CN116507370A - 使用AIMP2-DX2和任选地miR-142的靶序列及其组合物治疗神经元疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中公开了治疗神经元疾病的方法，包含向有需求的受试者施用一种载体，所述载体包含AIMP2‑DX2和任选地miR‑142的靶序列。

Description

使用AIMP2-DX2和任选地miR-142的靶序列及其组合物治疗神 经元疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年9月30日提交的美国临时申请号63/085,950的申请日权益，所述文献的公开内容通过引用方式完整并入本文。
引用电子方式提交的序列表
随本申请一并提交ASCII文本文件(名称：2493-0004WO01_Sequence Listing_ST25.txt；大小：28KB；并且创建日期：2021年9月30日)的以电子方式提交的序列表的内容，通过引用方式完整并入本文。
发明领域
本文中公开了治疗神经元疾病的方法，包含向有需求的受试者施用一种载体，所述载体包含AIMP2-DX2和任选地miR-142的靶序列。
发明背景
哺乳动物的脑可以在已经历经一系列过程后通过建立系统性神经网络执行复杂功能，所述过程包括神经元干细胞分裂、分化、生存与死亡和形成突触等。动物脑中的神经元连续产生神经生长必需的广泛类型物质，甚至在其成熟状态期间也如此，因而诱导轴突和树突生长。另外，可以称它们持续历经分化，因为无论何时执行新学习与记忆时，存在神经网络及突触连接的不停息性突触重塑。如果神经元不能在细胞分化和突触形成过程中收到目标衍生的存活因子如神经生长因子，则它们发生凋亡，并且因应激和细胞毒药物所致的凋亡变成退行性脑病症的主要原因。不同于中枢神经系统，动物的周围神经系统受损时，轴突历经延长的时间段再生。受损神经后部的轴突因称作Wallerian变性的过程而变性并且神经的细胞本体重新开始轴突再生长，同时，许旺细胞在已历经再生过程后再生，包括发生分化之前分裂后通过存活和灭绝等再次确定目标神经。
遍及全球，随着老年群体快速增加，存在每年神经变性病表现持续增加的趋势。由于尚未找到确定性预防和治疗方法，仍然没有治疗这类疾病的疗效突出的药物。另外，用于这些病症的现有药物和疗法频繁显示源自延长施用的副作用及毒性。另外，由于它们仅具有暂时减轻症状程度或延迟症状进展而非完全治疗疾病的作用，故迫在眉睫需要发掘并开发具有决定性治疗效果，与此同时具有减少的副作用和毒性的物质。
自1990年首次启动临床试验以来，直至2002大约600个在人类受试者中的基因治疗临床试验案例已经执行且正在进行中。基于2003年人类基因组序列分析完成，未来将通过发掘种类多样的基因加速新基因治疗的开发。然而直至现在，75％已经获批的基因治疗靶向单基因疾病如癌症或囊性纤维化等，并且用于神经疾病或再生的基因治疗药物开发不活跃(美国NIH重组DNA征询文件(2002)；Gene Therapy Clinical Trials,J.Gene Med.(2002)www.wiley.co.uk/genmed)。然而，已在尝试通过使用神经生长因子如NT-3和神经胶质衍生神经元因子(GDNF)开发基因治疗以治疗并再生帕金森病的感觉神经元(GDNFfamily ligands activate multiple events during axonal growth in maturesensory neurons(GDNF家族配体在成熟感觉神经元中轴突生长期间激活多个事件)(Mol.Cell.Neurosci.25:4453-4459(2004))。由于关于神经系统障碍相关脑功能的神经科学总体研究进展缓慢，开发用于神经系统的多种慢性病症的治疗药物也遭遇难题。
AIMP2-DX2是多因素凋亡性基因AIMP2的拮抗性可变剪接变体。已知AIMP2-DX2通过阻碍AIMP2的功能抑制细胞凋亡。充当AIMP2的竞争性抑制物的AIMP2-DX2通过抑制TRAF2的遍在蛋白化/降解，抑制TNF-α介导的凋亡。另外，已经报道，在现有研究中已确认AIMP2-DX2作为肺癌现有诱导因素并且，确认癌细胞中广泛表现的AIMP2-DX2通过干扰AIMP2的癌症抑制功能诱导癌症。另外，发现正常细胞中AIMP2-DX2的表现推进细胞的癌化，而抑制AIMP2-DX2的表现，则阻抑癌生长，因而展示出治疗作用。
还已经确定AIMP2-DX2可以用于治疗神经元疾病(KR10-2015-0140723(2017)和US2019/0298858(公告日期：2019年10月23日)。
发明概述
本文中公开了用于延迟肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者的疾病发作的方法，所述方法包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者中抑制神经元细胞死亡的方法，所述方法向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在有需求的受试者中治疗肌肉萎缩的方法，所述方法包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。在一些实施方案中，受试者患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)。在一些实施方案中，受试者患有脊髓性肌萎缩(SMA)。
本文中公开了用于增加帕金森病(PD)受试者的存活率或延长其寿命的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在帕金森病(PD)受试者中防止行为缺陷、恢复运动症状和/或减少神经元损伤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在阿尔茨海默病(AD)受试者中抑制淀粉样蛋白β寡聚物(Aβ-O)所诱导神经元细胞死亡或Aβ-O所诱导p53表达的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在脊髓性肌萎缩受试者(SMA)中抑制神经肌肉接头(NMJ)损伤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者中抑制神经肌肉接头(NMJ)损伤、抑制NMJ阻滞所致呼吸衰竭、呼吸困难、抑制NMJ阻滞所致肌肉颤搐或肌束震颤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森病(PD)受试者中抑制失巢凋亡和/或增加层粘连蛋白受体稳定作用的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
重组载体还可以包含miR-142靶序列。
载体还可以包含与AIMP2-DX2有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子或视蛋白启动子。
miR-142靶序列可以相对于AIMP2-DX2基因为3’。
在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、13、14、15、16、17、18、19或20至少90％相同。
在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因包含编码SEQ ID NO:2、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因不具有外显子，所述外显子包含了编码与SEQID NO:10或11至少90％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因不具有外显子，所述外显子包含了编码SEQ IDNO:10或11的氨基酸序列的核苷酸序列。
miR-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA。在一些实施方案中，miR-142靶序列包含ACACTA和SEQ ID NO:5的1-17个额外连续核苷酸。在一些实施方案中，miR-142靶序列包含的核苷酸序列与SEQ ID NO:5(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA)的核苷酸序列至少50％相同。在一些实施方案中，miR-142靶序列可以包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
在一些实施方案中，miR-142靶序列包含ACTTTA。在一些实施方案中，miR-142靶序列包含ACTTTA和SEQ ID NO:7的1-15个额外连续核苷酸。在一些实施方案中，miR-142靶序列包含的核苷酸序列与SEQ ID NO:7(AGTAGTGCTTTCTACTTTATG)的核苷酸序列至少50％相同。在一些实施方案中，miR-142靶序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
miR-142靶序列可以在本文公开的载体中重复2-10次。
载体可以是病毒载体。病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、人免疫缺陷病毒(HIV)载体、鼠白血病病毒(MLV)载体、禽肉瘤/白血病病毒(ASLV)载体、脾坏死病毒(SNV)载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。
附图说明
图1显示重组载体示例。
图2显示重组载体在体外环境下的神经细胞特异性表达效果。
图3显示帕金森病模型中实质内(黑质)注射scAAV-DX2-miR142-3pT后的脑特异性表达。
图4显示有miR142-3pT重复4次(加下划线)的miR142-3pT(靶)序列(SEQ ID NO:6)。
图5A显示有1、2和3次重复的miR142-3pT及突变体序列的示意图。
图5B显示用miR-142-3pT的1、2和3次重复对DX2表达的miR142-3p抑制作用
图6显示核心结合序列在DX2抑制作用中重要。使用含Tseq x3次重复的载体(其显示显著抑制DX2)(图5B)和DX2构建体作为对照。100pmol miR-142-3p处理显著地抑制Tseqx3载体，但是DX2序列和突变体序列不受抑制。
图7显示在鞘内注射scAAV2-DX2-miR142-3p后，从ALS模型的脊髓中提取的总RNA。进行qRT-PCR。
图8显示本发明表达载体在体外环境下的神经细胞特异性表达效果。
图9A-图9E.DX2转基因小鼠恢复鱼藤酮处理的小鼠中的运动症状。图9A.用所示小鼠中的小鼠脑分析TH表达。加黑点的正方形显示TF染色的区域。图9B.转棒分析。鱼藤酮处理的野生型小鼠和DX2转基因(TG)小鼠中的至跌落潜伏期。图9C.爬杆试验。鱼藤酮处理的野生型小鼠和DX2 TG小鼠中的垂直移动(左小图)和掉头时间(T-turn time)(右小图)。动物；n＝6(每个组中)，ns；非显著，**P<0.01，*P<0.05，t检验。图9D和图9E.DX2在鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中改善神经元损伤和行为。图9D.爬杆试验。scAAV-DX2在鱼藤酮处理的PD小鼠模型中恢复运动协调和平衡。“Con”和“GFP”指示野生型的和鱼藤酮处理的GFP注射小鼠。“剂量1”和“剂量2”代表鱼藤酮处理的小鼠中DX2的不同注射剂量。图9E.小鼠黑质的免疫组织化学图像和免疫荧光图像。上半小图显示纹状体中的TH阳性细胞并且下半小图指示已注射表达GFP的病毒的分布。黑点正方形指示TH的染色区域。动物；n＝5(每个组中)，ns；非显著，**P<0.05，*P<0.01，t检验。
图10A-10H.DX2在6-OHDA诱导的PD模型中阻止行为缺陷。图10A.与盐水处理或溶媒(GFP)处理的小鼠相比，scAAV-DX2处理的小鼠显示较低水平的对侧转动，这表明DX2减弱多巴胺能神经元中的损伤。图10B.DX2处理的小鼠显示对侧前爪接触增加，这表明AAV-DX2减弱多巴胺能神经元中的单侧损伤。图10C.AAV-DX2处理小鼠显示身体右偏摆动更少。动物；盐水(盐水处理的野生型小鼠)n＝4，GFP(注射GFP的6-OHDA处理的小鼠)n＝5，DX2(注射DX2的6-OHDA处理的小鼠)n＝11(每只小鼠)，scAAV；scAAV-GFP 4x 109vg，scAAV-DX2低1.6x 108vg，scAAV-DX2 4x 109vg，ns；非显著，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001，t检验。图10D.注射GFP和DX2的小鼠脑的免疫荧光图像。白色正方形框指示TH阳性多巴胺能神经元细胞并且白色箭头显示所指示的病毒注射部位。图10E.每个小鼠组中的生存率。动物；n＝15，盐水表示盐水处理的野生型小鼠。L-DOPA、GFP和DX2代表6-OHDA处理的小鼠中的L-DOPA注射、GFP注射和DX2注射。scAAV；scAAV-GFP(GFP)4x 109vg，scAAV-DX2(DX2)(低)1.6x 108vg，scAAV-DX2(DX2)(高)4x 109vg。图10F和图10G.未处理、6-OHDA处理和DX2处理小鼠的DX2和Bax mRNA表达。***P<0.001，t检验。图10H.在注射AAV-DX2的6-OHDA小鼠模型中鉴定表达DX2的细胞的RNA原位杂交。
图11A-图11G.DX2使MPTP诱导的PD模型中的运动症状恢复。图11A.与载体(scAAV-GFP，GFP)处理小鼠比较时，scAAV-DX2处理的小鼠在转棒试验中显示至跌落潜伏期略微较长，这表明scAAV-DX2减弱针对多巴胺能神经元的损伤。图11B.基于SHIRPA试验，DX2处理的小鼠显示自主活动改善。图11C.DX2处理的小鼠显示相对较低水平的肢体缺陷。图11D.与溶媒对照(GFP)比较时，过量表达DX2的小鼠显示梳理速率改善。图11E.小鼠黑质中TH-阳性细胞的免疫荧光图像。白色正方形框指示表达TH的区域。图11F和图11G.所示小鼠脑的DX2(图11F)和Bax(图11G)mRNA表达。未处理、GFP和DX2指示盐水处理的野生型小鼠、注射GFP的MPTP处理的小鼠和注射DX2的MPTP处理的小鼠。动物；未处理n＝6，GFP n＝9，DX2 n＝12，scAAV；scAAV-GFP 4x 109vg，scAAV-DX2 4x 109vg，*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001，t检验。
图12A和图12B.施用DX2在Lou Gehrig病模型中延迟疾病发作(图12A)并延长寿命(图12B)。动物；n＝5。
图13表示亮视野显微术下的细胞形态。AAV-DX2感染的细胞中DX2过量表达抑制Aβ-O介导的细胞死亡。DX2在Aβ-O处理的细胞中增加细胞活力。将SK-SY5Y细胞与AAV-DX2或AAV-GFP在25μM Aβ-O不存在或存在下孵育，48小时后，通过显微术观察到细胞死亡。原始放大图像，X40(上半小图)，X100(下半小图)。
图14显示对图13中细胞死亡的定量。白色框显示细胞死亡百分数并且黑色框指示细胞活力百分数。
图15指示p53表达水平。在神经毒素诱导的p53表达中DX2表达发挥重要作用。*AAV-DX2(#1)和AAV-DX2(#2)指示不同批中产生的AAV-DX2病毒。
图16A-图16D.突变体SOD1选择性地与KARS1相互作用。图16A.通过酵母双杂交测定法测试Lex-KARS1对B42-SOD1 WT和突变体G85R和G93A的结合亲和力。图16B.将HA-SOD1WT、G85R和G93A转染至HEK 293细胞中并且用HA抗体进行免疫沉淀(IP)。通过免疫印迹法测定KARS1水平和SOD1水平。图16C.通过酵母双杂交测定法测定KARS1片段对SOD1突变体的结合亲和力。图16D.将N2A细胞用myc-KARS1和SOD1 WT、G93A、G85RA转染。进行myc-KARS1的IP并进行免疫印迹以检测AIMP2和67LR(层粘连蛋白受体)。
图17A-图17F.突变体SOD1减少诱导失巢凋亡的67层粘连蛋白受体。图17A.将SK-N-SH细胞用SOD1 WT和G93A转染。收获细胞并对67层粘连蛋白受体(LR)进行免疫印迹。图17B.将神经细胞用SOD1 WT和G93A转染，随后接种在22x22盖玻片上。将细胞固定并且随后用KARS1抗体或67LR抗体处理并且随后，通过共聚焦显微术拍摄图像。白色箭头指示染色层粘连蛋白受体。图17C.为了观察SOD1转染WT和G93A对移行的影响，将神经细胞加载到贯穿孔平板的上室并将WT和G93A加载到下室，所述室由含8.0μm孔径的膜分隔。将膜切除并染色。图17D.将神经细胞用SOD1WT或G93A转染，随后用层粘连蛋白1(LN1)处理0、15、30和60分钟。通过蛋白质印迹法检查pERK水平和ERK水平。图17E.通过免疫沉淀法测定KARS1对WT细胞和表达突变体SOD1的细胞中67LR的结合亲和力。图17F.将SH-SY5Y细胞接种，用KARS1转染r24小时并且随后经SOD1 WT、G85R和G93A转染24小时。随后将它们接种在hema包被的培养皿中，并且随后经TNF-α和放线菌酮(CHX)处理6小时。进行MTT测定法以观察细胞活力。
图18A-图18D.AIMP2-DX2基因对KARS1和67LR的影响。图18A.将SK-N-SH细胞用SOD1 WT或G93A转染，随后用KARS1联合DX2或AIMP2处理。收获细胞并且进行蛋白质印迹。图18B.将神经母细胞瘤细胞用strep-DX2转染r24小时并且随后经SOD1 WT、G93A和G85R转染24小时。收获细胞并且进行亚细胞分级，并对样品进行免疫印迹。图18C.将神经细胞用SOD1WT或G93A转染，并且随后将其用AAV-EV或AAV-DX2处理。并且将细胞用层粘连蛋白1(LN1)处理0、15、30和60分钟。将细胞裂解并且随后对p-ERK水平和ERK水平进行免疫印迹。图18D.将SH-SY5Y细胞用SOD1 WT或G93A转染，随后用TNF-α(30ng/mL)处理24小时。通过iCelligence测量细胞贴壁。
图19A-图19B.施用DX2拯救突变体SOD1诱导神经元死亡。图19A.将SH-SY5Y细胞用SOD1 WT、G85R和G93A转染并用TNF-α和放线菌酮(CHX)处理6小时，随后用腺相关病毒(AAV)对照载体(GFP)或DX2处理。通过MTT测定法检查细胞活力。图19B.分离每只小鼠中的原代神经元细胞，接种在24孔平板上，用AAV-GFP或AAV-DX2处理，并且进行MTT测定法以检查它们的活力。
图20A.结合测定法显示DX2比AIMP2更强烈地与PARP-1结合。图20B.与氧化性应激条件下其他已转染细胞中所见的表达相比时，AIMP2转染的细胞显示对PARP-1的裂解显著增加。然而，DX2-转染的细胞中未观察到PARP-1裂解。图20C.在H2O2存在下AIMP2的PAR化增加，但是DX2的PAR化未改变。
图21A-图21C.AIMP2-DX2和变体的氨基酸序列比较(图21B和图21C是图21A的继续)。
图22A-图22B.抑制神经肌肉接头损伤。在图22A中，将神经肌肉接头用α-银环蛇毒素染色，并且将突触小泡和终板用SV2和2H3染色。在图22B中，计数并呈现受神经支配终板的数目。
发明详述
AIMP2-DX2是多因素凋亡性基因AIMP2(氨酰基tRNA合酶复合体相互作用性多功能蛋白2)的拮抗性可变剪接变体。已知AIMP2-DX2通过阻碍AIMP2的功能抑制细胞凋亡。
充当AIMP2的竞争性抑制物的AIMP2-DX2通过抑制TRAF2的遍在蛋白化/降解，抑制TNF-α介导的凋亡。另外，已经先前鉴定AIMP2-DX2为肺癌诱导性因子。
还已经确定AIMP2-DX2可以治疗神经元疾病(US2019/0298858A1)。
本文中公开了用于延迟肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者的疾病发作的方法，所述方法包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者中抑制神经元细胞死亡的方法，所述方法向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在有需求的受试者中治疗肌肉萎缩的方法，所述方法包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。在一些实施方案中，受试者患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)。在一些实施方案中，受试者患有脊髓性肌萎缩(SMA)。
本文中公开了用于增加帕金森病(PD)受试者的存活率或延长其寿命的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在帕金森病(PD)受试者中防止行为缺陷、恢复运动症状和/或减少神经元损伤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在阿尔茨海默病(AD)受试者中抑制淀粉样蛋白β寡聚物(Aβ-O)所诱导神经元细胞死亡或Aβ-O所诱导p53表达的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在脊髓性肌萎缩受试者(SMA)中抑制神经肌肉接头(NMJ)损伤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者中抑制神经肌肉接头(NMJ)损伤、抑制NMJ阻滞所致呼吸衰竭、呼吸困难、抑制NMJ阻滞所致肌肉颤搐或肌束震颤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
本文中公开了在肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森病(PD)受试者中失巢凋亡和/或增加层粘连蛋白受体稳定作用的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
还公开了抑制ALS受试者中炎症的方法、在PD受试者中防止行为缺陷、抑制神经元细胞死亡和/或肌肉萎缩的方法、在PD受试者中恢复运动症状的方法、在AD受试者中治疗阿尔茨海默病(AD)的方法和/或方法在有需求的受试者中治疗先天性肌营养不良、多发性硬化症、肌肉发育不良、重症肌无力、肌病、肌炎(包括多发性肌炎和皮肌炎)、外周神经病变、脊髓性肌萎缩、和/或其他细胞死亡诱导的CNS疾病，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
如本文中公开的重组载体还可以包含miR-142靶序列。载体还可以包含与AIMP2-DX2有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子、突触蛋白启动子、MeCP2启动子、CaMKII启动子、Hb9启动子或视蛋白启动子。
在本文所公开的方法中，在一些实施方案内，重组载体包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因和miR-142靶序列。miR-142靶序列可以相对于AIMP2-DX2基因为3’。本文所述的载体可以在神经元细胞中表达AIMP2-DX2，但不在造血细胞中表达，如不在白细胞和淋巴样细胞中表达。因此，本文所述的载体可以用于特异性靶向神经元细胞以治疗神经元疾病。
AIMP2-DX2多肽(SEQ ID NO:2)是AIMP2(例如，SEQ ID NO:12的aa序列；例如，SEQID NO:3的nt序列)的剪接变体，其中省略AIMP2的第二外显子(SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:4的nt序列)。在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因具有SEQ ID NO:1中所述的核苷酸序列，并且AIMP2-DX2多肽具有SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列。AIMP2-DX2多肽的变体或异构体也为已知并且可以由本领域那些技术人员测定(例如，参见SEQ ID NOS:13-19)。例如，图21A-21C显示的AIMP2(SEQ ID NO:2)和变体SEQ ID NO:13-19比较，以及共有或核心序列(SEQ ID NO:20)。
在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因可以包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、13、14、15、16、17、18、19或20至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或其间任何同一性％范围相同。AIMP2-DX2基因可以包含编码SEQ ID NO:2、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的核苷酸序列。
AIMP2-DX2基因可以包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少96％、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或其间任何同一性％范围相同的核苷酸序列。AIMP2-DX2基因可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因不具有包含下述核苷酸序列的外显子，所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:10或11具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因不具有外显子，所述外显子包含了编码SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因不具有包含下述核苷酸序列的外显子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
miR-142靶序列(miR-142T)可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA。miR-142靶序列可以包含一个核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA和SEQ ID NO:5的1-17个额外连续核苷酸。例如，miR-142靶序列可以包含一个核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA和如SEQ ID NO:5中所示与ACACTA的5’或3’邻接的总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个额外核苷酸。
miR-142靶序列可以包含与SEQ ID NO:5(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA；miR-142-3pT)的核苷酸序列至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同、至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的核苷酸序列。miR-142靶序列可以包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
miR-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA。miR-142靶序列可以包含一个核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA和SEQ ID NO:7的1-15个额外连续核苷酸。例如，miR-142靶序列可以包含一个核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA和如SEQ ID NO:7中所示与ACTTTA的5’或3’邻接的总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个额外核苷酸。
miR-142靶序列可以包含与SEQ ID NO:7(AGTAGTGCTTTCTACTTTATG；miR-142-5pT)的核苷酸序列至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同、至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的核苷酸序列。miR-142靶序列可以包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
miR142-3pT突变体序列的示例是：
突变体序列指miR142 3pT的核心序列的一个或多个区域(例如，四个区域)如下置换：(5’-AACACTAC-3’→5’-CCACTGCA-3’)。载体转染的有miR142-3p x1重复(100pmol)miR142-3p靶序列的HEK293细胞中观察到抑制DX2表达并且随着miR142-3p靶序列中核心结合序列的数目增加，miR142-3p对DX2表达的抑制作用也增加。含有Tseq x3核心序列的载体显示明显的抑制作用，而未观察到突变3x序列的抑制作用。
微RNA(miRNA)是功能在于控制基因表达的非编码性RNA分子。MiRNA通过与mRNA分子内部的互补序列(即，miRNA靶序列)碱基配对发挥作用。miRNAs可以与蛋白质编码基因的靶信使RNA(mRNA)转录物结合并且负向控制其翻译或引起mRNA降解。目前，已经鉴定到超过2000种人miRNA并且可公开获得miRbase数据库。许多miRNA以组织特异性方式表达并且在维持组织特异性功能和分化方面具有重要作用。
MiRNA在基因翻译后阶段发挥作用并且，在哺乳动物的情况下，已知大约60％基因表达受miRNA控制。miRNA在活体内部种类繁多的过程中发挥重要作用并且已经透露与癌症、心脏疾病和神经相关病症有相关性。例如，miR-142-3p和miR-142-5p存在于miR-142中并且可以使用其靶序列中任一者。因此，“miR-142”或“miRNA-142”例如指miR-142-3p和/或miR-142-5p，并且可以结合于miR-142靶序列，例如，miR-142-3pT或miR-142-5pT。
miR-142靶序列可以相对于AIMP2-DX2基因为5’或3’。
例如，“miR-142-3p”可以存在于侵袭性B细胞白血病中其基因转位发生的区域内并且已知在造血组织(骨髓、脾和胸腺等)中表达。另外，已知miR-142-3p参与造血系统分化，同时确认在胎小鼠肝脏(小鼠造血组织)中表达。
在一些实施方案中，miR-142-3p和/或miR-142-5p靶序列重复至少2-10次、至少2-8次、至少2-6次、至少4次或其任何范围或次数。
作为一个示例，例如具有SEQ ID NO:23的核苷酸序列的miR-142-3p可以具有相应的靶序列，例如具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的miR-142-3p靶序列(miR-142-3pT)，但不限于此。例如具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的miR-142-5p可以具有相应的靶序列，例如，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的miR-142-5p靶序列(miR-142-5pT)，但不限于此。
在一些实施方案中，miR-142-3p可以具有SEQ ID NO:23的核苷酸序列并且miR-142-5p可以具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列。
本文中公开了可以通过以下方式控制肿瘤中AIMP2-DX2变体过量表达的副作用的重组载体：将miR-142-3p和/或miR-142-5p靶序列(miR-142-3pT和/或miR-142-5pT分别)插入AIMP2-DX2的末端并且控制CD45衍生的细胞、尤其淋巴系统和白细胞中对AIMP2-DX2表达的抑制。因此，AIMP2-DX2变体的表达可以限制在仅在注射过的神经元细胞和组织中，而不在非神经元造血细胞(注射过的组织区域内的主要群体)中。MiR142-3p仅在造血细胞中表达。
本文中公开了含有针对miR-142-3p和/或miR-142-5p的靶序列的重组载体。本文中公开了包含如本文中公开的外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因和miR-142-3p和/或miR-142-5p靶序列的重组载体。
术语“重组载体”指可以在适宜的宿主细胞中表达为靶蛋白质或RNA的载体，及基因构建体，所述基因构建体含有基本上有效连接的控制因子以使得插入的基因适当表达成为可能。
术语“有效连接”指核酸表达控制序列与核酸序列之间的功能性联系，其中所述核酸序列编码被靶向的执行总体功能的蛋白质和RNA。例如，它可以影响核酸序列表达，其中所述核酸序列编码已经出于核酸序列的可操作性而连接的启动子和蛋白质或RNA。可以通过使用相应技术领域内熟知的基因重组技术及使用相应技术领域内通常已知用于区域特异性切割与连接DNA的酶，产生与重组载体的可操作性联系。
重组载体还可以包含如本文中公开的与AIMP2-DX2有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子、突触蛋白启动子、MeCP2启动子、CaMKII启动子、Hb9启动子或视蛋白启动子。
重组载体可以另外含有非均一启动子及启动子中有效连接的非均一基因。
如本文所用的“非均一基因(heterogeneous gene)”可以包括具有生物学上适宜激活作用的蛋白质或多肽，和被靶向产物(如免疫原或抗原性蛋白质或多肽或治疗激活性蛋白质或多肽)的加密序列。
多肽可以补足宿主细胞中内源蛋白的匮乏或缺少表达。可以从种类多样的供应物引出基因序列，所述供应物包括DNA、cDNA、合成DNA、RNA或其组合。基因序列可以包括含有或不含有天然内含子的基因组DNA。另外，基因组DNA可以随启动子序列或聚腺苷酸化序列一起获得。基因组DNA或cDNA可以按多种方法获得。可以通过相应领域内公开通告的方法从适宜细胞提取和纯化基因组DNA。或者，mRNA可以用来借助逆转录或其他方法通过与细胞分离，产生cDNA。或者，多核苷酸序列可以含有与RNA序列互补的序列，例如，反义RNA序列，并且可以将反义RNA施用至个体，以阻遏个体的细胞中互补性多核苷酸表达。
例如，非均一基因是其中丢失外显子2的AIMP-2剪接变体，miR-142-3p靶序列可能与非均一基因的3’UTR连接。文献中描述了AIMP2蛋白的序列(312aa形式：AAC50391.1或GI:1215669；320aa形式：AAH13630.1，GI:15489023、BC0 13630.1)(312aa形式：Nicolaides,N.C.,Kinzler,K.W.和Vogelstein,B.Analysis of the 5’region of PMS2 revealsheterogeneous transcripts and a novel overlapping gene(分析PMS2的5’区域揭示非均一转录物和一个新重叠基因),Genomics 29(2),329-334(1995)/320aa形式：Generationand initial analysis of more than 15,000full-length human and mouse cDNAsequences(超过15,000个全长人类和小鼠cDNA序列的生成和初步分析),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),16899-16903(2002))。
术语“AIMP2剪接变体”指因外显子1至4当中外显子2部分或完全丢失而生成的变体。就这而言，该变体意味着干扰AIMP2通过形成AIMP2蛋白质和异二聚体的正常功能。注射的AIMP2-DX2基因在排除已注射组织之外的组织中稀有表达。然而，作为额外的安全措施，可以插入miR142靶序列以完全断绝AIMP2-DX2在造血细胞(受注射组织区域内中非神经元细胞的主要群体)中表达的可能性。
重组载体可以包括SEQ ID NOS:1和5。
术语“序列同源性％”、“同一性％”或“％相同”于某核苷酸或氨基酸序列可以例如是通过在比较区内部比较2个最佳排列的序列来证实，并且最佳排列这2个序列(不包含添加或缺失)时与参考序列相比，比较区中一些核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，缺口)。
如本文中公开的蛋白质不仅包括具有其天然型氨基酸序列的的那些，还包括具有变异氨基酸序列的那些。
蛋白质的变体预示具有因天然氨基酸序列缺失、插入、非保守性或保守性置换或其组合和多于1个氨基酸残基所致的差异序列的蛋白质。在相应区域注明蛋白质和肽中总体上不调整分子激活作用的氨基酸交换(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,AcademicPress,New York,1979)。
可以通过天然提取、合成(Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156,1963)或基于DNA序列的基因重组(Sambrook等人,Molecular Cloning,Cold Spring HarbourLaboratory Press,New York,USA,第2版,1989)产生蛋白质或其变体。
氨基酸突变可以出现基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如亲水性、疏水性、电荷和大小等。根据对氨基酸侧链取代基大小、形状和类型的分析，可以了解精氨酸、赖氨酸和组氨酸是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这类考虑，可以认定精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在生物学上为功能等同物。
在引入一个或多个突变中，可以考虑氨基酸的疏水指数。根据疏水性和电荷向每种氨基酸赋予疏水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
在赋予蛋白质的互作性生物学功能时，疏水性氨基酸指数非常重要。只有用疏水指数相似的氨基酸进行置换才可能具有相似的生物学激活作用。在通过参考疏水指数引入突变的情况下，在疏水指数差异处于±2以内、±1以内或±0.5以内的氨基酸之间置换。
同时，还众所周知，在亲水性值相似的的氨基酸之间置换可以诱导具有等同生物学激活作用的蛋白质。如美国专利号4,554,101中所示，向每种氨基酸残基赋予以下亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在通过参考亲水值引入一个或多个突变的情况下，在亲水值差异处于±2以内、±1以内或±0.5以内的氨基酸之间置换，但不限于此。
在相应区域注明蛋白质中总体不调整分子激活作用的氨基酸交换(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。大部分通常上出现的交换是在包括以下者的氨基酸残基之间的那些交换：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。可以通过相应行业中宣布的多样性方法构建载体系统。Sambrook等人(2001),Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press中描述了具体方法。
本文公开的载体可以作为常见的克隆或表达载体构建。另外，载体可以用原核或真核细胞作为宿主来构建。如果载体是表达载体和并且使用核细胞作为宿主，则常见是纳入执行转录的强力启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、1pp启动子、pL X启动子、pRX启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子和T7启动子、等)、解码启动用核糖体结合位点和转录/解码终止序列。在使用大肠杆菌(例如，HB101、BL21、DH5a等)作为宿主细胞的情况下，大肠杆菌色氨酸生物合成路线的启动子和操纵基因位点(Yanofsky,C.(1984),J.Bacteriol.,158:1018-1024)和噬菌体X的左向启动子(pLX启动子，Herskowitz,I.和Hagen,D.(1980),Ann.Rev.Genet.,14:399-445)可以用作对照。
同时，可以使用的载体可能多于1个类型，如病毒载体、线性DNA或质粒DNA。
“病毒载体”指能够递送基因或遗传物质至预期细胞、组织和/或器官的病毒载体。
尽管病毒载体可以包括多于1个来自腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、HIV(人类免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(鸟类肉瘤/白血病)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)和单纯疱疹病毒所组成群组的物种，但它不限于此。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体或单纯疱疹病毒载体。
尽管逆转录病毒具有宿主细胞基因组整合功能且无害于人体，但它可以具有诸特征，包括整合时抑制正常细胞的功能、感染种类多样细胞的能力、易于增殖、容纳大约1-7kb外来基因及生成副本缺陷病毒。然而，逆转录病毒还可能具有诸缺点，包括难以感染有丝分裂后的细胞、体内条件下递送基因及需要在体外条件下增殖体细胞。另外，逆转录病毒具有自发突变风险，因为它可能整合入原癌基因中，因而带来细胞坏死的可能性。
同时，腺病毒作为克隆载体具有各种优点，包括甚至在中等大小水平的细胞的胞核中复制、临床上无毒、即使插入外来基因亦稳定、无基因重排或丢失、转化真核生物，并且甚至整合入宿主细胞染色体时也在高水平稳定发生表达。腺病毒的良好宿主细胞是作为人类中造血系统瘤、淋巴瘤和骨髓瘤病因的细胞。然而，增殖困难，原因在于它是线性DNA且不易回收感染的病毒，连同病毒感染率低。另外，已递送基因的表达在1-2周期间最大量，而仅在一些细胞中表达历经3-4周维持。另一个问题是它具有高度的免疫抗原性。
近几年，腺相关病毒(AAV)已经为优选，因为它可以弥补前述问题并且作为基因治疗剂具有众多优点。它还称作腺卫星病毒。腺相关病毒粒子的直径是20nm并且已知其对人体几乎无害。就出而论，其作为基因治疗剂在欧洲获批销售。
AAV是需要辅助病毒以复制的单链前病毒，并且AAV基因组具有可以向已感染细胞的染色体19的特定区域中插入的4,680bp。将转基因插入质粒DNA，所述质粒DNA由2个各自145bp的反向末端重复序列(ITR)序列部分和信号序列部分连接。与表达AAV rep部分和cap部分的其他质粒DNA一起执行转染，并且添加腺病毒作为辅助病毒。AAV具有以下优点：递送基因的宿主细胞类型广泛、反复施用时免疫副作用少和基因表达时间长。另外，它安全，即便AAV基因组整合入宿主细胞的染色体亦如此，并且不调整或重排宿主的基因表达。
腺相关病毒已知具有总共4个血清型。可以用于递送靶基因的许多腺相关病毒血清型当中，研究最充分的载体是腺相关病毒血清型2并且当前用于递送囊性纤维化、血友病和Canavan病的临床基因。另外，最近，重组腺相关病毒(rAAV)在基因治疗癌症领域的潜力正在增加。也正是腺相关病毒血清型2才用于本发明中。尽管可以选择并应用适当的病毒载体，它不限于此。
另外，如果载体是表达载体并且使用真核细胞作为宿主，则可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(示例：金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例子：后腺病毒启动子、疫苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV TK启动子)。具体而言，尽管启动子可以包括多于1个选自以下的种类：逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子，但不限于这些启动子。另外，它通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
本文公开的载体可以按需要与其他序列融合，以使得蛋白质纯化更容易。尽管可以例如使用诸如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)和6xHis(六组氨酸；Quiagen，美国)等融合序列，但不限于这些融合序列。另外，表达载体可以包含通常在相应行业中用作选择性标志物的抗生素耐药基因，所述抗生素包括氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素作为示例。
另外，本文公开了基因载体，包括含有分别针对miR-142(如miR-142-3p和/或miR-142-5p)的靶序列(miR-142-3pT和/或miR-142-5pT)的重组载体。
术语“基因转移”包括递送遗传物质至细胞以便总体转录和表达。其方法理想用于蛋白质表达和治疗目的。宣布了种类多样的递送方法如DNA转染法和病毒转导法。它代表归因如下的病毒介导基因转移：因为已递送基因的高递送效率和高表达水平及(如果需要)自然界友好或假性分型(nature-friendliness or pseudo-typing)而靶向特定受体和/或细胞类型的可能性。
基因载体可以是已被转化成重组载体的已转化实体，并且转化包括向有机实体、细胞、组织或器官引入核酸的全部方法，并且如在相应领域所宣称，有可能根据宿主细胞选择并且执行适宜的标准技术。尽管这类方法包括电穿孔法、原生质融合法、磷酸钙(CaP04)沉降法、氯化钙(CaCl2)沉降法，与使用碳化硅混合法、农杆菌介导的转化法、PEG法、硫酸葡聚糖法和脂质转染胺法(lipofectamin)等，但不限于这些方法。
基因载体旨在神经元中表达非均一基因。就此而言，它抑制非均一基因在CD45衍生的细胞中表达并且可以增加非均一基因在脑组织中表达。大多CD45是位于造血细胞上的酪氨酸磷酸酶跨膜蛋白。可以根据位于细胞表面上的分子界定细胞并且CD45是全部白细胞群和B淋巴细胞的细胞标志物。基因载体不在CD45衍生的细胞中、尤其淋巴样细胞和白细胞范围的细胞中表达。
基因载体可以额外地包含允许按药理方式使用的载体、辅料或稀释剂。
另外，本文公开了在神经元中递送及表达非均一基因的方法，所述方法包括将重组载体引入相应实体的步骤。
这些方法可以增加非均一基因在脑组织中表达并且控制非均一基因在其他组织中表达。
另外，本文公开了载体，所述载体包含1)启动子；2)与能够操纵的启动子连接的编码靶蛋白的核苷酸序列；和3)包含靶向miR-142-3p的核苷酸序列的表达盒，所述表达盒插入该核苷酸序列3’UTR中。在一些实施方案中，载体可以包含1)启动子；2)与能够操纵的启动子连接的编码靶蛋白的核苷酸序列；和3)包含靶向miR-142-5p的核苷酸序列的表达盒，所述表达盒插入该核苷酸序列3’UTR中。
术语“表达盒”指这样的单元盒，其可以执行表达以产生并分泌与下游信号肽有效连接的靶蛋白，因为它包含编码靶蛋白的基因和编码启动子与信号肽的核苷酸序列。本发明的分泌表达盒可以与分泌系统混合使用。可以辅助靶蛋白高效产生的种类多样的因子可以包含于这类表达盒中及其外部。
另外，本文公开了用于神经变性病的预防或治疗用制剂，所述制剂包含编码丢失外显子2的AIMP-2剪接变体的核苷酸序列和与核苷酸序列3’UTR连接的靶向miR-142-3p的核苷酸序列。
因此，本文还公开了在有需求的受试者中治疗神经元疾病的方法，所述方法包括施用本文公开的载体中任一者。虽然神经变性病可以是多于1种选自以下的疾病：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、视网膜变性、轻度认知损害、多发性梗死性痴呆、额-颞叶痴呆、痴呆伴路易体、亨廷顿病、退行性神经病、代谢性脑病、抑郁、癫痫、多发性硬化症、皮质基底节变性变性、多系统萎缩、进行性核上麻痹、齿状核红核苍白球路易体萎缩、脊髓小脑性共济失调、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩和卒中，但不限于这些疾病。在一些实施方案中，神经元疾病是ALS。治疗可以改进患有神经元疾病(例如，ALS、阿尔茨海默病或帕金森病)受试者的记忆、运动失调、运动活跃度和/或延长寿命。在一些实施方案中，治疗可以改进患有神经元疾病(例如，ALS)受试者的运动活跃度和/或延长寿命。
本文公开的载体可以实现但不限于抑制凋亡、改善运动失调和/或抑制氧化性应激，并且因此预防或治疗神经元疾病。
作为施加本文公开的药理学物质的结果，术语“治疗”不仅包括完全治疗神经变性病，还包括部分治疗、改善和/或减少神经变性病的总体症状。
术语“预防(prevention)”意指通过施加本文公开的药理学物质抑制或阻断诸如认知障碍、行为障碍和脑神经毁坏等症状或现象，事先预防神经变性病的总体症状出现。
相对于本文公开的药理学物质，可以额外地包括排除有效成分之外的佐剂。尽管可以无限制地使用任何佐剂，只要它在相应技术领域为已知，但有可能例如通过进一步包含Freund完全和不完全佐剂来增加免疫性。
本文公开的药理学物质可以按照使有效成分与药理学允许的载体混合的样式制造。此处，药理学允许的载体包括药理学领域内通常使用的载体、辅料和稀释剂。可以用于本文所公开药理学物质的药理允许的载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿位伯树胶橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟甲基苯甲酸酯、羟丙基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于这些。
本文公开的药理学物质可以通过按照各种样式制造来使用，所述样式包括口服施用类型如粉剂、颗粒剂，丸剂、胶囊剂、混悬溶液剂、乳剂、糖浆剂和气溶胶剂等，及根据其相应的一般制造方法，包括外部施加、栓剂药物或消毒注射溶液等。
当制造成制剂时，可以在制造中使用通常使用的稀释剂或辅料如填料，增容剂、结合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂等。固态口服施用制剂包括丸剂、片剂、粉剂、颗粒剂和胶囊制剂，并且可以通过将多于1种辅料如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶与有效成分混合，制造这类固态制剂。另外，除简单辅料之外，也可以使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石。液态口服施用制剂包括混悬溶液剂、内用溶液剂、油剂和糖浆剂等，同时包含排除作为通常所用稀释剂的水和液体石蜡之外的各种辅料如湿润剂、甜味剂、调味剂和防腐剂等。非口服施用制剂包括灭菌水溶液剂、非水溶剂、混悬剂、油剂、冷冻干燥剂和栓剂。可以使用植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油和可注射用酯如乙酯作非水溶剂及混悬溶液。栓剂用物质可以包括witepsol、tween 61、可可油、月桂精油和甘油明胶(glycerogelatin)等。
药理学物质可以通过多样化通道施用至受试者或实体中。可以使用全部施用样式如口服施用，及静脉内、肌肉、皮下和腹膜内注射。
本文公开的治疗活性剂的合乎需要的施用剂量根据各种因素而不同，所述因素包括制备生产方法、施用样式、年龄、患者体重和性别、疾病症状的程度、食物、施用时间、施用途径、释放速度和反应灵敏度等。然而，该剂量可以由相应的生产商适当地选择。对于治疗效果，熟练的医生可以确定并且开处有效剂量用于定向治疗。例如，治疗剂包括静脉内、皮下和肌肉注射剂、通过使用微针直接注射入脑室或脊髓。有可能多次注射和反复施用，例如，有效剂量在载体情况下是0.05至15mg/kg，在重组病毒情况下是5×1011至3.3×1014个病毒粒子(2.5×1012至1.5×1016IU)/kg，并且在细胞情况下是5×102至5×107个细胞/kg。合乎需要地，按每周施用2至3次的比率，剂量在载体情况下是0.1至10mg/kg，在重组病毒情况下是5×1012至3.3×1013个粒子(2.5×1013至1.5×1015IU)/kg并且在细胞情况下是5×103至5×106个细胞/kg。不严格限制剂量。而且，它可以根据患者的状况和神经疾病的表现程度调整。按照间距10cm及每周2～3次的比率时，用于其他皮下脂肪与肌肉注射和直接施用至受累区域的有效剂量是9×1010至3.3×1014个重组病毒粒子。不严格限制剂量。而且，它可以根据患者的状况和神经疾病的表现程度调整。更具体地，根据本发明的药理学物质包含1×1010to 1×1012个vg(病毒基因组)/mL重组腺相关病毒，并且通常，可建议历经2周每2天注射1×1012个vg一次。它可以一天施用一次或通过分割该剂量供一整天数次施用来施用。在一些实施方案中，载体可以按0.1×108个vg至500×108个vg、1×108个vg至100×108个vg、1×108个vg至10×108个vg(例如5×108个vg)或自其所衍生任何范围的剂量施用。对于IV注射剂，例如，vg可以转换成用于静脉内注射的基于体重的人用剂量。对于局部组织注射剂，例如，vg也可以转换成基于靶细胞数目和有效MOI(感染复数)的人用剂量。
在一些实施方案中，可以借助例如视网膜下注射、玻璃体内注射或脉络膜下注射，将本文公开的载体注入受试者。注射剂可以处于液体形式。在其他实施方案中，本文公开的载体可以按滴眼剂或油膏剂形式施用至受试者。
药理学制剂可以按种类多样的口服和非口服可施用样式产生。在一些实施方案中，本文公开的载体可以施用至脑或脊髓。在一些实施方案中，可以通过脑立体定位注射，将本文公开的载体施用至脑。
可口服施用药剂包括丸剂、片剂、硬胶囊剂和软胶囊剂、液体剂、混悬溶液剂、油剂、糖浆剂和颗粒剂等。除有效成分之外，这些药剂还可以包含稀释剂(示例：乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)和润滑剂(示例：二氧化硅、滑石和硬脂酸及其镁或钙盐和/或聚乙二醇)。另外、丸剂可以含有粘合剂如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷，并且取决于场景，可以含有分解剂如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或类似混合物和/或吸附剂、着色剂、风味剂和甜味剂。可以通过一般混合法、造粒法或包衣法制造药剂。
另外，注射剂是非口服施用制剂的代表性形式。这类注射剂的溶剂包括水、林格氏溶液、等渗生理盐水和悬液。注射剂的灭菌固定油可以用作溶剂或悬浮介质，并且包含单甘油酯和二甘油酯的任何无刺激性固定油可以用于这个目的。另外，注射剂可以使用脂肪酸如油酸。
如下将通过使用以下执行实施例更详细地解释本发明。然而，以下执行实施例仅旨在阐明本发明的内容且不将本发明的申请限于这类实施例。
实施例
实施例1产生重组载体
大部分CD45是造血细胞的酪氨酸磷酸酶跨膜蛋白，根据细胞表面上的分子其可以用来定义细胞。CD45是全部白细胞群和B淋巴细胞的标志物。已经产生一种重组载体，其特异性且仅在神经元中表达，而不在CD45衍生的细胞、尤其淋巴样和白细胞细胞中表达。重组载体含有其中氨酰基tRNA合成酶复合体相互作用性多功能蛋白2(AIMP2)的外显子2已被缺失的剪接变体和能够控制AIMP2剪接变体表达的miRNA。
作为分布安全措施，如上文产生重组载体，旨在诱导AIMP2剪接变体仅在受注射的神经元组织中特异性表达并且旨在完全断绝AIMP2-DX2在造血细胞(受注射组织区域内中非神经元细胞的主要群体)中表达的可能性。
实施例1.1.产生AIMP2变体
AIMP2是涉及氨酰基tRNA合成酶(ARS)形成并且充当多因子凋亡蛋白的蛋白质之一。为了构建其中AIMP2的外显子2已经被缺失的表达变体的质粒，将AIMP2剪接变体的cDNA克隆入pcDNA3.1-myc。通过已经使用引物扩增AIMP2剪接变体后，利用EcoRl和Xho1在pcDNA3.1-myc中执行亚克隆，其中所述引物具有与H322 cDNA连接的EcoR1接头和Xho1接头。
使用了具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的AIMP2变体。
实施例1.2.分选miRNA并且选择其靶序列
如上文提到，作为分布安全措施，如上文产生重组载体，旨在使AIMP2变体的表达限定于受注射的神经元细胞中并且旨在完全断绝AIMP2-DX2在造血细胞(受注射组织区域内中非神经元细胞的主要群体)中表达的可能性。
为此目的，选择仅在产生白细胞和淋巴样相关细胞的造血细胞中特异性表达的miR-142-3p作为靶。为了产生仅靶向miR-142-3p的序列，使用小鼠B细胞的微阵列数据和对miR-142-3p所靶向的基因的计算机编程(mirSVR评分)。miR-142-3p是以序列编号3指示的碱基序列。以碱基序列编号4指示靶向miR-142-3p的序列，其以互补方式与miR-142-3p结合。MiR-142-3p靶序列可以具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
miR-142-3p靶序列包含克隆用限制酶(Nhe 1和Hind III、Bmt 1)位点序列(ccagaagcttgctagc)和限制酶(Hind H)位点序列(aagcttgtag)。它包括已经重复4次的SEQID NO:5的核苷酸序列，连同将它们连接的接头(tcac和gatatc)(图3；SEQ ID NO:6)。
实施例1.3.产生重组载体
为了产生重组载体，将miR-142-3p靶序列(SEQ ID NO:5)插入AIMP2变体(序列编号1)的3’UTR中。以核苷酸序列编号6指示AIMP-2变体和miR-142-3p靶序列连接，并且具体而言，通过使用Nhe I位点和Hind III位点将它们切割并插入。图1中显示重组载体。
实施例2确认神经细胞特异性表达重组载体
实施例2.1.确认体外条件下神经元特异性表达作用
由于miR142-3p仅在造血细胞中才特异性表达，故在特定细胞中根据重组载体的miR142-3p靶序列的表达，根据AIMP2变体的敲减确认AIMP2变体的表达程度。
具体而言，存在无重组载体处理组(假性)、空白/对照载体处理组(NC载体)、单一AIMP2变体载体处理组(pscAAV_DX2)和重组载体处理组(pscAAV-DX2-miR142-3pT)。全部载体的浓度均以ug/ul为单位，且每个组用2.5ul(2.5ug)处理。在每个处理组中，处理THP-1细胞株(人白血病单核细胞)和SH-SY5Y细胞株(神经母细胞瘤)，同时证实AIMP2变体敲减。通过使用下表1中引物，执行qPCR(变性15秒和温度60℃下复性与延长30秒，经历40个循环)。
表1
AIMP2变体 引物 SEQ ID NO：
正向 CTGGCCACGTGCAGGATTACGGGG(仅人类) 8
反向 AAGTGAATCCCAGCTGATAG(仅人类) 9
作为结果，确认AIMP2变体在假性载体组和NC载体组中未表达。另外，确认单一AIMP2变体载体处理组(pscAAV-DX2)在THP-1细胞株和SH-SY5Y细胞株中存在表达，因而确认未诱导神经细胞特异性表达。在另一方面，确认AIMP2变体仅在重组载体处理组的SH-SY5Y细胞株中特异性表达(图2)。
实施例2.2.确认体内条件下神经细胞特异性表达作用
具体而言，存在空白/对照载体处理组(NC载体)、单一AIMP2变体载体处理组(pscAAV-DX2)和本发明重组载体处理组(pscAAV-DX2-miR142-3pT)。用10ul(109个vg)浓度为108个vg/ul的每种病毒进行实质内处理。向每个处理组的小鼠进行颅内注射后，1周后在大肠组织、肺组织、脑组织、肝组织、肾组织、胸腺组织、脾组织和外周血单核细胞(PBMC)中确认AIMP2表达。通过使用下表1中引物，执行qPCR(变性15秒和温度60℃下复性与延长30秒，经历40个循环)。
作为结果，确认在本发明重组载体处理的组中AIMP2变体表达仅在含有高浓度神经元的脑组织中特异性增加(图3)。在另一方面，证实AIMP2变体的表达在除脑组织之外的组织中受阻。
实施例3材料与方法
实施例3.1.qRT-PCR
根据生产商的操作方案，使用TRIzol(Invitrogen,Waltham,MA,USA)从脊髓分离总RNA。通过定量用分光光度计(ASP-2680,ACTgene,USA)对提取的RNA定量。为产生cDNA，借助生产商的方案，使用SuperScriptⅢFirst-Strand(Invitrogen)进行逆转录。使用SYBR绿PCR主混合物(ThermoFisher Scientific,USA)，将所产生的cDNA用于实时PCR。重复结果的表达数据用于2-ΔΔCt统计分析并且GADPH表达用于归一化。
实施例3.2.动物
这项研究中所用的hSOD1 G93A转基因小鼠(B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J)购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)。还使用年龄匹配的WT对照小鼠。在韩国首尔大学动物设施中，动物圈养在无特定病原体条件和恒定环境条件(21-23℃温度，50-60％湿度和12小时光/暗循环)下的单独笼中。全部实验程序均遵循首尔大学研究机构动物护理和使用委员会准则(SNUIACUC，2017年8月7日)进行并且这项研究由当地伦理委员会批准“SNUIACUC”(批准号SNU-170807-1)。在症状前阶段中，给予同龄雌性小鼠AAV-GFP和DX2载体。通过直接腰椎穿刺鞘内注射AAV-DX2转导。用Hamilton注射器(Hamilton，瑞士)在两个点缓慢注射(1μl/分钟)总共8μl(4μl/点)AAV-GFP或DX2载体，同时缓慢回撤针头以防止注射的载体损失。
实施例3.3.miR142-3p抑制实验
可以从x1 miR-142-3p靶序列观察到miR-142-3p对DX2表达的抑制作用。使用脂质转染胺2000(Invitrogen，US)，将HEK293细胞用x1、x2和x3重复miR-142-3p靶序列载体瞬时转染，并且还用100pmol miR-142-3p瞬时转染，并且随后孵育48小时。通过PCR分析DX2mRNA的量。从Tseq x1次重复miR142-3p靶序列中观察到miR142-3p对DX2表达的抑制作用(图5B)。
实施例4
实施例4.1.为核心结合序列的抑制作用所生成的三种载体
Tseq x1含有1个核心结合序列，Tseq x2含有2个核心结合序列，并且Tseq x3含有3个核心结合序列(图5A)。
开始从x1重复miR142-3p靶序列中观察到miR142-3p(100pmol)对DX2表达的抑制作用。使用脂质转染胺2000(invitrogen,US)，将HEK293细胞用x1、x2和x3重复miR-142-3pT序列载体瞬时转染并且还用100pmol miR-142-3p瞬时转染，随后孵育48小时。通过PCR分析DX2 mRNA的量。当miR142-3p靶序列中核心结合序列的数目增加时，miR142-3p对DX2表达的抑制作用也增加。含有Tseq x3核心序列的载体显示明显的抑制作用(图5B)。
实施例4.2.核心序列突变
使用小鼠B细胞微阵列数据和miR-142-3p靶基因的mirSVR评分，预测核心序列。如下置换核心序列的四个区域：(5’-AACACTAC-3’→5’-CCACTGCA-3’)(原始序列参见图4并且示意图参见图5A)。
实施例4.3.核心结合序列对DX2抑制作用重要。
置换四个核心序列(图5A)。通过使用脂质转染胺2000(Invitrogen，US)，将HEK293细胞用DX2-miR-142-3p T seq x3重复载体(Tseq3x)或用核心序列突变的载体(mut)瞬时转染，并且用100pmol miR-142-3p瞬时转染，并且随后孵育48小时。通过PCR分析DX2 mRNA的表达。使用Tseq x3重复的载体(其显示显著抑制DX2)(图5B)和DX2构建体作为对照。100pmol miR142-3p处理显著地抑制Tseq x3载体，但是DX2序列和mut序列不受抑制(图6)。
实施例4.4.ALS小鼠模型中的组织分布数据.
在鞘内注射scAAV2-DX2-miR142-3p后，从脊髓中提取总RNA。进行qRT-PCR。DX2表达应当仅限于局部注射部位—脊髓。对于hSOD1 G93A转基因小鼠，采用鞘内注射表达scAAV-DX2 miR142-3p。对照载体注射显示仅脊髓中有表达，脑及坐骨神经中均无表达(图7)。
实施例5
在实施例2中，将HEK293T细胞用其中三种来自Oxgene，UK的质粒共转染，所述质粒编码为产生重组AAV2粒子所必需的全部组分。
将HEK293T细胞也仅用插入AIMP2-DX2或DX2-miR142靶核苷酸作为表达载体且不用于产生AAV粒子的pSF-AAV-ITR-CMV-EGFP-ITR-KanR(Oxgene，UK)转染。
将编码DX2的载体(2ug)和编码DX2-miR142靶序列的载体(2ug)转染入THP-1细胞(人单核细胞，CD45+细胞)和SH-SY5Y(神经元细胞)。48小时后，收获细胞并且分离mRNA。采用合成的cDNA，通过实时PCR分析DX2表达。
相比DX2表达水平在编码DX2的载体所转染和编码DX2-miR142靶序列的载体所转染的SH-SY5Y之间相似，在编码DX2-miR142靶序列的载体所转染的THP-1细胞中DX2表达大幅度减少。因此，miR142-3p仅在THP-1细胞中起效(图8)。
实施例6
实施例6.1.实验方法
动物模型
这项研究中所用的hSOD1G93A转基因小鼠(B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J)购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)。动物圈养在无特定病原体条件和恒定环境条件(21-23℃温度，50-60％湿度和12小时光/暗循环)下的单独笼中。在症状前阶段中，给予同龄雌性小鼠AAV2-GFP或AAV2-DX2载体。通过直接腰椎穿刺鞘内注射AAV2-DX2转导。用Hamilton注射器(Hamilton，瑞士)在两个点缓慢注射(1μl/分钟)总共8μl(4μl/点)AAV-GFP或DX2载体，同时缓慢回撤针头以防止注射的病毒损失。
行为分析为确定疾病发作，我们记录小鼠开始距最大体重减低体重多达5-6％的日期。从总体上看，严重有症状阶段已知在SOD1G93A小鼠中自出生后12周就观察到，但运动能力缺陷在明显症状发作前若干周(出生后天45)就开始(C.R.Hayworth等人Neuroscience.2009December 15；164(3):975–985)。在本研究中，在出生后9周，此时观察到跛行和小鼠开始减低其多达5-6％的最大体重，将scAAV-GFP或scAAV-DX2(GO102)施用至同龄雌性小鼠。通过直接腰椎穿刺术借助鞘内注射实现AAV2-DX2(GO102)转导。
实施例6.2.结果
图9A-图9C显示DX2转基因小鼠恢复鱼藤酮处理的小鼠中的运动症状。图9A显示用所示小鼠中的小鼠脑分析TH表达。加黑点的正方形显示TF染色的区域。图9B显示转棒分析。鱼藤酮处理的野生型小鼠和DX2转基因(TG)小鼠中的至跌落潜伏期。图9C显示爬杆试验。鱼藤酮处理的野生型小鼠和DX2 TG小鼠中的垂直移动(左小图)和掉头时间(右小图)。动物；n＝6(每个组中)，ns；非显著，**P<0.01，*P<0.05，t检验。图9D和图9E显示DX2在鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中改善神经元损伤和行为。图9D显示爬杆试验。scAAV-DX2在鱼藤酮处理的PD小鼠模型中恢复运动协调和平衡。“Con”和“GFP”指示野生型的和鱼藤酮处理的GFP注射小鼠。“剂量1”和“剂量2”代表鱼藤酮处理的小鼠中DX2的不同注射剂量。图9E显示小鼠黑质的免疫组织化学图像和免疫荧光图像。上半小图显示纹状体中的TH阳性细胞并且下半小图指示已注射的表达GFP的病毒的分布。黑点正方形指示TH的染色区域。动物；n＝5(每个组中)，ns；非显著，**P<0.05，*P<0.01，t检验。
图10A-图10H显示DX2在6-OHDA诱导的PD模型中阻止行为缺陷。图10A表明，与盐水或溶媒(GFP)处理小鼠相比，scAAV-DX2处理的小鼠显示较低水平的对侧转动，这表明DX2减弱多巴胺能神经元中的损伤。图10B表明，DX2处理的小鼠显示对侧前爪接触增加，这表明AAV-DX2减弱多巴胺能神经元中的单侧损伤。图10C表明，AAV-DX2处理小鼠显示身体右偏摆动更少。动物；盐水(盐水处理的野生型小鼠)n＝4，GFP(注射GFP的6-OHDA处理的小鼠)n＝5，DX2(注射DX2的6-OHDA处理的小鼠)n＝11，scAAV；scAAV-GFP 4x 109vg，scAAV-DX2 4×109vg，ns；非显著，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001，t检验。图10D显示注射GFP和DX2的小鼠脑的免疫荧光图像。白色正方形框指示TH阳性多巴胺能神经元细胞并且白色箭头显示所指示的病毒注射部位。图10E显示每个小鼠组中的生存率。动物；n＝15，盐水表示盐水处理的野生型小鼠。L-DOPA、GFP和DX2代表6-OHDA处理的小鼠中的L-DOPA注射、GFP注射和DX2注射。scAAV；scAAV-GFP(GFP)4×109vg，scAAV-DX2(DX2)(低)1.6×108vg，scAAV-DX2(DX2)(高)4×109vg。图10F和图10G显示未处理、6-OHDA处理和DX2处理小鼠的DX2和Bax mRNA表达。***P<0.001，t检验。图10H显示在注射AAV-DX2的6-OHDA小鼠模型中鉴定表达DX2的细胞的RNA原位杂交。
图11A-图11G显示DX2在MPTP诱导的PD模型中使运动症状恢复。图11A显示，与载体(scAAV-GFP，GFP)处理小鼠比较时，scAAV-DX2处理的小鼠在转棒试验中显示至跌落潜伏期略微较长，这表明scAAV-DX2减弱针对多巴胺能神经元的损伤。图11B表明，基于SHIRPA试验，DX2处理的小鼠显示自主活动改善。图11C表明，DX2处理的小鼠显示相对较低水平的肢体缺陷。图11D表明与溶媒对照(GFP)比较时，过量表达DX2的小鼠显示梳理速率改善。图11E显示小鼠黑质中TH阳性细胞的免疫荧光图像。白色正方形框指示表达TH的区域。图11F和图11G显示所示小鼠脑的DX2(图11F)和Bax(图11G)mRNA表达。未处理、GFP和DX2指示盐水处理的野生型小鼠、注射GFP的MPTP处理的小鼠和注射DX2的MPTP处理的小鼠。动物；未处理n＝6，GFP n＝9，DX2 n＝12，scAAV；scAAV-GFP 4×109vg，scAAV-DX2 4×109vg，*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001，t检验。
实施例7
将SOD1转基因小鼠用AAV-GFP(GFP)或AAV-DX2于椎管中处理，以探索DX2体内的作用。与注射GFP的小鼠组相比，注射DX2的小鼠组中疾病发作延迟。另外，施用DX2的组中小鼠存活显著长于注射GFP的组者。相比注射GFP的小鼠，施用过DX2的小鼠的寿命延长。
图12A和图12B显示DX2的施用在Lou Gehrig病模型中延迟疾病发作并延长小鼠寿命。图12A.AAV-DX2组中疾病发作改善。图12B.相比AAV-GFP组中者，AAV-DX2组中小鼠的寿命延长。动物；n＝5。
实施例8
实施例8.1.实验方法
细胞培养和处理
在含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中维持人神经母细胞瘤细胞系—SK-SY5Y细胞。为了在神经元细胞中诱导阿尔茨海默病(AD)，将SK-SY5Y细胞以密度1×106个细胞/孔在6孔平板上接种，并且16小时后，将培养基更换为含有25μM淀粉样蛋白β-蛋白寡聚物Aβ-O的RPMI 1640持续24小时。为了鉴定DX2表达对神经元细胞死亡的抑制作用，将SK-SY5Y细胞与Aβ-O孵育24小时，并且随后，溶媒(scAAV2-GFP)或过量表达DX2(scAAV2-DX2)的病毒用来处理RPMI 1640生长培养基中的细胞48小时。通过蛋白质印迹法和显微术分析细胞死亡。
免疫印迹分析
将SH-SY5Y细胞在含有150mM NaCl、0.5％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物的25mM Tris-HCl pH 7.4中裂解。将含有50μg蛋白质的样品在10％聚丙烯酰胺凝胶中电泳并且印迹转移到膜上。将膜用含20％Tween-20、5％脱脂乳的Tri-缓冲盐水封闭并且与针对p53和肌动蛋白的第一抗体孵育。用辣根过氧化物酶缀合的小鼠抗山羊和抗兔第二抗体检测膜上的抗体。根据生产商的手册(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)，借助SuperSignal West Dura持续时间延长的底物分析膜。
实施例8.2.结果
AIMP2-DX2减弱Aβ-O诱导的神经元细胞死亡
阿尔茨海默病(AD)是脑中异常蛋白如淀粉样蛋白β-蛋白(Aβ)和磷酸化τ(p-tau)蛋白积累所致的渐进性神经变性病(Duyckaerts 2009)。已知因蛋白水解裂解淀粉样蛋白前体蛋白所致的淀粉样蛋白β-蛋白聚集在AD形成中发挥至关重要作用(Viola 2015和DeStrooper 2010)。因此，我们研究在诱导AD的细胞中过量表达细胞死亡抑制因子AIMP2-DX2(DX2)(Choi 2011)是否可能影响神经元细胞死亡。在图13中，细胞存活在未处理、溶媒处理(AAV-GFP)和DX2处理(AAV-DX2)的正常生长细胞中并无不同，提示正常条件下增加的DX2表达不是神经元细胞存活的原因。在Aβ-O处理条件下，相比载体处理的细胞(Aβ+AAV-GFP)，DX2处理的细胞(Aβ+AAV-DX2)中观察到神经元细胞死亡减少。并且定量分析图14中的神经元细胞死亡并且在图13的三个不同视野下观察细胞后评定细胞百分数。如图14中所示，相比载体处理组，过量表达DX2的细胞具有显著增加的神经元细胞活力(高达47％)。这些结果表明，DX2表达是对Aβ-O所诱导细胞死亡的保护作用的重要因素。
DX2抑制Aβ-O诱导的p53表达
肿瘤抑制蛋白P53是调节诸如细胞周期和凋亡等生物学事件的关键因素(Finlay1989)。如先前报告(Choi 2011)中所示，AIMP2结合于p53的N末端，后者是针对Mdm2的结合结构域并且其结合诱导p53稳定及促凋亡活性。另外，已知DX2通过打断AIMP2与p53相互作用抑制凋亡活性。因此，研究了病毒转导DX2基因所致的DX2表达增加是否在Aβ-O处理的神经元细胞中影响p53表达。在图15中，p53的细胞表达水平在正常生长条件未改变，但在Aβ-O存在时p53表达水平升高。另外，在DX2处理的细胞中，DX2表达减少Aβ-O诱导的p53表达。这些结果表明，DX2在神经元细胞中抑制Aβ-O诱导的凋亡和促凋亡蛋白(如p53)表达。
DX2表达在神经毒素诱导的p53表达中发挥重要作用(图15)。将SK-SY5Y细胞与AAV-DX2或AAV-GFP在25μM Aβ-O不存在或存在下孵育。在48小时后，制备总蛋白裂解物，并且通过免疫印迹分析法分析p53蛋白的水平。分析β-肌动蛋白的水平作为内参对照。红色正方形框指示Aβ-O处理的细胞中升高的p53水平。
实施例9
实施例9.1.材料与方法
细胞培养物和试剂
HEK 293细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯，VA，美国)并且Neuro-2A(N2A)细胞、SK-N-SH细胞和SH-SY5Y细胞获自韩国细胞库(KCLB，首尔，韩国)。在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(HyClone，匹兹堡，PA，美国)中培养HEK 293细胞和N2A细胞。并且在含10％FBS和1％抗生素的RPMI-1640中孵育SK-N-SH细胞。通过脂质转染胺2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)进行myc标记的KARS、HA标记的突变体SOD1、GFP标记的KARS和GFP标记的突变体SOD1的瞬时转染。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑鎓(MTT)和HEMA(甲基丙烯酸2-羟乙酯)来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，美国)。
酵母双杂交测定法
将全长KARS和片段化的KARS克隆入pLexA质粒并且将SOD1 WT、SOD1 G85R和SOD1G93A克隆入pB42质粒。使用X-gal平板，通过LEU2和LacZ报道分子系统确定酵母中KARS的LexA-片段与B42-SODWT/SOD85/SOD93之间的正相互作用(21)。
免疫沉淀测定法
收获细胞裂解物并用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA，150mMNaCl，20％甘油，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠和PMSF)配制。将细胞裂解物在冰上孵育30分钟，随后按12,000g离心10分钟后收集上清液。将抗HA琼脂糖珠或抗Myc琼脂糖珠添加至裂解物并在4℃用振摇平台孵育过夜。将琼脂糖珠结合的蛋白质洗涤三次并且通过SDS-PAGE分离收集的样品以及进行蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹和抗体
将细胞在含有150mM NaCl、0.5％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物的25mMTris-HCl pH 7.4中裂解。将含有50μg蛋白质的样品在10％聚丙烯酰胺凝胶中电泳并且印迹转移到膜上。将膜用含Tween-20、5％脱脂乳的Tri-缓冲盐水封闭并且与针对Myc(SantaCruz biotechnology,sc-40)、HA、GFP、67层粘连蛋白受体、IκB、微管蛋白、β-肌动蛋白、TRAF2、EPRS、KARS、AIMP2、Erk、磷酸化Erk的第一抗体孵育。用辣根过氧化物酶缀合的小鼠抗山羊和抗兔第二抗体检测膜上的抗体。根据生产商的手册(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)，借助SuperSignal West Dura持续时间延长的底物分析膜。
免疫细胞化学
将细胞用4％PFA在室温固定10分钟，随后用PBS洗涤并用针对SOD1、67LR的抗体孵育过夜。并将染色的细胞洗涤，随后与Alexa Fluor连接的IgG(Vector Laboratories INC,Burlingame,CA,USA)孵育。将核DNA用DAPI(4',6二脒基-2-苯基吲哚，Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)染色。
细胞迁移测定法
使用8μm Transwell室(Corning INC,Corning,NY,USA)进行迁移测定法。将无血清培养基中的N2A细胞接种在24孔迁移板的上室上。下室用400μL含10％FBS的DMEM填充。24小时后，上室用10％PFA在室温固定10分钟，随后用结晶紫染色。并且随后，计数迁移的细胞。
细胞活力测定法
对于MTT测定法，将5×104个细胞/孔铺种在96孔板上并且用所示分子处理24小时。在适宜孵育后，在每个孔中添加15μL在PBS(pH7.2)中5mg/mL的MTT溶液并且在37℃5％CO2气氛下孵育4小时。移除溶液并且在每个孔中添加二甲基亚砜(DMSO)，以溶解不溶性甲臜析出物，并且通过平板读数仪在620nm测量吸光度。
亚细胞分级
为确定KARS1的细胞定位，使用亚细胞级分试剂盒(Biovision,Milpitas,CA,USA)收集胞质级分和膜级分。简而言之，细胞裂解并且按1,000转/分钟在4℃离心10分钟，并且使用上清液作为胞质级分。随后，将沉淀物洗涤并且与脱氧胆酸钠缓冲液在4℃孵育10分钟并且用作膜级分。
细胞贴壁强度试验
将SOD1 G93A转染和DX2转染的SH-SY5Y细胞接种(1.0×104个细胞/mL)至96孔e-平板(ACEA Biosciences,San Diego,CA,USA)并用TNF-α处理24小时以筛选细胞贴壁。并且随后，通过iCELLigence(ACEA Biosciences,San Diego,CA,USA)计数贴壁的细胞。
实施例9.2.结果
先前报道，线粒体形式的KARS与突变体形式SOD1相互作用，并且突变体SOD1和mitoKARS导致线粒体形态异常和细胞毒性。因此，为了研究KARS是否可以通过SOD1突变调节神经元细胞死亡，我们首先确认突变体SOD1和KARS的结合效率。为了实验，制备WT SOD1，SOD1 G93A，SOD1 G85R和KARS并且通过酵母双杂交分析(图16A)和免疫沉淀分析(图16B)分析KARS与每种SOD1之间的相互作用，并且我们观察到KARS以远强于WT SOD1的结合作用与突变体SOD1结合(图16A和图16B)。
接着，为了研究KARS和突变体SOD1的特异性结合位点，我们使用酵母双杂交分析系统确认截短的KARS和突变体SOD1相互作用。如图16C中所示，在KARS的N末端观察到KARS和突变体SOD1结合。证明AIMP2和67层粘连蛋白受体与KRS的N末端相互作用以便癌细胞移行和细胞存活调节。由于AIMP2、67LR和突变体SOD1与KARS的N末端结合，故我们研究KARS和突变体SOD1的相互作用是否影响KARS与AIMP2和67LR结合。如图16D中所示，AIMP2和67LR在WT SOD1存在下结合KARS，然而，在突变体SOD1存在下观察到KARS与AIMP2和67LR的结合减少。结果显示，突变体SOD1通过竞争结合KARS的N末端，减少KARS与AIMP2和67LR结合。
由于我们证明突变体SOD1 G93A已最佳与KARS结合，故我们想要研究其对67LR的影响并且探索它是否与神经细胞死亡相关。当我们转染突变体SOD1至SK-N-SH细胞时，我们可以查明67LR的水平降低(图17A)。
为了确认67LR表达的位置，我们在突变体SOD1转染的细胞中进行IF(免疫荧光)。证明KARS水平在细胞质中比膜中更浓集并且从膜区域大幅度降低(图17B)。
先前证明KARS通过67LR引起细胞迁移。将细胞用SOD1野生型或突变体SOD1转染时，相比野生型SOD1，细胞迁移为突变体SOD1所抑制(图17C)。
由于突变体SOD1影响67LR表达，我们探索其对层粘连蛋白信号传导途径的影响，并且我们可以确认突变体SOD1高度地降低pERK活性(图17D)。
我们还研究了突变体SOD1的表达是否影响KARS与67LR之间的结合亲和力。在图17E中，我们观察到KARS与67LR之间的相互作用因突变体SOD1表达而减少。
失巢凋亡是一种为胞外基质(ECM)与细胞膜蛋白之间接触丧失所触发的凋亡，并且失巢凋亡抗性在细胞存活中发挥重要作用。并且为了诱导失巢凋亡，将细胞用突变体SOD1和KARS共转染并且在悬浮下条件与或不与TNF-α/CHX孵育。作为结果，我们观察到细胞死亡未因KARS过量表达而恢复(图17F)。这个结果提示，层粘连蛋白受体对细胞死亡的调节归因于下游信号传导因层粘连蛋白受体和ECM的相互作用而增加。
我们检验了DX2是否对突变体SOD1诱导的67LR表达具有重要作用。将SK-N-SH细胞用SOD1 WT和SOD1 G93A突变基因转染并且随后，将一个组用促凋亡AIMP2基因转染，而将另一个组用抗凋亡DX2基因转染。在DX2存在下，我们观察到因AIMP2过量表达所致的67LR蛋白减少情况恢复(图18A)。
随后，我们确认因突变体SOD1所致胞质膜中减少的67LR表达是否为DX2基因所恢复。在表达突变体SOD1的细胞中DX2的过量表达增加细胞膜中的67LR蛋白(图18B)，并且我们还观察到67LR的下游信号因DX2基因引入而恢复(图18C)。
接下来，我们检验TNF-α处理随即经EV、突变体SOD1和突变体SOD1+DX2转染之后细胞的脱离情况。DX2处理阻止细胞脱离和失巢凋亡(图18D)。
我们确认DX2通过突变体SOD1影响神经元细胞死亡。在过量表达WT SOD1或突变体SOD1的细胞中转导AAV-DX2时，我们观察到突变体SOD1诱导的凋亡降低至对照水平(图19A)。在GFP感染的细胞中，由CHX/TNF-α处理诱导的WT和两种突变体(G85R和G93A)的细胞死亡率分别升高约20％。但是，CHX/TNF-α处理所致的细胞死亡率在DX2感染的细胞中低于GFP已转导细胞的细胞死亡率约20％，差异显著(p<0.001)。
并且还在原代神经元中显示CHX/TNF-α诱导的细胞死亡因DX2过量表达而减少。在提取自野生型或SOD1转基因小鼠的原代神经细胞中感染过量表达DX2的AAV，将转染的细胞用CHX/TNF-α处理并且分析细胞死亡率。显示在CHX/TNF-α处理条件下G93A原代神经细胞的细胞死亡增加，而在CHX/TNF-α处理的WT和G93A原代神经细胞中DX2大幅度减少细胞死亡(图19B)。
实施例10
在先前研究中，显示AIMP2充当帕金蛋白的底物并且与PARP-1相互作用，而这种相互作用在PD中调节神经元细胞死亡(Lee 2013)。因此，为了研究DX2是否为AIMP2的竞争性抑制剂及是否调节神经元细胞死亡，我们首先在PARP-1和AIMP2或DX2之间进行结合测定法。通过在SH-SY5Y细胞中转染每种质粒诱导PARP-1、AIMP2和DX2的表达，并且随后用PARP-1下拉测定法进行分析(图20A)。将细胞用EV(空载体)、AIMP2和DX2转染，并且24小时后，将转染的细胞与10μM H2O2孵育4小时。使用免疫印迹测定法检查裂解型PARP-1水平(图20B)和PAR化(图20C)。在氧化性应激诱导的细胞损伤条件下，DX2减弱与细胞死亡有关的PARP-1裂解(图20B)和PAR化(图20C)。
如图20A中所示，我们发现DX2比AIMP2更强烈地与PARP-1结合。为了评估氧化性应激条件下AIMP2和DX2是否可能影响PARP-1裂解，我们将表达空对照(EV)、AIMP2或DX2的载体转染这些细胞，并且随后用过氧化氢处理。与氧化性应激条件下其他已转染细胞中所见的表达相比时，AIMP2转染的细胞显示对PARP-1的裂解显著增加。然而，PARP-1裂解在DX2-转染的细胞中未观察到(图20B)。
PAR化是一个翻译后过程，调节诸如DNA损伤反应和凋亡等生物学事件(Szabo1996和Virag 1998)。PARP-1是识别胞核中受损DNA、形成PAR链并诱导受损蛋白质通过PAR化发生降解的酶。因为PAR化(即形成PAR聚合物需要裂解型PARP-1的催化活性)(Barkauskaite 2015)，我们研究了AIMP2或DX2对PAR化的影响。如图20C中所示，在H2O2存在下AIMP2的PAR化增加，但是DX2的PAR化未改变。基于这些结果，我们得出结论：DX2是氧化性应激诱导PARP-1裂解过程的抑制性分子。
实施例11
DX2抑制神经肌肉接头损伤
运动神经元对脑和肌肉之间通讯及传递运动的重要指令为必需。当这些神经细胞发生机能失调或受损时，它们逐渐地停止与肌肉通讯，并且脑丧失其控制和启动随意运动的能力。这导致渐进性虚弱、肌肉颤搐(肌束震颤)和全身随意骨骼肌萎缩。另外，认为导致骨骼肌去神经化的NMJ变性在ALS的发作方面发挥重要作用。肌肉颤搐/肌束震颤和呼吸衰竭一般在ALS中自发作以来2–3年内发生。在疾病最终阶段，这导致致命性瘫痪和因呼吸衰竭所致的死亡。
将肌肉在4℃于4％PFA中固定过夜。使肌肉在30％蔗糖中脱水并且用OCT复合物物包埋用于组织冰冻切片。全部肌肉冰冻切片样品均从含有神经肌肉接头的20μm厚切片获得。
将20μm厚冰冻切片在1XPBS中洗涤两次(每次5分钟)，随后在室温于封闭液(5％BSA)中孵育1小时。
吸去BSA，在室温，将切片与封闭液中针对神经微丝的第一抗体(使用抗神经微丝抗体加抗2H3，SV2抗体作绿染色)和针对突触后乙酰胆碱受体_AChR的第一抗体(使用荧光α-银环蛇毒素缀合物作红染色)孵育过夜。可以轻易地在部分受神经支配或完全去神经支配的突触后受体部位、片段化或皱缩的突触后受体、萎缩的轴突或末梢以及肿胀或营养不良性轴突或末梢观察到众多缺陷。
用Image J测量免疫荧光ROI设定和重叠系数量值。
在这个基础上，通过将腓肠肌对α-银环蛇毒素和SV2、2H3复染，测量野生型(WT)组、ALS诱导的模型(AAV-GFP)组和ALS诱导的模型(GO102)组中各自的骨骼肌去神经化。
在图22A中，将神经肌肉接头用α-银环蛇毒素染色，并且将突触小泡和终板用SV2和2H3染色。在图22B中，计数并呈现受神经支配终板的数目。
GO102减轻在ALS疾病模型中观察到的受神经支配终板的下降％(75.6±12.6对41.0±2.03％)。
总之，DX2抑制神经肌肉接头(NMJ)损伤并且预计DX2使NMJ阻滞诱导的呼吸衰竭和肌肉颤搐或肌束震颤恢复。
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Brown等人,Endogenous microRNA can broadly exploited to regulatetransggene expression acording to tissue,lineage and diffferentiation state(内源微RNA可以广义地用来根据组织、谱系和分化状态调节转基因表达),NatureBiotech.25:12457-1467(2007)
前文对具体实施方案的描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，从而通过应用本领域技术人员能力范围内的知识，他人可以轻易地对各种应用进行修改和/或改编，而不脱离本发明的一般构思。因此，基于本文展示的教导和指引，这类改编和修改意在处于所公开实施方案的等同物的意义和范围范围内。应当理解，本文中的短语或术语旨在描述且并非起到限制作用，从而本说明书的术语或短语应由技术人员根据该教导和指引解读。
本发明的广度和范围不应当受前述示例性实施方案之任一者限制，而应当仅根据以下权利要求及其等同物限定。
本文所述多个方面、实施方案和选项的全体均可以按任意和全部变型组合。
本说明书提到的全部出版物、专利和专利申请均通过引用方式并入本文至相同程度，如同专门且独立地指出通过引用方式并入每份单独出版物、专利和专利申请。
序列表
<110> 杰内罗蒂股份有限公司
<120> 使用AIMP2-DX2和任选地miR-142的靶序列及其组合物治疗神经元疾病的方法
<130> 2493-0004WO01
<150> US 63/085,950
<151> 2020-09-30
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2
<400> 1
atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60
cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120
gctggccacg tgcaggatta cggggcgctg aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc 180
tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg 240
tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt 300
ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa gactatcagc tgggattcac tttaatttgg 360
aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc agcatccaga cgatgtgccc catcgaaggc 420
gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac 480
gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt 540
aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg aactctgctc ttgggaagag cccttggctc 600
gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga 660
ggctgcagtg tgacagtgcc agccaatgtg cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg 720
gctcctttta acacggccct caagctcctt aagtga 756
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2
<400> 2
Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly
20 25 30
Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly
35 40 45
Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu
50 55 60
Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu
65 70 75 80
Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu
85 90 95
Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr
100 105 110
Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met
115 120 125
Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile
130 135 140
Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn
145 150 155 160
Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys
165 170 175
Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser
180 185 190
Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala
195 200 205
Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val
210 215 220
Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu
225 230 235 240
Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys
245 250
<210> 3
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2
<400> 3
atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60
cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120
gctggccacg tgcaggaaga gtctaacctg tctctgcaag ctcttgagtc ccgccaagat 180
gatattttaa aacgtctgta tgagttgaaa gctgcagttg atggcctctc caagatgatt 240
caaacaccag atgcagactt ggatgtaacc aacataatcc aagcggatga gcccacgact 300
ttaaccacca atgcgctgga cttgaattca gtgcttggga aggattacgg ggcgctgaaa 360
gacatcgtga tcaacgcaaa cccggcctcc cctcccctct ccctgcttgt gctgcacagg 420
ctgctctgtg agcacttcag ggtcctgtcc acggtgcaca cgcactcctc ggtcaagagc 480
gtgcctgaaa accttctcaa gtgctttgga gaacagaata aaaaacagcc ccgccaagac 540
tatcagctgg gattcacttt aatttggaag aatgtgccga agacgcagat gaaattcagc 600
atccagacga tgtgccccat cgaaggcgaa gggaacattg cacgtttctt gttctctctg 660
tttggccaga agcataatgc tgtcaacgca acccttatag atagctgggt agatattgcg 720
atttttcagt taaaagaggg aagcagtaaa gaaaaagccg ctgttttccg ctccatgaac 780
tctgctcttg ggaagagccc ttggctcgct gggaatgaac tcaccgtagc agacgtggtg 840
ctgtggtctg tactccagca gatcggaggc tgcagtgtga cagtgccagc caatgtgcag 900
aggtggatga ggtcttgtga aaacctggct cctttt 936
<210> 4
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2的外显子2
<400> 4
gaagagtcta acctgtctct gcaagctctt gagtcccgcc aagatgatat tttaaaacgt 60
ctgtatgagt tgaaagctgc agttgatggc ctctccaaga tgattcaaac accagatgca 120
gacttggatg taaccaacat aatccaagcg gatgagccca cgactttaac caccaatgcg 180
ctggacttga attcagtgct tgggaag 207
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-142-3p靶序列
<400> 5
tccataaagt aggaaacact aca 23
<210> 6
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-142-3p靶序列的4个重复
<400> 6
ccagaagctt gctagctcca taaagtagga aacactacat cactccataa agtaggaaac 60
actacagata tctccataaa gtaggaaaca ctacatcact ccataaagta ggaaacacta 120
caaagcttgt ag 132
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-142-5p靶序列
<400> 7
agtagtgctt tctactttat g 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2变体正向引物
<400> 8
ctggccacgt gcaggattac gggg 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2变体反向引物
<400> 9
aagtgaatcc cagctgatag 20
<210> 10
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2的外显子2
<400> 10
Glu Glu Ser Asn Leu Ser Leu Gln Ala Leu Glu Ser Arg Gln Asp Asp
1 5 10 15
Ile Leu Lys Arg Leu Tyr Glu Leu Lys Ala Ala Val Asp Gly Leu Ser
20 25 30
Lys Met Ile Gln Thr Pro Asp Ala Asp Leu Asp Val Thr Asn Ile Ile
35 40 45
Gln Ala Asp Glu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Asn Ala Leu Asp Leu Asn
50 55 60
Ser Val Leu Gly Lys
65
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2变体的外显子2
<400> 11
Met Ile Gln Thr Pro Asp Ala Asp Leu Asp Val Thr Asn Ile Ile Gln
1 5 10 15
Ala Asp Glu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Asn Ala Leu Asp Leu Asn Ser
20 25 30
Val Leu Gly Lys
35
<210> 12
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2
<400> 12
Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly
20 25 30
Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Glu Glu Ser
35 40 45
Asn Leu Ser Leu Gln Ala Leu Glu Ser Arg Gln Asp Asp Ile Leu Lys
50 55 60
Arg Leu Tyr Glu Leu Lys Ala Ala Val Asp Gly Leu Ser Lys Met Ile
65 70 75 80
Gln Thr Pro Asp Ala Asp Leu Asp Val Thr Asn Ile Ile Gln Ala Asp
85 90 95
Glu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Asn Ala Leu Asp Leu Asn Ser Val Leu
100 105 110
Gly Lys Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro
115 120 125
Gly Ser Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu
130 135 140
His Phe Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser
145 150 155 160
Val Pro Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln
165 170 175
Pro Arg Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val
180 185 190
Pro Lys Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu
195 200 205
Gly Glu Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys
210 215 220
His Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala
225 230 235 240
Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe
245 250 255
Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn
260 265 270
Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile
275 280 285
Gly Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg
290 295 300
Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys
305 310 315 320
<210> 13
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP-DX2变体1
<400> 13
Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly
20 25 30
Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly
35 40 45
Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu
50 55 60
Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu
65 70 75 80
Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu
85 90 95
Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr
100 105 110
Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met
115 120 125
Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile
130 135 140
Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn
145 150 155 160
Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys
165 170 175
Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser
180 185 190
Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala
195 200 205
Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val
210 215 220
Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu
225 230 235 240
Ala Pro Phe
<210> 14
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2变体2
<400> 14
Met Gln Met Glu Gly Thr Ala His Val Lys Ile Cys Gly Gln Ser Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Arg Thr Val Trp Leu Glu His Arg Gln
20 25 30
Arg Thr Lys Leu Gly Glu Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile
35 40 45
Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg
50 55 60
Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser
65 70 75 80
Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln
85 90 95
Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile
100 105 110
Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met
115 120 125
Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu
130 135 140
Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp
145 150 155 160
Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys
165 170 175
Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp
180 185 190
Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val
195 200 205
Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln
210 215 220
Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu
225 230 235 240
Lys Leu Leu Lys
<210> 15
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2变体3
<400> 15
Met Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His
20 25 30
Phe Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val
35 40 45
Pro Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro
50 55 60
Arg Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro
65 70 75 80
Lys Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly
85 90 95
Glu Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His
100 105 110
Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile
115 120 125
Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg
130 135 140
Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly
165 170 175
Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser
180 185 190
Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys
195 200 205
<210> 16
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2变体4
<400> 16
Met Asn Ser Pro Ala Val Asn Thr Leu Ile Gln Arg Ser Arg His Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser
20 25 30
Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe
35 40 45
Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro
50 55 60
Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg
65 70 75 80
Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys
85 90 95
Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu
100 105 110
Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn
115 120 125
Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe
130 135 140
Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser
145 150 155 160
Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu
165 170 175
Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly
180 185 190
Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys
195 200 205
Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys
210 215 220
<210> 17
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2变体5
<400> 17
Met Pro Met Tyr Gln Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn
1 5 10 15
Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu
20 25 30
Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser
35 40 45
Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn
50 55 60
Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp
65 70 75 80
Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys
85 90 95
Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe
100 105 110
Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val
115 120 125
Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala
130 135 140
Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu
145 150 155 160
Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu
165 170 175
Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg
180 185 190
Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys
195 200 205
Leu Leu Lys
210
<210> 18
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2变体6
<400> 18
Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly
20 25 30
Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly
35 40 45
Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu
50 55 60
Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu
65 70 75 80
Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu
85 90 95
Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr
100 105 110
Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met
115 120 125
Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile
130 135 140
Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn
145 150 155 160
Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys
165 170 175
Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser
180 185 190
Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala
195 200 205
Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val
210 215 220
Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu
225 230 235 240
Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys
245 250
<210> 19
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2变体7
<400> 19
Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe
20 25 30
Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro
35 40 45
Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg
50 55 60
Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys
65 70 75 80
Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu
85 90 95
Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn
100 105 110
Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe
115 120 125
Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser
130 135 140
Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu
145 150 155 160
Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly
165 170 175
Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys
180 185 190
Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys
195 200 205
<210> 20
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIMP2-DX2 共有序列
<400> 20
Asp Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Pro Leu Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe
20 25 30
Arg Val Leu Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro
35 40 45
Glu Asn Leu Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg
50 55 60
Gln Asp Tyr Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys
65 70 75 80
Thr Gln Met Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu
85 90 95
Gly Asn Ile Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn
100 105 110
Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe
115 120 125
Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser
130 135 140
Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu
145 150 155 160
Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly
165 170 175
Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys
180 185 190
Glu Asn Leu Ala Pro Phe
195
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有4个重复的miR-142-3pT中的Nhe1, Hind III和Bmt1位点
<400> 21
ccagaagctt gctagc 16
<210> 22
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有4个重复的miR-142-3pT中的Hind H位点
<400> 22
aagcttgtag 10
<210> 23
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-142-3p
<400> 23
uguaguguuu ccuacuuuau gga 23
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-142-5p
<400> 24
cauaaaguag aaagcacuac u 21
<210> 25
<211> 238
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-142-3pT 靶序列突变体
<400> 25
ccgctgcagt gtgacagtgc cagccaatgt gcagaggtgg atgaggtctt gtgaaaacct 60
ggctcctttt aacacggccc tcaagctcct taagtgacca gaagcttgct agctccataa 120
agtaggacca ctgcaatcac tccataaagt aggaccactg caagatatct ccataaagta 180
ggaccactgc aatcactcca taaagtagga ccactgcaaa agcttgtagg gatccgcc 238

Claims (30)

1.一种用于延迟肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者的疾病发作的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
2.在肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者中抑制神经元细胞死亡的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
3.在有需求的受试者中治疗肌肉萎缩的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
4.根据权利要求4所述的方法，其中受试者患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中受试者患有脊髓性肌萎缩(SMA)。
6.用于增加帕金森病(PD)受试者的存活率或延长其寿命的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
7.在帕金森病(PD)受试者中防止行为缺陷、恢复运动症状和/或减少神经元损伤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
8.在阿尔茨海默病(AD)受试者中抑制淀粉样蛋白β寡聚物(Aβ-O)所诱导神经元细胞死亡或Aβ-O所诱导p53表达的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
9.在脊髓性肌萎缩受试者(SMA)中抑制神经肌肉接头(NMJ)损伤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
10.在肌萎缩性侧索硬化(ALS)受试者中抑制神经肌肉接头(NMJ)损伤、抑制NMJ阻滞所致呼吸衰竭、呼吸困难、抑制NMJ阻滞所致肌肉颤搐或肌束震颤的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
11.在肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森病(PD)受试者中抑制失巢凋亡和/或增加层粘连蛋白受体稳定作用的方法，包括向受试者施用包含外显子2缺失型AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因的重组载体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中载体还包含miR-142靶序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中载体还包含与AIMP2-DX2有效连接的启动子。
14.根据权利要求13所述的方法、其中启动子是逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子、突触蛋白启动子、MeCP2启动子、CaMKII启动子、Hb9启动子或视蛋白启动子。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中miR-142靶序列相对于AIMP2-DX2基因为3’。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中AIMP2-DX2基因包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、13、14、15、16、17、18、19或20至少90％相同。
17.根据权利要求16所述的方法，其中AIMP2-DX2基因包含编码SEQ ID NO:2、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的核苷酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中AIMP2-DX2基因不具有外显子，所述外显子包含了编码与SEQ ID NO:10或11至少90％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中AIMP2-DX2基因不具有外显子，所述外显子包含了编码SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的核苷酸序列。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中miR-142靶序列包含ACACTA。
21.根据权利要求12-19所述的方法，其中miR-142靶序列包含ACACTA和SEQ ID NO:5的1-17个额外连续核苷酸。
22.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中miR-142靶序列包含的核苷酸序列与SEQ ID NO:5(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA)的核苷酸序列至少50％相同。
23.根据权利要求22所述的方法，其中miR-142靶序列包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
24.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中miR-142靶序列包含ACTTTA。
25.根据权利要求12-19所述的方法，其中miR-142靶序列包含ACTTTA和SEQ ID NO:7的1-15个额外连续核苷酸。
26.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中miR-142靶序列包含的核苷酸序列与SEQ ID NO:7(AGTAGTGCTTTCTACTTTATG)的核苷酸序列至少50％相同。
27.根据权利要求26所述的方法，其中miR-142靶序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
28.根据权利要求12-27中任一项所述的方法，其中miR-142靶序列重复2-10次。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中载体是病毒载体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、人免疫缺陷病毒(HIV)载体、鼠白血病病毒(MLV)载体、禽肉瘤/白血病病毒(ASLV)载体、脾坏死病毒(SNV)载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)载体、痘苗病毒载体或单纯疱疹病毒载体。
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