CN110372779B - 一种能保护及延长卵巢功能的多肽bpp及其应用 - Google Patents

Abstract

一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用，全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSKRAASIQRTSA。本发明序列为自主创新，既具有穿过细胞膜的功能，有能特异抑制内源PROM的活性。从而可以通过多种给药途径（肌肉注射，口服，加在化妆品中通过皮肤吸收等）达到保护及延长卵巢功能。能够保护化疗期青春期女性（20～34岁）因化疗药过度激活卵泡导致的卵巢早衰和生殖力下降甚至丧失。对卵巢贮备及生殖力开始显著下降的女性（35～37），延缓原始卵泡激活，提高生殖力，推迟更年期。

Description

一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用

技术领域

本发明属于生殖医学领域，具体涉及一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用。

背景技术

众所周知，女性卵巢是女性保持生殖力的关键器官，卵巢分泌的甾体激素(雌激素、雄激素、孕激素)也是女性保持身体各方面健康的重要因素之一。然而，卵巢的基本功能单位-卵泡，在女性出生前就开始不断激活和凋亡。而在临近更年期(45～50岁)时，残余卵泡不足以维持正常的生殖及激素分泌功能，从此后女性的衰老过程相比男性将急剧加快。mTOR信号通路是调节卵泡激活程度的关键通路，目前世界各地研究者主要在模式动物(小鼠、大鼠、猴等)上采用多种mTOR信号通路各环节激活性激酶的抑制剂来相对调低mTOR信号通路的活性而相对延缓卵泡激活。但是这些抑制剂均不具有靶向特异性，因而会造成一定的毒副作用。比如被用于延缓卵泡激活及延长寿命的雷帕霉素(rapamycin)是一种免疫抑制剂，可能会引发不良的代谢反应。因此下一代理想的药物应该是能较特异地抑制卵泡激活而不影响机体正常生理机能靶向药物。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用，该多肽能够延缓卵巢早衰及自然衰老女性的卵巢中的卵泡激活，保护和延长女性生殖力，推迟女性更年期和延缓女性衰老。

技术方案：一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP，全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSKRAASIQRTSA。

上述多肽BPP在制备治疗卵巢早衰药物中的应用。

上述多肽BPP在制备延缓卵泡激活药物中的应用。

上述多肽BPP在制备提高卵巢生殖力保健品中的应用。

上述多肽BPP在制备护肤品中的应用。

对因化疗导致卵巢早衰的女性，在化疗前及化疗进行中口服BPP片剂，保护卵巢；也可用于35～37岁卵巢中原始卵泡贮备开始减少的女性，延长卵巢生殖力，推迟更年期和女性衰老。用药每天一次，1mg/kg。一个月为一疗程，疗程越长，效果越好。

对上述两类女性进行肌肉注射，用药剂量和方案同上。

由于BPP多肽中部分氨基酸有穿过细胞膜的功能，也可将BPP加入化妆品，护肤品中每日使用，通过皮肤吸收最后进入卵巢。

有益效果：本发明序列为自主创新，既具有穿过细胞膜的功能，又能特异抑制内源PROM的活性。从而可以通过多种给药途径(肌肉注射，口服，加在化妆品中通过皮肤吸收等)达到保护及延长卵巢功能。能够保护化疗期青春期女性(20～34岁)因化疗药过度激活卵泡导致的卵巢早衰和生殖力下降甚至丧失。对卵巢贮备及生殖力开始显著下降的女性(35～37)，延缓原始卵泡激活，提高生殖力，推迟更年期。

附图说明

图1为PROM敲除雌鼠生殖力显著增加示意图。

其中A、蛋白免疫印迹图，我们运用Cas9技术将PROM基因第9外显子整体删除。Westernblot(蛋白免疫印迹)显示与对照野生B6小鼠(+/+)相比，敲除小鼠(-/-)中PROM蛋白完全消失，证明敲除非常成功。GAPDH作为上样内参。B、PROM敲除对卵母细胞成熟及受精卵发育影响示意图，由图可知PROM敲除并不影响卵母细胞成熟及受精卵发育。C、PROM敲除雌鼠生殖力变化示意图，从6月龄开始，相比对照鼠，PROM敲除雌鼠生殖力显著增加。D、6月龄雌鼠卵巢切片，可知6月龄雌鼠卵巢切片显示敲除小鼠卵巢中各级卵泡显著增多。E、对6月龄雌鼠卵巢切片进行卵泡计数示意图，发现敲除小鼠卵巢中总卵泡数及原始卵泡均显著增加。

图2、PROM作用机制研究图。

其中A、特异磷酸化抗体制备示意图，我们用PROM抗体进行免疫沉淀→洗脱液磷酸化富集→磷酸化位点质谱鉴定发现两个相邻位点-Thr423&Ser424的磷酸化概率为99.8％，因此选取附近多肽序列QSKRAASIQR(pThr)(pSer)A制作特异磷酸化抗体。B、用抗体进行间接免疫荧光图，总PROM主要富集在卵母细胞膜上，磷酸化PROM(p-PROM)主要富集在纺锤体上。因此我们猜测膜上PROM被磷酸化激活后转位到纺锤体上。C、抗体免疫共沉淀后进行蛋白免疫印迹图，显示总PROM与Lck相互作用图。D、蛋白免疫印迹图显示，抑制Lck激酶活性后，p-PROM水平显著降低，说明Lck负责磷酸化激活PROM。Actin作为上样内参。E、蛋白免疫印迹图显示，与对照卵母细胞相比，PROM敲除卵中p-mTOR和p-rps6水平显著降低。Actin作为上样内参。F、PROM作用机制模式图。

图3、BPP可以高效进入卵母细胞及卵巢图。

我们设想，穿膜肽融合PROM磷酸化位点附近多肽而合成的BPP可以与内源PROM竞争被磷酸化，而发挥与PROM敲除类似的效应。其中A、…绿色荧光标记(FITC)的BPP在体外培养的卵母细胞中的分布图，我们将BPP简单添加到培养液中就可以高效进入体外培养的卵母细胞中。可以看到，对照(上)卵母细胞中荧光很低，而加FITC-BPP后卵母细胞中绿色荧光显著增强。B、绿色荧光标记(FITC)的BPP在体外培养的卵巢中的分布图，我们将BPP简单添加到培养液中也可以高效进入体外培养的卵巢中。可以看到，对照(上)卵巢中荧光很低，而加FITC-BPP后卵巢中绿色荧光显著增强。C、绿色荧光标记(FITC)的BPP在体内卵巢中的分布图，其中通过腹腔注射，BPP也可以高效进入小鼠卵巢中。可以看到，对照(上)卵巢中荧光很低，而加FITC-BPP后卵巢中绿色荧光显著增强。蓝色通道是DNA染色，也可显示卵巢的整体结构。D、腹腔注射BPP的Western blot显示图，可以看出腹腔注射的BPP可以抑制内源PROM的磷酸化而导致p-PROM水平降低。GAPDH作为上样内参。Ctr为对照鼠，CPP为不含特异BPP序列的对照穿膜肽。

图4、考察BPP药物典型的剂量依赖性和时间依赖性示意图。

其中，A、给小鼠腹腔注射1～3mg/Kg的BPP，24小时后血液中浓度呈现典型的剂量依赖性示意图。B、给小鼠腹腔注射1mg/Kg的BPP，在不同时间点血液中浓度呈现典型的时间依赖性示意图。

图5、BPP对化疗导致卵巢早衰的小鼠的生殖力影响示意图。

其中A、内源p-PROM的水平图，我们用环磷酰胺(CPA)腹腔注射制作卵巢早衰小鼠模型，同时注射BPP看其是否可以抑制p-mTOR而抑制卵巢早衰。Western blot显示BPP与CPA一起注入小鼠也可显著降低内源p-PROM水平。GAPDH作为上样内参。B、持续超6个月的生殖力鉴定显示图，CPA导致雌鼠几乎完全丧失生殖力(图表中最低线)，而BPP与CPA共同注射显著恢复了雌鼠生殖力(图表中中间线)。C、卵泡计数图，显示BPP与CPA共同注射显著恢复了CPA导致的各级卵泡减少。

图6、BPP有延缓退役雌鼠卵泡激活和提高生殖力的作用图。

A、生殖力鉴定结果显示，BPP腹腔注射组小鼠生殖力高于CPP对照组。B、Westernblot图显示，BPP腹腔注射显著降低了内源p-PROM的水平。GAPDH作为上样内参。Ctr为对照老龄鼠，CPP为不含特异BPP序列的对照穿膜肽。C、卵巢石蜡切片进行苏木精-伊红染色图，其中蓝色染DNA，粉红色染胞质。卵巢切片显示BPP腹腔注射显著增加了各级卵泡。D、卵泡计数显示BPP腹腔注射显著增加了各级卵泡数。E、卵巢mRNA测序图，显示BPP腹腔注射将退役鼠卵巢的RNA表达谱挽救到接近年轻鼠(红色虚线框)。F、对从卵巢mRNA测序结果鉴定到的差异基因的KEGG信号通路分析发现，差异基因最富集的10个信号通路中前3个与卵巢甾体激素合成及细胞因子与受体的相互作用相关(红色虚线框)。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

申请人在一项研究中发现，用Crisper-Cas9技术在小鼠上进行一个卵巢优势表达基因PROM全身性敲除(图1：A)后发现不影响机体各种正常的生理机能及受精卵发育(图1：B)，而小鼠的原始卵泡储备及生殖力显著增加(图1：C-E)；机制研究发现，PROM敲除导致小鼠卵母细胞的mTOR及其下游的转录因子rps6活性显著降低(图2：E)，PROM在Thr423&Ser424位点的磷酸化是将PROM从细胞膜上转位到细胞质而激活的关键(图2：A-D)。

因此我们推测用穿膜肽融合PROM磷酸化位点附近的多肽可以发挥dominant-negtive的效应而抑制内源PROM的磷酸化，从而部分模拟PROM敲除的表型而抑制mTOR通路的活性(磷酸化)，这样的话BPP就可能有用于临床保护女性卵巢储备的治疗性功能。我们将此多肽命名为BPP，其全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSKRAASIQRTSA。实验证实，将绿色荧光标记(FITC)的BPP通过体外培养液中添加或腹腔注射到小鼠体内，8小时后就可以在卵巢及卵母细胞中检测到显著增强的荧光(图3：A-C)，而内源磷酸化PROM(p-PROM)水平则显著降低(图3：D)。另外，在药物动力学研究中，我们发现BPP有典型的时间依赖性和剂量依赖性(图4：A，B)。

接下来我们来验证BPP是否具有治疗性功能。用环磷酰胺处理两月龄雌鼠制作人类女性卵巢早衰的模型中，我们发现BPP腹腔注射能显著降低p-PROM(图5：A),能显著挽救雌鼠的生殖力(图5：B),卵巢中的总、原始、次级卵泡均显著增多(图5：C)。在8月龄退役雌鼠中(相当于人类女性35岁)，我们发现相对于对照组，BPP腹腔注射能提高其生殖力(图6：A)，进一步研究结果显示BPP注射后显著降低p-PROM(图6：B),卵巢中的总、原始、初级卵泡均显著增多(图6：C、D)。卵巢RNA测序发现BPP挽救后卵巢的基因表达谱与2月龄年轻鼠更相似(图6：E红虚线框),KEGG信号通路分析发现表达挽救效果良好的基因多与卵母细胞质量相关(图6：F红虚线框)。

综上，外源BPP能特异抑制内源的p-PROM，从而适度降低mTOR的活性，实现延缓卵巢早衰及卵巢自然衰老中的原始卵泡激活的目的而不影响其它器官的正常功能。鉴于PROM在卵巢中相对优势表达，因此BPP有较好的卵巢靶向性。另外由于BPP能穿透细胞膜，因此BPP也有可能添加在化妆品中通过皮肤吸收而进入卵巢，因此其给药途径也很多样化。因此我们特申请BPP的发明专利，以保护和规范其今后的药物批准号申请、药物人类临床试验等，争取为我国乃至世界的女性卵巢生殖力延长、延缓女性衰老做出重要贡献。

实施例2

在青春期女性(20～35岁)患肿瘤需化疗时，化疗前、化疗期中及化疗后均可通过口服、输液及肌肉注射等途径给予1mg/kg BPP，成年女性按50kg体重计算，等于每天给与50mg，用量低于或与一般西药用量相当。因为PROM是卵巢优势表达，所以BPP既可以保护卵巢不因化疗药过度激活而早衰，而又不影响化疗效果。由于BPP无副作用，在两个化疗周期之间的时间患者也可以服用含BPP的保健品及使用含BPP的化妆品。实验支持数据见图5。

实施例3

对于35～37岁卵巢中原始卵泡贮备开始减少的女性，可以日常口服含BPP的片剂，也可以服用含BPP的保健品及使用含BPP的化妆品。达到延长卵巢生殖力，推迟更年期和女性衰老的功效。实验支持数据见图6。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val Gln Ser Lys Arg Ala Ala Ser Ile Gln Arg Thr

20 25 30

Ser Ala

Claims (3)

1.一种能保护及延长卵巢功能的多肽BPP，其特征在于全序列为KETWWETWWTEWSQPKKKRKVQSKRAASIQRTSA。

2.权利要求1所述多肽BPP在制备治疗卵巢早衰药物中的应用。

3.权利要求1所述多肽BPP在制备延缓卵泡激活药物中的应用。

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