KR20210116559A

KR20210116559A - 중추신경계 질환의 치료 방법

Info

Publication number: KR20210116559A
Application number: KR1020217025950A
Authority: KR
Inventors: 숙희 방; 정근 송; 승욱 신; 관희 이; 호준 이
Original assignee: 엘앤제이바이오 주식회사
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-09-27
Also published as: WO2020150725A1; EP3911348A4; US20200230218A1; AU2020210033A1; CA3126941A1; EP3911348A1; JP2022518729A

Abstract

본 출원은 치료를 필요로 하는 대상체의 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1 단백질을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효 용량을 전신 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 융합 폴리펩타이드는 (a) 제1 단백질; (b) 생체내에서 연장된 순환-수명(circulation-lifetime)을 제공하는 제2 단백질; 및 (c) 혈액 뇌 장벽 횡단(blood brain barrier crossing) 촉진 펩타이드를 포함하며; 상기 융합 폴리펩타이드는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 횡단하는 것인 방법을 개시한다.

Description

중추신경계 질환의 치료 방법

본 발명은 일반적으로 알츠하이머병과 같은 중추신경계 질환을 치료하기 위한 이중 작용 치료 시스템에 관한 것이다.

알츠하이머병(AD)은 뉴런의 점진적인 손실을 특징으로 하는 전 세계적으로 가장 흔한 신경퇴행성 질환 중 하나이며, 이는 전형적으로 기억 및 학습을 비롯한 인지 기능의 심각한 손상을 야기한다. AD의 병리학적 특징으로는 세포외 아밀로이드 플라크의 존재 및 뇌에서 신경원섬유 엉킴(neurofibrillary tangle: NFT)의 형성을 포함하며, 결과적으로 신경 기능장애 및 세포사멸을 초래한다. AD 치료제 개발의 가장 큰 과제 중 하나는 충분한 혈액뇌장벽(blood-brain barrier: BBB) 침투를 달성하는 것이다(Banks, 2016). BBB는 혈액과 뇌 사이의 분자, 이온 및 세포의 트래픽(traffic)을 조절하는 보호 계면이다(Patabendige, 2013). 다른 분자, 예컨대, 항체와 같은 생물학적 제제는 크기가 커서 BBB를 효율적으로 통과할 수 없다. 임상적으로, 지금까지 치료 단백질을 주요 뇌 장애를 치료하기에 충분한 양으로 BBB를 따라 침투를 향상시키려는 시도는 성공적이지 않았다(Gabathuler, 2010). 이로써, AD와 같은 CNS 질환에 생물학적 제제를 사용하는 것은 매우 어려운 일이다. 최근에, 다양한 치료 BBB 담체가 CNS 질환을 위해 개발되었고(Malakoutikhah, 2011), 예컨대, 화학 전달 시스템(Brewster, 1997; Carelli, 1996), 담체 매개 수송(Manfredini, 2002; Gynther, 2008; Gynther, 2009), 및 분자 트로이 목마(Boado, 2007; Boado, 2008; Boado, 2009; Boado, 2013)가 있다. 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide: CPP) 매개 약물 전달은 뇌 전달을 향상시키는 한 가지 방법이다. 생체내 설치류에 대한 연구에서는 가장 잘 알려진 CPP인 HIV-1 트랜스 활성화 전사체(trans-activating transcriptor: TAT)와 생체분자의 접합이 BBB를 통해 생체거대분자(biomacromolecule)의 전달을 촉진할 수 있는 작제물(construct)을 생성한다는 것을 밝혀냈다(Cao, 2002; Kilic, 2002; Banks, 2005).

그러나, 이들 전달 시스템의 치료 효능은 제한된 침투 및 유지 능력으로 인해 만족스럽지 않다. 질환이 있는 구역의 약물 농도는 치료 임계값보다 훨씬 낮다. 이러한 문제를 해결하기 위해 수용체 매개 BBB 전달 시스템이 BBB 침투 효능을 촉진하는 강력한 전략으로서 간주되었다. 많은 연구자들은 BBB 세포막에서 과발현되어 치료법에 필요한 농도로 뇌에 접근하게 되는 특정 수용체를 찾는 데 초점을 맞추었다(Wang, 2017).

최근에, 전임상 및 임상 연구에서 새로운 생물학적 제제는 뇌에 들어가서 아밀로이드 베타 플라크를 수축시키는 것으로 나타났다(Sevigny, 2016; Reiman, 2016; Chang, 2017). 생물학적 제제가 AD 치료제로서 눈에 띄는 접근법이 되면서 뇌로의 전달을 촉진하는 새로운 전략이 필요하다. 내인성 수송 시스템의 사용은 뇌로 약물을 전달하는 미개척 전략이다(Banks, 2012).

알츠하이머병(AD)은 미스폴딩된 아밀로이드-β(Aβ) 펩타이드의 세포외 침착 및 신경원섬유 엉킴(neurofibrillary tangle, NFT, 포스포-타우(phosphor-Tau) 또는 p-타우)의 세포내 형성을 특징으로 하지만, 이러한 병리학적 이벤트(event)를 낮추기 위한 전략은 여전히 달성하기 어렵다. 알츠하이머병(AD) 약물 개발은 대부분의 치료제가 혈액으로부터 뇌로 효율적으로 흡수되는 것을 방해하는 혈액뇌장벽(BBB)의 존재로 인해 제한적이다. 본 발명자들은 Aβ 및 NFT(p-타우)를 낮추기 위해, BBB 침투성 세포 투과 펩타이드(CPP, dTAT)를 함유하는 치료 단백질로서 인간 혈청 알부민(HSA) 융합 플랫폼을 개발하였다.

미세소관(microtubule) 관련 타우 단백질은 미세소관의 형성 및 안정화에 참여하는 것으로 생각된다(Spillantini, 2013; Lee, 2001). 타우는 인단백질로 존재하며, 건강한 성인의 뇌에서도 타우는 적어도 최소한으로 인산화되어 있지만(Seubert, 1995), AD를 구별하는 것은 타우 단백질을 따라 441개의 특정 아미노산 서열 중 19개의 인산화 범위와 일관성으로서, 이는 AD 뇌에서 특별한 인산화 시그니처 및 포스포(phospho)-타우의 더 큰 부담(burden)을 초래한다(Augustinack, 2002; Neddens, 2018; Medina, 2015). AD와 건강한 성인 뇌 사이의 포스포-타우 부담의 차이 크기는 타우 1몰당 인산염의 몰 수가 3 내지 4배 증가한 것으로 보고되었다(Ksiezak, 1992). 쌍을 이룬 나선형 필라멘트(paired helical filament, PHF)로 조립되는 과인산화된 형태의 타우로 이루어진 신경원섬유 엉킴(NFT)은 AD의 사후 Braak 병기결정 시스템에 적절한 병리학적 특징이다(Braak 및 Braak, 1995; Grundke-Iqbal, 1986; Kosik, 1986; Lee, 1991; Braak, 1995). 엉킴은 임상 증상학에 의해 부위적 및 정량적으로 상관관계가 있는 것으로 입증된 AD의 유일한 병리학적 소견이다(Arriagada, 1992; Braak, 1991; Goedert, 1993; Ballatore, 2007).

타우 발현은 무수(non-myelinated) 피질 축삭, 특히 해마를 포함하는 변연 피질과 같은 기억 응고화(memory consolidation)에 관여하는 뇌 영역에서 높다(Trojanowski, 1989). 타우의 과인산화는 이 단백질이 미세소관에서 분리되도록 하여 미세소관을 불안정하게 하고 축삭 수송을 손상시킨다(Bramblett, 1993; Ishihara, 1999). 타우의 인산화 및 탈인산화는 단백질 키나제, 예컨대, GSK3β, cdK5, Akt/PKB, PKA, ERK1/2, AMPK, 및 포스파타제, 예컨대, PP1, PP2A 및 PP5의 활성의 평형에 의해 조절된다(Ballatore, 2007; Chung, 2009; Wang, 2007).

AMP-활성화 단백질 키나제(AMPK)는 세포내 마스터 에너지 센서 및 대사 조절인자이다. AMPK는 해당과정 흐름(glycolytic flux)과 미토콘드리아 생물속생설(biogenesis)의 조절을 통해 세포 에너지 항상성에 관여한다(Hardie, 2011). 포유류 AMPK는 촉매성 α 서브유닛(α1 및 α2 동형체)와 조절성 β(β1 및 β2) 및 γ(γ1, γ2, γ3) 서브유닛으로 조립된 이종삼량체 복합체이다. AMPK는 대사의 세포 조건과 이의 상류 키나제에 의해 활성화되고, 여러 포스파타제 중 하나에 의해 저해된다. 증가된 세포질 AMP 및 칼슘 수준은 뉴런의 AMPK 신호전달의 주요 활성인자이다(Nakamura, 2001; Salminen, 2011; Steinberg, 2009). AD의 발병에서 대사 기능장애와 AMPK 활성은 타우 인산화와 아밀로이드생성의 조절인자인 것으로 보고되었다(Thornton, 2011; Vingtdeux, 2011). 또한, 마우스 1차 뉴런에서 내인성 AMPK 활성화는 여러 부위에서 타우 인산화의 증가를 유도했으며, 여기서 AMPK 저해는 타우 인산화를 신속하게 감소시켰다(Domise, 2016).

PP2A는 타우 인산화 과정에서 가장 중요한 포스파타제이며; 정상 조건에서 이의 저해는 타우의 과인산화와 관련이 있다. PP2A의 생체내 활성은 내인성 저해 단백질인 저해제 2(I2PP2A, SET로도 알려짐)에 의해 하향 조절된다(Li, 1996). AD 뇌에서, 리소좀의 아스파라긴 엔도펩티다제(AEP)는 I2PP2A 단백질(전체 길이 약 39kDa)을 약 20kDa의 활성 단편으로 절단한다(Rosenmann, 2014; Basurto-Islas, 2013). PP2A 활성은 활성화된 I2PP2A 단편과 PP2A의 촉매성 서브유닛의 상호작용에 의해 저해된다(Arnaud, 2011). 또한, I2PP2A 단편은 PP2A 활성의 저해를 담당하고 타우의 비정상적인 과인산화를 증가시키는 것으로 보고되었다(Basurto-Islas, 2013).

본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적은 본 발명의 다음 설명, 여기에 첨부되는 참조 도면 및 여기에 첨부되는 청구범위로부터 더욱 완전하게 이해될 것이다.

일 양상에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체의 중추신경계의 단백질 결핍을 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 상기 대상체에게 (a) 뇌에서의 부족이 알츠하이머병과 상관관계가 있는 제1 단백질; (b) 생체내에서 연장된 순환-수명(circulation-lifetime)을 제공하는 제2 단백질 및 (c) 혈액 뇌 장벽 횡단(crossing) 촉진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효 용량을 전신 투여하는 단계를 포함하되; 여기서 융합 폴리펩타이드는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 횡단한다. 제1 단백질의 아미노산 서열은 제2 단백질의 아미노산 서열에 공유 결합될 수 있다. 제2 단백질의 아미노산 서열은 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드에 절단 가능하게 공유 결합될 수 있다. 공유 결합은 pH의 변화에 의해 절단될 수 있고, 또는 도입된 절단 부위는 글리실 페닐알라닐 류실 글리신(GFLG)일 수 있다. 일 양상에서, 치료적 유효 용량은 적어도 약 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중일 수 있다.

다른 양상에서, 제1 단백질은 뇌에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키는 단백질 및/또는 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 단백질일 수 있다. 대안적으로, 제1 단백질은 뇌에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키고 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 이중 기능의 단백질을 보유할 수 있다.

상기 논의된 본 발명에 따른 일 양상에서, 제1 단백질은 시스타틴(Cystatin) C, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질-1 클러스터 IV(LRP1-C4), 최종 당화 산물(advanced glycation end product)에 대한 가용성 수용체(sRAGE), RAGE-v, 또는 미엘린 염기성 단백질(MBP)일 수 있다. 특히, 제1 단백질은 시스타틴 C 또는 RAGE-v일 수 있다. 더욱 특히, 제1 단백질은 시스타틴 C일 수 있다.

또 다른 양상에서, 제2 단백질은 인간 혈청 알부민일 수 있다.

또 다른 양상에서, 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드는 dTAT일 수 있다.

또 다른 양상으로서, 상기 논의된 방법에서, 제1 단백질은 내후각피질 또는 해마에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키고/시키거나 내후각피질 또는 해마에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 단백질일 수 있다.

특히, 제1 단백질로서 뇌에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키는 단백질을 포함하는 융합 단백질은 제1 단백질로서 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 단백질을 포함하는 융합 단백질과 동시 투여 또는 순차적으로 투여된다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체의 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 상기 대상체에게 내후각 피질 또는 해마에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키는 제1 단백질, 및 내후각 피질 또는 해마에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 제2 단백질을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효 용량을 전신 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 융합 폴리펩타이드는 생체내 연장된 순환-수명을 제공하는 단백질 및 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드를 포함하며; 융합 폴리펩타이드는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 횡단한다. 상기 논의된 방법에서, 생체내 연장된 순환-수명을 제공하는 단백질의 아미노산 서열은 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드에 절단 가능하게 공유적으로 결합된다. 공유 결합은 pH의 변화에 의해 절단될 수 있고, 또는 도입된 절단 부위가 글리실 페닐알라닐 류실 글리신(GFLG)일 수 있다. 상기 논의된 방법에 따른 일 양상에서, 치료적 유효 용량은 인간 체중의 1kg 당 적어도 약 1 내지 10㎎일 수 있다. 질병은 알츠하이머병일 수 있다. 특히, 제1 단백질은 시스타틴 C, 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질-1 클러스터 IV(LRP1-C4), 최종 당화 산물에 대한 가용성 수용체(sRAGE), RAGE-v 또는 미엘린 염기성 단백질(MBP)일 수 있다. 또 다른 양상에서, 상기 논의된 본 발명에 따르면, 제2 단백질은 Cystatin C, Pten-long, PDZ 도메인이 결실된 Pten-long, TFEB, 또는 SIRT1일 수 있다. 생체내에서 연장된 순환-수명을 제공하는 단백질은 인간 혈청 알부민일 수 있다. 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드는 dTAT일 수 있다. 그리고, 제1 단백질은 특히 시스타틴 C 또는 RAGE-v일 수 있다.

본 발명은 이하 본 명세서에 제시된 상세한 설명, 및 단지 예시의 목적으로 제공되어 본 발명을 제한하지 않는 첨부 도면으로부터 더 완전히 이해될 것이다:
도 1은 인간 혈청 알부민 융합 단백질 버전(Version) 1 또는 2를 발현하는 pOptivec/HSA-융합 플라스미드의 작제물을 나타낸다. 이중시스트론성 pOptivec/HSA-융합 플라스미드는 HSA 융합 단백질 버전 1(또는 2) 및 선택 마커 DHFR을 함유한다. 클로닝 절차에 사용되는 제한 부위는 이탤릭체로 표시된다.
도 2는 β-아밀로이드 플라크 또는 타우 엉킴을 저하시키기 위한 MOA(작용 메커니즘) 단백질; GS 링커[GGSAS(서열번호 1) 또는 GGGSGGGS(서열번호 2)]; HSA(인간 혈청 알부민); 절단 가능한 링커(GFLG)를 포함하는 HSA 융합 단백질(버전 1)의 개략도를 나타낸다; 수평선은 CPP(세포 투과성 펩타이드)이다. AL04(80kDa)의 개략적인 예시는 MOA로서 시스타틴 C, HSA, 및 CPP로서 변형된 TAT 펩타이드를 함유한다. 박스 위의 숫자는 융합 단백질의 N-말단에서부터의 아미노산 번호를 표시한다.
도 3은 HSA 융합 단백질(버전 2, AL06 내지 AL10)의 개략도를 나타낸다. β-아밀로이드 플라크 또는 타우 엉킴을 저하시키기 위한 MOA 단백질(MOA1 또는 MOA2); GS 링커(GGSAS 또는 GGGSGGGS); 인간 혈청 알부민(HSA); 절단 가능한 링커[GFLG(서열번호 3) 또는 GFLGGGGSA(서열번호 4)]; 세포 투과성 펩타이드(CPP). AL06(145kDa), AL07(135kDa), AL08(129kDa), AL09(144.5kDa), AL10(156kDa)의 개략도는 MOA1로서 RAGE-V 또는 RAGE-V-C1; MOA2로서 Pten-long, PDZ 도메인이 결실된 Pten-long 또는 TFEB, SIRT1; 담체로서 HSA; 및 CPP로서 변형된 TAT 펩타이드를 함유한다: 상자 위의 숫자는 AL04의 N-말단에서부터의 아미노산 번호를 표시한다.
도 4는 HSA 융합 단백질(버전 2.1, AL12)의 개략도를 나타낸다. 작제물은 베타-아밀로이드 플라크(MOA1) 또는 타우 엉킴(MOA2)을 저하시키기 위한 작용 메커니즘 단백질; GS 링커(GGGSGGGS); 인간 혈청 알부민(HSA); 절단 가능한 링커(GFLGGGGSAS); 세포 투과성 펩타이드(CPP)를 포함한다. AL12(88kDa)의 개략적인 예시는 MOA1로서 RAGE-V; 담체로서 HSA; MOA2로 SIRT1-엑손4, 및 CPP로서 변형된 TAT 펩타이드를 함유한다. 상자 위의 숫자는 각 HSA 융합 단백질의 N-말단에서부터의 아미노산 번호를 표시한다.
도 5는 정제된 AL04(80kDa), AL07(135kDa), AL08(129kDa) 및 AL12(88kDa)의 SDS-PAGE(a) 및 웨스턴 블롯(b)에 의한 특성화를 나타낸다. 정제된 샘플을 환원 조건 하에 4 내지 12% 구배 겔에서 진행시켰다. (a) 겔은 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색했다. (b) 각 단백질을 함유하는 구배 겔은 정제된 항-인간 혈청 알부민 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 위해 PVDF 막으로 전이시켰다.
도 6A 및 도 6B는 AL04가 미분화 PC-12 세포에 대해 Aβ1-42-유도된 세포 사멸을 약화시킨다는 것을 도시한다. 미분화 PC-12 세포에 대한 AL04의 비특이적 세포독성(A), AL04(CysC-HSA-TAT)(0.01μM)의 존재 또는 부재(대조군) 하에 PC12 세포를 10μM Aβ1-42에 72시간 동안 노출시켰다(B). 세포 생존율은 WST-8(수용성 테트라졸륨 염) 환원 검정으로 평가하였다.
도 7은 AL04가 분화된 PC12 세포에 대해 Aβ1-42-유도된 세포 사멸을 약화시킨다는 것을 도시한다. 세포는 AL04의 존재 또는 부재 하에 가용성 또는 응집성(노화된) Aβ1-42로 3일 동안 처리되었다. 세포 생존율은 WST-8(수용성 테트라졸륨 염) 환원 검정으로 평가하였다. ^*가용성 Aβ1-42, DPBS 완충액 중의 Aβ1-42 펩타이드; ^** 응집성 Aβ1-42, Aβ1-42 용액을 37℃에서 3일 동안 노화시킴.
도 8은 인간 BBB 모델을 사용한 AL04 BBB 투과성의 평가를 도시한다. (A) 120분에 1 및 10 uM의 AL04 및 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 사용하여 평가한 용량 의존적 투과성. (B) 3개의 시간 코스(60, 120, 240분)에서 AL04의 투과성을 비교함.
도 9A 및 도 9B는 HSA-융합 단백질이 용량 의존적 방식으로 세포 내로 침투함을 도시한다. PC12 세포는 1% 말 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 100 ng/㎖ NGF에 의해 분화되었다. 4일 후, NGF 고갈된 PC12 세포를 다양한 농도(1 내지 5 ug/㎖)의 AL04(A) 또는 AL12(B)로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 빙랭한 DPBS(pH 7.5)에서 2회 헹구고 용해시켰다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 처리한 후, 시스타틴 C(AL04) 또는 항-인간 혈청 알부민(AL12)에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행했다.
도 10은 작제물을 위한 담체 단백질과 세포 투과 단백질의 선택을 도시한다. "*"는 CHO-S 세포에서 웨스턴 블롯에 의해 결정된 융합 단백질의 일시적 발현 및 완전성을 나타내며; "**"는 CHO-DG44 세포에서 MTX(2000nM) 증폭으로부터의 SDS-PAGE에 의해 결정된 융합 단백질의 안정적 발현을 나타낸다. Fc-융합 단백질은 Fc 영역을 통해 이량체를 형성하였다.
도 11은 잠재성이 있는 치료제 개발을 위한 이중 작용 치료제(버전 1, 2 및 2.1)의 요약을 도시한다.
도 12A 및 도 12B는 PC12 세포에서 HSA-융합 단백질 처리에 의한 NGF 고갈된 하이퍼포스포(hyperphospho) 타우의 저하 수준을 도시한다. (A) NGF 고갈된 PC12 세포를 24시간 동안 AL04, AL07 또는 AL08로 처리 시, 포스포-타우(Ser 202/Thr205), 포스포-타우(Thr231) 및 총 타우의 대표적인 블롯. GAPDH는 로딩 대조군으로서 사용되었다. (B) 총 타우에 대해 정규화된 Ser202/Thr205 및 Thr231에서의 타우의 인산화 수준 비율의 정량 분석.
도 13은 AL04 처리가 I2PP2A(포스포타제 PP2A의 저해제)의 하향 조절을 통해 NGF-고갈된 포스포-타우 수준을 감소시킨다는 것을 도시한다. PC12 세포를 1% 말 혈청 함유 DMEM 배지에서 100 ng/㎖ NGF로 분화시켰다. 4일 후, NGF 고갈된 PC12 세포를 다양한 농도(1 내지 10 ug/㎖)의 AL04로 24시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 SDS-PAGE로 처리한 후, 시스타틴 C(AL04), P-타우(Ser202/Thr205) 및 I2PP2A에 대한 웨스턴 블롯팅으로 처리했다. 여러 레인들에서 동등한 단백질 로딩을 확인하기 위해 GAPDH를 사용했다.
도 14A 및 도 14B는 AL04 처리가 NGF 고갈된 PC12 세포에서 타우-튜불린의 상호작용을 증가시킨다는 것을 도시한다. (A) PC12 세포를 1% 말 혈청 함유 DMEM 배지에서 100 ng/㎖ NGF로 분화시켰다. 4일 후, NGF 고갈된 PC12 세포를 24시간 동안 1 ug/㎖ AL04로 처리하거나 처리하지 않았다. 그 다음, 세포를 용해시키고 항-베타 튜불린 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 면역침전물은 항-타우 항체로 프로브하였다. 용해물 투입 레인은 총 용해물의 1%였고, 단백질의 동등한 로딩을 보여주었다. 세포 용해물을 총 타우, 베타-튜불린 및 시스타틴 C(AL04의 경우)에 대해 웨스턴 블롯팅으로 처리했다. 베타-튜불린에 결합된 타우의 상대적 정량화는 (B)에서 나타난다. 값은 투입된 총 타우의 총 수준으로 정규화되며, 3회 결정치의 평균 +/-SE로 표현된다. "^*", P<0.001, 스튜던트 t 시험.
도 15는 AL04가 용량 의존적 방식으로 AMPK를 조절함으로써 하이퍼포스포-타우를 감소시킨다는 것을 도시한다. NGF 고갈된 PC12 세포를 다양한 농도(1 내지 5 ug/㎖)의 AL04로 24시간 동안 처리 시에, 시스타틴 C(AL04), 포스포-타우(Ser202/Thr205), 포스포-AMPK알파(Thr172), 포스포-AMPK베타(Ser182), 포스포-ULK1(Ser555)의 대표적인 블롯이 도시되어 있다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용했다.
도 16은 AL04 처리가 Tg2576 마우스의 해마에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 17은 AL04 처리가 Tg2576 마우스의 내후각피질에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 18은 AL04 처리가 JNPL3 마우스의 해마 및 내후각피질에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시킨다는 것을 도시한다.

본 출원은 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 헌팅턴병과 같은 신경퇴행성 질환, 가장 특히 알츠하이머병을 치료하기 위해 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 융합 폴리펩타이드의 제조를 개시한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 적어도 약 100 ug 또는 적어도 약 1 ㎎/㎏ 체중, 적어도 약 2 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏ 이상이 인체에 복강내로 전달되며, 이 중 투여량의 약 0.01%가 뇌에 국재화될 것으로 예상된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드의 치료 유효 용량은 적어도 약 0.5 ㎎/Kg 체중을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전신 투여는 비경구, 정맥내, 피하, 근육내, 비강내, 동맥내, 경피 또는 호흡기 투여이다.

본 명세서에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 달성하는 것을 포함한다. 치료적 이점은 치료되는 기저 장애 또는 상태의 근절 또는 개선을 의미한다. 예를 들어, 알츠하이머병이 있는 개체에서 치료적 이점은 장애 진행의 부분적 또는 완전한 정지, 또는 장애의 부분적 또는 완전한 역전을 포함한다. 또한, 치료적 이점은 환자가 여전히 상태에 영향을 받고 있을 수 있다는 사실에도 불구하고, 환자에서 개선이 관찰될 정도로, 기저 상태(underlying condition)와 관련된 생리학적 또는 심리적 증상 중 하나 이상의 근절 또는 개선으로 달성된다. 치료의 예방적 이점은 상태의 예방, 상태의 진행 지연(예를 들어, 알츠하이머병의 진행 지연) 또는 상태의 발생 가능성 감소를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"는 예방을 포함한다.

본 명세서에 사용된, "치료 단백질"은 융합 폴리펩타이드의 치료 활성 단백질 성분을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "융합 폴리펩타이드"는 여러 단백질 성분이 융합되어, BBB를 횡단할 수 있고 치료 단백질에게 장기간 지속되는 활성을 제공할 수 있는 폴리펩타이드를 생성하는 폴리펩타이드 작제물이다.

본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 전신 투여될 때 CNS에서 유익하거나 원하는 결과, 예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 결과, 또는 인지, 기억, 기분 향상, 또는 다른 원하는 CNS 결과를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 유효량은 또한 예방 효과를 생성하는 양, 예를 들어, 병리학적 상태 또는 바람직하지 않은 상태의 출현을 지연, 감소 또는 제거하는 양이다. 이러한 상태는 신경퇴행을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 치료의 관점에서, 본 발명의 조성물의 "유효량"은 장애, 예를 들어, 신경학적 장애의 진행을 완화, 개선, 안정화, 역전 또는 지연시키기에 충분한 양이다. "유효량"은 단독으로 사용되거나 또는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용된 하나 이상의 작용제(agent)와 함께 사용되는 본 발명의 임의의 조성물의 유효량일 수 있다. 본 발명의 의미 내에서 치료제의 "유효량"은 환자의 주치의에 의해 결정될 것이다. 이러한 양은 본 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 확인되고 본 발명에 따라 투여될 때 치료 효과가 있을 것이다. 치료적 유효량에 영향을 미치는 인자에는 투여된 융합 폴리펩타이드의 알츠하이머병 비활성(specific activity), 이의 흡수 프로파일(예를 들어, 뇌로의 흡수 속도), 장애가 시작된 후 경과된 시간, 및 연령, 신체 상태, 다른 질병 상태의 존재, 및 치료받는 개체의 영양 상태가 포함될 것이다. 추가로, 환자가 투여받고 있을 수 있는 다른 약물은 투여할 치료제의 치료학적 유효량의 결정에 영향을 미칠 것이다.

본 명세서에 사용된 "대상체" 또는 "개체"는 동물, 예를 들어, 포유류이다. 일부 실시형태에서, "대상체" 또는 "개체"는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 알츠하이머병을 앓고 있다.

일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약리학적 조성물은 "말초적으로 투여" 또는 "말초 투여"된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이들 용어는 CNS에 대한 직접 투여가 아닌, 즉 작용제가 혈액-뇌 장벽의 비-뇌측과 접촉되게 하는, 개체에 대한 작용제, 예를 들어, 치료제의 임의의 투여 형태를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "말초 투여"는 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 복강내, 경피, 흡입, 협측, 비강내, 직장, 경구, 비경구, 설하, 또는 비강경유 투여를 포함한다.

본 명세서에서 "약제학적 허용성 담체" 또는 "약제학적 허용성 부형제"는 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 항체의 생산을 자체적으로 유도하지 않는 임의의 담체를 지칭한다. 이러한 담체는 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 약제학적으로 허용되는 담체/부형제에 대한 철저한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A R, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USA에서 찾아볼 수 있다. 예시적인 약제학적 허용성 담체는 염, 예를 들어, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 액체 형태로 제공될 수 있고, 0.01 내지 1%의 폴리소르베이트-80과 같은 세제, 또는 만니톨, 소르비톨 또는 트레할로스와 같은 탄수화물 첨가제의 존재 또는 부재하에 다양한 pH(5 내지 8)의 식염수 기반 수용액으로 제형화될 수 있다. 일반적으로 사용되는 완충액은 히스티딘, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트를 포함한다.

"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 사용된 방법, 예를 들어, 직접 흡수, 형질도입, f-교배 또는 재조합 숙주 세포를 생성하는 것으로 본 기술분야에 공지된 기타 방법에 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 미통합 벡터, 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 대안적으로, 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩타이드에 대한 설명은 펩타이드에 대한 설명 및 단백질에 대한 설명과 동등하게 적용되며, 그 반대도 마찬가지이다. 이 용어는 천연 유래 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 유래 아미노산, 예를 들어, 아미노산 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩타이드 결합에 의해 연결된 전체 길이의 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함한다.

용어 "아미노산"은 천연 유래 및 비천연 유래 아미노산, 뿐만 아니라 천연 유래 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연적으로 암호화된 아미노산은 20개의 일반적인 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 피로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 유래 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물을 지칭하며, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄이 있다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖지만, 천연 유래 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다.

아미노산은 일반적으로 알려진 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에서 권장하는 1문자 기호로 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 뉴클레오타이드도 마찬가지로 일반적으로 허용되는 1문자 코드로 지칭될 수 있다.

용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 유래 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다.

융합 폴리펩타이드의 다양한 폴리펩타이드 성분을 연결하는 "링커"와 관련하여, 일부 실시형태에서, 링커는 글리신, 세린 및/또는 알라닌 잔기를 임의의 조합 또는 순서로 포함한다. 일부 경우에, 링커에서 글리신, 세린 및 알라닌 잔기의 합산 백분율은 링커 내 총 잔기 수의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95%이다. 일부 바람직한 실시형태에서, 링커 내 글리신, 세린 및 알라닌 잔기의 합산 백분율은 링커 내 총 잔기 수의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95%이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 조합(천연 또는 합성 아미노산 포함)의 임의의 수가 링커에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3개의 아미노산 링커가 사용된다. 일부 실시형태에서, 링커는 Ser-Ser-Ser 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 아미노산 링커는 글리신, 세린 및/또는 알라닌 잔기를 임의의 조합 또는 순서로 포함한다(예를 들어, Gly-Gly, Ser-Gly, Gly-Ser, Ser-Ser, Ala-Ala, Ser-Ala 또는 Ala-Ser 링커). 일부 실시형태에서, 2개의 아미노산 링커는 하나의 글리신, 세린 및/또는 알라닌 잔기와 또 다른 아미노산(예를 들어, Ser-X, 여기서, X는 임의의 공지된 아미노산임)으로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 2개의 아미노산 링커는 gly, ser 또는 ala를 제외한 임의의 2개의 아미노산(예를 들어, X-X)으로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 길이가 2개 아미노산보다 큰 링커가 사용될 수 있다. 이러한 링커는 또한 글리신, 세린 및/또는 알라닌 잔기를 본 명세서에 추가로 기재되는 바와 같이, 임의의 조합 또는 순서로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 다른 아미노산(예를 들어, Ser-nX, 여기서 X는 임의의 공지된 아미노산이고 n은 아미노산의 수임)과 함께 하나의 글리신, 세린 및/또는 알라닌 잔기로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 임의의 2개의 아미노산(예를 들어, X-X)으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 상기 임의의 2개의 아미노산은 임의의 조합 또는 순서로, 그리고 이들 사이에 개재된 다양한 수의 아미노산 내에 존재하는, Gly, Ser, 또는 Ala이다. 실시형태의 예에서, 링커는 적어도 하나의 Gly으로 구성된다. 실시형태의 예에서, 링커는 적어도 하나의 Ser으로 구성된다. 실시형태의 예에서, 링커는 적어도 하나의 Ala으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Gly, Ser, 및/또는 Ala 잔기로 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 링커는 Gly 및 Ser을 반복 서열로, 임의의 조합 또는 수로, 예컨대 (Gly₄Ser)₃, 또는 기타 변형으로 포함한다.

본 발명에서 사용하기 위한 링커는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 설계할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질의 조작에서 최적의 아미노산 링커를 결정하기 위한 공개적으로 이용가능한 프로그램은 다수가 있다. 단백질 서열 및 링커의 원하는 길이를 사용자가 입력하는 것에 기초하여 최적 링커의 아미노산 서열을 자동으로 생성하는 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램(예컨대, LINKER 프로그램)이 본 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 종종, 이러한 프로그램은 단백질 조작에 사용하기 위한 최적의 단백질 링커를 예측하기 위해 단백질 서브도메인을 결합시키는 천연 유래 링커에 대한 관찰된 경향을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 상기 프로그램은 최적의 링커를 예측하는 다른 방법을 사용한다.

펩타이드 링커 서열은 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "활성"은 생리학적 활성(예를 들어, BBB를 횡단하는 능력 및/또는 치료 활성), 또는 융합 폴리펩타이드에서 수송되는 관심 단백질의 효소 활성을 포함한다.

본 발명의 조성물은 주사용, 예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내 또는 복강내 투여를 위한 약제학적 조성물로서 특히 적합하다. 본 발명의 수성 조성물은 약제학적 허용성 담체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 본 발명의 조성물의 유효량을 포함한다. "약제학적 또는 약리학적 허용성"이라는 문구는 적절하게 동물, 예를 들어, 인간에게 투여될 때 이상 반응, 알레르기 반응 또는 기타 부적당한 반응을 생산하지 않는 분자적 실체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "약제학적 허용성 담체"는 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 화합할 수 없는 경우가 아닌 한, 치료 조성물에 그의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다.

주사용 조성물을 위한 예시적인 약제학적 허용성 담체는 염, 예를 들어, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 액체 형태로 제공될 수 있고, 0.01 내지 1%의 폴리소르베이트-80과 같은 세제 또는 만니톨, 소르비톨 또는 트레할로스와 같은 탄수화물 첨가제의 존재 또는 부재하에 다양한 pH(5 내지 8)의 식염수 기반 수용액으로 제형화될 수 있다. 일반적으로 사용되는 완충액은 히스티딘, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트를 포함한다. 일상적인 보관 및 사용 조건에서 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올; 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 슈가(sugar) 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 야기될 수 있다.

인간 투여용인 경우, 제제는 FDA 및 기타 규제 기관의 표준에서 요구하는 무균, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족한다. 활성 화합물은 일반적으로 비경구 투여용으로 제형화될 것이며, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 병변내 또는 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 것이다. 활성 성분 또는 성분을 함유하는 수성 조성물의 제조는 본 개시내용에 비추어 본 기술분야의 기술자라면 잘 알고 있을 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로 제조될 수 있으며; 주사 전에 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 사용하기에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있고; 제제는 또한 유화될 수도 있다.

멸균 주사액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시킴에 의해 제조된다. 멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 또 다른 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기술을 포함한다.

제형화 후, 용액은 투여 제형에 적합한 방식 및 본 명세서에 기재된 기준에 기초하여 치료적으로 유효한 양으로 전신 투여될 것이다. 제형은 전술한 주사액의 종류와 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 사용될 수 있다.

투여될 약제학적 조성물의 적절한 양, 치료 횟수, 및 단위 용량은 본 명세서에 기재된 융합 폴리펩타이드의 CNS 흡수 특성, 및 치료할 대상체, 대상체의 상태, 및 원하는 효과에 따라 달라질 것이다. 투여 담당자는 아무튼 개별 대상체에게 적절한 용량을 결정할 것이다.

경구 제형은 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지속 방출 제형 또는 분말의 형태를 취한다. 정의된 특정 실시형태에서, 경구 약제학적 조성물은 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체를 포함하거나, 또는 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나, 정제로 압축될 수 있거나, 또는 식사용 식품에 의해 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제에 의해 혼입될 수 있고 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 활성 화합물을 0.1% 이상 함유할 수 있다. 물론, 조성물 및 제제의 백분율은 변동될 수 있고, 편리하게는 단위 중량의 약 2 내지 약 75% 사이, 또는 약 25 내지 60%일 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물의 양은 적절한 투여량이 수득될 정도이다.

정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 다음을 함유할 수 있다: 트래거캔스 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등의 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제가 첨가될 수 있거나, 또는 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리 향료와 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅으로 존재하거나, 그렇지 않다면 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 셸락, 슈가 또는 둘 모두에 의해 코팅될 수 있다. 엘릭서 시럽은 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 보존제로서 메틸렌 및 프로필 파라벤, 염료 및 향미제, 예컨대, 체리 또는 오렌지 향을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 경구용 약제학적 조성물은 활성 성분을 위의 환경으로부터 보호하기 위해 장용 코팅될 수 있고; 장용 코팅 방법 및 제형은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

이중 작용 요법(DAT)

본 발명은 이중 작용을 갖는 본 출원에 기재된 작제물을 환자에게 투여함으로써 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 이중 작용 요법은 (i) 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키는 분자 및/또는 (ii) 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 분자를 발현하는 작제물의 투여를 포함한다. 두 구성 요소는 단일 작제물로부터 발현될 수 있다.

대안적으로, 본 발명은 또한 하나보다 많은 작제물을 투여함으로써 중추신경계 질환, 특히 알츠하이머병을 치료하는 방법에 관한 것이며, 각 작제물은 (i) 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키고/시키거나 (ii) 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 분자를 함유한다. 이러한 작제물은 동시 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있으며, 이와 같이 환자에게 이중 작용을 나타낼 수 있다. 이러한 이중 작용 요법은 (i) 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키고/시키거나 (ii) 본 출원에 기재된 바와 같이 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 분자를 제공하는 것을 포함한다.

AL04의 활성

아밀로이드 베타 축적은 AD의 발병 동안에서 신경 기능장애 및 신경 손실과 종종 연관되어 있다(Hensley, 1994). 이 연구에서, 본 발명자들은 먼저 인간 혈청 알부민 융합 단백질(AL04, CysC-HSA-dTAT)이 Aβ1-42 유도 독성으로부터 PC12 세포를 보호할 수 있는지의 여부를 조사했다. 우리의 결과는 10uM Aβ1-42가 세포 생존율을 유의적으로 감소시키는 것을 보여주었다.

두 번째 실험 세트에서 본 발명자들은 PC12 세포를 NGF의 존재로 처리하였고, 일단 분화되면 세포를 AL04의 존재 또는 부재하에 Aβ1-42로 72시간 동안 처리하였다. 미분화 세포에서 관찰된 바와 같이, AL04는 Aβ1-42의 존재 하에서 유의적인 보호 효과를 유도해냈다; 하지만, 보호율은 분화된 PC12 세포가 Aβ1-42에 덜 민감함을 나타냄으로 인해, 미분화 세포의 경우보다 낮았다.

임상 사용부터 전임상 연구에 이르기까지 AD 치료에 사용되는 몇몇 약물은 수송 시스템을 이용하는 것으로 알려져 있다. 도네페질 및 AD 치료용으로 승인된 단 2 부류의 약물 중 하나인 아마도 다른 콜린에스테라제 저해제는 콜린에 대한 수송체일 가능성이 가장 큰 유기 양이온 수송체에 의해 BBB를 통해 수송된다(Kang 2005; Kim, 2010). BBB 침투가 알츠하이머 치료를 위한 치료 생물학적 제제의 핵심 요소인지의 여부에 대한 개념 증명으로서, 본 발명자들은 여기서 처음으로 탠덤(tandem) 반복 HIV-1 트랜스 활성화 전사체(dTAT) 펩타이드를 함유하는 HSA 기반의 치료 생물학적 제제 및 이의 시험관내 인간 BBB 모델에서의 효과를 보고한다. 본 발명자들은 dTAT가 BBB를 통해 고분자량 단백질의 전달을 촉진하는 역할을 한다는 것을 발견했다.

우리의 HSA 융합 플랫폼의 장점은 다음과 같이 나열될 수 있다: (1) HSA는 전달 셔틀(shuttle)에 pH 의존적인 FcRn 재순환/트랜스사이토시스를 부과하여, 생체내에서 훨씬 긴 순환-수명을 가지며(Sand, 2015), (2) CNS로 들어가는 dTAT의 메커니즘이 주로 내피세포 표면의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 dTAT 사이의 상호작용 또는 단단한 접합 단백질(tight junction protein)의 발현을 감소시키고 분포를 변경시킴에 의한 BBB의 일시적인 파괴이며(Andras, 2005; Xu, 2012; Zhong, 2012; Toschi, 2001), (3) 작제물의 모델 단백질 코어가 시스타틴 C(CysC), 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질-1 클러스터 IV(LRP1- C4), 염색체 10번 상의 포스파타제 및 텐신 상동체(Pten), 최종 당화 산물에 대한 가용성 수용체(sRAGE), 또는 미엘린 염기성 단백질(MBP)을 포함한 임의의 유형의 활성 단백질에 의해 대체될 수 있어, 전달 시스템이 AD 및 다른 CNS 질환에 대한 추가적인 치료 효과를 갖게 할 수 있다(Sundelof, 2008; van Kasteren, 2011; Basurto-Islas, 2013; Tizon, 2010; Sagare,　 2013; Zhao, 2016; Zhang, 2006; Zong, 2010; Liao, 2009).

요약하면, 본 발명자들은 AL04와 같이 dTAT를 포함하는 인간 혈청 알부민 융합 단백질이 Aβ1-42 처리된 PC12 세포에서 부작용에 대한 저해 효과를 발휘한다는 것을 처음으로 입증하였다. 본 발명자들은 AL04의 dTAT가 시험관내 모델 인간 BBB를 통해 고분자량 단백질의 전달을 촉진하는 역할을 하며 생체내 모델의 대안으로서 개념 증명에 유용한 도구인 것을 발견했다. 인간 혈청 알부민 융합 단백질은 신경보호 및 혈액 뇌 장벽 투과성을 유의적으로 개선시켜, AD 치료의 약물 개발에 유용한 플랫폼을 제공할 수 있는 것으로 입증되었다.

AL04 판독 프레임은 다음 핵산(2211개 염기) 및 아미노산 서열(737개 아미노산 잔기)을 갖는다.

AL04의 아미노산 서열(737개 아미노산)

이 연구에서 본 발명자들은 Aβ1-42 유도 독성을 개선할 뿐만 아니라 PC12 세포에서 포스포-타우 수준을 저하시키는 AL04의 치료 잠재성을 조사했다. PC12 세포주는 AD에서 신경 손상 및 신경독성을 평가하기 위한 일반적인 시험관내 모델로서 사용되고 있다. 또한, PC12 세포는 높은 처리량을 제공하고 성숙한 뉴런 표현형을 유지할 수 있다(Tan, 1999). 뉴런 성장 인자(NGF)-유도된 PC12 세포의 생화학 및 형상은 뉴런과 유사하며 PC12 세포는 Aβ 펩타이드 및 NGF 고갈에도 특히 민감하다. 또한, Aβ1-42가 세포 독성 및 세포 사멸을 유발할 뿐만 아니라 PC12 세포에서 ROS 과잉생산 및 미토콘드리아 기능장애를 유도함을 시사하는 여러 보고가 있다(Hensley, 1994). 따라서, 우리 실험에 사용된 PC12 세포는 AL04가 Aβ-유도된 세포독성 및 NGF 고갈에 대한 보호를 제공하는지의 여부를 결정하기에 적절한 접근법을 제공한다.

HSA는 혈액에서 가장 풍부한 순환 단백질 중 하나이다. 이것은 혈류에서 오래 지속되는 반감기, 독성 결여, 및 세포 흡수 기능으로 인해 치료제용 담체 단백질로서 사용되었다(Chaudhury, 2003; Andersen, 2014). 본 발명자들은 원섬유 형성 저해를 통해 Aβ 제거 또는 p-타우 감소에 중요한 역할을 할 수 있고 제거를 촉진할 수 있을 시스타틴 C(CysC), 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질-1 클러스터 IV(LRP1-C4), 염색체 10번 상의 포스파타제 및 텐신 상동체(Pten), 최종 당화 산물의 가용성 수용체(sRAGE), 미엘린 염기성 단백질(MBP) 등을 포함한 10개 이상의 관심 단백질(POI)을 선택했다. HSA 융합 단백질 생산 세포주 개발을 위해 HSA 융합 단백질(AL04, CysC-HSA-dTAT) 및 선택 마커인 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 함유하는 발현 벡터 pOptivec(Invitrogen)을 작제했다. 안정적으로 형질감염된 DHFR-결핍 세포(DG44 세포) 및 메토트렉세이트(MTX, DHFR 저해제)-증폭된 세포 풀(pool)이 생성되었다. 정제된 AL04 단백질을 사용하여 개념 증명을 시험했다. AL04는 Aβ-유도된 세포 사멸을 약화시키고, NGF 고갈-유도된 타우의 과인산화를 감소시켰으며, 크롬친화세포종(PC12) 세포에서 내인성 타우-튜불린 상호작용을 개선시켰다. 본 발명자들은 세포 기반 시험관내 인간 BBB 모델을 사용하여 혈액-뇌 장벽을 통한 고분자량 단백질 AL04(80KDa)의 투과성을 평가했다. 이 BBB-횡단 인간 혈청 알부민 융합 단백질 플랫폼은 AD 치료의 약물 개발에 유용하다.

HSA-융합 단백질의 치료 효능은 융합 단백질의 세포 내로의 성공적인 전달에 의존적이다. 본 발명자들은 분화된 PC12 세포내로 인간 혈청 알부민 융합 단백질[AL04, CysC-HSA-CPP; AL12, RAGE(V)-HSA-SIRT1(Exon4)-CPP]이 침투할 수 있는지의 여부를 조사했다. 본 발명자들은 다른 버전의 HSA 융합 단백질(AL04 또는 AL12)이 PC12 세포 내로 쉽게 침투했고, 또한 세포내에서 생물학적 활성을 효과적으로 전달할 수 있음을 관찰했다.

이 연구에서, 본 발명자들은 NGF 고갈 하에 NGF 고갈-유도된 타우의 과인산화에서 인간 혈청 알부민 융합 치료제(AL04)의 역할을 조사하기 위해 분화된 PC12 세포를 사용하였다. 미분화 PC12 세포에서 타우는 낮은 수준으로 발현되는 반면, NGF로 자극하면 치료 3일 후부터 타우 발현의 증가를 야기한다(Drubin, 1985; Hanemaaijer, 1991). 타우는 NGF-유도된 신경돌기 신장의 후기 단계에서 미세소관 안정화에 필요한 것으로 알려져 있다(Brandt, 1995; Hanemaijer, 1991). 알츠하이머의 뇌 및 마우스 모델 중 Thr205 및 Thr231에서 인산화된 타우(p-타우)의 증가된 수준은 보고되었다(Wang, 2013). 본 발명자들은 AL04 처리가 PC12 세포에서 NGF 고갈-유도된 타우의 과인산화를 감소시키는지의 여부를 조사했다. 본 발명자들은 NGF-고갈된 PC12 세포에서 p-타우 Ser202/Thr205 및 p-타우 Thr231의 수준이 크게 증가함을 관찰했다(데이터는 제시되지 않음). AL04의 존재하에, 본 발명자들은 Ser202, Thr205 및 Thr231에서 포스포-타우 수준의 급감을 관찰했다. PP2A 활성은 PP2A의 촉매적 서브유닛과 활성화된 I2PP2A 단편의 상호작용에 의해 저해되는 것으로 보고되었다(Arnaud, 2011). AL04 처리는 I2PP2A의 약 20kDa 단편 및 또한 p-타우 Ser202/Thr205 및 p-타우 Thr231의 수준을 감소시켰으므로, 이러한 결과는 AL04(시스타틴 C 보유)가 I2PP2A의 하향조절을 통한 타우의 탈인산화와 관련된 PP2A 활성의 조절에 영향을 미친다는 것을 시사했다.

본 출원에 기재된 타우 단백질에 상대적인 돌연변이 부위는 이하 서열번호 7의 부위이다.

인간 타우: 미세소관-관련 단백질 타우 동형체 2(NCBI 참조 서열: NP_005901.2), 441 아미노산

몇몇 연구는 타우의 핵심 부위의 인산화가 타우의 정상 기능에 강한 영향을 미치고 병리학적 역할에 기여할 가능성이 있다는 증거를 제공했다(Ksiezak-Reding, 1992; Augustinack, 2002). Thr-231에서 타우의 인산화는 미세소관에 대한 친화도를 감소시키는 것으로도 밝혀져 있다(Cho, 2004; Sengupta, 1998; Lin, 2007). 본 발명자들은 또한 AL04 처리가 포스포-타우 수준을 감소시켜 미세소관-타우 상호작용을 안정화시키는 것을 관찰했다. 우리의 연구는 겉보기에 AMPK 활성의 저해에 의해 매개되는 것으로 보이는 AL04 처리와 관련된 타우 인산화의 감소에 책임이 있는 신호 경로를 확인하지는 않지만, AL04에 의한 처리는 생체 내에서 타우 응집 및 엉킴 형성을 저해한다. 현 보고서에서, 본 발명자들은 AL04 처리로부터 포스포-ULK1(Ser555에서 Unc51-유사 키나제1)의 감소를 관찰했는데, 이는 AL04가 AMPK 신호 경로를 통해 자가포식을 조절할 수 있음을 시사한다. AMPK는 자가포식을 개시하고 S555에서 ULK1을 비롯한 이의 직접적인 기질을 인산화하는 단백질 키나제의 인산화에 의해 자가포식 활성화를 직접 매개하는 것으로 보고되었다(Egan, 2011; Kim, 2011).

결론적으로, 우리의 발견은 AL04가 NGF 고갈 하에서 포스포-타우를 저하시키는데 있어서 상당한 보호 효과가 있음을 입증한다. 이러한 시험관내 연구에 따르면, AL04의 보호 효과는 타우 키나제 활성(AMPK), PP2A 활성을 조절하고, 타우-튜불린 상호작용을 안정화시킴으로써 매개될 수 있다. 타우 키나제와 PP2A는 AD에서 NFT 형성에 중요한 역할을 하므로, 이러한 데이터는 AL04가 타우 인산화를 변경시켜 AD 뇌에서 NFT의 축적에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

본 명세서에는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 전신 투여함으로써 BBB를 통해 CNS로 치료 폴리펩타이드의 유효 용량을 전달하는 방법이 기재된다. 융합 폴리펩타이드의 전달에 적합한 전신 용량은 본 명세서에 기재된 바와 같은 그의 CNS 흡수 특성 및 그의 비활성에 기초한다. 치료 단백질의 결핍을 앓고 있는 대상체에게 융합 폴리펩타이드의 전신 투여는 CNS로 치료 단백질을 비침습적 전달하는 효과적인 접근법이다.

융합 폴리펩타이드의 치료적 유효 전신 용량인 융합 폴리펩타이드의 양은 본 명세서에 기재된 바와 같은 투여될 융합 폴리펩타이드의 CNS 흡수 특성, 예를 들어, 전신 투여된 용량이 CNS에 흡수되는 백분율에 부분적으로 의존적이다.

일부 실시형태에서, 전신 투여된 융합 폴리펩타이드의 1%(즉, 약 0.3%, 0.4%, 0.48%, 0.6%, 0.74%, 0.8%, 0.9%, 1.05, 1.1, 1.2, 1.3%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 또는 약 0.3% 내지 약 3% 중 임의의 %)는 말초 혈액으로부터 BBB를 통해 흡수되는 결과로서 뇌로 전달된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드의 전신 투여된 용량의 적어도 0.5%(즉, 약 0.3%, 0.4%, 0.48%, 0.6%, 0.74%, 0.8%, 0.9%, 1.05, 1.1, 1.2, 1.3%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3% 또는 약 0.3% 내지 약 3% 중 임의의 %)는 전신 투여 후 2시간 이내 또는 그 미만 이내, 즉 1.8, 1.7, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 0.9, 0.8, 0.6, 0.5 시간 내 또는 전신 투여 후 약 0.5 내지 약 2시간 중 임의의 다른 기간 내에 뇌로 전달된다.

따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 BBB를 횡단하는 융합 폴리펩타이드의 양이 적어도 3ng의 치료 단백질/㎎ 단백질(대상체의 뇌에 존재)을 제공하고, 예를 들어, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50ng 또는 3 내지 50ng 중 임의의 다른 값의 치료 단백질/㎎ 단백질(대상체의 뇌에 존재)을 제공할 정도로 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 전신으로 투여하는 방법을 제공한다.

일 양상에서, BBB 침투율이 0.01%라고 가정하면, 100ug의 AL04가 마우스에 제공되었을 때, 10ng의 AL04는 마우스 뇌의 40㎎ 단백질로 전달될 수 있으며, 여기서 마우스 뇌 중량은 400㎎이고 그 총 단백질 양은 40㎎이다. 이것은 인간에게 외삽될 수 있다.

일부 실시형태에서, 치료 유효 전신 용량은 뇌당 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500 단위, 또는 뇌당 약 50 내지 2500 단위 중 임의의 다른 전신 용량의 치료 단백질을 포함한다.

다른 실시형태에서, 치료 유효 전신 용량은 적어도 약 10 단위의 치료 단백질 활성/㎏ 체중, 적어도 약 10, 12, 15, 18, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 또는 임의의 다른 수의 단위이다.

본 기술분야의 기술자는 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효 전신 용량의 질량 양이 부분적으로 이의 비활성에 의존적일 것임을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드의 비활성은 적어도 10 U/㎎ 단백질, 적어도 약 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 약 10 단위/㎎ 내지 약 50 단위/㎎ 중 임의의 다른 비활성 값이다.

따라서, 융합 폴리펩타이드의 비활성 및 치료되는 대상체의 체중을 적절히 고려하면, 융합 폴리펩타이드의 전신 용량은 적어도 5㎎, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 또는 약 5㎎ 내지 약 125㎎의 융합 폴리펩타이드 중 임의의 다른 값일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "전신 투여" 또는 "말초 투여"는 CNS로의 직접 투여가 아닌, 즉 BBB의 물리적 침투 또는 파괴를 수반하지 않는 임의의 투여 방법을 포함한다. "전신 투여"는 정맥내, 동맥내 근육내, 피하, 복강내, 비강내, 협측, 경피, 직장, 폐포경유(흡입), 또는 경구 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 융합 폴리펩타이드가 사용될 수 있다.

융합 폴리펩타이드는 조합 요법(combination therapy)의 일부로서 투여될 수 있다. 조합 요법은 알츠하이머병을 앓고 있는 환자에서 전형적으로 발견되는 증상의 치료 또는 완화를 위한 다른 요법과 조합으로 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물이 다른 CNS 장애 방법 또는 조성물과 조합으로 사용되는 경우, 본 발명의 조성물 및 추가 방법 또는 조성물의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 조성물의 사용이 다른 CNS 장애 치료제와 조합되는 경우, 둘은 동시에, 연속적으로, 중복되는 기간에, 유사한 빈도, 동일한 빈도, 또는 상이한 빈도 등으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 다른 CNS 장애 치료제와 조합으로 본 발명의 조성물을 함유하는 조성물이 사용될 것이다.

일부 실시형태에서, 조성물, 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 동일한 제형 내에 또는 별도의 조성물로서 또 다른 약물과 함께 환자에게 공동-투여된다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것 외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 본 기술분야의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위에 속하는 것으로 의도된다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

실시예 1. 인간 혈청 알부민(HSA) 융합 단백질을 발현하는 pOptivector의 작제

발현 벡터로는 플라스미드 pOptiVec(Invitrogen, 미국 소재)을 사용하였다. 인간 혈청 알부민(NM_000477), 관심 단백질: 시스타틴 C, NM_000099.3; Pten-long, NM_001304718; 최종 당화 산물의 수용체(RAGE), NM_001136.4; 호모 사피엔스 전사 인자 EB(TFEB), NM_007162.2; MOA1 또는 MOA2로서 SIR1_HUMAN NAD-의존성 단백질 탈아세틸화효소 시르투인(sirtuin)-1(SIRT1), NM_012238.5, 및 CPP로서 dTAT(탠덤 반복 TAT, UniProt-P04608의 TAT_HV1H2)의 코돈-최적화된 합성 유전자 cDNA 서열은 Genescript에서 주문했다. 플라스미드를 제한효소 XbaI, NheI 및 NotI(Thermo, 미국 소재)로 처리하였다. DNA 단편의 분리는 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 수행하였다. 겔에서 DNA 단편을 용출하기 위해 Thermo gel 추출 키트(Thermo, 미국 소재)를 사용했다. 그 다음, 생성된 단편을 T4 DNA 리가제(NEB, 미국 소재)를 이용하여 함께 결찰시켜 다음 발현 벡터를 생성하였다: pOptiVec-AL000.

고순도 단리된 플라스미드 DNA의 형질감염을 위해, 본 발명자들은 Plasmid Midi 키트(Thermo, 미국 소재)를 사용했다. 발현 벡터의 적절한 조립은 제한 분석에 의해 검증하였다. 유전자 및 인접 영역 모두의 뉴클레오타이드 서열은 시퀀싱(Genewiz, 미국 소재)에 의해 검증하였다.

실시예 2. CHO-DG44 세포주 배양

세포 배양은 125㎖ Erlenmeyer 플라스크에서 37℃의 온도 및 95% 습도, 8% CO₂의 대기 하에 125rpm의 속도로 작동하는 CO₂ 인큐베이터에서 수행하였다. 재파종(reseeding)은 0.3 내지 0.5×10⁶ 세포/㎖의 밀도로 3 내지 4일마다 수행했다. 본 발명자들은 8mM L-글루타민이 보충된 CD DG44(Life Technologies, 미국 소재) 무혈청 배지를 사용했다. 세포 계수 및 생존율 분석은 자동 세포 계수기 Cellometer AutoT4(Nexcelom Bioscience, 미국 소재)를 사용하여 트립판 블루로 염색한 후 수행하였다.

실시예 3. 안정한 세포주 개발

형질감염 전에, 발현 벡터 플라스미드를 FspI 제한효소(Thermo, 미국 소재)에 의해 선형화하였다. 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)-무효(null) CHO DG44 세포주는 FreeStyle MAX 시약 프로토콜(Invitrogen, 미국 소재)에 따라 선형화된 pOptiVec-AL000으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간에, 형질감염된 세포는 성장을 위해 하이포잔틴 및 티미딘(HT)의 부재 하에 8mM L-글루타민을 함유하는 CD OptiCHO™ 배지(Life Technologies, 미국 소재)(완전 선택 배지)에서 선택했다. 선택 배지는 선택된 세포의 생존율이 90% 초과가 될 때까지 0.5×10⁶ 세포/㎖의 밀도로 3 내지 4일마다 교체한 다음, 250nM에서부터 2uM까지 단계적으로 증가된 농도의 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 완전 배지에서 2 내지 3회 게놈 증폭을 수행했다. HSA 융합 단백질 생산은 선택/증폭 배지에서 배양 종료 시에 인간 알부민 정량 ELISA 키트(Bethyl Laboratory, 미국 소재) 및 SDS-PAGE를 사용하여 결정했다.

실시예 4. AL04의 진탕 플라스크 배양

2000nM MTX 증폭된 세포를 0.5 x 10⁶ 세포/㎖의 생존 세포 밀도에서 8mM L-글루타민을 함유하는 150㎖ CD OptiCHO™ 배지(Life Technologies, 미국 소재)를 함유하는 500㎖ 일회용 Erlenmeyer 플라스크에서 생존율이 90%를 초과할 때까지 배양하였다. 세포 밀도 및 생존율은 자동 세포 계수기인 Cellometer AutoT4(Nexcelom Bioscience, 미국 소재)를 사용하여 Trypan Blue Exclusion 방법으로 격일마다 결정했다. 단백질 정제를 위해 배양물을 10일째 또는 세포 생존율이 90% 미만으로 떨어졌을 때 수확했다.

실시예 5. AL04의 정제

CHO-DG44 세포로부터 분비된 인간 혈청 알부민 융합 단백질을 함유하는 배양 배지를 여과하고(0.2um 필터), 후속적으로 청색 염료 친화성 크로마토그래피에 이어 이온-교환 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 요약하면, 여과된 융합 단백질 함유 배지를 0.05M Tris 완충액(pH 8.0)으로 평형화시킨 Blue HP 칼럼(GE)에 적용했다. 칼럼을 평형 완충액으로 세척하여 미결합 단백질을 제거하고, 결합된 융합 단백질은 10X 칼럼 부피의 용출 완충액(0.05M Tris, pH 8.0 + 1.0M NaCl)로 용출시켰다. 용출된 분획은 40kDa 분자량 컷오프(Pierce)를 갖는 원심분리 탈염 칼럼을 사용하여 탈염시켰다. 추가 정제를 위해, 수행된 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 HiTrap QFF(GE)를 수행하였다. 제조업체의 설명서에 따라 융합 단백질을 함유하는 분획을 모아 PBS에서 투석했다. 정제된 단백질은 90% 초과의 순도인 것으로 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 그 다음, 인간 혈청 알부민 융합 단백질을 여과(0.2㎛)하여 멸균하고 -80℃에서 보관했다. 단백질 농도는 Bradford 방법(Thermo)을 사용하여 결정하였다.

실시예 6. 인간 알부민 정량 ELISA

96웰 ELISA 플레이트(Bethyl laboratory, 미국 소재)는 중탄산나트륨 코팅 완충액(pH 9.0)에 1:100으로 희석된 정제된 염소 항-인간 알부민 코팅 항체(Bethyl laboratory, 미국 소재)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 차단은 TBS 완충액에 제조된 1% 소 혈청 알부민으로 1시간 동안 달성하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 Tris 완충 식염수 트윈-20(TBST)으로 5회 세척하고, 샘플 및 대조군을 샘플 완충액(1% BSA를 함유하는 TBS 완충액)에 희석하고, 각 샘플 100㎕를 코팅된 웰에 직접 적용했다. 샘플 완충액에 희석된 인간 기준 혈청(Bethyl에서 공급됨)을 사용하여 6.5, 12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 ng/㎖로 표준 곡선을 만들었다. 마이크로플레이트를 100㎕의 희석된 샘플 및 기준물질과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 그 다음, 플레이트를 TBST 완충액으로 5회 세척하고 샘플 완충액에 1:100,000으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-인간 알부민 검출 항체(Bethyl) 100 ㎕와 함께 인큐베이션했다. 마이크로플레이트는 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 5회 세척한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(Bethyl) 100ul를 첨가하고 플레이트를 RT의 암실에서 15분 동안 발색시켰고, 반응은 ELISA 정지 용액(Bethyl)으로 정지시켰다. 마지막으로, 흡광도는 Plate reader(BioTEK)로 450 nm에서 측정하였다. 각 검정은 3반복으로 수행했고, AL04(CysC-HSA-dTAT) 단백질 농도는 표준 곡선의 선형 부분으로부터 보간되었다.

실시예 7. LC-MS/MS 분석 준비

8㎍의 정제된 AL04(CysC-HSA-dTAT) 단백질을 4% 내지 12% 구배 겔(Life Technologies)에 로딩하였다. Coomassie Brilliant Blue G-250(Thermo)에서 겔을 염색하고 물로 헹군 후, LC-MS/MS 기반 단백질 식별/분석(BioSyn)을 위해 겔로부터 AL04(CysC-HSA-dTAT) 단백질 밴드를 절제했다. N-말단 시퀀싱 샘플 준비를 위해 전기영동 완료 후, 10% 메탄올을 포함하는 NuPAGE 전달 완충액에서 100V 하에 90분 동안 0.22㎛ PVDF 막(Bio-Rad)으로 이동시켜 단백질 블롯팅을 수행했다. 블롯팅된 PVDF 막은 DDH₂O로 3회 세척하고 Ponceau S(Bio-Rad)에서 염색한 다음 DDH₂O에서 탈색했다. 염색된 AL04(CysC-HSA-dTAT) 단백질 밴드를 N-말단 시퀀싱(BioSyn, 미국 소재)을 위해 막에서 절제하였다.

실시예 8. Aβ1-42에 관한 PC-12 세포 독성 검정

Aβ1-42(AnaSpec, 미국 소재)는 0.1% NH₄OH를 함유하는 DPBS에 1mM 스톡 용액으로 용해했다. 분취량을 -80℃에서 저장하고 펩타이드 응집을 위해 37℃에서 3일 동안 사전 인큐베이션(에이징)했다.

랫트 크롬친화세포종 세포주(PC12)는 고전적인 시험관내 신경내분비 세포 모델이다. 1차 뉴런과 달리 미분화 PC12 세포는 생존을 위해 신경 성장 인자(NGF)를 필요로 하지 않지만, 긴 신경돌기 확장을 생성하고 콜린성 수용체 발현의 증가와 같은 다른 신경 특이적 변화를 겪음으로써 그에 반응한다(Jumblatt, 1982; Amy, 1983). NGF 처리된 PC12 세포는 분화된 뉴런의 많은 특징을 나타낸다. PC12 세포는 10%(v/v) 열불활성화된 소태아혈청(FBS), 5%(v/v) 열불활성화된 말 혈청(HS) 및 1%(v/v) 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지(Gibco)에서 배양했고, 그 다음 5% CO₂가 있는 가습 대기에서 37℃에서 배양했다. 세포는 취하여 다양한 실험에 사용하거나, 또는 80% 융합도에 도달하면 계대배양했다. 실험에 앞서, PC12 세포는 플레이트의 웰에 세포가 부착하도록 하는 폴리-D-라이신에 의해 예비코팅된 100ul의 96웰 플레이트에 웰당 15000 세포씩 파종했다. 미분화 세포에서의 실험을 위해 96웰 플레이트를 사용하였고, 세포를 파종한 후 24시간 후에 약물 처리를 바로 시작하였다. NGF-프라이밍된(뉴런으로 분화됨) PC12 세포는 DMEM 배지 + 1% 말 혈청 및 100ng/㎖ NGF(Sigma, 미국 소재)에서 적어도 6일 동안 성장시켰다. Aβ1-42 매개 독성 효과는 WST-8 환원 검정(Dojindo Molecular Technologies, 미국 소재)을 사용하여 결정했다. 간단히 말해서, 세포는 상이한 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 10uM)의 AL04 및/또는 Aβ1-42(10uM)의 존재 또는 부재하에 37℃에서 추가 3일 동안 처리했다. 인큐베이션 기간 후, 10ul의 스톡 WST-8을 첨가하고 인큐베이션을 추가 3 내지 4시간 동안 계속하였다. 생세포에서 탈수소효소 활성에 의해 생성된 WST-8-포마잔의 A₄₅₀을 마이크로플레이트 리더(BioTEK, 미국 소재)를 이용하여 측정하였다(기준: 630 nm).

실시예 9. AL04의 BBB 투과성 검정

시험관내 인간 BBB 모델(Neuromics, 미국 소재)은 1차 인간 뇌 내피 세포(HBEC), 인간 뇌 주위세포(HBPC), 및 인간 뇌 성상세포(HBAC)의 공동 배양물을 사용하여 확립시켰다. 시험관내 인간 BBB 모델 키트는 12개의 트랜스웰 인서트(폴리에스터 막, 0.4 um 기공, 직경 12mm, 인서트 성장 면적: 1.12㎠²)가 있는 양면(내강측, 혈액/내강 반대측, 뇌)을 가지고 있다. HBPC는 인서트의 바닥면에서 성장시켰고, HBEC는 인서트의 상단면에서 단층화했고, HBAC는 12웰 배양 플레이트(Neuromics, 미국 소재)의 바닥에서 성장시켰다. 시험관내 BBB 모델은 제조사의 설명서에 따라 4일 동안 활성화시켰다. 간단히 말해서, 트랜스웰 인서트의 내강측 및 내강 반대(하부, 뇌) 측의 배지를 격일마다 교체했다. 수송 실험 전에, 내강 반대 측을 투과성 검정 매질로 채웠다. 투과성 검정을 위해, 정제된 AL04 또는 재조합 HSA(Sigma, 미국 소재)를 트랜스웰 인서트의 내강 측(0.3㎖)에 첨가하여 최종 농도가 1 또는 10uM이 되도록 하였다. 인큐베이션은 오비탈 쉐이커(100rpm)에서 37℃에서 수행했다. 샘플(150㎕)을 60, 120 및 240분에 내강 반대 측면(1.2㎖)에서 수집하고, 즉시 새로운 투과성 검정 배지로 교체했다. 수송된 AL04 또는 rHSA의 농도는 Human albumin quantitation ELISA 키트(Bethyl laboratory, 미국 소재)를 이용하여 측정하였고, 표준곡선법을 이용하여 분석했다. 투과성 계수(P _e , ㎝ s^-1)는 다음 방정식을 사용하여 계산했다: P _e = (V_A/(A×c₀))×(dQ/dt), 여기서 V_A는 혈액 측(인서트 내부)의 검정 완충액의 부피이고, A는 인서트의 표면적(1.12 ㎠)이며, c₀은 혈액 측에 첨가된 단백질 샘플의 초기 농도이고, dQ/dt는 정의된 기간 동안 뇌 측에 수송된 단백질 샘플의 농도이다. 정제된 AL04 또는 재조합 HSA에 대한 투과성 계수(P _e , ㎝ s^-1)는 이전에 설명된 바와 같이 계산했다(Prades, 2015; Nakagawa, 2009).

실시예 10. 결과

실시예 10.1. 재조합 HSA 융합 단백질(AL04)을 위한 유전자 작제물 및 벡터 설계

초기 단계에서, 인간 혈청 알부민, 관심 단백질(예를 들어, 시스타틴 C, MOA1 또는 MOA2로서 Pten-long), 및 dTAT를 최적화된 코돈 조성으로 암호화하는 유전자를 합성하였다. 유전자 서열은 공개적으로 이용가능한 출처(NCBI, 국립 생명공학 정보 센터, 및 UniProt, 보편적 단백질 자원)에서 얻었다. pOptiVec 플라스미드 벡터는 인간 혈청 알부민, 관심 단백질(예를 들어, 시스타틴 C, MOA1 또는 MOA2로서 Pten-long), 및 dTAT의 개별 유전자의 담체로서 사용했다(도 1 내지 도 4).

실시예 10.2. HSA 융합 단백질(AL04) 생산

현탁 후, CHO-DG44 세포를 선형화된 발현 벡터인 Optivec-CysC-HSA-dTAT로 형질감염시켰고, 배양 상청액에서 인간 알부민 정량 ELISA 키트(Bethyl)를 사용하여 검출하였다. 형질감염된 CHO 세포를 그 다음 8mM L-글루타민을 함유하는 CD Opti CHO 배지에서 선택 및 MTX 증폭으로 처리했다. 재조합 단백질의 고역가 생산을 달성하기 위해, 바이오제약 산업에서 널리 사용되는 포유동물 세포 발현 시스템인 메토트렉세이트(MTX) 증폭 시스템(Ng, 2012)을 사용하였다. MTX 증폭 과정 동안, 인간 알부민으로서 배양 상청액에서 증가된 AL04(Optivec-CysC-HSA-dTAT)의 발현을 ELISA로 정량화했다. 2000nM MTX 농도의 세포 풀을 AL04 발현 배양물에 적응시켰다.

실시예 10.3. 정제된 AL04 단백질의 특성화

AL04 단백질의 정체(identity)는 SDS-PAGE 분석에 의해 검증했다(도 5). 정제된 AL04 단백질 밴드의 크기(완전성)는 청색 칼럼 크로마토그래피로부터의 용출물에서 환원 조건 하에 약 80kDa인 것으로 나타났다. 청색 칼럼에서 정제된 AL04 단백질의 진위 여부를 확인하기 위해 단백질을 LC-MS/MS 분석(Biosyn)으로 처리했다. AL04에 해당하는 적어도 69개의 고유한 펩타이드가 92%의 단백질 범위(coverage)로 검출되었다. AL04 단백질의 N-말단을 확인하기 위해 고유 펩타이드 SSPGKPPRLV를 샘플에서 관찰했다(데이터는 제시되지 않음). 분석은 또한 신호 펩타이드가 성숙한 분비 단백질로부터 정확하게 절단되었음을 확인시켜 주었다. LC-MS/MS 분석과 N-말단 시퀀싱을 기반으로 할 때, 본 발명자들은 청색 칼럼 크로마토그래피로부터 정제된 AL04 단백질이 발현된 서열과 동일한 것을 확인하였다.

실시예 10.4. Aβ1-42 유도된 세포독성에 대한 AL04(CysC-HSA-dTAT)의 보호 효과

본 발명자들은 PC12 세포 배양물에서 AL04의 가능한 비특이적 세포독성을 연구했다. AL04가 0.01μM, 0.1μM 및 1μM로 단독으로 인큐베이션되었을 때에는 세포 생존율의 변화는 관찰되지 않았지만, 그럼에도 불구하고 10μM AL04만큼 높은 농도는 세포 생존율을 감소시켰다(도 6A). 시험관내 연구에 따르면, 시스타틴 C는 Aβ 구조에 중요한 Aβ의 중심 도메인에 결합하고, Aβ 응집의 형성을 저해하고, Aβ-유도 독성을 방지하는 것을 나타내었다(Juszczyk, 2009; Tizon, 2010). 본 발명자들은 시스타틴 C를 함유하는 AL04가 Aβ-유도 독성을 저해하는지의 여부를 시험하였다. 10μM Aβ1-42 단독에 의한 PC12 세포의 처리는 대조군 세포(Aβ1-42 없음)와 비교하여 가용성 10uM Aβ1-42에서 세포 생존율을 20%로 크게 감소시켰다. 그러나, Aβ1-42-유도된 세포 사멸은 AL04의 존재하에 구제되었다(도 6B).

미분화 PC12 세포와 유사하게, 신경 성장 인자(NGF)-처리(분화)된 PC12 세포는 3일 동안 가용성 또는 응집된 Aβ1-42 처리(10μM)에 노출되었을 때 세포 생존율이 약 40% 감소함을 보여주었다. 명백하게, 0.01μM AL04 단독은 분화된 PC12 세포에서 어떠한 해도 일으키지 않았다. 종합하면, 이러한 데이터는 AL04가 Aβ1-42-유도 세포독성으로부터 세포를 보호할 수 있음을 나타낸다(도 7). AL04가 Aβ 응집, 플라크 형성 및 신경독성을 효율적으로 차단한다는 것은 분명하다.

실시예 10.5. AL04의 BBB 투과성 평가

이 연구에서, 본 발명자들은 Neuromics에서 구입한 상업적으로 이용가능한 시험관내 인간 BBB 모델을 사용했다. 본 발명자들은 1 내지 10uM의 농도를 사용하여 BBB 투과성 검정을 수행했다. 검정 후, 뇌 측으로부터 AL04의 농도를 인간 알부민 정량 ELISA를 사용하여 측정했고, 실시예 9에 기재된 식에 따라 계산된 침투 계수(P _e )를 추정하였다. AL04의 전달 플랫폼(CysC-HSA-dTAT)에서 TAT 펩타이드의 융합을 확인하기 위해, BBB 모델을 통한 AL04와 비-TAT 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)의 투과성을 비교하였다. TAT 단백질이 BBB를 붕괴시킨다는 여러 메커니즘, 예를 들어, 단단한 접합 단백질 발현의 감소, 내피에서 혈관 침투성 유도 및 재국재화가 제안되어 있다(Andras, 2005; Xu, 2012; Zhong, 2012; Toschi, 2001).

도 8a에 나타낸 바와 같이, 용량 의존성 결과는 AL04가 모델 BBB를 통해 수송되었음을 나타냈다. dTAT를 함유하는 AL04는 rHSA보다 높은 투과성으로 BBB 모델을 통해 뇌측으로 수송되는 경향이 있다. 또한, 1 및 10 uM에서 AL04의 BBB 모델을 통한 투과성에 대해 검정 시간이 미치는 효과를 평가했다. 본 발명자들은 세 가지 다른 분석 시간(60, 120, 240분)에서 투과성을 비교했다. 도 8b는 이러한 P _e 가 120분까지 점진적으로 증가했지만, 10uM AL04의 P _e 는 240분에 약간 감소하는 경향이 있음을 보여주었다.

실시예 11 - 이중 작용 요법 플랫폼(인간 혈청 알부민 융합 단백질)의 설계

실시예 11.1 - 재료 및 방법

이 연구에서, 시스타틴 C 서열을 선택하여 버전-1 HSA-융합 단백질-CPP 플랫폼을 시험했다. HSA-융합 단백질 플랫폼 버전1에 대한 벌키 HSA 구조의 영향을 피하기 위해, 시스타틴 C와 HSA 사이에 링커(GGSAS)를 삽입했다. HSA와 CPP 사이에는 절단 가능한 링커(GFLG)를 삽입했고, 이는 HSA 융합 단백질 침투로부터 CPP의 유리를 촉진할 수 있다(도 1). HSA-융합 단백질 플랫폼 버전 2(MOA1-HSA-MOA2-CPP: AL06, AL07, AL08, AL09, AL10)에서 4개의 서로 다른 단백질 서열이 선택되었다. 최종 당화 산물에 대한 수용체의 V 도메인(AL10에 대한 RAGE-V, RAGE-V&C1 도메인) 도메인은 버전-2에서 Abeta를 환원시키기 위한 작용 메커니즘1(MOA1)로서 사용했다. 3개의 다른 단백질을 포스포-타우 수준의 저하를 담당하는 작용 메커니즘2(MOA2)로서 사용했다: 버전 2 플랫폼에서 각각 Pten-Long(AL06의 경우), PDZ 도메인이 결실된 Pten-Long(AL09 및 AL10의 경우); AL07에 대한 TFEB(전사 인자 EB, 자가포식 및 리소좀 분해의 주요 조절인자); AL08에 대한 SIRT1(침묵 매칭 유형 정보 조절인자 2 동족체 1, 타우 엉킴을 탈아세틸화하고 프로테오솜 분해에 대해 표시함). 버전 2에서는 다양한 링커를 사용했다: GS 링커(GGGSGGGS)는 MOA1과 HSA 사이에 삽입했고; GS 링커/절단 가능한 링커(GFLGGGGSAS)는 HSA와 MOA2 사이에 삽입했으며; 절단 가능한 링커(GFLG)는 MOA2와 CPP 사이에 삽입하였다(도 3). HSA-융합 단백질 플랫폼 버전 2.1(MOA1-HSA-MOA2-CPP: AL12)에서, Abeta를 환원시키기 위한 작용 메커니즘1(MOA1)로서 RAGE-V 도메인을 사용하였고, 포스포-타우를 환원시키기 위한 MOA2로서 52개 아미노산(SIRT1의 엑손 4, SIRT1의 촉매성 도메인의 일부)을 사용했다. 버전 2.1에서는 GS 링커(GGGSGGGS)가 MOA1과 HSA 사이; MOA2와 CPP 사이에 삽입되었다. GS 링커/절단 가능한 링커(GFLGGGGSAS)는 HSA와 MOA2 사이에 삽입되었다. 본 발명자들은 HSA와 다른 융합 구획 사이의 입체 장애를 방지하기 위해 다양한 링커를 사용했다(도 4).

실시예 12 - 웨스턴 블롯

PC12 세포를 1% 말 혈청 함유 DMEM 배지에서 100 ng/㎖ NGF로 분화시켰다. 4일 후, NGF 고갈된 PC12 세포를 다양한 농도(0 내지 10 ug/㎖)의 AL04(또는 AL07, AL08, AL12)로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 빙랭된 DPBS(pH 7.5)에서 2회 헹구고, 용해 완충액으로 용해하고, 이전에 설명된 바와 같이(Bang, 2012) SDS-PAGE 및 면역블롯으로 처리했다. 다음 항체가 사용되었다: 타우46(총 타우), 포스포-AMPKα(Thr 172), AMPKα, 포스포-AMPKβ(Ser182), AMPKβ, 포스포-ULK1(Ser555), β3-튜불린, 시스타틴 C, GAPDH(글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소)는 Cell Signaling Technology에서 구입했다. 포스포-타우(AT8: Ser202/Thr205, Thermo), 포스포-타우(PHF-6: Thr231, Santa Cruz), 항인간 알부민(Bethyl). SuperSignal West Pico 화학발광 시약(Thermo)은 신호 검출을 위해 사용했다. 포스포-타우 및 총 타우 신호의 정량화는 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 농도계에 의해 수행했다. 각 시점의 포스포-타우 수준은 동일한 샘플의 총 타우 수준에 대해 정규화했고, 각각 정규화된 값은 100%로 할당된 최고 값에 대한 백분율로 표시했다. 통계적 유의성은 스튜던트 t 시험으로 결정했다.

실시예 13 - 면역침전(IP)

처리된 세포를 50mM Tris(pH 7.4), 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 15% 글리세롤, 포스파타제 저해제 칵테일(Santa Cruz), 및 프로테아제 저해제 칵테일(BioVision)에서 용해시켰다. 총 단백질(1000μg)을 표시된 바와 같은 β3-튜불린 항체 5μg과 함께 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하고 60㎕ TrueBlot 항-토끼 Ig 면역침전 비드(Rockland)로 추가 3시간 동안 침전시켰다. 면역침전된 비드를 용해 완충액으로 5회 세척하고, SDS 로딩 샘플 완충액을 첨가하였다. 샘플은 SDS-PAGE로 분리하고 이전에 설명된 바와 같이(Bang, 2014) 면역블롯팅으로 분석했다. 타우 블롯의 면역침전물에 대해, SuperSignal West Pico 화학발광 시약(Thermo)을 사용하여 검출하기 위해 Mouse TrueBlot ULTRA 항-마우스 Ig 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 이차 항체(Rockland)를 사용했다. 결합된 타우 및 투입 타우 신호의 정량화는 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하는 농도계에 의해 수행했다. 통계적 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 결정되었다.

실시예 14 - 결과

실시예 14.1 - 정제된 AL04(80kDa), AL07(135kDa), AL08(129kDa), 및 AL12(88kDa)의 특성화

AL04(버전 1), AL07 및 AL08(버전 2), 및 AL12(버전 2.1)를 발현시키고 청색 염료 친화성 크로마토그래피에 이어 이온-교환 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 농축하고 한외여과 스핀 칼럼을 사용하여 완충액을 PBS로 교환한 후, Bradford 단백질 검정을 사용하여 정량화했다. AL04 및 AL12는 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색에서 90% 초과의 순도가 관찰되었다. AL07 및 AL08의 순도는 쿠마시 염색 및 웨스턴 블롯 모두에 의해 확인되었고, 여기서 쿠마시 염색 겔에서의 주요 밴드는 인간 알부민 항체를 사용한 웨스턴 블롯에서 관찰된 밴드와 일치했다(도 5 및 11).

실시예 14.2 - AL04 또는 AL12는 분화된 PC12 세포 내로 용량 의존적 방식으로 침투한다.

기능적 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 전달하기 위한 새로운 전략이 지속적으로 평가되고 있지만, 임상 모델로 변경하기에는 전반적인 효율성 및 안전성이 여전히 부족하다(Zhang, 2012). 수용체 매개 및 세포내이입 경로를 포함한 다양한 내재화 방식이 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다(Gradishar, 2005). 따라서, 본 발명자들은 AL04 또는 AL12가 세포 내로 침투하는지의 여부를 조사했다. 세포를 24시간 동안 NGF 고갈 하에 다양한 농도(0 내지 5 ug/㎖)의 AL04 또는 AL12로 처리하였다. HSA 융합 단백질이 분화된 PC12 세포 내로 침투하는 정도를 평가하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 이용했다. 도 9에 도시된 바와 같이, AL04 또는 AL12 단백질은 분화된 PC12 세포 내로 용량 의존적 방식으로 침투한다(도 9). 이것은 상이한 버전의 HSA 융합 단백질[AL04, 시스타틴 C-HSA-CPP; AL12, RAGE(V)-HSA-SIRT1(엑손4)-CPP]이 PC12 세포 내로 쉽게 침투하며, 이들의 생물학적 활성을 세포내로 효과적으로 전달할 수 있음을 시사한다.

실시예 14.3 - HSA-융합 단백질(AL04, AL07 및 AL08)은 NGF-고갈된 PC12 세포에서 타우의 인산화 상태에 영향을 미친다.

AL07 및 AL08은 일반적인 Abeta 환원제인 RAGE-V, 및 포스포-타우 저하제로서 TFEB 및 SIRT1을 함유한다. 분화된 PC12 세포에 AL04 1ug/㎖ 또는 2ug/㎖의 AL04, AL07, AL08로 각각 24시간 동안 처리하였다. 세포를 용해시키고 총 세포 용해물(20 ug/레인)을 SDS-PAGE로 분리하였다. 타우 에피토프의 상대적 수준은 표시된 항체를 사용한 면역블롯팅에 의해 결정되었다: 총 타우의 척도인 타우-46; 타우 단백질 상의 Ser202/Thr205의 인산화된 잔기를 인식하는 AT8; 타우 단백질에 있는 Thr231의 인산화된 잔기를 인식하는 PHF-6. AL04, AL07 및 AL08의 투여는 Thr231에서 타우의 인산화를 감소시켰지만, AL04만은 Ser202/Thr205에서 p-타우를 감소시켰다. AL07 및 AL08 처리는 Ser202/Thr205에서 타우의 인산화를 저하시키지 못했다. 타우-46 항체로 측정되는 바와 같이, 총 타우의 수준은 AL04 처리에 의해 변화되지 않았으나, 총 타우의 수준은 AL07 및 AL08 처리에 의해 약간 증가했다. 면역블롯 분석의 결과는 Thr231에서 총 타우 단백질에 대한 포스포-키나제의 비율이 AL04, AL07 또는 AL08 처리에서 감소하는 반면(도 12), AL04 처리로부터 Ser202/Thr205에서 총 단백질에 대한 포스포-키나제의 비율은 유의적인 감소가 나타난다는 증거를 제공한다.

실시예 14.4 - AL04는 I2PP2A(포스포타제PP2A의 저해제)의 하향조절을 통해 NGF-고갈된 포스포-타우 수준을 감소시킨다.

PP2A 활성은 AD에서 손상되어 타우 신경원섬유 병리의 원인으로 여겨진다. I2PP2A는 성인 인간 뇌 포스포세린/포스포트레오닌 타우 단백질 포스파타제 활성의 약 70%를 차지하는 포스파타제인 PP2A의 강력한 저해제로서 기술되어 있다(Liu, 2005). 시스타틴 C는 AEP의 저해제이므로(Alvarez-Fernandez, 1999; van Kasteren, 2011), AL04(시스타틴 C 보유)는 I2PP2A의 하향조절을 통해 타우의 탈인산화와 관련된 PP2A 활성 조절에 영향을 미치는 것이 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 AL04 처리가 I2PP2A 절단(활성화)을 저해하는지의 여부를 조사했다. 본 발명자들은 분화된 PC12 세포를 NGF 고갈 하에 1 내지 10 ug/㎖ AL04로 24시간 동안 처리하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, AL04 처리는 I2PP2A의 약 20kDa 활성화 단편의 수준을 감소시켰다. 본 발명자들은 또한 AL04 처리가 P-타우 Ser202/Thr205의 수준을 용량 의존적 방식으로 유의적으로 감소시킨다는 것을 관찰했다. 유사하게, P-타우 Thr231은 또한 처리되지 않은 세포와 비교하여 AL04 처리된 세포에서 약간 감소된 수준을 나타냈다. 타우-46 항체로 측정한 총 타우의 수준은 AL04 처리에 의해 변화되지 않았다. GAPDH의 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 AL04가 I2PP2A의 하향조절을 통해 PP2A 활성을 구제함으로 인해 NGF 고갈-유도된 타우의 과인산화 수준을 감소시킨다는 것을 시사했다.

실시예 14.5 - 튜불린-타우 상호작용에 대한 타우 인산화의 저하 효과

타우는 신경 발달에서 미세소관 동역학을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 타우의 핵심 부위의 인산화는 타우의 정상적인 기능에 강한 영향을 미치고 병리학적 역할에 기여할 가능성이 있음이 밝혀져 있다(Cho, 2004; Sengupta, 1998; Lin, 2007). 본 발명자들은 다음으로 AL04의 존재 여부 하에 시험하여, NGF 고갈-유도된 타우의 과인산화가 튜불린 결합에 영향을 미치는데 필요한 것인지의 여부를 조사했다. 본 발명자들은 AL04의 처리가 타우-튜불린 결합 수준을, 처리 없이 수득되는 수준에 비해 2배 증가시켰음을 관찰했고(도 14), 이는 AL04가 포스포-타우 수준의 감소를 통해, NGF 고갈에 의해 감소된 미세소관-타우 상호작용을 회복시킨다는 것을 시사한다.

실시예 14.6 - AL04는 용량 의존적 방식으로 타우 키나제(AMPK) 조절을 통해 하이퍼포스포-타우를 감소시킨다.

AL04 처리가 포스포-타우를 감소시키므로, 본 발명자들은 AL04 처리가 또한 타우의 인산화와 잠재적으로 관련되어 있는 여러 키나제의 활성을 변경시키는지의 여부를 시험했다. AD 뇌 및 마우스 1차 뉴런에서 내인성 AMPK 활성화는 여러 부위에서 타우 인산화의 증가를 유도했고, 여기서 AMPK 저해는 타우 인산화를 빠르게 감소시켰다(Vingtdeux, 2011; Domise, 2016). 따라서, 본 발명자들은 AL04가 NGF 고갈-유도된 하이퍼포스포-타우의 감소를 유발했을 가능성 및 AMPK 신호 경로가 관련이 있는지를 조사했다. AMPK 활성화는 α1 및 α2 서브유닛의 활성화 루프에서 Thr172의 인산화를 필요로 하기 때문에 AMPK 활성은 포스포-AMPK의 발현 수준을 검출하는 웨스턴 블롯에 의해 결정했다(Bang, 2012; Bang 2014). 본 발명자들은 다음과 같은 실험을 수행했다. 첫째, AMPK 활성화 촉매성 α 서브유닛, p-AMPK(Thr172) 및 조절성 서브유닛, β1에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, p-AMPK(Thr172) 및 p-AMPKβ1(Ser182)의 감소된 수준은 용량 의존적 방식으로 관찰되었고, 이는 AL04 처리가 AMPK 활성을 감소시킴을 시사한다. 둘째, 본 발명자들은 ULK1, AMPK 의존적 기질 및 자가포식 조절인자를 조사했고(Egan, 2011; Kim, 2011; Guha, 2019), AL04로 세포를 처리한 후에 Ser 555에서 ULK1의 고도로 감소된 인산화를 AMPK 의존적 방식으로 관찰했다. 특히, 이들 세포에서 감소된 p-ULK1(Ser555) 수준은 2개의 진정한 AMPK 기질인 ACC 및 Raptor의 수준과 유사했다(데이터는 표시되지 않음). GAPDH는 변화되지 않았다. AL04 처리는 타우 키나제로 알려진 AMPK를 조절(불활성화)할 수 있으며, 이는 PC12 세포에서 낮은 포스포-타우 수준에 기여한다는 것을 시사했다.

실시예 15 - Tg2576, JNPL3 마우스를 사용한 해마 및 내후각 실험의 설명.

인간 AD에서, 질병 진행과 관련된 기억 결손은 AD에서 가장 취약하게 영향을 받는 곳 중에서 새로운 기억 형성에 중요한 영역인 내후각 피질(EC) 및 해마의 병리학적 변화로 인해 발생할 가능성이 있다(Knowles, 1998; Alvarez, 1995; Bannerman, 2001; Buckmaster, 2004). 해마는 하부장(subfield)인 치아이랑(DG), CA1, CA2, CA3 및 지지물(subiculum)로 구성된다. 해마와 EC는 스웨덴 이중 돌연변이(K670N, M671L)가 있는 인간 APP를 과발현하는 Tg2576 마우스에서 Aβ 침착의 주요 부위이며(Hsiao, 1996; Su, 1998; Reilly, 2003; Dong, 2007; Lauritzen, 2012; Xu, 2015), 또한 P301L 돌연변이가 있는 인간 타우를 발현하는 JNPL3 마우스에서 병리학적 타우(올리고머/응집된 포스포-타우를 포함하는 신경원섬유성 엉킴)를 나타내는 주요 부위이기도 하다(Lewis, 2000; Lin, 2003; Acker, 2013; 2018)고 보고되었다. 알츠하이머병(AD)에 대한 AL04의 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 AL04가 Tg2576 및 JNPL3 마우스의 해마 및 EC에서 각각 아밀로이드 베타(Aβ) 및/또는 과인산화된 타우의 부담을 각각 감소시킬 수 있는지의 여부를 조사했다. AL04 처리에 의한 Aβ 침착 또는 과인산화된 타우의 변화는 면역조직화학 검정을 사용하여 대조군(PBS 주입) 동물과 비교한다.

실시예 15.1 - 동물 및 처리

본 연구에 사용된 9 내지 10개월령의 Tg2576 암컷 마우스 및 3 내지 4개월령의 JNPL3 마우스는 Taconic Farms(미국 뉴욕주 제르맨타운 소재)에서 구입했으며, Noble Life Science, Inc.(미국 메릴랜드주 사익스빌 소재)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜(승인 번호 NLS-511)에 따라 유지 및 관리하였다. 본 연구의 모든 동물 실험은 L&J Biosciences, Inc.에 의해 계획되었고 Noble Life Science, Inc.와 함께 수행되었다. Tg2576 마우스는 2개월 동안 매주 복강내 주사에 의해 10 ㎎/㎏의 AL04 또는 PBS로 처리되었다. JNPL3 마우스는 6개월 동안 격주로 복강내 주사에 의해 5 ㎎/㎏의 AL04 또는 PBS로 처리되었다. 처리 후 동물은 아이소플루란으로 마취했고 뇌를 제거했다. 뇌는 정중선(시상)에서 분할하여 면역조직화학 분석을 위해 뇌의 절반만을 해부하였다.

실시예 15.2 - 조직학 및 면역조직화학 분석

뇌는 추가 24시간 동안 후고정시킨 다음, 표준 프로토콜을 사용하여 파라핀에 포매시켰다. 관상 절편(5㎛)은 마이크로톰 상에서 절단했고, 다음 1차 항체를 사용하여 면역조직화학을 위해 처리했다: 6E10(인간 Aβ의 잔기 1-16, Biolegend, 1:500), AT8(포스포-타우 Ser202/Thr205, Thermo, 1:1000) 및 HT7(총 타우, Thermo, 1:1000). 1차 항체와 인큐베이션한 후, 절편은 PBS로 세척한 다음, 절편을 2차 항체[HRP-접합됨(1:1000, Jackson Labs) 또는 형광 AlexaFluor 항체, Alexa 488-접합됨(Thermo, 1:1000)]와 함께 인큐베이션했다. Tg2576 마우스 뇌 샘플에서 Aβ 침착 또는 JNPL3 마우스 뇌에서 총 타우를 검출하기 위해, HRP-접합 항체가 있는 슬라이드를 디아미노벤지딘(DAB)과 함께 인큐베이션하고 헹구고 헤마톡실린으로 대비염색하였다. DAB 발색에 대해, 슬라이드를 광학 현미경(Zeiss)을 사용하여 분석했다. 형광 슬라이드는 염색된 핵을 위해 DAPI와 함께 5분 동안 인큐베이션했다. JNPL3 마우스 뇌 샘플에서 포스포-타우의 면역형광은 여기 필터 340(DAPI용, 청색) 및 488(p-타우용, 녹색)을 가지고 공초점 현미경(Zen2, Zeiss)을 사용하여 가시화했다. 조직학/면역조직화학 및 이미지화 절차는 L&J Biosciences Inc.에서 계획했고, 각각 Histoserve(미국 메릴랜드주 제르맨타운 소재) 및 CVPath(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)에 의해 수행되었다.

실시예 16 - 결과

실시예 16.1 - AL04는 Tg2576 마우스의 해마 및 내후각 피질에서 아밀로이드 베타의 침착을 감소시킨다.

아밀로이드 캐스케이드 가설에 기초할 때, Aβ의 축적 및 응집은 AD 발병의 병리학적 및 임상적 증상을 촉발한다(Walsh, 2012; Hardy, 1992; Hardy, 2002). 이전 연구들은 Tg2576 마우스의 뇌에서 Aβ 축적이 일어났고 행동 장애가 발생했다고 보고했다(Hsiao, 1996). 내후각피질에서부터 해마의 치아 이랑까지의 뉴런 투사인 관통 경로(perforant pathway)의 변화는 기억 손상과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Hyman, 1984; Hyman, 1986; Gomez-Isla, 1996; van Strien, 2009). 따라서, 본 발명자들은 AL04 처리가 Tg2576 마우스의 해마와 내후각 피질에서 Aβ 축적을 감소시켰는지의 여부를 조사했다. 9 내지 10개월령부터 Tg2576 마우스에게는 매주 PBS 또는 AL04(10 ㎎/㎏)를 복강내 주사했다. 동물은 총 8회 용량을 투여받았고, 9주째 죽였다. AL04 처리는 내약성이 좋았다. 아밀로이드 β 전구체 단백질(AβPP)은 α- 및 β-세크레타제에 의해 처리된다. 6E10 항체는 Aβ 도메인의 처음 16개의 잔기를 인식하고, 이에 따라 이론적으로 전체 길이의 βAPP, C99(베타-세크레타제, BACE1에 의해 분해된 15kDa의 APP 단편) 및 Aβ(Lauritzen, 2012)를 표지한다. 11 내지 12개월령의 PBS 처리 Tg2576 마우스에서 6E10(도 16)은 CA1, CA3, 및 DG 하부장 영역에서 해마에 조밀한 침착(갈색)의 존재를 나타낸다. 또한, PBS 처리된 동물의 내후각 피질에서 6E10 표지는 세포외 Aβ 침착을 강하게 나타낸다(도 17). 이와 대조적으로, AL04 처리된 Tg2576 마우스의 해마의 각 하부장(CA1, CA3 및 DG) 및 내후각 피질에서는 Aβ 축적이 감소되는 것으로 나타났다(도 16 및 도 17). 이러한 결과는 AL04가 Tg2576 마우스를 보유하는 인간 APP 돌연변이체의 해마 및 내후각 피질에서 Aβ 부담을 감소시킨다는 것을 시사한다.

실시예 16.2 - AL04는 JNPL3 마우스의 해마에서 과인산화된 타우를 감소시킨다.

AD 및 다른 신경퇴행성 장애에서, 타우는 과인산화되고 미세소관으로부터 분리되어, 포스포-타우 응집 및 신경 체세포 및 수상돌기에서 신경원섬유 엉킴의 형성을 초래한다. 이러한 신경원섬유 엉킴(NFT)은 AT8(p-타우S202/T205), AT100 및 PHF1(p-타우S396/404)과 같은 세린 및 트레오닌 항체/쌍을 이룬 나선 필라멘트(PHF) 상의 다수의 포스포-타우에 의해 잘 인식된다(Lewis, 2000; Augustinack, 2002; Lace, 2009).

NFT 형성은 타우병증 모델에서 병리학적 증상과 밀접하게 연관되어 있다(Braak, 1991, 1997; Duyckaerts, 1997; Rub, 2000; Sassin, 2000; Lewis, 2000; Lace, 2009). 인간의 전두측두엽 치매를 유발하는 인간 타우 P301L 돌연변이를 발현하는 JNPL3 마우스는 빠르면 4.5개월에 NFT를 발생시키고 이후 단계에서 운동 기능의 점진적인 악화를 발생시킨다(Lewis, 2000). 본 발명자들은 AL04 처리가 JNPL3 마우스의 해마 및 EC에서 포스포-타우의 수준을 감소시킬 수 있는지의 여부를 조사했다. 생후 3 내지 4개월부터 JNPL3 마우스에게 PBS 또는 AL04(5 ㎎/㎏)를 6개월 동안 격주로 복강내 주사했다. 동물은 총 12회 용량을 투여받았고 25주에 죽였다.

과인산화된 타우의 수준을 저하시키는 개념 증명으로서, AT8(포스포-타우, S202/T205) 면역형광 분석을 해마 및 EC의 DG 하부장을 통해 CA1/CA3에서 수행했다. 관통 경로인 해마 및 EC는 기억 형성에 중요한 역할을 하며 비교적 노화 초기에 타우 병리, 치매 및 경미한 인지 장애에 취약한 영역이다(Braak and Braak, 1991; Duyckaerts, 1997; Tulving, 1998; Braak, 2006; Lace, 2009).

본 발명자들은 PBS 처리된 9 내지 10개월령 동물의 해마에서 포스포-타우(S202/T205) 양성 세포를 관찰했다(도 18). 포스포-타우(S202/T205)의 존재는 축삭 타우가 비정상적으로 인산화되고 해마에 대한 투사에서 축삭 기능장애가 노화의 흔한 조기 변화일 가능성을 상승시킨다는 것을 시사한다(Lace, 2009). 이와 대조적으로, AL04 처리된 9 내지 10개월령 마우스의 해마 및 EC의 CA1 및 CA3 하부장에서는 포스포-타우 수준(S202/T205)의 유의적인 감소가 검출되었다(도 18). 이러한 결과는 AL04가 JNPL3 마우스의 해마 및 EC에서 NFT(과인산화된 타우)를 저하시키고 CA1, CA3 및 치아 이랑을 함유하는 해마의 하부장 내에서 타우 병리학적 중증도의 확산을 약화시킨다는 것을 시사했다.

시스타틴 C는 AD 발달에서 신경보호 역할을 하고 치료제로서 임상적 관련성이 있다(Li, 1996; Tizon, 2010). AD 치료제의 후보로서 시스타틴 C 함유 이중 작용 요법(DAT) 플랫폼에 대한 담체 및/또는 CPP의 선택에 대한 조사는 도 10에 요약되어 있다. 담체 단백질로서 Fc 또는 HSA(생체내 장기 지속성 단백질이라고도 알려져 있음) 및 CPP로서 dNP2(Lim, 2015) 또는 dTAT를 함유하는 AL04의 4개의 변이 작제물, 일명 AL04-1 내지 AL04-4는 실시예 11.1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이러한 작제물을 사용하여 단백질 발현을 CHO-S 세포 또는 CHO-DG44 세포에서 각각 일시적 발현 및 안정적 발현에 대해 시험했다(데이터는 제시되지 않음). CPP로서 dTAT와 함께 Fc 또는 HSA를 함유하는 작제물은 dNP2를 갖는 작제물보다 더 큰 단백질 발현 수준을 나타내었다. 더욱이, dTAT를 갖는 HSA 융합체는 Fc 융합 작제물보다 일시적 및 안정적 발현 모두에서 더 나은 발현을 갖는 것으로 관찰되었다(데이터는 제시되지 않음). Fc-융합 단백질이 인간 PBMC로부터 염증성 사이토카인 방출을 유도했다는 점에서 바람직하지 않은 면역 세포 활성화가 보고되었다(Edwards, 2014). CysC-HSA-dTAT는 AD 치료제 개발을 위한 DAT 플랫폼의 적합한 작제물인 것으로 시사된다. DAT 플랫폼은 AD 치료(버전 1 및 2)를 위한 치료제 후보인 7개의 다른 작제물의 수립에 적용되었으며, 이들의 발현 및 정제에 대한 요약은 도 11에 제시된다. 7개의 다른 작제물은 실시예 11.1에 기재된 바와 같이 제조되었고, 이들의 발현 및 정제 과정이 연구되었다. 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 염색(데이터는 제시되지 않음)에 의해 결정된 DHFR 결손성 CHO-DG44 세포에서 MTX를 사용한 유전자 증폭 및 일시적 발현을 포함하는 융합 단백질의 발현 수준은 분자량에 의존적이었다. AL06(145kDa), AL09(144.5kDa), 및 AL10(156kDa)은 단백질을 거의 발현하지 않았고 MTX/DHFR 유전자 증폭법을 통해 단백질을 생산하지 못했다. 각 융합 단백질의 품질을 결정하기 위해, 단백질은 실시예 5에 기재된 바와 같이 정제하고 SDS-PAGE로 분석하였다(데이터는 제시되지 않음). AL07과 AL08 단백질은 정제 동안 이들 단백질이 분해되었기 때문에 부분적으로 정제되었다(도 5). 도 11은 AL04(80kDa) 및 AL12(88kDa)가 단백질 발현 및 정제에 양호한 작제물임을 나타낸다.

참고문헌

본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.

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본 기술분야의 기술자는 본 명세서에 구체적으로 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 일상적인 실험만을 사용하여 확인할 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> L & J Bio Co., Ltd. <120> METHOD OF TREATING CENTRAL NERVOUS SYSTEM DISEASE <130> WO2020/150725 <140> PCT/US2020/014338 <141> 2020-01-21 <150> 62/794,147 <151> 2019-01-18 <150> 16/556,957 <151> 2019-08-30 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <400> 1 Gly Gly Ser Ala Ser 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <400> 2 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker <400> 3 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker <400> 4 Gly Phe Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AL04 <400> 5 tccagccctg gcaagccccc tcgcctggtg ggcggcccca tggacgccag cgtggaggag 60 gagggcgtga ggcgggctct ggacttcgcc gtgggcgagt acaacaaggc ctccaatgat 120 atgtatcact ctagggctct gcaggtggtg agagcccgca 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Glu Tyr Lys Phe 515 520 525 Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser 530 535 540 Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser 545 550 555 560 Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp 565 570 575 Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr 580 585 590 Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn 595 600 605 Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro 610 615 620 Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr 625 630 635 640 Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu 645 650 655 Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val 660 665 670 Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp 675 680 685 Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser 690 695 700 Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Phe Leu Gly Tyr Ala Arg Lys Ala Ala 705 710 715 720 Arg Gln Ala Arg Ala Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 725 730 735 Gly <210> 7 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440

Claims

치료를 필요로 하는 대상체의 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 (a) 뇌에서의 부족이 알츠하이머병과 상관관계가 있는 제1 단백질; (b) 생체내에서 연장된 순환-수명(circulation-lifetime)을 제공하는 제2 단백질; 및 (c) 혈액 뇌 장벽 횡단(blood brain barrier crossing) 촉진 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효 용량을 전신 투여하는 단계를 포함하되; 상기 융합 폴리펩타이드는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 횡단하는, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단백질의 아미노산 서열은 상기 제2 단백질의 아미노산 서열에 공유 결합되어 있는, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 단백질의 아미노산 서열은 상기 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드에 절단 가능하게 공유 결합되어 있는, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 공유 결합은 pH의 변화에 의해 절단될 수 있거나, 또는 도입된 절단 부위가 글리실 페닐알라닐 류실 글리신(GFLG)인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 치료적 유효 용량은 적어도 약 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중을 포함하는, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 상기 뇌에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키는 단백질 및/또는 상기 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 단백질인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 제1 단백질은 상기 뇌에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키고 상기 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 이중 기능의 단백질을 갖는, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 시스타틴(Cystatin) C, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질-1 클러스터 IV(LRP1-C4), 최종 당화 산물(advanced glycation end product)에 대한 가용성 수용체(sRAGE), RAGE-v, 또는 미엘린 염기성 단백질(MBP)인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 제1 단백질은 시스타틴 C 또는 RAGE-v인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 제1 단백질은 시스타틴 C인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 단백질은 인간 혈청 알부민인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드는 dTAT인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드에서, 상기 제1 단백질은 내후각 피질 또는 해마에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키고/시키거나 내후각 피질 또는 해마에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 단백질인, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 제1 단백질로서 상기 뇌에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키는 단백질을 포함하는 융합 단백질이 상기 제1 단백질로서 상기 뇌에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 단백질을 포함하는 상기 융합 단백질과 동시 투여 또는 순차적으로 투여되는, 중추신경계에서 단백질 결핍을 치료하는 방법.
치료를 필요로 하는 대상체의 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법으로서,
상기 대상체에게 내후각 피질 또는 해마에서 아밀로이드 베타(Abeta) 침착을 감소시키는 제1 단백질, 및 내후각 피질 또는 해마에서 과인산화된 타우의 수준을 감소시키는 제2 단백질을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 치료적 유효 용량을 전신 투여하는 단계를 포함하되, 상기 융합 폴리펩타이드는 생체내 연장된 순환-수명을 제공하는 단백질 및 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드를 포함하고; 상기 융합 폴리펩타이드는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 횡단하는 것인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 생체내 연장된 순환-수명을 제공하는 단백질의 아미노산 서열이 상기 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드에 절단 가능하게 공유 결합되어 있는, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 공유 결합은 pH의 변화에 의해 절단될 수 있거나, 또는 도입된 절단 부위가 글리실 페닐알라닐 류실 글리신(GFLG)인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 치료적 유효 용량은 적어도 약 1 내지 10 ㎎/Kg 체중을 포함하는, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 질환이 알츠하이머병인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 제1 단백질은 시스타틴 C, 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질-1 클러스터 IV(LRP1-C4), 최종 당화 산물에 대한 가용성 수용체(sRAGE), RAGE-v 또는 미엘린 염기성 단백질(MBP)인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 제2 단백질은 시스타틴 C, Pten-long, PDZ 도메인이 결실된 Pten-long, TFEB, 또는 SIRT1인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 생체내에서 연장된 순환-수명을 제공하는 단백질이 인간 혈청 알부민인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 혈액 뇌 장벽 횡단 촉진 펩타이드가 dTAT인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 제1 단백질이 시스타틴 C 또는 RAGE-v인, 중추신경계 퇴행성 질환을 치료하는 방법.