은 글루코스, 갈락토스, 과당, 자당 중에서, 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용하는 경우가 있다.
양전하의 금속 이온, 음전하의 이온 및 당은 생체 내에서 세포내액 및 세포외액에 있어서 침투압 조절에 사용하는 경우가 있는데, 세포에 있어서 부담이 적다.
배양액의 침투압을 담당하는 성분으로서, 양전하의 금속 이온은 침투압 전체의 1/3 이상, 2/5 이상 또는 3/7 이상을 구성하고, 2/3 이하, 3/5 이하 또는 4/7 이하를 구성하면 좋다.
배양액의 침투압을 담당하는 성분으로서 음전하의 이온은 침투압 전체의 1/3 이상, 2/5 이상 또는 3/7 이상을 구성하고, 2/3 이하, 3/5 이하 또는 4/7 이하를 구성하면 좋다. 양전하의 금속 이온이 너무 많은 경우에는 음전하의 이온이 상대적으로 적게 되고, 양전하의 금속 이온이 너무 적은 경우에는 음전하의 이온이 상대적으로 많아져서, 어느 경우나 세포에 과도한 스트레스를 주는 경우가 있다.
배양액의 침투압을 담당하는 성분으로서 당은 침투압 전체의 1/3 이상, 2/5 이상 또는 3/7 이상을 구성하고, 2/3 이하, 3/5 이하 또는 4/7 이하를 구성하면 좋다.
당이 너무 적으면 세포의 대사에 부담이 가고, 당이 너무 많으면 배양액의 유동성에 문제가 생기는 경우가 있다.
2. 해산 어류의 알의 생산 방법
본 발명의 해산 어류의 알의 생산 방법은 본 발명의 난소 유지 방법에 의해 배양한 난소를 배란시켜서 알을 얻는 방법이다.
본 발명의 알의 생산 방법에 있어서, 배란은 통상적으로 난소 또는 단편화된 난소를 배양액 중에서 배양함으로써 자동적으로 행해진다. 또한, 얻은 알을 해치지 않는 이상 임의의 방법으로 배란을 재촉하여도 좋고, 배양액으로부터 꺼내서 강제적으로 배란시켜도 좋다.
「배란」이란, 난소 내에서 난포가 찢어져서 알이 배출되는 것을 말하며, 알의 배출에는 개체 안에서 알이 배출되는 것 외에, 꺼내진 난소에서 난소 밖으로 알이 배출되는 것이 포함된다.
「배란수」는 실태 현미경에 의하여, 단편화된 난소로부터 격리된 알을 배란 수로 하여 관찰하는 것, 또는 배양 후에 난소 또는 단편화된 난소를 고정액으로 고정하고, 난소 또는 단편화된 난소 내의 배란 후 여포를 배란수로 하여 계측함으로써 결정할 수 있다.「배란하지 않은 투명화 알의 수」는 배양 후에 난소 또는 단편화된 난소를 고정액으로 고정하고, 난소 또는 단편화된 난소 내에 배란하지 않고 남겨진 투명화 알의 수를 계측하는 것으로 결정할 수 있다.「배란율」은 배란수를 배란수와 배란하지 않고 남겨진 투명화 알의 수를 합한 값으로 나눔으로써 구할 수 있다.
본 발명의 수정란의 생산 방법은 본 발명의 알의 생산 방법에 의해 얻은 알과 정자를 교배시켜서 수정란을 얻는 방법이다. 상기 본 발명의 알 생산 방법에 의해 얻은 알은 수정능이 있기 때문에 수정시키는 것이 가능하고, 인공 수정을 계획적으로 실시할 수 있게 된다.
「정자」란, 정소에서 만들어지는 웅성 배우자이다. 본 발명의 수정란의 생산 방법에 있어서의 정자는 수정 작용을 가지고 있으면 되는데, 자연 환경하에서 방정된 정자 및 인공 환경하에서 유도하여 방정된 정자, 생체로부터 정소를 꺼내어 채취한 정자, 동결 보존된 정자가 포함된다.
「알과 정자를 교배시킨다」는 것은 알과 정자를 접촉시키는 환경에 있어서 수정을 재촉하는 것을 말한다. 본 발명의 수정란의 생산 방법에 있어서, 본 발명의 교배는 자연 환경하에서 실시하는 것 및 인공적으로 조정한 용액 중에서 실시하는 것을 포함한다.
본 발명의 수정란의 생산 방법에 있어서, 알과 정자가 교배를 자연 환경하에서 실시하여도 좋고, 인공적으로 조정한 용액 중에서 실시하여도 좋다. 알과 정자의 교배를, 하나의 알과 하나 혹은 복수의 정자, 복수의 알과 하나 혹은 복수의 정자로 실시하여도 좋다.
「수정」이란, 정자와 알이 접합하여, 정자가 알 안에 들어가는 것을 말한다. 본 발명의 수정란의 생산 방법에 있어서의 수정에는 자연 환경하에서 실시하는 것 및 인공적으로 조정한 용액 중에서 실시하는 것이 포함된다. 수정은 알로부터 배양액을 제거한 후에 정자를 교배하여도 좋다.
「수정란」이란 수정한 알을 말한다. 본 발명의 수정란의 생산 방법에 있어서의 수정란에는 정자와 알의 접합 후에 세포 분열을 개시하는 것, 세포 분열 후에 부상하여 부상란이 되는 것, 부상 후에 투명화하여 투명화 알이 되는 것이 포함된다.
「수정능이 있는 알」이란, 알과 정자를 교배하였을 때, 수정하는 능력을 가진 알을 말한다. 본 발명의 수정란의 생산 방법에 있어서, 알이 수정능이 있는 알인지 아닌지는, 그 종에 있어서 수정을 저해하지 않는 환경하에서, 정자와 접촉시켜 수정하는지 아닌지를 가지고 판단한다.
3. 본 발명의 해산 어류의 성육 방법 및 본 발명의 양식 해산 어류의 생산 방법
본 발명의 해산 어류의 성육 방법은 상기 본 발명의 수정란의 생산 방법으로 얻는 수정란으로부터 부화한 자어를, 치어, 미성어 또는 성어까지 성육시키는 성육하는 공정을 포함하는 방법이다. 또한, 본 발명의 양식 해산 어류의 생산 방법은 상기 본 발명의 수정란의 생산 방법으로 얻는 수정란으로부터 부화한 자어를, 치어, 미성어 또는 성어까지 성육시키는 공정을 포함하는 방법이다.
즉, 본 발명의 수정란의 생산 방법에 의하여 얻은 수정란은 부화하여, 부화 자어로 할 수 있고, 그 후, 미성어 및 성어로 성장할 수 있다. 또한, 수정란을 계획적으로 얻음으로써, 부화 자어를 계획적으로 얻을 수 있고, 종묘 생산 및 양식을 계획적 및/또는 효율적으로 실시할 수 있다.
「자어」란, 알로부터 부화하여 치어가 될 때까지의 단계의 물고기를 말한다. 자어에는, 자연 환경하 및 인공 환경하에서 부화한 자어가 포함된다.
「치어」란, 자어가 성장하여 미성어가 될 때까지의 단계를 말한다. 치어에는, 지느러미 기조 수나 척추 골수가 정수(定數)에 도달하여, 종의 특징을 나타낼 단계에 이른 물고기가 포함된다.
「미성어」란, 치어가 성장하여 성어가 될 때까지의 단계를 말한다. 미성어에는 비늘이 형성되고 나서 성숙에 이르기까지의 물고기가 포함된다.
「성어」란, 미성어가 성장하여 성숙한 물고기를 말한다. 성어에는, 성숙 후에 생식 능력을 가지게 된 물고기 및 생식 능력을 가진 후에 생식 능력을 잃은 물고기가 포함된다.
수정란을 부화시키려면, 수정란을 해수 중 또는 적절한 용액 중에서 일정 기간 유지함으로써 실시할 수 있고, 대상이 되는 해산 어류의 종류에 따라 적절하게 결정된다.
부화 자어로부터 미성어 및 성어를 얻으려면, 부화 자어를 해수 중 또는 적절한 환경하에서 일정기간 사육함으로써 실시할 수 있고, 그 사육 조건은 대상이 되는 해산 어류의 종류에 따라 적절하게 결정된다.
본 발명의 해산 어류의 성육 방법 (양식 해산 어류의 생산 방법)에 의해 얻은 자어, 치어, 미성어 및 성어는 종묘 또는 식용으로서 판매할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 발명의 각 실시 상태에 관한 한 가지 실시 상태 중에서 설명된 각 발명의 특정 사항은 임의로 조합하여 새로운 실시 형태로 하여도 좋으며, 이러한 새로운 실시 형태도 본 발명의 각 실시 상태에 포함될 수 있는 것으로서 이해되어야 한다.
[실시예]
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
<재료와 방법>
(1) 실험에 사용하는 어종
실험에는 양식 참다랑어 (평균 체중：86.4 kg)를 사용하였다. 이는 일본해에서 양조망으로 잡아서 3년간 양식한 것이다. 양식 기간 중에는 이 물고기들에게 냉동 까나리, 정어리, 전갱이 및 고등어를 먹이로 주었다.
(2) 정자의 채취
실험에 사용하는 정자는 출하를 위해서 낚아올린 웅어 (雄魚)에 있어서, 생식공으로부터 방출하는 정자, 또는 적출된 정소 내의 정자를 채취하여, 1 내지 3 마리분을 혼합하여 사용하였다. 실험에는 당일에 채취한 정자만을 사용하였다.
(3) 배양액
배양액은 124.1 mM 염화나트륨, 5.1 mM 염화칼륨, 1.0 mM 황산마그네슘, 1.6 mM 염화칼슘, 5.6 mM 글루코스로 이루어지는 조성의 것을 사용하였다. 배양액의 제작은 와코쥰야쿠코교사제에서 판매되고 있는 시약을 혼합함으로써 실시하였다. 이 배양액에 대하여, 항생 물질로서 100 mg/L 스트레프마이신 황산염, 50 mg/L 카나마이신 황산염 및 70 mg/L 벤질 페니실린 칼륨을 첨가하여 사용하였다. 항생 물질은 모두 와코쥰야쿠코교사제의 시약을 사용하였다. 또한, 참다랑어의 난소강액은 평균 pH 8.0 (n=5, 최대값 pH 8.1 최소값 pH 7.9)이었기 때문에, 배양액은 pH 8.0으로 하고, 완충제로서 도진카가쿠켄큐죠제의 EPPS를 10 mM 사용하였다.
＜배양액의 검토>
이번에 사용하는 배양액이 참다랑어의 배란한 알의 수정능을 유지할 수 있을지에 대하여 검토하였다. 실험에는, 생체 내에서 이미 배란된 알을 사용하였는데, 출하를 위해서 낚아올린 자어 1마리의 적출된 난소 내로부터 채취하였다. 채취 후, 이 알들을 AGC 테크노글래스사제의 12 웰 배양용 마이크로플레이트에 각각 약 100 개씩 분배하였다. 또한, 채취한 알을 무처리의 대조구 및 배양액으로 클리닝 후에 2 ml의 배양액에 담그는 배양액구를 만들고, 또한 이러한 시험구 안에, 실험 개시 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 또는 8.0 시간 후에 인공 수정을 실시하는 구를 마련하였다. 또한, 실험 개시 0 시간이란 개시 직후에 실시한 것을 의미한다.
알 채취 후에는, 신속하게 시험구를 설정하여 실험을 개시하고, 인공 수정할 때까지는 온도 26℃, 습도 100%로 관리하였다. 인공 수정시에는 정자를 알에 섞어 충분히 고루 미치게 한 후, 해수를 첨가하여 수정시켰다. 배양액구의 경우에는, 배양액을 최대한 제거한 후에 정자를 교배하였다.
인공 수정 후에는, 올림푸스사제의 실체 현미경 SZ61을 사용한 관찰에 의하여, 상실배기 (桑實胚期)에 있어서의 부상율 (100×부상란수/실험에 이용한 전체 배란란수), 수정율 (부상율×수정란수/부상란수)을 산출하였다. 또한, 부상란으로부터 랜덤하게 약 20개를 10 mL의 해수가 들어가 있는 6 웰 배양용 마이크로플레이트로 옮겨, 부화할 때까지 관리하고, 부화율 (부상율×부화 자어수/옮긴 부상란수)을 구하였다. 관리 중에는 죽은 알을 적절하게 제거하여, 수질을 유지하였다.
도 1 내지 3에 도시하는 바와 같이, 대조구의 부상율, 수정율, 부화율은 2 시간 이상 경과하고나서 인공 수정을 실시한 구로부터 유의하게 저하하였다. 배양액구의 부상율은 8 시간 후까지 유지되고, 수정율 및 부화율은 4 시간 후부터 저하하는 경향을 볼 수 있으며, 6 시간 이상 경과한 구에서는 유의하게 저하하였다. 따라서, 배란한 알은 배양액 중에서 4 시간까지는 수정능을 유지 가능하고, 배양액은 향후의 배양 실험에 사용 가능한 것이 확인되었다.
<생체 외에서 배란시키기 위한 난소의 처리 방법의 검토>
생체 외에서 배란시키기 위한 알을 채취하기 위하여, 적절한 난소의 처리 방법을 검토하였다. 실험에는 투명화한 난모 세포인 투명화 알이 포함되는 난소를 사용하여 출하를 위해서 낚아올린 자어 1 마리로부터 적출된 난소를 적출하였다.
적출한 난소를 배양액 중에서 난소를 약 1 cm각으로 단편화하고, 이러한 단편화된 난소를 2 ml의 배양액을 채운 12 웰 배양용 마이크로플레이트에 각각 약 100개의 투명화 알이 포함되도록 분배하였다. 상기 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리는 난소 적출 직후를 0 시간으로 하고, 이후 1, 2 및 3 시간 후에 실시하는 실험구 및 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 하지 않고 난소를 그대로의 실험구와 동일한 조건으로 유지하는 대조구를 설정하였다. 실험구에 있어서는, 상기 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리 후 0.5 시간마다 2 시간까지, 대조구에 있어서는, 난소 적출 직후를 0 시간으로 하고, 이후 0.5 시간마다 5 시간까지 샘플링을 실시하였다. 실험 중에는 온도 26℃로 관리하였다.
샘플링한 시료로부터 배란율을 산출하였다. 배란율의 산출은, 실체 현미경을 사용하고, 실험구에서는 배양 플레이트의 웰 안에 단편화된 난소로부터 박리한 알을 배란한 알로서 계수하고, 대조구에서는, 10% 포르말린 (와코쥰야쿠코교사제)으로 고정된 시료 난소 내의 배란 후 여포 (濾胞)의 수를 배란으로서 계수하였다.
또한, 두 개의 구 모두 10% 포르말린으로 고정된 단편화된 난소 내 또는 시료 난소 내에 배란하지 않고 남겨진 투명화 알을 계수하였다. 실험구에서는 배란한 알의 수로 배란하지 않고 남겨진 투명화 알의 수를 더해서 분모로 하고, 대조구에서는 배란 후 여포의 수와 배란하지 않고 남겨진 투명화 알의 수를 더해서 분자로 하여, 각각 배란한 알의 수를 나눔으로써 배란율을 계산하였다. 또한, 실체 현미경을 사용하여 상기 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리 2 시간 후에 있어서 배란한 알의 형태를 관찰하였다. 알의 형태는 별개체에서 얻은 생체 내에서 배란한 알의 형태를 정상적인 형태로 하고, 구상이 아닌 알 및 알 내에 불균일한 갈색 성분을 볼 수 있는 알을 이상한 형태의 알이라고 판단하였다.
이 결과, 도 4에 도시하는 바와 같이, 난소 적출 0, 1, 2, 3 시간 후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 실험구에 있어서는, 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리 0.5 시간 후부터 배란율이 유의하게 상승하였다. 그러나, 대조구에서는 배란율에 변화가 없었다.
도 5에 각 실험구에 있어서의 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리의 2 시간 후에 배란한 알의 형태를 관찰한 결과를 나타낸다. 배란한 알의 형태 관찰의 결과, 생체 내에서의 배란에서 보이는 정상적인 형태의 알은 난소 적출 직후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 구에서만 확인되었다. 도 6에 실험구 및 대조구에 있어서의 정상적인 또는 이상한 형태를 나타내는 배란한 알의 출현 빈도를 나타낸다.
따라서, 난소를 단편화 처리함으로써 배란은 일어나지만, 수정능을 가진 것으로 생각되는 정상적인 형태의 배란한 알을 생체 외에서 얻기 위해서는, 난소 적출 직후에 단편화 및 마이크로플레이트 처리를 할 필요가 있는 것이 확인되었다.
＜수정능의 확인>
합계 7 마리의 난소를 사용하여, 난소 적출 직후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 한 것을 0 시간으로 하고, 배양액 중에서 1 시간 배양하여 생체 외에서 배란한 알에 대하여, 인공 수정을 실시하였다. 도 7에 생체 외에서의 배란으로부터 얻은 수정란 및 부화 자어의 사진을 도시한다. 또한, 표 1에 각 개체에 있어서의 배란율, 부상율, 수정율, 부화율을 정리하여 나타낸다.
이 결과, 알질에 개체 차가 있었지만, 5 마리로부터 자어를 얻을 수 있었다.
＜배양액의 조성 검토>
표 2에 나타내는 범위의 농도 (조성)의 배양액을 사용하여, 난소 적출 직후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 하고, 1 시간 배양 후에 얻은 배란된 알의 인공 수정을 실시하였다. 먼저, 50, 100, 150, 또는 200%의 농도로 시험한 결과, 모든 농도에서 수정란 및 자어를 얻을 수 있었다. 카나마이신
또한, 별개체를 사용하여 동일한 시험을 100 내지 175%의 농도로 실시한 결과, 양호한 배양 성적은 100 내지 150%의 농도에서 얻을 수 있었다 (표 3).
<다랑어 혈청의 금속 이온 조성에 맞춘 배양액의 조정>
자어 5마리로부터 혈청을 채취하여, 나트륨 이온 및 칼륨 이온의 농도를 이온 선택 전극법에 의해 측정하였다. 또한, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 농도는 원자 흡광법에 의해 측정하였다.
그 결과, 채취된 혈청은 표 4와 같은 조성이었다. 이 금속 이온의 조성에 맞추어, 193.6 mM 염화나트륨, 7.8 mM 염화칼륨, 3.8 mM 염화칼슘, 1.1 mM 황산마그네슘의 조성의 배양액으로 하고, 또한 이 배양액에 대하여, 5.6 mM 글루코스, 항생 물질(100 mg/L 스트레프마이신 황산염, 50 mg/L 카나마이신 황산염 및 70 mg/L 벤질 페니실린 칼륨) 및 10mM Epps를 가하고, pH를 8.0으로 조정하였다.
<다랑어 혈청의 금속 이온 조성에 맞춘 배양액의 효과>
실시예 1에 기재한 배양액을 사용하는 표준 배양액구, 또는 상기 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하는 다랑어 배양액구를 설정하고, 각각 난소 적출 직후에 단편화 및 마이크로플레이트에의 분배 처리를 하여, 1, 2, 3 및 4 시간 배양한 후에, 수정을 실시하여 배란율, 부상율, 수정율 및 부화율을 산출하였다. 시험은 2 개체로부터의 난소를 사용하여 2회 실시하였다.
1 개체째의 결과를 도 8 내지 11에 나타낸다.
도 8에 도시하는 바와 같이, 1 개체째에 있어서의 표준 배양액구의 배란율은 배양 1 시간부터 거의 100%에 이르렀다. 이에 대하여, 배양 1 시간에서의 다랑어 배양액구의 배란율은 낮고, 그 후, 배양 시간의 경과에 따라 상승하였다. 또한, 부상율은 양쪽 구간 사이에 차이는 없었다 (도 9). 또한, 수정율은 다랑어 배양액구에 있어서 표준 배양액구에 대하여, 배양 2 시간 이후에 높아졌다(도 10). 또한, 부화율에 관하여는, 모든 배양 시간에서 표준 배양액구에 대하여, 다랑어 배양액구에서 높은 값을 나타내었다 (도 11).
2 개체째의 결과를 도 12 내지 15에 나타낸다.
2 개체째에 있어서도, 거의 동일한 결과가 보였지만, 표준 배양액구에 있어서, 수정율이 현저하게 낮고, 부화율에 관하여는 모든 배양 시간에서 0%이었다.
이상의 결과로부터, 다랑어 혈청의 금속 이온의 조성에 맞춘 배양액을 사용하면, 표준 배양액에 대하여, 수정 및 부화의 성적이 향상되는 것이 나타났다. 또한, 전혀 부화하지 않을 것 같은 경우에도, 부화 자어를 얻을 수 있는 것이 밝혀졌다. 한편, 배란의 진행은 지금까지보다 늦어졌지만, 배양 시간을 연장시킴으로써 일정수의 배란한 알을 얻을 수 있는 것이 확인되었다.
본 발명은 해산 어류의 난소의 유지 방법 및 수정란 취득 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하여, 해산 어류가 적출한 난소의 유지 및 수정란의 취득이 용이해져서, 효율적으로 종묘를 제조할 수 있다.
Claims (24)
- 해산 어류로부터 난소를 적출하고, 상기 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 배양액 중에서 배양하는 해산 어류의 난소의 유지 방법.
- 제1항에 있어서, 난소에 포함되는 알을 수정 가능한 상태로 유지하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 난소는 난모 세포를 포함하는 난소인 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액의 pH는 난소를 적출한 어종의 난소강액의 pH와 비교하여 ＋0.5에서 -0.5의 범위가 되도록 조정한 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액의 침투압은 100 mOsm/kg 이상 6000 mOsm/kg 이하인 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온으로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 배양액의 나트륨 이온 농도는 120 mM 이상 250 mM 이하인 것인 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 배양액의 칼륨 이온 농도는 5 mM 이상 10 mM 이하인 것인 방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액의 칼슘 이온 농도는 1.5 mM 이상 5.0 mM 이하인 것인 방법.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액의 마그네슘 이온 농도는 1.0 mM 이상 2.0 mM 이하인 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액은 염소 이온 및/또는 황산 이온을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액은 글루코스, 갈락토스, 과당 및 자당으로부터 선택되는 1종 이상의 당을 함유하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양액은 항생 물질을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 난소의 적출 대상인 해산 어류는 양식어인 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 난소의 적출 대상의 해산 어류는 낚아올린 물고기인 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 해산 어류는 고등어과 어류인 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 하나에 기재된 방법으로 배양한 난소를 배란시켜서 알을 얻는 해산 어류의 알의 생산 방법.
- 제17항에 기재된 방법에 의하여 얻은 알과 정자를 교배시켜서 수정란을 얻는 해산 어류의 수정란의 생산 방법.
- 제17항에 기재된 방법으로 얻은 해산 어류의 알.
- 제18항에 기재된 방법으로 얻은 해산 어류의 수정란.
- 제18항에 기재된 방법으로 얻은 수정란으로부터 부화한 자어를, 치어, 미성어 또는 성어까지 성육시키는 성육하는 공정을 포함하는 해산 어류의 성육 방법.
- 제18항에 기재된 방법으로 얻은 수정란으로부터 부화한 자어를, 치어, 미성어 또는 성어까지 성육시키는 공정을 포함하는 양식 해산 어류의 생산 방법.
- 해산 어류로부터 난소를 적출한 난소 또는 단편화된 난소를 유지하기 위해서 사용되는 배양액의 조정 방법으로,
난소의 적출 대상인 어종의 난소강액의 pH를 측정하는 공정과,
나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온으로부터 선택되는 1종 이상의 농도를 조정함으로써, 측정된 난소강액의 pH에 대하여, ＋0.5로부터 -0.5의 범위가 되도록 배양액의 pH를 조정하는 공정을 포함하는 방법. - 제23항에 있어서, 배양액의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 몰 농도는 난소의 적출에 사용하는 해산 어류의 혈청의 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 각각 1/4 내지 4배의 몰 농도로 조정하는 것인 방법.
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