KR101749138B1

KR101749138B1 - 신경질환 예방 또는 치료를 위한 aimp2-dx2를 포함하는 약학 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101749138B1
Application number: KR1020150140723A
Authority: KR
Inventors: 최진우; 김성훈
Original assignee: 원광대학교산학협력단; 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2015-10-07
Filing date: 2015-10-07
Publication date: 2017-06-20
Also published as: KR20170041363A

Abstract

본 발명은 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 이를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 신경질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 AIMP2-DX2 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 세포사멸(apoptosis) 억제, 운동장애 개선 및 산화적 스트레스 억제 효과를 나타내므로, 파킨슨병, 루게릭병 등 신경질환의 효과적인 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있다.

Description

신경질환 예방 또는 치료를 위한 AIMP2-DX2를 포함하는 약학 조성물 및 이의 용도{Pharmaceutical composition comprising AIMP2-DX2 for preventing or treating neuronal diseases and use thereof}

본 발명은 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 폴리펩티드 또는 상기 AIMP2-DX2를 포함하는 바이러스벡터, 보다 구체적으로 AIMP2-DX2를 탑재한 아데노조력 바이러스(adenoassociated virus, AAV)를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 상기 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 신경질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

신경세포는 발생 및 시냅스를 재구성하는 과정에서 끊임없이 세포사멸하며, 스트레스와 세포독성 약물에 의한 세포사멸이 퇴행성 뇌질환의 주요 요인이 된다. 이중 산화적 스트레스는 파킨슨 병, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환과 같은 퇴행성 뇌질환의 유발원인과 많은 연관관계를 가진 것으로 알려져 있으며, 최근 연구에 따르면 만성적인 스트레스 및 산화적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질계, 해마, 선조체, 흑질 그리고 전뇌피질 부위에서 산화적 스트레스를 유발하여 세포사멸을 증가시키고 뉴런 및 성장인자를 감소시켜 파킨슨 병, 스트레스, 노화, 뇌졸중 및 헌팅톤 질환을 초래하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

특히 산소에서 유리되는 자유라디칼은 조직 손상의 주요 원인으로 알려져 있고, 신경독성과 관련된 산화적 라디칼의 종류에는 과산화수소, 과산화수소 음이온, 수산화기 등이 있고, 이 중 과산화수소가 고반응성 자유 라디칼의 전구체로 가장 중요한 물질로 알려져 있고, 중추신경계의 세포사멸을 유발할 것으로 유력시되고 있다.

뇌신경세포에 산화적 스트레스를 주게 되면 활성산소종이 촉발되고, 이는 미토콘드리아에서의 시토크롬 C의 유리와 카스파아제-3 활성화를 일으켜 세포사멸을 가져온다. 이와 동시에 ROS는 글루타메이트, 특히 NMDA 수용체의 활성화를 가져와 메타보트로피칼 폭포(metabotrophical cascade)에 의한 Ca²⁺ 이온의 증가를 가져오고, ROS와 연관된 세포내 Ca²⁺의 증가는 또한 카스파아제-2의 활성화를 가져와 DNA 손상을 초래하게 된다.

신경질환 중 파킨슨 병(Parkinson's disease)은 뇌의 흑질(substantia nigra)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되어 발생하는 것으로 알려져 있으며, 안정떨림, 경직, 운동완만 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환의 하나이다. 이러한 전형적인 이상 운동증상 이외에도 자율신경계 증상, 신경정신과정 증상, 인지기능 장애, 수면장애, 통증, 피로, 후각장애 등이 나타나기도 한다. 파킨슨병의 원인은 아직까지 밝혀지지 않았으며, 현재 도파민 전구물질인 레보도파(levodopa)를 기본으로 하는 레보도파 요법이 파킨슨 병에 대한 일반적인 치료법이다. 최근에는 레보도파가 뇌로 이동하기 전에 분해되는 것을 막아주는 효소를 혼합한 약물을 주로 사용한다. 하지만 치료 과정에서 약물과 관련된, 또는 병의 진행에 의해 나타나는 다양한 운동 장애가 관찰되며, 이를 치료하기 위하여 도파민 작용제, 분해효소 억제제 등을 병용하는 경우가 일반적이다. 파킨슨병의 증상들 중에는 도파민성 약물에 반응하지 않는 것도 있으며, 이러한 비운동성증상이 나타나는 경우에는 증상에 따라 증상을 완화하는 대증적 요법을 시도한다. 한편 우울증은 파킨슨병의 가장 흔한 기분장애이며, 이 경우 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI), 삼환계 항우울제 등을 투여한다. 최근 전형적 파킨슨병에 대한 수술적 치료 요법이 개발되어 시행되고 있으며, 이는 뇌의 깊은 곳에 위치한 시상밑핵(subthalamic nucleus) 등에 고주파 전기자극을 가함으로써 파킨슨병의 증상을 완화시키는 치료이다. 그러나 아직까지 파킨슨 병을 예방 하거나 완전히 치료할 수 있는 치료제는 개발되지 않았으며, 대부분 약물을 통해 증상을 완화시키려는 노력을 하거나, 상기 언급한 바와 같이 전기자극을 주는 수술적 기법에 의존하고 있다는 점에서 한계가 있다.

또한 신경질환 중 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis)은 운동신경세포만 선택적으로 사멸하는 질환으로서, 대뇌 겉질(피질)의 위운동신경세포(upper motor neuron, 상위운동신경세포)와 뇌줄기(뇌간) 및 척수의 아래운동신경세포(lower motor neuron) 모두가 점차적으로 파괴되는 특징을 보이며, 임상 증상은 서서히 진행되는 사지의 위약(weakness, 쇠약) 및 위축으로 시작하고, 병이 진행되면서 결국 호흡근 마비로 수년 내에 사망에 이르게 되는 치명적인 질환이다. 루게릭 병의 발병 원인은 아직 밝혀지지 않았으며, 루게릭병의 발병 원리 및 경과 등에 맞추어 여러 가지 약물이 개발 중이지만 아직 확실하게 효과가 입증된 약제는 없다. 현재 유일하게 사용을 인정받은 약물인 릴루졸(riluzole)은 생존기간을 수개월 정도 연장시키는 효과는 있지만, 삶의 질을 개선하거나 근력을 회복시키는 데에는 아직까지 효과가 확인되지 않았다. 이와 같이 루게릭 병은 현재 치료제가 없는 상태이며, 따라서 희귀난치의 대표 질환인 루게릭 병에 대한 보조 또는 주 치료제의 개발이 필요하다.

한편 AIMP2-DX2는 세포 사멸에 다방면으로 관련된 종양억제인자 AIMP2의 얼터너티브 스플라이싱 변이체(alternative splicing variant)로서 AIMP2의 기능을 저해함으로써 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 발명자는 AIMP2-DX2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물, 보다 상세하게는 AIMP2-DX2 억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물, AIMP2-DX2의 발현을 억제하는 발현벡터를 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물 및 AIMP2-DX2의 발현을 억제하는 물질을 스크리닝하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제의 스크리닝 방법에 관한 특허(특허문헌 4)의 발명자 중 한 명이며, 여기에서는 AIMP2/p38가 TRAF2를 유비퀴틴화 하는 것을 촉진하여 TNF-α에 의해 유도되는 세포 사멸을 조절하며, AIMP2/p38의 스플라이싱 변이체인 AIMP2-DX2가 AIMP2와 경쟁적 저해제로 작용하여 TRAF2의 유비퀴틴을 억제하여 TNF-α에 의한 세포 사멸을 억제함으로서 종양생성을 촉진하는 점 및 염증 마커인 Cox-2의 발현을 저해함을 밝혔다.

또한 AIMP2-DX2는 기존에 폐암 유발인자로 확인되어 보고된바 있고, 상기 종래 연구에서는 AIMP2의 변이체인 AIMP2-DX2가 암세포에서 많이 발생하고, AIMP2의 암억제 기능을 방해하여 암을 유발한다는 사실을 확인하였으며, AIMP2-DX2를 정상세포에서 발현시키면 세포의 암화가 진행되고 반대로 AIMP2-DX2의 발생을 억제하면 암의 성장이 억제되어 치료 효과가 나타난다는 사실을 발견한바 있다. 또한 AIMP2-DX2 타겟을 억제하면 탁솔이나 시스플라틴과 같은 기존 항암제에 대해 반응을 보이지 않는 난소암을 치료할 수 있다는 점을 동물모델을 통해 확인한 바 있다. 그러나 AIMP2-DX2는 그 자체로는 정상세포에 대한 암화 능력을 가지고 있지는 않다.

본 발명의 발명자는 AIMP2의 길항역할을 하는 AIMP2-DX2를 아데노-조력 바이러스(Adeno-associated virus)에 삽입하여 신경세포에 도입할 경우, 신경세포사멸을 효과적으로 억제한다는 것을 in vitro 와 in vivo에서 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 1,351,587호 (2014. 1. 8. 등록) 대한민국 등록특허 1,528,440호 (2015. 6. 5. 등록) 대한민국 등록특허 1,252,891호 (2013. 4. 3. 등록) 대한민국 등록특허 1,067,816호 (2011. 9. 20. 등록) 대한민국 공개특허 2012-0119425 (2012. 10. 31. 공개) 미국공개특허 2009-0156536 (2009. 6. 18. 공개)

N. Muzyczka, Use of Adeno-Associated Virus as a General Transduction Vector for Mammalian Cells, Viral Expression Vectors, Current Topics in Microbiology and Immunology Vol. 158, 1992, pp 97-129 Michael G. Kaplitt et al., Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain, Nature genetics, Vol. 8, 1994, pp 148-154 Yunjong Lee et al., Parthanatos mediates AIMP2-activated age-dependent dopaminergic neuronal loss, Nature Neuroscience, Vol. 16, 2013, pp 1392-1400 Jin Woo Choi et al., AIMP2 promotes TNF-dependent apoptosis via ubiquitin-mediated degradation of TRAF2, J. Cell Sci. Vol. 122, 2009, pp 2710-2715 Jin Woo Choi et al., Cancer-Associated Splicing Variant of Tumor Suppressor AIMP2/p38: Pathological Implication in Tumorigenesis, PLoS Genetics, Vol. 7(3), 2011, pp 1-13 Hwang SK et al., Lentivirus-AIMP2-DX2 shRNA suppresses cell proliferation by regulating Akt1 signaling pathway in the lungs of AIMP2/ mice, J. Aerosol Med. Pulm. Drug Deliv., Vol.26(3), 2013, pp 165-173

본 발명은 치료제가 없거나 치료제가 있더라도 그 효과가 미미한 신경질환 분야에 있어, 신경세포에 주입하여 신경질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타내는 유전자치료제를 개발함으로써, 파킨슨 병, 루게릭 병과 같은 난치성 신경질환에 대한 보조 또는 주 치료제를 제공하는 것을 발명의 목적으로 한다.

본 발명은 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공함으로써, 상기 과제를 해결하였다.

본 발명의 일 양태에서, 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터는 세포사멸(apoptosis) 억제, 운동장애 개선 및 산화적 스트레스 억제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타냄으로써, 신경질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다는 점을 구명하였다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 병, 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis), 경도인지장애, 다발-경색성 치매, 전두측두치매(frontotemporal dementia), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 헌팅톤 질환, 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 우울증, 간질, 다발성 경화증, 피질기저퇴행증(corticobasal degeneration), 다계통위축병(multiple system atrophy), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(dentatorubropallidoluysian atrophy), 척수소뇌실조병(spinocerebella ataxia), 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 척수근육위축병(spinal muscular atrophy) 및 뇌졸중(stroke)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 질환일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 바이러스벡터, 선형 DNA 및 플라즈미드 DNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 담체에 탑재한 형태일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 담체로서 바이러스벡터를 사용하는 경우 보다 구체적으로 아데노조력 바이러스(adenoassociated virus, AAV), 아데노 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 벡시니아 바이러스 및 허페스 심플렉스 바이러스 (Herpes Simplex Virus)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 바이러스벡터를 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 필요로 하는 인간을 제외한 동물 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공함으로써 상기 과제를 해결하였다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 투여는 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터는 화학적 방법, 물리적 방법, 리포좀을 이용한 접합방법, 수용체를 이용한 방법 및 바이러스를 이용한 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 방법에 의하여 세포 내로 도입시킴으로써 수행될 수 있다.

AIMP2-DX2 형질전환 마우스의 경우 대조군 마우스에 비하여 총 수명이 증가하였고, 행동테스트, PD 마우스실험, 로타로드 실험 및 폴 실험 결과 운동장애가 개선되는 것으로 나타났다.

또한, 신경세포사멸을 현저히 저하시키는 것으로 나타났는바, 신경질환, 구체적으로 알츠하이머 질환, 파킨슨 병, 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis), 경도인지장애, 다발-경색성 치매, 전두측두치매(frontotemporal dementia), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 헌팅톤 질환, 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 우울증, 간질, 다발성 경화증, 피질기저퇴행증(corticobasal degeneration), 다계통위축병(multiple system atrophy), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(dentatorubropallidoluysian atrophy), 척수소뇌실조병(spinocerebella ataxia), 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 척수근육위축병(spinal muscular atrophy) 및 뇌졸중(stroke)을 예방하거나 상기 질환에 따른 제증상을 개선, 완화하거나, 치료하기 위한 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도1은 N2A세포에 대한 WT, 85, 93 뮤턴트 및, 여기에 각각 AIMP2 유전자와 DX2 유전자를 넣은 세포군에서 AIMP2-DX2 폴리펩티드 및 대조군의 염증성 사이토카인-유도성 세포사멸에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도2는 AAV-DX2가 1차 신경세포의 세포사멸에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도3은 DX2-SOD1 마우스가 SOD 마우스에 비하여 어느 정도 생존기간이 증가하는지를 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도4는 ASL 마우스에서 AAV-DX2가 생존기간 연장에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도5는 AAV-DX2가 PD 마우스에서 세포사멸에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도6은 로타로드 실험(rotarod test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도7은 폴 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도8은 N2A세포에 대한 WT, 85, 93 뮤턴트 및, 여기에 DX2 유전자를 넣은 세포군에서 사이클로헥시미드 및 TNF-알파를 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때 세포사멸 유도 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 AIMP2-DX2 폴리펩티드는 AIMP2(서열번호 3)의 스플라이싱 변이체로서, AIMP2의 2번째 엑손(서열번호 4)이 누락된 형태의 폴리펩티드이며, 아미노산 서열에 대한 정보는 선행특허(대한민국 등록특허 제1,067,816호)에 기재된 바와 같다. 구체적으로, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열, AIMP2-DX2 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.

상기 AIMP2-DX2 폴리펩티드는 실험 결과, 염증성 사이토카인-유도성 세포 사멸을 효과적으로 저해하는 것으로 나타났다.

자궁경부암(cervical carcinoma)(BI259092) 및 근육 횡문근육종(muscle rhabdomyosarcoma)(BI115365)에 대한 엑손 2가 결여된 AIMP2-스플라이싱 변이체의 익스프레션은 EST 데이터베이스에 보고된바 있으며, 다음에 나타낸 바와 같다:

본 발명의 일 양태에서, 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터는 세포사멸(apoptosis) 억제, 운동장애 개선 및 산화적 스트레스 억제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타냄으로써, 신경질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 벡터는 바이러스벡터, 선형 DNA 및 플라즈미드 DNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편 유전자 치료법은 크게 생체내(in vivo)와 생체외(ex vivo) 두 가지로 구분되는데, in vivo 유전자 치료법은 치료 유전자를 직접 체내에 주입하는 것이고, ex vivo 유전자 치료법은 일차적으로 표적 세포(target cell)를 시험관내에서 배양하고, 이들 세포에 유전자를 도입시킨 다음, 유전자 변형된 세포를 다시 체내로 주입하는 것이다. 현재 유전자 치료 연구 분야에서는 in vivo 유전자 치료법보다는 ex vivo 유전자 치료법을 많이 사용하고 있다.

유전자 전달 기술은 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법, 플라즈미드를 이용하는 방법, 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다.

상기 전달 기술 중에서, 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료유전자로 대체된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자치료를 위해 선호하는 방법이다.

본 발명의 일 양태에서, 바이러스벡터를 사용하는 경우, 보다 구체적으로 아데노조력 바이러스(adenoassociated virus, AAV), 아데노 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 벡시니아 바이러스 및 허페스 심플렉스 바이러스 (Herpes Simplex Virus)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 바이러스벡터에 탑재한 재조합 바이러스를 사용할 수 있다.

본 발명의 “바이러스벡터”는 원하는 세포, 조직 및/또는 기관으로 치료 유전자 또는 유전물질을 전달할 수 있는 바이러스벡터이다.

바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 예를 들어 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노조력 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 허페스 심플렉스 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다.

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스(Retrovirus)는 숙주세포의 게놈에 통합기능이 있으며,인체에 해가 없지만 통합 시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7 kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 특징을 갖는다. 그러나 레트로바이러스는 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 체세포 조직을 항시 in vitro에서 증식하여야만 한다는 단점도 지니고 있다. 또한, 레트로바이러스는 원형암유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.

한편, 아데노바이러스(Adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점을 가지는데, 중간정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈, 림프, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염율이 낮다. 또한 전달된 유전자의 발현이 1~2주 후에 가장 많이 되고, 일부 세포에서는 3~4주 정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역 항원성을 갖는다는 것이다.

아데노조력 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. 본 발명의 용어 “아데노조력 바이러스(adenoassociated virus, AAV)”는 아데노위성 바이러스(adeno-satellitovirus)라고도 불린다. 아데노조력 바이러스 입자의 직경은 20 nm이며, 인체에 해가 거의 없는 것으로 알려져 유럽에서 유전자치료제로 판매가 승인되기도 하였다.

AAV는 단일가닥의 원바이러스(Provirus)로서, 복제하기 위하여 보조바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈(genome)은 4,680 bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 트랜스 유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence)부분에 의해 연결된 플라즈미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라즈미드 DNA와 함께 트랜스펙션(transfection)시키고 아데노바이러스는 보조바이러스로서 첨가한다. AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복투여 시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈이 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.

상기 아데노조력 바이러스는 4종의 혈청형이 있는 것으로 알려져 있다. 목적유전자의 전달에 사용될 수 있는 많은 아데노조력 바이러스의 혈청형들 중에서, 가장 널리 연구된 벡터는 아데노-부속 바이러스 혈청형 2 (Adeno-associated virus serotype 2)로, 낭포성섬유증[1], 혈우병[2] 및 카나반 병[3]의 임상적 유전자 전달에 현재 사용되고 있다. 또한, 최근에는 암 유전자 치료 분야 (cancer gene therapy)에서 rAAV(recombinant adeno-associated virus)의 잠재성이 증가하고 있다[4]. 본 발명에서 사용한 것 역시 아데노조력 바이러스 혈청형 2이며, 적절한 바이러스벡터를 선택하여 적용할 수 있다.

기타 바이러스벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 벡시니아 바이러스[5], 렌티바이러스[6], 허페스 심플렉스 바이러스[7]로부터 유래된 벡터들도 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

한편, 상기 본 발명에 따른 유전자는, 리포좀, 나노미립자 전달체, 마이크로인젝션법, 또는 전기투과법 등을 이용하여 전달할 수도 있다.

이중 리포좀은 예를 들어, 구체적으로 리포좀, 나노리포좀, 프로테오리포좀, 세라마이드-함유 나노리포좀을 사용할 수 있으며, 리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 세포 내로 운반한 예는 참고문헌[8]을 참조할 수 있으며, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에는 리포펙타민 등의 시약이 많이 사용된다. 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포 내로 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 운반한다.

상기 유전자 전달 시스템을 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 본 발명에서 유전자 전달 시스템이 바이러스벡터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시될 수 있다. 본 발명에서 유전자 전달 시스템은 네이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라즈미드인 경우에는, 마이크로인젝션법[9], 칼슘 포스페이트 침전법[10], 전기투과법[11], 리포좀-매개 형질감염법[12], DEAE-덱스트란 처리법[13] 등에 의해 유전자를 세포 내로 이입시킬 수 있고, 이외에도 나노미립자, 칼슘 인-실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머 등의 방법 중 하나를 선택하여 적용할 수 있다.

본 발명은 또한 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 필요로 하는 인간을 제외한 동물 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 아데노조력 바이러스(adenoassociated virus, AAV)를 필요로 하는 인간을 제외한 동물 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 투여는 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 화학적 방법, 물리적 방법, 리포좀을 이용한 접합방법 및 바이러스를 이용한 방법으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 방법에 의하여 세포내로 도입시킬 수 있으며, 이에 대하여는 상술한 바와 같다.

본 발명에서, 용어 “인간을 제외한 동물”은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 신경질환을 가진 인간만을 제외한 돼지, 소, 말, 양, 염소, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여함으로써, 신경질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 참고문헌[14]에 기재되어 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여되는데, 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 개선에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학 조성물은 척수 내 투여, 뇌 내 투여 또는 정맥투여가 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 치료방법은 비록 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 치료방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 신경질환을 가지는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용되어 질 수 있다.

본 발명에서 "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 신경질환을 갖는 개체에 적용한 결과로서 신경질환의 완치는 물론 신경질환에 따른 제증상의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 신경질환을 갖는 개체에 적용하여 인지장애, 행동장애, 뇌신경 파괴 등의 증세 내지 현상을 억제 또는 차단함으로써, 신경질환에 따른 제증상이 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

그러나 치료효과를 위해서, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어 상기 치료제는 혈관주사, 피하지방, 근육주사 및 미세주사기를 이용한 뇌실 또는 척수에 직접주사를 포함한다. 이때 multiple injection 및 반복 투여가 가능하다. 혈관주사의 경우, 유효 용량은 체중 1 kg당 벡터의 경우에는 0.05 내지 15 mg/kg, 재조합 바이러스의 경우에는 1 × 10⁷ 내지 1 × 10¹¹ 바이러스 입자(1 × 10⁵ 내지 1 × 10⁹ IU)/kg, 세포의 경우에는 1 × 10³ 내지 1 × 10⁶ 세포/kg이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 mg/kg, 재조합 바이러스의 경우에는 1 × 10⁸ 내지 1 × 10¹⁰ 입자(1 × 10⁶ 내지 1 × 10⁸ IU)/kg, 세포의 경우에는 1 × 10² 내지 1 × 10⁵ 세포/kg이며, 일주일에 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다. 기타 피하지방, 근육주사, 환부 직접 투여에 대한 유효 용량은 10cm 의 간격으로 1 × 10⁷ 내지 1 × 10⁹의 재조합바이러스 입자가 투여되며, 일주일에 2 ~ 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 1 × 10⁵ 내지 1 × 10¹⁵PFU/mL의 제조합 아데노조력 바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 10¹⁰PFU를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법과 함께 이용될 수 있고, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우 보다 효과적인 치료가 가능할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학요법제는 AChE 저해제, 글루타민산 저해제, 아리셉트(aricept), 엑셀론(exelon), 나멘다(namenda), 라다자인(radazyne), 레보도파(levodapa), 릴루졸(riluzole) 등을 포함한다.

< 참고문헌 >

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[2] Wu, Z., et al., 2007, Mol Ther.; Sabatino, D. E., et al.,2007, Mol Ther 15: 1677-1685; Wiwanitkit, V.,2007, Hum Gene Ther 18: 89-92

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이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예 등을 들어 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 권리범위가 아래의 실시예들에 의해 한정되는 것을 의미하는 것은 아니다.

< 실험방법 >

1. AAV-DX2 의 준비

AAV-MCS 벡터 (KRcroGen 제공, type2)를 EcoRI/XhoI 사이트를 이용하여 DX2 발현 벡터 (pcDNA3.0)를 EcoRI/XhoI 으로 잘라 넣었다.

2. ALS 마우스 실험

(1) DX2 마우스 / SOD 마우스

사이토졸 Cu/Zn 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 93번째 코돈 글라이신이 알라닌 염기쌍으로 치환된 hSOD1G93A 형질전환 마우스(B6SJL-Tg (SOD1*G93A)1Gur/J)를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였다. 모든 실험동물은 Institute of Laboratory Animals Resources (SNU-110517-3, Seoul National University, Korea)에 따라 수행하였다. AIMP-DX2 형질전환 마우스(서울대학교 김성훈 박사 랩 제공)를 상기 SOD 마우스와 교배(cross mated)하였다. SOD1 TG 및 DX2 TG간 총 수명 및 다른 증상의 발현여부를 비교하기 위해 F1 마우스를 사용하였다.

(2) SOD 마우스에 AAV-DX2를 주사

AAV-DX2 및 GFP를 척수에 주사하였다. 구체적인 실험과정은 다음과 같다.

Tg 마우스를 랜덤하게 AAV-GFP가 주사된 대조군, AAV-DX2가 주사된 그룹, 2개의 그룹으로 나누었다. 13주령 마우스에 아버틴(avertin)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 마우스의 배면 피부를 수직절개(cm)하고, 그 후 페디클을 가위로 스티핑하여 T2에서 L3까지 후궁절제술(laminectomy)을 실시하여 라미나를 제거하였다. 1 μL의 AAV 혼합물(바이러스를 함유하는 것)을 노출된 척수로 분당 0.5 μL의 속도로 5회 주사하였다(해밀턴 주사기(5 μL Model 75 RN SYR)에 31 게이지 니들을 꽂았으며, 울트라-마이크로4 펌프 및 스테레오탁식 기구(World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)와 연결시킨 형태의 주사를 이용함). 주사는 600-900 μm로 하되, 역류 방지를 위해 주사 전 후 니들을 표적부위에 1분간 고정시켰다.

3. 행동 테스트

AAV를 마우스에 주사한 후, 14주령 마우스를 로타로드 트레드밀 (7650 Accelerating model, Ugo Basile Biological Research Apparatus, Comerio, Italy)로 1주일 동안 트레이닝하였고, 운동 배위 능력을 모니터링하는 행동테스트를 수행하였고, 마우스가 10 rpm으로의 회전에 견딜 수 있는 시간을 매일 측정하였다. 각 실험의 대표값은 3회의 실험 기록을 이용하여 계산하였다(마우스의 무게를 재고, 매일 실험하였으며, 각 마우스는 매 행동테스트를 3회 수행하였다.)

4. PD 마우스 실험

PD 마우스에 정위(stereotaxic)로 AAV-DX2를 주사하였다. 보다 상세한 실험과정은 다음과 같다. 마우스를 케타민:롬푼(3:1) 혼합물로 마취하고 두개골 천공을 위해 정위 프레임에 위치시켰다. 천공 과정 동안, 아래 피질이 과열되는 것을 막기 위해 머리를 생리식염수로 계속 관주하였다. 총 70마리의 마우스에 3 μl(200,000 cells/3 μl)의 AAV-DX2를 좌반구 선조체(striatum)에 다음 좌표: 브레그마(Bregma)로부터 AP +0.5 mm, ML ±1.7 mm 및 DV -3.2 mm에 주사하였다. 침착물을 인퓨전 펌프로 0.5 μl/min로 주었다. 주사를 완료한 후 5분 동안 니들을 남겨두었다가 천천히 제거하였다.

5. 로타로드 실험(Rotarod test)

로타로드 실험은 동물의 사지운동 협응기능과 균형감각(운동기능) 평가실험으로서, 다음과 같은 과정에 따라 실험을 수행하였다.

처리군 마우스가 운동 장애를 보이는지 여부를 관찰하기 위하여, 가혹 로타로드 실험(accelerating rotarod test)을 수행하였다. 동물을 초기 속도가 4 rpm인 롤링 로드에 위치시켰다. 한 시간 간격으로 2회의 시험을 하되 가혹 속도 수준(4 내지 40 rpm)의 조건에서 수행하였다. 로타로드에서 떨어진 평균시간을 기록하였다.

6. 폴 실험(Pole test)

Matsuura 방법을 살짝 변형시켜 사용하였다. 버티컬 우드 폴을 테이프로 감싸 거친 표면을 만들었다. 폴의 위쪽 상단에 동물 머리를 위치시켰다. 완전히 아래로 턴하는 시간(T/turn) 및 네 발이 모두 바닥에 도착하는 총 시간(T/floor)를 기록하였다. 만약 동물이 완전히 턴할 수 없다면, 바닥에 도착한 시간을 또한 T/turn에 반영하였다. 각 동물에 대해 5회 시험을 수행하였고, 평균 점수를 최종 폴 테스트 점수로 하였다.

7. 1차 신경세포의 분리

1차 신경세포를 Wistar 랫트의 18일째 되는 배아(E18) 또는 E19에서 분리하였다. 임신한 암컷 Wistar 랫트를 SLC(Shizuoka, Japan)에서 구입하였다. 대략 10 태아를 각 랫트로부터 얻어 전체 뇌를 태아로부터 분리하였다. 두 쌍의 미세 핀셋(fine tweezers)을 사용하여 피질 부를 실체현미경(stereoscopic microscope)으로 뇌로부터 절개하였다.

절개(dissection)후, 15-mL 코니컬 튜브에서 7-8 mL의 인산완충생리식염수(PBS, Wako)로 조심스럽게 3회 세척하였다. 세척 후 5 mL의 파파인 용액과 20-60 mL의 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I, 5 units/mL, Takara, Shiga, Japan)을 튜브내 피질에 첨가하고, 32℃에서 12분 동안 배양하였다. 70 mg의 파파인(0.5 units/g, Wako) 및 10 mg의 에틸렌디아민 테트라아세트산-2Na(Wako)를 PBS에 용해시켜 총 20 mL가 되도록 하여 파파인 용액을 제조하였다. 파파인 용액을 0.2-mm 필터(Sartorius, Gottingen, Germany)로 여과하고, 5 mL로 균등하게 나눈 후, -30℃에서 보관하였다. 파파인 용액을 사용 전 몇 시간 전에 4℃에서 천천히 해동시켰다.

효소로 배양 및 소화시킨 후, 피질을 글래스 파스퇴르 파이펫을 사용하여 12회 조심스럽게 피펫팅하고, 젖은 세포 스트레이너(wetted cell strainer, 40-mm mesh, BD Biosciences)를 사용하여 여과하고 50-mL 코티컬 튜브에 넣었다. 비특이적 신경세포 부착을 방지하기 위하여 20% FBS(Gibco) 및 1% N2 서플러먼트(1006, Invitrogen, Life Technologies)를 함유하는 10 mL의 MEM(Sigma)으로 세포 스트레이너를 미리 적셨다. 전체 피질 현탁액을 세포 트레이너를 통해 붓고, 10 mL의 20% FBS/N2/MEM를 상부에 부었으며, 여과지에 남은 신경세포를 수집하였다.

8. FACS를 이용한 세포 사멸 측정

EV, AIMP2 또는 DX2를 코딩하는 플라즈미드로 형질전환된 N2A를 FasL 또는 CHX/TNFα (30 ng/ml) 존재 또는 부존재 하에서 24 또는 12시간 동안 배양하고, 70% 에탄올로 4℃에서 1시간 동안 고정하고, 아이스-콜드 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 1 x 10⁶세포를 0.1% 소디움 시트레이트, 0.3% NP-40 (nonylphenoxylpolyethoxylethanol 40) 및 50 μg/ml RNaseA를 함유하는 프로피디움 아이오다이드(50 μg/ml)으로 40분간 염색하고, 유세포분석기(FACSCalibur, Becton-Dickinson)로 분석하였다. Sub-G1 세포를 카운팅하여 사멸된 세포를 측정하였다. 각 샘플에 대해 20,000 세포를 Cell Quest Pro 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

N2A 세포에 대해 SOD wt, 85, 93 에 대한 뮤턴트 유전자 (이들은 ALS 유발 시키는 것으로 알려진 대표적인 원인 유전자이자 이에 대한 돌연변이임)를 형질전환(transfection) 하였다. 한쪽 그룹에는 세포사멸을 촉진하는 것으로 알려진 AIMP2 유전자와 다른 한쪽 그룹에는 AIMP2 의 세포사멸 기능을 억제하는 것으로 알려진 DX2 유전자를 함께 넣었다. 이후 FasL (20 ng/ml)를 24시간 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 그 결과 wt 기준, AIMP2를 과발현 시켰을 때 평균 8%, 돌연변이 기준, 15% 정도의 세포 사멸 증가가 유의하게(p<0.01) 나타났으며, DX2를 과발현 시켰을 때는 원래 엠프티 벡터(empty vector, PcDNA3.0) 을 넣었을 때와 유사하게 (유의성 없는 정도) 세포사멸 수준이 회복되었다.

이러한 DX2 에 의한 N2A 세포사멸 억제는 FasL 외에 대표적인 염증성 세포사멸 유발인자인 TNF-alpha 처리에 대해서도 유사하게 확인되었다. 사이클로헥시미드(cycloheximide, CHX, 10 μg/ml, TNF-alpha의 세포사멸을 보기 위해 함께 처리하는 화합물) + TNF-alpha (mouse) : 30 ng/ml를 12시간 처리하였을 때, wt 기준 약 20% 뮤턴트 기준 40% 이상의 세포사멸이 유도된 것에 비해 DX2 가 과발현 되었을 때는 각각 5%, 10% 정도 세포사멸이 증가하는 정도로 세포사멸이 유의하게 억제되었다. (각각 EV 대조군에 비해 p<0.001). y 축은 FACS 실험에 의해 얻은 세포사멸 %

9. MTT 분석

N2A 또는 1차 신경세포의 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 웰 당 5 × 10⁴세포의 농도로 분주하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(MTT)를 스톡 용액(5 mg/mL, in PBS, pH 7.2)으로 우선 준비하고, 여과하였다. 그 후 15 μL의 MTT 용액을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 5% CO₂하에서 4시간 동안 배양한 후 185 μL의 사용화 용액/스톱을 각 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 ELISA를 위해 준비하고 620 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존도를 결정하고, 생존 세포의 퍼센티지를 미처리 세포에 대한 처리세포의 흡광도비로 계산하였다.

이러한 DX2 에 의한 N2A 세포사멸 억제는 1차 신경세포(primary neuron)에서도 공통적으로 확인되었다. AAV-GFP 또는 DX2를 인펙션(infection) 시킨 후 FasL와 CHX/TNF-alpha 를 처리하여 확인하였다. FasL의 경우, GFP 기준 약 4~5% 의 세포사멸 억제가 유의하게 관찰되었으며, TNF-alpha 의 경우도 약 5% 의 세포사멸 억제가 확인되었다. 이는 MTT 분석결과를 % of 대조군으로 역환산한 수치이다.

한편 1차 신경세포에서 파킨슨 병의 주원인으로 알려져 있는 산화적 스트레스를 유도하기 위해 과산화수소(100 μM, 36h)를 처리하였으며, 이후 MTT 기법으로 세포 사멸을 확인하였다. 8% 정도의 유의한 세포사멸억제효과가 관찰되었다.

<110> Cooperation Foundation Wonkwang University Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Pharmaceutical composition comprising AIMP2-DX2 for preventing or treating neuronal diseases and use thereof <130> p2015-205 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 756 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60 cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120 gctggccacg tgcaggatta cggggcgctg aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc 180 tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg 240 tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt 300 ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa gactatcagc tgggattcac tttaatttgg 360 aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc agcatccaga cgatgtgccc catcgaaggc 420 gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac 480 gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt 540 aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg aactctgctc ttgggaagag cccttggctc 600 gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga 660 ggctgcagtg tgacagtgcc agccaatgtg cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg 720 gctcctttta acacggccct caagctcctt aagtga 756 <210> 2 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly 20 25 30 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly 35 40 45 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu 50 55 60 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu 65 70 75 80 Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu 85 90 95 Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met 115 120 125 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 3 <211> 936 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60 cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120 gctggccacg tgcaggaaga gtctaacctg tctctgcaag ctcttgagtc ccgccaagat 180 gatattttaa aacgtctgta tgagttgaaa gctgcagttg atggcctctc caagatgatt 240 caaacaccag atgcagactt ggatgtaacc aacataatcc aagcggatga gcccacgact 300 ttaaccacca atgcgctgga cttgaattca gtgcttggga aggattacgg ggcgctgaaa 360 gacatcgtga tcaacgcaaa cccggcctcc cctcccctct ccctgcttgt gctgcacagg 420 ctgctctgtg agcacttcag ggtcctgtcc acggtgcaca cgcactcctc ggtcaagagc 480 gtgcctgaaa accttctcaa gtgctttgga gaacagaata aaaaacagcc ccgccaagac 540 tatcagctgg gattcacttt aatttggaag aatgtgccga agacgcagat gaaattcagc 600 atccagacga tgtgccccat cgaaggcgaa gggaacattg cacgtttctt gttctctctg 660 tttggccaga agcataatgc tgtcaacgca acccttatag atagctgggt agatattgcg 720 atttttcagt taaaagaggg aagcagtaaa gaaaaagccg ctgttttccg ctccatgaac 780 tctgctcttg ggaagagccc ttggctcgct gggaatgaac tcaccgtagc agacgtggtg 840 ctgtggtctg tactccagca gatcggaggc tgcagtgtga cagtgccagc caatgtgcag 900 aggtggatga ggtcttgtga aaacctggct cctttt 936 <210> 4 <211> 207 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaagagtcta acctgtctct gcaagctctt gagtcccgcc aagatgatat tttaaaacgt 60 ctgtatgagt tgaaagctgc agttgatggc ctctccaaga tgattcaaac accagatgca 120 gacttggatg taaccaacat aatccaagcg gatgagccca cgactttaac caccaatgcg 180 ctggacttga attcagtgct tgggaag 207

Claims

엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는, 알츠하이머 질환, 파킨슨 병, 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis), 경도인지장애, 다발-경색성 치매, 전두측두치매(frontotemporal dementia), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 헌팅톤 질환, 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 우울증, 간질, 다발성 경화증, 피질기저퇴행증(corticobasal degeneration), 다계통위축병(multiple system atrophy), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(dentatorubropallidoluysian atrophy), 척수소뇌실조병(spinocerebella ataxia), 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 척수근육위축병(spinal muscular atrophy) 및 뇌졸중(stroke)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터는, 세포사멸(apoptosis) 억제, 운동장애 개선 및 산화적 스트레스 억제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스벡터, 선형 DNA 및 플라즈미드 DNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,
상기 바이러스벡터는 아데노조력 바이러스(adenoassociated virus, AAV), 아데노 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 벡시니아 바이러스 및 허페스 심플렉스 바이러스 (Herpes Simplex Virus)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 바이러스벡터인 것을 특징으로 하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
엑손 2가 결여된 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 필요로 하는 인간을 제외한 동물 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 알츠하이머 질환, 파킨슨 병, 루게릭 병, 경도인지장애, 다발-경색성 치매, 전두측두치매, 루이소체 치매, 헌팅톤 질환, 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 우울증, 간질, 다발성 경화증, 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증, 척수소뇌실조병, 원발성 측삭 경화증, 척수근육위축병 및 뇌졸중으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법.