CN111670049A

CN111670049A - 用于预防或治疗免疫疾病的ripk1和ikk抑制剂的组合

Info

Publication number: CN111670049A
Application number: CN201880088634.3A
Authority: CN
Inventors: 马诺利斯·帕斯帕拉基斯; 尼科斯·奥科诺穆; 阿波斯托洛斯·波尔多拉蒂
Original assignee: Universitaet zu Koeln
Current assignee: Universitaet zu Koeln
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-09-15
Also published as: MX2020007036A; JP2021505611A; CA3103847A1; EP3720493A1; EP3494994A1; US20200383995A1; WO2019110832A1

Abstract

本发明涉及与失调的免疫应答有关的疾病的治疗，所述疾病例如是作为药物治疗的不良反应的自身免疫疾病、炎症性疾病或病理性免疫应答。特别地，本发明提供了受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）的抑制剂和κB抑制蛋白（IκB）激酶（IKK）的抑制剂在患有此类疾病的对象中的组合用途。本发明提供了用于医学应用的此类抑制性化合物及其组合，以及包含本发明化合物的药物组合物。

Description

用于预防或治疗免疫疾病的RIPK1和IKK抑制剂的组合

技术领域

本发明涉及与失调的免疫应答有关的疾病的治疗，所述疾病例如是作为药物治疗的不良反应的自身免疫疾病、炎症性疾病或病理性免疫应答。特别地，本发明提供了受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Receptor-interacting serine/threonine-proteinkinase 1，RIPK1）的抑制剂和κB抑制蛋白（IκB）激酶（Inhibitor of κB Kinase，IKK）的抑制剂在患有此类疾病的对象中的组合用途。本发明提供了用于医学应用的此类抑制性化合物及其组合，以及包含本发明化合物的药物组合物。

描述

NF-κB是一种异二聚体转录因子，调节多个炎症性基因的表达。NF-κB与许多病理生理过程有关，包括血管生成（Koch et al, Nature 1995, 376, 517-519）、动脉粥样硬化（Brand et al. Clin Inv. 1996, 97, 1715-1722）、内毒素休克和败血症（Bohrer et al,J. Clin. Inv. 1997, 200972-985）、炎症性肠病（Panes et al, Am J Physiol. 1995,269, H1955-H1964）、局部缺血/再灌注损伤（Zwacka et al, Nature Medicine 1998, 4,698-704）以及过敏性肺部炎症（Gosset et al, Int Arch Allergy Immunol. 1995, 206,69-77）。因此，通过靶向NF-κB活化途径中的调节蛋白来抑制NF-κB代表了一种有吸引力的策略，该策略用于产生用于治疗由于NF-κB在炎症性病症中的重要作用而引起的失调的免疫应答的治疗剂。

IκB激酶（IKK）是协调NF-κB活化的关键调节信号分子。许多免疫和炎症性介质已被证明导致NF-κB活化，包括TNFα、脂多糖（LPS）、IL-1β、CD3/CD28（抗原呈递）、CD40L、FasL、病毒感染和氧化应激。尽管转导这些不同刺激的受体复合物在它们的蛋白质成分上看起来有很大不同，但是可以理解，这些刺激事件中的每一个都会导致IKK和NF-κB的激活。

由调节亚基NEMO/IKKγ和催化亚基IKKα/IKK1和IKKβ/IKK2组成的IKK复合物对于NF-κB活化是必不可少的。IKK/NF-κB信号通路是炎症性应答的关键调节因子。因此，IKK/NF-κB信号传导抑制剂具有治疗炎症性疾病的巨大潜力。然而，无论是从遗传学（IKKβ敲除）还是从药理学（小分子IKK抑制剂）角度，抑制骨髓细胞中的IKK/NF-κB信号传导都会导致IL-1β的产生增多和系统性中性白细胞增多症（neutrophilia）（Greten et al, DOI:10.1016/j.ce11.2007.07.009, Hsu et al, DOI: 10.1038/ni. 1976）。这些发现引起了人们对IKK/NF-κB信号传导抑制剂的安全性的严重关注，这使多家公司终止了其对IKK抑制剂的开发和治疗应用的项目。此外，之前的研究表明，肠和皮肤的上皮细胞以及肝实质细胞中IKK信号传导的抑制引起这些组织中的严重炎症性疾病，这引起了对IKK抑制剂的安全性的额外关注（Pasparakis et al, DOI:lO.l0381nature00820, Nenci et al, DOI:l0.1038/nature05698, Luedde et al, DOI:10.1016/j.ccr.2006.12.016）。

因此，本发明寻求提供通过抑制IKK/NF-κB信号传导但克服这种治疗的已知不良反应来解决免疫相关疾病的新的治疗途径。

在第一方面，通过受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）抑制剂解决了上述问题，该抑制剂用于治疗或预防与病理性或失调的免疫应答有关的疾病，例如对象中白介素-1β（IL-1β）释放增加或系统性中性白细胞增多症。

不受理论的束缚，发明人推测，用IKK抑制剂处理的骨髓细胞产生的IL-1β的增加很大程度上取决于RIPK1激酶活性。无论是从遗传学（使用表达激酶失活的RIPK1 D138N的敲入小鼠）或药理学（使用Necrostatin-1，RIPK1的化学抑制剂）角度，通过用两种不同的IKK抑制剂处理的巨噬细胞，RIPK1激酶活性的抑制大大降低了LPS诱导的IL-1β产生。这表明IKK抑制剂的最严重的已知副作用（即由骨髓细胞产生的IL-1β增加）可以通过抑制RIPK1来预防。因此，本发明出人意料地发现了RIPK1抑制剂在治疗与病理性或失调的免疫应答有关的疾病中的应用，例如由IKK抑制引起的白细胞介素1β（IL-1β）释放增加。

因此，在一些优选的实施方案中，与IL-1β释放增加或系统性中性白细胞增多症有关的疾病是由使用κB抑制蛋白（IκB）激酶（IKK）/核因子κB（NFκB）信号传导抑制剂治疗对象引起的副作用或不良反应。

在本发明的上下文中，术语“RIPK1抑制剂”或“RIPK1的抑制剂”或“RIPK1的拮抗剂”或任何类似的表达应该包括具有作为RIPK1或RIPK1变体的表达、功能和/或稳定性的调节剂的活性的任何化合物或化合物的组合。

在本发明的上下文中，调节剂优选是抑制剂/拮抗剂。

此外，在本发明的上下文中，术语“受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1”或“RIPK1”属于编码根据SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质的人基因。RIPK1也被称为“受体（TNFRSF）相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶1”或“受体相互作用蛋白激酶1”（RIP）（HUGO基因命名委员会符号：HGNC：10019，数据库版本为2017年11月）。人RIPK1基因位于6p25.2，同源物已知来源于小鼠（MGI：108212；NCBI基因：19766）和大鼠（大鼠基因组数据库（RGD）ID：1310158）。

在本文公开的发明的上下文中使用的术语“RIPK1蛋白”或“RIPK1的蛋白”应涉及包含如SEQ ID NO：1所示序列的蛋白（例如全长蛋白、融合蛋白或部分蛋白）。该术语应该还指包含具有任何蛋白质修饰的根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质。这种蛋白质修饰优选不改变多肽链的氨基酸序列，而是构成与碱性氨基酸聚合物链偶联的官能团。在本发明的上下文中，蛋白质修饰可以选自另外的氨基酸序列与RIPK1氨基酸链的偶联，例如泛素化（ubiquitination）、类泛素化（sumolation、neddylation）或类似的小蛋白质偶联物。其他蛋白质修饰包括但不限于糖基化、甲基化、脂质结合或技术人员已知的其他天然或人工翻译后修饰。术语“RIPK1变体的蛋白质”等应该具有相对于RIPK1变体的相应含义。

在本文公开的发明的上下文中使用的术语“RIPK1-mRNA”或“RIPK1的mRNA”应该涉及信使核糖核酸（例如全长mRNA、融合mRNA或部分mRNA和/或其剪接变体），其包含编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的区域。该术语还应该指包含用于编码具有任何密码子或核苷酸修饰的根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的区域的mRNA。这样的修饰优选不改变编码的多肽链的氨基酸序列。术语“RIPK1的变体的mRNA”等应该具有相对于RIPK1的变体的相应含义。

在一些实施方案中，RIPK1的变体是包含与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，优选至少80％（例如至少90％），并且最优选与SEQ ID NO：1（人RIPK1氨基酸序列）具有至少95％（例如至少98%）的序列同一性。在本发明的一个优选实施方案中，RIPK1的变体包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

如本文所用，当在两个或更多个核酸或蛋白质/多肽序列的上下文中的任何地方使用时，术语“相同”或百分比“同一性”是指如使用序列比较算法或通过手动比对和目测检查（参见例如NCBI网站）所测量的，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有（或至少具有）相同的特定百分比的氨基酸残基或核苷酸（即，当比较并比对以在比较窗口或指定区域上获得最大对应性时，在指定区域中（优选在其全长序列中）具有或至少具有约60％的同一性，优选具有或至少具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％的同一性，更优选地具有或至少具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性）。特别是对于氨基酸同一性，使用具有以下参数的BLASTP 2.2.28+：矩阵：BLOSUM62；空位罚分：存在：11，延伸：1；相邻词阈值：11；多次点击的窗口：40。

在本发明的上下文中，术语“对象”或“患者”优选指哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猴、或者优选人类，例如人类患者。本发明的对象可能处于患有失调的免疫应答的危险中，所述失调的免疫应答优选由本文其他地方定义的IKK抑制剂的施用诱导或引起。

在本发明的上下文中，“RIPK1或IKK或者RIPK1或IKK的变体的表达、功能和/或稳定性的调节剂”或语法相似的表达可以是任何化合物，所述化合物分别影响（例如，抑制剂/拮抗剂损害或干扰）RIPK1或IKK或这些靶标的变体的表达、功能和/或稳定性，特别是RIPK1或IKK或其变体的蛋白质的表达、功能和/或稳定性、和/或RIPK1或IKK或其变体的mRNA的表达、功能和/或稳定性。

在本发明的上下文中，RIPK1抑制剂选自：小分子；多肽；肽；糖蛋白；肽模拟物（peptidomimetic）；抗原结合蛋白（ABP），例如，抗体、抗体样分子或其他抗原结合衍生物或其抗原结合片段；核酸，例如DNA或RNA，例如反义或抑制性DNA或RNA、核酶、RNA或DNA适体、RNAi、siRNA、shRNA等，包括其变体或衍生物，例如肽核酸（PNA）；用于靶向基因编辑的遗传构建体，例如CRISPR/Cas9构建体和/或指导核酸（gRNA或gDNA）和/或tracrRNA。

在另一个优选的实施方案中，RIPK1或RIPK1的变体的表达、功能和/或稳定性的调节剂是反义核苷酸分子，例如下文中详细描述的，更优选与编码RIPK1或RIPK1的变体或调节其表达的核酸结合（例如特异性结合）的反义核苷酸分子，或者替代地更优选与编码RIPK1或RIPK1的变体或调节控制其表达、功能和/或稳定性的基因的表达的核酸结合（例如特异性结合）的反义核苷酸分子。

如本文所用，术语“RIPK1表达的抑制剂”等（类似地，包括“RIPK1表达的拮抗剂”等）应该涉及本文公开的任何调节剂（例如，本文所述的抗原结合构建体或反义分子），其对RIPK1蛋白的表达具有拮抗活性，从而损害、抑制、降低和/或减少例如可以通过测量RIPK1蛋白或RIPK1 mRNA的量（或量的变化）来确定的RIPK1蛋白的表达。在本文中，术语“表达”是指将基因转录成mRNA以及随后将mRNA翻译成蛋白质的细胞过程。因此，“基因表达”可以仅指mRNA的产生，而不管如此产生的mRNA的命运如何，或者可替代地/另外地是指将表达的mRNA翻译成蛋白质。另一方面，术语“蛋白质表达”应指蛋白质合成的完整细胞过程。在一个优选的实施例中，本发明的抑制性调节剂（例如反义分子）可以与RIPK1基因或mRNA结合并减少RIPK1 mRNA的转录和/或翻译。术语“RIPK1变体表达的抑制剂”等应该具有相对于RIPK1变体的相应含义。

术语“RIPK1稳定性的抑制剂”等（类似地，包括“RIPK1稳定性的拮抗剂”等）应该涉及本文公开的任何调节剂（例如，本文所述的抗原结合构建体或反义分子），其对RIPK1蛋白的稳定性具有负活性。

术语“RIPK1功能的抑制剂”等（类似地，包括“RIPK1功能的拮抗剂”等）应该涉及本文公开的任何调节剂（例如，本文所述的抗原结合构建体或反义分子），其损害RIPK1蛋白或mRNA的一种或多种活性（例如诱导活性的量或速率的减少或降低）（例如，通过损害RIPK1蛋白或mRNA的表达和/或稳定性），例如本文描述的那些活性中的一种或多种（例如，RIPK1的激酶活性）。

这样的抑制性调节剂可以直接起作用，例如通过与RIPK1结合并降低RIPK1的一种或多种特性（例如其表达、功能和/或稳定性）的量或速率。RIPK1拮抗剂或抑制剂还可以通过损害其表达、稳定性来降低RIPK1功能或活性的量或速率，例如通过与RIPK1蛋白或mRNA结合并对其进行修饰（例如通过去除或添加部分，或改变其三维构象）；以及通过与RIPK1蛋白或mRNA结合并降低其稳定性或构象完整性。RIPK1拮抗剂或抑制剂也可以间接起作用，例如，通过与调节分子或基因区域结合以调控调节蛋白或基因区域的功能并引起RIPK1表达、功能和/或稳定性的量或速率的降低，特别是通过损害RIPK1蛋白或mRNA的一种或多种活性（例如通过改变RIPK1蛋白或mRNA的表达和/或稳定性的量或速率）。因此，RIPK1抑制剂或拮抗剂可以通过任何损害RIPK1表达、功能和/或稳定性（例如导致其量或速率的降低）的机理来起作用。

在一些优选的实施方案中，可能优选的是，RIPK1抑制剂是仅影响和损害RIPK1的激酶酶活性或功能而不干扰RIPK1蛋白表达或蛋白稳定性的化合物。如本文所用，术语“激酶活性”是指包括RIPK1的底物被RIPK1蛋白磷酸化。这样的实施方案可能是有利的，因为已知RIPK1发挥激酶非依赖性功能，其损伤可在被治疗的对象或患者中诱导或引起另外的不良反应。为了特异性地靶向和降低/抑制RIPK1激酶活性，本发明在一些优选的实施方案中涉及选择性结合并损害RIPK1的激酶酶活性或自磷酸化或由自磷酸化引起的构象变化获得的化合物，例如小分子化合物，例如激酶抑制剂。

本发明优选的RIPK1抑制剂是小分子化合物。此类化合物优选选自GSK2982772、necrostatin-1（5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫基-4-咪唑啉酮，5-(吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫代乙内酰脲）、以及稳定的necrostatin-1（5-((7-氯-1H-吲哚-3-基)甲基)-3-甲基-2,4-咪唑烷二酮，5-((7-氯-1H-吲哚-3-基)甲基)-3-甲基咪唑烷-2,4-二酮）。然而，在本发明的上下文中可以使用任何其他已知的RIPK1抑制剂。

如本文将进一步描述的，在优选实施方案中，经受本发明的治疗或用途的对象或患者患有与失调的免疫应答有关的疾病，例如作为药物治疗的不良反应的自身免疫疾病、炎症性疾病或病理性免疫应答。在一些实施方案中，治疗或预防包含向对象施用治疗有效量的RIPK1抑制剂。这样的施用可以是向对象按顺序地或同时地施用治疗有效量的RIPK1抑制剂和IKK/NFκB信号传导抑制剂。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指例如研究者或临床医生根据本文公开的发明寻找的引起组织、系统、动物或人类对象的生物学或医学反应的化合物或组合物的量。此外，术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应对象相比，导致疾病、病症或副作用的治疗、治愈、预防或改善、或疾病或病症进展速度的降低的任何量。

根据本文提供的医学用途和治疗方法的所有方面和实施方案，向需要用RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导抑制剂治疗的对象施用至少一次的化合物或组合的有效量通常为每次施用约0.01 mg/kg至约500 mg/kg、或每次施用约0.01 mg/kg至约100 mg/kg，例如每次施用约1 mg/kg至约10 mg/kg。在一些实施方案中，向所述对象施用至少一次的RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导抑制剂的有效量为每次施用约0.01 mg/kg至约0.1 mg/kg、每次施用约0.1 mg/kg至约1 mg/kg、每次施用约1 mg/kg至约5 mg/kg、每次施用约5 mg/kg至约10 mg/kg、每次施用约10 mg/kg至约50 mg/kg、或者每次施用约50 mg/kg至约100 mg/kg。

为了预防或治疗疾病，RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导抑制剂（或者包含其的药物组合物）的合适剂量将取决于要治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、是否出于预防或治疗目的施用RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导抑制剂和/或药物组合物、之前的治疗、患者的临床病史、年龄、尺寸/体重以及对RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导抑制剂和/或药物组合物的应答、以及主治医师的决定。将RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导抑制剂和/或药物组合物适当地以一次或一系列治疗施用于患者。如果此类RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导抑制剂和/或药物组合物通过一系列治疗施用，则给定治疗方案的施用总数可以由总共约2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于约10次治疗组成。例如，可以在一周、一个月甚至几个月内每天给予一次（或每天2、3或4次）治疗。在某些实施方案中，治疗过程可以无限期地继续。

术语“IKK抑制剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制或中和由IKK介导的生物活性的分子，优选通过阻止IKK的活化。关于本发明上下文中的RIPK1抑制剂的性质和定义的上述内容应同样适用于“IKK抑制剂”的性质和定义。除此之外，优选的IKK抑制剂直接作用于IKK的一个或多个亚基，例如通过与IKK的一个或多个亚基结合。然而，在其他实施方案中，IKK抑制剂可以阻止IKK与底物（如I-κB）相互作用和/或可以作用于IKK信号传导通路中的分子（优选在IKK下游）。在其他实施方案中，IKK抑制剂可以调节受影响细胞中IKK基因表达的水平或降低IKK的水平。可以使用本领域众所周知的测定法来测量分子抑制IKK活化的能力。例如但不限于，可以使用免疫复合物激酶测定和基因报道分子测定来鉴定IKK抑制剂。简而言之，在免疫复合物激酶测定中，检查了免疫沉淀的IKK复合物在体外磷酸化GST-IκBα的能力。例如，通过与偶联了蛋白A珠子的小鼠抗IKKα抗体（Santa CruzBiotechnology）孵育并在4℃摇动3小时，可以从用假定的IKK抑制剂处理过的动物或细胞中清除的纹状体提取物中免疫沉淀IKK复合物。洗涤珠子，并在30℃、10 μCi [32P]γ-ATP存在30分钟下，用1 μg纯化的GST-Iκ-Bα（N末端61个氨基酸）在体外评估IKK活性。产物通过SDS-PAGE检查后再进行放射自显影。

此外，术语“IKK抑制剂”包括这样的任何分子，该分子模拟由IKK亚基介导的生物学活性并特异性改变IKK的功能或表达或通过IKK进行信号传导的效率，从而抑制已经存在的生物学活性或触发新的生物学活性。

在本发明的上下文中，优选的IKK/NFκB信号传导抑制剂是IKK抑制剂，优选IKK2/IKKβ抑制剂。该蛋白质被称为IKK-β、IKK2、IKKB、NFKBIKB或“核因子κB激酶亚基β的抑制剂”（人基因命名委员会符号HGNC：5960），是包含在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的蛋白质（参见https:// www.genenames.org/）。

本发明优选的IKK抑制剂选自SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)、苯氨基嘧啶衍生物(Signal Pharmaceutical Inc.)、MLN120B或PS1145 (MillenniumPharmaceutical Inc.)、BMS- 34554 l*(Bristol-Myers Squibb PharmaceuticalResearch Institute, IKK inhib-itor III)、SC- 514*(Smithkilne Beecham Corp.)、氨基咪唑甲酰胺衍生物（Smithkilne Beecham Corp.）、脲基噻吩甲酰胺衍生物（AstraZeneca）、二芳基吡啶（Diarylpybidine）衍生物（Bayer）、吡啶并恶嗪酮（Pyridooxazinone）衍生物（Bayer）、吲哚甲酰胺衍生物（Aventis Pharma）、苯并咪唑甲酰胺衍生物（Aventis Pharma）、吡唑并[4,3-c]喹啉衍生物（Pharmacia Corporation）、咪唑基喹啉-吡咯甲醛氨基脲衍生物（Tulark Inc.）、吡啶基氰基胍衍生物（Leo Pharma）、IkB激酶抑制剂肽（CalBiochem）、IKK-2抑制剂IV [5-(对氟苯基)-2-脲基]噻吩-3-甲酰胺（CalBiochem）、IKK抑制剂II、蟛蜞菊内酯（Wedelolactone）(CalBiochem)、IKK抑制剂VII（CaIB iochem）、IKK-2抑制剂V N-(3,5-双-三氟甲基苯基)-5-氯-2-羟基苯甲酰胺IMD-0354（CalBiochem）、IKK-2抑制剂VI (5-苯基-2-脲基)噻吩-3-甲酰胺（CalBiochem）、IKK-2抑制剂 VIII ACHP 2-氨基-6-(2-(环丙基甲氧基)-6-羟苯基)-4-(4-哌啶基)-3-氰基吡啶（CalBiochem）、TPCA-1或BI605906。

在另一方面，该问题通过用于预防或治疗炎症性疾病的IKK/NFκB信号传导抑制剂来解决，其中所述预防或治疗包含同时地或按顺序地施用如本文所定义的IKK/NFκB信号传导抑制剂和RIPK1抑制剂。因此，本发明提供了IKK/NFκB信号传导抑制剂（例如IKK抑制剂）和RIPK1抑制剂在治疗患有炎症性疾病的对象中的组合用途。令人惊讶地，本发明的组合可以克服由IKK/NFκB信号传导抑制引起的严重副作用的现有技术的问题，所述副作用例如是中性白细胞增多症的发展和/或IL-1β的释放。

因此，还提供了用于治疗或预防炎症性疾病的（化合物的）组合，其中所述组合包含如本文所定义的RIPK1抑制剂和IKK/NFκB信号传导抑制剂。优选地，所述治疗或预防包含向患有所述炎症性疾病的对象施用治疗有效量的IKK/NFκB信号传导抑制剂。所述治疗或预防还可以优选地包含向所述对象施用足够量的RIPK1抑制剂，以抑制或预防由于向所述对象施用IKK/NFκB信号传导抑制剂而引起的IL-1β释放和/或中性白细胞增多症。

优选以协同有效量提供本发明的组合，尤其是RIPK1和IKK抑制剂的组合。因此，在优选实施方案中，本发明的组合是协同组合。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防与对象的白介素-1β（IL-1β）释放增加有关的疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含如前所述的RIPK1抑制剂以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。优选地，IL-1β或中性白细胞增多症是IKK抑制剂治疗的副作用。

另一个方面涉及用于治疗或预防与对象的白介素-1β（IL-1β）释放增加或中性白细胞增多症有关的疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含如前所述的IKK/NFκB信号传导抑制剂以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

将本发明的药物组合物配制成与其预期的施用途径相适合。施用途径的实施例包括肠胃外施用，例如鞘内、动脉内、静脉内、皮内、皮下、口服、经皮（局部）、脑室内、实质内（intraparenchymal）和经粘膜施用。通常，本发明的药物组合物应该包含一种或多种用于抑制RIPK1和/或IKK/NFκB信号传导的化合物，以及至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。本文所述的药物组合物特别适用于本文所述的方法来治疗免疫相关疾病。

如本文所用，术语“鞘内”是指引入或存在于覆盖脑和脊髓的蛛网膜下的空间中。术语“脑室内”是指例如通过注射、输注或植入将组合物施用脑的脑室系统中（例如，进入脑的脑室）。如本文所用，术语“实质内”可以指直接对脑组织的施用。在其他情况下，实质内施用可以针对任何大脑区域，在该区域中递送一种或多种本发明的化合物对减轻或预防本文所述的一种或多种病症是有效的。在一些实施方案中，直接施用于脑组织的形式是优选的。

用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下成分：无菌稀释剂，例如用于注射的水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱（例如盐酸或氢氧化钠）调节pH。肠胃外制剂可以被封闭在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液（水溶性时）或分散液，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM（(BASF, Parsippany, N.J.）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。在所有情况下，可注射的组合物应该是无菌的，并且应该以易于注射的程度流动。可注射的组合物必须在生产和储存条件下稳定，并且必须进行防腐处理，以防止微生物（如细菌和真菌）的污染。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣（例如卵磷脂）、通过维持所需的颗粒尺寸（在分散液的情况下）以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物污染的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇（如甘露醇，山梨糖醇）和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂（例如单硬脂酸铝和明胶）来实现。

可以通过将所需量的活性化合物（例如，磺基转移酶抑制剂）与所需的以上列举的成分中的一种或组合并入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体包含基本的分散介质和以上列举的所需的其他成分。至于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其之前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。口服组合物可以被封闭在明胶胶囊中或被压成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂合并并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体制备以用作漱口剂，其中将流体载体中的化合物口服施用，漱口（swished）并吐出或吞咽。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分被包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含性质相似的任何以下成分或化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶（gum tragacanth）或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖，崩解剂（例如藻酸、凝胶（Primogel）或玉米淀粉）；润滑剂，例如硬脂酸镁或Stertes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或柑橘调味剂。

为了通过吸入施用，将化合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器递送，所述容器或分配器包含合适的推进剂（例如二氧化碳的气体）或喷雾器。

全身施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸（fusidic acid）衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，如本领域通常已知的将药物组合物制成软膏、药膏、凝胶或乳膏。

在某些实施方案中，药物组合物被制成用于活性成分的持续或控制释放。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚正酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的。该材料也可以从例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc商购获得。脂质体悬浮液（包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体）也可以被用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备。

以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物对于易于施用和剂量均匀特别有利。本文所用的剂量单位形式包括适合作为待治疗对象的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含预定量的经计算可与所需的药物载体联合产生预期的治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于活性化合物的独特特征和要达到的特定治疗效果，以及混合这种活性化合物用于个体治疗领域中固有的局限性。

此类化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药步骤来确定，例如，用于确定LD50（对50％的群体具有致命性的剂量）和ED50（在50％的群体中具有治疗效果的剂量）的。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但应注意设计将此类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以最大程度地减少对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以被用于配制用于人类的剂量范围。这类化合物的剂量优选在包括几乎没有毒性或无毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。对于本发明的方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养测定中初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量，以达到包括细胞培养中确定的IC50（即达到症状最大抑制一半的试验化合物的浓度）在内的循环血浆浓度范围。此类信息可以被用于更准确地确定对人体有用的剂量。药物组合物可以与施用说明一起被包含在容器、包装或分配器中。

本文公开的化合物、组合和组合物特别用于预防或治疗患有与病理性或失调的免疫应答有关的疾病（例如白介素-1β（IL-1β）释放增加或系统性中性白细胞增多症）的对象的方法，所述方法包含向所述对象施用治疗有效量的RIPK1抑制剂。

在本发明的上下文中，术语“ 失调的免疫应答”应指以对象的异常的（优选有害的）免疫应答为特征的任何病理性状况。优选地，这种免疫应答的特征在于在免疫系统的细胞（如骨髓细胞，如骨髓来源的骨髓原始细胞、单核细胞或巨噬细胞）中IL-1β释放增加或系统性中性白细胞增多症。优选地，这种失调的免疫应答是用IKK/NFκB信号传导抑制剂治疗对象的不良反应。

可以用本发明的化合物、组合物、组合和方法治疗的疾病优选是炎症性疾病。为了本发明的目的，术语“炎症性疾病”还包括“自身免疫性疾病”。如本文所用，术语“自身免疫”通常被理解为包含涉及“自身”抗原的炎症性免疫介导的过程。在自身免疫性疾病中，自身抗原会引起宿主免疫应答。

自身免疫和/或炎症性疾病的实施例包括但不限于：全身性红斑狼疮（SLE）；盘状狼疮；狼疮性肾炎；结节病；炎症性关节炎，包括幼年型关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔氏（Reiter's）综合征、强直性脊柱炎、以及痛风性关节炎；器官或组织移植排斥；超急性、急性或慢性排斥和/或移植物抗宿主疾病；多发性硬化症；高IgE综合征；结节性多动脉炎；原发性胆汁性肝硬化；炎症性肠病；克罗恩氏（Crohn's）病；溃疡性结肠炎；乳糜泻（谷氨酸敏感性肠病）；自身免疫性肝炎；恶性贫血；自身免疫性溶血性贫血；牛皮癣；硬皮病；重症肌无力；自身免疫性血小板减少性紫癜；自身免疫性甲状腺炎；格雷夫氏（Grave's）病；桥本氏（Hasimoto's）甲状腺炎；免疫复合物疾病；慢性疲劳免疫功能障碍综合症（CFIDS）；多肌炎和皮肌炎；冷球蛋白血症；溶栓；心肌病；寻常型天疱疮；肺间质纤维化；I型和II型糖尿病；1、2、3和4型迟发型超敏反应；过敏或过敏性疾病；对治疗性蛋白质的有害的/意外的免疫反应（参见例如Koren, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:349-60）；哮喘；变应性肉芽肿性血管炎（变应性肉芽肿病）；过敏性皮肤炎；过敏性和刺激性接触性皮炎；荨麻疹（urtecaria）；IgE介导的过敏；动脉粥样硬化；血管炎；特发性炎症性肌病；溶血性疾病；阿尔茨海默氏病；肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）；慢性炎症性去髓鞘多发性神经病变等。

与根据本发明要治疗的疾病有关的细胞优选是骨髓细胞，例如骨髓来源的骨髓原始细胞、单核细胞或巨噬细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗对象中的炎症性疾病的方法，该方法包含向对象同时或按顺序地施用治疗有效量的（i）RIPK1抑制剂和（ii）IKK/NFκB信号传导抑制剂。

如前所述，本发明的一个优选实施方案涉及本文公开的化合物、组合、组合物和方法用于治疗由用IKK/NFκB信号传导抑制剂的疗法引起的不良反应的用途。作为说明，该实施方案涉及其中对象患有主要使用IKK/NFκB信号传导抑制剂治疗的疾病的医学用途。但是，这种疗法通常与严重的不良反应有关。因此，在一些实施方案中，本发明通过对相同的对象施用根据本文提供的RIPK1抑制剂来提供对此类副作用的预防/治疗。因此，在一些进一步的实施方案中，要治疗的疾病是与RIPK1活性有关的副作用或不良事件。在替代或另外的实施方案中，原发性疾病（在本文中是指通过使用IKK/NFκB信号传导抑制剂治疗的疾病）是与RIPK1不相关的疾病。

在一些实施方案中，术语“不良反应”、“不良事件”或“副作用”应指通过用针对给定的（原发性）疾病的治疗/疗法治疗患有该给定的疾病（此处为原发性疾病）的患者而诱导、引起或加重的医学不利状况。因此，在本文公开的发明的上下文中，可能优选的是，在对象中作为继发性疾病发生的副作用或不良反应通过本文公开的化合物、组合物、组合和/或方法治疗，最优选本文公开的RIPK1抑制剂，其中所述对象患有与继发性疾病不同的原发性疾病。

现在将参考附图和序列在以下实施例中进一步描述本发明，但不限于此。为了本发明的目的，本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。在图中：

图1：RIPK1激酶活性的遗传的（A）或药理的（B）失活消除了用不同浓度的IKK2抑制剂处理的BMDM中LPS诱导的IL-1β分泌。每个条形代表每种条件三个重复样品的平均值+/-SEM值。

图2：通过使用CRISPR/Cas9介导的基因打靶将赖氨酸44突变为丙氨酸（K44A），从内源性Ikk2基因组位点产生表达激酶失活的IKK2的敲入小鼠。a）鼠Ikk2基因组位点的示意图表明赖氨酸44在外显子3上的位置（上图），并且野生型外显子3和突变型外显子3的序列表明设计的突变将赖氨酸44变为丙氨酸（AAG到GCG）（下图）。b）表格描述了从所示育种获得的同窝仔数、总数以及Ikk2 ^K44A/K44A小鼠的数量。请注意，仅在Ripk1 ^D138N/D138N遗传背景下获得了Ikk2 ^K44A/K44A小鼠。c）来自野生型和纯合Ikk2 ^K44A/K44A小鼠的基因组DNA的DNA测序表明，计划的突变已正确引入外显子3中。

图3：在表达突变的IKK2 K44A的细胞中，IKK2激酶活性的损失强烈抑制了骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）中响应于TNF和LPS的NF-κB活化。从2周龄对照（Ikk2 ^wt/K44A；Ripk1 ^wt ^/D138N和Ikk2 ^wt/K44A；Ripk1 ^D138N/D138N）和IKK2激酶失活的（Ikk2 ^K44A/K44A；Ripk1 ^D138N/D138N）小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓。BMDM在存在20 ng/ml M-CSF（Thermo Fisher Scientific, #14-8983-62）的情况下分化7天，然后将其以1x10⁶细胞接种到6孔细胞培养皿中。在第8天，在M-CSF（20 ng/ml）存在的情况下，用TNF（20 ng/ml）和LPS（100 ng/ml）进行时间过程刺激，并在冰上使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液制备细胞裂解液。通过SDS-PAGE分离蛋白质（20 µg），并使用以下抗体进行蛋白质印迹：磷酸化-IκBα S32/36（CellSignaling, #9246L）、IκBα（Santa Cruz Biotechnologies, #K1315）、磷酸化-RelA S536（Cell Signaling, #3036S）和α微管蛋白（Sigma-Aldrich, #T6074）。注意到，与携带一个野生型和一个激酶失活的IKK2等位基因的对照细胞相比，在纯合表达激酶失活的IKK2的细胞中，IκBα的磷酸化和降解以及RelA的磷酸化受到强烈抑制。RIPK1 D138N突变不影响NF-κB活化（Polykratis et al, 2014, J Immunol 193: 1539–1543）。

图4：在表达突变的IKK2 K44A的细胞中，IKK2激酶活性的损失强烈抑制了肺成纤维细胞中响应于TNF和LPS的NF-κB活化。从两周龄对照（IKK2^wt/K44A；Ripk1^D138N/D138N）和IKK2和Ripk1激酶失效（Ikk2^K44A/K44A；Ripk1^D138N/D138N）小鼠中分离肺成纤维细胞。使用剪刀和胶原酶处理剂破坏肺，然后培养7天。在第7天，将肺成纤维细胞以1x10⁶细胞接种到6孔细胞培养皿中。在第8天，用TNF（20 ng/ml）和LPS（100 ng/ml）进行时间过程刺激，并在冰上使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液制备细胞裂解液。通过SDS-PAGE分离蛋白质（20 µg），并使用以下抗体进行蛋白质印迹：磷酸化- IκBαS32/36（Cell Signaling, #9246L）、IκBα（Santa Cruz Biotechnologies, #K1315）和α微管蛋白（Sigma-Aldrich, #T6074）。

图5：RIPK1激酶活性的抑制预防具有特异性抑制IKK2激酶活性的骨髓细胞的小鼠中中性白细胞增多症的发展。通过流式细胞术对从2.5个月大的对照小鼠（Ikk2 ^FL/FL；Cx3cr1 ^WT/WT）、具有特异性抑制IKK2激酶活性的巨噬细胞的小鼠（Ikk2 ^FL/K44A；Cx3cr1 ^Cre/WT）、以及具有特异性抑制IKK2激酶活性的巨噬细胞且所有细胞中还缺乏RIPK1激酶活性的小鼠（Ikk2 ^FL/K44A；Cx3cr1 ^Cre/WT；Ripk1 ^D138N/D138N）收集的外周血评估中性白细胞的存在。中性白细胞被确定为CD115^-Ly6G⁺Ly6C⁺白细胞。在所示的稀释度下，使用以下抗体对全血（50 µL）进行染色：CD115（Biolegend, #135512） 1/100、Ly6G（Biolegend, #127618） 1/200、Ly6C（Biolegend, #128016） 1/200、Life/Dead（Life technologies, #L34959） 1/400。使用Fix/Lyse溶液（eBioscience, #00-5333-54）进行红细胞裂解和固定。将染色的细胞重悬于补充有0.5％FCS的PBS中，并使用LSR Fortessa（BD Biosciences）进行获取。示出了具有所示基因型的小鼠的代表性FACS图。该图示出了具有所示基因型的小鼠中CD115^-Ly6G⁺Ly6C⁺白细胞的百分比。每个点代表单独的小鼠。请注意，缺少RIPK1激酶活性完全预防由于IKK2激酶活性的抑制而引起的中性白细胞增多症。

SEQ ID NO: 1 (RIPK1 同种型 1)

MQPDMSLNVIKMKSSDFLESAELDSGGFGKVSLCFHRTQGLMIMKTVYKGPNCIEHNEALLEEAKMMNRLRHSRVVKLLGVIIEEGKYSLVMEYMEKGNLMHVLKAEMSTPLSVKGRIILEIIEGMCYLHGKGVIHKDLKPENILVDNDFHIKIADLGLASFKMWSKLNNEEHNELREVDGTAKKNGGTLYYMAPEHLNDVNAKPTEKSDVYSFAVVLWAIFANKEPYENAICEQQLIMCIKSGNRPDVDDITEYCPREIISLMKLCWEANPEARPTFPGIEEKFRPFYLSQLEESVEEDVKSLKKEYSNENAVVKRMQSLQLDCVAVPSSRSNSATEQPGSLHSSQGLGMGPVEESWFAPSLEHPQEENEPSLQSKLQDEANYHLYGSRMDRQTKQQPRQNVAYNREEERRRRVSHDPFAQQRPYENFQNTEGKGTAYSSAASHGNAVHQPSGLTSQPQVLYQNNGLYSSHGFGTRPLDPGTAGPRVWYRPIPSHMPSLHNIPVPETNYLGNTPTMPFSSLPPTDESIKYTIYNSTGIQIGAYNYMEIGGTSSSLLDSTNTNFKEEPAAKYQAIFDNTTSLTDKHLDPIRENLGKHWKNCARKLGFTQSQIDEIDHDYERDGLKEKVYQMLQKWVMREGIKGATVGKLAQALHQCSRIDLLSSLIYVSQN

SEQ ID NO: 2 (IKK2 同种型 1)

MSWSPSLTTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQETGEQIAIKQCRQELSPRNRERWCLEIQIMRRLTHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRKYLNQFENCCGLREGAILTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEQRLIHKIIDLGYAKELDQGSLCTSFVGTLQYLAPELLEQQKYTVTVDYWSFGTLAFECITGFRPFLPNWQPVQWHSKVRQKSEVDIVVSEDLNGTVKFSSSLPYPNNLNSVLAERLEKWLQLMLMWHPRQRGTDPTYGPNGCFKALDDILNLKLVHILNMVTGTIHTYPVTEDESLQSLKARIQQDTGIPEEDQELLQEAGLALIPDKPATQCISDGKLNEGHTLDMDLVFLFDNSKITYETQISPRPQPESVSCILQEPKRNLAFFQLRKVWGQVWHSIQTLKEDCNRLQQGQRAAMMNLLRNNSCLSKMKNSMASMSQQLKAKLDFFKTSIQIDLEKYSEQTEFGITSDKLLLAWREMEQAVELCGRENEVKLLVERMMALQTDIVDLQRSPMGRKQGGTLDDLEEQARELYRRLREKPRDQRTEGDSQEMVRLLLQAIQSFEKKVRVIYTQLSKTVVCKQKALELLPKVEEVVSLMNEDEKTVVRLQEKRQKELWNLLKIACSKVRGPVSGSPDSMNASRLSQPGQLMSQPSTASNSLPEPAKKSEELVAEAHNLCTLLENAIQDTVREQDQSFTALDWSWLQTEEEEHSCLEQAS

SEQ ID NO：3至7描述了图2中公开的序列。

实施例

实施例1: RlPK1激酶活性的抑制阻止用药理学IKK抑制剂治疗的巨噬细胞中LPS诱导的IL-1β产生。

实验步骤：

从一只WT和一只Ripk1^D138N/D138N小鼠（6-7周龄）的胫骨和股骨中分离出骨髓。立即冷冻每只小鼠一条腿的骨髓。将来自另一条腿的骨髓细胞以1200 rpm离心5分钟，并接种在15cm²未处理的细胞培养板中的20 ml含10 ng/ml M-CSF的培养基中。允许细胞分化六天，随后将附着的BMDM提起，计数并以2×10⁵个细胞/孔的密度接种在48孔板中。第二天，将细胞用不同浓度的IKK2抑制剂预处理30 min，然后用总体积为250 µl的100 ng/ml LPS刺激。每种实验条件测定三次。20-24小时后，从漂浮细胞中去除、清除上清液并冷冻直至细胞因子测定。按照制造商的说明，使用特异性ELISA（eBioscience）确定IL-1ß浓度。

对于使用Nec1的实验，使用了冷冻的骨髓细胞。解冻后，如上文对于新鲜的骨髓细胞所述地分化巨噬细胞。在预处理的30 min期间，将Necrostatin-1（Nec-1）与IKK2抑制剂一起加入，BMDM用LPS刺激20-24 h，并保留上清液用于ELISA测量。

结果：

用两种不同的IKK2/IKKß抑制剂处理野生型（WT）骨髓来源的巨噬细胞（BMDM），导致LPS刺激后分泌IL-1ß。使用的两种IKK2抑制剂均增强IL-1ß分泌，尽管程度不同，而TPCA-1表现出更大的效价。RIPK1的激酶活性的遗传学（使用来自表达激酶失活的RIPK1^D138N突变体的敲入小鼠的BMDM）（图1A）或者药理学（使用Necrostatin-1）（图1B）的抑制大大降低分泌的IL-1ß的量，表明在IKK2抑制后，BMDM中LPS诱导的IL-1ß分泌取决于RIPK1激酶活性。

试剂

培养基：DMEM，10％FCS，2 mM谷氨酰胺，1 mM丙酮酸钠，10 mM HEPES 100 U/ml青霉素，100 pg/ml链霉素

M-CSF：10 ng/ml（Immunotools）

Nec1：30 pM（Enzo）

LPS：100 ng/ml（Salmonella enterica serotype enteritidis, Sigma）

Bi-605906（Hycultec）

TPCA-1（Tocris）

实施例2: RlPK1激酶活性的抑制阻止巨噬细胞中由IKK2激酶活性的抑制引起的系统性中性白细胞增多症的发展。

为了解决体内IKK2激酶活性的作用，我们从内源性Ikk2基因组位点产生表达激酶失活的IKK2的敲入小鼠。具体来说，我们使用CRISPR/Cas9介导的定向诱变在ikk2基因的外显子3中引入了两个核苷酸改变，从而将编码赖氨酸44的密码子（AAG）改变为编码丙氨酸的密码子（GCG）（图2a）。IKK2的ATP结合袋（binding pocket）中赖氨酸44的突变使其催化活性失活（E Zandi et al., Cell 91, no. 2 (October 17, 1997): 243–52.）。将靶向Ikk2基因的sgRNA与含有所需突变的修复寡核苷酸以及Cas9一起显微注射到C57Bl/6小鼠的受精卵原核中，从而产生了将K44A突变传递给后代的奠基小鼠（founder mice）。杂合Ikk2 ^K44A/wt小鼠是活的，发育到成年，是可育的并且没有显示任何异常。Ikk2 ^K44A/wt小鼠的杂合繁殖未能产生活的纯合Ikk2 ^K44A/K44A后代，这与在缺乏IKK2的小鼠中观察到的胚胎致死性一致（QLi et al., Science (New York, NY) 284, no. 5412 (April 9, 1999): 321–25）。为了解决Ikk2 ^K44A/K44A小鼠的胚胎致死性是否取决于RIPK1激酶活性，本发明人将这些小鼠与表达激酶失活的RIPK1的Ripk1 ^D138N/D138N敲入动物进行了繁殖。确实，发明人获得了存活的Ikk2 ^K44A/K44A Ripk1 ^D138N/D138N小鼠，表明RIPK1激酶活性的抑制可以挽救Ikk2 ^K44A/K44A小鼠的胚胎致死性（图2b）。对来自Ikk2 ^K44A/K44A Ripk1 ^D138N/D138N小鼠的Ikk2基因进行测序，证实了AAG突变为GCG，将赖氨酸44变为丙氨酸（图2c）。尽管双重激酶失活的Ikk2 ^K44A/K44A Ripk1 ^D138N/D138N小鼠正常出生，但是它们表现出生长减慢，且在2周龄时死亡，这可能是由于条件致病菌感染所致，如之前在双RelA和TNFR1基因敲除动物中显示的，这些动物也已出生，但在出生后的前三周因细菌感染而死亡（E Alcamo et al., Journal of Immunology (Baltimore, Md :1950) 167, no. 3 (August 1, 2001): 1592–1600.）。这些结果表明，RIPK1激酶活性介导了Ikk2 ^K44A/K44A小鼠的胚胎致死表型，但是缺乏IKK2和RIPK1两者的激酶活性的小鼠出生后可能会死于严重的免疫缺陷。

为了证实K44A突变消除了IKK2的激酶活性，发明人分析了Ikk2 ^K44A/K44A Ripk1 ^D138N ^/D138N小鼠的骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）以及对照细胞中NF-κB的活化。如图3所示，Ikk2 ^K44A ^/K44A Ripk1 ^D138N/D138N小鼠的BMDM表现出非常强烈地被抑制的NF-κB的活化，这如响应于TNF或LPS刺激的IκBα的磷酸化和降解以及RelA/p65的磷酸化受损所示。通过测量响应于TNF或LPS的Ikk2 ^K44A/K44A Ripk1 ^D138N/D138N和对照小鼠的肺成纤维细胞中NF-κB的活化获得类似的结果（图4）。这些结果证实，K44A突变消除了IKK2的激酶活性，并且非常强烈地抑制了TNF或LPS对NF-κB的活化。

特异性敲除IKK2的骨髓细胞以及用IKK2激酶抑制剂治疗小鼠导致系统性中性白细胞增多症的发展（Greten et al, DOI:10.1016/j.ce11.2007.07.009, Hsu et al,DOI: 10.1038/ni.1976）。这些发现引起了人们对IKK/NF-κB信号传导抑制剂安全性的严重关注，这使多家公司终止了其对IKK抑制剂的开发和治疗应用的项目。发明人假设响应IKK2抑制的中性白细胞增多症的发展可能是由RIPK1激酶活性引起的，并且旨在使用遗传实验解决该假设。本发明人通过将携带一个K44A和一个loxP侧翼IKK2等位基因的小鼠（Ikk2 ^FL ^/K44A）与在巨噬细胞中特异性表达Cre重组酶的Cx3cr1-Cre小鼠杂交，产生了在骨髓细胞中具有抑制IKK2激酶活性的小鼠（Simon Yona et al., “Fate Mapping Reveals Originsand Dynamics of Monocytes and Tissue Macrophages Under Homeostasis.,”Immunity 38, no. 1 (January 24, 2013): 79–91, doi:10.1016/j.immuni.2012.12.001）。在这些动物中，Cre重组酶删除了表达野生型IKK2的loxP侧翼IKK2等位基因，从而导致巨噬细胞中仅表达激酶失活的IKK2K44A。与基于特异性敲除IKK2的骨髓细胞以及使用IKK2激酶抑制剂治疗小鼠的早期研究相一致，发明人发现，巨噬细胞中IKK2激酶活性的抑制导致小鼠中系统性中性白细胞增多症的发展，如对血液中中性白细胞的分析所示（图5）。重要的是，将Ikk2 ^FL/K44A、Cx3cr1-Cre小鼠与Ripk1 ^D138N/D138N动物杂交可以挽救中性白细胞增多症的发展，如Ikk2 ^FL/K44A、Cx3cr1-Cre、Ripk1 ^D138N/D138N小鼠的血液中中性粒细胞的正常数量所示（图4）。这些发现提供了实验证据，表明通过IKK2激酶活性的抑制的系统性中性白细胞增多症的发展依赖于RIPK1激酶活性。

根据这些发现，本发明人提出RIPK1激酶抑制剂的施用将会克服IKK/NF-κB抑制剂的严重不良反应，从而允许抑制IKK/NF-κB信号传导的药物用于炎症性疾病的治疗的安全应用。由于在某些急性和慢性炎症性病理模型中，也已报道了RIPK1激酶活性的抑制可以抑制炎症，因此RIPK1抑制剂与IKK/NF-κB抑制剂的共同施用可以不仅预防后者的不良副作用，而且可以通过将两种抑制剂的治疗作用组合来产生协同作用。

序列表

<110> 科隆大学

<120> 用于预防或治疗免疫疾病的RIPK1和IKK抑制剂的组合

<130> U30819WO

<150> EP17205864.6

<151> 2017-12-07

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 671

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gln Pro Asp Met Ser Leu Asn Val Ile Lys Met Lys Ser Ser Asp

1 5 10 15

Phe Leu Glu Ser Ala Glu Leu Asp Ser Gly Gly Phe Gly Lys Val Ser

20 25 30

Leu Cys Phe His Arg Thr Gln Gly Leu Met Ile Met Lys Thr Val Tyr

35 40 45

Lys Gly Pro Asn Cys Ile Glu His Asn Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala

50 55 60

Lys Met Met Asn Arg Leu Arg His Ser Arg Val Val Lys Leu Leu Gly

65 70 75 80

Val Ile Ile Glu Glu Gly Lys Tyr Ser Leu Val Met Glu Tyr Met Glu

85 90 95

Lys Gly Asn Leu Met His Val Leu Lys Ala Glu Met Ser Thr Pro Leu

100 105 110

Ser Val Lys Gly Arg Ile Ile Leu Glu Ile Ile Glu Gly Met Cys Tyr

115 120 125

Leu His Gly Lys Gly Val Ile His Lys Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile

130 135 140

Leu Val Asp Asn Asp Phe His Ile Lys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala

145 150 155 160

Ser Phe Lys Met Trp Ser Lys Leu Asn Asn Glu Glu His Asn Glu Leu

165 170 175

Arg Glu Val Asp Gly Thr Ala Lys Lys Asn Gly Gly Thr Leu Tyr Tyr

180 185 190

Met Ala Pro Glu His Leu Asn Asp Val Asn Ala Lys Pro Thr Glu Lys

195 200 205

Ser Asp Val Tyr Ser Phe Ala Val Val Leu Trp Ala Ile Phe Ala Asn

210 215 220

Lys Glu Pro Tyr Glu Asn Ala Ile Cys Glu Gln Gln Leu Ile Met Cys

225 230 235 240

Ile Lys Ser Gly Asn Arg Pro Asp Val Asp Asp Ile Thr Glu Tyr Cys

245 250 255

Pro Arg Glu Ile Ile Ser Leu Met Lys Leu Cys Trp Glu Ala Asn Pro

260 265 270

Glu Ala Arg Pro Thr Phe Pro Gly Ile Glu Glu Lys Phe Arg Pro Phe

275 280 285

Tyr Leu Ser Gln Leu Glu Glu Ser Val Glu Glu Asp Val Lys Ser Leu

290 295 300

Lys Lys Glu Tyr Ser Asn Glu Asn Ala Val Val Lys Arg Met Gln Ser

305 310 315 320

Leu Gln Leu Asp Cys Val Ala Val Pro Ser Ser Arg Ser Asn Ser Ala

325 330 335

Thr Glu Gln Pro Gly Ser Leu His Ser Ser Gln Gly Leu Gly Met Gly

340 345 350

Pro Val Glu Glu Ser Trp Phe Ala Pro Ser Leu Glu His Pro Gln Glu

355 360 365

Glu Asn Glu Pro Ser Leu Gln Ser Lys Leu Gln Asp Glu Ala Asn Tyr

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His Leu Tyr Gly Ser Arg Met Asp Arg Gln Thr Lys Gln Gln Pro Arg

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His Asp Pro Phe Ala Gln Gln Arg Pro Tyr Glu Asn Phe Gln Asn Thr

420 425 430

Glu Gly Lys Gly Thr Ala Tyr Ser Ser Ala Ala Ser His Gly Asn Ala

435 440 445

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Asn Asn Gly Leu Tyr Ser Ser His Gly Phe Gly Thr Arg Pro Leu Asp

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Pro Gly Thr Ala Gly Pro Arg Val Trp Tyr Arg Pro Ile Pro Ser His

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Asn Tyr Met Glu Ile Gly Gly Thr Ser Ser Ser Leu Leu Asp Ser Thr

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<213> 智人

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<212> DNA

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<212> DNA

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Claims

1.一种用于治疗或预防对象的疾病的受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）抑制剂，其中所述疾病是由用κB抑制蛋白（IκB）激酶（IKK）/核因子κB（NFκB）信号转导抑制剂治疗对象引起的作为副作用的病理性或失调的免疫反应。

2.根据权利要求1所述的特定用途的RIPK1抑制剂，其中所述疾病是由用IKK/NFκB信号传导抑制剂治疗对象引起的作为副作用的系统性中性白细胞增多症或白细胞介素-1β（IL-1β）释放增加。

3.根据权利要求2所述的特定用途的RIPK1抑制剂，其中所述对象患有炎症性疾病。

4.根据权利要求1至3的任一项所述的特定用途的RIPK1抑制剂，其中所述治疗或预防包含向所述对象按顺序地或同时地施用治疗有效量的RIPK1抑制剂和IKK/NFκB信号传导抑制剂。

5.根据权利要求2至4的任一项所述的特定用途的RIPK1抑制剂，其中所述IKK/NFκB信号传导抑制剂是IKK抑制剂，优选IKK2/IKKβ抑制剂。

6.根据权利要求1至6的任一项所述的特定用途的RIPK1抑制剂，其中所述RIPK1抑制剂选自：小分子；多肽；肽；糖蛋白；肽模拟物；抗原结合蛋白（ABP）（例如，抗体、抗体样分子或其他抗原结合衍生物或其抗原结合片段）；核酸，例如DNA或RNA，例如反义或抑制性DNA或RNA、核酶、RNA或DNA适体、RNAi、siRNA、shRNA等，包括其变体或衍生物，例如肽核酸（PNA）；用于靶向基因编辑的遗传构建体，例如CRISPR/Cas9构建体和/或指导核酸（gRNA或gDNA）和/或tracrRNA。

7.一种用于预防或治疗炎症性疾病的IKK/NFκB信号传导抑制剂，其中所述预防或治疗包含同时地或按顺序地施用IKK/NFκB信号传导抑制剂和RIPK1抑制剂。

8.根据权利要求7所述的特定用途的IKK/NFκB信号传导抑制剂，其中所述RIPK1抑制剂是根据权利要求1至6的任一项所述的RIPK1抑制剂。

9.根据权利要求7或8所述的特定用途的IKK/NFκB信号传导抑制剂，所述IKK/NFκB信号传导抑制剂是IKK抑制剂，优选IKK2/IKKβ抑制剂。

10.一种用于治疗或预防炎症性疾病的组合，其中所述组合包含RIPK1抑制剂和IKK/NFκB信号传导抑制剂。

11.根据权利要求10所述的特定用途的组合，其中所述治疗或预防包含向患有炎症性疾病的对象施用治疗有效量的IKK/NFκB信号传导抑制剂。

12.根据权利要求10或11所述的特定用途的组合，其中所述治疗或预防包含向所述对象施用足够量的RIPK1抑制剂，以抑制或预防由向所述对象施用所述IKK/NFκB信号传导抑制剂引起的不良反应。

13.根据权利要求10至11的任一项所述的特定用途的组合，其中所述RIPK1抑制剂是根据权利要求1至6的任一项所述的RIPK1抑制剂，和/或其中所述IKK/NFκB信号传导抑制剂是根据权利要求7至9的任一项所述的IKK/NFκB信号传导抑制剂。

14.一种用于治疗或预防对象中的疾病的药物组合物，所述疾病是IKK抑制剂治疗的副作用，例如白介素-1β（IL-1β）释放增加或系统性中性白细胞增多症，其中所述药物组合物包含：根据权利要求1至6的任一项所述的RIPK1抑制剂，和/或根据权利要求7至9的任一项所述的IKK/NFκB信号传导抑制剂，和/或根据权利要求10至13的任一项所述的组合；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。