JP2023544141A - ＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列ならびにその組成物を使用した神経系疾患を処置する方法 - Google Patents

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Abstract

神経系疾患の処置を必要とする対象にＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列を含むベクターを投与することを含む、神経系疾患を処置する方法が、本明細書に開示されている。このベクターは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。ｍｉＲ－１４２の標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側であり得る。上記方法は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象の疾患発症を遅延させる方法を含み得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年９月３０日に出願された米国出願第６３／０８５，９５０号の出願日の利益を主張する。この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
本出願と共に出願されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：２４９３－０００４ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：２８ＫＢ；作成日２０２１年９月３０日）で電子的に提出された配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
神経系疾患の処置を必要とする対象にＡＩＭＰ２－ＤＸ２および必要に応じてｍｉＲ－１４２の標的配列を含むベクターを投与することを含む、神経系疾患を処置する方法が、本明細書に開示されている。
発明の背景技術
哺乳動物の脳は、神経幹細胞の分裂、分化、生存、死、およびシナプスの形成などの一連のプロセスを経た後、全身的なニューラルネットワークの構築により複雑な機能を発揮することができる。動物の脳内のニューロンは、成熟した状態の間でさえ、神経の成長に必要な広範囲の物質を連続的に産生し、それによって軸索および樹状突起の成長を誘導する。さらに、新たな学習および記憶が実行される度に、ニューラルネットワークおよびシナプス結合の絶え間のないシナプスリモデリングがあるため、継続的に分化すると言われ得る。ニューロンは、細胞分化およびシナプス形成のプロセスで神経成長因子などの標的由来生存因子を受け取ることができない場合にアポトーシスを受け、ストレスおよび細胞傷害剤によるアポトーシスは変性脳障害の主な原因となる。中枢神経系とは異なり、動物の末梢神経系が損傷されると、軸索は長期間を通して再生される。損傷を受けた神経より遠位の軸索は、ワーラー変性として公知なプロセスによって変性し、神経の細胞体は軸索再成長を再開し、シュワン細胞は、分化などを再度受ける前の分裂後の生存および消退による標的神経の決定などを含む再生プロセスを受けた後に再生される。
世界中で、高齢者人口の急速な増加に伴い、神経変性疾患の現れは毎年継続した増加傾向にある。決定的な予防および処置方法はまだ発見されていないため、そのような疾患の処置に顕著な有効性を有する薬物はまだない。さらに、これらの障害に使用される既存の薬物および療法は、長期投与から生じる副作用および毒性をしばしば呈する。さらに、それらは、疾患の完全な処置ではなく、一時的に症候の程度を低減させるか、または症候の進行を遅延させる効果しかないため、副作用および毒性を低減しながら、決定的な処置効果を有するマテリアルを探求および開発することが急務である。
１９９０年に初めて臨床試験が開始されてから、２００２年までに、ヒト対象に対する遺伝子治療に関する約６００例の臨床試験が実施され、進行中であった。２００３年のヒトゲノム配列解析の完了を受けて、多様な遺伝子を掘り下げることで、将来、新たな遺伝子治療の開発が加速するであろう。しかしながら、これまでに承認されている遺伝子治療の７５％は、癌または嚢胞性線維症などの単遺伝子疾患を標的としており、神経性障害または再生のための遺伝子治療薬の開発は盛んではない（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ ｏｆ ＮＩＨ，ＵＳＡ（２００２）；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．（２００２）ｗｗｗ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏ．ｕｋ／ｇｅｎｍｅｄ）。それでもなお、パーキンソン病の感覚ニューロンの処置および再生のためにＮＴ－３およびグリア由来神経因子（ＧＤＮＦ）などの神経成長因子を使用することによる遺伝子治療の開発が既に試みられている（ＧＤＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｌｉｇａｎｄｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｖｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｘｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：４４５３－４４５９（２００４））。神経系の障害に関連する脳の機能に関する神経科学研究全体の進歩は緩慢であるため、神経系の様々な慢性障害の処置薬物の開発も困難に直面している。
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、多因子アポトーシス遺伝子であるＡＩＭＰ２の代替的な拮抗的スプライシングバリアントである。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＡＩＭＰ２の機能を妨げることによって細胞アポトーシスを抑制することが公知である。ＡＩＭＰ２の競合的阻害剤として作用するＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＴＲＡＦ２のユビキチン化／分解の阻害によりＴＮＦ－α媒介性アポトーシスを抑制する。さらに、既に肺癌誘導因子としてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が確認されていることが報告されており、既存の研究では、癌細胞に広く現れるＡＩＭＰ２－ＤＸ２がＡＩＭＰ２の癌抑制機能を妨害することによって癌を誘導することが確認された。さらに、正常細胞におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２の現れは、細胞の癌化を進行させるのに対して、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２の現れの抑制は、癌の成長を抑制し、それによって処置効果を発揮することを発見した。
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、神経系疾患の処置に有用であり得ることも明らかにされている（ＫＲ１０－２０１５－０１４０７２３（２０１７）およびＵＳ２０１９／０２９８８５８（公開２０１９年１０月２３日）。
米国特許出願公開２０１９／０２９８８５８号明細書 韓国公開特許第１０－２０１５－０１４０７２３号公報
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ ｏｆ ＮＩＨ，ＵＳＡ（２００２） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．（２００２）ｗｗｗ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏ．ｕｋ／ｇｅｎｍｅｄ ＧＤＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｌｉｇａｎｄｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｖｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｘｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：４４５３－４４５９（２００４）
発明の要旨
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象の疾患発症を遅延させる方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象の神経系細胞死を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
筋萎縮症の処置を必要とする対象において筋萎縮症を処置する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、対象は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する。いくつかの実施形態では、対象は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する。
パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象の生存率を向上または生存期間を延長する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象における行動欠陥を予防する、運動症候を回復させる、および／または神経系損傷を軽減する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象におけるアミロイドβオリゴマー（Ａβ－Ｏ）誘導性神経系細胞死またはＡβ－Ｏ誘導性ｐ５３発現を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する対象における神経筋接合部（ＮＭＪ）損傷を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書で開示されている。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象における神経筋接合部（ＮＭＪ）損傷の阻害、ＮＭＪブロック誘導性呼吸不全、呼吸困難の阻害、ＮＭＪブロック誘導性筋単収縮または線維束性攣縮の阻害の方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象におけるアノイキスを抑制する、および／またはラミニン受容体安定化を増大させる方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
組換えベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列をさらに含み得る。
ベクターは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターまたはオプシンプロモーターである。
ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側であり得る。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。
ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５のうちの１～１７個の追加の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列はＡＣＴＴＴＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７のうちの１～１５個の追加の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
ｍｉＲ－１４２標的配列は、本明細書に開示されているベクターにおいて２～１０回繰り返され得る。
ベクターはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、トリ肉腫／白血病（ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、単純ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスのベクターであり得る。
図面の簡単な説明
図１は、例示的な組換えベクターを示す。
図２は、インビトロ環境下での組換えベクターの神経細胞特異的発現効果を示す。
図３は、パーキンソン病モデルにおけるｓｃＡＡＶ－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐＴの実質内（黒質）注射後の脳特異的発現を示す。
図４は、ｍｉＲ１４２－３ｐＴの４回繰返し（下線）を有するｍｉＲ１４２－３ｐＴ（標的）配列（配列番号６）を示す。
図５Ａは、１×、２×、および３×繰返しならびに変異配列を有するｍｉＲ１４２－３ｐＴの概略図を示す。図５Ｂは、ｍｉＲ－１４２－３ｐＴの１×、２×、および３×繰返しによる、ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害を示す。
図６は、コア結合配列がＤＸ２阻害において重要であることを示す。ＤＸ２の有意な阻害を示したＴｓｅｑ ｘ３繰返し（図５Ｂ）を有するベクターおよびＤＸ２構築物を対照として使用した。１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐ処置は、Ｔｓｅｑ ｘ３ベクターを有意に阻害したが、ＤＸ２および変異配列は阻害されなかった。
図７は、ｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐの髄腔内注射後に、ＡＬＳモデルの脊髄から抽出された全ＲＮＡを示す。ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。
図８は、インビトロ環境下での本発明の発現ベクターの神経細胞特異的発現効果を示す。
ＤＸ２トランスジェニックマウスは、ロテノンで処置されたマウスにおける運動症候をリカバーする。図９Ａは、示されたマウスの脳を用いて、ＴＨの発現を分析した。黒い点線の四角はＴＦ染色された領域を示す。図９Ｂは、ロータロッド分析である。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２トランスジェニック（ＴＧ）マウスにおける落下までのレイテンシー。図９Ｃは、ポール試験である。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２ ＴＧマウスにおける垂直運動（左パネル）およびＴターン時間（右パネル）。動物；ｎ＝６（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定。図９Ｄおよび図９Ｅでは、ＤＸ２は、ロテノン誘導性ＰＤマウスモデルにおいて神経系損傷および行動を改善する。図９Ｄは、ポール試験である。ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２は、ロテノンで処置されたＰＤマウスモデルにおいて運動協調性およびバランスをリカバーした。「Ｃｏｎ」および「ＧＦＰ」は、野生型およびロテノンで処置されたＧＦＰ注射マウスを示す。「用量１」および「用量２」は、ロテノンで処置されたマウスにおけるＤＸ２の異なる注射用量を表す。図９Ｅは、マウス黒質の免疫組織化学および免疫蛍光画像である。上のパネルは、線条体におけるＴＨ陽性細胞を示し、下のパネルは、注射されたＧＦＰを発現するウイルスの分布を示す。黒い点線の四角はＴＨの染色された領域を示す。動物；ｎ＝５（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定。 ＤＸ２トランスジェニックマウスは、ロテノンで処置されたマウスにおける運動症候をリカバーする。図９Ａは、示されたマウスの脳を用いて、ＴＨの発現を分析した。黒い点線の四角はＴＦ染色された領域を示す。図９Ｂは、ロータロッド分析である。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２トランスジェニック（ＴＧ）マウスにおける落下までのレイテンシー。図９Ｃは、ポール試験である。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２ ＴＧマウスにおける垂直運動（左パネル）およびＴターン時間（右パネル）。動物；ｎ＝６（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定。図９Ｄおよび図９Ｅでは、ＤＸ２は、ロテノン誘導性ＰＤマウスモデルにおいて神経系損傷および行動を改善する。図９Ｄは、ポール試験である。ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２は、ロテノンで処置されたＰＤマウスモデルにおいて運動協調性およびバランスをリカバーした。「Ｃｏｎ」および「ＧＦＰ」は、野生型およびロテノンで処置されたＧＦＰ注射マウスを示す。「用量１」および「用量２」は、ロテノンで処置されたマウスにおけるＤＸ２の異なる注射用量を表す。図９Ｅは、マウス黒質の免疫組織化学および免疫蛍光画像である。上のパネルは、線条体におけるＴＨ陽性細胞を示し、下のパネルは、注射されたＧＦＰを発現するウイルスの分布を示す。黒い点線の四角はＴＨの染色された領域を示す。動物；ｎ＝５（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定。 ＤＸ２トランスジェニックマウスは、ロテノンで処置されたマウスにおける運動症候をリカバーする。図９Ａは、示されたマウスの脳を用いて、ＴＨの発現を分析した。黒い点線の四角はＴＦ染色された領域を示す。図９Ｂは、ロータロッド分析である。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２トランスジェニック（ＴＧ）マウスにおける落下までのレイテンシー。図９Ｃは、ポール試験である。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２ ＴＧマウスにおける垂直運動（左パネル）およびＴターン時間（右パネル）。動物；ｎ＝６（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定。図９Ｄおよび図９Ｅでは、ＤＸ２は、ロテノン誘導性ＰＤマウスモデルにおいて神経系損傷および行動を改善する。図９Ｄは、ポール試験である。ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２は、ロテノンで処置されたＰＤマウスモデルにおいて運動協調性およびバランスをリカバーした。「Ｃｏｎ」および「ＧＦＰ」は、野生型およびロテノンで処置されたＧＦＰ注射マウスを示す。「用量１」および「用量２」は、ロテノンで処置されたマウスにおけるＤＸ２の異なる注射用量を表す。図９Ｅは、マウス黒質の免疫組織化学および免疫蛍光画像である。上のパネルは、線条体におけるＴＨ陽性細胞を示し、下のパネルは、注射されたＧＦＰを発現するウイルスの分布を示す。黒い点線の四角はＴＨの染色された領域を示す。動物；ｎ＝５（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定。
ＤＸ２は、６－ＯＨＤＡ誘導性ＰＤモデルにおける行動欠損を予防する。図１０Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、生理食塩水またはビヒクル（ＧＦＰ）の場合と比較して低レベルの対側回転を示し、ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンの損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｂは、ＤＸ２で処置されたマウスが、対側の前足接触の増加を示し、ＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンにおける片側損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｃでは、ＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスは、右に偏った体のスイングをあまり示さなかった。動物；生理食塩水（生理食塩水で処置された野生型マウス）ｎ＝４、ＧＦＰ（ＧＦＰを注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝５、ＤＸ２（ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝１１（各マウス）、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２低１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、ｎｓ；非有意、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｄは、ＧＦＰおよびＤＸ２を注射されたマウス脳の免疫蛍光画像である。白い四角のボックスはＴＨ陽性ドーパミン作動性神経系細胞を示し、白い矢印は示されたウイルス注射部位を示す。図１０Ｅは、各マウス群における生存率である。動物；ｎ＝１５、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）は生理食塩水で処置された野生型マウスを示す。Ｌ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２は、６－ＯＨＤＡで処置されたマウスにおけるＬ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２の注射を表す。ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ（ＧＦＰ）４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（低）１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（高）４×１０９ｖｇ。図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ナイーブ、６－ＯＨＤＡおよびＤＸ２で処置されたマウスのＤＸ２およびＢａｘのｍＲＮＡ発現である。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｈは、ＡＡＶ－ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡマウスモデルにおいて、ＤＸ２を発現する細胞を同定するためのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションである。 ＤＸ２は、６－ＯＨＤＡ誘導性ＰＤモデルにおける行動欠損を予防する。図１０Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、生理食塩水またはビヒクル（ＧＦＰ）の場合と比較して低レベルの対側回転を示し、ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンの損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｂは、ＤＸ２で処置されたマウスが、対側の前足接触の増加を示し、ＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンにおける片側損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｃでは、ＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスは、右に偏った体のスイングをあまり示さなかった。動物；生理食塩水（生理食塩水で処置された野生型マウス）ｎ＝４、ＧＦＰ（ＧＦＰを注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝５、ＤＸ２（ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝１１（各マウス）、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２低１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、ｎｓ；非有意、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｄは、ＧＦＰおよびＤＸ２を注射されたマウス脳の免疫蛍光画像である。白い四角のボックスはＴＨ陽性ドーパミン作動性神経系細胞を示し、白い矢印は示されたウイルス注射部位を示す。図１０Ｅは、各マウス群における生存率である。動物；ｎ＝１５、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）は生理食塩水で処置された野生型マウスを示す。Ｌ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２は、６－ＯＨＤＡで処置されたマウスにおけるＬ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２の注射を表す。ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ（ＧＦＰ）４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（低）１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（高）４×１０９ｖｇ。図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ナイーブ、６－ＯＨＤＡおよびＤＸ２で処置されたマウスのＤＸ２およびＢａｘのｍＲＮＡ発現である。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｈは、ＡＡＶ－ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡマウスモデルにおいて、ＤＸ２を発現する細胞を同定するためのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションである。 ＤＸ２は、６－ＯＨＤＡ誘導性ＰＤモデルにおける行動欠損を予防する。図１０Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、生理食塩水またはビヒクル（ＧＦＰ）の場合と比較して低レベルの対側回転を示し、ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンの損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｂは、ＤＸ２で処置されたマウスが、対側の前足接触の増加を示し、ＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンにおける片側損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｃでは、ＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスは、右に偏った体のスイングをあまり示さなかった。動物；生理食塩水（生理食塩水で処置された野生型マウス）ｎ＝４、ＧＦＰ（ＧＦＰを注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝５、ＤＸ２（ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝１１（各マウス）、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２低１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、ｎｓ；非有意、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｄは、ＧＦＰおよびＤＸ２を注射されたマウス脳の免疫蛍光画像である。白い四角のボックスはＴＨ陽性ドーパミン作動性神経系細胞を示し、白い矢印は示されたウイルス注射部位を示す。図１０Ｅは、各マウス群における生存率である。動物；ｎ＝１５、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）は生理食塩水で処置された野生型マウスを示す。Ｌ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２は、６－ＯＨＤＡで処置されたマウスにおけるＬ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２の注射を表す。ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ（ＧＦＰ）４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（低）１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（高）４×１０９ｖｇ。図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ナイーブ、６－ＯＨＤＡおよびＤＸ２で処置されたマウスのＤＸ２およびＢａｘのｍＲＮＡ発現である。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｈは、ＡＡＶ－ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡマウスモデルにおいて、ＤＸ２を発現する細胞を同定するためのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションである。 ＤＸ２は、６－ＯＨＤＡ誘導性ＰＤモデルにおける行動欠損を予防する。図１０Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、生理食塩水またはビヒクル（ＧＦＰ）の場合と比較して低レベルの対側回転を示し、ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンの損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｂは、ＤＸ２で処置されたマウスが、対側の前足接触の増加を示し、ＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンにおける片側損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｃでは、ＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスは、右に偏った体のスイングをあまり示さなかった。動物；生理食塩水（生理食塩水で処置された野生型マウス）ｎ＝４、ＧＦＰ（ＧＦＰを注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝５、ＤＸ２（ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝１１（各マウス）、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２低１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、ｎｓ；非有意、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｄは、ＧＦＰおよびＤＸ２を注射されたマウス脳の免疫蛍光画像である。白い四角のボックスはＴＨ陽性ドーパミン作動性神経系細胞を示し、白い矢印は示されたウイルス注射部位を示す。図１０Ｅは、各マウス群における生存率である。動物；ｎ＝１５、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）は生理食塩水で処置された野生型マウスを示す。Ｌ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２は、６－ＯＨＤＡで処置されたマウスにおけるＬ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２の注射を表す。ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ（ＧＦＰ）４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（低）１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（高）４×１０９ｖｇ。図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ナイーブ、６－ＯＨＤＡおよびＤＸ２で処置されたマウスのＤＸ２およびＢａｘのｍＲＮＡ発現である。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｈは、ＡＡＶ－ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡマウスモデルにおいて、ＤＸ２を発現する細胞を同定するためのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションである。
ＤＸ２は、ＭＰＴＰ誘導性ＰＤモデルにおける運動症候を回復させる。図１１Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、ビヒクル（ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ、ＧＦＰ）の場合と比較して、ロータロッド試験においてわずかに長い落下までのレイテンシーを示し、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンに対する損傷を減弱させたことを示す。図１１Ｂでは、ＤＸ２で処置されたマウスは、ＳＨＩＲＰＡ試験に基づくと、改善された自発運動活性を示した。図１１Ｃでは、ＤＸ２で処置されたマウスは、比較的低いレベルの四肢欠損を示した。図１１Ｄでは、ＤＸ２過剰発現マウスは、ビヒクル対照（ＧＦＰ）と比較した場合、グルーミング率の改善を示した。図１１Ｅは、マウス黒質におけるＴＨ陽性細胞の免疫蛍光画像である。白い四角のボックスはＴＨの発現領域を示す。図１１Ｆおよび図１１Ｇは、示されたマウス脳のＤＸ２（図１１Ｆ）およびＢａｘ（図１１Ｇ）のｍＲＮＡ発現である。ナイーブ、ＧＦＰ、およびＤＸ２は、生理食塩水で処置された野生型マウス、ＧＦＰを注射されたＭＰＴＰ処置マウス、およびＤＸ２を注射されたＭＰＴＰ処置マウスを示す。動物；ナイーブｎ＝６、ＧＦＰ ｎ＝９、ＤＸ２ ｎ＝１２、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｔ検定。 ＤＸ２は、ＭＰＴＰ誘導性ＰＤモデルにおける運動症候を回復させる。図１１Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、ビヒクル（ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ、ＧＦＰ）の場合と比較して、ロータロッド試験においてわずかに長い落下までのレイテンシーを示し、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンに対する損傷を減弱させたことを示す。図１１Ｂでは、ＤＸ２で処置されたマウスは、ＳＨＩＲＰＡ試験に基づくと、改善された自発運動活性を示した。図１１Ｃでは、ＤＸ２で処置されたマウスは、比較的低いレベルの四肢欠損を示した。図１１Ｄでは、ＤＸ２過剰発現マウスは、ビヒクル対照（ＧＦＰ）と比較した場合、グルーミング率の改善を示した。図１１Ｅは、マウス黒質におけるＴＨ陽性細胞の免疫蛍光画像である。白い四角のボックスはＴＨの発現領域を示す。図１１Ｆおよび図１１Ｇは、示されたマウス脳のＤＸ２（図１１Ｆ）およびＢａｘ（図１１Ｇ）のｍＲＮＡ発現である。ナイーブ、ＧＦＰ、およびＤＸ２は、生理食塩水で処置された野生型マウス、ＧＦＰを注射されたＭＰＴＰ処置マウス、およびＤＸ２を注射されたＭＰＴＰ処置マウスを示す。動物；ナイーブｎ＝６、ＧＦＰ ｎ＝９、ＤＸ２ ｎ＝１２、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｔ検定。
図１２Ａおよび図１２Ｂでは、ＤＸ２の投与は、ルーゲーリック（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ）病モデルにおいて、疾患発症を遅延させ（図１２Ａ）、生存期間を延長する（図１２Ｂ）。動物；ｎ＝５。
図１３は、明視野顕微鏡法における細胞形態を表す。ＡＡＶ－ＤＸ２に感染した細胞におけるＤＸ２の過剰発現は、Ａβ－Ｏ媒介性細胞死を阻害する。ＤＸ２は、Ａβ－Ｏで処置された細胞の細胞生存率を増加させる。ＳＫ－ＳＹ５Ｙ細胞を、２５μＭのＡβ－Ｏの非存在下または存在下で、ＡＡＶ－ＤＸ２またはＡＡＶ－ＧＦＰと共にインキュベートし、４８時間後、細胞死を顕微鏡法によって観察した。元の倍率画像のＸ４０（上パネル）、Ｘ１００（下パネル）。
図１４は、図１３の細胞死の定量化を示す。白いボックスは細胞死のパーセンテージを示し、黒いボックスは細胞生存率のパーセンテージを示す。
図１５は、ｐ５３の発現レベルを示す。ＤＸ２の発現は、ニューロトキシン誘導性ｐ５３発現において重要な役割を果たす。＊ＡＡＶ－ＤＸ２（＃１）およびＡＡＶ－ＤＸ２（＃２）は、異なるバッチで産生されたＡＡＶ－ＤＸ２ウイルスを示す。
変異型ＳＯＤ１は、ＫＡＲＳ１と選択的に相互作用する。図１６Ａでは、Ｂ４２－ＳＯＤ１ ＷＴならびに変異体Ｇ８５ＲおよびＧ９３Ａに対するＬｅｘ－ＫＡＲＳ１の結合親和性を、酵母ツーハイブリッドアッセイによって試験した。図１６Ｂでは、ＨＡ－ＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ８５Ｒ、およびＧ９３ＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ＨＡ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った。ＫＡＲＳ１およびＳＯＤ１のレベルを免疫ブロット法によって決定した。図１６Ｃは、酵母ツーハイブリッドアッセイによって決定された、ＳＯＤ１変異体に対するＫＡＲＳ１断片の結合親和性である。図１６Ｄでは、Ｎ２Ａ細胞を、ｍｙｃ－ＫＡＲＳ１およびＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ９３Ａ、Ｇ８５ＲＡでトランスフェクトした。ｍｙｃ－ＫＡＲＳ１のＩＰを行い、ＡＩＭＰ２および６７ＬＲ（ラミニン受容体）の検出のために免疫ブロットした。 変異型ＳＯＤ１は、ＫＡＲＳ１と選択的に相互作用する。図１６Ａでは、Ｂ４２－ＳＯＤ１ ＷＴならびに変異体Ｇ８５ＲおよびＧ９３Ａに対するＬｅｘ－ＫＡＲＳ１の結合親和性を、酵母ツーハイブリッドアッセイによって試験した。図１６Ｂでは、ＨＡ－ＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ８５Ｒ、およびＧ９３ＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ＨＡ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った。ＫＡＲＳ１およびＳＯＤ１のレベルを免疫ブロット法によって決定した。図１６Ｃは、酵母ツーハイブリッドアッセイによって決定された、ＳＯＤ１変異体に対するＫＡＲＳ１断片の結合親和性である。図１６Ｄでは、Ｎ２Ａ細胞を、ｍｙｃ－ＫＡＲＳ１およびＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ９３Ａ、Ｇ８５ＲＡでトランスフェクトした。ｍｙｃ－ＫＡＲＳ１のＩＰを行い、ＡＩＭＰ２および６７ＬＲ（ラミニン受容体）の検出のために免疫ブロットした。
変異型ＳＯＤ１は、アノイキスを誘導する６７ラミニン受容体を減少させた。図１７Ａでは、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞を、ＳＯＤ１ ＷＴおよびＧ９３Ａでトランスフェクトした。細胞を収集し、６７ラミニン受容体（ＬＲ）のために免疫ブロットした。図１７Ｂでは、神経性細胞をＳＯＤ１ ＷＴおよびＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、２２×２２カバースリップに播種した。細胞を固定し、次いで、ＫＡＲＳ１または６７ＬＲ抗体で処置し、次いで、画像を共焦点顕微鏡法によって取得した。白い矢印は染色されたラミニン受容体を示す。図１７Ｃでは、遊走に対するＷＴおよびＧ９３ＡのＳＯＤ１トランスフェクションの効果を見るために、神経性細胞を上部チャンバにロードし、ＷＴおよびＧ９３Ａを８．０μｍの孔径を有する膜によって分離されたトランスウェルプレートの下部チャンバにロードした。膜を切除し、染色した。図１７Ｄでは、神経性細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、ラミニン１（ＬＮ１）で０、１５、３０および６０分間処置した。ｐＥＲＫおよびＥＲＫのレベルをウエスタンブロットによってチェックした。図１７Ｅでは、ＷＴおよび変異型ＳＯＤ１を発現する細胞における、６７ＬＲに対するＫＡＲＳ１の結合親和性を免疫沈降によって決定した。図１７Ｆでは、ＫＡＲＳ１で２４時間、次いでＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ８５Ｒ、およびＧ９３Ａで２４時間トランスフェクトしたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を播種した。次いで、それらをｈｅｍａコーティングに播種し、次いで、ＴＮＦ－αおよびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で６時間処置した。ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を観察した。 変異型ＳＯＤ１は、アノイキスを誘導する６７ラミニン受容体を減少させた。図１７Ａでは、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞を、ＳＯＤ１ ＷＴおよびＧ９３Ａでトランスフェクトした。細胞を収集し、６７ラミニン受容体（ＬＲ）のために免疫ブロットした。図１７Ｂでは、神経性細胞をＳＯＤ１ ＷＴおよびＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、２２×２２カバースリップに播種した。細胞を固定し、次いで、ＫＡＲＳ１または６７ＬＲ抗体で処置し、次いで、画像を共焦点顕微鏡法によって取得した。白い矢印は染色されたラミニン受容体を示す。図１７Ｃでは、遊走に対するＷＴおよびＧ９３ＡのＳＯＤ１トランスフェクションの効果を見るために、神経性細胞を上部チャンバにロードし、ＷＴおよびＧ９３Ａを８．０μｍの孔径を有する膜によって分離されたトランスウェルプレートの下部チャンバにロードした。膜を切除し、染色した。図１７Ｄでは、神経性細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、ラミニン１（ＬＮ１）で０、１５、３０および６０分間処置した。ｐＥＲＫおよびＥＲＫのレベルをウエスタンブロットによってチェックした。図１７Ｅでは、ＷＴおよび変異型ＳＯＤ１を発現する細胞における、６７ＬＲに対するＫＡＲＳ１の結合親和性を免疫沈降によって決定した。図１７Ｆでは、ＫＡＲＳ１で２４時間、次いでＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ８５Ｒ、およびＧ９３Ａで２４時間トランスフェクトしたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を播種した。次いで、それらをｈｅｍａコーティングに播種し、次いで、ＴＮＦ－αおよびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で６時間処置した。ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を観察した。
ＫＡＲＳ１および６７ＬＲに対するＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子の効果。図１８Ａでは、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、ＤＸ２またはＡＩＭＰ２と共にＫＡＲＳ１で処置した。細胞を収集し、ウエスタンブロットを行った。図１８Ｂでは、神経芽細胞腫の細胞をｓｔｒｅｐ－ＤＸ２で２４時間、次いでＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ９３ＡおよびＧ８５Ｒで２４時間トランスフェクトした。細胞を収集し、細胞成分分画を行い、試料を免疫ブロットした。図１８Ｃでは、神経性細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、それらをＡＡＶ－ＥＶまたはＡＡＶ－ＤＸ２で処置した。そして、細胞をラミニン１（ＬＮ１）で０、１５、３０および６０分間処置した。細胞を溶解し、次いで、ｐ－ＥＲＫおよびＥＲＫのレベルのために免疫ブロットした。図１８Ｄでは、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、ＴＮＦ－α（３０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処置した。細胞の付着を、ｉＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅによって測定した。 ＫＡＲＳ１および６７ＬＲに対するＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子の効果。図１８Ａでは、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、ＤＸ２またはＡＩＭＰ２と共にＫＡＲＳ１で処置した。細胞を収集し、ウエスタンブロットを行った。図１８Ｂでは、神経芽細胞腫の細胞をｓｔｒｅｐ－ＤＸ２で２４時間、次いでＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ９３ＡおよびＧ８５Ｒで２４時間トランスフェクトした。細胞を収集し、細胞成分分画を行い、試料を免疫ブロットした。図１８Ｃでは、神経性細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、それらをＡＡＶ－ＥＶまたはＡＡＶ－ＤＸ２で処置した。そして、細胞をラミニン１（ＬＮ１）で０、１５、３０および６０分間処置した。細胞を溶解し、次いで、ｐ－ＥＲＫおよびＥＲＫのレベルのために免疫ブロットした。図１８Ｄでは、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＳＯＤ１ ＷＴまたはＧ９３Ａでトランスフェクトし、次いで、ＴＮＦ－α（３０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処置した。細胞の付着を、ｉＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅによって測定した。
ＤＸ２レスキュー変異型ＳＯＤ１の投与は神経系死を誘導した。図１９Ａでは、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＳＯＤ１ ＷＴ、Ｇ８５ＲおよびＧ９３Ａでトランスフェクトし、ＴＮＦ－αおよびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で６時間、続いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）対照ベクター（ＧＦＰ）またはＤＸ２で処置した。細胞生存率をＭＴＴアッセイによってチェックした。図１９Ｂでは、初代神経系細胞を各マウスで単離し、２４ウェルプレートに播種し、ＡＡＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ－ＤＸ２で処置し、ＭＴＴアッセイを行い、それらの生存率をチェックした。
図２０Ａは、結合アッセイにより、ＤＸ２がＡＩＭＰ２よりも強くＰＡＲＰ－１に結合することを示す。図２０Ｂでは、ＡＩＭＰ２でトランスフェクトされた細胞は、酸化ストレス条件下で他のトランスフェクトされた細胞で見られる発現と比較した場合、ＰＡＲＰ－１の切断の有意な増加を示した。しかしながら、ＰＡＲＰ－１の切断は、ＤＸ２でトランスフェクトされた細胞では観察されなかった。 図２０Ｃでは、ＡＩＭＰ２のＰＡＲｙｌａｔｉｏｎはＨ２Ｏ２の存在下で増加したが、ＤＸ２のＰＡＲｌｙｌａｔｉｏｎは変化しなかった。
図２１Ａ～図２１Ｃは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２およびバリアントのアミノ酸配列の比較である（図２１Ｂおよび図２１Ｃは、図２１Ａの続きである）。 図２１Ａ～図２１Ｃは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２およびバリアントのアミノ酸配列の比較である（図２１Ｂおよび図２１Ｃは、図２１Ａの続きである）。 図２１Ａ～図２１Ｃは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２およびバリアントのアミノ酸配列の比較である（図２１Ｂおよび図２１Ｃは、図２１Ａの続きである）。
神経筋接合部損傷の阻害。図２２Ａでは、神経筋接合部をα－ブンガロトキシンで染色し、シナプス小胞およびエンドプレートをＳＶ２および２Ｈ３で染色した。図２２Ｂでは、神経支配されたエンドプレートの数を計数して表した。
発明の詳細な説明
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、多因子アポトーシス遺伝子であるＡＩＭＰ２（アミノアシルｔＲＮＡシンターゼ複合体相互作用多機能タンパク質２）の代替的な拮抗的スプライシングバリアントである。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＡＩＭＰ２の機能を妨げることによって細胞アポトーシスを抑制することが公知である。
ＡＩＭＰ２の競合的阻害剤として作用するＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＴＲＡＦ２のユビキチン化／分解の阻害によりＴＮＦ－α媒介性アポトーシスを抑制する。また、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、肺癌の誘導因子として以前に同定されている。
また、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２が神経系疾患を処置できることも明らかになっている（ＵＳ２０１９／０２９８８５８ Ａ１）。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象の疾患発症を遅延させる方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象の神経系細胞死を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
筋萎縮症の処置を必要とする対象において筋萎縮症を処置する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、対象は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する。いくつかの実施形態では、対象は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する。
パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象の生存率を向上または生存期間を延長する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象における行動欠陥を予防する、運動症候を回復させる、および／または神経系損傷を軽減する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象におけるアミロイドβオリゴマー（Ａβ－Ｏ）誘導性神経系細胞死またはＡβ－Ｏ誘導性ｐ５３発現を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する対象における神経筋接合部（ＮＭＪ）損傷を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書で開示されている。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象における神経筋接合部（ＮＭＪ）損傷の阻害、ＮＭＪブロック誘導性呼吸不全、呼吸困難の阻害、ＮＭＪブロック誘導性筋単収縮または線維束性攣縮の阻害の方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象におけるアノイキスを抑制する、および／またはラミニン受容体安定化を増大させる方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示されている。
また、ＡＬＳを有する対象における炎症を阻害する方法、ＰＤを有する対象における行動欠陥を予防、神経系細胞死および／もしくは筋萎縮を阻害する方法、ＰＤを有する対象における運動症候を回復させる方法、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象におけるＡＤを処置する方法、ならびに／または、以下の処置を必要とする対象における先天性筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ミオパシー、筋炎（多発性筋炎および皮膚筋炎を含む）、末梢性ニューロパシー、脊髄性筋萎縮症および／もしくは他の細胞死誘導性ＣＮＳ疾患を処置する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを対象に投与することを含む、方法も開示されている。
本明細書に開示されている組換えベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列をさらに含み得る。ベクターは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣａＭＫＩＩプロモーター、Ｈｂ９プロモーター、またはオプシンプロモーターである。
本明細書に開示されている方法において、いくつかの実施形態では、組換えベクターは、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子およびｍｉＲ－１４２標的配列を含む。ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側であり得る。本明細書に記載のベクターは、神経系細胞でＡＩＭＰ２－ＤＸ２を発現することができるが、白血球およびリンパ系細胞などの造血細胞では発現できない。したがって、本明細書に記載のベクターは、神経系疾患を処置するために神経系細胞を特異的に標的化するのに有用であり得る。
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチド（配列番号２）は、ＡＩＭＰ２（例えば、配列番号１２のａａ配列；例えば、配列番号３のｎｔ配列）のスプライスバリアントであり、ＡＩＭＰ２の第２のエクソン（配列番号１０；配列番号４のｎｔ配列）が省かれている。いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有し、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチドのバリアントまたはアイソフォームも公知であり、当業者によって決定することができる（例えば、配列番号１３～１９を参照）。例えば、図２１Ａ～図２１Ｃは、ＡＩＭＰ２（配列番号２）およびバリアント、配列番号１３～１９、ならびにコンセンサスまたはコア配列（配列番号２０）の比較を示す。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、またはその中の同一性％の任意の範囲にあるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、またはその中の同一性％の任意の範囲にあるヌクレオチド配列を含み得る。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１０または１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。いくつかの実施形態では、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない。
ｍｉＲ－１４２標的配列（ｍｉＲ－１４２Ｔ）は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５のうちの１～１７個の追加の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５に示されるように、ＡＣＡＣＴＡと、ＡＣＡＣＴＡの５’側または３’側に連続する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の追加のヌクレオチドとの合計とを含むヌクレオチド配列を含み得る。
ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ；ｍｉＲ－１４２－３ｐＴ）に対して少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一なヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。
ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＴＴＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７のうちの１～１５個の追加の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７に示されるように、ＡＣＴＴＴＡと、ＡＣＴＴＴＡの５’側または３’側に連続する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の追加のヌクレオチドの合計とを含むヌクレオチド配列を含み得る。
ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ；ｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）に対して少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一なヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的配列は、配列番号７のヌクレオチド配列を含み得る。
例示的なｍｉＲ１４２－３ｐＴの変異配列：
ＣｃｇｃｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃａｇｔｇｃｃａｇｃｃａａｔｇｔｇｃａｇａｇｇｔｇｇａｔｇａｇｇｔｃｔｔｇｔｇａａａａｃｃｔｇｇｃｔｃｃｔｔｔｔａａｃａｃｇｇｃｃｃｔｃａａｇｃｔｃｃｔｔａａｇｔｇａｃｃａｇａａｇｃｔｔｇｃｔａｇｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａｔｃａｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａｇａｔａｔｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａｔｃａｃｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａＣＣＡＣＴＧＣＡａａａｇｃｔｔｇｔａｇｇｇａｔｃｃｇｃｃ（配列番号：２５）である。
変異配列は、以下のように置換されているｍｉＲ１４２ ３ｐＴのコア配列の１つまたはそれを超える領域、例えば４つの領域を指す：（５’－ＡＡＣＡＣＴＡＣ－３’→５’－ＣＣＡＣＴＧＣＡ－３’）。ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＤＸ２の発現の阻害が、ｍｉＲ１４２－３ｐ ｘ１繰返し（１００ｐｍｏｌ）ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列により観察され、ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列におけるコア結合配列の数が増大するにつれて、ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害も増大した。Ｔｓｅｑ ｘ３コア配列含有ベクターは有意な阻害を示したが、変異型の３ｘ配列については阻害が観察されなかった。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御するように機能する非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子内の相補的配列、すなわちｍｉＲＮＡ標的配列との塩基対形成により機能する。ｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に結合し、それらの翻訳を負に制御するか、またはｍＲＮＡ分解を引き起こし得る。現在、２０００を超えるヒトｍｉＲＮＡが同定されており、ｍｉＲｂａｓｅデータベースが公に利用可能である。多くのｍｉＲＮＡは、組織特異的な様式で発現し、組織特異的な機能および分化を維持することにおいて重要な役割を有する。
ｍｉＲＮＡは、遺伝子の転写後段階で作用し、哺乳動物の場合、遺伝子発現の約６０％がｍｉＲＮＡによって制御されることが公知である。ｍｉＲＮＡは、生体内の多様なプロセスにおいて重要な役割を果たし、癌、心障害および神経関連障害との相関を有することが開示されている。例えば、ｍｉＲ－１４２には、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１４２－５ｐが存在し、そのいずれ標的配列も使用することができる。したがって、「ｍｉＲ－１４２」または「ｍｉＲＮＡ－１４２」は、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐを指し、ｍｉＲ－１４２標的配列、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐＴまたはｍｉＲ－１４２－５ｐＴに結合することができる。
ｍｉＲ－１４２標的配列は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して５’側または３’側であり得る。
例えば、「ｍｉＲ－１４２－３ｐ」は、その遺伝子の転座がアグレッシブＢ細胞白血病において起こる領域に存在することができ、造血組織（骨髄、脾臓、胸腺など）において発現することが公知である。さらに、ｍｉＲ－１４２－３ｐは、胎児マウスの肝臓（マウスの造血組織）における発現が確認され、造血系の分化に関与していることが公知である。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列は、少なくとも２～１０回、少なくとも２～８回、少なくとも２～６回、少なくとも４回、またはその任意の範囲もしくは回数繰り返される。
一例として、例えば、配列番号２３のヌクレオチド配列を有するｍｉＲ－１４２－３ｐは、対応する標的配列、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列を有するがこれに限定されないｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列（ｍｉＲ－１４２－３ｐＴ）を有し得る。例えば、配列番号２４のヌクレオチド配列を有するｍｉＲ－１４２－５ｐは、対応する標的配列、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列を有するがこれに限定されないｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列（ｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）を有し得る。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐは、配列番号２３のヌクレオチド配列を有し得、ｍｉＲ－１４２－５ｐは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有し得る。
ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列（それぞれｍｉＲ－１４２－３ｐＴおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）をＡＩＭＰ２－ＤＸ２の末端に挿入し、ＣＤ４５由来細胞、特にリンパ系および白血球におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２発現の抑制を制御することによって、腫瘍におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２バリアントの過剰発現の副作用を制御することができる組換えベクターが、本明細書に開示されている。したがって、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２バリアントの発現は、注射された神経系細胞および組織のみに制限され得るが、注射された組織領域の主要な集団である非神経系造血細胞では制限され得ない。ｍｉＲ１４２－３ｐは、造血細胞においてのみ発現する。
ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列を含む組換えベクターが、本明細書に開示されている。エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子ならびにｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的配列を含む組換えベクターが、本明細書に開示されている。
「組換えベクター」という用語は、適切な宿主細胞において標的タンパク質またはＲＮＡとして発現され得るベクター、および挿入された遺伝子が適切に発現されることを可能にするために必須な作動可能に連結された制御因子を含む遺伝子構築物を指す。
「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現の制御配列と、標的タンパク質およびＲＮＡをコードして一般的な機能を発揮する核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、それは、プロモーターをコードする核酸配列および核酸配列の作動性のために連結されたタンパク質またはＲＮＡの発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動可能な連結は、当該技術領域で周知であり、領域特異的なＤＮＡ切断および連結のために当該技術領域で一般的に公知な酵素を使用する遺伝子組換え技術を使用することによって製造することができる。
組換えベクターは、本明細書に開示されているように、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣａＭＫＩＩプロモーター、Ｈｂ９プロモーター、またはオプシンプロモーターである。
組換えベクターは、外因性プロモーターおよびプロモーターに作動可能に連結された外因性遺伝子をさらに含み得る。
本明細書で使用される「外因性遺伝子」は、生物学的に適切な活性化を有するタンパク質またはポリペプチド、および免疫原もしくは抗原タンパク質もしくはポリペプチド、または処置活性化タンパク質もしくはポリペプチドなどの標的産物の暗号化配列を含み得る。
ポリペプチドは、宿主細胞における内因性タンパク質の発現の欠損または欠如を補い得る。遺伝子配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせを含む多様な供給元から誘導され得る。遺伝子配列は、天然イントロンを含むかまたは含まないゲノムＤＮＡを含み得る。さらに、ゲノムＤＮＡは、プロモーター配列またはポリアデニル化配列と共に取得され得る。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、様々な方法で取得され得る。ゲノムＤＮＡは、当該領域で公に知られた方法により、適切な細胞から抽出および精製され得る。または、ｍＲＮＡを使用して、逆転写または細胞から分離することによる他の方法によってｃＤＮＡを産生することができる。または、ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列に相補的な配列、例えばアンチセンスＲＮＡ配列を含み得、アンチセンスＲＮＡを個体に投与して、個体の細胞における相補的ポリヌクレオチドの発現を抑制することができる。
例えば、外因性遺伝子は、エクソン２を喪失したＡＩＭＰ－２スプライシングバリアントであり、ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列は、外因性遺伝子の３’ＵＴＲに連結され得る。ＡＩＭＰ２タンパク質（３１２ａａバージョン：ＡＡＣ５０３９１．１またはＧＩ：１２１５６６９；３２０ａａバージョン：ＡＡＨ１３６３０．１、ＧＩ：１５４８９０２３、ＢＣ０ １３６３０．１）の配列は、文献（３１２ａａバージョン：Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９（２），３２９－３３４（１９９５）／３２０ａａバージョン：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｅ １５，０００ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６），１６８９９－１６９０３（２００２））に記載されている。
「ＡＩＭＰ２スプライシングバリアント」という用語は、エクソン１～４のうちのエクソン２の部分的または全体的な喪失に起因して生成されるバリアントを指す。したがって、バリアントは、ＡＩＭＰ２タンパク質およびヘテロ二量体を形成することによるＡＩＭＰ２の正常な機能の妨害を意味する。注射されたＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、注射された組織以外の組織ではほとんど発現されない。しかしながら、さらなる安全対策として、ｍｉＲ１４２標的配列を挿入して、注射された組織領域における非神経系細胞の主要な集団である造血細胞においてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が発現される可能性を完全にブロックすることが可能である。
組換えベクターは、配列番号１および５を含み得る。
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する「配列相同性の％」、「同一性％」または「同一％」という用語は、例えば、２つの最適に配置された配列を比較ドメインと比較することによって確認することができ、比較ドメイン内のヌクレオチド配列のいくつかは、２つの配列（付加または欠失を含まない）の最適な配置で参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。
本明細書に開示されているタンパク質は、その天然型アミノ酸配列を有するものだけでなく、バリアントのアミノ酸配列を有するものも含む。
タンパク質のバリアントは、天然アミノ酸配列と１個以上のアミノ酸残基との欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換またはそれらの組み合わせに起因する異なる配列を有するタンパク質を意味する。全体として分子の活性化を改変しないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該領域で知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。
タンパク質またはそのバリアントは、天然抽出、合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５６、１９６３）またはＤＮＡ配列に基づく遺伝子組換え（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、２ｎｄ Ｅｄ．、１９８９）によって製造され得る。
アミノ酸変異は、親水性、疎水性、電荷およびサイズなどのアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいて起こり得る。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および種類の分析によれば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは正電荷を有する残基；アラニン、グリシンおよびセリンは同様のサイズを有する；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは類似の形状を有することが理解され得る。したがって、このような考察に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、生物学的に機能的等価物とみなすことができる。
１つまたはそれを超える変異の導入では、アミノ酸の疎水性指標が考慮され得る。疎水性指標は、疎水性度および電荷に従って各アミノ酸に割り当てられる：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。
タンパク質の相互作用的な生物学的機能を割り当てる際に、疎水性アミノ酸指標は非常に重要である。類似の疎水性指標を有するアミノ酸で置換が行われる場合にのみ、類似の生物学的活性化を有することが可能である。疎水性指標を参照して変異を導入する事例では、疎水性指標の差が±２以内、±１以内、または±０．５以内であるアミノ酸間の置換。
一方、同様の親水性値を有するアミノ酸間の置換は、同等の生物学的活性化を有するタンパク質を誘導できることも周知である。米国特許第４，５５４，１０１号に示されるように、以下の親水性値が各アミノ酸残基に割り当てられる：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。
親水性値を参照して１つまたはそれを超える変異を導入する事例では、親水性値の差が±２以内、±１以内、または±０．５以内であるがこれらに限定されないアミノ酸間で置換を行うことができる。
分子の活性化を全体的に改変しないタンパク質のアミノ酸交換は、当該領域で知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９）。最も一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙを含むアミノ酸残基間のものである。ベクター系は、当該業界で発表されている多様な方法によって構築され得る。具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
本明細書に開示されているベクターは、クローニングまたは発現のための典型的なベクターとして構築され得る。さらに、ベクターは、宿主として原核または真核細胞を用いて構築され得る。ベクターが発現ベクターであり、原核細胞が宿主として使用される場合、転写を実行するための強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、１ｐｐプロモーター、ｐＬ Ｘプロモーター、ｐＲＸプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、デコード開始のためのリボソーム結合部位および転写／デコード終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５ａなど）を使用する場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．（１９８４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８：１０１８－１０２４）、ファージＸのレフト指向性プロモーター（ｐＬＸプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．およびＨａｇｅｎ，Ｄ．（１９８０）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３９９－４４５）をコントロール部位として使用することができる。
一方、使用され得るベクターは、ウイルスベクター、線状ＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡなどの１種以上であり得る。
「ウイルスベクター」は、遺伝子または遺伝物質を所望の細胞、組織および／または器官に送達することができるウイルスベクターを指す。
ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血病）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウイルス）、および単純ヘルペスウイルスで構成される群から選択される１種以上を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。
レトロウイルスは、宿主細胞のゲノムに対する組込み機能を有し、人体に対して無害であるが、組込み時に正常細胞の機能を抑制すること、多様な細胞に感染する能力、容易な増殖、およそ１～７ｋｂの外部遺伝子を収容すること、および複製欠損ウイルスを生成することを含む特徴を有し得る。しかしながら、レトロウイルスはまた、有糸分裂後の細胞への感染の困難さ、インビボ条件下での遺伝子送達、およびインビトロ条件下で体細胞を増殖させる必要性を含む欠点を有し得る。さらに、レトロウイルスは、癌原遺伝子に組み込まれ得、それによって細胞壊死の可能性を呈するので、自然変異のリスクを有する。
一方、アデノウイルスは、中程度のサイズの細胞の核内であっても複製すること、臨床的に無毒であること、外部遺伝子を挿入されたとしても安定であること、遺伝子の再編成や喪失がないこと、真核生物の形質転換、および宿主細胞の染色体に組み込まれても安定に高レベルで発現することを含む、クローニングベクターとして様々な利点を有する。アデノウイルスの良好な宿主細胞は、ヒトにおける造血、リンパ系および骨髄腫の原因である細胞である。しかしながら、線状ＤＮＡであり、ウイルスの感染率が低いことに伴い、感染したウイルスをリカバーすることは容易ではないため、増殖は困難である。さらに、送達された遺伝子の発現は１～２週間の間に最も大規模であり、発現は一部の細胞においてのみ３～４週間にわたって持続される。別の課題は、高い免疫抗原性を有することである。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、前述の問題を補完することができ、遺伝子治療剤として多くの利点を有するため、近年好まれている。これは、アデノサテライトウイルスとも呼ばれる。アデノ随伴ウイルス粒子の直径は２０ｎｍであり、人体に対してほとんど害がないことが公知である。したがって、欧州での遺伝子治療剤としての販売が承認された。
ＡＡＶは、複製のために補助ウイルスを必要とする一本鎖でのプロウイルスであり、ＡＡＶゲノムは、感染した細胞の１９番染色体の特定の領域に挿入され得る４，６８０ｂｐを有する。導入遺伝子は、各々１４５ｂｐの２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列セクションおよびシグナル配列セクションによって接続された血漿ＤＮＡに挿入される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐセクションを発現する他のプラスミドＤＮＡと共にトランスフェクションが実行され、アデノウイルスは補助ウイルスとして添加される。ＡＡＶは、遺伝子を送達する広範囲の宿主細胞、反復投与時の免疫学的副作用がほとんどない、および遺伝子発現期間が長いという利点を有する。さらに、ＡＡＶゲノムが宿主細胞の染色体に組み込まれたとしても、宿主の遺伝子発現を改変または再編成せずに安全である。
アデノ随伴ウイルスは、合計４つの血清型を有することが公知である。標的遺伝子の送達に使用され得る多くのアデノ随伴ウイルスの血清型の中で、最も広く研究されているベクターはアデノ随伴ウイルス血清型２であり、現在、嚢胞性線維症、血友病およびカナバン病の臨床遺伝子の送達に使用されている。さらに、近年、癌遺伝子治療の領域において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の可能性が高まっている。それは、本発明で使用されたアデノ随伴ウイルス血清型２でもあった。適切なウイルスベクターを選択して適用することは可能であるが、これに限定されない。
さらに、ベクターが発現ベクターであり、宿主として真核細胞を使用する場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：ポストアデノウイルスプロモーター、ワクチンウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶ ＴＫプロモーター）が使用され得る。具体的には、レトロウイルスのＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターおよびオプシンプロモーターで構成される群から選択されるプロモーターで構成される群から選択される１種以上を含み得るが、これらに限定されない。さらに、それは一般に、転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。
本明細書に開示されているベクターは、タンパク質の精製をより容易にするために必要に応じて他の配列と融合され得る。例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）、６ｘＨｉｓ（ヘキサヒスチジン；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などの融合した配列を使用することができるが、これらに限定されない。さらに、発現ベクターは、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンを含む選択マーカーとして当該業界で一般的に使用される抗生物質に対する耐性遺伝子を含み得る。
さらに、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐなどのｍｉＲ－１４２それぞれの標的配列（ｍｉＲ－１４２－３ｐＴおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐＴ）を含む組換えベクターを含む遺伝子キャリアが本明細書に開示されている。
「遺伝子導入」という用語は、一般に転写および発現のための細胞への遺伝物質の送達を含む。その方法は、タンパク質発現および処置目的に対して理想的である。ＤＮＡトランスフェクションおよびウイルス形質導入などの多様な送達方法が発表されている。それは、送達される遺伝子の高い送達効率および高レベルの発現、ならびに必要に応じて自然環境に優しいことまたはシュードタイピングによって特定の受容体および／または細胞型を標的化する可能性に起因するウイルス媒介性遺伝子導入を意味する。
遺伝子キャリアは、組換えベクターに形質転換された形質転換体であり得、形質転換には、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するすべての方法が含まれ、当該領域で発表されているように、宿主細胞に従って適切な標準技術を選択し実行することが可能である。そのような方法には、エレクトロポレーション、プロトプラズムの融合、リン酸カルシウム（ＣａＰ０４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコーンカーバイド繊維の使用との混合、アグリバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストランおよびリポフェクタミンなどが含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子キャリアは、ニューロンにおける外因性遺伝子の発現を目的とする。したがって、それはＣＤ４５由来細胞における外因性遺伝子の発現を抑制し、脳組織における外因性遺伝子の発現を増加させ得る。ＣＤ４５の大部分は、造血細胞に位置する膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼである。細胞は、細胞表面に位置する分子に従って定義され得、ＣＤ４５は、すべての白血球群およびＢリンパ球の細胞マーカーである。遺伝子キャリアは、ＣＤ４５由来細胞、特にリンパ系および白血球の範囲の細胞では発現されない。
遺伝子キャリアは、薬理学的に使用され得るキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含み得る。
さらに、組換えベクターを対応する実体に導入する段階を含む、外因性遺伝子をニューロンに送達および発現する方法が、本明細書に開示されている。
方法は、脳の組織における外因性遺伝子の発現を増加させ、他の組織における外因性遺伝子の発現を制御し得る。
さらに、１）プロモーター；２）作動を可能にするようにプロモーターと連結された標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および３）ヌクレオチド配列の３’ＵＴＲに挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐを標的とするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含むベクターが、本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、１）プロモーター；２）作動を可能にするようにプロモーターと連結された標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列；および３）ヌクレオチド配列の３’ＵＴＲに挿入されたｍｉＲ－１４２－５ｐを標的とするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み得る。
「発現カセット」という用語は、標的タンパク質をコードする遺伝子ならびにプロモーターおよびシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むので、シグナルペプチドの下流に作動可能に連結された標的タンパク質の産生および分泌のための発現を実行することができる単位カセットを指す。本発明の分泌発現カセットは、分泌系と混合して使用され得る。標的タンパク質の効率的な産生を補助し得る多様な因子が、そのような発現カセットの内外に含まれ得る。
さらに、エクソン２を喪失したＡＩＭＰ－２スプライシングバリアントをコードするヌクレオチド配列、およびヌクレオチド配列の３’ＵＴＲに連結されたｍｉＲ－１４２－３ｐを標的とするヌクレオチド配列を含む、神経変性疾患のための予防用または治療用製剤が、本明細書に開示されている。
したがって、本明細書に開示されているベクターのいずれかを投与することを含む、それを必要とする対象の神経系疾患を処置する方法も本明細書に開示されている。神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜変性、軽度認知機能障害、多発梗塞性認知症、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、変性神経疾患、代謝性脳障害、うつ病、てんかん、多発性硬化症、皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症および脳卒中で構成される群から選択される疾患の１種以上であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、神経系疾患はＡＬＳである。処置は、神経系疾患、例えばＡＬＳ、アルツハイマー病、またはパーキンソン病を有する対象の記憶、ジスキネジア、運動活性を改善、および／または生存期間を延長することができる。いくつかの実施形態では、処置は、神経系疾患、例えばＡＬＳを有する対象の運動活性を改善、および／または生存期間を延長することができる。
本明細書に開示されているベクターは、限定されないが、アポトーシスの阻害、ジスキネジアの改良、および／または酸化ストレスの阻害をもたらし、したがって神経系疾患を予防または処置することができる。
「処置」という用語は、神経変性疾患の完全な処置だけでなく、本明細書に開示されている薬理学的薬剤の適用の結果としての神経変性疾患の全体的な症候の部分的な処置、改善および／または低減も含む。
「予防」という用語は、本明細書に開示されている薬理学的薬剤を適用することによって、認知障害、行動障害および脳神経の破壊などの症候または現象を抑制またはブロックすることによって、神経変性疾患の全体的な症候の発生を事前に予防することを意味する。
活性成分以外のアジュバントは、本明細書に開示されている薬理学的薬剤に追加して含めることができる。アジュバントは、当該技術領域において公知のものである限り制限なく使用することができるが、例えばフロイントの完全および不完全アジュバントをさらに含むことにより、免疫力を高めることができる。
本明細書に開示されている薬理学的薬剤は、活性成分を薬理学的に許容される担体と混合した様式で製造され得る。ここで、薬理学的に許容される担体には、薬理学の領域で一般的に使用される担体、賦形剤および希釈剤が含まれる。本明細書に開示されている薬理学的薬剤に使用され得る薬理学的に許容される担体には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マリトール、スターチ、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示されている薬理学的薬剤は、それぞれの一般的な製造方法に従って、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、およびエアゾール剤などの経口投与用、ならびに外用、坐薬、または消毒注射液剤などを含む種々な様式で製造されることによって使用され得る。
製剤に製造される場合、一般的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤および界面活性剤などの、希釈剤または賦形剤を製造に使用することができる。経口投与用の固形製剤には、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤が含まれ、これらの固形製剤は、スターチ、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、およびゼラチンなどの１種以上の賦形剤を活性成分と混合することにより製造され得る。さらに、単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの潤滑剤も使用され得る。経口投与用の液体製剤には、一般的に使用されている希釈剤である水および流動パラフィン以外に、保湿剤、甘味剤、香味・保存剤などの各種賦形剤を含む懸濁液剤、内服用液剤、油剤、およびシロップ剤などが含まれる。非経口投与用の製剤には、滅菌水溶液、非水溶媒、懸濁剤、油剤、凍結乾燥剤および坐剤が含まれる。非水溶媒および懸濁溶液として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびオリーブ油などの植物油、エチレートなどの注射用エステルが使用され得る。坐剤用の薬剤には、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、ツイーン（ｔｗｅｅｎ（登録商標））６１、カカオ油、ラウリン油およびグリセロゼラチンなどが含まれる。
薬理学的薬剤は、多様なチャネルを介して対象または実体に投与され得る。経口投与、ならびに静脈内、筋肉、皮下および腹腔内注射などのすべての投与様式が使用され得る。
本明細書に開示されている治療剤の投与の望ましい用量は、製剤の生産方法、投与様式、患者の年齢、体重および性別、疾患の症候の程度、食事、投与期間、投与経路、排出速度および反応感受性などを含む様々な要因に応じて異なる。それにもかかわらず、それは対応する製造業者によって適切に選択され得る。しかしながら、処置効果について、熟練した医師は、標的化した処置のための有効用量を決定し、処方することができる。例えば、処置薬剤には、静脈内、皮下および筋肉注射、ならびにマイクロニードルを使用した脳室または脊髄への方向注射が含まれる。複数回の注射および反復投与が可能であり、例えば、有効用量は、ベクターの場合は０．０５～１５ｍｇ／ｋｇ、組換えウイルスの場合は５×１０１１～３．３×１０１４ウイルス粒子（２．５×１０１２～１．５×１０１６ＩＵ）／ｋｇ、細胞では５×１０２～５×１０７細胞／ｋｇである。望ましくは、用量は、ベクターの場合は０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、組換えウイルスの場合は５×１０１２～３．３×１０１３粒子（２．５×１０１３から１．５×１０１５ＩＵ）／ｋｇ、細胞の場合は５×１０３～５×１０６細胞／ｋｇであり、週に２～３回の投与レートである。用量は厳密には制限されない。むしろ、患者の症状および神経性障害の現れの程度に従って修正され得る。他の皮下脂肪および筋肉注射ならびに患部への直接投与のための有効用量は、９×１０１０～３．３×１０１４の組換えウイルス粒子であり、１０ｃｍ間隔で週に２～３回のレートである。用量は厳密には制限されない。むしろ、患者の症状および神経性障害の現れの程度に従って修正され得る。より具体的には、本発明に従う薬理学的薬剤は、１×１０１０～１×１０１２ｖｇ（ウイルスゲノム）／ｍＬの組換えアデノ随伴ウイルスを含み、一般に、２週間にわたって２日に１回、１×１０１２ｖｇを注射することが賢明である。それは、１日１回投与され得るか、または１日を通して数回の投与のために用量を分割することによって投与され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、０．１×１０８ｖｇ～５００×１０８ｖｇ、１×１０８ｖｇ～１００×１０８ｖｇ、１×１０８ｖｇ～１０×１０８ｖｇ、例えば５×１０８ｖｇ、またはそれに由来する任意の範囲の用量で投与され得る。ＩＶ注射の場合、例えば、ＩＶ注射用の体重に基づいて、ｖｇをヒト用の用量に変換することができる。局所組織注射の場合、例えば、標的細胞数および有効ＭＯＩ（感染多重度）に基づいて、ｖｇをヒト用の用量に変換することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、例えば網膜下注射、硝子体内注射、または脈絡膜下注射によって対象に注射され得る。注射は液体の形態であり得る。他の実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、点眼剤または軟膏の形態で対象に投与され得る。
薬理学的製剤は、経口および非経口投与可能な多様な様式で生産され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、脳または脊髄に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているベクターは、定位注射によって脳に投与され得る。
経口投与薬剤には、丸剤、錠剤、硬質および軟質カプセル、液剤、懸濁液剤、油剤、シロップ剤および顆粒剤などが含まれる。これらの薬剤は、活性成分に加えて、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン）および流動促進剤（ｇｌｙｄｅｎｔｓ）（例：シリカ、タルクならびにステアリン酸およびそのマグネシウムもしくはカルシウム塩、ならびに／またはポリエチレングリコール）を含み得る。さらに、丸剤は、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、スターチペースト、ゼラチン、トラガカンチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリジンなどの結合剤を含有し得、状況に応じて、スターチ、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩または同様の混合物などの崩壊剤および／あるいは吸収剤、着色剤、香味剤および甘味料を含有し得る。薬剤は、一般的な混合、造粒またはコーティング法によって製造され得る。
ざらに、注射剤は、非経口投与される製剤の代表的な形態である。そのような注射剤用の溶媒には、水、リンガー液、等張性生理食塩水および懸濁液が含まれる。注射剤の滅菌固定油を溶媒または懸濁媒体として使用することができ、モノ－およびジ－グリセリドを含む任意の非刺激性固定油をそのような目的のために使用することができる。さらに、注射剤は、オレイン酸などの脂肪酸を使用することができる。
以下の実行例を使用して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の実行例は、発明の内容を特定する目的のためだけであって、本発明の適用をその例に限定するものではない。
実施例
実施例１．組換えベクターの作製
ＣＤ４５の大部分は、造血細胞の膜貫通タンパク質チロシンホスファターゼであり、細胞表面の分子に従って細胞を定義するために使用され得る。ＣＤ４５は、すべての白血球群およびＢリンパ球のマーカーである。ＣＤ４５由来細胞、特にリンパ系および白血球細胞において発現されず、ニューロンにおいてのみ特異的に発現される組換えベクターが作製されている。組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ複合体相互作用多機能性タンパク質２（ＡＩＭＰ２）のエクソン２が欠失したスプライシングバリアント、およびＡＩＭＰ２スプライシングバリアントの発現を制御することができるｍｉＲＮＡを含む。
分布の安全対策として、注射された神経系組織においてのみＡＩＭＰ２スプライシングバリアントの特異的発現を誘導し、注射された組織領域における非神経系細胞の主要な集団である造血細胞においてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が発現される可能性を完全にブロックするために、組換えベクターを上記のように作製した。
実施例１．１．ＡＩＭＰ２バリアントの作製
ＡＩＭＰ２は、アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）の形成に関与するタンパク質の１つであり、多因子アポトーシスタンパク質として作用する。ＡＩＭＰ２のエクソン２が欠失したバリアントを発現するプラスミドを構築するために、ＡＩＭＰ２スプライシングバリアントのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃにクローニングした。Ｈ３２２ ｃＤＮＡに結合したＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１リンカーを有するプライマーを使用してＡＩＭＰ２スプライシングバリアントを増幅した後、ＥｃｏＲｌおよびＸｈｏ１を使用してｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃにサブクローニングを実行した。
配列番号１のヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するＡＩＭＰ２バリアントを使用した。
実施例１．２．ｍｉＲＮＡの選別およびその標的配列の選択
上記のように、分布の安全対策として、注射された神経系細胞におけるＡＩＭＰ２バリアントの発現を限定し、注射された組織領域における非神経系細胞の主要な集団である造血細胞においてＡＩＭＰ２－ＤＸ２が発現される可能性を完全にブロックするために、組換えベクターを上記のように作製した。
この目的のために、白血球およびリンパ系関連細胞を生成する造血細胞においてのみ特異的に発現されるｍｉＲ－１４２－３ｐを標的として選択した。ｍｉＲ－１４２－３ｐのみを標的とする配列を作製するために、マウスＢ細胞のマイクロアレイデータおよびｍｉＲ－１４２－３ｐが標的とする遺伝子のコンピュータプログラミング（ｍｉｒＳＶＲスコア）を使用した。ｍｉＲ－１４２－３ｐは、配列番号３で示される塩基配列である。ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的とする配列を、ｍｉＲ－１４２－３ｐと相補的に結合する塩基配列番号４で示した。ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を有し得る。
ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列には、クローニング用制限酵素（Ｎｈｅ １およびＨｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂｍｔ １）部位配列（ｃｃａｇａａｇｃｔｔｇｃｔａｇｃ）および制限酵素（Ｈｉｎｄ Ｈ）部位配列（ａａｇｃｔｔｇｔａｇ）が含まれる。それらを接続するリンカー（ｔｃａｃおよびｇａｔａｔｃ）を用いて４回繰り返された配列番号５のヌクレオチド配列を含む（図３；配列番号６）。
実施例１．３．組換えベクターの作製
組換えベクターを作製するために、ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列（配列番号５）をＡＩＭＰ２バリアント（配列番号１）の３’ＵＴＲに挿入した。ＡＩＭＰ－２バリアントおよびｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列の接続は、ヌクレオチド配列番号６で示され、具体的には、Ｎｈｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を使用して切断および挿入された。組換えベクターを図１に示す。
実施例２．組換えベクターの神経細胞特異的発現の確認
実施例２．１．インビトロ条件下でのニューロン特異的発現効果の確認
ｍｉＲ１４２－３ｐは造血細胞においてのみ特異的に発現するため、組換えベクターのｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列の発現によるＡＩＭＰ２バリアントのノックダウンにより、特定の細胞におけるＡＩＭＰ２バリアントの発現の程度を確認した。
具体的には、組換えベクターの処置を行わない群（ＳＨＡＭ）、空／対照ベクターで処理された群（ＮＣベクター）、単一ＡＩＭＰ２バリアントベクターで処理された群（ｐｓｃＡＡＶ＿ＤＸ２）および組換えベクターで処置された群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐＴ）があった。すべてのベクターの濃度はｕｇ／ｕｌの単位であり、各群を２．５ｕｌ（２．５ｕｇ）で処置した。各処置群において、ＡＩＭＰ２バリアントのノックダウンを確認しながら、ＴＨＰ－１細胞株（ヒト単球性白血病細胞）およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株（神経芽細胞腫）に対して処置を行った。ｑＰＣＲは、下記表１のプライマーを使用して実行した（１５秒間の変性、６０℃の温度下で３０秒間の４０サイクルにわたるアニーリングおよび伸長）。
その結果、ＳＨＡＭおよびＮＣベクター群ではＡＩＭＰ２バリアントが発現しないことが確認された。さらに、単一ＡＩＭＰ２バリアントベクターで処理された群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２）のＴＨＰ－１細胞株およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株の両方で発現が確認され、それによって神経細胞特異的発現が誘導されないことが確認された。一方、組換えベクターで処置された群では、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株においてのみＡＩＭＰ２バリアントが特異的に発現することが確認された（図２）。
実施例２．２．インビボ条件下での神経細胞特異的発現効果の確認
具体的には、空／対照ベクターで処理された群（ＮＣベクター）、単一ＡＩＭＰ２バリアントベクターで処置された群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２）および本発明の組換えベクターで処置された群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐＴ）があった。１０８ｖｇ／ｕｌの濃度の各ウイルス１０ｕｌ（１０９ｖｇ）を用いて実質内処置を実行した。処置された各群のマウスへの頭蓋内注射後、１週間後に大腸組織、肺組織、脳の組織、肝組織、腎組織、胸腺組織、脾臓組織および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてＡＩＭＰ２の発現が確認された。ｑＰＣＲは、下記表１のプライマーを使用して実行した（１５秒間の変性、６０℃の温度下で３０秒間の４０サイクルにわたるアニーリングおよび伸長）。
結果として、本発明の組換えベクターで処置された群では、高度に濃縮されたニューロンを有する脳組織においてのみ、ＡＩＭＰ２バリアントの発現が特異的に増加したことが確認された（図３）。一方、脳組織以外の組織では、ＡＩＭＰ２バリアントの発現が妨げられることが確認された。
実施例３．材料および方法
実施例３．１．ｑＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、脊髄から単離した。抽出されたＲＮＡを分光光度計（ＡＳＰ－２６８０、ＡＣＴｇｅｎｅ、ＵＳＡ）によって定量化のために、定量した。ｃＤＮＡを作製するために、逆転写を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルにより行った。得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用したリアルタイムＰＣＲに使用した。２－ΔΔＣｔ統計解析には二連での結果の発現データを使用し、正規化にはＧＡＤＰＨ発現を使用した。
実施例３．２．動物
この研究で使用したｈＳＯＤ１ Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入した。同齢のＷＴ対照マウスも使用した。動物を、韓国のソウル国立大学（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の動物施設において、特定の病原体のない条件下および一定の環境条件下（２１～２３℃の温度、５０～６０％の湿度および１２時間の明／暗サイクル）で個々のケージに収容した。すべての実験手順は、ソウル国立大学 Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＳＮＵＩＡＣＵＣ、２０１７年８月７日）のガイドラインに従って行い、この研究は、本発明者らの地域倫理委員会「ＳＮＵＩＡＣＵＣ」によって承認された（承認番号ＳＮＵ－１７０８０７－１）。発症前段階において、同齢の雌性マウスにＡＡＶ－ＧＦＰおよびＤＸ２ベクターを投与した。ＡＡＶ－ＤＸ２の形質導入は、直接腰椎（ｌｕｍｂｅｒ）穿刺によって髄腔内注射した。ハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、合計８μｌ（４μｌ／点）のＡＡＶ－ＧＦＰまたはＤＸ２ベクターを、注射されたベクターの喪失を防ぐために針をゆっくりと引き抜きながら、２点でゆっくり注射（１μｌ／分）した。
実施例３．３．ｍｉＲ１４２－３ｐ阻害実験
ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ－１４２－３ｐ阻害は、ｘ１ ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列から観察することができた。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して、ｘ１、ｘ２、およびｘ３繰返しｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列ベクター、加えて１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐで一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡの量をＰＣＲによって分析した。ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害は、Ｔｓｅｑ ｘ１繰返しｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列から観察された（図５Ｂ）。
実施例４
実施例４．１．コア結合配列の阻害効果のために作成した３種類のベクター
Ｔｓｅｑ ｘ１は１つのコア結合配列を含み、Ｔｓｅｑ ｘ２は２つのコア結合配列を含み、Ｔｓｅｑ ｘ３は３つのコア結合配列を含む（図５Ａ）。
ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ（１００ｐｍｏｌ）阻害は、ｘ１繰返しｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列から観察され始めた。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して、ｘ１、ｘ２、およびｘ３繰返しｍｉＲ－１４２－３ｐ Ｔｓｅｑベクター、加えて１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐで一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡ量をＰＣＲによって分析した。ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列におけるコア結合配列の数が増加すると、ＤＸ２の発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害も増大した。Ｔｓｅｑ ｘ３コア配列を含むベクターは有意な阻害を示した（図５Ｂ）。
実施例４．２．コア配列変異．
マウスＢ細胞マイクロアレイデータおよびｍｉＲ－１４２－３ｐの標的遺伝子のｍｉｒＳＶＲスコアを使用して、コア配列を予測した。コア配列の４つの領域を以下のように置換した：（５’－ＡＡＣＡＣＴＡＣ－３’→５’－ＣＣＡＣＴＧＣＡ－３’）（オリジナル配列については図４、模式図については図５Ａを参照）。
実施例４．３．コア結合配列は、重要なＤＸ２阻害である。
４つのコア配列を置換した（図５Ａ）。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して、ＤＸ２－ｍｉＲ－１４２－３ｐ Ｔｓｅｑ ｘ３繰返しベクター（Ｔｓｅｑ３ｘ）またはコア配列変異型ベクター（ｍｕｔ）、および１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐで一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡの発現をＰＣＲによって分析した。ＤＸ２の有意な阻害を示したＴｓｅｑ ｘ３繰返しベクター（図５Ｂ）およびＤＸ２構築物を対照として使用した。１００ｐｍｏｌのｍｉＲ１４２－３ｐ処置は、Ｔｓｅｑ ｘ３ベクターを有意に阻害したが、ＤＸ２およびｍｕｔ配列は阻害されなかった（図６）。
実施例４．４．ＡＬＳマウスモデルにおける組織分布データ。
ｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐの髄腔内注射後に、全ＲＮＡを脊髄から抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ＤＸ２の発現は、局所注射部位、脊髄においてのみに限定されるはずである。ｈＳＯＤ１ Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ｍｉＲ１４２－３ｐは髄腔内注射で発現された。対照ビヒクル注射は、脊髄でのみ発現を示し、脳でも坐骨神経でも発現を示さなかった（図７）。
実施例５
実施例２では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、組換えＡＡＶ２粒子を産生するのに必要なすべての構成要素をコードする３つのプラスミド（Ｏｘｇｅｎｅ、ＵＫから）でコトランスフェクトした。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はまた、発現ベクターとしてであり、ＡＡＶ粒子を産生するためではない、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２またはＤＸ２－ｍｉＲ１４２の標的ヌクレオチドの挿入を伴うｐＳＦ－ＡＡＶ－ＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＩＴＲ－ＫａｎＲ（Ｏｘｇｅｎｅ、ＵＫ）のみでトランスフェクトした。
ＤＸ２コーディングベクター（２ｕｇ）およびＤＸ２－ｍｉＲ１４２標的配列コーディングベクター（２ｕｇ）を、ＴＨＰ－１細胞（ヒト単球、ＣＤ４５＋細胞）およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ（神経系細胞）にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を収集し、ｍＲＮＡを単離した。合成されたｃＤＮＡを用いて、ＤＸ２の発現をリアルタイムＰＣＲによって分析した。
ＤＸ２の発現レベルは、ＤＸ２コーディングベクターおよびＤＸ２－ｍｉＲ１４２標的配列コーディングベクターでトランスフェクトされたＳＨ－ＳＹ５Ｙの間で類似していたが、ＤＸ２の発現は、ＤＸ２－ｍｉＲ１４２標的配列コーディングベクターでトランスフェクトされたＴＨＰ－１細胞において劇的に減少した。したがって、ｍｉＲ１４２－３ｐは、ＴＨＰ－１細胞においてのみ機能した（図８）。
実施例６
実施例６．１．実験方法
動物モデル
この研究で使用したｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入した。動物を、特定の病原体のない条件下および一定の環境条件下（２１～２３℃の温度、５０～６０％の湿度および１２時間の明／暗サイクル）で個々のケージに収容した。発症前段階において、同齢の雌性マウスにＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＤＸ２を投与した。ＡＡＶ２－ＤＸ２の形質導入は、直接腰椎（ｌｕｍｂｅｒ）穿刺によって髄腔内注射した。ハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、合計８μｌ（４μｌ／点）のＡＡＶ－ＧＦＰまたはＤＸ２ベクターを、注射されたウイルスの喪失を防ぐために針をゆっくりと引き抜きながら、２点でゆっくり注射（１μｌ／分）した。
行動分析 疾患の発症を判定するために、本発明者らは、マウスが最大体重から５～６％まで体重を失い始めた日に注目した。一般に、重度の発症段階が、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて生後１２週間から観察されることが公知であるが、運動機能欠損が明白な症候の発症の数週間前（出生後４５日目）に始まった（Ｃ．Ｒ．Ｈａｙｗｏｒｔｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年１２月１５日；１６４（３）：９７５－９８５）。本研究では、跛行が観察され、マウスが最大体重の５～６％まで失い始めた生後９週間の時点で、ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＧＯ１０２）を同齢の雌性マウスに投与した。ＡＡＶ２－ＤＸ２（ＧＯ１０２）の形質導入は、直接腰椎穿刺による髄腔内注射によって達成された。
実施例６．２．結果
図９Ａ～図９Ｃは、ＤＸ２トランスジェニックマウスが、ロテノンで処置されたマウスにおいて運動症候をリカバーすることを示す。図９Ａは、示されたマウスにおけるマウスの脳を用いて、ＴＨの発現を分析したことを示す。黒い点線の四角はＴＦ染色された領域を示す。図９Ｂは、ロータロッド分析を示す。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２トランスジェニック（ＴＧ）マウスにおける落下までのレイテンシー。図９Ｃは、ポール試験を示す。ロテノンで処置された野生型およびＤＸ２ ＴＧマウスにおける垂直運動（左パネル）およびＴターン時間（右パネル）。動物；ｎ＝６（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定。図９Ｄおよび図９Ｅは、ＤＸ２が、ロテノン誘導性ＰＤマウスモデルにおいて神経系損傷および行動を改善することを示す。図９Ｄは、ポール試験を示す。ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２は、ロテノンで処置されたＰＤマウスモデルにおいて運動協調性およびバランスをリカバーした。「Ｃｏｎ」および「ＧＦＰ」は、野生型およびロテノンで処置されたＧＦＰ注射マウスを示す。「用量１」および「用量２」は、ロテノンで処置されたマウスにおけるＤＸ２の異なる注射用量を表す。図９Ｅは、マウス黒質の免疫組織化学および免疫蛍光画像を示す。上のパネルは、線条体におけるＴＨ陽性細胞を示し、下のパネルは、注射されたＧＦＰを発現するウイルスの分布を示す。黒い点線の四角はＴＨの染色された領域を示す。動物；ｎ＝５（各群）、ｎｓ；非有意、＊＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定。
図１０Ａ～図１０Ｈは、ＤＸ２が、６－ＯＨＤＡ誘導性ＰＤモデルにおける行動欠損を予防することを示す。図１０Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、生理食塩水またはビヒクル（ＧＦＰ）の場合と比較して低レベルの対側回転を示したことを実証し、ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンの損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｂは、ＤＸ２で処置されたマウスが、対側の前足接触の増加を示したことを実証し、ＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンにおける片側損傷を減弱させたことを示す。図１０Ｃは、ＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、右に偏った体のスイングをあまり示さなかったことを実証している。動物；生理食塩水（生理食塩水で処置された野生型マウス）ｎ＝４、ＧＦＰ（ＧＦＰを注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝５、ＤＸ２（ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡ処置マウス）ｎ＝１１、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、ｎｓ；非有意、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｄは、ＧＦＰおよびＤＸ２を注射されたマウス脳の免疫蛍光画像を示す。白い四角のボックスはＴＨ陽性ドーパミン作動性神経系細胞を示し、白い矢印は示されたウイルス注射部位を示す。図１０Ｅは、各マウス群における生存率を示す。動物；ｎ＝１５、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）は生理食塩水で処置された野生型マウスを示す。Ｌ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２は、６－ＯＨＤＡで処置されたマウスにおけるＬ－ＤＯＰＡ、ＧＦＰおよびＤＸ２の注射を表す。ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ（ＧＦＰ）４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（低）１．６×１０８ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２（ＤＸ２）（高）４×１０９ｖｇ。図１０Ｆおよび図１０Ｇは、ナイーブ、６－ＯＨＤＡおよびＤＸ２で処置されたマウスのＤＸ２およびＢａｘのｍＲＮＡ発現を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。図１０Ｈは、ＡＡＶ－ＤＸ２を注射された６－ＯＨＤＡマウスモデルにおいて、ＤＸ２を発現する細胞を同定するためのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
図１１Ａ～図１１Ｇは、ＤＸ２が、ＭＰＴＰ誘導性ＰＤモデルにおける運動症候を回復させることを示す。図１１Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２で処置されたマウスが、ビヒクル（ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ、ＧＦＰ）の場合と比較して、ロータロッド試験においてわずかに長い落下までのレイテンシーを示したことを実証し、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２がドーパミン作動性ニューロンに対する損傷を減弱させたことを示す。図１１Ｂは、ＤＸ２で処置されたマウスが、ＳＨＩＲＰＡ試験に基づくと、改善された自発運動活性を示したことを実証している。図１１Ｃは、ＤＸ２で処置されたマウスが、比較的低いレベルの四肢欠損を示したことを実証している。図１１Ｄは、ＤＸ２過剰発現マウスが、ビヒクル対照（ＧＦＰ）と比較した場合、グルーミング率の改善を示したことを実証している。図１１Ｅは、マウス黒質におけるＴＨ陽性細胞の免疫蛍光画像を示す。白い四角のボックスはＴＨの発現領域を示す。図１１Ｆおよび図１１Ｇは、示されたマウス脳のＤＸ２（図１１Ｆ）およびＢａｘ（図１１Ｇ）のｍＲＮＡ発現を示す。ナイーブ、ＧＦＰ、およびＤＸ２は、生理食塩水で処置された野生型マウス、ＧＦＰを注射されたＭＰＴＰ処置マウス、およびＤＸ２を注射されたＭＰＴＰ処置マウスを示す。動物；ナイーブｎ＝６、ＧＦＰ ｎ＝９、ＤＸ２ ｎ＝１２、ｓｃＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ ４×１０９ｖｇ、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ４×１０９ｖｇ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｔ検定。
実施例７
ＳＯＤ１トランスジェニックマウスを脊柱管でＡＡＶ－ＧＦＰ（ＧＦＰ）またはＡＡＶ－ＤＸ２で処置して、インビボでのＤＸ２の効果を調査した。疾患の発症は、ＧＦＰを注射されたマウス群と比較して、ＤＸ２を注射されたマウス群で遅延した。さらに、ＤＸ２を投与された群のマウスは、ＧＦＰを注射された群のマウスよりも有意に長く生存した。ＤＸ２を投与されたマウスの生存期間は、ＧＦＰを注射されたマウスと比較して延長された。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＤＸ２の投与が、ルーゲーリック病モデルにおいて、疾患発症を改善し、マウスの生存期間を延長することを示す。図１２Ａ．疾患発症はＡＡＶ－ＤＸ２群で改善された。図１２Ｂ．マウスの生存期間は、ＡＡＶ－ＧＦＰ群のものと比較した場合、ＡＡＶ－ＤＸ２群で延長された。動物；ｎ＝５。
実施例８
実施例８．１．実験方法
細胞培養および処置
ヒト神経芽腫細胞株であるＳＫ－ＳＹ５Ｙ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０で維持した。神経系細胞におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の誘導のために、ＳＫ－ＳＹ５Ｙ細胞を６ウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルの密度で播種し、１６時間後、培養培地を２５μＭのアミロイドβ－タンパク質オリゴマー（Ａβ－Ｏ）を含有するＲＰＭＩ １６４０で２４時間置き換えた。ＤＸ２の発現による神経系細胞死の阻害効果を特定するために、ＳＫ－ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ－Ｏと共に２４時間インキュベートし、次いで、ビヒクル（ｓｃＡＡＶ２－ＧＦＰ）または過剰発現ＤＸ２（ｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２）ウイルスを使用して、ＲＰＭＩ １６４０増殖培地で４８時間細胞を処置した。細胞死をウエスタンブロットおよび顕微鏡法によって分析した。
免疫ブロット分析
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４に溶解した。５０μｇのタンパク質を含有する試料を１０％ポリアクリルアミドゲルにブロットし、電気泳動的に膜に転写した。膜を、２０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中５％脱脂粉乳でブロックし、ｐ５３およびアクチンに対する一次抗体と共にインキュベートした。膜上の抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次マウス抗ヤギおよび抗ウサギ抗体で検出した。膜を、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のマニュアルに従って、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ持続時間延長型基質によって分析した。
実施例８．２．結果
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２はＡβ－Ｏ誘導性神経系細胞死を減弱させる。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）およびリン酸化タウ（ｐ－ｔａｕ）タンパク質などの異常タンパク質が脳に蓄積することによって引き起こされる進行性の神経変性疾患である（Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ ２００９）。アミロイド前駆体タンパク質のタンパク質分解的切断によるアミロイドβタンパク質の凝集が、ＡＤ発症において重要な役割を果たすことが公知である（Ｖｉｏｌａ ２０１５およびＤｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ ２０１０）。したがって、本発明者らは、ＡＤ誘導性細胞における細胞死の阻害因子であるＡＩＭＰ２－ＤＸ２（ＤＸ２）（Ｃｈｏｉ ２０１１）の過剰発現が神経系細胞死に影響を及ぼし得るかどうかを研究した。図１３では、細胞の生存は、正常増殖時に未処置、ビヒクル（ＡＡＶ－ＧＦＰ）で処置およびＤＸ２（ＡＡＶ－ＤＸ２）で処置された細胞で差がなく、正常条件でのＤＸ２の発現の増加は神経系細胞の生存の原因ではないことを示唆している。Ａβ－Ｏ処置条件では、ビヒクルで処置された細胞（Ａβ＋ＡＡＶ－ＧＦＰ）と比較して、ＤＸ２で処置された細胞（Ａβ＋ＡＡＶ－ＤＸ２）で神経系細胞死の減少が観察された。また、図１３の３つの異なる視野で細胞を観察した後、図１４において神経系細胞死を定量的に分析し、細胞のパーセンテージをスコア化した。図１４に示すように、ＤＸ２を過剰発現する細胞は、ビヒクルで処置された群と比較して、有意に増加した神経系細胞の生存率を有する（最大４７％）。これらの結果は、ＤＸ２の発現がＡβ－Ｏ誘導性細胞死の保護効果にとって重要な要因であることを示す。
ＤＸ２はＡβ－Ｏ誘導性ｐ５３発現を阻害する。
腫瘍抑制タンパク質であるＰ５３は、細胞周期およびアポトーシスなどの生物学的事象が制御される重要な因子である（Ｆｉｎｌａｙ １９８９）。既報（Ｃｈｏｉ ２０１１）に示されるように、ＡＩＭＰ２は、Ｍｄｍ２の結合ドメインであるｐ５３のＮ末端に結合し、その結合はｐ５３の安定性およびアポトーシス促進活性を誘導する。また、ＤＸ２が、ｐ５３との相互作用を妨害することによって、ＡＩＭＰ２のアポトーシス活性を阻害することは公知である。したがって、ＤＸ２遺伝子のウイルス形質導入によるＤＸ２の発現増加が、Ａβ－Ｏで処置された神経系細胞におけるｐ５３発現に影響を及ぼすかどうかを研究した。図１５では、正常増殖条件ではｐ５３の細胞発現レベルは変化しなかったが、Ａβ－Ｏの存在下ではｐ５３の発現レベルが増加した。また、ＤＸ２で処置された細胞では、ＤＸ２の発現はＡβ－Ｏ誘導性ｐ５３発現を減少させた。これらの結果は、ＤＸ２が神経系細胞においてＡβ－Ｏ誘導性アポトーシスおよびアポトーシス促進性タンパク質発現、例えばｐ５３を阻害することを示唆している。
ＤＸ２の発現は、ニューロトキシン誘導性ｐ５３発現において重要な役割を果たす（図１５）。ＳＫ－ＳＹ５Ｙ細胞を、２５μＭのＡβ－Ｏの非存在下または存在下で、ＡＡＶ－ＤＸ２またはＡＡＶ－ＧＦＰと共にインキュベートした。４８時間後、全タンパク質溶解物を調製し、ｐ５３タンパク質のレベルを免疫ブロット分析によって分析した。β－アクチンのレベルをローディングコントロールとして分析した。赤い四角のボックスは、Ａβ－Ｏで処置された細胞におけるｐ５３の増加したレベルを示す。
実施例９
実施例９．１．材料および方法
細胞培養および試薬
ＨＥＫ２９３細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手し、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ（Ｎ２Ａ）、ＳＫ－Ｎ－ＳＨおよびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）から入手した。ＨＥＫ２９３細胞およびＮ２Ａ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。また、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質を含むＲＰＭＩ－１６４０中でインキュベートした。ｍｙｃタグ付きＫＡＲＳ、ＨＡタグ付き変異型ＳＯＤ１、ＧＦＰタグ付きＫＡＲＳ、およびＧＦＰタグ付き変異型ＳＯＤ１の一過性トランスフェクションをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってトランスフェクトした。また、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラ－ゾリウムブロミド（ＭＴＴ）およびＨＥＭＡ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）からである。
酵母－ツーハイブリッドアッセイ
全長ＫＡＲＳおよび断片化ＫＡＲＳをｐＬｅｘＡプラスミドにクローニングし、ＳＯＤ１ ＷＴ、ＳＯＤ１ Ｇ８５Ｒ、およびＳＯＤ１ Ｇ９３ＡをｐＢ４２プラスミドにクローニングした。酵母におけるＫＡＲＳのＬｅｘＡ断片およびＢ４２－ＳＯＤＷＴ／ＳＯＤ８５／ＳＯＤ９３の間の正の相互作用を、Ｘ－ｇａｌプレート（２１）を使用したＬＥＵ２およびＬａｃＺレポーター系によって判定した。
免疫沈降アッセイ
細胞溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１％ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、およびＰＭＳＦ）によって収集し、調製した。細胞溶解物を氷上で３０分間インキュベートし、続いて１２，０００ｇで１０分間遠心分離した後に上清を回収した。抗ＨＡまたは抗Ｍｙｃアガロースビーズを溶解物に添加し、ロッキングプラットフォームを用いて４度で一晩インキュベートした。アガロースビーズに結合したタンパク質を３回洗浄し、回収した試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ウエスタンブロッティング分析を行った。
ウエスタンブロッティングおよび抗体
細胞を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４に溶解した。５０μｇのタンパク質を含有する試料を１０％ポリアクリルアミドゲルにブロットし、電気泳動的に膜に転写した。膜を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むトリス緩衝生理食塩水中５％脱脂粉乳でブロックし、Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、ＨＡ、ＧＦＰ、６７ラミニン受容体、ＩκＢ、チューブリン、β－アクチン、ＴＲＡＦ２、ＥＰＲＳ、ＫＡＲＳ、ＡＩＭＰ２、Ｅｒｋ、リン酸化Ｅｒｋに対する一次抗体と共にインキュベートした。膜上の抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次マウス抗ヤギおよび抗ウサギ抗体で検出した。膜を、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のマニュアルに従って、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ持続時間延長型基質によって分析した。
免疫細胞化学
細胞を室温で１０分間４％ＰＦＡで固定し、続いてＰＢＳで洗浄し、ＳＯＤ１、６７ＬＲに対する抗体と共に一晩インキュベートした。そして、染色された細胞を洗浄し、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ連結ＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共にインキュベーションした。核ＤＮＡをＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で染色した。
細胞遊走アッセイ
遊走アッセイを、８μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＩＮＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して行った。無血清培地中のＮ２Ａ細胞を、２４ウェル遊走プレートの上部チャンバに播種した。下部チャンバに、１０％ＦＢＳを含む４００μＬのＤＭＥＭを充填した。２４時間後、上部チャンバを室温にて１０分間１０％ＰＦＡで固定し、続いてクリスタルバイオレットで染色した。次いで、遊走した細胞を計数した。
細胞生存率アッセイ
ＭＴＴアッセイのために、５×１０４細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、特定の分子で２４時間処置した。適切なインキュベーション後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１５μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートした。溶液を除去し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加して不溶性ホルマザン沈殿物を溶解し、プレートリーダーによって６２０ｎｍで吸光度を測定した。
細胞成分分画
ＫＡＲＳ１の細胞局在化を判定するために、細胞成分分画キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してサイトゾル画分および膜画分を回収した。簡潔には、細胞を溶解し、４℃で１０分間、１，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をサイトゾル画分として使用した。次いで、ペレットを洗浄し、デオキシコール酸ナトリウム緩衝液と共に４℃で１０分間インキュベートし、膜画分として使用した。
細胞の付着強度試験
ＳＯＤ１ Ｇ９３ＡおよびＤＸ２でトランスフェクトされたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、９６ウェルｅプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に播種し（１．０×１０４細胞／ｍＬ）、ＴＮＦ－αで２４時間処置して細胞付着をスクリーニングした。次いで、付着した細胞をｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって計数した。
実施例９．２．結果
ミトコンドリア形態のＫＡＲＳが、変異形態のＳＯＤ１と相互作用し、変異型ＳＯＤ１およびｍｉｔｏＫＡＲＳが、ミトコンドリア形態異常および細胞毒性をもたらすことが以前に報告されている。したがって、ＫＡＲＳがＳＯＤ１変異によって神経系細胞死を調節できるかどうかを調べるために、本発明者らはまず、変異型ＳＯＤ１およびＫＡＲＳの結合効率を確認した。実験のために、ＷＴ ＳＯＤ１、ＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ、ＳＯＤ１ Ｇ８５ＲおよびＫＡＲＳを調製し、ＫＡＲＳおよび各ＳＯＤ１の間の相互作用を酵母ツーハイブリッド（図１６Ａ）および免疫沈降分析（図１６Ｂ）によって分析し、本発明者らは、ＫＡＲＳがＷＴ ＳＯＤ１よりもはるかに強い結合で変異型ＳＯＤ１に結合することを観察した（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。
次に、ＫＡＲＳおよび変異型ＳＯＤ１の特異的結合部位を研究するために、本発明者らは、酵母ツーハイブリッドアッセイ系を使用して、切断型ＫＡＲＳおよび変異型ＳＯＤ１の相互作用を確認した。図１６Ｃに示すように、ＫＡＲＳのＮ末端でＫＡＲＳおよび変異型ＳＯＤ１の結合が観察された。ＡＩＭＰ２および６７ラミニン受容体が、癌細胞の遊走および細胞生存の調節のためにＫＲＳのＮ末端で相互作用することが示されている。ＡＩＭＰ２、６７ＬＲおよび変異型ＳＯＤ１はＫＡＲＳのＮ末端に結合するので、本発明者らは、ＫＡＲＳおよび変異型ＳＯＤ１の相互作用がＡＩＭＰ２および６７ＬＲへのＫＡＲＳの結合に影響するかどうかを調べた。図１６Ｄに示すように、ＡＩＭＰ２および６７ＬＲは、ＷＴ ＳＯＤ１の存在下でＫＡＲＳに結合したが、変異型ＳＯＤ１の存在下では、ＡＩＭＰ２および６７ＬＲへのＫＡＲＳの結合の減少が観察された。結果は、変異型ＳＯＤ１が、ＫＡＲＳのＮ末端の結合競合により、ＡＩＭＰ２および６７ＬＲへのＫＡＲＳの結合を減少させたことを示した。
本発明者らは、変異型ＳＯＤ１ Ｇ９３ＡがＫＡＲＳへの最良の結合を有したことを示したので、本発明者らは、６７ＬＲに対するその効果を調査し、それが神経性細胞死と相関するかどうかを調査したいと考えた。本発明者らが変異型ＳＯＤ１をＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞にトランスフェクトしたとき、本発明者らは６７ＬＲのレベルが低下したことを見出すことができた（図１７Ａ）。
６７ＬＲの発現位置を確認するために、本発明者らは、変異型ＳＯＤ１でトランスフェクトされた細胞においてＩＦ（免疫蛍光）を行った。ＫＡＲＳレベルは膜よりも細胞質に濃縮されており、膜領域からは高度に減少していることが示された（図１７Ｂ）。
ＫＡＲＳが６７ＬＲを介して細胞の遊走を誘導することが以前に示されている。細胞をＳＯＤ１野生型または変異型ＳＯＤ１でトランスフェクトした場合、細胞遊走は、野生型ＳＯＤ１と比較して、変異型ＳＯＤ１で抑制された（図１７Ｃ）。
変異型ＳＯＤ１は６７ＬＲの発現に影響を及ぼすので、本発明者らはラミニンのシグナル伝達経路に対するその影響を調査し、本発明者らは、変異型ＳＯＤ１がｐＥＲＫ活性を高度に低下させることを確認できた（図１７Ｄ）。
本発明者らはまた、変異型ＳＯＤ１の発現がＫＡＲＳおよび６７ＬＲの間の結合親和性に影響を及ぼすかどうかを調べた。図１７Ｅでは、本発明者らは、変異型ＳＯＤ１の発現によるＫＡＲＳおよび６７ＬＲの相互作用の低下を観察した。
アノイキスは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および細胞膜タンパク質の間の接触の喪失によって引き起こされる一種のアポトーシスであり、アノイキスの耐性は、細胞生存において重要な役割を果たす。また、アノイキスを誘導するために、細胞を変異型ＳＯＤ１およびＫＡＲＳでコトランスフェクトし、懸濁条件でＴＮＦ－α／ＣＨＸありまたはなしでインキュベートした。その結果、本発明者らは、細胞死がＫＡＲＳの過剰発現によって回復しなかったことを観察した（図１７Ｆ）。この結果は、ラミニン受容体による細胞死の調節が、ラミニン受容体およびＥＣＭの相互作用を介した下流シグナル伝達の増加に起因することを示唆した。
本発明者らは、ＤＸ２が変異型ＳＯＤ１誘導性６７ＬＲ発現にとって重要な役割であるかどうかを試験した。ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞をＳＯＤ１ ＷＴおよびＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ変異遺伝子にトランスフェクトし、次いで、一方の群をアポトーシス促進性ＡＩＭＰ２遺伝子でトランスフェクトし、他方の群を抗アポトーシスＤＸ２遺伝子でトランスフェクトした。ＤＸ２の存在下で、本発明者らは、ＡＩＭＰ２の過剰発現による６７ＬＲタンパク質の減少が回復したことを観察した（図１８Ａ）。
次いで、本発明者らは、変異型ＳＯＤ１によって原形質膜で低下した６７ＬＲの発現がＤＸ２遺伝子によって回復するかどうかを確認した。変異型ＳＯＤ１を発現する細胞におけるＤＸ２の過剰発現は、細胞膜における６７ＬＲタンパク質を増加させ（図１８Ｂ）、本発明者らはまた、６７ＬＲの下流シグナルがＤＸ２遺伝子導入によってリカバーされることを観察した（図１８Ｃ）。
次に、本発明者らは、ＴＮＦ－αで処置、続いてＥＶ、変異型ＳＯＤ１および変異型ＳＯＤ１＋ＤＸ２のトランスフェクション後の細胞の剥離を試験した。ＤＸ２の処置は、細胞の剥離およびアノイキスを防止した（図１８Ｄ）。
本発明者らは、変異型ＳＯＤ１による神経系細胞死に対するＤＸ２の効果を確認した。ＡＡＶ－ＤＸ２をＷＴ ＳＯＤ１または変異型ＳＯＤ１を過剰発現する細胞に形質導入した場合、本発明者らは、変異型ＳＯＤ１によって誘導されたアポトーシスが対照レベルまで減少したことを観察した（図１９Ａ）。ＣＨＸ／ＴＮＦ－α処置によって誘導されたＷＴおよび２つの変異体Ｇ８５ＲおよびＧ９３Ａの細胞死率は、ＧＦＰに感染した細胞でそれぞれ約２０％増加した。しかしながら、ＤＸ２に感染した細胞におけるＣＨＸ／ＴＮＦ－α処置による細胞死率は、ＧＦＰを形質導入した細胞の細胞死率よりも約２０％低く、有意差があった（ｐ＜０．００１）。
また、ＤＸ２の過剰発現によるＣＨＸ／ＴＮＦ－α誘導性細胞死の減少も、初代ニューロンにおいて示された。ＤＸ２を過剰発現するＡＡＶを、野生型またはＳＯＤ１トランスジェニックマウスから抽出した初代神経性細胞に感染させ、トランスフェクトされた細胞をＣＨＸ／ＴＮＦ－αで処置し、細胞死率を分析した。Ｇ９３Ａの初代神経性細胞はＣＨＸ／ＴＮＦ－αの処置条件で細胞死を増加させたが、ＤＸ２はＣＨＸ／ＴＮＦ－αで処置されたＷＴおよびＧ９３Ａ初代神経性細胞で細胞死を大幅に減少させたことが示された（図１９Ｂ）。
実施例１０
以前の研究では、ＡＩＭＰ２がパーキンの基質として作用し、ＰＡＲＰ－１と相互作用し、この相互作用がＰＤにおける神経系細胞死を調節することが示されている（Ｌｅｅ ２０１３）。したがって、ＤＸ２がＡＩＭＰ２の競合的阻害剤であり、神経系細胞死を調節するかどうかを調べるために、本発明者らはまず、ＰＡＲＰ－１およびＡＩＭＰ２またはＤＸ２の間の結合アッセイを行った。ＰＡＲＰ－１、ＡＩＭＰ２、およびＤＸ２の発現を、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における各プラスミドのトランスフェクションによって誘導し、続いて、ＰＡＲＰ－１プルダウンアッセイ（図２０Ａ）の分析を行った。細胞をＥＶ（エンプティベクター）、ＡＩＭＰ２、およびＤＸ２でトランスフェクトし、２４時間後、トランスフェクトされた細胞を１０μＭのＨ２Ｏ２と共に４時間インキュベートした。切断されたＰＡＲＰ－１レベル（図２０Ｂ）およびＰＡＲｌｙａｔｉｏｎ（図２０Ｃ）を、免疫ブロットアッセイを使用して調べた。酸化ストレス誘導性細胞損傷条件では、ＤＸ２は、細胞死に関連するＰＡＲＰ－１の切断（図２０Ｂ）およびＰＡＲｙｌａｔｉｏｎ（図２０Ｃ）を減弱させる。
図２０Ａに示すように、本発明者らは、ＤＸ２がＡＩＭＰ２よりも強くＰＡＲＰ－１に結合することを見出した。ＡＩＭＰ２およびＤＸ２が酸化ストレス条件下でＰＡＲＰ－１の切断に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、本発明者らは、エンプティ対照（ＥＶ）、ＡＩＭＰ２またはＤＸ２を発現するベクターでそれらをトランスフェクトし、次いで過酸化水素で処置した。ＡＩＭＰ２でトランスフェクトされた細胞は、酸化ストレス条件下で他のトランスフェクトされた細胞で見られる発現と比較した場合、ＰＡＲＰ－１の切断の有意な増加を示した。しかしながら、ＰＡＲＰ－１の切断は、ＤＸ２でトランスフェクトされた細胞では観察されなかった（図２０Ｂ）。
ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎは翻訳後プロセスであり、ＤＮＡ損傷応答およびアポトーシスなどの生物学的事象を調節する（Ｓｚａｂｏ １９９６およびＶｉｒａｇ（１９９８）。ＰＡＲＰ－１は、核内の損傷ＤＮＡを認識し、ＰＡＲ鎖を形成し、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎにより損傷タンパク質の分解を誘導する酵素である。ＰＡＲｌｙｌａｔｉｏｎ、すなわちＰＡＲポリマーの形成は、切断されたＰＡＲＰ－１の触媒活性を必要とするので（Ｂａｒｋａｕｓｋａｉｔｅ ２０１５）、本発明者らは、ＰＡＲｙｌａｔｉｏｎに対するＡＩＭＰ２またはＤＸ２の効果を調査した。図２０Ｃに示すように、ＡＩＭＰ２のＰＡＲｙｌａｔｉｏｎはＨ２Ｏ２の存在下で増加したが、ＤＸ２のＰＡＲｌｙｌａｔｉｏｎは変化しなかった。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ＤＸ２が酸化ストレス誘導性ＰＡＲＰ－１切断の阻害性分子であると結論付ける。
実施例１１
神経筋接合部損傷のＤＸ２阻害
運動ニューロンは、脳および筋肉の間のコミュニケーションに不可欠であり、モビリティのための重要な命令を送信する。これらの神経細胞が機能不全または損傷すると、それらは筋肉とのコミュニケーションを徐々に停止し、脳は自発的運動を制御および開始する能力を失う。これは、全身の随意骨格筋の進行性衰弱、筋単収縮（線維束性攣縮）、および萎縮をもたらす。さらに、骨格筋の脱神経をもたらすＮＭＪの変性は、ＡＬＳの発症において必須な役割を果たすと考えられている。筋単収縮／線維束性攣縮および呼吸不全は、典型的には、ＡＬＳにおいて発症から２～３年以内に起こる。疾患の最終段階では、これは致命的な麻痺および呼吸不全による死につながる。
筋肉を４℃にて４％ＰＦＡで一晩固定した。筋肉を３０％スクロースで脱水し、組織凍結切片のためにＯＣＴ化合物で包埋した。すべての筋肉凍結切片試料を、厚さ２０μｍの神経筋接合部含有切片から取得した。
厚さ２０μｍの凍結切片を１ＸＰＢＳ中で２回（各５分間）洗浄し、次いで、室温にて１時間ブロッキング溶液（５％ＢＳＡ）中でインキュベートした。
ＢＳＡを吸引し、切片を、ニューロフィラメント（ｎｅｕｒｏｆｌｉａｍｅｎｔｓ）（抗ニューロフィラメント＋抗２Ｈ３、ＳＶ２を使用して緑色に染色）およびシナプス後アセチルコリン受容体＿ＡＣｈＲ（蛍光α－ブンガロトキシンコンジュゲートを使用して赤色に染色）に対する一次抗体と共に、ブロッキング溶液中、室温で一晩インキュベートした。部分的に神経支配されたまたは完全に脱神経されたシナプス後受容体部位、断片化されたまたは収縮したシナプス後受容体、萎縮した軸索または終末、および膨潤したまたはジストロフィーの軸索または終末を含む、いくつかの欠陥が容易に観察され得る。
免疫蛍光ＲＯＩセットおよび重複係数測定値をＩｍａｇｅ Ｊで測定した。
これに基づいて、野生型（ＷＴ）、ＡＬＳ誘導性モデル（ＡＡＶ－ＧＦＰ）、およびＡＬＳ誘導性モデル（ＧＯ１０２）の各群における骨格筋の脱神経を、α－ブンガロトキシンおよびＳＶ２、２Ｈ３の腓腹筋の二重染色によって測定した。
図２２Ａでは、神経筋接合部をα－ブンガロトキシンで染色し、シナプス小胞およびエンドプレートをＳＶ２および２Ｈ３で染色した。図２２Ｂでは、神経支配されたエンドプレートの数を計数して表した。
ＧＯ１０２は、ＡＬＳ疾患モデルにおいて観察される神経支配されたエンドプレート（７５．６±１２．６対４１．０±２．０３％）の減少した％を改良した。
総合すると、ＤＸ２は神経筋接合部（ＮＭＪ）損傷を阻害し、ＤＸ２は、ＮＭＪブロック誘導性呼吸不全および筋単収縮または線維束性攣縮を回復させると予想される。
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具体的な実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにし得るので、他の者は、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、当該分野の技術の知識を適用することによって、様々な適用のために容易に改変および／または適合させることができる。したがって、そのような適合および改変は、本明細書に提示されている教示およびガイダンスに基づき、開示されている実施形態の均等物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書の表現または用語は、本明細書の用語または表現が教示およびガイダンスに照らして当業者によって解釈されるように、限定ではなく説明を目的とするものであることを理解されたい。
本発明の広がりおよび範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
本明細書に記載の様々な態様、実施形態、およびオプションのすべては、ありとあらゆる変形形態で組み合わされ得る。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (30)

  1. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象の疾患発症を遅延させる方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  2. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象の神経系細胞死を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  3. 筋萎縮症の処置を必要とする対象において筋萎縮症を処置する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  4. 前記対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する、請求項４に記載の方法。
  5. 前記対象が脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する、請求項４に記載の方法。
  6. パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象の生存率を向上または生存期間を延長する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  7. パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象における行動欠陥を予防する、運動症候を回復させる、および／または神経系損傷を軽減する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  8. アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象におけるアミロイドβオリゴマー（Ａβ－Ｏ）誘導性神経系細胞死またはＡβ－Ｏ誘導性ｐ５３発現を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  9. 脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する対象における神経筋接合部（ＮＭＪ）損傷を阻害する方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  10. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象における神経筋接合部（ＮＭＪ）損傷の阻害、ＮＭＪブロック誘導性呼吸不全、呼吸困難の阻害、ＮＭＪブロック誘導性筋単収縮または線維束性攣縮の阻害の方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  11. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）を有する対象におけるアノイキスを抑制する、および／またはラミニン受容体安定化を増大させる方法であって、エクソン２欠失ＡＩＭＰ２バリアント（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子を含む組換えベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  12. 前記ベクターがｍｉＲ－１４２標的配列をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ベクターが、前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記プロモーターが、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣａＭＫＩＩプロモーター、Ｈｂ９プロモーター、またはオプシンプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号１０または１１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子が、配列番号１０または１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むエクソンを有しない、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列がＡＣＡＣＴＡを含む、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５のうちの１～１７個の追加の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２～１９に記載の方法。
  22. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、配列番号５（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列がＡＣＴＴＴＡを含む、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７のうちの１～１５個の追加の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２～１９に記載の方法。
  26. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が、配列番号７（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ｍｉＲ－１４２標的配列が２～１０回繰り返される、請求項１２～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、トリ肉腫／白血病（ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスのベクターである、請求項２９に記載の方法。
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