KR20230079267A - AIMP2-DX2 및 선택적으로 miR-142에 대한 표적 서열 및 이의 조성물을 이용한 신경질환의 치료방법 - Google Patents

AIMP2-DX2 및 선택적으로 miR-142에 대한 표적 서열 및 이의 조성물을 이용한 신경질환의 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 AIMP2-DX2 및 임의로 miR-142에 대한 표적 서열을 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

AIMP2-DX2 및 선택적으로 miR-142에 대한 표적 서열 및 이의 조성물을 이용한 신경질환의 치료방법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 9월 30일자로 출원된 미국 공개특허 제63/085,950호에 기술되어 있으며, 상기 개시 내용은 그 전체가 본 문서에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록 참조
본 명세서와 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(이름:2493-0004WO01_Sequence Listing_ST25.txt, 크기: 28KB, 생성 날짜: 2021년 9월 30일)로 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 전체가 참조로 본 문서에 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 AIMP2-DX2 및 선택적으로 miR-142에 대한 표적 서열을 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경질환의 치료방법에 관한 것이다.
포유류의 뇌는 신경줄기세포의 분열, 분화, 생존과 사멸, 시냅스의 형성 등 일련의 과정을 거쳐 전신 신경망의 구축을 통해 복잡한 기능을 수행할 수 있다. 동물 뇌의 뉴런은 성숙한 상태에서도 신경 성장에 필요한 다양한 물질을 지속적으로 생산하여 축삭과 수상돌기의 성장을 유도한다. 또한 새로운 학습과 기억이 이루어질 때마다 신경망과 시냅스 연결의 끊임없는 시냅스 리모델링이 일어나기 때문에 지속적으로 분화를 겪는다고 할 수 있다. 뉴런은 세포분화 및 시냅스 형성 과정에서 신경성장인자와 같은 표적-유래 생존 인자를 받지 못하면 세포사멸을 겪게 되며 스트레스로 인한 세포사멸은 퇴행성 뇌질환의 주요 원인이 된다. 손상된 신경의 뒤쪽에 있는 축삭돌기는 윌러 변성(Wallerian degeneration)으로 알려진 과정에 의해 퇴화되고 슈반 세포(Schwann cell)는 분화 전 분열 후 생존과 소멸을 통한 표적 신경의 결정 등을 포함하는 재생 과정을 거쳐 재생되는 반면, 신경의 세포체가 축삭 재성장을 재개한다.
전 세계적으로 고령인구의 급속한 증가와 함께 신경퇴행성 질환의 발현이 매년 지속적으로 증가하는 추세이다. 아직까지 확실한 예방법과 치료법이 개발되지 않았기 때문에 이러한 질환에 탁월한 효능을 보이는 치료제는 아직까지 없다. 또한 이러한 질환에 사용되는 기존 치료제 및 치료법은 장기간 투여로 인해 발생하는 부작용 및 독성을 자주 나타낸다. 또한 질환의 완전한 치료보다는 일시적으로 증상의 정도를 줄이거나 증상의 진행을 지연시키는 효과만 있기 때문에 부작용과 독성을 줄이면서 결정적인 치료 노력을 기울인 소재를 발굴하고 개발하는 것이 시급하다.
1990년 첫 임상시험 개시 이후 2002년까지 약 600건의 인간 대상 유전자 치료의 임상시험이 수행되었다. 2003년 인간 유전체 염기서열 분석 완료를 기반으로 향후 다양한 유전자 발굴을 통해 새로운 유전자 치료제 개발에 가속화될 것이다. 그러나 현재까지 승인된 유전자 치료제의 75%는 암이나 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 등 단일유전자 질환을 대상으로 하고 있으며, 신경질환이나 재생에 대한 유전자 치료제 개발이 활발하지 않다(Recombinant DNA Consulting Paper of NIH, USA(2002), Gene Therapy Clinical Trials, J. Gene Med.(2002) www.wiley.co.uk/genmed). 그럼에도 불구하고 파킨슨병에 대한 감각신경세포의 치료 및 재생을 위해 NT-3 및 신경아교세포유래신경세포인자(GDNF)와 같은 신경성장인자를 이용한 유전자치료제의 개발이 이미 시도되고 있다. (GDNF family ligands activate multiple events during axonal growth in mature sensory neurons (Mol. Cell. Neurosci. 25:4453-4459 (2004)). 신경계 장애와 관련된 뇌기능에 대한 전반적인 신경과학 연구의 진전이 더디기 때문에 다양한 만성 신경계 질환에 대한 치료제 개발도 난항을 겪고 있다.
AIMP2-DX2는 AIMP2의 대안적인 길항 스플라이싱 변이체로 다인자 세포사멸 유전자이다. AIMP2-DX2는 AIMP2의 기능을 방해하여 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다. AIMP2의 경쟁적 억제제로서 작용하는 AIMP2-DX2는 TRAF2의 유비퀴틴화/분해의 억제를 통해 TNF-알파 매개 세포사멸을 억제한다. 아울러, AIMP2-DX2가 기존의 폐암유발인자로 보고된 바 있으며, 기존 연구에서는 암세포에 광범위하게 발현하는 AIMP2-DX2가 AIMP2의 암 억제 기능을 방해해 암을 유도하는 것으로 확인됐다.
게다가, AIMP2-DX2가 신경질환 치료에 유용할 수 있음이 확인되었다 (KR10-2015-0140723(2017) 및 US2019/0298858(2019.10.23 공개)).
본 발명은 AIMP2-DX2 및 선택적으로 miR-142에 대한 표적 서열을 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경질환의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 갖는 개체의 발병을 지연시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 갖는 개체의 신경 세포사멸을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축의 치료를 필요로 하는 개체의 근위축 치료방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 개체의 질환은 근위축성 측삭 경화증(ALS, amyotrophic lateral sclerosis)일 수 있고 척수성 근위축증(SMA, spinal muscular atrophy)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병(PD)을 갖는 개체의 생존율을 증가시키거나 수명을 연장시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병(PD)이 있는 개체의 행동 결함을 예방, 운동 증상을 회복, 및/또는 신경 손상을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병(AD) 개체의 아밀로이드 베타 올리고머(Aβ-O)-유도 신경 세포사멸 또는 Aβ-O-유도 p53 발현을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 척수성 근위축증(SMA)을 갖는 개체에서 신경근 접합부(NMJ) 손상을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 가진 개체의 신경근 접합부(NMJ) 손상 억제, NMJ 차단으로 인한 호흡 부전 억제, 호흡 곤란, NMJ 차단으로 인한 근육 경련 또는 속상수축을 억제방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병(PD)이 있는 개체의 아노이키스(anoikis) 억제, 및/또는 라미닌 수용체 안정화 증가방법이 제공된다.
상기 재조합 벡터는 miR-142 표적 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 벡터는 AIMP2-DX2에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 레트로바이러스(LTR) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 또는 옵신(opsin) 프로모터일 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열은 AIMP2-DX2 유전자에 대해 3'일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20과 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 10 또는 11과 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑손을 갖지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑손을 갖지 않을 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열은 ACACTA를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 miR-142 표적 서열은 ACACTA 및 서열번호 5의 1 내지 17개의 추가적인 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 5(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 miR-142 표적 서열은 ACTTTA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 miR-142 표적 서열은 ACTTTA 및 서열번호 7의 1 내지 15개의 추가적인 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 7(AGTAGTGCTTTCTACTTTATG)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열은 본 문서에 기재된 벡터에서 2 내지 10회 반복될 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV), 조류 육종/백혈병(ASLV), 비장 괴사 바이러스(SNV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 벡터일 수 있다.
도 1은 재조합 벡터의 예를 나타낸다.
도 2는 in vitro 환경에서 재조합 벡터의 신경세포-특이적 발현 효과를 나타낸다.
도 3은 파킨슨병 모델에서 scAAV-DX2-miR142-3pT의 뇌 실질내(흑질) 주사 후 뇌 특이적 발현을 나타낸다.
도 4는 miR142-3pT(밑줄)의 4개 반복을 갖는 miR142-3pT(표적) 서열(서열번호 6)을 나타낸다.
도 5a는 1x, 2x 및 3x 반복 및 돌연변이 서열을 갖는 miR142-3pT의 개략도를 나타낸다.
도 5b는 miR-142-3pT의 1x, 2x 및 3x 반복을 사용한 DX2 발현에 대한 miR142-3p 억제를 나타낸다.
도 6은 코어 결합 서열이 DX2 억제에서 중요함을 나타낸다. DX2의 현저한 억제를 나타내는 Tseq x3 반복을 갖는 벡터(도 5b) 및 DX2 컨스트럭트의 대조군으로 사용하였다. 100 pmol의 miR-142-3p 처리는 Tseq x3 벡터를 상당히 억제했지만 DX2 및 돌연변이 서열은 억제하지 않았다.
도 7은 scAAV2-DX2-miR142-3p의 척수강내 주사 후 ALS 모델의 척수(spinal cord)로부터 추출된 총 RNA를 나타낸다. qRT-PCR을 수행하였다.
도 8은 in vitro 환경에서 본 발명의 발현벡터의 신경세포 특이적 발현 효과를 나타낸다.
도 9a 내지 9e는 DX2 형질전환 마우스는 로테논-처리 마우스에서 운동 증상을 회복함을 나타낸다. 도 9a는 표시된 마우스에서 마우스 뇌로 TH 발현을 분석 결과를 나타낸다. 검은색 점선 사각형은 TF로 염색된 영역을 나타낸다. 도 9b는 로타로드 분석(Rotarod analysis). 로테논-처리된 야생형 및 DX2 형질전환(TG) 마우스에서 잠복기. 도 9C는 폴 테스트. 로테논-처리 야생형 및 DX2 TG 마우스의 수직 이동(왼쪽 패널) 및 T-턴 시간(오른쪽 패널). 동물; n=6(각 그룹에서), ns; 유의하지 않음, ** P<0.01, * P<0.05, t-테스트. 도 9d 및 9e는 DX2는 로테논-유도 PD 마우스 모델에서 신경 손상 및 행동을 개선한다. 도 9d는 폴 테스트(pole test). scAAV-DX2는 로테논-처리된 PD 마우스 모델에서 운동 조정 및 균형을 회복했다. "Con" 및 "GFP"는 야생형 및 로테논-처리된 GFP 주입 마우스를 나타낸다. "용량 1" 및 "용량 2"는 로테논-처리된 마우스에서 DX2의 상이한 주사 용량을 나타낸다. 도 9e는 마우스 흑질의 면역조직화학 및 면역형광 이미지를 나타낸다. 상단 패널은 선조체(striatum)의 TH 양성 세포를 나타내고 하단 패널은 주입된-GFP 발현 바이러스의 분포를 나타낸다. 검은색 점선 사각형은 TH의 스테인드 영역을 나타낸다. 동물; n=5(각 그룹에서), ns; 유의하지 않음, ** P<0.05, * P<0.01, t-테스트.
도 10a 내지 10h는 DX2는 6-OHDA-유도 PD 모델에서 행동 장애를 방지한다. 도 10a는 scAAV-DX2-처리 마우스는 식염수 또는 비히클(GFP)에 비해 반대쪽 회전 수준이 낮았으며 이는 DX2가 도파민성 뉴런의 손상을 약화시켰음을 나타낸다. 도 10b는 DX2-처리된 마우스는 반대측 앞발 접촉이 증가한 것으로 나타났으며, 이는 AAV-DX2가 도파민성 뉴런에서 일측성 손상을 약화시켰음을 나타낸다. 도 10c는 AAV-DX2 처리된 마우스는 더 적은 오른쪽-편향된 신체 스윙을 나타내었다. 동물; 식염수(식염수-처리된 야생형 마우스) n=4, GFP(GFP 주입된 6-OHDA 처리된 마우스) n=5, DX2(DX2 주입된 6-OHDA 처리된 마우스) n=11(각 마우스), scAAV ; scAAV-GFP 4 x 109 vg, scAAV-DX2 낮은 1.6 x 108 vg, scAAV-DX2 4 x 109 vg, ns; 유의하지 않음, * P<0.05, ** P<0.005, *** P<0.001, t-테스트. 도 10d는 GFP 및 DX2 주입 마우스 뇌의 면역형광 이미지. 흰색 사각형 상자는 TH 양성 도파민성 신경 세포를 나타내고 흰색 화살표는 표시된 바이러스 주입 부위를 나타낸다. 도 10e는 각 마우스 그룹의 생존율. 동물; n=15, 식염수는 식염수 처리된 야생형 마우스를 나타낸다. L-DOPA, GFP 및 DX2는 6-OHDA-처리 마우스에서 L-DOPA, GFP 및 DX2 주입을 나타낸다. scAAV; scAAV-GFP(GFP) 4 x 109 vg, scAAV-DX2(DX2)(낮음) 1.6 x 108 vg, scAAV-DX2(DX2)(높음) 4 x 109 vg. 도 10f 및 10g. naive, 6-OHDA 및 DX2 처리 마우스의 DX2 및 Bax mRNA 발현. *** P<0.001, t-테스트. 도 10h는 AAV-DX2 주입된 6-OHDA 마우스 모델에서 DX2 발현 세포를 확인하기 위한 RNA in situ 혼성화를 나타낸다.
도 11a 내지 11g는 DX2는 MPTP 유발 PD 모델에서 운동 증상을 회복시킴을 나타내는 도면이다. 도 11a는 scAAV-DX2-처리 마우스는 비히클(scAAV-GFP, GFP)과 비교했을 때 로타로드(rotarod) 테스트에서 떨어지는 대기 시간이 약간 더 길어 scAAV-DX2가 도파민성 뉴런에 대한 손상을 약화시켰음을 나타낸다. 도 11b는 DX2-처리 마우스는 SHIRPA 테스트를 기반으로 개선된 운동 활동을 보여주는 도면이다. 도 11c는 DX2-처리 마우스는 비교적 낮은 수준의 사지 결손을 보여주는 도면이다. 도 11d는 DX2-과발현 마우스는 비히클 대조군(GFP)과 비교할 때 개선된 그루밍 비율을 보여주는 도면이다. 도 11e는 마우스 흑질에서 TH-양성 세포의 면역형광 이미지. 흰색 사각형 박스는 TH 발현 영역을 나타내는 도면이다. 도 11f 및 11g는 지시된 마우스 뇌의 DX2(도 11f) 및 Bax(도 11g) mRNA 발현을 나타내는 도면이다. Naive, GFP 및 DX2는 식염수-처리된 야생형 마우스, GFP-주입된 MPTP-처리된 마우스 및 DX2-주입된 MPTP-처리된 마우스를 나타낸다. 동물; Naive n=6, GFP n=9, DX2 n=12, scAAV; scAAV-GFP 4 x 109 vg, scAAV-DX2 4 x 109 vg, * P<0.05, ** P<0.001, *** P<0.0001, t-테스트.
도 12a 및 12b는 DX2의 투여는 루게릭병 모델에서 질병 발병을 지연시키고(도 12a) 수명을 연장시킴을 나타내는 도면이다(도 12b). 동물; n=5.
도 13은 밝은 필드 현미경에서의 세포 형태를 나타낸다. AAV-DX2-감염 세포에서 DX2의 과발현은 Aβ-O-매개 세포 사멸을 억제한다. DX2는 Aβ-O-처리된 세포에서 세포 생존력을 증가시킨다. SK-SY5Y 세포를 25 μM의 Aβ-O의 부재 또는 존재 하에 AAV-DX2 또는 AAV-GFP와 함께 인큐베이션하고, 48시간 후, 세포사멸을 현미경으로 관찰하였다. 원본 확대 이미지, X40(상부 패널), X100(하부 패널).
도 14는 도 13에서의 세포 사멸의 정량화를 나타낸다. 흰색 박스는 세포사멸률을 나타내고 검정색 박스는 세포 생존율을 나타낸다.
도 15는 p53의 발현 수준을 나타낸다. DX2 발현은 신경독-유발 p53 발현에서 중요한 역할을 한다. * AAV-DX2(#1) 및 AAV-DX2(#2)는 서로 다른 배치에서 생성된 AAV-DX2 바이러스를 나타낸다.
도 16a 내지 16d는 돌연변이 SOD1은 KARS1과 선택적으로 상호 작용함을 나타내는 도면이다. 도 16a는 B42-SOD1 WT 및 돌연변이 G85R 및 G93A에 대한 Lex-KARS1의 결합 친화도를 효모 2-하이브리드 분석에 의해 테스트하였다. 도 16b는 HA-SOD1 WT, G85R 및 G93A를 HEK 293 세포에 형질전환시키고 HA 항체로 면역침전(IP)을 수행하였다. KARS1 및 SOD1의 수준은 면역블롯팅에 의해 결정되었다. 도 16c는 효모 2-하이브리드 분석에 의해 결정된 SOD1 돌연변이에 대한 KARS1 단편의 결합 친화도를 나타낸다. 도 16d는 N2A 세포를 myc-KARS1 및 SOD1 WT, G93A, G85RA로 형질전환시켰다. myc-KARS1의 IP를 수행하고 AIMP2 및 67LR(라미닌 수용체)의 검출을 위해 면역블로팅하였다.
도 17a 내지 17f는 돌연변이 SOD1은 아노이키스를 유도하는 67개의 라미닌 수용체를 감소시킴을 나타내는 도면이다. 도 17a는 SK-N-SH 세포를 SOD1 WT 및 G93A로 형질전환시켰다. 상기 세포를 수확하고 67 라미닌 수용체(LR)에 대해 면역블롯팅을 수행하였다. 도 17b는 신경세포를 SOD1 WT 및 G93A로 형질전환시킨 다음 22x22 커버 슬립에 파종하였다. 상기 세포를 고정시킨 후 KARS1 또는 67LR 항체로 처리하였고 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하였다. 흰색 화살표는 염색된 라미닌 수용체를 나타낸다. 도 17c는 WT 및 G93A의 SOD1 형질전환이 이동에 미치는 영향을 확인하기 위해 신경 세포를 상부 챔버에 로딩하고 WT 및 G93A를 8.0 μm 기공 크기의 멤브레인으로 분리된 트랜스-웰 플레이트의 하부 챔버에 로딩했다. 상기 멤브레인이 제거되고 염색되었다. 도 17d는 신경 세포를 SOD1 WT 또는 G93A로 형질전환시킨 후 라미닌 1(LN1)으로 0, 15, 30 및 60분 동안 처리하였다. pERK 및 ERK 수준은 웨스턴 블롯으로 확인했습니다. 도 17e는 면역침전에 의해 결정된 WT 및 돌연변이 SOD1 발현 세포에서 KARS1의 67 LR에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 도 17f는 SH-SY5Y 세포를 24시간 동안 KARS1로 형질전환시킨 후 SOD1 WT, G85R 및 G93A로 24시간 동안 형질전환시켰다. 그런 다음 hema-coated에 파종하였고 TNF-α와 cycloheximide (CHX)로 6시간 동안 처리했다. 세포 생존력을 관찰하기 위해 MTT 분석을 수행하였다.
도 18a 내지 18d는 AIMP2-DX2 유전자가 KARS1 및 67LR에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 도 18a는 SK-N-SH 세포를 SOD1 WT 또는 G93A로 형질전환시킨 다음 KARS1과 DX2 또는 AIMP2로 처리하였다. 상기 세포를 수확하고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 18b는 신경모세포종(Neuroblastoma) 세포를 strep-DX2로 24시간 동안 형질전환시킨 다음 SOD1 WT, G93A 및 G85R로 24시간 동안 형질전환시켰다. 상기 세포를 수확하고 세포하 분획을 수행하고 상기 샘플을 면역블로팅하였다. 도 18c는 신경세포를 SOD1 WT 또는 G93A로 형질전환시킨 다음 AAV-EV 또는 AAV-DX2로 처리하였다. 그리고 상기 세포를 0, 15, 30 및 60분 동안 라미닌 1(LN1)로 처리하였다. 상기 세포를 용해시킨 다음 p-ERK 및 ERK 수준에 대해 면역블로팅하였다. 도 18d는 SH-SY5Y 세포를 SOD1 WT 또는 G93A로 형질전환시킨 후 TNF-α(30 ng/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 세포 부착은 iCelligence로 측정했다.
도 19a 내지 19b는 DX2 구조 돌연변이 SOD1의 투여는 신경세포 사멸을 유도를 나타내는 도면이다. 도 19a는 SH-SY5Y 세포를 SOD1 WT, G85R 및 G93A로 형질전환시키고 TNF-α 및 시클로헥시미드(CHX)로 6시간 동안 처리한 후 아데노관련바이러스(AAV) 제어 벡터(GFP) 또는 DX2로 처리하였다. 세포 생존력은 MTT 분석으로 확인하였다. 도 19b는 1차 신경 세포를 각 마우스에서 분리하고, 24-웰 플레이트에 파종하였으며, AAV-GFP 또는 AAV-DX2로 처리하고, 이들의 생존력을 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다.
도 20a는 결합 분석은 DX2가 AIMP2보다 PARP-1에 더 강하게 결합함을 보여주는 도면이다. 도 20b는 AIMP2로 형질전환된 세포는 산화 스트레스 조건에서 다른 형질전환된 세포에서 보이는 발현과 비교할 때 PARP-1의 절단이 상당히 증가한 것으로 나타났다. 그러나, PARP-1 절단은 DX2-형질전환된 세포에서 관찰되지 않았다. 도 20c는 AIMP2의 PARylation은 H2O2의 존재 하에서 증가하였으나, DX2의 PARylation은 변하지 않았다.
도 21a 내지 21c는 AIMP2-DX2 및 변이체의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면이다(도 21b 및 21c는 도 21a의 연속임).
도 22a 내지 22b는 신경근 접합부 손상 억제를 나타내는 도면이다. 도 22a에서 상기 신경근 접합부는 알파-붕가로톡신(alpha-Bungarotoxin)으로 염색되었고, 시냅스 소포 및 말단 플레이트는 SV2 및 2H3로 염색되었다. 도 22b에서, 신경분포된 말단 플레이트의 수를 세고 나타내었다.
AIMP2-DX2는 AIMP2(aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2)의 대안적 길항 스플라이싱 변종으로 다인자 세포사멸 유전자이다. AIMP2-DX2는 AIMP2의 기능을 방해하여 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다.
AIMP2의 경쟁적 억제제로서 작용하는 AIMP2-DX2는 TRAF2의 유비퀴틴화/분해의 억제를 통해 TNF-알파 매개 아폽토시스를 억제한다. 또한, AIMP2-DX2는 이전에 폐암유발인자로 확인된 바 있다.
또한 AIMP2-DX2가 신경질환을 치료할 수 있는 것으로 확인되었다(US2019/0298858 A1).
본 발명의 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 갖는 개체의 질병 개시를 지연시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 갖는 개체의 신경 세포사멸을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축의 치료를 필요로 하는 개체의 근위축 치료 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 개체의 질환은 근위축성 측삭 경화증(ALS, amyotrophic lateral sclerosis)일 수 있고 척수성 근위축증(SMA, spinal muscular atrophy)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병(PD)을 갖는 개체의 생존율을 증가시키거나 수명을 연장시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병(PD)이 있는 개체의 행동 결함을 예방, 운동 증상을 회복, 및/또는 신경 손상을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병(AD) 개체의 아밀로이드 베타 올리고머(Aβ-O)-유도 신경 세포사멸 또는 Aβ-O-유도 p53 발현을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 척수성 근위축증(SMA)을 갖는 개체의 신경근접합부(NMJ) 손상을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 개체에서 신경근접합부(NMJ) 손상 억제, NMJ 차단 유발 호흡 부전, 호흡 곤란, NMJ 차단 유발 근육 경련 또는 속상수축을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병(PD)이 있는 개체의 아노이키스(anoikis) 억제, 및/또는 라미닌 수용체 안정화 증가방법이 제공된다.
또한 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, PD 개체에서 ALS 개체에서 염증을 억제하는 방법, PD 개체에서 행동 결손 예방하는 방법, 신경세포 사멸 및/또는 근위축을 억제하는 방법, PD 개체의 운동 증상을 회복시키는 방법, 알츠하이머병(AD)개체의 AD 치료방법 및/또는, 선천성 근육 이영양증, 다발성 경화증, 근육 이영양증, 중증 근무력증, 근병증, 근염(다발성 근염 및 피부근염 포함), 말초신경병증, 척수근위축증 및/또는 기타 세포사멸로 인한 중추신경계(CNS) 질환의 치료 방법이 제공된다.
상기 재조합 벡터는 miR-142 표적 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 AIMP2-DX2에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 레트로바이러스(LTR) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터. Synapsin 프로모터, MeCP2 프로모터, CaMKII 프로모터, Hb9 프로모터, 또는 옵신 프로모터일 수 있다.
본 문서에 개시된 방법의 일부 실시양태에서 상기 재조합 벡터는 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 및 miR-142 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 miR-142 표적 서열은 AIMP2-DX2 유전자에 대해 3'일 수 있다. 본 문서에 기재된 상기 벡터는 신경 세포에서 AIMP2-DX2를 발현할 수 있지만 백혈구 및 림프구 세포와 같은 조혈 세포에서는 발현하지 않는다. 따라서, 본 문서에 기재된 상기 벡터는 신경 질환을 치료하기 위해 신경 세포를 특이적으로 표적화하는데 유용할 수 있다.
AIMP2-DX2 폴리펩티드(서열번호 2)는 AIMP2(예컨대, 서열번호 12; 예컨대, 서열번호 3의 nt 서열)의 스플라이스 변이체이며, 여기에서 AIMP2의 두 번째 엑손(서열번호 10, 서열번호 4의 nt 서열)은 생략된다. 일부 실시 양태예에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 상기 AIMP2-DX2 폴리펩티드는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. AIMP2-DX2 폴리펩티드의 변이체 또는 동형단백질(isoform)도 알려져 있고 당업자에 의해 결정될 수 있다(예컨대, 서열번호 13 내지 19 참조). 예컨대, 도 21A 내지 21C는 AIMP2(서열번호 2)와 변이체인 서열번호 13 내지 19, 뿐만 아니라 컨센서스 또는 코어 서열(서열번호 20)의 비교를 나타낸다.
일부 실시 양태에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 또는 그 안에 포함된 % 상동성 범위와 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 그 안에 포함된 % 상동성 범위와 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑손을 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑손을 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 4에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑손을 포함하지 않을 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열(miR-142T)은 ACACTA를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 miR-142 표적 서열은 ACACTA 및 서열번호 5의 1 내지 17개의 추가적인 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 5에 기재된 ACACTA의 5’ 또는 3'에 연속한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 추가 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 5(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA; miR-142-3pT)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 뉴틀레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열은 ACTTTA를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 miR-142 표적 서열은 ACTTTA 및 서열번호 7의 1 내지 15개의 추가적인 연속 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 miR-142 표적 서열은 ACTTTA 및 서열번호 7에 기재된 ACTTTA의 5’ 또는 3’에 연속한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 추가적인 뉴클레오티드의 합을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 7 (AGTAGTGCTTTCTACTTTATG; miR-142-5pT)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 뉴틀레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
miR142-3pT 돌연변이 서열의 예는 하기와 같다: CcgctgcagtgtgacagtgccagccaatgtgcagaggtggatgaggtcttgtgaaaacctggctccttttaacacggccctcaagctccttaagtgaccagaagcttgctagctccataaagtaggaCCACTGCAatcactccataaagtaggaCCACTGCAagatatctccataaagtaggaCCACTGCAatcactccataaagtaggaCCACTGCAaaagcttgtagggatccgcc (서열번호 25).
돌연변이 서열은 하기과 같이 치환된 miR142 3pT의 코어 서열 중 하나 이상의 영역, 예컨대 4개의 영역을 의미한다: (5'-AACACTAC-3' -> 5'-CCACTGCA-3'). miR142-3p x1 repeat(100 pmol) miR142-3p 표적 서열로 벡터 형질전환된 HEK293 세포에서 DX2 발현의 억제가 관찰되었고 miR142-3p 표적 서열에서 코어 결합 서열의 수가 증가함에 따라 DX2에 발현 대한 miR142-3p 억제가 증가되었다. 벡터를 포함하는 Tseq x3 코어 서열은 현저한 억제를 보인 반면, 돌연변이 3x 서열에 대해서는 억제가 관찰되지 않았다.
마이크로RNA(miRNA)는 유전자 발현을 제어하는 기능을 하는 비-암호화 RNA 분자이다. miRNA는 mRNA 분자 내의 상보적인 서열, 즉 miRNA 표적 서열과의 염기쌍 결합을 통해 기능한다. miRNA는 단백질 코딩-유전자의 표적 메신저 RNA(mRNA) 전사체에 결합하여 번역을 부정적으로 제어하거나 mRNA 분해를 일으킬 수 있다. 현재 2000개 이상의 인간 miRNA가 확인되었으며 miRbase 데이터베이스가 공개되어 있다. 많은 miRNA는 조직-특이적 방식으로 발현되며 조직-특이적 기능과 분화를 유지하는 데 중요한 역할을 한다.
miRNA는 유전자의 전사 후 단계에 작용하며, 포유류의 경우 유전자 발현의 약 60%가 miRNA에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. miRNA는 생체 내 다양한 과정에서 중요한 역할을 하며 암, 심장 질환 및 신경 관련 질환과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 예컨대, miR-142-3p 및 miR-142-5p는 miR-142에 존재하며 상기 표적 서열 중 어느 것이든 사용될 수 있다. 따라서 "miR-142" 또는 "miRNA-142"는 예컨대 miR-142-3p 및/또는 miR-142-5p를 의미하고 miR-142 표적 서열, 예컨대 miR-142-3pT 또는 miR-142-5pT에 결합할 수 있다.
상기 miR-142 표적 서열은 AIMP2-DX2 유전자에 대해 5' 또는 3'일 수 있다. 예컨대, "miR-142-3p"는 공격적인 B 세포 백혈병에서 유전자의 전좌가 야기되는 부위에 존재할 수 있으며 조혈 조직(골수, 비장 및 흉선 등)에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, miR-142-3p는 태아 마우스의 간(마우스의 조혈조직)에서 발현 확인과 함께 조혈계 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 일부 실시 양태에서, miR-142-3p 및/또는 miR-142-5p 표적 서열은 적어도 2 내지 10회, 적어도 2 내지 8회, 적어도 2 내지 6회, 적어도 4회 또는 해당하는 어떤 범위나 횟수로 반복된다.
예컨대, 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열을 갖는 miR-142-3p는 예컨대, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 miR-142-3p 표적 서열에 해당하는 표적 서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 상기 miR-142-5p는 서열번호 7의 뉴클레오티드를 갖는 예컨대 miR-142-5p 표적 서열에 해당하는 표적 서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시 양태에서, miR-142-3p는 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있고 miR-142-5p는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, CD45-유래 세포, 특히 림프계와 백혈구에서 AIMP2-DX2 발현의 억제를 제어하고, AIMP2-DX2의 말단으로 miR-142-3p 및/또는 miR-142-5p 표적 서열(각각 miR-142-3pT 및/또는 miR-142-5pT)을 삽입함으로써 종양에서 AIMP2-DX2 변이체의 과발현의 부작용을 제어할 수 있는 재조합 벡터를 제공한다.
따라서, 상기 AIMP2-DX2 변이체의 발현은 주입된 신경 세포 및 조직에서만 제한될 수 있으며 주입된 조직 영역의 주요 집단인 비-신경 조혈 세포에서는 발현되지 않는다. MiR142-3p는 조혈 세포에서만 발현된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, miR-142-3p 및/또는 miR-142-5p에 대한 표적 서열을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자 및 miR-142-3p 및/또는 miR-142-5p 표적 서열을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
본 문서에 기재된 용어 "재조합 벡터"는 적절한 숙주 세포에서 표적 단백질 또는 RNA로 발현될 수 있는 벡터 및 삽입된 유전자가 적절하게 발현될 수 있도록 필수적인 작동가능하게 연결된 조절 인자를 포함하는 유전자 구조물을 의미한다.
상기 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 일반적인 기능을 수행하기 위해 핵산 발현 제어 서열과 표적 단백질 및 RNA를 코딩하는 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미한다. 예컨대, 핵산 서열의 작동성을 위해 연결된 프로모터 및 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 해당 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있으며, 영역 특이적 DNA 절단 및 연결은 해당 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소를 사용한다.
상기 재조합 벡터는 본 문서에 개시된 바와 같이 AIMP2-DX2에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 레트로바이러스(LTR) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터, 시냅신(Synapsin) 프로모터, MeCP2 프로모터, CaMKII 프로모터, Hb9 프로모터, 또는 옵신(opsin) 프로모터일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 이종 프로모터 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "이종 유전자(heterogeneous gene)"는 생물학적으로 적절한 활성화를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드, 및 면역원 또는 항원성 단백질 또는 폴리펩타이드와 같은 표적 산물의 암호화된 서열, 또는 치료 활성화 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 숙주 세포에서 내인성 단백질의 결핍 또는 부재 발현을 보충할 수 있다. 유전자 서열은 DNA, cDNA, 합성 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 공급자로부터 유도될 수 있다. 상기 유전자 서열은 천연 인트론을 포함하거나 포함하지 않는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 상기 게놈 DNA는 프로모터 서열 또는 폴리아데닐화 서열과 함께 획득될 수 있다. 게놈 DNA 또는 cDNA는 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 게놈 DNA는 해당 지역에서 고시하는 방법을 통해 적절한 세포로부터 추출 및 정제할 수 있다. 또는, mRNA는 세포로부터 분리되어 역전사 또는 다른 방법에 의해 cDNA를 생산하는데 사용될 수 있다. 또는, 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열에 상보적인 서열, 예컨대 안티센스 RNA 서열을 포함할 수 있으며, 안티센스 RNA는 개인에게 투여되어 개인의 세포에서 상보적인 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제할 수 있다.
예컨대, 상기 이종 유전자는 엑손 2가 결실된 AIMP-2 스플라이싱 변이체이며 miR-142-3p 표적 서열은 이종 유전자의 3' UTR에 연결될 수 있다. AIMP2 단백질의 서열(312aa 버전: AAC50391.1 또는 GI: 1215669; 320aa 버전: AAH13630.1, GI: 15489023, BC0 13630.1)은 하기 문헌(312aa version: Nicolaides, N.C., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. Analysis of the 5’ region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene, Genomics 29 (2), 329-334 (1995)/ 320 aa version: Generation and initial analysis of more than 15, 000 full-length human and mouse cDNA sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))에 기재되어 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "AIMP2 스플라이싱 변이체"는 엑손 1 내지 4 중 엑손 2의 일부 또는 전체 결실로 인해 생성된 변이체를 의미한다. 이와 같이 상기 변이체는 AIMP2 단백질 및 이종이중체(heterodimer)를 형성하여 AIMP2의 정상적인 기능을 방해하는 것을 의미한다. 상기 주입된 AIMP2-DX2 유전자는 주입된 조직 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않는다. 그러나 추가 안전 조치로 miR142 표적 서열을 삽입하여 AIMP2-DX2가 주입된 조직 영역에서 비-신경 세포의 주요 집단인 조혈 세포에서 발현될 가능성을 완전히 차단할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 서열번호 1 및 5를 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대한 용어 "서열 상동성 %", "% 동일성" 또는 "% 동일성"은 예컨대 최적으로 배열된 2개의 서열을 비교 도메인 및 일부 비교 도메인의 뉴클레오타이드 서열 중 2개 서열의 최적 배열 상의 참조 서열과 비교하여 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다(추가 또는 결실은 포함하지 않음).
본 문서에 개시된 바와 같은 단백질은 자연형 아미노산 서열을 갖는 것뿐만 아니라 변이체 아미노산 서열을 갖는 것도 포함한다.
단백질의 변이체는 자연 아미노산 서열과 1개 이상의 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 인해 서열이 다른 단백질을 의미한다. 단백질에서의 아미노산 교환과 전체적으로 분자의 활성화를 변형시키지 않는 펩타이드는 해당 분야에 고시되어 있다(H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
단백질 또는 그 변이체는 자연적 추출, 합성(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기반으로 유전자 재조합(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2nd Ed., 1989)을 통해 제조할 수 있다.
아미노산 변이는 친수성, 소수성, 전하 및 크기 등과 같은 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성에 기초하여 발생할 수 있다. 아미노산 측쇄 치환체의 크기, 형태 및 유형의 분석에 따라, 아르기닌, 리신 및 히스티딘은 양전하를 갖는 잔기임을 식별할 수 있다; 알라닌, 글리신 및 세린은 크기가 비슷하다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 모양이 비슷하다. 따라서, 이러한 고려사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 생물학적으로 기능적 동등물로 간주될 수 있다.
하나 이상의 돌연변이를 도입함에 있어서, 아미노산의 소수성 지수(hydrophobic index)가 고려될 수 있다. 소수성 지수는 소수성 및 전하에 따라 각 아미노산에 지정된다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)
단백질의 상호작용적 생물학적 기능을 부여함에 있어서, 소수성 아미노산 지수는 매우 중요하다. 소수성 지수가 유사한 아미노산으로 치환해야만 비슷한 생물학적 활성화가 가능하다. 소수성 지수를 참고하여 돌연변이를 도입한 경우, 소수성 지수 차이가 ±2 이내, ±1 이내 또는 ±0.5 이내인 아미노산 간의 치환을 수행한다.
한편, 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산 간의 치환이 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 유도할 수 있다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 기재된 바와 같이, 하기의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 할당된다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0 ±1); 글루타메이트(+3.0 ±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 경우, 친수성 값 차이가 ±2 이내, ±1 이내 또는 ±0.5 이내인 아미노산 간에 치환이 이루어질 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
전체적으로 분자의 활성화를 변형시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 해당 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 일반적으로 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함하는 아미노산 잔기 사이의 교환이다. 벡터 시스템은 해당 업계에서 발표된 다양한 방법을 통해 구축할 수 있다. 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.에 기재되어 있다.
본 문서에 개시된 벡터는 클로닝 또는 발현을 위한 일반적인 벡터로 구성될 수 있다. 또한, 원핵 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 벡터를 구축할 수 있다. 벡터가 발현 벡터이고 원핵 세포를 숙주로 사용하는 경우에는 전사 실행을 위한 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, 1pp 프로모터, pL X 프로모터, pRX 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 대장균(예컨대, HB101, BL21, DH5a 등)을 숙주세포로 사용하는 경우, 대장균의 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 작동자 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol., 158: 1018-1024) 및 파지 X의 좌측 방향성 프로모터(pLX 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann. Rev. Genet., 14: 399-445)를 제어 부위로 사용할 수 있다.
한편, 사용될 수 있는 벡터는 바이러스 벡터, 선형 DNA 또는 플라스미드 DNA와 같이 1가지 이상의 유형일 수 있다. "바이러스 벡터"는 원하는 세포, 조직 및/또는 기관에 유전자 또는 유전 물질을 전달할 수 있는 바이러스 벡터를 의미한다.
바이러스 벡터는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 및 단순포진바이러스(Herpes simplex virus)로 구성된 군으로부터 1종 이상을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노연관바이러스(AAV), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스 또는 단순포진바이러스 벡터일 수 있다.
레트로바이러스는 숙주 세포의 게놈에 대한 통합 기능을 갖고 인체에 무해하지만, 통합시 정상 세포의 기능 억제, 다양한 범위의 세포 감염 능력, 증식 용이성, 약 1-7kb의 외부 유전자 수용 및 복제 결핍 바이러스 생성 등의 특성을 가질 수 있다. 그러나 레트로바이러스(Retrovirus)는 유사분열 후 세포 감염이 어렵고 생체 내 조건에서 유전자 전달이 어렵고 체외 조건에서 체세포 증식이 필요한 단점도 있다. 또한 레트로바이러스는 원발암유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 자발적인 돌연변이의 위험이 있으므로 세포 괴사의 가능성이 있다.
한편, 아데노바이러스는 중간 크기의 세포의 핵에서도 복제가 가능하고, 임상적으로 무독성이며, 외부 유전자가 삽입되어도 안정적이고, 유전자의 재배열이나 결실이 없으며, 진핵생물의 형질전환이 가능하고 숙주 세포 염색체에 통합되더라도 안정적으로 높은 수준으로 발현되는 등 클로닝 벡터로서 다양한 장점을 가지고 있다. 아데노바이러스의 좋은 숙주 세포는 인간의 조혈, 림프 및 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나 선형 DNA이기 때문에 증식이 어렵고 바이러스 감염률이 낮아 감염된 바이러스를 복구하기가 쉽지 않다. 또한, 전달된 유전자의 발현은 1-2주 동안 가장 광범위하며 일부 세포에서만 발현이 3-4주 동안 지속된다. 또 다른 문제는 면역 항원성이 높다는 것이다.
아데노연관바이러스(AAV)는 상기 문제점을 보완할 수 있고 유전자 치료제로서 많은 장점을 가지기 때문에 최근에 선호되고 있다. 이는 아데노위성바이러스라고도 하는데 아데노연관바이러스 입자의 직경은 20nm로 인체에 거의 해가 없는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 유럽에서 유전자치료제로 판매가 승인됐다.
AAV는 복제를 위한 보조 바이러스가 필요한 단일 가닥을 가진 프로바이러스이며 AAV 게놈은 감염된 세포의 19번 염색체의 특정 영역에 삽입될 수 있는 4,680 bp를 갖는다. 트랜스진(Trans-gene)은 각각 145bp의 2개의 ITR(inverted terminal repeat) 시퀀스 섹션과 신호 시퀀스 섹션으로 연결된 혈장 DNA에 삽입된다. AAV rep 및 cap 섹션을 발현하는 다른 플라스미드 DNA와 함께 형질감염이 수행되고, 아데노바이러스가 보조 바이러스로 추가된다. AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고 반복 투여 시 면역학적 부작용이 적고 유전자 발현 기간이 긴 장점이 있다. 또한 AAV 게놈이 숙주 세포의 염색체와 통합되어 숙주의 유전자 발현을 변형하거나 재배열하지 않아도 안전하다.
아데노연관바이러스는 총 4가지 혈청형(serotype)을 갖는 것으로 알려져 있다. 표적 유전자의 전달에 사용될 수 있는 많은 아데노연관바이러스 혈청형 중 가장 널리 연구된 벡터는 아데노관련바이러스 혈청형 2로 현재 낭포성 섬유증, 혈우병 및 카나반병의 임상 유전자 전달에 사용된다. 또한 최근 암 유전자 치료 분야에서 rAAV(recombinant adeno-associated virus)의 가능성이 높아지고 있다. 또한 본 발명에서 아데노연관바이러스 혈청형 2를 사용하였다. 적절한 바이러스 벡터를 선택하여 적용하는 것이 가능하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 벡터가 발현 벡터이고 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 포유류 세포의 게놈에서 유래한 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유래한 프로모터(예: 포스트-아데노바이러스 프로모터, 백신 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV TK 프로모터)가 사용될 수 있다. 구체적으로, 레트로바이러스의 LTR, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, RSV(Rous sarcoma virus) 프로모터, MT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 구성되는 군으로 부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화(polyadenylated) 서열을 갖는다.
본 발명에 개시된 벡터는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수 있다. 예컨대 glutathione S-transferase(Pharmacia, USA), maltose binding protein(NEB, USA), FLAG(IBI, USA), 6xHis(hexahistidine; Quiagen, USA) 등의 융합서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 발현 벡터는 암피실린(Ampicillin), 젠타마이신(Gentamycin), 카베니실린(Carbenicillin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 스트렙토마이신(Streptomycin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin), 네오마이신(Neomycin), 테트라사이클린(Tetracycline) 등을 예시적으로 선택 마커로 해당 산업에서 일반적으로 사용되는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, miR-142-3p 및/또는 miR-142-5p와 같은 miR-142에 대한 표적 서열(miR-142-3pT 및/또는 miR-142-5pT)을 각각 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 운반체가 제공된다.
본 문서에 사용되는 "유전자 전달"이라는 용어는 일반적으로 전사 및 발현을 위해 유전 물질을 세포로 전달하는 것을 포함한다. 상기 방법은 단백질 발현 및 치료 목적에 이상적이다. "DNA 침투법과 바이러스 전달법 등 다양한 전달 방법이 발표되었다. 이는 특정 수용체 및/또는 세포 유형을 대상으로 높은 전달 효율과 전달된 유전자의 높은 발현 수준을 통해 바이러스 매개 유전자 전달의 가능성을 나타내며, 필요한 경우 친환경성이나 의사형성(pseudo-typing)을 갖춘 특성을 가질 수 있다.
유전자 운반체는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체일 수 있으며, 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 모든 방법을 포함하며, 해당 분야에서 공지된 바와 같이, 숙주세포에 따라 적절한 표준기술을 선택하여 시행한다. 이러한 방법으로는 전기천공(electroporation), 원형질 융합(fusion of protoplasm), 인산칼슘(CaPO4) 침강, 염화칼슘(CaCl2) 침강, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 혼합, 농균-매개 형질전환, PEG, 황산 덱스트란(dextran sulphate) 및 리포펙타민(lipofectamin) 등이 있으나, 이에 한정되지 않습니다.
유전자 운반체는 뉴런에서 이종 유전자의 발현을 목적으로 한다. 이와 같이 CD45-유래 세포에서 이종 유전자의 발현을 억제하고 뇌 조직에서 이종 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. CD45의 대부분은 조혈 세포에 위치한 막관통 단백질 티로신 포스파타제(tyrosine phosphatase)이다. 세포는 세포 표면에 위치한 분자에 따라 정의될 수 있으며 CD45는 모든 백혈구 그룹과 B 림프구에 대한 세포 마커입니다. 유전자 캐리어는 CD45-유래 세포, 특히 림프구 및 백혈구 범위의 세포에서 발현되지 않는다.
상기 유전자 운반체는 추가적으로 약리학적으로 사용될 수 있는 운반체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 재조합 벡터를 상응하는 개체에 도입하는 단계를 포함하는 뉴런에서 이종 유전자를 전달 및 발현하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 대뇌 조직에서 이종 유전자의 발현을 증가시키고 다른 조직에서 이종 유전자 발현을 제어할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 1) 프로모터; 2) 작동가능하게 프로모터와 연결된 목적 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 3) 뉴클레오티드 서열의 3'UTR에 삽입된 miR-142-3p를 표적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다.
일부 실시 양태에서, 상기 벡터는 1) 프로모터; 2) 작동가능하게 프로모터와 연결된 목적 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 3) 뉴클레오티드 서열의 3'UTR에 삽입된 miR-142-5p를 표적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "발현 카세트"는 표적 단백질을 암호화하는 유전자와 프로모터 및 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 신호 펩타이드의 하류와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질의 생산 및 분비를 위한 발현을 수행할 수 있는 단위 카세트를 의미한다.
본 발명의 분비 발현 카세트는 분비 시스템과 혼합되어 사용될 수 있다. 이러한 발현 카세트에는 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자들이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 엑손 2가 결실된 AIMP-2 스플라이싱 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열의 3'UTR에 연결된 miR-142-3p를 표적으로 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AMD에 대한 예방 또는 치료제가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 문서에 개시된 임의의 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체의 신경 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
상기 신경퇴행성 질환은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환 중 1중 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다: 알츠하이머병(Alzheimer’s disease,), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 근위축성측삭경화증(ALS), 망막변성(retinal degeneration), 경도인지장애(mild cognitive impairment), 다발경색치매(multi-infarct dementia), 전측두엽치매(fronto-temporal dementia), 루이소체치매(dementia with Lewy bodies), 헌팅턴병(Huntington’s disease), 퇴행성신경질환(degenerative neural disease), 대사성 뇌질환(metabolic cerebral disorders), 우울증(depression), 간질(epilepsy), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 코르티코-기저 변성(cortico-basal degeneration), 다계통 위축(multiple system atrophy), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 치성두안근위축(dentatorubropallidoluysian atrophy), 척수소뇌 운동실조증(spinocerebella ataxia), 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 척수성 근위축(spinal muscular atrophy) 뇌졸중 및 다발성치매로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질환일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 신경 질환은 ALS이다. 상기 치료는 신경 질환, 예컨대 ALS, 알츠하이머병 또는 파킨슨병이 있는 개체의 기억력, 운동 이상증, 운동 활동을 개선하고/하거나 수명을 연장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 신경 질환, 예컨대 ALS를 갖는 개체의 운동 활동을 개선 및/또는 수명을 연장할 수 있다.
본 발명에 개시된 상기 벡터는 아폽토시스 억제, 운동 이상증 개선 및/또는 산화 스트레스 억제를 수행할 수 있지만 이에 제한되지 않으며, 따라서 신경 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 문서에 사용되는 용어 "치료"는 신경퇴행성 질환의 완전한 치료뿐만 아니라 본 문서에 개시된 약리학적 제제의 적용 결과로서 신경퇴행성 질환의 전체 증상의 부분적 치료, 개선 및/또는 감소를 포함한다.
본 문서에 사용되는 용어 "예방"은 본 문서에 개시된 약리학적 제제를 적용하여 인지장애, 행동장애, 뇌신경의 파괴 등의 증상이나 현상을 억제하거나 차단함으로써 신경퇴행성 질환의 전반적인 증상의 발생을 미리 예방하는 것을 의미한다.
활성 성분 이외의 보조제가 본 문서에 개시된 약리학적 제제에 추가로 포함될 수 있다. 보조제는 해당 기술분야에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 예컨대 프로인트(Freund)의 완전 및 불완전 보조제를 추가로 포함함으로써 면역력을 높일 수 있다.
본 문서에 개시된 약리학적 제제는 활성 성분을 약리학적으로 허용된 담체와 혼합한 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약리학적으로 허용되는 담체는 약리학 분야에서 일반적으로 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다.
본 문서에 개시된 약리학적 제제에 사용될 수 있는 약리학적으로 허용되는 담체는 락토스(lactose), 덱스트로스(dextrose), 수크로스(sucrose), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 에리스리톨(erythritol), 말리톨(malitol), 전분(starch), 아카시아 고무(acacia rubber), 알기네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 인산칼슘(calcium phosphate), 규산칼슘(calcium silicate), 셀룰로오스(cellulose), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 물, 메틸하이드록시벤조에이트(methylhydroxy benzoate), 프로필하이드록시벤조에이트(propylhydroxy benzoate), 탈크(talc), 스테아르산마그네슘(magnesium stearate) 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 문서에 개시된 약리학적 제제는 산제, 과립제, 환제, 캡슐제, 현탁액제, 유제제, 시럽제, 에어로졸제제 등의 경구용 제제와 외용제제, 좌제제 또는 소독주사제제 등을 각각의 일반적인 제조방법에 따라 구분하고 다양한 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
제제로 제조할 때 일반적으로 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 제조에 사용할 수 있다. 경구 투여용 고형 제제는 환제, 정제, 산제, 과립제 및 캡슐제를 포함하며, 상기 고형 제제는 유효성분에 전분, 탄산칼슘, 자당, 유당, 젤라틴 등의 부형제를 1종 이상 혼합하여 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 외에 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 탈크(talc) 등의 윤활제도 사용할 수 있다. 경구투여용 액제는 현탁액, 내복액, 유상액 등으로 습윤제, 감미료, 향료, 방부제 등의 각종 부형제를 포함한다. 일반적으로 사용되는 희석제인 물과 유동 파라핀 이외의 것. 비경구용 제제에는 멸균 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유지제, 동결건조제 및 좌제가 포함된다. 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름과 에틸레이트(ethylate)와 같은 주사 가능한 에스테르는 비수성 용매 및 현탁 용액으로 사용할 수 있다. 좌제의 제제는 위텝솔, 트윈 61, 카카오 오일, 라우린 오일 및 글리세로젤라틴 등을 포함할 수 있다.
약리학적 제제는 다양한 채널을 통해 피험자 또는 독립체에 투여될 수 있다. 경구투여, 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 복강주사 등 모든 형태의 투여가 가능하다. 본 문서에 개시된 치료제의 바람직한 투여량은 제제 제조방법, 투여형태, 환자의 연령, 체중 및 성별, 질환의 증상 정도, 식이, 투여기간, 투여경로, 배출속도 및 반응감도 등을 포함하는 다양한 인자에 따라 상이하다. 다만, 해당 제조사에서 적절하게 선택할 수 있다. 그러나, 치료 효과를 위해 숙련된 의사가 목표 치료를 위한 유효 용량을 결정하고 처방할 수 있다. 예컨대, 상기 치료제는 정맥주사, 피하주사, 근육주사, 마이크로니들을 이용하여 뇌실이나 척수에 직접 주사하는 방식이 있다. 다중 주사 및 반복 투여가 가능하며, 예컨대, 벡터의 경우 유효 용량은 0.05~15 mg/kg, 재조합 바이러스 및 5 X 102 ~ 5 X 107 cells/kg 세포에서 바이러스 입자의 경우, 5 X 1011~3.3 X 1014(2.5 X 1012~1.5 X 1016 IU)/kg이다. 바람직하게는 상기 용량은 벡터의 경우 0.1~10 mg/kg, 재조합 바이러스의 경우 5 X 1012~3.3 X 1013 입자(2.5 X 1013~1.5 X1015 IU)/kg이며 세포의 경우 주당 2~3회 투여 비율로 5 X103~5 X 106 cells/kg이다. 복용량은 엄격하게 제한되지 않는다. 오히려 환자의 상태와 신경질환의 발현 정도에 따라 수정될 수 있다. 기타 피하 지방 및 근육 주사 및 환부에 직접 투여하는 유효용량은 재조합 바이러스 입자 9 X 1010~3.3 X 1014를 10cm 간격으로 주 2~3회 비율로 투여한다. 복용량은 엄격하게 제한되지 않는다. 오히려 환자의 상태와 신경질환의 발현 정도에 따라 수정될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 약리학적 제제는 1 X 1010 내지 1 X 1012 vg(바이러스 게놈)/mL의 재조합 아데노연관바이러스를 포함하며, 일반적으로 2주에 걸쳐 2일에 한번씩1 X 1012 vg를 주사하는 것이 바람직하다. 1일 1회 투여하거나 하루에 여러 번 나누어 투여할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 벡터는 0.1 X 108 vg에서 500 X 108 vg까지, 1 X 108 vg에서 100 X 108 vg까지, 1 X 108 vg에서 10 X 108 vg까지, 예컨대 5 X 108 vg 또는 이에 해당하는 범위에서 투여될 수 있다. IV 주사의 경우, 예컨대, vg는 IV 주사에 대한 체중을 기준으로 한 사람의 용량으로 변환될 수 있다. 국소 조직 주사의 경우, 예컨대, vg는 표적 세포 수 및 효과적인 MOI(다중 감염)에 기초하여 사람에 대한 투여량으로 변환될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 문서에 개시된 벡터는 예컨대, 망막하 주사, 유리체내 주사 또는 유리체강 내 주입에 의해 개체에게 주사될 수 있다. 주사는 액체 형태일 수 있다. 다른 일부 실시 양태에서, 본 문서에 개시된 벡터는 점안액 또는 연고 형태로 개체에게 투여될 수 있다.
상기 약리학적 제제는 다양한 범위의 경구 및 비경구 투여 가능한 형식으로 제조될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 문서에 개시된 벡터는 뇌 또는 척수에 투여될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본 문서에 개시된 벡터는 정위 주사(stereotaxic injection)에 의해 뇌에 투여될 수 있다.
경구 투여 제제에는 알약, 정제, 경질 및 연질 캡슐, 액체, 현탁 용액, 오일, 시럽 및 과립 등이 포함된다.
상기 제제에는 희석제(예: 유당, 포도당, 자당, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스 및/또는 글리신) 및 글리덴트(예: 실리카, 활석 및 스테아르산 및 이의 마그네슘 또는 칼슘 염, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)가 포함될 수 있다. 또한 환제는 규산알루미늄마그네슘, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸틴, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 상황에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그 나트륨염 또는 이와 유사한 혼합물과 같은 붕해제 및/또는 흡수제, 착색제, 향료 및 감미료를 포함할 수 있다. 상기 제제는 일반적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 주사용 제제는 비경구 투여 제제의 대표적인 형태이다. 상기 주사제의 용매는 물, 링거액, 등장성 생리 식염수 및 현탁액을 포함한다. 멸균된 주사용 고정유는 용매 또는 현탁매체로 사용할 수 있으며, 모노글리세라이드, 디글리세라이드 등 무자극성 고정유라면 모두 사용할 수 있다. 또한 주사제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다. 이하의 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 특정하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 적용이 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 재조합 벡터의 제조
CD45의 대부분은 세포 표면의 분자에 따라 세포를 정의하는 데 사용할 수 있는 조혈 세포의 막관통 단백질 티로신 포스파타제이다. CD45는 모든 백혈구 그룹과 B 림프구에 대한 마커이다. CD45 유래 세포, 특히 림프계 및 백혈구 세포에서는 발현되지 않고 뉴런에서만 특이적으로 발현되는 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 벡터는 AIMP2(Aminoacyl tRNA Synthetase Complex Interacting Multifunctional Protein 2)의 엑손 2가 결실된 스플라이싱 변이체와 상기 AIMP2 스플라이싱 변이체의 발현을 조절할 수 있는 miRNA를 포함하고 있다.
분포 안전 조치로써 AIMP2 스플라이싱 변이체를 주입된 신경 조직에서만 특이적으로 발현하도록 유도하고 AIMP2-DX2가 주입된 조직 영역의 비신경 세포 집단인 조혈 세포에서 발현될 가능성을 완전히 차단하기 위해 상기와 같이 재조합 벡터를 제조하였다.
1-1: AIMP2 변이체의 생산
AIMP2는 ARS(aminoacyl-tRNA synthetase)의 형성에 관여하는 단백질 중 하나로 다인성 세포사멸 단백질로 작용한다. AIMP2의 엑손 2가 결실된 변이체를 발현하는 플라스미드를 구축하기 위해 AIMP2 스플라이싱 변이체의 cDNA를 pcDNA3.1-myc에 클로닝하였다. pcDNA3.1-myc에서의 서브클로닝은 AIMP2 스플라이싱 변이체를 H322 cDNA에 부착된 EcoR1 및 Xho1 링커를 갖는 프라이머를 사용하여 증폭시킨 후 EcoR1 및 Xho1을 사용하여 수행하였다.
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2 변이체가 사용되었다.
1-2: miRNA의 분류 및 표적 서열의 선택
상기한 바와 같이, 분포 안전 조치로써 주입된 신경 세포에서 AIMP2 변이체의 발현을 제한하고 AIMP2-DX2가 주입된 조직 영역에서 비신경 세포의 주요 집단인 조혈 세포에서 발현될 가능성을 완전히 차단하기 위해 상기와 같이 재조합 벡터를 제조하였다. 이를 위해 백혈구 및 림프계 관련 세포를 생성하는 조혈 세포에서만 특이적으로 발현되는 miR-142-3p를 표적으로 선택하였다. miR-142-3p만을 표적으로 하는 서열을 생성하기 위해 마우스 B 세포의 마이크로어레이 데이터 및 miR-142-3p가 표적으로 하는 유전자의 컴퓨터 프로그래밍(mirSVR 점수)을 사용했다. 상기 miR-142-3p는 서열번호 3으로 표시된 염기서열이다. 상기 miR-142-3p를 표적으로 하는 서열은 miR-142-3p와 상보적으로 결합하는 염기 서열번호 4로 나타내었다. MiR-142-3p 표적 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 miR-142-3p 표적 서열은 클로닝을 위한 제한 효소(Nhe1 및 Hind III, Bmt1) 부위 서열(ccagaagcttgctagc) 및 제한 효소(Hind H) 부위 서열(aagcttgtag)을 포함한다. 이를 연결하는 링커(tcac 및 gatatc)로 4회 반복된 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함한다(도 3; 서열번호 6).
1-3: 재조합 벡터의 생산
재조합 벡터를 생산하기 위해, AIMP2 변이체(서열번호 1)의 3'UTR에 miR-142-3p 표적서열(서열번호 5)을 삽입하였다. AIMP-2 변이체 및 miR-142-3p 표적 서열의 연결은 서열번호 6으로 표시하였으며, 구체적으로 NheI 및 HindIII 부위를 이용하여 절단 삽입하였다. 상기 재조합 벡터는 도 1에 도시되어 있다.
실시예 2. 재조합 벡터의 신경세포 특이적 발현 확인
2-1: in vitro 조건에서 뉴런 특이적 발현 효과 확인
miR142-3p는 조혈세포에서만 특이적으로 발현되기 때문에 재조합 벡터의 miR142-3p 표적서열의 발현에 따른 AIMP2 변이체의 넉다운에 따라 특정 세포에서 AIMP2 변이체의 발현 정도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 재조합 벡터를 처리하지 않은 그룹(SHAM), 보이드/대조군 벡터 처리된 그룹(NC 벡터), 단일 AIMP2 변이체 벡터 처리된 그룹(pscAAV_DX2) 및 재조합 벡터 처리된 그룹(pscAAV-DX2-miR142-3pT)으로 분류하였다. 모든 벡터의 농도는 ug/ul 단위이며 각 그룹은 2.5 ul(2.5ug)씩 처리하였다. 각 처리군에서 THP-1 세포주(인간 백혈병 단핵구 세포) 및 SH-SY5Y 세포주(신경모세포종)에 AIMP2 변이체의 넉다운을 확인하여 처리하였다. qPCR은 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 수행하였다(변성 15초, 어닐링 및 연장은 60℃온도 30초로 40 사이클).
AIMP2 변이체 프라이머 서열번호
정방향 CTGGCCACGTGCAGGATTACGGGG (only human) 8
역방향 AAGTGAATCCCAGCTGATAG (only human) 9
그 결과, AIMP2 변이체가 SHAM 및 NC 벡터 그룹에서 발현되지 않음을 확인하였다. 또한 단일 AIMP2 변이 벡터 처리 그룹(pscAAV-DX2)의 THP-1 세포주 및 SH-SY5Y 세포주 모두에서 발현이 있음을 확인하여 신경세포 특이적인 발현이 유도되지 않음을 확인하였다. 한편, 상기 재조합 벡터를 처리 그룹에서는 AIMP2 변이체가 SH-SY5Y 세포주에서만 특이적으로 발현됨을 확인하였다(도 2).
2-2: In vivo 조건에서 신경세포 특이적 발현 효과 확인
구체적으로, 공극/대조군 벡터 처리 그룹(NC 벡터), 단일 AIMP2 변이체 벡터 처리 그룹(pscAAV-DX2) 및 본 발명의 재조합 벡터 처리 그룹(pscAAV-DX2-miR142-3pT)이 있었다. 농도가 108 vg/ul인 바이러스 각각을 10 ul(109 vg)씩 뇌실질 내 처리하였다. 각 처리 그룹을 마우스에 두개내 주사한 후 1주일 경과한 다음 대장 조직, 폐 조직, 뇌 조직, 간 조직, 신장 조직, 흉선 조직, 비장 조직 및 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 AIMP2의 발현을 확인하였다. qPCR은 표 1의 프라이머를 사용하여 수행하였다(변성 15초, 어닐링 및 연장은 60℃ 온도 30초로 40 사이클).
그 결과, 본 발명의 재조합 벡터를 처리한 군에서 AIMP2 변이체의 발현은 신경세포가 고농축된 뇌조직에서만 특이적으로 증가함을 확인하였다(도 3). 한편, 뇌 조직 이외의 조직에서는 AIMP2 변이체의 발현이 저해됨을 확인하였다.
실시예 3: 재료 및 방법
3-1: qRT-PCR
제조업체의 프로토콜에 따라 TRIzol(Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 사용하여 척수로부터 총 RNA를 분리하였다. 상기 추출된 RNA는 분광광도계(ASP-2680, ACTgene, USA)로 정량하였다. cDNA 제조를 위해 SuperScript Ⅲ First-Strand(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 역전사를 수행하였다. 상기 생성된 cDNA는 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(ThermoFisher Scientific, USA)를 사용하여 실시간 PCR에 사용하였다. 중복된 결과의 발현 데이터는 2-ΔΔCt 통계 분석에 사용되었고 GADPH 발현은 정규화에 사용되었다.
3-2: 동물
본 발명에 사용된 hSOD1 G93A 형질전환 마우스(B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J)는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였다. 연령 일치 WT 대조군 마우스도 사용되었다. 동물들은 한국, 서울대학교 동물시설에서 특정 병원체가 없는 일정한 환경 조건(온도 21-23℃, 습도 50-60%, 12시간 명/암 주기)의 개별 우리에 수용되었다. 모든 실험 절차는 서울대학교 동물실험연구위원회(SNUIACUC, 2017.08.07)의 지침에 따라 수행되었으며, 본 발명은 우리지역윤리위원회 “SNUIACUC”의 승인을 받았다(승인번호 SNU-170807- 1). 동일 연령의 전-증상 단계에서 암컷 마우스에 AAV-GFP 및 DX2 벡터를 투여했다. AAV-DX2 형질도입은 직접 요추 천자(lumber puncture)에 의해 척추 강내 주사되었다. 총 8 μl(4 μl/point)의 AAV-GFP 또는 DX2 벡터를 Hamilton 주사기(Hamilton, Switzerland)를 사용하여 두 지점에 천천히 주입(1 μl/min)하면서 주입된 벡터의 손실을 방지하기 위해 바늘을 천천히 후퇴시켰다.
3-3: miR142-3p 억제 실험
DX2 발현에 대한 miR-142-3p 억제는 x1 miR-142-3p 표적 서열로부터 관찰될 수 있었다. 상기 HEK293 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen, US)을 사용하여 x1, x2 및 x3 반복 miR-142-3p 표적 서열 벡터 및 100 pmol miR-142-3p로 일시적으로 형질감염시킨 후, 48시간 동안 배양하였다. DX2 mRNA의 양은 PCR로 분석하였다. DX2 발현에 대한 miR142-3p 억제는 Tseq x1 반복 miR142 3p 표적 서열로부터 관찰되었다(도 5B).
실시예4: 코어 결합 서열의 억제 효과를 위해 제조된 3종의 벡터
Tseq x1은 1개의 코어 결합 서열을 포함하고, Tseq x2는 2개의 코어 결합 서열을 포함하며, Tseq x3은 3개의 코어 결합 서열을 포함한다(도 5a).
DX2 발현에 대한 miR142-3p(100 pmol) 억제는 x1 반복 miR142-3p 표적 서열로부터 관찰되기 시작하였다. 상기 HEK293 세포를 x1, x2 및 x3 반복 miR-142-3p T seq 벡터 및 리포펙타민 2000(invitrogen, US)을 사용하여 100 pmol miR-142-3p로 일시적으로 형질감염시킨 다음, 48시간 동안 배양하였다. DX2 mRNA의 양을 PCR로 분석하였다. miR142-3p 표적 서열의 코어 결합 서열(core binding sequence)의 수가 증가하면 DX2 발현에 대한 miR142-3p 억제도 증가하였다. Tseq x3 코어 서열 포함 벡터는 상당한 억제를 보였다(도 5b).
4-2: 코어 서열 돌연변이
마우스 B 세포 마이크로어레이 데이터 및 miR-142-3p 표적 유전자의 mirSVR 점수를 사용하여 코어 서열을 예측하였다. 코어 서열의 4개 영역을 하기와 같이 대체하였다: (5'-AACACTAC-3' -> 5'-CCACTGCA-3')(원래 서열에 대해서는 도 4를 참조하고 개요도에 대해서는 도 5a를 참조).
4-3: 코어 결합 서열이 중요한 DX2 억제
4개의 코어 서열이 치환되었다(도 5a). 상기 HEK293 세포를 DX2-miR-142-3p T seq x3 반복 벡터(Tseq3x) 또는 코어 서열 돌연변이 벡터(mut) 및 리포펙타민 2000(Invitrogen, US)을 사용한 100 pmol miR-142-3p로 일시적으로 형질감염시킨 후 48시간 동안 배양하였다. DX2 mRNA의 발현을 PCR로 분석하였다. DX2(도 5b) 및 DX2 컨스트럭트의 현저한 억제를 나타내는 Tseq x3 반복 벡터를 대조군으로 사용하였다. 100 pmol의 miR142-3p 처리는 Tseq x3 벡터를 상당히 억제했지만 DX2 및 mut 서열은 억제하지 않았다(도 6).
4-4: ALS 마우스 모델의 조직 분포 데이터
scAAV2-DX2-miR142-3p의 척수강내 주사 후 척수로부터 전체 RNA를 추출하였다. qRT-PCR을 수행하였다. DX2 발현은 국소 주사 부위인 척수에서만 제한되어야 한다. hSOD1 G93A 형질전환 마우스, scAAV-DX2 miR142-3p는 척추 강내 주사로 발현되었다. 대조군 비히클 주입은 뇌나 좌골 신경이 아닌 척수에서만 발현을 보였다(도 7).
실시예 5: 형질감염
실시예 2에서, HEK293T 세포는 재조합 AAV2 입자를 생산하는 데 필요한 모든 성분을 암호화하는 영국 옥스진(Oxgene, UK)의 3개 플라스미드로 공동-형질감염되었다. HEK293T 세포는 AIMP2-DX2 또는 DX2-miR142 표적 뉴클레오티드를 발현 벡터로 삽입하고 AAV 입자를 생산하지 않는 pSF-AAV-ITR-CMV-EGFP-ITR-KanR(Oxgene, UK)만으로 형질감염되었다. DX2 코딩 벡터(2ug) 및 DX2-miR142 표적 서열 코딩 벡터(2ug)를 THP-1 세포(인간 단핵구, CD45+ 세포) 및 SH-SY5Y(뉴런 세포)에 형질감염시키고 48시간 후, 상기 세포를 수확하여 mRNA를 분리하였다. 합성된 cDNA로 실시간 PCR을 통해 DX2의 발현을 분석하였다.
DX2 발현 수준이 DX2 코딩 벡터 및 SH-SY5Y로 형질감염된 DX2-miR142 표적 서열 코딩 벡터 사이에서 유사한 반면, DX2 발현은 DX2-miR142 표적 서열 코딩 벡터로 형질감염된 THP-1 세포에서 현저하게 감소하였다. 따라서 miR142-3p는 THP-1 세포에서만 작용했다(도 8).
실시예 6: 실험 방법
6-1: 동물모델
본 발명에 사용된 hSOD1G93A 형질전환 마우스(B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J)는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였다. 상기 동물은 특정 병원균이 없는 조건과 일정한 환경 조건(온도 21-23℃, 습도 50-60% 및 12시간 명/암 주기)에서 개별 우리에 수용되었다. 동일 연령의 전-증상 단계에서 암컷 마우스에 AAV2-GFP 또는 AAV2-DX2를 투여했다. AAV2-DX2 형질도입은 직접 요추 천자에 의해 척추 강내 주사되었다. AAV-GFP 또는 DX2 벡터의 총 8 μl(4 μl/point)를 Hamilton 주사기(Hamilton, Switzerland)를 사용하여 두 지점에 천천히 주입(1 μl/min)하면서 주입된 바이러스의 손실을 방지하기 위해 바늘을 천천히 후퇴시켰습니다.
행동 분석
질병의 시작을 결정하기 위해 마우스가 최대 체중에서 최대 5-6%까지 체중이 감소하기 시작한 날을 지적했다. 일반적으로 SOD1G93A 마우스는 생후 12주부터 중증의 증상단계가 관찰되는 것으로 알려져 있으나, 운동수행력의 결손은 명백한 증상이 나타나기 몇 주 전부터(출생 45일) 시작되었다(C. R. Hayworth et al. Neuroscience. 2009.12.15) ; 164(3): 975-985). 본 발명에서는 생후 9주째 절뚝거림이 관찰되고 최대 체중의 5~6%까지 감량되기 시작하는 시점에 scAAV-GFP 또는 scAAV-DX2(GO102)를 동일 연령의 암컷 마우스에 투여하였다. AAV2-DX2(GO102) 형질도입은 직접 요추 천자에 의한 척추 강내 주사를 통해 달성되었다.
6-2: 결과
도 9a 내지 9c는 DX2 형질전환 마우스가 로테논-처리된 마우스에서 운동 증상을 회복함을 보여준다. 도 9a는 표시된 마우스에서 TH 발현이 마우스 뇌로 분석되었음을 보여준다. 검은색 점선 사각형은 TF로 염색된 영역을 보여준다. 도 9B는 Rotarod 분석 결과로 로테논-처리된 야생형 및 DX2 트랜스제닉(TG) 마우스에서 잠복기를 나타낸다. 도 9C는 폴 테스트 결과를 나타낸다. 로테논-처리 야생형 및 DX2 TG 마우스의 수직 이동(왼쪽 패널) 및 T-턴 시간(오른쪽 패널). 동물; n=6(각 그룹에서), ns; 유의하지 않음, ** P<0.01, * P<0.05, t-테스트. 도 9d 및 9e는 DX2가 로테논-유도된 PD 마우스 모델에서 신경 손상 및 행동을 개선함을 보여준다. 도 9d는 폴 테스트 결과를 나타낸다. scAAV-DX2는 로테논-처리된 PD 마우스 모델에서 운동 조정 및 균형을 회복했다. "Con" 및 "GFP"는 야생형 및 로테논-처리된 GFP 주입 마우스를 나타낸다. "용량 1" 및 "용량 2"는 로테논-처리된 마우스에서 DX2의 상이한 주사 용량을 나타낸다. 도 9e는 마우스 흑질의 면역조직화학 및 면역형광 이미지를 나타낸다. 상단 패널은 선조체의 TH-양성 세포를 나타내고 하단 패널은 주입된 GFP 발현 바이러스의 분포를 나타낸다. 검은색 점선 사각형은 TH의 스테인드 영역을 나타낸다. 동물; n=5(각 그룹에서), ns; 유의하지 않음, ** P<0.05, * P<0.01, t-테스트.
도 10a 내지 10h는 DX2가 6-OHDA-유도된 PD 모델에서 행동 결함을 예방함을 나타낸다. 도 10a는 scAAV-DX2-처리된 마우스가 식염수 또는 비히클(GFP)에 비해 더 낮은 수준의 반대측 회전(contralateral rotation)을 나타냄을 입증하며, 이는 DX2가 도파민성 뉴런에서 손상을 약화시킴을 나타낸다. 도 10b는 DX2-처리된 마우스가 증가된 반대측 앞발 접촉을 나타냄을 입증하며, 이는 AAV-DX2가 도파민성 뉴런에서 일측성 손상을 약화시킴을 나타낸다. 도 10c는 AAV-DX2 처리된 마우스가 더 적은 우측 편향(right-biased)된 신체 스윙을 나타냄을 입증한다. 동물; 식염수(식염수 처리된 야생형 마우스) n=4, GFP(GFP 주입된 6-OHDA 처리된 마우스) n=5, DX2(DX2-주입된 6-OHDA-처리된 마우스) n=11, scAAV; scAAV-GFP 4 x 109 vg, scAAV-DX2 4 x 109 vg, ns; 유의하지 않음, * P<0.05, ** P<0.005, *** P<0.001, t-테스트. 도 10d는 GFP 및 DX2-주입된 마우스 뇌의 면역형광 이미지를 보여준다. 흰색 사각형 상자는 TH 양성 도파민성 신경 세포를 나타내고 흰색 화살표는 표시된 바이러스 주입 부위를 나타낸다. 도 10e는 각 마우스 그룹의 생존율을 나타낸다. 동물; n=15, 식염수는 식염수 처리된 야생형 마우스를 나타냅니다. L-DOPA, GFP 및 DX2는 6-OHDA 처리 마우스에서 L-DOPA, GFP 및 DX2 주입을 나타낸다. scAAV; scAAV-GFP(GFP) 4 x 109 vg, scAAV-DX2(DX2)(저) 1.6 x 108 vg, scAAV-DX2(DX2)(고) 4 x 109 vg. 도 10f 및 10g는 naive, 6-OHDA 및 DX2-처리된 마우스의 DX2 및 Bax mRNA 발현을 나타낸다. *** P<0.001, t-테스트. 도 10H는 AAV-DX2 주사된 6-OHDA 마우스 모델에서 DX2 발현 세포를 확인하기 위한 RNA in situ hybridization를 보여준다. 도 11a 내지 11g는 DX2가 MPTP-유도 PD 모델에서 운동 증상을 회복시킨다는 것을 보여준다. 도 11a는 scAAV-DX2-처리된 마우스가 비히클(scAAV-GFP, GFP)의 과 비교했을 때 로타로드 테스트(rotarod test)에서 떨어지는 약간 더 긴 잠복기를 나타냄을 입증하며, 이는 scAAV-DX2가 도파민성 뉴런에 대한 손상을 약화시킴을 나타낸다. 도 11b는 DX2-처리된 마우스가 SHIRPA 테스트에 기초하여 개선된 운동 활성을 나타냄을 입증한다. 도 11c는 DX2-처리된 마우스가 비교적 낮은 수준의 사지 결손(limb deficit)을 나타냄을 입증한다. 도 11d는 DX2-과발현된 마우스가 비히클 대조군(GFP)과 비교할 때 개선된 그루밍 비율을 나타냄을 입증한다. 도 11e는 마우스 흑질(substantia nigra)에서 TH-양성 세포의 면역형광 이미지를 보여준다. 흰색 사각형 상자는 TH 발현 영역을 나타낸다. 도 11f 및 11g는 표시된 마우스 뇌의 DX2(도 1f) 및 Bax(도 11g) mRNA 발현을 보여준다. Naive, GFP 및 DX2는 식염수-처리된 야생형 마우스, GFP-주입된 MPTP-처리된 마우스 및 DX2-주입된 MPTP 처리된 마우스를 나타낸다. 동물; Naive n=6, GFP n=9, DX2 n=12, scAAV; scAAV-GFP 4 x 109 vg, scAAV-DX2 4 x 109 vg, * P<0.05, ** P<0.001, *** P<0.0001, t-테스트.
실시예 7
SOD1 형질전환 마우스를 척추관(spinal canal)에서 AAV-GFP(GFP) 또는 AAV-DX2로 처리하여 생체내 DX2의 효과를 조사하였다. 질병의 발병은 GFP-주입 마우스 그룹에 비해 DX2-주입 마우스 그룹에서 지연되었다. 또한, DX2를 투여한 그룹의 마우스는 GFP 주입 그룹의 마우스보다 훨씬 더 오래 생존했다. DX2-투여 마우스의 수명은 GFP-주입 마우스에 비해 연장되었다.
도 12a 및 12b는 루게릭병 모델에서 DX2의 투여가 질병 발병을 개선하고 마우스의 수명을 연장함을 보여준다. 도 12a는 질병 발병은 AAV-DX2 그룹에서 개선됨을 나타낸다. 도 12b는 마우스의 수명은 AAV-GFP 그룹과 비교했을 때 AAV-DX2 그룹에서 연장됨을 나타낸다. 동물; n=5.
실시예 8
8-1: 실험 방법
세포 배양 및 처리
인간 신경모세포종(neuroblastoma) 세포주인 SK-SY5Y 세포는 10% 태아 소 혈청, 100 unit/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 유지되었다. 신경세포에서 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 유도를 위해 SK-SY5Y 세포를 6개의 웰 플레이트에 1×106 세포/웰의 밀도로 파종하고, 16시간 후 배양 배지를 25 μM의 아밀로이드 β-단백질 올리고머(Aβ-O)를 포함하는 RPMI 1640으로 교체 후 24시간 동안 배양하였다. DX2 발현에 의한 신경 세포 사멸의 억제 효과를 확인하기 위해, SK-SY5Y 세포를 Aβ-O와 함께 24시간 동안 배양한 다음 비히클(scAAV2-GFP) 또는 과발현-DX2(scAAV2-DX2) 바이러스를 사용하여 RPMI 1640 성장 배지에서 48시간 동안 세포에 처리했다. 세포 사멸은 웨스턴 블롯 및 현미경으로 분석하였다.
면역블롯 분석
SH-SY5Y 세포를 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하는 25 mM Tris-HCl, pH 7.4에서 용해시켰다. 50μg의 단백질을 포함하는 샘플을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 블롯팅하고 전기영동적으로 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 20% Tween-20이 포함된 Tris 완충 식염수 중 5% 무-지방 밀크로 차단하고 p53 및 액틴에 대한 1차 항체와 함께 배양했다. 멤브레인의 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 2차 마우스 항-염소 및 항-토끼 항체로 검출되었다. 상기 멤브레인은 제조업체의 매뉴얼(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 따라 SuperSignal West Dura 확장-기간 기판으로 분석되었다.
8-2: 결과
AIMP2-DX2는 Aβ-O-유도 신경 세포 사멸을 약화시킨다. 알츠하이머병(AD)은 뇌에 아밀로이드 β-단백질(Aβ) 및 인산화된 타우(p-tau) 단백질과 같은 비정상 단백질의 축적에 의해 유발되는 진행성 신경퇴행성 질환이다(Duyckaerts 2009). 아밀로이드 전구체 단백질의 단백질 분해 절단에 의한 아밀로이드 β-단백질 응집이 AD 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Viola 2015 및 De Strooper 2010). 따라서 본 발명에서는 AD-유발 세포에서 세포사멸(Choi 2011) 억제 인자인 AIMP2-DX2(DX2)의 과발현이 신경 세포사멸에 영향을 미칠 수 있는지를 연구하였다. 도 13에 나타난 바와 같이, 정상 성장 상태에서 비처리(untreated), 비히클 처리(AAV-GFP) 및 DX2-처리(AAV-DX2) 세포에서 세포 생존이 차이가 없었으며, 이는 정상 조건에서 증가된 DX2 발현이 신경세포 생존의 원인이 아님을 시사한다. Aβ-O 처리 조건에서, 비히클-처리된 세포(Aβ + AAV-GFP)에 비해 DX2-처리된 세포(Aβ + AAV-DX2)에서 감소된 신경 세포사멸이 관찰되었다. 또한 도 14의 신경 세포사멸은 정량적으로 분석되었고 도 13의 세 가지 서로 다른 영역에서 세포의 백분율을 점수화하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, DX2 과발현 세포는 비히클-처리 그룹에 비해 신경세포 생존율이 유의하게 증가하였다(최대 47%). 상기 결과는 DX2 발현이 Aβ-O-유도 세포사멸의 보호 효과에 중요한 인자임을 나타낸다.
DX2는 Aβ-O-유도된 p53 발현을 억제한다.
종양 억제 단백질인 P53은 세포 주기 및 세포사멸과 같은 생물학적 사건을 조절하는 핵심 인자이다(Finlay 1989). 종래 연구 보고에서 나타난 바와 같이(Choi 2011), AIMP2는 Mdm2의 결합 도메인인 p53의 N-말단에 결합하고 이의 결합은 p53의 안정성과 pro-apoptotic 활성을 유도한다. 또한, DX2는 p53과의 상호작용을 방해함으로써 AIMP2의 세포사멸 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, DX2 유전자의 바이러스 형질도입에 의한 DX2의 발현 증가가 Aβ-O 처리 신경세포에서 p53 발현에 영향을 미치는지 연구하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 정상 성장 조건에서는 p53의 세포 발현 수준이 변화하지 않았으나, Aβ-O 존재 하에서 p53의 발현 수준이 증가하였다. 또한, DX2 처리 세포에서 DX2 발현은 Aβ-O 유도 p53 발현을 감소시켰다. 상기 결과는 DX2가 신경 세포에서 Aβ-O 유도 세포사멸 및 p53과 같은 세포사멸 촉진 단백질 발현을 억제함을 시사한다.
DX2 발현은 신경독 유도 p53 발현에서 중요한 역할을 한다(도 15). SK-SY5Y 세포를 25 μM Aβ-O의 부재 또는 존재하에 AAV-DX2 또는 AAV-GFP와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후 총 단백질 용해물을 준비하고 p53 단백질의 수준을 면역블롯 분석으로 분석하였다. β-액틴의 수준을 로딩 대조군으로 분석하였다. 빨간색 사각형 상자는 Aβ-O 처리 세포에서 p53의 증가된 수준을 나타낸다.
실시예 9
9.1. 재료 및 방법
세포 배양 및 시약
HEK 293 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, Neuro-2A(N2A), SK-N-SH 및 SH-SY5Y 세포는 Korean Cell Line Bank에서 구입하였다(KCLB, 서울, 한국). HEK 293 세포 및 N2A 세포를 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(HyClone, Pittsburgh, PA, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 성장시켰다. 그 후, SK-N-SH 세포를 10% FBS 및 1% 항생제가 포함된 RPMI-1640에서 배양하였다. myc-태그된 KARS, HA-태그된 돌연변이 SOD1, GFP-태그된 KARS 및 GFP-태그된 돌연변이 SOD1의 일시적인 형질감염은 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 의해 형질감염되었다. 또한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide (MTT) 및 HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
효모-2 하이브리드 검정
전체 KARS 및 단편화된 KARS를 pLexA 플라스미드로 클로닝하고 SOD1 WT, SOD1 G85R 및 SOD1 G93A를 pB42 플라스미드로 클로닝하였다. 효모에서 KARS의 LexA-단편과 B42-SODWT/SOD85/SOD93 사이의 양성 상호작용은 X-gal 플레이트를 사용하여 LEU2 및 LacZ 리포터 시스템에 의해 결정되었다(21).
면역침전 분석
세포 용해물을 수확하고 RIPA 완충액(50mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 20% 글리세롤, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트 및 PMSF)에 의해 제조하였다. 세포 용해물을 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 12,000g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 수집했다. 항-HA 또는 항-Myc 아가로스 비드를 용해물에 첨가하고 진동 플랫폼(rocking platform)으로 4도에서 밤새 배양했다. 아가로스 비드 결합 단백질을 3회 세척하고 수집된 샘플을 SDS-PAGE를 통해 분리하고 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다.
웨스턴 블롯팅 및 항체
세포를 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하는 25 mM Tris-HCl, pH 7.4에서 용해시켰다. 50 μg의 단백질을 포함하는 샘플을 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 블롯팅하고 전기영동적으로 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 Tween-20과 함께 Tris-완충 식염수에서 5% 무지방 분유로 차단했고 Myc(Santa Cruz biotechnology, sc-40), HA, GFP, 67 라미닌 수용체, IκB, 튜불린, β-액틴, TRAF2, EPRS, KARS, AIMP2, Erk, 인산화 Erk에 대한 1차 항체와 함께 배양하였다. 상기 멤브레인의 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 2차 마우스 항-염소 및 항-토끼 항체로 검출되었다. 상기 멤브레인은 제조업체의 매뉴얼(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 따라 SuperSignal West Dura 확장-기간 기판으로 분석되었다.
면역세포화학
세포를 실온에서 10분 동안 4% PFA로 고정한 후 PBS로 세척하고 SOD1, 67LR에 대한 항체와 함께 밤새 배양하였다. 또한 염색된-세포를 세척한 다음 Alexa Fluor-linked IgG(Vector Laboratories INC, Burlingame, CA, USA)와 함께 배양했다. 핵 DNA는 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 염색되었다.
세포 이동 분석
8 μm 트랜스웰 챔버(Corning INC, Corning, NY, USA)를 사용하여 이동 분석을 수행하였다. 무혈청 배지의 N2A 세포를 24웰 이동 플레이트의 상부 챔버에 파종했다. 하부 챔버는 10% FBS가 포함된 400 μL의 DMEM으로 채워졌다. 24시간 후 상부 챔버는 실온에서 10분 동안 10% PFA로 고정한 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 그런 다음 이동한 세포를 계수하였다.
세포 생존율 분석
MTT 분석을 위해, 5 x 104개 세포/웰을 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 특정 분자로 24시간 동안 처리하였다. 적절한 인큐베이션 후, PBS(pH7.2) 중 5 mg/mL MTT 용액 15 μL를 각 웰에 첨가하고 5% CO2 분위기에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 용액을 제거하고 디메틸설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하여 불용성 포르마잔 침전물을 용해시킨 후 플레이트 리더기로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포하 분류
KARS1의 세포 국소화를 결정하기 위해, 세포질 분획 키트(Biovision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 세포질 및 멤브레인 분획을 수집하였다. 간략하게, 상기 세포를 용해시키고 1,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상등액을 세포질 분획으로 사용하였다. 그런 다음, 펠릿을 세척하고 4℃에서 10분 동안 소듐 데옥시콜레이트 완충액으로 인큐베이션하고 막 분획으로 사용하였다.
세포의 부착 강도 시험
SOD1 G93A 및 DX2 형질감염된 SH-SY5Y 세포를 96웰 e-플레이트(ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA)에 파종(1.0 x 104개 세포/mL)하고 세포 접착을 위해 TNF-α로 24시간 동안 처리하여 스크리닝하였다. 다음 부착된 세포를 iCELLigence(ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA)로 계수했다.
9-2: 결과
미토콘드리아 형태의 KARS는 돌연변이 형태 SOD1 및 돌연변이 SOD1 및 mitoKARS와 상호작용하여 미토콘드리아 형태 이상 및 세포 독성을 초래한다고 이전에 보고되었다. 따라서 KARS가 SOD1 돌연변이에 의한 신경 세포사멸을 조절할 수 있는지 알아보기 위해 먼저 돌연변이 SOD1과 KARS의 결합 효율을 확인하였다. 실험을 위해, WT SOD1, SOD1 G93A, SOD1 G85R 및 KARS를 준비하고 KARS와 각각의 SOD1 간의 상호작용을 효모 2종 하이브리드(도 16a) 및 면역침전 분석(도 16b)으로 분석하였으며, KARS가 WT SOD1보다 훨씬 강한 결합으로 돌연변이 SOD1에 결합하는 것을 관찰했다(도 16a 및 16b). 다음으로, KARS와 돌연변이 SOD1의 특이적 결합 부위를 연구하기 위해, 효모 2종 하이브리드 검정 시스템을 사용하여 절단된 KARS와 돌연변이 SOD1의 상호작용을 확인하였다. 도 1에 도시된 바와 같이. 도 16c, KARS 및 돌연변이 SOD1 결합이 KARS의 N-말단에서 관찰되었다. AIMP2와 67 laminin 수용체가 KRS의 N-말단과 상호작용하여 암세포 이동과 세포 생존 조절을 하는 것으로 나타났다. AIMP2, 67 LR 및 돌연변이 SOD1은 KARS의 N-말단에 결합하기 때문에 KARS와 돌연변이 SOD1의 상호작용이 KARS와 AIMP2 및 67LR의 결합에 영향을 미치는지 조사했다. 도 1에 도시된 바와 같이. 16D, AIMP2 및 67LR은 WT SOD1의 존재 하에 KARS에 결합했지만, AIMP2 및 67LR에 대한 KARS의 감소된 결합은 돌연변이 SOD1의 존재 하에 관찰되었다. 상기 결과는 돌연변이 SOD1이 KARS의 N-말단의 결합 경쟁을 통해 AIMP2 및 67LR에 대한 KARS의 결합을 감소시킨다는 것을 보여주었다.
돌연변이 SOD1 G93A가 KARS에 가장 잘 결합한다는 것을 보여주었기 때문에, 본 발명자들은 67LR에 대한 이의 효과를 조사하고 그것이 신경 세포 사멸과 상관관계가 있는지 조사하였다. 돌연변이 SOD1을 SK-N-SH 세포에 형질감염시켰을 때, 67LR의 수준이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 17a).
67LR의 발현 위치를 확인하기 위해, 돌연변이 SOD1 형질감염된 세포에서 IF(면역형광)를 수행하였다. KARS 수준은 멤브레인보다 세포질에 더 집중되어 있고 멤브레인 영역에서 크게 감소하는 것으로 나타났다(도 17b). 이전에 KARS가 67LR을 통해 세포의 이동을 유도한 것으로 나타났다. 상기 세포를 SOD1 야생형 또는 돌연변이 SOD1로 형질감염시켰을 때, 야생형 SOD1에 비해 돌연변이 SOD1로 세포 이동이 억제되었다(도 17c).
돌연변이 SOD1은 67LR의 발현에 영향을 미치므로 라미닌의 신호전달 경로에 미치는 영향을 조사한 결과, 돌연변이 SOD1이 pERK 활성을 크게 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 17d).
또한 돌연변이 SOD1의 발현이 KARS와 67LR 사이의 결합 친화도에 영향을 미치는지 조사하였다. 도 17e에 도시한 바와 같이, 돌연변이 SOD1 발현에 의해 KARS 및 67LR과의 감소된 상호작용을 관찰하였다.
아노이키스(Anoikis)는 세포외기질(ECM)과 세포막 단백질 사이의 접촉 상실에 의해 유발되는 세포사멸의 일종으로, 아노이키스의 저항성은 세포 생존에 중요한 역할을 한다. 또한 아노이키스를 유도하기 위해, 세포를 돌연변이 SOD1 및 KARS로 공동-형질감염시키고 현탁액 조건에서 TNF-알파/CHX와 함께 또는 처리없이 배양하였다. 그 결과, KARS의 과발현에 의해 세포사멸이 회복되지 않음을 관찰하였다(도 17f). 상기 결과는 라미닌 수용체에 의한 세포사멸의 조절이 라미닌 수용체와 ECM의 상호작용을 통한 하류 신호전달의 증가에 기인함을 시사한다. 본 발명자들은 DX2가 돌연변이 SOD1-유도된 67 LR 발현에 중요한 역할을 하는지 테스트했다. SK-N-SH 세포를 SOD1 WT 및 SOD1 G93A 돌연변이 유전자로 형질감염시킨 후, 한 그룹은 pro-apoptotic AIMP2 유전자로, 다른 그룹은 anti-apoptotic DX2 유전자로 형질감염시켰다. DX2의 존재 하에, AIMP2의 과발현에 의한 67LR 단백질의 감소가 회복됨을 관찰하였다(도 18a).
다음으로 돌연변이 SOD1에 의해 원형질막에서 감소된 67LR의 발현이 DX2 유전자에 의해 회복되는지 확인하였다. 돌연변이 SOD1을 발현하는 세포에서 DX2의 과발현은 세포막에서 67LR 단백질을 증가시켰고(도 18b), 본 발명자들은 또한 67LR의 하류 신호가 DX2 유전자 도입에 의해 회복되었음을 관찰하였다(도 18c). 다음으로, TNF-α로 처리한 후 EV, 돌연변이 SOD1 및 돌연변이 SOD1+DX2의 형질감염 후 세포의 탈착을 시험하였다. DX2의 처리는 세포 및 아노이키스의 탈착을 방지하였다(도 18d).
본 발명자들은 돌연변이 SOD1에 의한 신경 세포사멸에 대한 DX2의 효과를 확인하였다. AAV-DX2가 WT SOD1 또는 돌연변이 SOD1 과발현 세포에서 형질도입되었을 때, 돌연변이 SOD1에 의해 유도된 세포사멸이 대조군 수준으로 감소됨을 관찰하였다(도 19a). CHX/TNF-α 처리에 의해 유도된 WT 및 두 변이체 G85R 및 G93A의 세포사멸률은 GFP 감염 세포에서 각각 약 20% 증가하였다. 그러나 DX2 감염 세포에서 CHX/TNF-α 처리에 의한 세포 사멸률은 GFP-형질도입 세포의 세포 사멸률보다 약 20% 낮았으며 유의한 차이가 있었다(p<0.001).
또한 DX2 과발현에 의한 CHX/TNF-α에 의한 세포사멸의 감소도 일차신경세포에서 나타났다. AAV를 과발현하는 DX2를 야생형 또는 SOD1 형질전환 마우스로부터 추출한 1차 신경 세포에 감염시키고, 형질감염된 세포를 CHX/TNF-α로 처리하고 세포 사멸률을 분석하였다. G93A 1차 신경 세포는 CHX/TNF-α 처리 조건에서 세포 사멸이 증가한 반면, DX2는 CHX/TNF-α 처리된 WT 및 G93A 1차 신경 세포에서 세포 사멸을 크게 감소시킨 것으로 나타났다(도 19b).
실시예 10
이전 연구에서, AIMP2는 파킨의 기질로 작용하고 PARP-1과 상호작용하며, 이러한 상호작용은 PD에서 신경 세포 사멸을 조절하는 것으로 밝혀졌다(Lee 2013). 따라서 DX2가 AIMP2의 경쟁적 억제제이고 신경 세포 사멸을 조절하는지 여부를 조사하기 위해 먼저 PARP-1과 AIMP2 또는 DX2 사이의 결합 분석을 수행했다. PARP-1, AIMP2 및 DX2 발현은 SH-SY5Y 세포에서 각각의 플라스미드의 형질감염에 의해 유도된 후 PARP-1 풀-다운 검정의 분석이 수행되었다(도 20a). EV(빈 벡터), AIMP2, 및 DX2를 세포에 형질감염시키고 24시간 후 형질감염된 세포를 10 μM H2O2와 함께 4시간 동안 배양하였다. 절단된 PARP-1 수준(도 20b) 및 PARlyation(도 20c)를 면역블롯 분석을 사용하여 조사하였다. 산화적 스트레스-유도 세포 손상 조건에서, DX2는 세포 사멸과 관련된 PARP-1의 절단(도 20b) 및 PARylation(도 20c)을 약화시킨다.
도 20a에 도시된 바와 같이. 본 발명자들은 DX2가 AIMP2보다 더 강하게 PARP-1에 결합한다는 것을 발견했다. AIMP2 및 DX2가 산화 스트레스 조건에서 PARP-1 절단에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 빈 대조군(EV), AIMP2 또는 DX2를 발현하는 벡터로 형질감염시킨 다음 과산화수소(hydrogen peroxide)로 처리했다. AIMP2로 형질감염된 세포는 산화 스트레스 조건에서 다른 형질감염된 세포에서 보이는 발현과 비교할 때 PARP-1의 절단이 현저히 증가한 것으로 나타났습니다. 그러나, PARP-1 절단은 DX2-형질감염된 세포에서 관찰되지 않았다(도 20b). PARylation은 DNA 손상 반응 및 세포사멸과 같은 생물학적 사건을 조절하는 번역 후 과정이다(Szabo 1996 및 Virag 1998). PARP-1은 핵에서 손상된 DNA를 인식하고 PAR 사슬을 형성하며 PARylation을 통한 손상된 단백질의 분해를 유도한다. PARlylation, 즉 PAR 폴리머의 형성에는 절단된 PARP-1의 촉매 활성이 필요하기 때문에(Barkauskaite 2015), AIMP2 또는 DX2가 PARylation에 미치는 영향을 조사했다. 도 20c에 도시한 바와 같이, AIMP2의 PARylation은 H2O2의 존재 하에서 증가하였으나, DX2의 PARylation은 변하지 않았다. 상기 결과를 기반으로 본 발명자들은 DX2가 산화 스트레스 유발 PARP-1 절단의 억제 분자라는 결론을 내렸다.
실시예 11: 신경근 접합부 손상의 DX2 억제
운동 뉴런은 뇌와 근육 사이의 통신에 필수적이며 이동성을 위한 중요한 명령을 전달한다. 이러한 신경 세포가 기능 장애를 일으키거나 손상되면, 근육과의 통신이 점차 중단되며 뇌는 자발적인 움직임을 제어하고 시작하는 능력을 잃는다. 이로 인해 점진적인 쇠약, 근육 경련(속상수축, fasciculation), 몸 전체의 자발적 골격근 위축이 발생한다. 또한, 골격근 탈신경으로 이어지는 NMJ의 변성은, ALS 발병에 필수적인 역할을 하는 것으로 생각된다. 근육 경련/속상수축 및 호흡 부전은 일반적으로 발병 후 2~3년 이내에 ALS에서 발생한다. 질병의 말기에는 치명적인 마비와 호흡 부전으로 인한 사망으로 이어진다.
근육을 4℃에서 밤새 4% PFA에 고정시켰다. 그 후 상기 근육을 30% 수크로스에서 탈수시키고 조직 동결 절편을 위해 OCT 화합물로 포매했다. 모든 근육 냉동 절편 샘플은 20 μm 두께의 절편을 포함하는 신경근 접합부에서 획득했다.
20 μm 두께의 냉동 절편을 1XPBS에서 2회(각각 5분) 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 차단 용액(5% BSA)에서 배양했다.
흡인 BSA, 절편을 실온에서 차단 용액에서 신경섬유(항-신경필라멘트 + 항-2H3, SV2를 사용하여 녹색으로 염색됨) 및 시냅스 후 아세틸콜린 수용체_ AChR(형광 α-붕가로톡신 접합체를 사용하여 적색으로 염색됨)에 대한 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션했다.
부분적으로 신경분포되거나 완전히 탈신경화된 시냅스 후 수용체 부위, 단편화되거나 축소된 시냅스 후 수용체, 위축된 축삭 또는 말단, 부풀거나 이영양성 축삭 또는 말단을 포함하여 많은 결함이 쉽게 관찰될 수 있다.
면역형광법(Immunofluorescence) ROI 세트 및 중복 계수는 이미지 J로 측정되었다.
이를 기반으로, 야생형(WT), ALS 유도 모델(AAV-GFP) 및 ALS 유도 모델(GO102) 그룹 각각에서 골격근 탈신경화(skeletal muscle denervation)를 알파-분가로톡신 및 SV2, 2H3에 대한 비복근 근육의 이중 염색으로 측정했다.
도 22a에 나타난 바와 같이, 신경근 접합부는 알파-분가로톡신으로 염색되었고, 시냅스 소포 및 말단판은 SV2 및 2H3로 염색되었다. 도 22B에서, 신경분포 종판(endplates)의 수를 계수하고 나타내었다.
GO102는 ALS 질병 모델에서 관찰된 신경분포 종판의 감소된 %(75.6 ± 12.6 대 41.0 ± 2.03%)를 개선했다. 종합하면, DX2는 신경근 접합부(NMJ) 손상을 억제하고 DX2가 NMJ 차단-유도된 호흡 부전 및 근육 경련 또는 속상수축을 회복시키는 것으로 예상된다.
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Leu 20 25 30 Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser 35 40 45 Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn 50 55 60 Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp 65 70 75 80 Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys 85 90 95 Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe 100 105 110 Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val 115 120 125 Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala 130 135 140 Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu 165 170 175 Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg 180 185 190 Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys 195 200 205 Leu Leu Lys 210 <210> 18 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 variant 6 <400> 18 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly 20 25 30 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly 35 40 45 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu 50 55 60 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu 65 70 75 80 Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu 85 90 95 Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met 115 120 125 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 19 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 variant 7 <400> 19 Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser 1 5 10 15 Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe 20 25 30 Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro 35 40 45 Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg 50 55 60 Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys 65 70 75 80 Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu 85 90 95 Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn 100 105 110 Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe 115 120 125 Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser 130 135 140 Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu 145 150 155 160 Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly 165 170 175 Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys 180 185 190 Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 195 200 205 <210> 20 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2-DX2 consensus sequence <400> 20 Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser 1 5 10 15 Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe 20 25 30 Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro 35 40 45 Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg 50 55 60 Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys 65 70 75 80 Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu 85 90 95 Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn 100 105 110 Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe 115 120 125 Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser 130 135 140 Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu 145 150 155 160 Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly 165 170 175 Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys 180 185 190 Glu Asn Leu Ala Pro Phe 195 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nhe1, Hind III, and Bmt1 sites in miR-142-3pT with 4 repeats <400> 21 ccagaagctt gctagc 16 <210> 22 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind H site in miR-142-3pT with 4 repeats <400> 22 aagcttgtag 10 <210> 23 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-142-3p <400> 23 uguaguguuu ccuacuuuau gga 23 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-142-5p <400> 24 cauaaaguag aaagcacuac u 21 <210> 25 <211> 238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-142-3pT target sequence mutant <400> 25 ccgctgcagt gtgacagtgc cagccaatgt gcagaggtgg atgaggtctt gtgaaaacct 60 ggctcctttt aacacggccc tcaagctcct taagtgacca gaagcttgct agctccataa 120 agtaggacca ctgcaatcac tccataaagt aggaccactg caagatatct ccataaagta 180 ggaccactgc aatcactcca taaagtagga ccactgcaaa agcttgtagg gatccgcc 238

Claims (30)

  1. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 갖는 개체의 발병을 지연시키는 방법.
  2. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 갖는 개체의 신경 세포사멸을 억제하는 방법.
  3. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축(muscle atrophy)의 치료를 필요로 하는 개체의 근위축 치료방법.
  4. 제4항에 있어서,
    상기 개체는 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 갖는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 개체는 척수성 근위축증(SMA)을 갖는 방법.
  6. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병(PD)을 갖는 개체의 생존율을 증가시키거나 수명을 연장시키는 방법.
  7. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병(PD)이 있는 개체의 행동 결함을 예방, 운동 증상을 회복, 및/또는 신경 손상을 감소시키는 방법.
  8. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병(AD) 개체의 아밀로이드 베타 올리고머(Aβ-O)-유도 신경 세포사멸 또는 Aβ-O-유도 p53 발현을 억제하는 방법.
  9. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 척수성 근위축증(SMA)을 갖는 개체에서 신경근 접합부(NMJ) 손상을 억제하는 방법.
  10. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 가진 개체의 신경근 접합부(NMJ) 손상 억제, NMJ 차단으로 인한 호흡 부전 억제, 호흡 곤란, NMJ 차단으로 인한 근육 경련 또는 속상수축 억제방법.
  11. 엑손 2-결실 AIMP2 변이체(AIMP2-DX2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병(PD)이 있는 개체의 아노이키스(anoikis) 억제 및/또는 라미닌 수용체 안정화 증가방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 miR-142 표적 서열을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 AIMP2-DX2에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 프로모터는 레트로바이러스(LTR) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터, 시냅신(Synapsin) 프로모터, MeCP2 프로모터, CaMKII 프로모터, Hb9 프로모터, 또는 옵신(opsin) 프로모터인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 AIMP2-DX2 유전자에 대해 3'인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20과 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 10 또는 11과 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑손을 갖지 않는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AIMP2-DX2 유전자는 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑손을 갖지 않는 방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-142 표적 서열이 ACACTA를 포함하는 것인 방법.
  21. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 ACACTA 및 서열번호 5의 1 내지 17개의 추가 연속 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  22. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 5(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  24. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 ACTTTA를 포함하는 것인 방법.
  25. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 ACTTTA 및 서열번호 7의 1-15개의 추가적인 연속뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  26. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 7(AGTAGTGCTTTCTACTTTATG)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 50% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  28. 제12항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-142 표적 서열은 2 내지 10회 반복되는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노연관바이러스(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV), 조류 육종/백혈병(ASLV), 비장 괴사 바이러스(SNV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 또는 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터인, 방법.
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