JP7291423B2 - ＡＩＭＰ２－ＤＸ２およびｍｉＲ－１４２の標的核酸を含むベクター、ならびにその使用 - Google Patents

Description

電子提出された配列表への言及
本出願とともに提出された、ＡＳＣＩＩテキストファイルにおいて電子提出された配列表（ファイル名： ２４９３－０００３ＷＯ０１－ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ： ６ＫＢ；および作成日： ２０２０年３月１６日）の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。

発明の分野
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２およびｍｉＲ－１４２の標的配列を含むベクター、ならびにその使用が、本明細書で開示される。

発明の背景
哺乳動物の脳は、神経幹細胞の分裂、分化、生存および死滅を含む一連のプロセス、ならびにシナプスの形成などを受けた後、全身の神経ネットワークの確立を通じて複雑な機能を実施し得る。動物の脳におけるニューロンは、それらが成熟した状態の間ですら、神経の成長において必要な広い範囲の物質を連続して生成し、それによって、軸索および樹状突起の成長を誘導する。さらに、それらは連続して分化を受けるといわれている。なぜなら新たな学習および記憶が実施されるときには常に、神経ネットワークの絶え間ないシナプス再編およびシナプス接続が存在するからである。ニューロンは、これらが、ストレスに起因する、細胞分化およびシナプス形成およびアポトーシスのプロセスにおいて、標的由来生存因子（例えば、神経成長因子）を受容できない場合に、アポトーシスを受け、細胞傷害性薬剤は、脳変性障害の主要な原因になる。動物の末梢神経系が損傷される場合、中枢神経系とは異なり、軸索は、長期間にわたって再生される。損傷した神経の背後にある軸索は、ワーラー変性として公知のプロセスによって変性され、神経の細胞本体は、軸索の再成長を再び開始すると同時に、シュワン細胞が、再生プロセス（分裂後の生存および消失を経て標的神経の決定、その後、分化などを再び受けることを含む）を受けた後に再生される。

世界中で、毎年、神経変性疾患の出現が連続して増大する傾向があるとともに、高齢者集団において急激に増大する。最終的な防止および処置方法は、未だ発見されていないことから、このような疾患を処置するにあたって、優れた有効性を有する薬物もなお存在しない。加えて、これらの障害に使用される既存の薬物および治療は、長期投与から生じる副作用および毒性を頻繁に示す。さらに、それらは、症状の程度を一時的に低減するか、または疾患の完全な処置よりむしろ症状の進行を遅らせるという効果を有するに過ぎないので、副作用および毒性を低減しながら、決定的な処置努力の結果を伴う物質を発掘し開発することは急務である。

ヒト被験体に対する遺伝子治療に関して、およそ６００事例の臨床試験が実施されており、１９９０年に初めて臨床試験を開始して以来、２００２年まで進行中であった。２００３年にヒトゲノム配列分析の完了を拠り所として、新たな遺伝子療法の開発は、多様な遺伝子範囲の発掘を経て、将来的に加速すると思われる。しかし、今までに承認されてきた遺伝子療法のうちの７５％は、単一遺伝子疾患（例えば、がんまたは嚢胞性線維症など）に標的化され、神経障害または再生のための遺伝子療法薬物は活発に開発されていない（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ ｏｆ ＮＩＨ， ＵＳＡ （２００２）； Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． （２００２） ｗｗｗ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏ．ｕｋ／ｇｅｎｍｅｄ）。にもかかわらず、パーキンソン病の感覚ニューロンの処置および再生に関する神経成長因子（例えば、ＮＴ－３およびグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を使用することによる遺伝子療法の開発は、既に試みられている（ＧＤＮＦファミリーリガンドは、成熟感覚ニューロンにおける軸索成長の間に多数の事象を活性化する（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５：４４５３－４４５９（２００４））。神経系の障害に関連して大脳の機能に関する神経科学研究全体の進歩が低迷しているので、神経系の種々の慢性障害の処置薬物の開発はまた、困難に直面している。

多くの方法でアポトーシスと関連する腫瘍サプレッサーである、ＡＩＭＰ２の選択的スプライシング改変体としてのＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＡＩＭＰ２の機能を妨げることによってアポトーシスを抑制することが公知である。これは、ＴＲＡＦ２のＡＩＭＰ２／ｐ３８媒介性ユビキチン化によるＴＮＦ－ａ誘導性アポトーシス、ならびにＴＲＡＦ２のユビキチン化の抑制および炎症マーカーであるＣｏｘ－２の出現の抑制を通じて、ＴＮＦ－ａ誘導性アポトーシスを抑制することによって、腫瘍の生成を促進するＡＩＭＰ２の競合的インヒビターとして作用するＡＩＭＰ２／ｐ３８のスプライス改変体であるＡＩＭＰ２－ＤＸ２を制御することによって達成される。加えて、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２が、既存の肺がん誘導因子として確認されたことが報告されており、既存の研究では、がん細胞において広範囲にわたって出現したＡＩＭＰ２－ＤＸ２（これは、ＡＩＭＰ２の改変体である）が、ＡＩＭＰ２のがん抑制機能に干渉することによって癌を誘導することが確認された。さらに、正常細胞におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２の出現は、細胞のがん化を進行させるが、他方で、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２の出現を抑制すると、がんの増殖は抑制され、それによって、処置効果を示すことが発見された。
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２が、神経疾患を処置するにあたって有用であり得ることもまた、決定されている（ＫＲ１０－２０１５－０１４０７２３（２０１７）およびＵＳ２０１９／０２９８８５８（２０１９年１０月２３日公開））。

Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｐａｐｅｒ ｏｆ ＮＩＨ， ＵＳＡ （２００２） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． （２００２） ｗｗｗ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏ．ｕｋ／ｇｅｎｍｅｄ

発明の要旨
ｍｉＲ－１４２を標的化する配列（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的核酸）を含む組換えベクターは、ＡＩＭＰ２スプライス改変体の発現を、神経組織および脳組織において選択的に制御し得る。

エキソン２欠失ＡＩＭＰ２改変体（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子およびｍｉＲ－１４２標的核酸を含む組換えベクターが、本明細書で開示される。

上記ベクターは、上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。上記プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターまたはオプシンプロモーターであり得る。

上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側にあり得る。上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して５’側にあり得る。

上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％ 同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。

上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％ 同一のヌクレオチド配列を有し得る。上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有し得る。

上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５の１～１７個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。

上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ； ｍｉＲ－１４２－３ｐ）と少なくとも５０％ 同一のヌクレオチド配列を含み得る。上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。

上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７の１～１５個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。

上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ； ｍｉＲ－１４２－５ｐ）と少なくとも５０％ 同一のヌクレオチド配列を含み得る。上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含み得る。

上記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、２～１０回反復され得る。

上記ベクターは、ウイルスベクターであり得る。上記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血病）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）、または単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。上記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。

必要性のある被験体において神経疾患を処置する方法がまた本明細書で開示され、上記方法は、本明細書で開示されるベクターのうちのいずれかを投与する工程を包含する。

上記神経疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、網膜変性、軽度認知障害、多発梗塞性認知症、前頭側頭葉型認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、神経変性疾患、代謝性脳障害、鬱病、てんかん、多発性硬化症、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、または脳卒中であり得る。上記神経疾患は、ＡＬＳであり得る。

上記処置は、運動活動を改善し得るか、または上記被験体の寿命を延ばす。

上記ベクターは、脳または脊髄に投与され得る。上記ベクターは、定位固定注射によって脳に投与され得る。

本発明の目的は、ｍｉＲ－１４２－３ｐの標的配列を含む組換えベクターを提供することである。

加えて、本発明は、ｍｉＲ－１４２－３ｐの標的配列を含む組換えベクターを含む遺伝子キャリアを提供し得る。

加えて、本発明は、組換えベクターを実体に投入する段階を含む、ニューロンにおいて異種遺伝子を送達および発現する方法を提供し得る。

加えて、本発明は、１）プロモーター；２）作動を可能にするプロモーターと連結された標的タンパク質をコードする塩基配列；および３）上記塩基配列の ３’ＵＴＲに挿入された、ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する塩基配列を含む発現カセット、を提供し得る。

加えて、本発明は、エキソン２の喪失を伴うＡＩＭＰ－２スプライス改変体をコードする塩基配列、および上記塩基配列の３’ＵＴＲに連結された、ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する塩基配列を含む、神経変性疾患の防止的または治療的調製物を提供し得る。

前述の目的を達成するために、本発明は、ｍｉＲ－１４２－３ｐの標的配列を含む組換えベクターを提供する。

加えて、本発明は、ｍｉＲ－１４２－３ｐの標的配列を含む組換えベクターを含む遺伝子キャリアを提供する。

加えて、本発明は、組換えベクターを実体に投入する段階を含む、ニューロンにおいて異種遺伝子を送達および発現させる方法を提供する。

加えて、本発明は、１）プロモーター；２）作動を可能にするプロモーターと連結された標的タンパク質をコードする塩基配列；および３）上記塩基配列の３’ＵＴＲへと挿入された、ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する塩基配列を含む発現カセット、を提供する。

加えて、本発明は、エキソン２の喪失を伴うＡＩＭＰ－２スプライス改変体をコードする塩基配列および上記塩基配列の３’ＵＴＲへと連結された、ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する塩基配列を含む、神経変性疾患の防止的または治療的調製物を提供する。

本発明の組換えベクターは、ｍｉＲ－１４２－３ｐを、ＡＩＭＰ２の末端の標的配列へと挿入し、ＣＤ４５由来細胞、特に、リンパ系および白血球におけるその発現の抑制を制御することによって、腫瘍におけるＡＩＭＰ２スプライス改変体の過剰発現の副作用を制御するという効果を有する。従って、本発明の組換えベクターは、ＡＩＭＰ２スプライス改変体が、ニューロンにおいてのみ特異的に発現され得、かつ身体の種々の組織の中でも、脳組織においてのみ選択的に発現され得ることから、関連産業において有益に使用され得る。

図１は、本発明の組換えベクターを図示する。

図２は、インビトロ環境下での本発明の組換えベクターの神経細胞特異的発現効果を示す。

図３は、インビボ環境下での本発明の組換えベクターの神経細胞特異的発現効果を示す。

図４は、ｍｉＲ１４２－３ｐＴの４回反復（下線を付す）を伴うｍｉＲ１４２－３ｐＴ（標的）配列を示す。

図５Ａは、１×、２×、および３× 反復を伴うｍｉＲ１４２－３ｐ、および変異体の模式図を示す。図５Ｂは、ｍｉＲ－１４２－３ｐＴの１×、２×、および３× 反復を伴うＤＸ２発現に際するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害を示す。

図６は、コア結合配列が、ＤＸ２阻害において重要であることを示す。Ｔｓｅｑ ×３反復を有するベクター（これは、ＤＸ２の有意な阻害を示した（図５Ｂ））、およびＤＸ２構築物を、コントロールとして使用した。１００ｐｍｏｌのｍｉＲ－１４２－３ｐ処理は、Ｔｓｅｑ ×３ベクターを有意に阻害したが、ＤＸ２および変異配列は、阻害しなかった。

図７は、ｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐの髄腔内投与後に脊髄から抽出された全ＲＮＡを示す。ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。

図８は、インビトロ環境下での本発明の組み換えベクターの神経細胞特異的発現効果を示す。

発明の詳細な説明
ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、アポトーシスと関連する、腫瘍抑制因子ＡＩＭＰ２の選択的スプライシング改変体である。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、ＡＩＭＰ２の機能を抑制することによって、腫瘍のアポトーシスを阻害することが公知である。

ＫＲ １０－１０６７８１６（２０１１）は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２のインヒビターが炎症性疾患を処置し得ることを記載している。ＫＲ １０－１０６７８１６（２０１１）はまた、ＡＩＭＰ２／ｐ３８がＴＲＡＦ２のユビキチン化を促進して、ＴＮＦ－α誘導性アポトーシスを調節すること、およびＡＩＭＰ２－ＤＸ２（ＡＩＭＰ２／ｐ３８のスプライス改変体）が、ＴＲＡＦ２のユビキチン化を阻害し、従って、ＴＮＦ－α誘導性アポトーシスを阻害するようにＡＩＭＰ２の競合的インヒビターとして働き、それによって、腫瘍生成を促進し、Ｃｏｘ－２（炎症マーカー）の発現を阻害することを開示する。

加えて、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２は、肺がん誘導因子として以前に同定されている。研究において、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２（ＡＩＭＰ２の改変体である）が、がん細胞に共通しており、ＡＩＭＰ２のがん阻害機能に干渉し、従って、がんを引き起こすことが見出された。正常細胞におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２の発現が、細胞のがん化をもたらすのに対して、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２の発生の阻害ががん細胞の増殖を阻害し、がん処置効果を生じることもまた、見出された。また、研究によって、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２標的の阻害が、タキソールおよびシスプラチンのような従来の抗がん薬に応答しない卵巣がんの処置をもたらし得ることが、動物モデルを通じて示された。しかし、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２自体は、正常細胞を形質転換する発がん能力を有しない。

ＡＩＭＰ２－ＤＸ２が神経疾患を処置し得ることも、決定されている（ＵＳ２０１９／０２９８８５８ Ａ１）。

エキソン２欠失ＡＩＭＰ２改変体（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子およびｍｉＲ－１４２標的核酸を含む組換えベクターが、本明細書で開示される。本明細書で記載されるベクターは、ニューロン細胞においてＤＸ２を特異的に発現し得るが、造血細胞（例えば、白血球およびリンパ系球）においてはそうでない。従って、本明細書で記載されるベクターは、神経疾患を処置するために、ニューロン細胞を特異的に標的化するにあたって有用であり得る。

ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチド（配列番号２）は、ＡＩＭＰ２（配列番号３）のスプライス改変体であり、ここでＡＩＭＰ２の第２のエキソン（配列番号４）が省かれている。具体的には、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有し、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％ 同一、少なくとも９３％ 同一、少なくとも９５％ 同一、少なくとも９６％ 同一、少なくとも９７％ 同一、少なくとも９８％ 同一、少なくとも９９％同一であるか、またはその中の任意の範囲の％ 同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し得る。

ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％ 同一、少なくとも９３％ 同一、少なくとも９５％ 同一、少なくとも９６％ 同一、少なくとも９７％ 同一、少なくとも９８％ 同一、少なくとも９９％同一であるか、またはその中の任意の範囲の％ 同一であるヌクレオチド配列を有し得る。ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有し得る。

ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５の１～１７個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５に示されるとおりのＡＣＡＣＴＡの５’側または３’側に連続する、合計１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、または１７個のさらなるヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。

ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ； ｍｉＲ－１４２－３ｐ）と少なくとも５０％ 同一、少なくとも６０％ 同一、少なくとも７０％ 同一、少なくとも８０％ 同一、少なくとも９０％ 同一、または少なくとも９５％ 同一のヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。

ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡを含むヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７の１～１５個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７に示されるとおりのＡＣＴＴＴＡの５’側または３’側に連続する合計１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のさらなるヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み得る。

ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ； ｍｉＲ－１４２－５ｐ）と少なくとも５０％ 同一、少なくとも６０％ 同一、少なくとも７０％ 同一、少なくとも８０％ 同一、少なくとも９０％ 同一、または少なくとも９５％ 同一のヌクレオチド配列を含み得る。ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含み得る。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御するように機能する非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子内の相補的配列と塩基対合することを介して機能する。ｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に結合し得、それらの転写を負に制御し得るか、またはｍＲＮＡ分解を引き起こし得る。現在、２０００超のヒトｍｉＲＮＡが同定されており、ｍｉＲｂａｓｅデータベースが公に利用可能である。多くのｍｉＲＮＡは、組織特異的様式において発現され、組織特異的機能および分化を維持するにあたって重要な役割を有する。

ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐをＡＩＭＰ２－ＤＸ２の末端の標的配列に挿入し、ｃｄ４５由来細胞、特に、リンパ系および白血球においてＡＩＭＰ２－ＤＸ２発現の抑制を制御することによって、腫瘍におけるＡＩＭＰ２－ＤＸ２改変体の過剰発現の副作用を制御し得る組換えベクターが、本明細書で開示される。従って、上記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２改変体は、ニューロン細胞においてのみ発現され得るか、または脳組織においては選択的に発現され得るが、他のタイプの細胞または組織においてはそうでない。

本発明は、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐの標的配列を含む組換えベクターを提供する。エキソン２欠失ＡＩＭＰ２改変体（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子ならびにｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ 標的核酸を含む組換えベクターが、本明細書で開示される。

用語「組み換えベクター」とは、適切な宿主細胞において標的タンパク質またはＲＮＡとして発現され得るベクター、およびその挿入された遺伝子が適切に発現されることを可能にする本質的に作動可能に連結された制御因子を含む遺伝子構築物に言及する。

用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列と、一般的な機能を実施する標的化されたタンパク質およびＲＮＡをコードする核酸配列との間の機能的連結に言及する。例えば、それは、上記核酸配列の作動のために連結されている、プロモーターおよびタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動可能な連結は、遺伝子組み換え技術（これは、対応する技術分野において周知である）を使用することによって製造され得、領域特異的ＤＮＡ切断および連結のために対応する技術分野において概して公知の酵素を使用する。

上記組換えベクターは、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されるプロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、またはオプシンプロモーターである。

用語「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、約２０個、２１個、２２個、２３個、または２４個のヌクレオチドから構成される非コードＲＮＡであり、遺伝子発現を制御するという役割を果たす。上記ｍｉＲＮＡは、遺伝子の転写後ステージとして作用し、哺乳動物の場合には、遺伝子発現のうちのおよそ６０％が、ｍｉＲＮＡによって制御されることは公知である。ｍｉＲＮＡは、生きている身体の内部でのプロセスの多様な範囲において重要な役割を果たし、がん、心臓障害、および神経関連障害との相関を有することが開示されている。ｍｉＲＮＡ（これは、１本鎖ＲＮＡである）、このｍｉＲＮＡの標的配列は、２本鎖の成熟前ＲＮＡの中での標的遺伝子の発現が抑制され得る限りにおいて、使用され得る。例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１４２－５ｐは、ｍｉＲ－１４２に存在し、その標的核酸のうちのいずれかは、本発明において使用され得る。「ｍｉＲ－１４２」とは、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよびｍｉＲ－１４２－５ｐの両方に言及し、望ましくは、ｍｉＲ－１４２－３ｐであり得る。

ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して５’側または３’側にあり得る。

「ｍｉＲ－１４２－３ｐ」は、その遺伝子の転座がアグレッシブＢ細胞白血病において起こり、造血組織（骨髄、脾臓および胸腺など）において発現することが公知である領域に存在し得る。加えて、ｍｉＲ－１４２－３ｐは、胎仔マウスの肝臓（マウスの造血組織）における発現が確認されて、造血系の分化に関与することが公知である。

いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ標的核酸は、少なくとも２～１０回、少なくとも２～８回、少なくとも２～６回、少なくとも４回、またはその回数の任意の範囲もしくは回数、反復される。

本発明の実施の一例として、上記ｍｉＲ－１４２－３ｐは、番号３で示される塩基配列を含み得る。加えて、ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する配列は、ｍｉＲ－１４２－３ｐと相補的に結合する配列番号４を有する塩基配列を含み得る。上記相補的配列を含む本発明のｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列は、番号５で示される塩基配列であるが、これに限定されない。

上記組換えベクターは、異種プロモーター、および上記プロモーターにおいて作動可能に連結される異種遺伝子をさらに含み得る。

本発明において「異種遺伝子（」とは、生物学的に適切な活性化を伴うタンパク質またはポリペプチド、および標的化された生成物（免疫原または抗原性タンパク質もしくはポリペプチド）の暗号化された配列、または処置活性化タンパク質もしくはポリペプチドを含み得る。

ポリペプチドは、宿主細胞において内因性タンパク質の発現の欠乏または非存在を補足し得る。遺伝子配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせを含む多様な範囲の供給物から誘導され得る。上記遺伝子配列は、天然のイントロンを含むかまたは含まないゲノムＤＮＡを含み得る。加えて、ゲノムＤＮＡは、プロモーター配列またはポリアデニル化配列とともに獲得され得る。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、種々の方法において獲得され得る。ゲノムＤＮＡは、対応する分野において公に知られている方法を通じて、適切な細胞から抽出および精製され得る。あるいは、ｍＲＮＡは、上記細胞から分離されることによって、逆転写または他の方法によってｃＤＮＡを生成するために使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列に相補的である配列（例えば、アンチセンスＲＮＡ配列）を含み得、上記アンチセンスＲＮＡは、個体の細胞において相補的なポリヌクレオチドの発現を抑制するために、上記個体に投与され得る。

本発明の目的下では、上記異種遺伝子は、本発明のエキソン２の喪失を伴うＡＩＭＰ－２スプライス改変体であり、ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列は、上記異種遺伝子の３’ ＵＴＲに連結され得る。ＡＩＭＰ２タンパク質の配列（３１２ａａバージョン： ＡＡＣ５０３９１．１またはＧＩ： １２１５６６９； ３２０ａａバージョン： ＡＡＨ１３６３０．１、ＧＩ： １５４８９０２３、ＢＣ０ １３６３０．１）は、文献中に記載される（３１２ａａバージョン： Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ， Ｎ．Ｃ．， Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｋ．Ｗ． ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９ （２）， ３２９－３３４ （１９９５）／ ３２０ ａａバージョン： Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １５，０００ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９９ （２６）， １６８９９－１６９０３ （２００２））。

本発明の用語「ＡＩＭＰ２スプライス改変体」とは、エキソン１～４の中でエキソン2の部分的または完全な喪失に起因して生成される改変体をいう。よって、上記改変体は、ＡＩＭＰ２タンパク質およびヘテロダイマーを形成することによるＡＩＭＰ２の正常な機能の干渉を表す。加えて、上記ＡＩＭＰ２スプライス改変体が細胞または組織において過剰発現される場合、がんが誘導され得る。従って、がんの誘導を抑制するために、組織特異的発現を誘導することが必要である。

本発明の組換えベクターは、配列番号１および５を含み得る。

用語、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と「％の配列相同性」、「％ 同一性）」または「％ 同一」とは、例えば、その２つの最適に配置された配列を、その比較ドメインと比較することによって確認され得、その比較ドメインにおける塩基配列のうちのいくつかは、その２つの配列の最適な配置に関する参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。

本発明のタンパク質は、その天然タイプのアミノ酸配列を有するもののみならず、本発明の範囲において改変アミノ酸配列を有するものをも含む。

本発明のタンパク質の改変体は、天然のアミノ酸配列および１より多くのアミノ酸残身の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはこれらの組み合わせに起因して、異なる配列を有するタンパク質を表す。全体として分子の活性化を改変しないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸の変化は、対応する分野において知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７９）。

タンパク質またはその改変体は、自然に抽出もしくは合成を通じて（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９－２１５６， １９６３）、またはＤＮＡ配列に基づいて遺伝子組み換え法を通じて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ， 第２版， １９８９）製造され得る。

アミノ酸変異は、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性（例えば、親水性、疎水性、電荷およびサイズなど）に基づいて起こる。アミノ酸側鎖の置換基のサイズ、形状およびタイプの分析によれば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが、正電荷を有する残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンが類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが類似の形状を有することは、認められ得る。従って、このような考慮事項に基づけば、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、生物学的に機能的に等価であるとみなされ得る。

１またはこれより多くの変異を導入するにあたって、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。疎水性指数は、疎水性および電荷に従って各アミノ酸に割り当てられる：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。

タンパク質の相互作用的な生物学的機能を割り当てるにあたって、疎水性アミノ酸指数は、非常に重要である。置換が類似の疎水性指数を有するアミノ酸で行われる場合にのみ、類似の生物学的活性化を有することが可能であるということは、周知の事実である。疎水性指数を参照することによって変異を導入するという事象においては、望ましくは±２以内の、より望ましくは±１以内の、およびさらにより望ましくは±０．５以内の疎水性指数の差異を有するアミノ酸の間で置換を実施のこと。

一方で、類似の親水性値を有するアミノ酸の間での置換が、等価な生物学的活性化を有するタンパク質を誘導することはまた、周知である。米国特許第４，５５４，１０１号に示されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基の各々に割り当てられる：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。

親水性値を参照することによって１またはこれより多くの変異を導入するという事象においては、望ましくは±２以内、より望ましくは±１以内、およびさらにより望ましくは±０．５以内の親水性値の差異を有するアミノ酸の間で置換を実施のこと。

全体として分子の活性化を改変しないタンパク質におけるアミノ酸の変化は、対応する分野において知られている（Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７９）。最も一般的に起こる変化は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙを非組むアミノ酸残基間のものである。本発明のベクターシステムは、対応する産業において知られる多様な方法を通じて構築され得る。その具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．（２００１）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓによって記載されており、この論文は、本明細書のこの陳述において参考文献として特定される。

本発明のベクターは、クローニングのためまたは発現のための代表的なベクターとして構築され得る。加えて、本発明のベクターは、宿主細胞として原核生物細胞または真核生物細胞とともに構築され得る。本発明のベクターが組み換えベクターであり、かつ原核生物細胞が宿主として使用される場合、転写の実施のための強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、１ｐｐプロモーター、ｐＬ Ｘプロモーター、ｐＲＸプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、暗号解読および転写の開始のためのリボソーム結合部位／暗号解読終結配列を含めることは、一般的である。Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５ａなど）を宿主細胞として使用する場合、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ， Ｃ．（１９８４）， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５８： １０１８－１０２４）およびファージＸの左側プロモーター（ｐＬＸプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， Ｉ． ａｎｄ Ｈａｇｅｎ， Ｄ．（１９８０）， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １４： ３９９－４４５）は、制御部位として使用され得る。

一方で、本発明において使用され得るベクターは、ウイルスベクター、直線状ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡから構成される群から選択される１より多くの種であり得る。

本発明において「ウイルスベクター」とは、所望の細胞、組織および／または器官に遺伝子または遺伝物質を送達し得るウイルスベクターをいう。

ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血病）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）および単純ヘルペスウイルスから構成される群から選択される１より多くの種を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。

レトロウイルスは、宿主細胞のゲノムにとって組み込み機能を有しかつヒトの身体に有害であるが、組み込み時の正常細胞の機能の抑制、ならびに多様な範囲の細胞に感染する能力、増殖が容易である、およそ１～７ｋｂの外部遺伝子を収容する、および複製欠損ウイルスを生成することを含む特徴を有する。しかし、レトロウイルスは、有糸分裂後の細胞に感染させる、インビボ条件下での遺伝子送達、およびインビトロ条件下で体細胞を増殖させる必要があるということにおける困難を含む欠点を有する。加えて、レトロウイルスは、がん原遺伝子へと組み込まれ得る場合に突然変異するというリスクを有し、それによって、細胞壊死の可能性を示す。

一方で、アデノウイルスは、中程度のレベルのサイズにある細胞核においても複製する、臨床的に非毒性である、外部遺伝子が挿入された場合にすら安定である、遺伝子の再編成も喪失もない、真核生物細胞の形質転換、および宿主細胞染色体に組み込まれた場合にすら高レベルで安定して発現を受ける、を含むクローニングベクターとして種々の利点を有する。アデノウイルスの良好な宿主細胞は、ヒトにおいて造血性、リンパ性および骨髄腫の原因である細胞である。しかし、アデノウイルスが直線状のＤＮＡであることから増殖は困難であり、ウイルス感染率が低いとともに、感染したウイルスを回収することは容易でない。加えて、送達された遺伝子の発現は、１～２週間の間に最も広範囲にわたり、その細胞のうちのいくらかにおいてのみ、３～４週間にわたって発現が持続する。別の論点は、高い免疫－抗原性を有することである。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、近年好まれてきた。なぜならそれは、前述の問題を補うことができ、遺伝子療法因子として多くの利点を有するからである。アデノ随伴ウイルスはまた、アデノ衛星ウイルスともいわれる。アデノ随伴ウイルス粒子の直径は２０ｎｍであり、ヒトの身体にはほぼ害がないことは公知である。よって、欧州では、遺伝子療法因子としてのその販売が認められた。

ＡＡＶは、複製に補助的ウイルスを必要とする１本鎖を有するプロウイルスであり、ＡＡＶゲノムは、４，６８０ｂｐを有し、感染細胞の第１９染色体の特異的領域へと挿入され得る。導入遺伝子は、各１４５ｂｐを有する２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列部分およびシグナル配列部分によって接続されるプラスミドＤＮＡ(ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ)に挿入される。トランスフェクションは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ部分を発現する他のプラスミドＤＮＡとともに実施され、アデノウイルスは、補助的ウイルスとして添加される。ＡＡＶは、遺伝子を送達する宿主細胞の範囲が広い、反復投与時に免疫学的副作用がほとんどない、および遺伝子発現の期間が長いという利点を有する。さらに、ＡＡＶゲノムが宿主細胞の染色体に組み込まれたとしても安全であり、宿主の遺伝子発現を改変も再編成もしない。

アデノ随伴ウイルスは、合計で４つの血清型を有することが公知である。標的遺伝子の送達において使用され得る多くのアデノ随伴ウイルスの血清型の中で、最も広く研究されているベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型２であり、嚢胞性線維症、血友病およびカナバン病の臨床用の遺伝子送達において現在使用されている。加えて、近年、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の可能性は、がん遺伝子療法の分野においてますます増している［４］。本発明において使用したのはまた、アデノ随伴ウイルス血清型２であった。適切なウイルスベクターを選択し、適用することは可能であるが、これに限定されない。

加えて、本発明のベクターが組み換えベクターであり、宿主として真核生物細胞を使用する場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例：ポストアデノウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶ ＴＫプロモーター）が使用され得る。具体的には、それは、レトロウイルスのＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターおよびオプシンプロモーターから構成される群から選択されるプロモーターから構成される群より選択される１より多くの種を含み得るが、これらに限定されない。さらに、それは、転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。

本発明のベクターは、タンパク質の精製をより容易にするために必要とされる場合に、他の配列と融合され得る。その融合される配列（例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ， ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ， ＵＳＡ）および６×Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジン；Ｑｕｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）など）が、例えば、使用され得るが、これらに限定されない。加えて、本発明の組み換えベクターは、選択マーカーとして対応する産業において一般に使用される抗生物質（例としては、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンが挙げられる）に対する耐性遺伝子を含み得る。

加えて、本発明は、ｍｉＲ－１４２の標的配列（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐおよび／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）を含む組換えベクターを含む遺伝子キャリアを提供する。

本発明において用語「遺伝子移入」とは、概して、転写および発現のために、細胞に遺伝物質を送達することを含む。その方法は、タンパク質発現および処置目的に理想的である。多様な範囲の送達法（例えば、ＤＮＡトランスフェクションおよびウイルス形質導入）が知られる。それは、送達される遺伝子の高い送達効率および高レベルの発現、ならびに必要であれば、自然に優しいことまたは疑似タイプ化を通じて、特異的レセプターおよび／または細胞タイプを標的化する可能性に起因するウイルス媒介性遺伝子移入を表す。

遺伝子キャリアは、本発明の組換えベクターへと形質転換されている、形質転換された実体であり得、形質転換は、核酸を有機的な実体、細胞、組織、または器官へと導入する全ての方法を包含し、対応する分野において知られるように、宿主細胞に従って、適切な標準的技術を選択および実施することが可能である。このような方法としては、エレクトロポレーション、原形質の融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、炭化ケイ素線維の使用との混合、アグロバクテリウム媒介性形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストランおよびリポフェクタミンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

遺伝子キャリアは、ニューロンにおける異種遺伝子の発現の目的のためである。よって、上記キャリアは、ＣＤ４５由来細胞において異種遺伝子の発現を抑制し、脳組織において異種遺伝子の発現を増大し得る。ＣＤ４５のうちの大部分には、造血細胞に位置する膜貫通プロテイントリシンホスファターゼがある。細胞は、細胞表面上に位置する上記分子に従って定義され得、ＣＤ４５は、全ての白血球群およびＢリンパ球の細胞マーカーである。本発明の遺伝子キャリアは、ＣＤ４５由来細胞、特に、リンパ球および白血球範囲の細胞において発現されなくてもよい。

遺伝子キャリアはさらに、薬理学的に使用されることが許容されるキャリア、賦形剤または希釈剤を含み得る。

加えて、本発明は、組換えベクターを対応する実体に導入する段階を含む、ニューロンにおいて異種遺伝子を送達および発現する方法を提供する。

上記方法は、大脳組織において異種遺伝子の発現を増大させ得、他の組織において異種遺伝子発現を制御し得る。

加えて、本発明は、１）プロモーター；２）作動を可能にするプロモーターと連結された、標的タンパク質をコードする塩基配列；および３）上記塩基配列の３’ＵＴＲに挿入された、ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する塩基配列を含む発現カセット、を提供する。本発明は、１）プロモーター；２）作動を可能にするプロモーターと連結された、標的タンパク質をコードする塩基配列；および３）上記塩基配列の３’ＵＴＲに挿入された、ｍｉＲ－１４２－５ｐを標的化する塩基配列を含む発現カセット、を提供する。

本発明において用語「発現カセット」とは、標的タンパク質をコードする遺伝子、ならびにプロモーターおよびシグナルペプチドをコードする塩基配列を含むことから、シグナルペプチドの下流で作動可能に連結された標的タンパク質の生成および分泌のために発現を実施し得る単位カセットに言及し得る。本発明の分泌発現カセットは、分泌システムと混合して使用され得る。標的タンパク質の効率的生成を補助し得る多様な範囲の因子が、このような発現カセットの中および外に含まれ得る。

加えて、本発明は、エキソン２の喪失を伴うＡＩＭＰ－２スプライス改変体をコードする塩基配列および上記塩基配列の３’ＵＴＲに連結されたｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する塩基配列を含む、神経変性疾患のための防止的または治療的調製物を提供する。

よって、必要性のある被験体において神経疾患を処置する方法がまた、本明細書で開示され、上記方法は、本明細書で開示されるベクターのうちのいずれかを投与する工程を包含する。上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜変性、軽度認知障害、多発梗塞性認知症、前頭側頭葉型認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、神経変性疾患、代謝性脳障害、鬱病、てんかん、多発性硬化症、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症および脳卒中から構成される群から選択される１より多くの疾患であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記神経疾患は、ＡＬＳである。上記処置は、記憶、ジスキネジア、運動活動を改善し得る、および／または神経疾患（例えば、ＡＬＳ、アルツハイマー病、またはパーキンソン病）を有する被験体の寿命を延ばし得る。いくつかの実施形態において、上記処置は、運動活動を改善し得る、および／または神経疾患（例えば、ＡＬＳ）を有する被験体の寿命を延ばし得る。

本明細書で開示されるベクターは、アポトーシス阻害、ジスキネジア改善、および／または酸化的ストレス阻害をもたらし得るが、これらに限定されず、従って、神経疾患を防止または処置し得る。

本発明において用語「処置」とは、脳変性障害を有する実体に、本発明に従う薬理学的因子を適用する結果として、神経変性疾患の完全な処置のみならず、神経変性疾患の全体的な症状における部分的な処置、改善および低減をも含む。

本発明において用語「防止」とは、脳変性障害を有する実体に、本発明に従う薬理学的因子を適用することによって、認知障害、行動障害および脳神経の破壊のような症状または現象を抑制または遮断することによって、神経変性疾患の全体的な症状の発生を予め防止することを表す。

活性成分以外のアジュバントは、本発明に従う薬理学的因子に加えて含まれ得る。任意のアジュバントが、対応する技術分野において公知である限りにおいて、制限なく使用され得るが、例えば、フロイントの完全アジュバントおよび不完全アジュバントをさらに含めることによって、免疫性を増大させることは可能である。

本発明に従う薬理学的因子は、活性成分と薬理学的に許容されるキャリアとを混合させた形態において製造され得る。ここで、薬理学的に許容されるキャリアは、薬理学の分野において一般に使用されるキャリア、賦形剤および希釈剤を含む。本発明に従う薬理学的因子に使用され得る薬理学的に許容されるキャリアとしては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に従う薬理学的因子は、散剤、粒剤、丸剤、カプセル剤、懸濁液剤、エマルジョン、シロップ剤およびエアロゾールなどのような経口投与タイプ、ならびに外用、坐剤薬または消毒注射液剤などを含む種々の形式において、それらそれぞれの一般的製造法に従って製造されることによって、使用され得る。

調製物へと製造される場合、一般に使用される希釈剤または賦形剤（例えば、充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤および界面活性剤など）は、製造時に使用され得る。経口投与のための固体調製物としては、丸剤、錠剤、散剤、粒剤およびカプセル剤の調製物が挙げられ、このような固体調製物は、１種より多くの賦形剤（例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトースおよびゼラチン）と活性成分とを混合することによって製造され得る。加えて、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムおよびタルク）はまた、単純な賦形剤に加えて使用され得る。経口投与のための液体製剤としては、懸濁液剤、内服用の液剤、オイルおよびシロップ剤などが挙げられ、一般に称される希釈剤である水および流動パラフィン以外に、種々の賦形剤（例えば、保湿剤、甘味剤、矯味矯臭剤および保存剤など）が含まれる。非経口投与のための調製物としては、滅菌済み水性液剤、非水性溶媒、懸濁剤、オイル、凍結乾燥剤および坐剤が挙げられる。植物性オイル（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびオリーブ油）、および注射用エステル（例えば、エチラート）は、非水性溶媒および懸濁液剤として使用され得る。坐剤用の薬剤としては、ウイテプソール、ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ脂、ラウリン油およびグリセロゼラチンなどが挙げられ得る。

本発明に従う薬理学的因子は、多様化したチャネルを通じて実体に投与され得る。経口投与、ならびに静脈内注射、筋肉注射、皮下注射および腹腔内注射のような投与の全ての形態が、認識され得る。

本発明に従う治療剤の投与の望ましい用量は、調製物の生成法、投与形式、患者の年齢、体重および性別、疾患の症状の程度、食べ物、投与期間、投与経路、排出速度および反応感度などを含む種々の要因に依存して異なる。にも関わらず、それは、対応する製造業者によって適切に選択され得る。

しかし、処置効果に関して、熟練の医師は、標的化処置のために有効用量を決定および処方し得る。例えば、処置薬剤は、静脈内注射、皮下注射および筋肉注射、ならびにマイクロニードルを使用することによる脳室または脊髄への直接注射を含む。多数回の注射および反復投与が可能であり、例えば、その有効用量は、ベクターの場合には、０．０５～１５ｍｇ／ｋｇであり、組換えウイルスの場合には、５×１０^１１～３．３×１０^１４ ウイルス粒子（２．５×１０^１２～１．５×１０^１６ ＩＵ）／ｋｇであり、細胞の場合には、５×１０^２～５×１０^７ 細胞／ｋｇである。望ましくは、上記用量は、１週間に２～３回の投与の割合において、ベクターの場合には、０．１～１０ｍｇ／ｋｇであり、組換えウイルスの場合には、５×１０^１２～３．３×１０^１３ 粒子（２．５×１０^１３～１．５×１０^１５ ＩＵ）／ｋｇであり、細胞の場合には、５×１０^３～５×１０^６ 細胞／ｋｇである。上記用量は、厳密には制限されない。むしろ、それは、患者の状態および神経障害の出現の程度に従って、改変され得る。他の皮下脂肪および筋肉注射、ならびに罹患した領域への直接投与のための有効用量は、１０ｃｍの間隔を空けて１週間に２～３回の割合において、９×１０^１０～３．３×１０^１４ 組換えウイルス粒子である。上記用量は、厳密には制限されない。むしろ、それは、患者の状態および神経障害の出現の程度に従って、改変され得る。より具体的には、本発明に従う薬理学的因子は、１×１０^１０～１×１０^１２ ｖｇ（ウイルスゲノム）／ｍＬの組換えアデノ随伴ウイルスを含み、一般には、１×１０^１２ ｖｇを２日ごとに１回、２週間にわたって注射することが推奨される。上記薬理学的因子は、１日に１回、またはその１日を通じて数回の投与のために用量を分割することによって投与され得る。

薬学的調製物は、多様な範囲の経口投与および非経口投与が可能な形式において生成され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるベクターは、脳または脊髄に投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるベクターは、定位固定注射によって脳に投与され得る。

経口管理薬剤としては、丸剤、錠剤、硬質および軟質のカプセル剤、液体、懸濁液剤、オイル、シロップ剤および粒剤などが挙げられる。これらの薬剤は、活性成分に加えて、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン）および滑剤（例：シリカ、タルク、ならびにステアリン酸およびそのマグネシウム塩またはカルシウム塩、ならびに／またはポリエチレングリコール）を含み得る。加えて、丸剤は、結合剤（例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン）を含み得、状況に応じて、崩壊剤（例えば、デンプン、アガー、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩または類似の混合物）、ならびに／または吸収剤、着色剤、矯味矯臭剤、および甘味料を含み得る。上記薬剤は、一般的な混合、造粒またはコーティング法によって製造され得る。

加えて、注射用薬剤は、非経口投与調製物の代表的な形態である。このような注射用薬剤のための溶媒としては、水、リンゲル液、等張性生理食塩水および懸濁物が挙げられる。上記注射用薬剤の滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として使用され得、モノグリセリドおよびジグリセリドを含む任意の非刺激性不揮発性油は、このような目的で使用され得る。加えて、上記注射用薬剤は、脂肪酸（例えば、オレイン酸）を使用し得る。

さらなる実施形態Ａ～Ｘが続く。

Ａ． ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的化配列を含む、組換えベクター。

Ｂ． 実施形態Ａに関して、前記ｍｉＲ－１４２－３ｐは、塩基配列番号３で示される、組換えベクター。

Ｃ． 実施形態Ａに関して、前記ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的化配列は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ配列と相補的に結合する配列である、組換えベクター。

Ｄ． 実施形態Ａに関して、前記ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的化配列は、塩基配列番号４で示される、組換えベクター。

Ｅ． 実施形態Ａに関して、前記ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的化配列は、塩基配列番号５で示される、組換えベクター。

Ｆ． 実施形態Ａに関して、前記標的化されるｍｉＲ－１４２－３ｐは、塩基配列番号４で示され、９０％より高い相同性を有する塩基配列で示される、組換えベクター。

Ｇ． 実施形態Ａに関して、前記標的化されるｍｉＲ－１４２－３ｐは、塩基配列番号５で示され、９０％より高い相同性を有する塩基配列で示される、組換えベクター。

Ｈ． 実施形態Ａに関して、前記組換えベクターは、異種プロモーターおよびプロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子をさらに含む、組換えベクター。

Ｉ． 実施形態Ｈに関して、ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的化配列は、前記異種遺伝子の３’ ＵＴＲに挿入されている、組換えベクター。

Ｊ． 実施形態Ｈに関して、前記異種遺伝子は、エキソン２の欠失を伴うＡＩＭＰ２改変体である、組換えベクター。

Ｋ． 実施形態Ｈに関して、前記異種プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターおよびオプシンプロモーターからなる群より選択されている、組換えベクター。

Ｌ． 実施形態Ａに関して、前記組換えベクターは、ウイルスベクター、直線状のＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡからなる群より選択される１より多くのタイプである、組換えベクター。

Ｍ． 実施形態Ｌに関して、前記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血病）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）および単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１より多くの種に由来するベクターである、組換えベクター。

Ｎ． 実施形態Ａに関して、前記組換えベクターは、配列番号７で示される塩基配列を含む、組換えベクター。

Ｏ． ｍｉＲ－１４２－３ｐの標的配列を含む組換えベクターを含む、遺伝子キャリア。

Ｐ． 実施形態Ｏに関して、前記遺伝子キャリアは、ニューロンにおいて異種遺伝子を発現する、遺伝子キャリア。

Ｑ． 実施形態Ｏに関して、前記遺伝子キャリアは、ＣＤ４５由来細胞において異種遺伝子の発現を抑制する、遺伝子キャリア。

Ｒ． 実施形態Ｏに関して、前記遺伝子キャリアは、脳組織において異種遺伝子の発現を増大させる、遺伝子キャリア。

Ｓ． 異種遺伝子をニューロンに送達し、ニューロンにおいて発現させる方法であって、前記方法は、前記実施形態Ａに記載の組換えベクターを実体に投与する段階を包含する方法。

Ｔ． 実施形態Ｓに関して、異種遺伝子の発現を増大させ、他の組織において異種遺伝子の発現を制御する方法。

Ｕ． 以下：
１）プロモーター；
２）プロモーターに作動可能に連結された標的タンパク質をコードする塩基配列；および
３）前記塩基配列の３’ＵＴＲに挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐ標的塩基配列を含む発現カセット、
を含む実施形態。

Ｖ． 実施形態Ｕに関して、前記標的タンパク質は、エキソン２を欠失させたＡＩＭＰ－２改変体タンパク質である、発現カセット。

Ｗ． エキソン２を欠失させたＡＩＭＰ－２改変体をコードする塩基配列を有する、前記塩基配列の３’ＵＴＲに挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐ標的塩基配列を含む、神経変性疾患のための防止的または処置的調製物。

Ｘ． 実施形態Ｗに関して、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病（筋萎縮性側索硬化症）、網膜変性、軽度認知障害、多発梗塞性認知症、前頭側頭葉型認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、神経変性疾患、代謝性脳障害、鬱病、てんかん、多発性硬化症、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症および脳卒中からなる群より選択されるが、これらに限定されない１またはこれより多くの疾患である。

本発明は、以下の実施例を使用することによってより詳細に説明される。しかし、以下の実施例は、本発明の概念を特定する目的に過ぎず、本発明の適用をそのような例に限定しない。

実施例１． 組換えベクターの生成
ＣＤ４５の大部分は、造血細胞の膜貫通プロテインチロシンホスファターゼであり、これは、細胞表面上の上記分子に従って上記細胞を定義するために使用され得る。ＣＤ４５は、全ての白血球群およびＢリンパ球のマーカーである。本発明者らは、ＣＤ４５由来細胞、特に、リンパ球および白血球範囲の細胞において発現されることなく、ニューロンにおいてのみ特異的に発現される組換えベクターを生成した。その組換えベクターは、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ複合体相互作用多機能タンパク質２（ＡＩＭＰ２）のエキソン２が欠失しているスプライス改変体を含み、ＡＩＭＰ２スプライス改変体の発現を制御し得るｍｉＲＮＡを挿入することによる。

ＡＩＭＰ２のスプライシングを実施したことによって、腫瘍のシグナル伝達と関連するＴＲＡＦ２（ＴＮＦレセプター関連因子２）を分解する機能を有しないＡＩＭＰ２スプライス改変体が、ＴＲＡＦ２との結合においてＡＩＭＰ２と競合することによって、ＡＩＭＰ２の機能を妨げることから、ＡＩＭＰ２スプライス改変体は、ＡＩＭＰ２の腫瘍の抑制作用に干渉することによって、腫瘍において過剰発現されることが確認された。

従って、本発明の組換えベクターを、ニューロンにおいてのみＡＩＭＰ２スプライス改変体の特異的発現を誘導し、腫瘍においてＡＩＭＰ２スプライス改変体の発現を抑制するために、上記のように生成した。

１－１． ＡＩＭＰ２改変体の生成

ＡＩＭＰ２は、アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ（ＡＲＳｓ）の形成に関与するタンパク質のうちの１つであり、腫瘍抑制因子として作用する。ＡＩＭＰ２のエキソン２が欠失している改変体を発現するプラスミドを構築するために、ＡＩＭＰ２スプライス改変体のｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃでクローニングした。ＥｃｏＲ １およびＸｈｏ １リンカーをＨ３２２ ｃＤＮＡに結合したプライマーを使用することによってＡＩＭＰ２スプライス改変体を増幅した後に、ｐｃＤＮＡ３．１－ｍｙｃにおけるサブクローニングを、ＥｃｏＲｌおよびＸｈｏ １を使用することによって実施した。

本発明のＡＩＭＰ２改変体は、配列番号１のヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有する。

１－２． ｍｉＲＮＡのソートおよびその標的配列の選択

上述のように、本発明のＡＩＭＰ２改変体が腫瘍において過剰発現されることを確認した。よって、ＡＩＭＰ２改変体発現を制御し得る、ｍｉＲＮＡおよびその標的を、白血球およびリンパ系関連細胞においてＡＩＭＰ２改変体の発現を抑制するが、同時にニューロン（標的細胞）において安全に発現されるように選択した。

この目的のために、白血球およびリンパ系関連細胞を生じる造血細胞においてのみ特異的に発現されるｍｉＲ－１４２－３ｐを、標的として選択した。ｍｉＲ－１４２－３ｐのみを標的化する配列を生成するために、マウスＢ細胞のマイクロアレイデータおよびｍｉＲ^－１４２－３ｐによって標的化される遺伝子のコンピュータープログラミング（ｍｉｒＳＶＲ ｓｃｏｒｅ）を使用した。上記ｍｉＲ－１４２－３ｐは、配列番号３で示される塩基配列である。ｍｉＲ－１４２－３ｐを標的化する配列を、ｍｉＲ－１４２－３ｐと相補的に結合する塩基配列番号４で示した。ＭｉＲ－１４２－３ｐ標的配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を有し得る。

本発明のｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列は、クローニングのための制限酵素（Ｎｈｅ １およびＨｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂｍｔ １）部位配列（ｃｃａｇａａｇｃｔｔｇｃｔａｇｃ）および制限酵素（Ｈｉｎｄ Ｈ）部位配列（ａａｇｃｔｔｇｔａｇ）を含む。それは、配列番号５のヌクレオチド配列が、これらを接続するリンカー（ｔｃａｃおよびｇａｔａｔｃ）とともに４回反復されているものを含む（図４； 配列番号６）。

１－３． 組換えベクターの生成

本発明の組換えベクターを生成するために、ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列（配列番号５）を、本発明のＡＩＭＰ２改変体（配列番号１）の３’ＵＴＲに挿入した。ＡＩＭＰ－２改変体およびｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列の接続は、塩基配列番号６で示され、具体的には、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用することによって切断および挿入された。組換えベクターは、図１に示される。

実施例２． 組換えベクターの神経細胞特異的発現の確認
２－１． インビトロ条件下でのニューロン特異的発現効果の確認

ｍｉＲ１４２－３ｐは、造血細胞においてのみ特異的に発現されることから、ＡＩＭＰ２改変体の発現の程度を、本発明の組換えベクターのｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列の発現に従って、本発明のＡＩＭＰ２改変体のノックダウンに従う特異的細胞において確認した。

具体的には、本発明の組換えベクターの処理なしの群（偽）、空／コントロールベクター処理群（ＮＣベクター）、単一のＡＩＭＰ２改変体ベクター処理群（ｐｓｃＡＡＶ＿ＤＸ２）および本発明の組換えベクター（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐＴ）で処理した群が存在した。全ベクターの濃度は、μｇ／μｌの単位にあり、各群は、２．５μｌ（２．５μｇ）で処理した。処理群の各々において、処理を、ＡＩＭＰ２改変体のノックダウンを確認して、ＴＨＰ－１細胞株（ヒト白血球単球細胞）およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株（神経芽腫）に対して行った。ｑＰＣＲを、以下の表１中のプライマーを使用することによって実施した（変性 １５秒、ならびに３０秒間、６０℃の温度下で４０サイクルにわたってアニーリングおよび伸長）。

結果として、ＡＩＭＰ２改変体が、偽およびＮＣベクター群において発現されないことを確認うぃた。加えて、単一のＡＩＭＰ２改変体ベクター処理群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２）のＴＨＰ－１細胞株およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株の両方における発現が存在することを確認し、それによって神経細胞特異的発現が誘導されないことを確認した。他方で、ＡＩＭＰ２改変体が、本発明の組換えベクターで処理した群において、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株においてのみ特異的に発現されることを確認した（図２）。

２－２． インビボ条件下での神経細胞特異的発現効果の確認

具体的には、空／コントロールベクター処置群（ＮＣべくテアー）、単一のＡＩＭＰ２改変体ベクター処置群（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２）および本発明の組換えベクター（ｐｓｃＡＡＶ－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐＴ）で処置した群が存在した。１０^８ ｖｇ／μｌの濃度を有するウイルスの各々１０μｌ（１０^９ ｖｇ）での実質内処置を行った。処置群の各々のマウスへの頭蓋内注射後、１週間後に、大腸組織、肺組織、大脳組織、肝臓組織、腎臓組織、胸腺組織、脾臓組織および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）においてＡＩＭＰ２の発現を確認した。ｑＰＣＲを、以下の表１中のプライマーを使用することによって実施した（変性 １５秒間、ならびに３０秒間、６０℃の温度下で４０サイクルにわたってアニーリングおよび伸長）。

結果として、ＡＩＭＰ２改変体の発現は、脳組織においてのみ特異的に増大し、本発明の組換えベクターで処置した群においてニューロンに非常に集中することを確認した（図３）。他方で、ＡＩＭＰ２改変体の発現は、脳組織以外の組織において妨げられることを確認した。

実施例３． 材料および方法
３－１． ｑＲＴ－ＰＣＲ

全ＲＮＡを、脊髄から、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って単離した。抽出したＲＮＡを、定量のための分光光度計（ＡＳＰ－２６８０， ＡＣＴｇｅｎｅ， ＵＳＡ）によって定量した。ｃＤＮＡを作製するために、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコールによって逆転写を行った。得られたｃＤＮＡを、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を使用してリアルタイムＰＣＲに使用した。複製した結果の発現データを、２－ΔΔＣｔ統計分析に使用し、ＧＡＤＰＨ発現を正規化に使用した。

３－２． 動物

この研究において使用するｈＳＯＤ１ Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ）を、ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ， ＵＳＡ）から購入した。年齢を合わせたＷＴコントロールマウスもまた使用した。動物を、Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）の動物施設において、特定病原体のない条件および一定の環境条件（２１～２３℃ 温度、５０～６０％ 湿度および１２時間明／暗サイクル）の下で個々のケージの中で飼育した。全ての実験手順を、Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ動物実験委員会（ＳＮＵＩＡＣＵＣ， ２０１７年８月７日）のガイドラインに従って行い、この研究は、本発明者らの地元の倫理委員会「ＳＮＵＩＡＣＵＣ」によって承認された（承認番号ＳＮＵ－１７０８０７－１）。発症前段階において、同じ年齢の雌性マウスに、ＡＡＶ－ＧＦＰおよびＤＸ２ベクターを投与した。ＡＡＶ－ＤＸ２形質導入を、直接腰椎穿刺によって髄腔内注射した。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて合計８μｌ（４μｌ／点）のＡＡＶ－ＧＦＰまたはＤＸ２ベクターを２点においてゆっくりと注射した（１μｌ／分）。一方で、注射したベクターの喪失を防止するために、針をゆっくりと抜いた。

３－３． ｍｉＲ１４２－３ｐ阻害実験

ＤＸ２発現に対するｍｉＲ－１４２－３ｐ阻害は、×１ ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列から観察できた。ＨＥＫ２９３細胞を、×１、×２、および×３反復ｍｉＲ－１４２－３ｐ標的配列ベクターで、ならびにリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳ）を使用して１００ｐｍｏｌ ｍｉＲ－１４２－３ｐでも一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡの量をＰＣＲによって分析した。ＤＸ２発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害を、Ｔｓｅｑ ×１反復ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列から観察した（図５Ｂ）。

実施例４．
４－１． コア結合配列の阻害効果のために生成した３タイプのベクター

Ｔｓｅｑ ×１は、１つのコア結合配列を含み、Ｔｓｅｑ ×２は、２つのコア結合配列を含み、Ｔｓｅｑ ×３は、３つのコア結合配列を含む（図５Ａ）。

ＤＸ２発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ（１００ｐｍｏｌ）阻害は、×１ 反復ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列から観察され始めた。ＨＥＫ２９３細胞を、×１、×２、および×３ 反復ｍｉＲ－１４２－３ｐ Ｔ ｓｅｑベクターで、ならびにリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳ）を使用して１００ｐｍｏｌ ｍｉＲ－１４２－３ｐでも一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡの量をＰＣＲによって分析した。ｍｉＲ１４２－３ｐ標的配列中のコア結合配列の数が増大されると、ＤＸ２発現に対するｍｉＲ１４２－３ｐ阻害はまた、増大した。Ｔｓｅｑ ×３ コア配列含有ベクターは、有意な阻害を示した（図５Ｂ）。

４－２． コア配列変異

マウスＢ細胞マイクロアレイデータおよびｍｉＲ－１４２－３ｐ標的遺伝子のｍｉｒＳＶＲスコアを使用して、コア配列を推定した。コア配列の４つの領域を、以下のとおりに置換した： （５’－ＡＡＣＡＣＴＡＣ－３’ → ５’－ＣＣＡＣＴＧＣＡ－３’）（元の配列については図４を、および模式図については図５Ａを参照のこと）。

４－３． コア結合配列は、重要なＤＸ２阻害である

４つのコア配列を置換した（図５Ａ）。ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＸ２－ｍｉＲ－１４２－３ｐ Ｔ ｓｅｑ ×３ 反復ベクター（Ｔｓｅｑ３×）で、またはコア配列変異ベクター（ｍｕｔ）で、およびリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳ）を使用することによって１００ｐｍｏｌ ｍｉＲ－１４２－３ｐでも一過性にトランスフェクトし、次いで、４８時間インキュベートした。ＤＸ２ ｍＲＮＡの発現をＰＣＲによって分析した。ＤＸ２の有意な阻害を示したＴｓｅｑ ×３反復ベクター（図５Ｂ）およびＤＸ２構築物を、コントロールとして使用した。１００ｐｍｏｌのｍｉＲ１４２－３ｐ処置は、Ｔｓｅｑ ×３ベクターを有意に阻害したが、ＤＸ２およびｍｕｔ配列は、阻害されなかった（図６）。

４－４． ＡＬＳマウスモデルにおける組織分布データ

脊髄由来の全ＲＮＡを、ｓｃＡＡＶ２－ＤＸ２－ｍｉＲ１４２－３ｐの髄腔内投与後に抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ＤＸ２発現は、局所的な注射部位である脊髄においてのみ制限されるべきである。ｈＳＯＤ１ Ｇ９３Ａトランスジェニックマウスにおいて、ｓｃＡＡＶ－ＤＸ２ ｍｉＲ１４２－３ｐは、髄腔内投与で発現した。コントロールビヒクル注射は、脊髄においてのみの発現を示したが、脳でも坐骨神経でも発現を示さなかった（図７）。

実施例５．
実施例２において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、組換えＡＡＶ２粒子を生成するために必要な構成要素の全てをコードするＯｘｇｅｎｅ（ＵＫ）の３種のプラスミドで共トランスフェクトした。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をまた、組み換えベクターとしておよびＡＡＶ粒子を生成するためではない、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２またはＤＸ２－ｍｉＲ１４２標的ヌクレオチドの挿入を伴うｐＳＦ－ＡＡＶ－ＩＴＲ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ＩＴＲ－ＫａｎＲ（Ｏｘｇｅｎｅ， ＵＫ）のみでトランスフェクトした。

ＤＸ２コードベクター（２μｇ）およびＤＸ２－ｍｉＲ１４２標的配列コードベクター（２μｇ）を、ＴＨＰ－１細胞（ヒト単球、ＣＤ４５＋ 細胞）およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ニューロン細胞）へとトランスフェクトした。４８時間後、細胞を採取し、ｍＲＮＡを単離した。合成したｃＤＮＡを用いて、ＤＸ２の発現をリアルタイムＰＣＲによって分析した。

ＤＸ２発現レベルは、ＳＨ－ＳＹ５Ｙをトランスフェクトした、ＤＸ２コードベクターとＤＸ２－ｍｉＲ１４２標的配列コードベクターとの間で類似であったのに対して、ＤＸ２発現は、ＴＨＰ－１をトランスフェクトしたＤＸ２－ｍｉＲ１４２標的配列コードベクターにおいて劇的に減少した。従って、ｍｉＲ１４２－３ｐは、ＴＨＰ－１細胞においてのみ機能した（図８）。

具体的実施形態の前述の説明は、本発明の一般的概念から逸脱することなく、他者が当該分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、種々の適用のために容易に改変および／または適合させ得る本発明の包括的な性質を非常に十分に明らかにする。従って、このような適合および改変は、本明細書で示される教示およびガイダンスに基づいて、開示される実施形態の意味および均等の範囲内にあることが意図される。本明細書の用語法または語法が教示およびガイダンスに鑑みて、当業者によって解釈されるべきであるように、本明細書中の語法および用語法は説明目的であって限定目的ではないことは、理解されるべきである。

本発明の広さおよび範囲は、上記の例示的実施形態のうちのいずれかによって限定されるべきであるのではなく、以下の請求項およびそれらの均等物に従ってのみ規定されるべきである。

本明細書で記載される種々の局面、実施形態、および選択肢の全ては、任意のおよび全てのバリエーションにおいて組み合わされ得る。

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、および特許出願が参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
エキソン２欠失ＡＩＭＰ２改変体（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子およびｍｉＲ－１４２標的核酸を含む、組換えベクター。
(項目２)
前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、項目１に記載のベクター。
(項目３)
前記プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターまたはオプシンプロモーターである、項目２に記載のベクター。
(項目４)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側にある、項目１～３のいずれか１項に記載のベクター。
(項目５)
前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、項目１～４のいずれか１項に記載のベクター。
(項目６)
前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、項目５に記載のベクター。
(項目７)
前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する、項目１～４のいずれか１項に記載のベクター。
(項目８)
前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する、項目７に記載のベクター。
(項目９)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含む、項目１～８のいずれか１項に記載のベクター。
(項目１０)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５の１～１７個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、項目９に記載のベクター。
(項目１１)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ）と少なくとも５０％同一のヌクレオチド配列を含む、項目１～８のいずれか１項に記載のベクター。
(項目１２)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、項目１１に記載のベクター。
(項目１３)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡを含むヌクレオチド配列を含む、項目１～８のいずれか１項に記載のベクター。
(項目１４)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７の１～１５個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、項目１３に記載のベクター。
(項目１５)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ）と少なくとも５０％同一のヌクレオチド配列を含む、項目１～８のいずれか１項に記載のベクター。
(項目１６)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む、項目１５に記載のベクター。
(項目１７)
前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、２～１０回反復される、項目１～１６のいずれか１項に記載のベクター。
(項目１８)
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目１～１７のいずれか１項に記載のベクター。
(項目１９)
前記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血病）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）、または単純ヘルペスウイルスベクターである、項目１８に記載のベクター。
(項目２０)
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターである、項目１８に記載のベクター。
(項目２１)
神経疾患の処置の必要性のある被験体において神経疾患を処置する方法であって、前記方法は、項目１～２０のいずれか１項に記載のベクターを投与する工程を包含する、方法。
(項目２２)
前記神経疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、網膜変性、軽度認知障害、多発梗塞性認知症、前頭側頭葉型認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、神経変性疾患、代謝性脳障害、鬱病、てんかん、多発性硬化症、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、または脳卒中である、項目２１に記載の方法。
(項目２３)
前記神経疾患は、ＡＬＳである、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記処置は、運動活動を改善するか、または前記被験体の寿命を延ばす、項目２３に記載の方法。
(項目２５)
前記ベクターは、脳または脊髄に投与される、項目２１～２４のいずれかに記載の方法。
(項目２６)
前記ベクターは、定位固定注射によって脳に投与される、項目２５に記載の方法。

Claims (20)

1. エキソン２欠失ＡＩＭＰ２改変体（ＡＩＭＰ２－ＤＸ２）遺伝子およびｍｉＲ－１４２標的核酸を含む、組換えベクター。
2. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１に記載のベクター。
3. 前記プロモーターは、レトロウイルス（ＬＴＲ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーターまたはオプシンプロモーターである、請求項２に記載のベクター。
4. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子に対して３’側にある、請求項１～３のいずれか１項に記載のベクター。
5. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のベクター。
6. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のベクター。
7. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のベクター。
8. 前記ＡＩＭＰ２－ＤＸ２遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載のベクター。
9. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のベクター。
10. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＡＣＴＡおよび配列番号５の１～１７個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のベクター。
11. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列（ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ）と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ここで、前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２発現を抑制する、請求項１～８のいずれか１項に記載のベクター。
12. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載のベクター。
13. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のベクター。
14. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＣＴＴＴＡおよび配列番号７の１～１５個のさらなる連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のベクター。
15. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧ）と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含み、ここで、前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、ＡＩＭＰ２－ＤＸ２発現を抑制する、請求項１～８のいずれか１項に記載のベクター。
16. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載のベクター。
17. 前記ｍｉＲ－１４２標的核酸は、２～１０回反復される、請求項１～１６のいずれか１項に記載のベクター。
18. 前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１～１７のいずれか１項に記載のベクター。
19. 前記ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫／白血病）、ＳＮＶ（脾臓壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス）、または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
20. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。

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