KR20170036085A - 포유동물 rpe65의 높은 아소머로하이드롤라아제 활성 돌연변이 - Google Patents

포유동물 rpe65의 높은 아소머로하이드롤라아제 활성 돌연변이 Download PDF

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Abstract

대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부 및 돌연변이를 코딩하는 핵산이 개시되며, 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는다. 치료를 필요로 하는 포유동물 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 유전자 치료 방법이 개시되며, 상기 방법은, 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는, 치료적 유효량의 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 치료를 필요로 하는 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법이 개시되며, 상기 방법은, 치료적 유효량의 적어도 하나의 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 대상에 투여하는 단계를 포함한다.

Description

포유동물 RPE65의 높은 아소머로하이드롤라아제 활성 돌연변이{HIGH ISOMEROHYDROLASE ACTIVITY MUTANTS OF MAMMALIAN RPE65}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 7월 31일자로 출원된 미국 가출원 제 62/031,472 호의 우선권을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 IRRF의 지원 하에 미국 국립 보건원 과제번호 EY012231, EY018659, EY019309, 및 GM104934로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
망막 색소 상피(Retinal pigment epithelium, RPE) 특이적 65-kDa 단백질(RPE65)은 눈에서의 비타민 A 대사 및 정상 시력의 유지에 필수적이다. 이는 시각 색소의 발색단의 전구체인 11-시스 레티놀(11cROL)에 대한 올-트랜스 레티닐 에스테르(all-trans retinyl ester )의 이성질체화를 촉진하는 중요한 레티노이드 시각 회로 효소이다. RPE65의 돌연변이는 레버 선천성 흑암시(Leber’s Congenital Amaurosis, LCA) 및 망막색소 변성증(Retinitis Pigmentosa, RP)과 같은 유전성 망막 이영양증(retinal dystrophy)과 관련된다. 개와 마우스 모델의 RPE65 결실 돌연변이체에서의 이전의 RPE65 유전자 대체는 망막 변성(retinal degeneration)에 유망한 효과를 나타내었다. 그러나, 인간 RPE65(hRPE65)와 같은 포유동물 RPE65는 다른 레티노이드 처리 효소보다 낮은 고유 활성도(specific activity)를 가지며, 따라서 RPE에서 다량의 RPE65(11 μg/소의 눈)는 정상적인 시력을 위해 충분한 11-시스 레티노이드를 생성해야 한다. 높은 레벨의 hRPE65에 대한 이러한 요구는 RPE65 유전자 치료의 효능을 제한한다.
전기 천공법(electroporation)과 함께 아데노바이러스(AD), 재조합 아데노-관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus, rAAV), 렌티바이러스, 나노입자에 도입된 플라스미드 및 플라스미드 DNA와 같은 유전자 전달을 위한 여러 벡터를 사용하여 손상되지 않은 DNA(또는 리포터 유전자)를 안구 조직에 전달하였다. GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터 및 AD를 이용한 망막하 공간(subretinal space)으로의 유전자 전달은 널리 분포된 GFP 발현을 나타내었다. 야생형(wt) 인간 RPE65(rAAV-hRPE65)를 발현하는 rAAV를 이용한 최근의 인간 임상 시험은 RP 및 LCA 환자에서 약간의 시력 개선만을 나타내었다. 그러나 성공적인 유전자 전달에도 불구하고, 이전의 RPE65 유전자 치료법은 완전한 시력 회복을 성공적으로 이루지 못했다.
본원에 개시된 발명적 개념은, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17 중 적어도 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖고; 아소머로하이드롤라아제(isomerohydrolase) 활성을 가지며; 및 170번 및 297번 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 170번 위치의 아미노산 치환은 Lys, Arg 또는 His일 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 297번 위치의 아미노산 치환은 Gly 또는 Ala일 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 2번, 3번 및 26번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 2번 위치의 아미노산 치환은 Tyr, Phe 또는 His일 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 3번 위치의 아미노산 치환은 Ser, Thr 또는 Cys일 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 26번 위치의 아미노산 치환은 Val, Ala 또는 Ile일 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 예를 들어 본원에 기술된 것일 수 있는 2번, 3번, 26번, 170번 및 297번의 각각에 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 돌연변이되지 않은 RPE65 단백질보다 큰 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 RPE65 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 소 RPE65보다 큰 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는다.
또한, 본원에 기술된 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 포함하는, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클 내에 배치되는 약학적 조성물이 본원에 기술된다.
또한, 본원에 기술된 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산이 본원에 기술된다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 핵산은 벡터 내에 배치될 수 있다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터 또는 인핸서 서열을 포함하고; 및/또는 핵산의 3'에 위치하는 정지 코돈 또는 폴리-A 서열을 포함한다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터는 핵산에 작동 가능하게 연결된 RPE65 프로모터 서열을 포함하고; 및/또는 핵산에 작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터 서열을 포함한다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 나노입자, 플라스미드 및 렌티바이러스로 이루어진 군에서 선택된다.
또한 본원에 기술된 핵산을 포함하는 AAV 벡터가 본원에 기술된다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열을 포함한다.
특정 비제한적인 실시형태에서, AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 하나의 ITR 서열, 또는 이로부터의 ITR 서열의 혼합물을 포함한다.
특정 비제한적인 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV 캡시드 서열을 포함한다.
특정 비제한적인 실시형태에서, AAV 캡시드 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함한다.
또한, 본원에 개시된 발명적 개념의 AAV 벡터를 생산하는 세포가 개시된다.
또한, 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는, 치료적 유효량의 벡터를 대상에 투여함으로써, 치료를 필요로 하는 포유동물 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 유전자 치료 방법이 개시되며, 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대상의 망막 세포에서 생체내 발현되고 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는다. 이러한 유전자 치료 방법에서 사용되는 벡터, 핵산 및 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 본원에 기술된 것들을 포함할 수 있다.
또한, 치료적 유효량의 적어도 하나의 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 대상에 투여함으로써 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 완화시키는, 치료를 필요로 하는 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법이 기술된다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 망막 변성과 관련된 질환은 레버 선천성 흑암시 또는 망막색소 변성증이다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 치료되는 대상은 인간이다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 대상은 18세 미만, 15세 미만, 12세 미만, 10세 미만, 대략 8세 내지 10세, 대략 6세 내지 10세, 대략 4세 내지 6세, 대략 1세 내지 3세 또는 1세 미만이다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 대상은 RPE65 돌연변이에 의해 유발되는 망막 변성 또는 이영양증을 가질 수 있거나 가질 위험이 있을 수 있다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 사용된 벡터는 대상의 하나 이상의 눈에 투여될 수 있다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 사용된 벡터는 대상의 하나 이상의 눈의 망막하 공간(subretinal space) 및/또는 맥락막상 공간(suprachoroidal space)에 투여될 수 있다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 사용된 벡터는 AAV 벡터이다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 대략 1×108개 이상의 AAV 벡터 게놈이 대상의 하나 이상의 눈에 투여된다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 대략 1×108 내지 대략 1×1014 개의 AAV 벡터 게놈이 대상의 하나 이상의 눈에 투여된다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 대략 1×109 내지 대략 1×1013 개의 AAV 벡터 게놈이 대상의 하나 이상의 눈에 투여된다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 10 마이크로리터(μl) 내지 대략 1,000 μl의 부피로 투여된다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 50 μl 내지 대략 800 μl의 부피로 투여된다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 100 μl 내지 대략 600 μl의 부피로 투여된다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 200 μl 내지 대략 500 μl의 부피로 투여된다.
본원에 기술된 방법의 특정 비제한적인 실시형태에서, 본원에 기술된 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대상의 하나 이상의 눈의 망막 색소 상피 세포에 전달되거나 도입된다.
본원에 개시된 발명적 개념의 특정 실시형태는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17 중 적어도 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖고; 및 야생형 인간 RPE65와 비교하여 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 2배 내지 대략 6배의 증가를 유발하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 2배 내지 대략 6배의 증가는 시험관내 아소머로하이드롤라아제 활성 분석에 의해 결정된다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 아미노산 치환은 170번 위치에서 Lys, Arg 또는 His이고; 및/또는 297번 위치에서 Gly 또는 Ala이다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 아미노산 치환(들)은 야생형 인간 RPE65와 비교하여 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 3.2배의 증가를 유발한다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 아미노산 치환은 170번 위치에서 Lys, Arg 또는 His 치환; 297번 위치에서 Gly 또는 Ala 치환; 2번 위치에서 Tyr, Phe 또는 His 치환; 3번 위치에서 Ser, Thr 또는 Cys 치환; 및 26번 위치에서 Val, Ala 또는 Ile 치환을 포함한다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 아미노산 치환은 야생형 인간 RPE65와 비교하여 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 4.4배의 증가를 유발한다.
본원에 개시된 발명적 개념의 여러 실시형태가 첨부된 도면에 도시된다. 그러나, 첨부된 도면은 단지 전형적인 여러 실시형태를 설명하기 위한 것이고, 따라서 본원에 개시된 발명적 개념의 범위를 제한하는 것으로 간주되지는 않는다 것에 주목해야 한다. 또한, 첨부된 도면에서, 동일하거나 유사한 요소를 식별하기 위해 동일하거나 유사한 참조 번호가 사용될 수 있으며, 이러한 모든 요소가 그렇게 번호가 부여되는 것은 아니다. 도면은 반드시 일정한 축척이 아니며, 일부 특징 및 특정 도면은 명료성 및 간결성 위해 일정한 비율로 또는 대략적으로 과장되게 도시될 수 있다.
도 1은 야생형(wt) 인간 RPE65(hRPE65) 및 닭 RPE65(cRPE65)의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. hRPE65의 아미노산 잔기와 동일한 cRPE65의 아미노산 잔기는 점 "."으로 표시된다.
도 2A 내지 도 2R는, (A) 야생형 인간 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 1); (B) 인간 RPE65를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 2); (C) 닭 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 3); (D). 닭 RPE65를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 4); (E) 게잡이 원숭이 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 5); (F) 게잡이 원숭이 RPE65를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 6); (G) 녹색 원숭이 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 7); (H) 녹색 원숭이 RPE65를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 8); (I) 소 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 9); (J) 소 RPE65를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 10); (K) 염소 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 11); (L) 염소 RPE65를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 12); (M) 개 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 13); (N) 개 RPE65를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 14); (O) 집 고양이 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 15); (P). 집 고양이 RPE65를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 16); (Q) 생쥐 RPE65의 아미노산 서열(서열번호 17); 및 (R). 생쥐 RPE65를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 18)을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3D는 인간 및 닭에서의 RPE65의 발현 및 효소 활성을 나타낸다. 야생형 hRPE65, cRPE65 및 적색 형광 단백질(red fluorescence protein, rfp, 음성 대조군)을 발현하는 플라스미드를 293A-LRAT 세포에 개별적으로 형질 감염시켰다. hRPE65와 cRPE65의 발현 수준과 효소 활성을 각각 웨스턴 블롯 분석(A, Pc; 소의 RPE 마이크로솜 단백질(2.5 μg), Nc; Rfp, Hum; hRPE65 및 Chk, cRPE65, 각각 20 μg) 및 시험관내 아소머로하이드롤라아제 활성 분석으로 측정하였다. rfp(B), hRPE65(C) 및 cRPE65(D)를 발현하는 세포의 125 μg의 총 세포 단백질로 올-트랜스-[3H] 레티놀(0.2 μM)을 2 시간 동안 배양하고, 생성된 레티노이드를 HPLC로 분석하였다. 피크 1, 레티닐 에스테르; 2, 11cROL.
도 4A 내지 도 4G는 부위-지정(site-directed) 돌연변이가 RPE65의 아소머로하이드롤라아제 활성 및 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸다. 야생형 hRPE65 및 cRPE65를 발현하는 플라스미드 및 제시된 hRPE65 돌연변이체를 293A-LRAT 세포에 개별적으로 형질 감염시키고 48 시간 동안 배양하였다. (A-D) 로딩 대조군으로 항-β-액틴 항체와 함께 RPE65에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅을 위해 세포 용해물(20 μg)의 동일한 양의 총 단백질을 사용하였다(첫 번째 실험 세트에서 A; 단일, B; 이중, C; 삼중 및 사중 돌연변이체, 및 두 번째 실험 세트에서 D; 단일, E; 이중 돌연변이체; Pc, 양성 대조군(소 RPE 마이크로솜 단백질, 2.5 μg), Nc, 음성 대조군(적색 형광 단백질), WT; 야생형 hRPE65). RPE65 수준은 농도계로 반-정량화하였고 β-액틴 수준으로 정규화하였다. (F 및 G) 시험관내 활성 분석은 동일한 배치의 웨스턴 블롯 분석 샘플로 수행하였다. 아소머로하이드롤라아제 활성은 3 가지 독립적인 측정에서 생성된 11-[3H]-시스 레티놀에 의해 정량화하였고 상대적인 RPE65 단백질 수준으로 정규화하였다. 값은 상대 활성(야생형 hRPE65 활성의 %, 평균 ± SEM, n = 3)으로 나타내었다. 효소 활동 표(F 및 G)에서 인간(○) 및 닭(●) 잔류물은 각각 흰색 및 검은색 원으로 표시하였다. 수직 번호는 후보 잔기의 위치를 나타낸다. 표(F 및 G)에서 패널 위와 아래의 문자는 각각 표시된 위치에서의 hRPE65 및 cRPE65 아미노산 잔기를 나타낸다: 예를 들어, 첫 번째 실험 세트(F) 표의 “●●○●”는 hRPE65의 삼중 돌연변이체(T39R/N170K/Q497P)를 나타낸다.
도 5A 내지 도 5C는 키메라 인간 RPE65 돌연변이체 및 이들의 효소 활성의 개략도를 나타낸다. (A) 각각의 단편과 특정 제한 부위에서 후보 부위의 위치가 표에 나타나있다(흰색 막대; hRPE65, 회색 막대; cRPE65, F1-F6; 해당 cRPE65 단편으로 대체된 키메라 hRPE65). (B) hRPE65, cRPE65 및 키메라의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였으며(Pc; 2.5 μg의 소 RPE 마이크로솜 단백질, 20 μg의 인간의 총 세포 단백질; hRPE65, Chk; cRPE65 및 F1-F6), RPE65의 단백질 수준은 농도계로 반-정량화하였다 (C). 효소 활성은 시험관내 아소머로하이드롤라아제 분석으로 측정하였고, 생성된 11-[3H]-시스 레티놀을 이용하여 정량화하였으며, 이들의 상대적인 RPE65 단백질 수준으로 정규화하였다(C).
도 6A 및 6B는 부위-지정 돌연변이 및 cRPE65의 위치 지정 돌연변이를 이용한 단편 치환이 hRPE65의 단백질 수준 및 효소 활성에 미치는 영향을 나타낸다. 본 연구에서 확인한 부위-지정 돌연변이체(N170K 및 K297G) 및 F1 키메라를 조합하여 돌연변이 sIMH(F1/N170K/K297G)를 생성하였다. RPE65의 확인된 점 돌연변이체와 F1 키메라는 293A-LRAT 세포에서 발현되었다. 형질 감염 후 48 시간에 세포를 수확하고, RPE65의 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다(A). 효소 활성은 시험관내 아소머로하이드롤라아제 분석으로 측정하였고, 생성된 11-[3H]-시스 레티놀에 의해 정량화하였다(B). 아소머로하이드롤라아제 활성은 생성된 11-[3H]-시스 레티놀(피코몰/시간)에 의해 정량화하였으며, 야생형 hRPE65 활성의 %로 나타내었다(평균 ± SEM, n = 3).
도 7A 내지 도 7C는 야생형 hRPE65 및 sIMH에서의 촉매 효율의 분석을 나타낸다. hRPE65 및 sIMH를 발현하는 아데노바이러스를 제조하였다. 야생형 hRPE65 및 sIMH는 MOI 100에서 24 시간 동안 293A(LRAT 없는) 세포에서 개별적으로 발현되었고, 그 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다(A). 총 세포 단백질 용해물(125 μg)을 포함하는 리포좀 내 기질의 다양한 농도를 시험관내 효소 분석에 적용하고, 11cROL 생성의 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 플롯을 통해 야생형 hRPE65(B) 및 sIMH(C)의 Km 및 Vmax를 각각 계산하였다.
도 8A 내지 8C는 Asn170 및 Lys297의 위치 및 RPE65 3D 구조 모델의 F1 단편을 나타낸다. 두 개의 확인된 핵심 잔기와 F1 단편의 위치는 소 RPE65(PDB accession: 3FSN)의 결정 구조에 기반한 3D 모델에 나타내었다. 촉매 도메인 내의 철 결합 부위는 주황색 점선 원으로 나타내었다. 팔미토일화된(palmitoylated) Cys 잔기(Cys112)를 함유하는 무질서한 세그먼트(Phe109-Val126)는 분홍색 점선으로 나타내었다. 활성 부위를 포함하는 소수성 터널의 입구는 빨간색 점선 원으로 나타내었다. F1 단편의 위치는 노란색 점선 원으로 나타내었다. Asn170 및 Lys297 잔기는 모두 단백질의 표면에 위치하고(A 및 B), 잠재적인 촉매 도메인 내의 철-II로부터 20Å 이상 떨어져있다(C).
도 9는 포유동물 RPE65 서열의 다양한 위치에서의 교대 돌연변이체 치환의 비제한적인 예를 나타낸다.
RPE65 돌연변이체 및 본원에 개시된 발명적 개념의 방법의 다양한 실시형태를 예시된 설명, 실시예 및 결과에 의해 더욱 상세히 기술하기 전에, 본원에 개시된 발명적 개념은 방법의 이하의 설명에 명시된 방법 및 조성물의 세부 사항으로의 적용으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 개시된 발명적 개념은 다른 실시형태가 가능하거나 또는 다양한 방법으로 실시되거나 수행될 수 있다. 이와 같이, 본원에서 사용된 언어는 가능한 가장 넓은 범위와 의미를 부여하기 위한 것이며, 실시형태는 예시적인 것이지 포괄적인 것은 아니다. 또한, 본원에서 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것으로서 달리 명시하지 않는 한 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 다음의 상세한 설명에서, 본 발명의 더욱 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정한 세부 사항이 설명된다. 그러나, 본원에 개시된 발명적 개념이 이러한 특정 세부 사항 없이도 실시될 수 있다는 것은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 다른 예들에서, 설명의 불필요한 복잡성을 피하기 위해 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 특징들은 상세히 설명하지 않았다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 개시된 발명적 개념과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 형태는 복수를 포함하고 복수 형태는 단수를 할 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 비-특허 간행물은 본원에 개시된 발명적 개념이 속하는 기술 분야의 숙련자의 숙련도를 나타낸다. 본 출원의 임의의 부분에서 언급된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 비-특허 간행물은, 각각의 개별 특허 또는 간행물이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타나는 것과 동일한 정도로 이들 전체가 참조로서 명백하게 포함된다.
본원에 개시된 모든 조성물 및 이의 제조 및 적용 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 수행될 수 있다. 본원에 개시된 발명적 개념의 조성물 및 방법이 특정 실시형태에 관해서 설명되었지만, 본 발명적 개념의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변경이 적용될 수 있음이 본 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 본원에 개시된 발명적 개념의 사상, 범위 및 개념 있는 것으로 간주된다.
본 개시의 방법 및 조성물에 따라 이용되는 바와 같이, 다음의 용어는 달리 명시되지 않는 한 다음의 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다:
청구항 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 관련하여 사용될 때 "하나"라는 용어의 사용은 "하나"를 의미할 수도 있지만, 이는 또한 "하나 또는 그 이상의", "적어도 하나", 및 "하나 이상"의 의미와 일치한다. 청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 개시가 오직 대체물들 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 지지한다고 하더라도, 대체물들만을 언급하거나 또는 대체물들이 상호 배타적인 경우를 언급하도록 명시적으로 지시되지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. "적어도 하나"라는 용어의 사용은 하나뿐만 아니라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 또는 이에 포함된 임의의 정수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 임의의 양을 포함하는 것으로도 이해해야 한다. "적어도 하나"라는 용어는 이 용어가 붙여진 용어에 따라 최대 100 또는 1000 또는 그 이상으로 확장될 수 있고; 또한, 100/1000의 양은, 더 높은 제한이 또한 만족스러운 결과를 가져올 수 있기 때문에, 제한으로 간주되어서는 안 된다. 또한, "적어도 하나의 X, Y 및 Z"라는 용어의 사용은 X 단독, Y 단독 및 Z 단독뿐만 아니라 X, Y 및 Z의 모든 조합을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용된 용어 "구성되는"(및 "구성된다"와 같은 모든 형태의 "구성되는"이란 용어), "갖는"(및 "갖는다"와 같은 모든 형태의 "갖는"이란 용어), "포함하는"(및 "포함한다"와 같은 모든 형태의 "포함하는"이란 용어) 및 "함유하는"(및 "함유한다"와 같은 모든 형태의 "함유하는"이란 용어)은 포괄적이거나 개방형이며, 추가의 인용되지 않는 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "또는 이들의 조합"은 해당 용어 앞에 나열된 항목의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도되며, 특정 상황에서 순서가 중요한 경우 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB를 포함한다. 이러한 예를 계속하면, BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등과 같이 하나 이상의 항목이나 용어를 반복하여 포함하는 조합이 명시적으로 포함된다. 본 기술 분야의 숙련자는, 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 일반적으로 임의의 조합으로 항목 또는 용어의 수에 제한이 없다는 것을 알 수 있을 것이다.
본 병세서 전체에서, "대략"이라는 용어는 조성물, 조성물을 투여하기 위해 사용되는 방법, 또는 연구 대상에 존재하는 변동에 대한 오차의 고유한 변화를 포함하는 값을 나타내기 위해 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "실질적으로"는 후속하여 기술된 사건 또는 상황이 완전하게 발생하거나 후속하여 기술되는 사건 또는 상황이 더욱 큰 정도로 발생하는 것을 의미한다. 예를 들어, "실질적으로"라는 용어는 후속적으로 기술된 사건 또는 상황이 적어도 90%의 시간, 또는 적어도 95%의 시간, 또는 적어도 98%의 시간에 발생한다는 것을 의미한다.
"약학적으로 허용 가능한"이란 용어는 합리적인 이득/위험 비율에 비례하는 독성, 자극 및/또는 알레르기 반응과 같은 과도한 부작용 없이 인간 및/또는 동물에게 투여하기에 적합한 화합물 및 조성물을 의미한다.
"생물학적으로 활성"이란 활성제가 어떻게 생리적 효과를 갖는지에 관계없이 생물체의 생리학적 체계를 변형시키는 능력을 의미한다.
본원에서 사용된 "순수한" 또는 "실질적으로 순수한"은 대상 종이, 존재하는 우세한 종(즉, 몰 기준으로 해당 조성물에서 임의의 다른 대상 종보다 풍부함)임을 의미하고, 특히 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이, 존재하는 모든 거대 분자 종의 적어도 대략 50%(몰 기준으로)를 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은, 조성물에 존재하는 모든 거대 분자 종의 대략 80% 이상, 더욱 상세하게는 대략 85 % 이상, 대략 90 % 이상, 대략 95 % 이상 또는 대략 99 % 이상을 포함할 것이다. "순수한" 또는 "실질적으로 순수한"이란 용어는 대상 종(예를 들어, 펩타이드 화합물)이 적어도 60%(w/w) 순수한, 또는 적어도 70%(w/w) 순수한, 적어도 75%(w/w) 순수한, 또는 적어도 80%(w/w) 순수한, 또는 적어도 85%(w/w) 순수한, 또는 적어도 90%(w/w) 순수한, 또는 적어도 92%(w/w) 순수한, 또는 적어도 95%(w/w) 순수한, 또는 적어도 96%(w/w) 순수한, 또는 적어도 97%(w/w) 순수한, 또는 적어도 98%(w/w) 순수한, 또는 적어도 99%(w/w) 순수한, 또는 100%(w/w) 순수한 제제를 의미한다.
용어 "대상" 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 온혈 동물, 특히 포유동물을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 이 용어의 범위와 의미 내에 있는 동물의 비제한적인 예는 개, 고양이, 생쥐, 쥐, 기니 피그, 말, 염소, 소, 양, 동물원 동물, 구세계 및 신세계 원숭이, 비인간 영장류 및 인간을 포함한다. 인간의 경우 18세 이상 성인과 18세 미만 어린이 모두가 치료에 적합하다.
"치료"는 치료적 처치를 의미한다. 용어 "치료하는"은 치료 목적을 위해 조성물을 환자에게 투여하는 것을 의미한다.
"예방"은 예방을 위한 또는 예방적 치료 조치를 의미한다. 대상에게 투여하는 것은 질환에 의해 유발되거나 질환과 관련된 이상 증상, 질환, 합병증 등이 발생하기 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 선별(screen, 예를 들어 유전체)을 사용하여 본원에 개시된 발명적 개념의 조성물 및 방법에 대한 후보 대상을 확인할 수 있다. 이러한 대상은 따라서 기능성 유전자 산물(단백질) 내의 부족한 양 또는 결핍에 대해 양성으로 선별된 대상, 또는 비정상적인, 부분적으로 기능성이거나 비-기능성 유전자 산물(단백질)을 생산하는 대상을 포함한다.
용어 "치료용 조성물" 및 "약학적 조성물"은 조성물의 투여가 본원에 기술된 치료 효과를 유발하는, 본 기술 분야에 공지된 또는 본원에서 고려되는 임의의 방법에 의해 대상에 투여될 수 있는 활성제-함유 조성물을 의미한다. 또한 본원에 개시된 발명적 개념의 조성물은 본 기술 분야에 공지된 제형 기술을 사용하여 지연, 조절, 연장 및/또는 지속 방출을 제공하도록 설계될 수 있다.
용어 "유효량"은 발명적인 개념의 방식으로 사용될 때 합리적인 이득/위험 비율에 비례하는 과도한 부작용(과도한 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 검출 가능한 치료 효과를 나타내기에 충분한 활성제의 양을 의미한다 치료 효과는 예를 들어 시력의 부분적 또는 완전한 회복을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 망막/시각 기능 검사에 미치는 유익한 효과를 평가하기 위해, 치료 전후의 망막 전위도(electroretinogram, ERG), 동공측정법(pupillometry) 및 행동 검사(예를 들어, 빛의 변화가 있는 장애물 코스)를 포함한다..
환자의 유효량은 환자의 유형, 환자의 크기 및 건강, 치료될 질환의 특성 및 중증도, 투여 방법, 치료 기간, 동시 치료(있는 경우)의 특성, 사용된 특정 제형 등에 따라 결정될 수 있다. 따라서 정확한 유효량을 미리 특정할 수는 없다. 그러나, 주어진 상황에 대한 유효량은 본원에 제공된 정보를 기반으로 하는 통상적인 실험을 사용하여 본 기술 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
용어 "개선하다"는 대상의 질병 또는 증상에서 검출 가능하거나 측정 가능한 개선을 의미한다. 검출 가능하거나 측정 가능한 개선은 질병의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간에서의 주관적 또는 객관적 감소, 축소, 저지, 억제, 제한 또는 통제, 또는 질병의 증상 또는 근본 원인 또는 결과의 개선, 또는 질병의 종식을 의미한다.
성공적인 치료 결과는 대상에서 질병의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속 기간 또는 질병의 결과를 감소, 축소, 저지, 억제, 제한, 통제 또는 예방하는 "치료 효과" 또는 "이득"을 유발할 수 있다. 질환 또는 이상 증상의 하나 이상의 근본 원인에 영향을 미치는 치료 방법 및 용도가 따라서 유익한 것으로 간주된다. 질병의 안정화와 같은 악화의 감소 또는 축소가 또한 성공적인 치료 결과이다.
치료 효과는 따라서 질병의 완전한 제거 또는 종식, 또는 질병과 관련된 어느 하나의, 대부분의 또는 모든 부정적인 증상, 합병증, 결과 또는 근본적인 원인의 제거 또는 종식일 필요는 없다. 따라서 단기간 또는 장기간(시간, 일, 주, 월 등)에 걸친 질병의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속 기간, 또는 억제 또는 종식(예를 들어, 안정화)에서 부분적 감소, 축소, 저지, 억제, 제한, 통제 또는 예방과 같은 점진적인 개선이 있을 때 만족스러운 종점이 달성된다. 잠재적인 치료 효과 또는 질병의 개선을 제공하는 치료와 같은 방법이나 사용의 효과는, 치료 후의 망막 전위도(ERG), 동공측정법 및 행동 검사를 포함하는 망막/시각 기능 검사와 같은 다양한 방법으로 확인할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상동성(homologous)" 또는 "% 동일성(% identity)"은 70% 초과, 또는 80% 초과, 또는 85% 초과, 또는 90% 초과, 또는 91% 초과, 또는 92% 초과, 또는 93% 초과, 또는 초과 94% 초과, 또는 95% 초과, 또는 96% 초과, 또는 97% 초과, 또는 98% 초과, 또는 99% 초과일 수 있는 상응하는 천연 기준 핵산 또는 단백질에 대한 상동성 정도를 갖는 핵산(또는 이의 단편) 또는 단백질(또는 이의 단편)을 의미한다. 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여, 본원에 기술된 바와 같은 상동성 또는 동일성의 비율은 일반적으로 100 개의 아미노산 길이에서 4 개의 갭(gap)이 해당 정렬을 돕기 위해 도입될 수 있을 때와 비교되는 서열에서 동일한 아미노산 잔기와 정렬되는 두 서열 중 작은 것에서 발견되는 아미노산 잔기의 백분율로서 계산된다(Dayhoff의 문헌(단백질 서열 및 구조의 지도( Atlas of Protein Sequence and Structure ) (1972) Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.)에 개시됨). 일 실시형태에서, 상기한 백분율 상동성은 두 서열(갭의 도입을 통해) 중 큰 것에서 발견될 수도 있는 두 서열 중 작은 것에서 발견되는 성분들의 백분율로서 계산되고, 하나의 성분은 연속적인 4 개의 아미노산으로 정의된다. 또한, 천연 단백질 산물에 대한 항체와의 교차-반응성에 의해 단리될 수 있는 임의의 단백질 산물이 실질적으로 상동성인 것으로 포함된다. 서열 동일성 또는 상동성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 특히, 서열 동일성은 다수의 수학적 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 두 시퀀스의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 Karlin 및 Altschul((1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87, 2264-2268)의 알고리즘이며 Karlin 및 Altschul((1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90, 5873-5877)에서 수정되었다.
일 실시형태에서, "% 동일성"는 동일한 활성을 갖거나 유사한 단백질을 코딩하는 단백질의 2 개의 서열 내의 대응 위치에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드의 수를 나타낸다. 예를 들어, 각각 100 개의 잔기를 갖는 2 개의 아미노산 서열은 대응 위치에서 아미노산 95 개가 동일할 때 95%의 동일성을 가질 것이다.
서열 비교에 사용되는 수학 알고리즘의 또 다른 예는 Myers 및 Miller의 알고리즘((1988) CABIOS, 4, 11-17)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 중량 잔기표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 국부적 서열 유사성 및 정렬의 영역을 동정하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘은 Pearson 및 Lipman((1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85, 2444-2448)에 개시된 FASTA 알고리즘이다.
또 다른 알고리즘은 WU-BLAST(워싱턴 대학교 BLAST) 버전 2.0 소프트웨어(여러 UNIX 플랫폼용 WU-BLAST 버전 2.0 실행 프로그램)이다. 이 프로그램은 WU-BLAST 버전 1.4를 기반으로 하며, 이는 공개 도메인 NCBI-BLAST 버전 1.4(Altschul & Gish (1996) Local alignment statistics. In Methods in Enzymology (R. Doolittle, ed.) 266, 460-480; Altschul et al. (1990) Journal of Molecular Biology, 215, 403-410; Gish & States (1993) Nature Genetics, 3: 266-272; Karlin & Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90, 5873-5877; 이들 모두는 본원에 참조로 포함됨)를 기반으로 한다.
본원에서 달리 언급된 것 외에도, National Center for Biotechnology Information에서 제공한 BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP 및 PSI-BLAST 프로그램을 언급한다. 이들 프로그램은 이 목적을 위해 본 기술 분야에서 널리 사용되며 2 개의 아미노산 서열의 상동성 영역을 정렬시킬 수 있다. 수행되는 모든 검색 프로그램에서 갭이 있는 정렬 방식은 데이터베이스 검색 자체에 필수적이다. 원하는 경우 갭핑(gapping)을 끌 수 있다. 길이 1의 갭에 대한 디폴트 페널티(Q)는 단백질 및 BLASTP에 대해서는 Q=9이고, BLASTN에 대해서는 Q=10이지만 임의의 정수로 변경될 수 있다. 갭(R)을 연장하기 위한 잔기당 디폴트 페널티는 단백질 및 BLASTP의 경우 R=2이며, BLASTN의 경우 R=10이지만 임의의 정수로 변경될 수 있다. 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 서열을 정렬하기 위해 Q 및 R 값의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 디폴트 아미노산 비교 매트릭스는 BLOSUM62이지만, PAM과 같은 다른 아미노산 비교 매트릭스가 활용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산"은 mRNA와 같은 RNA 형태, 또는 예를 들어 클로닝에 의해 또는 화학적 합성 기술 또는 이들의 조합에 의해 제조된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA 형태의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이 RPE65 단백질 산물을 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA는 센스 가닥(sense strand)으로도 알려진 코딩 가닥(coding strand)이거나, 또는 안티센스 가닥(anti-sense strand)으로도 알려진 비-코딩 가닥일 수 있다. 돌연변이 단백질을 코딩하거나 돌연변이 단백질의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 생물학적으로 활성인 돌연변이 단백질 산물을 코딩하는 한 내재적 코딩 서열의 코딩 서열과 실질적으로 동일할 수 있다. 또한, 돌연변이 단백질 또는 돌연변이 단백질의 단편은 유전 코드 또는 대립 유전자 변이의 퇴화로 인해 코돈 사용이 다른 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 사용하여 발현될 수 있다.
용어 "감염", "형질 도입" 및 "형질 감염"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 코딩된 단백질 산물이 발현되도록 세포 내로의 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 것을 의미한다. 본원에 개시된 발명적 개념의 폴리뉴클레오티드는 동일한 전사 단위 내의 추가적인 코딩 서열과 같은 추가적인 서열, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위와 같은 조절 요소, 동일하거나 상이한 프로모터, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 상동성 재조합 및 형질 전환을 가능하게 하는 서열, 및 본원에 개시된 발명적 개념의 실시형태를 제공하기에 바람직한 그러한 구조물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자 치료"는 인간 또는 동물에서 질병 또는 결핍의 치료 또는 예방을 위해 체내에서 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 발현 또는 복제하기 위한 목적으로 이들 세포에 외인성 DNA 또는 RNA를 도입하여 유도하는 세포의 유전적 변형을 의미한다. 유전자 치료는 일반적으로 미국 특허 제 5,399,346호에 개시되어 있다. 핵산 또는 단백질의 임의의 적절한 투여 경로가 본원에 개시된 발명적 개념의 약학적 조성물을 환자에게 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비경구(피하, 망막하, 맥락막상, 근육내, 정맥내, 경피) 및 유사한 투여 형태가 사용될 수 있다. 투여 제형은 주사, 임플란트 또는 그 밖의 공지되고 효과적인 유전자 치료 전달 방법을 포함한다.
본원에 개시된 발명적 개념의 단백질 산물을 코딩하는 핵산에 대한 유전자 전달체(벡터)는 돌연변이 RPE65 단백질 산물의 발현을 촉진하기에 적합한 임의의 벡터를 포함하며 망막 색소 상피 세포에 특이적인, 작동 가능하게 부착된 프로모터 서열(예를 들어, 미국 특허 제 8,785,413호 참조)을 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 유전자 전달체는 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고, 따라서, 이의 상세한 설명은 본원에서 필요하지 않은 것으로 간주된다. 예를 들어, 본원에 개시된 발명적 개념의 단백질 산물을 코딩하는 핵산은 아데노-관련 바이러스 벡터(예를 들어, 미국 특허 제 5,139,941호, 제 5,436,146호 및 제 5,622,856호에 개시됨), 약독화 또는 무기력한(gutless) 아데노바이러스 벡터(예를 들어, Morsy, MA 및 Caskey, C. T. (1999) Mol . Med . Today 5:18 24; 및 미국 특허 제 5,935,935호에 개시됨), 렌티바이러스 벡터(미국 특허 제 5,665,577호; 제 5,994,136호; 및 제 6,013,516호에 개시됨) 플라스미드 또는 합성(비-바이러스) 벡터(미국 특허 제 4,394,448호 및 제 5,676,954호에 개시됨), 및/또는 나노입자(예를 들어, 미국 특허 제 6,217,912호, 제 7,514,098호; 및 제 8,323,618호에 개시됨)에 함유될 수 있다. 대안적인 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터(미국 특허 제 5,672,510호; 제 5,707,865호; 및 제 5,817,491호에 개시됨), 헤르페스 바이러스 벡터(미국 특허 제 5,288,641호에 개시됨) 및 신드비스 바이러스 벡터 및 유두종 바이러스 벡터(EP 820 773에 개시됨)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 모노시스트로닉(monocistronic), 바이시스트로닉(bicistronic) 또는 멀티시스트로닉(multistronic)일 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 본질적으로 완전한 아데노바이러스 게놈을 포함할 수 있다(Shenk, 등 (1984) Curr . Top . Microbiol . Immunol ., 111: 1-39). 대안적으로, 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 적어도 일부가 결실된 변형 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 문헌(He, et al. (1998) PNAS, 95:2590-2514; Chartier, et al. (1996) J. Virol ., 70:4805-4810; and Hitt, et al. (1995) Methods in Molecular Genetics, 7:13-30)에 따라 제조될 수 있다. 아데노바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달하는 방법은 PCT/US95/15947에 개시되어 있다. 많은 아데노바이러스 벡터가 유전자의 세포 내로의 도입을 위해 개발되었다(Berkner, et al. (1988) BioTechniques 6: 616-629). 형질 도입된 유전자 산물의 높은 수준의 구성적 발현(constitutive expression)이 달성되었다. 이들 벡터는 감염을 위해 복제 세포를 요구하지 않는다는 점에서 레트로바이러스 벡터에 비해 본질적인 장점을 가지므로, 체세포 유전자 치료에 적합한 벡터로 만든다(Mulligan, R. C. (1993) Science 260:926-932). 배양액 내의 1차 쥐 간세포 및 근아세포에서의 아데노바이러스-매개 전달을 사용하여 포도당 대사와 관련된 유전자를 형질 도입하는 가능성이 개시되었다(Baque, et al. (1994) Biochem . J. 304 (Pt 3):1009-1014; Gomez-Foix, et al. (1992) J. Biol . Chem . 267:25129-25134).
본원에 개시된 발명적 개념의 방법에 사용될 수 있는 벡터가 또한 문헌(Narfstrom, et al. (2003) “RPE65 삭제 돌연변이 개에서 유전자 치료 후 망막의 기능적 및 구조적 회복(Functional and structural recovery of the retina after gene therapy in the RPE65 null mutation dog).” Invest . Ophthalmol . Vis. Sci . 44, 1663-1672; Bennett, et al. (1994) “성체 쥐 망막으로의 아데노바이러스 벡터-매개 생체내 유전자 전달(Adenovirus vector-mediated in vivo gene transfer into adult murine retina).” Invest. Ophthalmol . Vis . Sci . 35, 2535-2542; Zhang, et al. (2008) “망막에서 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터의 독특한 유전자 형질 도입 효율성(Distinctive gene transduction efficiencies of commonly used viral vectors in the retina).” Curr . Eye Res . 33, 81-90; Weber, et al. (2003) “망막하 전달 이후 생쥐, 개 및 비인간 영장류에서 망막 색소 상피의 독특하고 배타적인 장기간의 형질 도입을 매개하는 재조합 아데노-관련 바이러스 혈청형 4(Recombinant adeno-associated virus serotype 4 mediates unique and exclusive long-term transduction of retinal pigmented epithelium in rat, dog, and nonhuman primate after subretinal delivery).” Mol . Ther ., 7, 774-781; Yokoi, et al. (2007) “자기-상보성 AAV 벡터를 이용한 안구 유전자 전달(Ocular gene transfer with self-complementary AAV vectors).” Invest. Ophthalmol. Vis . Sci ., 48, 3324-3328; Auricchio, et al. (2001) “표면 단백질의 교환이 바이러스 벡터 세포 특이성 및 형질 도입 특성에 미치는 영향: 모델로서의 망막(Exchange of surface proteins impacts on viral vector cellular specificity and transduction characteristics: the retina as a model).” Hum. Mol. Genet., 10, 3075-3081; Pang, et al. (2008) “신생아 마우스 망막에서 생체내 및 시험관내 AAV 벡터 형질 도입의 비교 분석: 혈청형 및 투여 부위의 영향(Comparative analysis of in vivo and in vitro AAV vector transduction in the neonatal mouse retina: effects of serotype and site of administration).” Vision Res., 48, 377-385; Yanez-Munoz, et al., (2006) “비-통합 렌티바이러스 벡터를 이용한 효과적인 유전자 치료(Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors).” Nat . Med ., 12, 348-353; Bemelmans, et al. (2006) “레버 선천성 흑암시의 마우스 모델에서 원추 세포의 생존과 기능을 구하는 RPE65의 렌티바이러스 유전자 전달(Lentiviral gene transfer of RPE65 rescues survival and function of cones in a mouse model of Leber congenital amaurosis).” PLoS Med ., 3, 1892-1903; Miyoshi, et al. (1997) “HIV 기반 렌티바이러스 벡터를 이용한 망막으로의 안정적이고 효율적인 유전자 전달(Stable and efficient gene transfer into the retina using an HIV-based lentiviral vector).” Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 94, 10319-10323; Farjo, et al. (2006) 압축 DNA 나노입자를 이용한 효율적인 비-바이러스성 안구 유전자 전달(Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNA nanoparticles). PLoS One, 1, e38; Kachi, et al. (2005) “비-바이러스성 안구 유전자 전달(Nonviral ocular gene transfer).” Gene Ther ., 12, 843-851; and Johnson, et al. (2008) “기술 요약: 성체 마우스 눈으로의 망막하 주사 및 전기 천공법(Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes).” Mol . Vis ., 14, 2211-2226.)에 개시되어 있다.
재조합 벡터(예를 들어, lenti-, parvo-, AAV) 서열은 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질 도입)을 위해 본원에서 말하는 "입자"로서 포장될 수 있다. 재조합 벡터 서열이 캡시드화되거나 AAV 입자로 포장되는 경우, 입자는 또한 "rAAV"로 지칭될 수 있다. 이러한 입자는 벡터 게놈을 캡슐화하거나 포장하는 단백질을 포함한다. 특정 실시예는 바이러스 엔벨로프 단백질 및 AAV의 경우 캡시드 단백질을 포함한다.
벡터 "게놈"은 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 형성하기 위해 궁극적으로 포장되거나 캡시드화된 재조합 플라스미드 서열의 일부를 의미한다. 재조합 플라스미드가 재조합 벡터를 구성하거나 제조하는데 사용되는 경우, 벡터 게놈은 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 벡터가 아닌 게놈 부분은 "플라스미드 백본"이라고 지칭되고, 이는 플라스미드의 복제와 증폭에 중요하며, 재조합 바이러스 생산에 필요하지만 그 자체는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자로 포장되거나 캡시드화되지 않은 과정이다.
따라서, 벡터 "게놈"은 포장되거나 캡시드화된(예를 들어, AAV)의 벡터 플라스미드의 부분을 의미하고, 돌연변이 RPE65 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 함유한다. 재조합 플라스미드의 비-벡터 게놈 부분은 플라스미드의 복제 및 증폭에 중요한, 즉, 카나마이신과 같은 선택 가능한 마커를 가지지만 그 자체는 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해 포장되거나 캡시드화되지는 않는 "플라스미드 백본"이다.
AAV 벡터는 임의의 혈청형일 수 있다. 대표적인 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8을 포함한다.
벡터는 추가 핵산 또는 단백질 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터는 AAV 벡터에 보유된 AAV 게놈의 하나 또는 두 개의 역위 말단 반복(ITR) 서열을 포함할 수 있다. ITR 서열은 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8을 포함하는 임의의 AAV 혈청형의 ITR을 포함하거나 또는 이에 기초할 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터에서, 돌연변이 RPE65 단백질 또는 이의 단편(부분)을 코딩하는 핵산은 5' 및/또는 3' AAV ITR 서열에 의해 측면에 위치한다.
핵산 서열의 추가의 비제한적인 예는 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, 폴리-아데닌 서열, 정지 코돈 등을 포함한다. 발현 조절 요소를 포함하는 이러한 서열은 전사된 서열의 5'(즉, "상류"), 3' 말단(즉, "하류") 또는 서열 내(예를 들어, 인트론 내)에 위치할 수 있다. 발현 조절 요소를 포함하는 이러한 서열은 전사된 서열에 인접하거나 또는 상당한 거리에서도 이로부터 멀리 떨어져(예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-500 또는 그 이상의 뉴클레오티드) 위치할 수 있다.
발현 조절 요소의 특정 예는 전사된 서열(돌연변이 RPE65 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 5'에 일반적으로 위치하는 프로모터이다. 발현 조절 요소의 또 다른 예는 전사된 서열의 5' 및/또는 3' 또는 전사된 서열 내에 위치할 수 있는 인핸서이다.
"프로모터"는 돌연변이 RPE65 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같은 서열에 인접하여 위치하는 핵산(예를 들어, DNA) 서열을 의미할 수 있다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않을 때 발현된 양에 비하여 작동적으로 연결된 핵산의 발현량을 증가시킨다.
"인핸서(enhancer)"는 돌연변이 RPE65 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 같은 서열에 인접하여 위치하는 서열을 의미할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하지만 기능적으로 프로모터의 하류에 위치하거나 DNA 서열 내에 있을 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 돌연변이 RPE65 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 서열의 상류 또는 하류에 10-25, 25-50, 50-100 100-200, 200-300 또는 그 이상의 염기쌍으로 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 또한 전형적으로 작동 가능하게 연결된 서열의 발현을 증가시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 기술된 성분의 물리적 또는 기능적 병치를 의미한다. 핵산과 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소의 일례에서, 이들의 관계는 제어 요소가 핵산의 발현을 조절하도록 하는 것이다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 두 개의 DNA 서열은, DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계 내에서 두 개의 DNA가 배열되는(시스 또는 트랜스) 것을 의미한다.
임의의 적합한 망막 색소 상피-특이적 프로모터 서열이 돌연변이 RPE65 단백질을 코딩하는 또는 단편을 코딩하는 핵산과 함께 사용될 수 있다. 사용되는 프로모터의 선택은 예를 들어 안구의 경우 RPE65 단백질을 코딩하는 또는 단편을 코딩하는 핵산을 발현할 수 있는 광범위한 천연, 구성적 또는 유도성 프로모터 중에서 이루어질 수 있다.
일 실시형태에서, 프로모터는 세포-특이적이다. 용어 "세포-특이적"은 선택된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 재조합 벡터에 대해 선택된 특정 프로모터가 특정 안구 세포형임을 의미한다. 일례로서, 프로모터는 RPE 세포에서 발현에 특이적이다. 또 다른 예로서, 프로모터는 광수용체 세포에서 발현에 특이적이다.
RPE-특이적 프로모터의 대표적인 비제한적 예는 RPE-65 프로모터, 메탈로프로티아제3(Timp3) 프로모터의 조직 억제제 및 티로시나제 프로모터를 포함한다. 또 다른 RPE-특이적 프로모터는 당해 분야에 공지되어있다(예를 들어, 국제 특허 공개 제 WO 00/15822 호에 기재된 프로모터 참조).
광수용체 프로모터의 대표적인 비제한적 예는 막대 옵신 프로모터, 적-녹색 옵신 프로모터, 청색 옵신 프로모터, 광수용체간 결합 단백질(inter photoreceptor binding protein, IRBP) 프로모터 및 cGMP-베타-포스포디에스테라아제 프로모터(예를 들어, 국제 특허 공보 제 WO 98/48097호에 기재된 프로모터 참조)를 포함한다.
발현 조절 요소는 다양한 세포형에서 발현을 유도할 수 있는 유비쿼터스 또는 무차별 프로모터/인핸서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 구성적이다. 구성적 프로모터의 대표적인 비제한적 예는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 즉시 초기 인핸서/닭 β-액틴(CβA) 프로모터-엑손 1-인트론 1 요소, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 프로모터/인핸서 서열, LTR 프로모터/인핸서, SV40 CMV 프로모터,CMV 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)프로모터 및 포스포글리세롤 키나아제(phosphoglycerol kinase, PGK) 프로모터를 포함한다.
AAV 벡터는 임의의 혈청형의 캡시드를 포함할 수 있다. 대표적인 AAV 캡시드 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8을 포함한다. AAV 벡터는 임의의 혈청형의 캡시드 키메라 또는 변이체를 포함할 수 있다. 특정 AAV 캡시드 변이체는 아미노산 치환, 삭제 또는 삽입/추가를 갖는 캡시드 서열과 같은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8와 같은 캡시드 변이체를 포함한다.
본원에 개시된 발명적 개념의 특정 실시형태에서, 돌연변이 RPE65 단백질(및/또는 이의 치료적으로 유효한 단편)을 포함하는 조성물이 치료적 처치에 제공된다. 대안적으로, 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물은 유전자 치료에 제공될 수 있다. 또한, 이들 조성물의 제조 방법 및 이의 사용 방법이 또한 제공된다. 일 실시형태에서, 조성물은 레버 선천성 흑암시 및 망막색소 변성증(예를 들어, 상염색체 열성 망막색소 변성증)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 대상에서의 망막 변성 관련 질병(이영양증) 또는 질환의 치료에 사용된다. 상기한 바와 같이, 특정 치료 방법은 예를 들어 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 플라스미드 또는 나노입자를 통한 유전자 치료에 의한 것이다. 특정 실시형태에서, 치료는 인간과 같은 포유동물 대상에서 시력 손실의 발생 및/또는 중증도를 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 발명적 개념의 치료는 적절한 또는 적합한 조건 하에 또는 적합한 숙주 세포 내에서 원하는 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편을 체내에서 발현하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 사용한다. 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클과 함께 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 핵산으로 구성되거나, 또는 핵산으로 구성되고 이를 발현시키는 생체내 발현 벡터와 같은 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 발현 벡터(AAV, lenti 등과 같은 바이러스성)를 포함하거나 본질적으로 벡터로 구성되거나, 또는 벡터로 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 벡터는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 비히클에서 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 핵산으로 구성되거나, 또는 핵산으로 구성되고 이를 발현시킨다. 따라서, 본원에 개시된 발명적 개념의 일 실시형태에 따르면, 조성물 내의 다른 벡터(들)는 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 담체, 비히클 및/또는 부형제는 형질 전환을 용이하게 하고 및/또는 벡터의 보존을 향상시킨다. 본 기술 분야에 공지되어 있거나 본원에서 고려되는 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체, 비히클 및 부형제가 본원에 개시된 발명적 개념에 따라 이용될 수 있다. 제한은 아니지만 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 담체, 비히클 또는 부형제는 물, 0.9% NaCl(예를 들어, 식염수) 용액 또는 인산염 완충액일 수 있다. 본원에 개시된 발명적 개념의 방법에 사용될 수 있는 그 밖의 약학적으로 허용 가능한 담체, 비히클 및 부형제는 폴리(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함 하지만 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 비히클 또는 부형제는 벡터의 투여를 용이하게 하고, 발현 수준을 증가 시키고 및/또는 발현 지속 기간을 증가시키는 임의의 화합물 또는 화합물들의 조합일 수 있다.
투여량 및 선량 체적(dose volume)은 본원에서 일반적인 설명에서 논의되며, 과도한 실험 없이도 본 기술 분야의 지식과 함께 읽는 본 개시로부터 숙련자에 의해 결정될 수도 수 있다. 예를 들어, 선량 체적은 대략 0.01 내지 대략 2 ml, 예를 들어 대략 0.02 내지 대략 1 ml일 수 있다. 더욱 상세한 선량 체적은 대략 0.05 내지 대략 0.80 ml, 대략 0.10 내지 대략 0.60 ml, 또는 대략 0.20 내지 대략 0.50 ml일 수 있다.
치료용 및/또는 약학적 조성물은, 비제한적인 실시형태에서, 예를 들어, 대략 104 내지 대략 1011 개의 입자, 대략 105 내지 대략 1010 개의 입자, 또는 대략 106 내지 대략 109 개의 입자의 범위로 투여량당 바이러스 입자를 함유한다. AAV 벡터와 관련하여, 벡터 게놈은 예를 들어 대략 104 내지 대략 1014 개의 벡터 게놈, 대략 105 내지 대략 1013 개의 벡터 게놈, 대략 106 내지 대략 1013 개의 벡터 게놈, 대략 107 대략 1013 개의 벡터 게놈, 대략 108 내지 대략 1013 개의 벡터 게놈 또는 대략 109 내지 대략 1013 개의 벡터 게놈을 포함한다. 이러한 투여량/양의 AAV 벡터는 본원에 기술된 방법에서 유용하다.
본원에 개시된 발명적 개념은 본원에 개시된 발명적 개념에 따라 제조된 치료용 조성물의 유효량을 대상에게 적어도 1회 투여하는 것을 고려한다. 이 투여는 근육내, 피하, 안구내, 결막하, 망막하, 맥락막상 또는 혈관내를 포함하는 다양한 경로를 통해 이루어질 수 있다.
실례로서, 본원에 개시된 발명적 개념의 단백질/핵산에 포함되는 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편은, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열과 정확하게 동일하지 않지만, 뉴클레오티드 서열의 변화가 코딩된 아미노산 서열을 변경하지 않거나, 또는 아미노산 잔기의 보전적 치환, 하나 또는 몇 개의 아미노산의 결실 및/또는 첨가, 코딩된 폴리펩타이드의 특성 등에 크게 영향을 미치지 않는 아미노산 유사체에 의한 아미노산 잔기의 치환만을 유발하는, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 보존적 아미노산 치환의 예는 글리신/알라닌 치환; 발린/이소류신/류신 치환; 아스파라긴/글루타민 치환; 아스파르트산/글루탐산 치환; 세린/트레오닌/메티오닌 치환; 라이신/아르기닌/히스티딘 치환; 및 페닐알라닌/티로신/트립토판 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
따라서, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 돌연변이 RPE65 단백질 및 단편이 본원에 개시된 발명적 개념에 포함된다. 단백질 화학 및 구조에 대한 자세한 설명은 문헌(Schulz, G. E. et al. (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, and Creighton, T. E. (1984) Proteins: Structure and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., San Francisco)을 참조하라. 제조될 수 있는 치환의 유형은 보존적 치환이고, 다음 그룹 중 하나에서 교환으로서 본원에서 정의된다: (1) 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: 예를 들어, Ala, Ser, Thr, Gly; (2) 극성의, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아미드: 예를 들어, Asp, Asn, Glu, Gin; 및 (3) 극성의, 양으로 하전된 잔기: 예를 들어, His, Arg, Lys. Pro는 비정상적인 형상으로 인해 체인을 단단히 제한한다. 기능적 특성의 실질적인 변화는 상기한 그룹(또는 위에서 제시되지 않은 두 개의 다른 아미노산 그룹) 내에서보다는 이들 사이에서와 같이 덜 보존적인 치환을 선택함으로써 이루어지며, 이는 (a) 치환 영역에서 펩타이드 백본의 구조 (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 미치는 영향이 상당히 다를 것이다. 본원에 개시된 발명적 개념에 따른 대부분의 치환은 단백질의 특성에서 급진적인 변화를 일으키지 않는 것이다. 그렇게 하기 전에 치환의 정확한 효과를 예측하는 것이 어렵다 할지라도, 효과는 본 발명에 개시된 활성 분석(예를 들어, 아소머로하이드롤라아제 활성 분석)과 같은 통상적인 선별 분석에 의해 평가될 수 있다는 것을 본 기술 분야의 숙련자는 알 것이다. 산화 환원 또는 열 안정성, 소수성, 단백질 분해에 대한 민감성 또는 담체와 또는 다량체로 응집하는 경향을 포함하는 펩타이드 특성의 변형은 숙련자에게 공지된 방법으로 분석된다.
상기한 바와 같은 기능성 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편 및 상동체를 유발하는 그 밖의 유형의 치환체, 변형체, 첨가체, 결실체 및 유도체가 또한 본원에 개시된 발명적 개념에 포함되며, 본 기술 분야의 숙련자는 이러한 변이체 또는 유도체를 제조하고, 확인하고 또는 선택하는 방법, 및 이러한 변이체 또는 유도체의 RPE65 활성을 시험하는 방법을 쉽게 알 수 있을 것이다. 본 기술 분야의 숙련자는 암호 스플라이스 부위의 제거, 시작 코돈 이전에 코작 공통 서열의 도입에 의한 코돈 사용의 조정, 코돈 사용의 변경, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 발현을 향상시키기 위해 본원에 개시된 발명적 개념의 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편 폴리펩타이드의 발현을 최적화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 발명적 개념은 적어도 하나 이상의 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 또는 서열번호 18에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, or 적어도 99%의 동일성 또는 상동성을 갖고, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성 또는 상동성을 갖는 변이체 RPE65를 코딩하며, 도 9에 개시된 것들 중 하나 이상과 같이 본원에 기술된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 핵산 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 돌연변이 RPE65 단백질 또는 단편을 코딩하는 DNA는 엄격한 조건 하에서 본원에 기술된 야생형 DNA(예를 들어, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18)로 혼성화하는 DNA이다. "엄격한 조건 하에서 혼성화하는 DNA"란, 구체적으로 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA가 65℃에서 0.7 내지 1.0 M NaCl의 존재 하에 고정화되는 필터를 사용하고, 65℃에서 0.1x 내지 2x SSC 용액(1x SSC 용액의 조성은 150 mM 염화나트륨 및 15 mM 시트르산 나트륨을 포함함)을 사용하여 생성된 필터를 세척하는 혼성화 이후 동정된 DNA를 포함하는, RPE65, 단백질을 코딩하는 DNA를 사용하여, 콜로니 혼성화, 플라크 혼성화, 또는 서던 블롯 혼성화에 의해 수득된 DNA를 의미한다. 혼성화는 예를 들어 문헌(Molecular Cloning , A Laboratory Manual , the 2 nd edition (Sambrook, Fritsch, & Maniatis eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989))에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본원에 개시된 발명적 개념이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본원에 개시된 발명적 개념의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 본원에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 약어는 다음과 같다: 11cROL: 11-시스 레티놀; AD: 아데노바이러스; BTP: 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판; cRPE65: 닭 RPE65; HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피; hRPE65: 인간 RPE65; LCA: 레버 선천성 흑암시; PVDF: 폴리비닐리덴 플루오라이드; rAAV: 재조합 아데노-관련 바이러스; RFP: 적색 형광 단백질; RPE: 망막 색소 상피; RPE65: RPE 특이적 65-kDa 단백질; RP: 망막색소 변성증; TBST: 0.1% Tween-20 함유 트리스 완충 식염수; wt: 야생형.
본원에 인용된 모든 출원, 공개, 특허 및 기타 참고 문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 참조로 포함된다. 충돌이 있을 경우, 정의를 포함한 명세서가 통제할 것이다.
본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시하지 않는 한, 개시된 특징(예를 들어, 핵산, 벡터, 플라스미드, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 벡터 게놈 또는 바이러스 입자)은 일종의 동등하거나 유사한 특징의 예이다.
상기한 바와 같이, 본원에서 단수 형태는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 이러한 핵산을 포함하고, "하나의 벡터"에 대한 언급은 복수의 해당 벡터를 포함하며, "하나의 바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 해당 비리온/입자를 포함한다.
본원에서 사용된 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 값의 해당 범위 내의 정수 및 분수 또는 해당 범위 내의 정수를 포함한다. 따라서, 설명을 위해, 80% 이상의 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 등뿐만 아니라 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5% 등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5% 등등을 포함한다.
초과 또는 미만의 정수에 대한 언급은 각각 해당 수보다 크거나 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 100 미만에 대한 언급은 99, 98, 97 내지 숫자 1까지 포함하고, 10 미만은 9, 8, 7 내지 숫자 1까지 포함한다.
본원에서 사용되는 모든 수치 값 또는 범위는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 해당 범위 내의 값의 분수 및 정수 및 해당 범위 내의 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 설명을 위해, 1 내지 10과 같은 수치 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등등을 포함한다. 1 내지 50 범위에 대한 언급은 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 내지 최대 50을 포함할 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등등을 포함한다.
일련의 범위에 대한 언급은 해당 연속 내의 다른 범위의 경계 값을 결합하는 범위를 포함한다. 따라서, 일련의 범위, 예를 들어, 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 750, 750 내지 1,000, 1,000 내지 1,500, 1,500 내지 2,000, 2,000 내지 2,500, 2,500 내지 3,000, 3,000 내지 3,500, 3,500 내지 4,000, 4,000 내지 4,500, 4,500 내지 5,000, 5,500 내지 6,000, 6,000 내지 7,000, 7,000 내지 8,000, 또는 8,000 내지 9,000은 1 내지 20, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 1,000, 1,000 내지 3,000, 2,000 내지 4,000 등의 범위를 포함한다.
본원에 개시된 발명적 개념은 단지 본원에 개시된 발명적 개념의 특정 양태 및 실시형태를 설명하기 위한 목적으로만 포함되고, 제한하려는 것은 아닌 이하의 실시예 및 실시형태를 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 것이다. 다음의 상세한 실시예 및 방법은 본원에 개시된 발명적 개념의 다양한 돌연변이 단백질을 제조하고 사용하는 방법을 기술하고, 상기한 바와 같이, 단지 예시로서 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 본 개시를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 기술 분야의 숙련자는 본원에 기술된 재료 및 절차의 적절한 변형을 즉시 인식할 것이다.
원뿔-우성 닭 RPE65(cRPE65 - 서열번호 3)는 인간 RPE65(hRPE65 - 서열번호 1), 소 RPE65(bRPE65 - 서열번호 9) 또는 그 밖의 포유동물 RPE65 단백질보다 상당히 큰 아소머로하이드롤라아제 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다. 이하에서 상세히 설명하는 바와 같이, cRPE65, hRPE65 및 hRPE65의 돌연변이체의 효소 활성을 시험관내 아소머로하이드롤라아제 활성 분석법으로 측정하였고, 레티노이드 생성물을 HPLC로 분석하였다. 본원에서 분석된 본원에 개시된 발명적 개념의 돌연변이체 중 두 개의 단일 점 돌연변이인 N170K 및 K297G, 및 hRPE65의 이중 돌연변이체 N170K/K297G는 야생형 hRPE65보다 상당히 높은 촉매 활성을 나타내었다. 또한, hRPE65의 N170K/K297G 이중 돌연변이체의 아미노 말단 단편(아미노산 1Met-33Arg)을 대응하는 n-말단 cRPE65 33-잔기 단편으로 대체할 경우, 아소머로하이드롤라아제 활성이 cRPE65와 유사한 수준으로 더욱 증가되었다. 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는, RPE65 돌연변이에 의해 유발되는 망막 변성을 갖거나 가질 위험이 있는 포유동물 대상에서 시력을 향상시키기 위해 본 개시의 특정 RPE65 유전자 치료 실시형태에서, 이러한 고효율의 아소머로하이드롤라아제 돌연변이 조합(S2Y/I3S/L26V/N170K/K297G - 아래에서 더 설명됨)이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 연구에서, 부위-지정 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)을 이용하여, hRPE65의 다수의 잔기를 cRPE65의 위치 대응물로 치환하고(도 1에 도시된 정렬), 생성된 hRPE65 돌연변이체의 아소머로하이드롤라아제 활성을 평가하였다. 결과를 아래에서 도시하고 논의한다.
실험 절차
부위-지정 돌연변이 유도
야생형(wt) hRPE65 단백질(서열번호 1) 및 cRPE65 단백질(서열번호 3)을 코딩하는 cDNA를 상기한 바와 같이 클로닝 벡터에 서브클로닝하였다(Moiseyev, et al. (2005) “레티노이드 시각 회로에서 아소머로하이드롤라아제인 RPE65(RPE65 Is the Isomerohydrolase in the Retinoid Visual Cycle).” Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 102, 12413-12418; and Moiseyev, et al. (2008) “막대-우성 종의 아소머로하이드롤라아제에 비해 더욱 효과적인 아소머로하이드롤라아제인 원뿔-우성 닭의 RPE65(RPE65 from Cone-dominant Chicken Is a More Efficient Isomerohydrolase Compared with That from Rod-dominant Species).” J. Biol . Chem ., 283, 8110-8117). hRPE65 내의 선택된 잔기는 제조사의 프로토콜에 따라 QuickChange 부위-지정 돌연변이 유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 cRPE65 내의 대응물로 대체되었다. 도입된 돌연변이는 ABI-3730 DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 두 가닥 모두에서 시퀀싱하여 확인하고 발현 벡터(pcDNA3.1(-))(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 서브클로닝하였다. 서열 확인 후, 발현 구조물을 QIAfilter Maxi Prep 키트(Qiagen, Valencia, CA)로 정제하였다. 또한, hRPE65 cDNA(서열번호 2) 및 cRPE65 cDNA(서열번호 4)를 개별적으로 pUC18로 서브클로닝하였다. hRPE65 및 cRPE65의 6 개의 제한 단편을 생성하기 위해, 독특한 제한 효소 부위가 아미노산 서열을 변화시키지 않고 도입되었다(도 5A 참조). hRPE65의 각각의 단편은 도입된 제한 효소 부위를 사용하여 cRPE65의 대응물로 대체되었다. 본 연구에서 사용된 모든 프라이머 세트(서열번호 19 내지 42)는 표 1에 나타나있다.
프라이머 세트
명칭 서열 서열 번호
Hum T39R-Fwd 5'-CCCCCTCTGGCTCCGCGGCAGTCTCCTTC-3' 서열번호 19
Hum T39R-Rev 5'-GAAGGAGACTGCCGCGGAGCCAGAGGGGG-3' 서열번호 20
Hum N170K-Fwd 5'-GGTTGATCTTTGCAAGTATGTCTCTGTC-3' 서열번호 21
Hum N170K-Rev 5'-GACAGAGACATACTTGCAAAGATCAACC-3' 서열번호 22
Hum C330T-Fwd 5'-GATTGTGGATCTCTGCACCTGGAAAGGATTTG-3' 서열번호 23
Hum C330T-Rev 5'-CAAATCCTTTCCAGGTGCAGAGATCCACAATC-3' 서열번호 24
Hum Q497P-Fwd 5'-GCCCAGGAGCAGGACCAAAGCCTGCTTATC-3' 서열번호 25
Hum Q497P-Rev 5'-GATAAGCAGGCTTTGGTCCTGCTCCTGGGC-3' 서열번호 26
Hum C106Y-Fwd 5'-CAGAATTTGGCACCTATGCTTTCCCAGATCCC-3' 서열번호 27
Hum C106Y-Rev 5'-GGGATCTGGGAAAGCATAGGTGCCAAATTCTG-3' 서열번호 28
Hum K297G-Fwd 5'-GCTGACAAAAAAAGGGGAAAGTACCTCAATAATAAATACAG-3' 서열번호 29
Hum K297G-Rev 5'-CTGTATTTATTATTGAGGTACTTTCCCCTTTTTTTGTCAGC-3' 서열번호 30
Hum L510M-Fwd 5'-CTGAATGCCAAGGACATGAGTGAAGTTGCCCGG-3' 서열번호 31
Hum L510M-Rev 5'-CCGGGCAACTTCACTCATGTCCTTGGCATTCAG-3' 서열번호 32
Hum S533A-Fwd 5'-GGACTGTTCAAAAAAGCTTGAGCATACTCCAGCAAGC-3' 서열번호 33
Hum S533A-Rev 5'-GCTTGCTGGAGTATGCTCAAGCTTTTTTGAACAGTCC-3' 서열번호 34
Hum KpnI-Fwd 5'-CAGAATTTGGTACCTGTGCTTTCCCAG-3' 서열번호 35
Hum KpnI-Rev 5'-CTGGGAAAGCACAGGTACCAAATTCTG-3' 서열번호 36
Hum SalI-Fwd 5'-GGGTTTCTGATTGTCGACCTCTGCTGCTGG-3' 서열번호 37
Hum SalI-Rev 5'-CCAGCAGCAGAGGTCGACAATCAGAAACCC-3' 서열번호 38
ChkPstI-Fwd 5'-GCAGTTCCCCTGCAGTGACAGATTTAAG-3' 서열번호 39
ChkPstI-Rev 5'-CTTAAATCTGTCACTGCAGGGGAACTGC-3' 서열번호 40
Chk SmaI-Fwd 5'-GTGAAGTGGCCCGGGCAGAAGTGGAGG-3' 서열번호 41
Chk SmaI-Rev 5'-CCTCCACTTCTGCCCGGGCCACTTCAC-3' 서열번호 42
플라스미드 형질 감염
야생형 hRPE65, cRPE65 및 hRPE65 돌연변이체를 발현하는 구축된 플라스미드를 QIAfilter Maxi Prep 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 정제하고, Fugene 6 형질 감염 시약(Roche, Indianapolis, IN) 또는 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, Inc., Warrington, PA; 1 mg/ml, pH 7.4, 2:1의 PEI:DNA 비율)을 사용하여 인간 LRAT(45)를 안정적으로 발현하는 세포주인 293A-LRAT 세포에 형질 감염시켰으며, 배양 배지를 형질 감염 후 6 시간에 교체하였다. 형질 감염 48 시간 후에, 세포를 세포 스크레이퍼로 수확하고 빙냉 PBS로 2 회 헹구었다. 야생형 hRPE65 및 이의 돌연변이체의 단백질 수준과 효소 활성을 웨스턴 블롯 분석과 시험관내 아소머로하이드롤라아제 활성 분석에 의해 확인하였다.
웨스턴 블롯 분석
총 세포 단백질 농도는 Bradford 분석을 사용하여 측정하였다. 야생형 hRPE65와 cRPE65를 발현하는 293A-LRAT 세포와 hRPE65 돌연변이체 및 양성 대조군으로서 소 RPE 마이크로솜 단백질(2.5 μg)의 동량의 총 세포 단백질(20 μg)을 8% 트리스-글리신 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 통한 전기 영동으로 용해하고 이모빌론 PVDF 멤브레인(Millipore, Billerica, MA) 상에 전기 이동시켰다. 멤브레인을 TBST(0.1% Tween-20 함유 트리스 완충 식염수)에서 5%(wt/vol)의 탈지 분유로 30분간 차단한 후, 항-RPE65 다클론 항체(예를 들어, Ma, et al. (2001) “RPE65의 발현, 정제 및 MALDI 분석(Expression, purification, and MALDI analysis of RPE65).” Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., 42, 1429-1435) 참조)의 1:1,000 희석액으로 4℃에서 밤새 배양하여 핵심 잔기 및 항-β-액틴 단클론 항체(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 1:50,000 희석액을 확인하였다. 본 발명자들은 또 다른 RPE65 항체(Moiseyev, et al. (2008) “막대-우성 종의 아소머로하이드롤라아제에 비해 더욱 효과적인 아소머로하이드롤라아제인 원뿔-우성 닭의 RPE65(RPE65 from Cone-dominant Chicken Is a More Efficient Isomerohydrolase Compared with That from Rod-dominant Species).” J. Biol . Chem ., 283, 8110-8117)를 사용하여, 단편 3 상의 면역 반응의 차이를 방지하기 위해 cRPE65 및 RPE65의 키메라 돌연변이체의 발현 수준을 비교하였다. TBST로 4번 세척한 후, DyLight-549로 접합된 염소 항-마우스 IgG 및 DyLight-649(Pierce, Rockford, IL)로 접합된 염소 항-토끼 IgG의 1:25,000 희석액으로 차광 컨테이너에서 1.5 시간 동안 배양하였고, FluorChem Q 이미징 시스템(AlphaInnotech, San Leandro, CA)을 사용하여 밴드를 검출하였다. 신호 강도는 AlphaView Q 소프트웨어(AlphaInnotech, San Leandro, CA)를 사용하여 농도계로 반-정량화하였고, 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터 평균화하였다.
아소머로하이드롤라아제 활성 분석
293A-LRAT 세포를 야생형 인간 및 닭 RPE65 및 hRPE65 돌연변이체를 발현하는 플라스미드로 개별적으로 형질 감염시켰다. 적색 형광 단백질(rfp)을 발현하는 293A-LRAT 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 반응 완충액(10 mM 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판(BTP), pH 8.0, 100 mM NaCl)에서 초음파 처리하여 세포를 용해시켰다. N,N-디메틸 포름아미드 내의 올-트랜스[11,12-3H]-레티놀(1 mCi/ml, 45.5 Ci/mmol, American Radiolabeled Chemical, Inc., St. Louis, MO)을 아소머로하이드롤라아제 분석에 적합한 기질로 사용하였다. 각각 반응에 대해, 0.2 μM 올-트랜스 레티놀, 1% BSA 및 25 μM의 세포 망막 알데히드-결합 단백질을 함유하는 반응 완충액(10 mM BTP, pH 8.0, 100 mM NaCl) 200 μl에 총 세포 단백질(125 μg)을 첨가하였다. 반응을 멈추고, 300 μl의 차가운 메탄올과 300 μl의 헥산으로 레티노이드를 추출하였다. 생성된 레티노이드를 정상(normal phase) HPLC로 분석하였다. 각 레티노이드 이성질체의 피크는 레티노이드 표준의 특성 보유 시간 및 흡수 스펙트럼에 기초하여 확인하였다. 아소머로하이드롤라아제 활성은 합성 11-시스 [3H]-레티놀을 표준 물질로 사용하는 Radiomatic 610TR 소프트웨어(Perkin Elmer, Boston, MA)를 사용하여 11cROL 피크의 면적으로부터 계산하였다. 형질 감염 효율의 변화를 최소화하기 위해, 돌연변이체의 모든 시험관내 활성 분석을 야생형 hRPE65와 나란히 수행하였고, 특정되지 않는 한 야생형 hRPE65의 값과 관련된 값으로 촉매 활성을 나타내었다.
결과
hRPE65 및 cRPE65의 발현 및 효소 활성 비교.
적색 형광 단백질(rfp, 음성 대조군)을 발현하는 플라스미드인 hRPE65 및 cRPE65를 293A-LRAT 세포에 개별적으로 형질 감염시키고 48 시간 동안 배양하였다. hRPE65 및 cRPE65의 발현 수준 및 효소 활성을 웨스턴 블롯 분석(도 3a) 및 시험관내 아소머로하이드롤라아제 분석에 의해 확인하였다. 음성 대조 단백질 rfp가 아닌 hRPE65 및 cRPE65 모두는 올-트랜스 레티닐 에스테르를 아소머로하이드롤라아제의 생성물인 11cROL로 전환시켰다(도 3B 내지 도 3D). cRPE65는 이의 RPE65 단백질 수준으로 정규화한 후에 야생형 hRPE65보다 높은 수준의 11cROL를 생성하였으며, 이는 cRPE65의 높은 효소 활성을 나타낸다.
돌연변이체의 선택
hRPE65와 cRPE65 사이의 아소머로하이드롤라아제 활성의 차이를 조사하기 위해 cRPE65의 다양한 위치로부터 8 개의 잔기를 선택하였다(도 1 참조). 아소머로하이드롤라아제 활성에 대한 이러한 잔기의 기여도를 평가하기 위해, hRPE65에서 8 개의 후보 잔기의 일련의 점 돌연변이를 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 생성하였다. 시험관내 효소 활성 분석을 위해, hRPE65 내의 39번 위치의 Thr, 170번 위치의 Asn, 330번 위치의 Cys 및 497번 위치의 Gln의 치환 효과를 첫 번째 실험 세트에서 조사하였다. 106번 위치의 Cys, 297번 위치의 Lys, 510번 위치의 Leu 및 533번 위치의 Ser의 치환을 두 번째 실험 세트에서 조사하였다.
부위- 지정 점 돌연변이 hRPE65 의 단백질 수준과 촉매 활성에 미치는 영향
hRPE65 및 cRPE65를 발현하는 플라스미드 및 부위-지정 돌연변이체를 293A-LRAT 세포에 개별적으로 형질 감염시키고, 형질 감염된 세포를 48 시간 동안 배양하였다. 단백질 발현은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었고(시험된 RPE65 돌연변이체의 상대적 발현 수준을 표 2에 나타냄), 총 세포 단백질의 동일한 배치를 시험관내 아소머로하이드롤라아제 활성 분석에 사용하였다. 단일, 이중 및 다중 돌연변이를 함유하는 모든 hRPE65 돌연변이체에 대해, RPE65의 발현 수준은 비교 가능했지만(도 4A-4E), 두 개의 단일 점 돌연변이체 N170K 및 K297G는 총 RPE65 발현 수준으로 정규화한 후 각각 야생형 hRPE65에 비해 1.6배 및 1.7배 높은 효소 활성을 나타내었다(도 4F 및 4G). 또한, 각각의 실험 세트에서 N170K(또는 K297G)를 갖는 시험된 이중, 삼중 또는 다중 돌연변이체는 RPE65의 촉매 활성을 추가로 향상시키지 않았다. 이러한 결과는 hRPE65에서 N170K 및 K297G의 돌연변이가 효소 활성을 증가시키는 데 중요할 수 있음을 시사한다.
생성된 RPE65 돌연변이체의 발현 수준.
돌연변이명 단백질 발현(야생형 ± SEM의 %) N =
wt hRPW65 100.0 ± -
T39R 119.2 ± 8.3 6
N170K 104.9 ± 3.3 7
C330T 106.3 ± 6.5 6
Q497P 80.6 ± 8.4 6
T39R/N170K 102.3 ± 10.7 5
N170K/C330T 86.2 ± 8.7 5
N170K/Q497P 92.0 ± 4.4 5
T39R/N170K/C330T 92.1 ± 3.0 4
T39R/N170K/Q497P 87.9 ± 2.2 4
T39R/N170K/C330T/Q497P 108.9 ± 5.4 4
C106Y 89.0 ± 5.9 5
K297G 111.3 ± 7.1 7
L510M 171.0 ± 11.7 4
S533A 114.9 ± 9.1 5
C106Y/K297G 146.3 ± 8.2 3
K297G/L510M 186.1 ± 16.8 3
K297G/S533A 176.3 ± 12.2 3
I220M 99.2 ± 9.8 4
N170K/I220M 78.7 ± 2.4 3
T39R/N170K/I220M 103.3 ± 0.9 3
T39R/N170K/I220M/Q497P 96.9 ± 2.8 4
N302I 130.4 ± 14.1 3
K297G/N302I 145.2 ± 8.0 4
키메라 인간 RPE65 의 생성 및 이의 단백질 수준 및 촉매 활성에 미치는 영향
hRPE65의 촉매 활성을 추가로 향상시키기 위해, 본 발명자들은 hRPE65의 펩티드 단편을 cRPE65의 대응물로 대체하여 키메라 RPE65를 구성하였다(도 5A, 단편 F1-F6). 형질 감염 후 48 시간에, 웨스턴 블롯 분석 및 시험관내 아소머로하이드롤라아제 분석을 위해 세포를 수확하였다. 웨스턴 블롯 분석은 F1 키메라(대체된 단편 1)를 제외한 키메라 돌연변이체가 야생형 hRPE65 및 다른 키메라 돌연변이체보다 높은 단백질 수준의 RPE65를 나타냄을 보였다(도 5B-5C). 흥미롭게도, F1 및 F3 키메라 돌연변이체는 야생형 hRPE65보다 대략 1.5 내지 2배 높은 촉매 활성을 나타내는 반면, F2, F4 및 F5 키메라 돌연변이체는 hRPE65의 촉매 활성을 실질적으로 감소시켰다. RPE65 단백질 수준으로 정규화한 후에, F1 키메라 돌연변이체는 야생형 hRPE65와 비교할 만한 촉매 활성(야생형 hRPE65의 106.9%)을 나타내었고, 이는 F1 키메라의 향상된 촉매 활성이 아마도 F1 RPE65 키메라의 증가된 단백질 수준으로 인한 것이었다는 것을 시사한다(도 5b, 5c). F3 키메라는 아마도 N170K 돌연변이로 인해 야생형 hRPE65보다 높은 정규화된 효소 활성(야생형 hRPE65의 152%)을 나타냈음을 유의해야 한다. 이는 N170K 단일 돌연변이의 결과와 상당한 관련이 있다. cRPE65의 F1 단편은 hRPE65의 상응하는 잔기(S2Y, I3S 및 L26V)와는 상이한 2번, 3번 및 26번 위치의 잔기를 포함한다.
고활성 돌연변이체의 조합에 의한 슈퍼- 아소머로하이드롤라아제(sIMH)의 생성
일련의 부위-지정 점 돌연변이와 키메라 돌연변이 연구에서 발견된 세 개의 고활성 돌연변이체가 조합되었다. 상기한 바와 같이, 두 개의 단일 돌연변이체(N170K 및 K297G)는 이들의 발현 수준이 야생형 hRPE65과 유사하더라도(도 6A), 야생형 hRPE65보다 유의하게 높은 촉매 활성을 나타내었다(도 6B). 도 6에 나타낸 바와 같이, hRPE65의 이중 돌연변이체(N170K/K297G)는 야생형 hRPE65보다 3.2배 높은 효소 활성을 나타내었다. 또한, N170K 돌연변이를 갖는 F1 키메라(세 개의 치환을 가짐)의 조합은 N170K 단일 돌연변이체보다 더 높은(2.2배) 단백질 수준 및 촉매 활성을 나타내었다. 단일 돌연변이체(sIMH)에 이들 돌연변이(S2Y/I3S/L26V/N170K/K297G)를 모두 결합시킨 후 돌연변이체의 촉매 활성은 야생형 hRPE65의 4.4배인 것으로 밝혀졌으며, 이는 야생형 cRPE65의 활성과 비교할 만하다(동일한 분석에서 5.8배, 도 6B).
대체 돌연변이
표 3에 나타낸 바와 같이, hRPE65와 cRPE65, 예를 들어, 220번 위치 및 302번 위치에서의 차이를 근거로 한 특정 돌연변이는 활성을 향상시키지도 활성을 감소시키지 않았거나, 또는 170번 위치 및 297번 위치에서의 돌연변이에 의해 유도된 개선을 감소시키지 못했다.
hRPE65의 일련의 I220M 및 N302I 돌연변이체의 아소머로하이드롤라아제 활성.
돌연변이명 정규화된 활성 (야생형 ± SEM의 %)
wt hRPE65 100
I220M 62.0 ± 11.0
N170K/I220M 31.1 ± 7.8
T39R/N170K/I220M 109.7 ± 4.2
T39R/ N170K/I220M/Q497P 108.6 ± 10.4
N302I 124.8 ± 13.3
N302/K297G 107.7 ± 6.9
두 개의 점 돌연변이, 특히 N170K 및 K297G는 hRPE65의 효소 활성을 상당히 증가시켰다. 이들 돌연변이 둘 모두를 포함하는 돌연변이체(N170K/K297G)는 hRPE65의 더욱 향상된 촉매 활성(야생형 RPE65의 3.2배)을 나타내었다. 또한, 이러한 이중 돌연변이체의 활성은 cRPE65의 F1 단편을 대체함으로써 더욱 향상되었다(1Met-33Arg; 세 개의 다른 잔기, 즉 2번 위치에서 Y, 3번 위치에서 S, 26번 위치에서 V를 함유함). 그 결과, 이러한 슈퍼-아소머로하이드롤라아제(sIMH; F1/N170K/K297G)의 촉매 활성은 동일한 실험 조건 하에서 야생형 hRPE65에 비해 대략 4.4배였으며, 이는 1.9배 높은 촉매 활성 및 2.3배 높은 단백질 수준으로 인한 것이었다. sIMH에 의한 11cROL의 생성은 cRPE65의 수준에 가까웠다(hRPE65의 5.8배).
sIMH의 향상된 효소 활성의 또 다른 확인으로서, 본 발명자들은 야생형 hRPE65 및 sIMH의 촉매 효율을 평가하였다(도 7). 계산된 Km 및 Vmax는 sIMH의 높은 Vmax가 주로 높은 효소 활성에 기여한다는 것을 시사한다(도 7C).
확인된 핵심 잔기가 cRPE65의 높은 촉매 활성에 기여할 수 있는 가능성을 이해하기 위해, 본 발명자들은 SwissPDB Viewer 버전 4.01(/www.expasy.org/spdbv/)를 이용해 소 RPE65(PDB accession: 3FSN)의 3D 구조를 분석하였고, 그 결과를 POV-Ray 버전 3.61(www.povray.org/)을 이용해 나타내었다. 3D 모델에서, Asn170 및 Lys297 잔기 모두는 RPE65 분자의 표면 상에 국소화되었고(도 8A, B) RPE65 촉매 부위에서의 보조 인자 철(co-factor iron)과 떨어져 있으며(도 8C), 이는 이들 두 잔기가 기질의 촉매 작용에 직접 참여하지 않을 가능성을 시사한다. 이론에 제한되기를 바라지 않고, 본 발명자들은 이들 잔기 치환이, 예를 들어, 더욱 효율적인 기질 섭취 및/또는 생성물(11cROL) 방출을 위해 RPE65 멤브레인 결합을 향상시킬 수 있다고 추측한다. 대안적으로, 이들 두 잔기는 RPE65의 적절한 폴딩에 기여하여 멤브레인과 결합될 때 활성 구조를 얻을 수 있다. 흥미롭게도, F1 키메라(2번, 3번, 26번 위치에서 치환됨)는 RPE65의 증가된 단백질 수준으로 인해 hRPE65의 촉매 활성이 상당히 향상되었음을 나타내었다. 다른 두 잔기 치환과 달리, F1 단편만이 cRPE65의 단편으로 대체된 F1 키메라는 RPE65 단백질 수준으로 정규화한 후 야생형 hRPE65와 유사한 촉매 활성을 나타내었다. F1 단편은 33 개의 아미노산 및 hRPE65와 cRPE65 사이에서 상이한 오직 세 개의 잔기를 포함하고 있다. F1 단편 내의 이러한 잔기는 hRPE65 돌연변이체의 단백질 안정성을 향상시키기 위해 적절한 폴딩에 기여할 수 있다. 또 다른 가능성은 뉴클레오티드 서열 차이의 기여이다. F1 단편 내의 33 개 아미노산을 코딩하는 99 개의 염기쌍 중에서, hRPE65와 cRPE65 간에 19 개의 상이한 뉴클레오티드가 있다. 이들 뉴클레오티드 치환은 hRPE65 mRNA의 안정성을 향상시키거나 또는 더욱 효과적인 코돈 사용에 기여할 수 있고, 이는 더욱 높은 발현 수준으로 이어진다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 연구는 야생형 5 개 잔기(2번 위치, 3번 위치, 4번 위치, 5번 위치 및 6번 위치에서)를 cRPE65의 상응하는 아미노산 위치의 잔기로 대체하여 고활성 hRPE65 돌연변이체(본원에서는 슈퍼-아소머로하이드롤라아제(sIMH) 로 지명됨)를 생성하였다. 이 sIMH는 총 세포 단백질 수준으로 정규화한 후에 더욱 높은 촉매 활성을 나타내었다(야생형 RPE65보다 4.4배 더 높음). 일 실시형태에서, 이러한 sIMH 돌연변이체는 인간 대상에서의 망막 이영양증의 더욱 효과적인 치료를 위해 RPE65 유전자 대체 치료법에 사용될 수 있다. 다른 포유동물 RPE65 서열(본원에 기술된 다른 포유동물 RPE65 서열을 포함하지만 이에 한정되지는 않음)에 근거하여, 본원에 개시된 발명적 개념의 다른 돌연변이체를 형성하기 위해 형성될 수 있는 다른 치환은 도 9에 도시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 비제한적인 실시형태에서, 2번 위치에서, Phe 또는 His는 Tyr 대신에 치환된 아미노산으로 사용될 수 있고, 3번 위치에서, Thr 또는 Cys는 Ser 대신에 치환된 아미노산으로 사용될 수 있고, 26번 위치에서, Ala 또는 Ile은 Val 대신에 치환된 아미노산으로 사용될 수 있고, 170번 위치에서 Arg 또는 His는 Lys 대신에 치환된 아미노산으로 사용될 수 있으며, 297번 위치에서 Ala는 Gly 대신에 치환된 아미노산으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1에 근거하여 형성된 임의의 돌연변이체가 또한 포유동물 RPE65 서열 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 또는 서열번호 17 중 임의의 서열로 생성될 수 있다.
해당 돌연변이체의 시험관내 활성 분석을 본원에 기술된 바와 같이 수행하였고, 아소머로하이드롤라아제 활성을 RPE65 수준의 정규화(야생형 hRPE65 활성의 %, 평균 ± SEM, n = 3) 이후 상대 활성으로 나타내었다.
본원에 개시된 발명적 개념이 이의 양태가 더욱 완전하게 이해되고 인식될 수 있도록 특정 실시형태와 관련하여 본원에서 기술되었지만, 본원에 개시된 발명적 개념은 이러한 특정 실시형태에 한정되지는 않는다. 반대로, 모든 대안, 수정 및 등가물이 본원에서 정의된 바와 같은 본원에 개시된 발명적 개념의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 따라서, 특정 실시형태를 포함하는 상기한 실시예는 본원에 개시된 발명적 개념의 실시를 설명하는 역할을 할 것이고, 도시된 세부 사항은 예로서 그리고 본원에 개시된 발명적 개념의 특정 실시형태에 대한 설명을 목적으로 하며, 발명적 개념의 원칙과 개념적 양태뿐만 아니라 절차의 가장 유용하고 쉽게 이해할 수 있는 설명을 제공하기 위해 제시된다. 본원에 기술된 다양한 조성물의 제제, 본원에 기술된 방법 또는 본원에 기술된 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 본원에 개시된 발명적 개념의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 변경이 이루어질 수 있다. 또한, 본원에 개시된 발명적 개념의 다양한 실시형태가 아래의 청구항에 기술되었지만, 본원에 개시된 발명적 개념은 이들 특정 청구항들로 제한되지는 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Ma, Jian-Xing Gennadiy, Moiseyev Takahashi, Yusuke <120> HIGH ISOMEROHYDROLASE ACTIVITY MUTANTS OF MAMMALIAN RPE65 <130> 820233.02315 <150> 62/031,472 <151> 2014-07-31 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 533 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ile Gln Val Glu His Pro Ala Gly Gly Tyr Lys Lys Leu Phe 1 5 10 15 Glu Thr Val Glu Glu Leu Ser Ser Pro Leu Thr Ala His Val Thr Gly 20 25 30 Arg Ile Pro Leu Trp Leu Thr Gly Ser Leu Leu Arg Cys Gly Pro Gly 35 40 45 Leu Phe Glu Val Gly Ser Glu Pro Phe Tyr His Leu Phe Asp Gly Gln 50 55 60 Ala Leu Leu His Lys Phe Asp Phe Lys Glu Gly His Val Thr Tyr His 65 70 75 80 Arg Arg Phe Ile Arg Thr Asp Ala Tyr Val Arg Ala Met Thr Glu Lys 85 90 95 Arg Ile Val Ile Thr Glu Phe Gly Thr Cys Ala Phe Pro Asp Pro Cys 100 105 110 Lys Asn Ile Phe Ser Arg Phe Phe Ser Tyr Phe Arg Gly Val Glu Val 115 120 125 Thr Asp Asn Ala Leu Val Asn Val Tyr Pro Val Gly Glu Asp Tyr Tyr 130 135 140 Ala Cys Thr Glu Thr Asn Phe Ile Thr Lys Ile Asn Pro Glu Thr Leu 145 150 155 160 Glu Thr Ile Lys Gln Val Asp Leu Cys Asn Tyr Val Ser Val Asn Gly 165 170 175 Ala Thr Ala His Pro His Ile Glu Asn Asp Gly Thr Val Tyr Asn Ile 180 185 190 Gly Asn Cys Phe Gly Lys Asn Phe Ser Ile Ala Tyr Asn Ile Val Lys 195 200 205 Ile Pro Pro Leu Gln Ala Asp Lys Glu Asp Pro Ile Ser Lys Ser Glu 210 215 220 Ile Val Val Gln Phe Pro Cys Ser Asp Arg Phe Lys Pro Ser Tyr Val 225 230 235 240 His Ser Phe Gly Leu Thr Pro Asn Tyr Ile Val Phe Val Glu Thr Pro 245 250 255 Val Lys Ile Asn Leu Phe Lys Phe Leu Ser Ser Trp Ser Leu Trp Gly 260 265 270 Ala Asn Tyr Met Asp Cys Phe Glu Ser Asn Glu Thr Met Gly Val Trp 275 280 285 Leu His Ile Ala Asp Lys Lys Arg Lys Lys Tyr Leu Asn Asn Lys Tyr 290 295 300 Arg Thr Ser Pro Phe Asn Leu Phe His His Ile Asn Thr Tyr Glu Asp 305 310 315 320 Asn Gly Phe Leu Ile Val Asp Leu Cys Cys Trp Lys Gly Phe Glu Phe 325 330 335 Val Tyr Asn Tyr Leu Tyr Leu Ala Asn Leu Arg Glu Asn Trp Glu Glu 340 345 350 Val Lys Lys Asn Ala Arg Lys Ala Pro Gln Pro Glu Val Arg Arg Tyr 355 360 365 Val Leu Pro Leu Asn Ile Asp Lys Ala Asp Thr Gly Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Leu Pro Asn Thr Thr Ala Thr Ala Ile Leu Cys Ser Asp Glu Thr 385 390 395 400 Ile Trp Leu Glu Pro Glu Val Leu Phe Ser Gly Pro Arg Gln Ala Phe 405 410 415 Glu Phe Pro Gln Ile Asn Tyr Gln Lys Tyr Cys Gly Lys Pro Tyr Thr 420 425 430 Tyr Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Asn His Phe Val Pro Asp Arg Leu Cys 435 440 445 Lys Leu Asn Val Lys Thr Lys Glu Thr Trp Val Trp Gln Glu Pro Asp 450 455 460 Ser Tyr Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Ser His Pro Asp Ala Leu Glu 465 470 475 480 Glu Asp Asp Gly Val Val Leu Ser Val Val Val Ser Pro Gly Ala Gly 485 490 495 Gln Lys Pro Ala Tyr Leu Leu Ile Leu Asn Ala Lys Asp Leu Ser Glu 500 505 510 Val Ala Arg Ala Glu Val Glu Ile Asn Ile Pro Val Thr Phe His Gly 515 520 525 Leu Phe Lys Lys Ser 530 <210> 2 <211> 1602 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtctatcc aggttgagca tcctgctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag 60 gaactgtcct cgccgctcac agctcatgta acaggcagga tccccctctg gctcaccggc 120 agtctccttc gatgtgggcc aggactcttt gaagttggat ctgagccatt ttaccacctg 180 tttgatgggc aagccctcct gcacaagttt gactttaaag aaggacatgt cacataccac 240 agaaggttca tccgcactga tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata 300 acagaatttg gcacctgtgc tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt 360 tcttactttc gaggagtaga ggttactgac aatgcccttg ttaatgtcta cccagtgggg 420 gaagattact acgcttgcac agagaccaac tttattacaa agattaatcc agagaccttg 480 gagacaatta agcaggttga tctttgcaac tatgtctctg tcaatggggc cactgctcac 540 ccccacattg aaaatgatgg aaccgtttac aatattggta attgctttgg aaaaaatttt 600 tcaattgcct acaacattgt aaagatccca ccactgcaag cagacaagga agatccaata 660 agcaagtcag agatcgttgt acaattcccc tgcagtgacc gattcaagcc atcttacgtt 720 catagttttg gtctgactcc caactatatc gtttttgtgg agacaccagt caaaattaac 780 ctgttcaagt tcctttcttc atggagtctt tggggagcca actacatgga ttgttttgag 840 tccaatgaaa ccatgggggt ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc 900 aataataaat acagaacttc tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac 960 aatgggtttc tgattgtgga tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac 1020 ttatatttag ccaatttacg tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct 1080 ccccaacctg aagttaggag atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc 1140 aagaatttag tcacgctccc caatacaact gccactgcaa ttctgtgcag tgacgagact 1200 atctggctgg agcctgaagt tctcttttca gggcctcgtc aagcatttga gtttcctcaa 1260 atcaattacc agaagtattg tgggaaacct tacacatatg cgtatggact tggcttgaat 1320 cactttgttc cagataggct ctgtaagctg aatgtcaaaa ctaaagaaac ttgggtttgg 1380 caagagcctg attcataccc atcagaaccc atctttgttt ctcacccaga tgccttggaa 1440 gaagatgatg gtgtagttct gagtgtggtg gtgagcccag gagcaggaca aaagcctgct 1500 tatctcctga ttctgaatgc caaggactta agtgaagttg cccgggctga agtggagatt 1560 aacatccctg tcacctttca tggactgttc aaaaaatctt ga 1602 <210> 3 <211> 533 <212> PRT <213> Chicken <400> 3 Met Tyr Ser Gln Val Glu His Pro Ala Gly Gly Tyr Lys Lys Leu Phe 1 5 10 15 Glu Thr Val Glu Glu Leu Ser Ser Pro Val Thr Ala His Val Thr Gly 20 25 30 Arg Ile Pro Thr Trp Leu Arg Gly Ser Leu Leu Arg Cys Gly Pro Gly 35 40 45 Leu Phe Glu Val Gly Ala Glu Pro Phe Tyr His Leu Phe Asp Gly Gln 50 55 60 Ala Leu Leu His Lys Phe Asp Phe Lys Glu Gly His Val Thr Tyr His 65 70 75 80 Arg Arg Phe Val Arg Thr Asp Ala Tyr Val Arg Ala Met Thr Glu Lys 85 90 95 Arg Ile Val Ile Thr Glu Phe Gly Thr Tyr Ala Tyr Pro Asp Pro Cys 100 105 110 Lys Asn Ile Phe Ser Arg Phe Phe Ser Tyr Phe Lys Gly Val Glu Val 115 120 125 Thr Asp Asn Ala Leu Val Asn Val Tyr Pro Val Gly Glu Asp Tyr Tyr 130 135 140 Ala Cys Thr Glu Thr Asn Phe Ile Thr Lys Ile Asn Pro Asp Thr Leu 145 150 155 160 Glu Thr Ile Lys Gln Val Asp Leu Cys Lys Tyr Val Ser Val Asn Gly 165 170 175 Ala Thr Ala His Pro His Val Glu Asn Asp Gly Thr Val Tyr Asn Ile 180 185 190 Gly Asn Cys Phe Gly Lys Asn Phe Ser Leu Ala Tyr Asn Ile Ile Arg 195 200 205 Ile Pro Pro Leu Gln Ala Asp Lys Glu Asp Pro Met Asn Lys Ser Glu 210 215 220 Val Val Val Gln Phe Pro Cys Ser Asp Arg Phe Lys Pro Ser Tyr Val 225 230 235 240 His Ser Phe Gly Leu Thr Pro Asn Tyr Ile Val Phe Val Glu Thr Pro 245 250 255 Val Lys Ile Asn Leu Leu Lys Phe Leu Ser Ser Trp Ser Leu Trp Gly 260 265 270 Ala Asn Tyr Met Asp Cys Phe Glu Ser Asn Glu Thr Met Gly Val Trp 275 280 285 Leu His Val Ala Glu Lys Lys Lys Gly Arg Leu Leu Asn Ile Lys Tyr 290 295 300 Arg Thr Ser Ala Phe Asn Leu Phe His His Ile Asn Thr Phe Glu Asp 305 310 315 320 Asn Gly Phe Leu Ile Val Asp Leu Cys Thr Trp Lys Gly Phe Glu Phe 325 330 335 Val Tyr Asn Tyr Leu Tyr Leu Ala Asn Leu Arg Ala Asn Trp Asp Glu 340 345 350 Val Lys Lys Gln Ala Glu Lys Ala Pro Gln Pro Glu Ala Arg Arg Tyr 355 360 365 Val Leu Pro Leu Arg Ile Asp Lys Ala Asp Thr Gly Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Leu Pro Tyr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Leu Arg Ser Asp Glu Thr 385 390 395 400 Val Trp Leu Glu Pro Glu Val Ile Phe Ser Gly Pro Arg His Ala Phe 405 410 415 Glu Phe Pro Gln Ile Asn Tyr Lys Lys Tyr Gly Gly Lys Pro Tyr Thr 420 425 430 Tyr Thr Tyr Gly Leu Gly Leu Asn His Phe Val Pro Asp Arg Leu Cys 435 440 445 Lys Leu Asn Val Lys Thr Lys Glu Thr Trp Val Trp Gln Glu 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Bovine <400> 10 atgtccatcc aagttgaaca tccagctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag 60 gaactatcct caccgctcac agcccatgtt acaggcagga tccccctctg gctgaccggc 120 agtctccttc gatgtgggcc aggactcttt gaagttggat cggaaccatt ttaccacctg 180 tttgatgggc aagccctcct gcacaagttt gactttaaag aagggcatgt cacataccac 240 agaaggttca tccgcactga tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata 300 acagaatttg gcacctgtgc tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt 360 tcttacttcc gaggagtgga ggttactgac aatgcccttg ttaatatcta cccagtgggg 420 gaagattact atgcctgcac agagaccaac ttcattacaa agattaatcc tgagaccttg 480 gaaacaatta agcaggttga cctttgcaac tatgtctcag ttaatggagc cactgctcac 540 ccccacattg aaaatgatgg gactgtttac aacattggta attgctttgg gaaaaatttt 600 tcaattgcct acaatattgt aaagatccca ccactacaag cagacaagga agatccaata 660 agcaagtcag agatcgttgt acaattcccc tgcagtgacc gattcaagcc atcttacgtc 720 catagttttg gtttgactcc caactatatt gtttttgtgg agacaccagt caaaattaat 780 ctattcaagt ttctttcttc atggagtctt tggggagcca actacatgga ttgttttgag 840 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<210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ccccctctgg ctccgcggca gtctccttc 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gaaggagact gccgcggagc cagaggggg 29 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ggttgatctt tgcaagtatg tctctgtc 28 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gacagagaca tacttgcaaa gatcaacc 28 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gattgtggat ctctgcacct ggaaaggatt tg 32 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 caaatccttt ccaggtgcag agatccacaa tc 32 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gcccaggagc aggaccaaag cctgcttatc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gataagcagg ctttggtcct gctcctgggc 30 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagaatttgg cacctatgct ttcccagatc cc 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gggatctggg aaagcatagg tgccaaattc tg 32 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gctgacaaaa aaaggggaaa gtacctcaat aataaataca g 41 <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 ctgtatttat tattgaggta ctttcccctt tttttgtcag c 41 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ctgaatgcca aggacatgag tgaagttgcc cgg 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ccgggcaact tcactcatgt ccttggcatt cag 33 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 ggactgttca aaaaagcttg agcatactcc agcaagc 37 <210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 gcttgctgga gtatgctcaa gcttttttga acagtcc 37 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cagaatttgg tacctgtgct ttcccag 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ctgggaaagc acaggtacca aattctg 27 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gggtttctga ttgtcgacct ctgctgctgg 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 ccagcagcag aggtcgacaa tcagaaaccc 30 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Chicken <400> 39 gcagttcccc tgcagtgaca gatttaag 28 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Chicken <400> 40 cttaaatctg tcactgcagg ggaactgc 28 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Chicken <400> 41 gtgaagtggc ccgggcagaa gtggagg 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Chicken <400> 42 cctccacttc tgcccgggcc acttcac 27

Claims (66)

  1. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17 중 적어도 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖고; 및 170번 및 297번 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부로서, 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 아소머로하이드롤라아제(isomerohydrolase) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  2. 제 1 항에 있어서,
    170번 위치의 상기 아미노산 치환은 Lys, Arg 또는 His이고; 및 297번 위치의 상기 아미노산 치환은 Gly 또는 Ala인 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  3. 제 1 항에 있어서,
    2번, 3번 및 26번 위치 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  4. 제 3 항에 있어서,
    2번 위치의 상기 아미노산 치환은 Tyr, Phe 또는 His이고; 3번 위치의 상기 아미노산 치환은 Ser, Thr 또는 Cys이며; 및 26번 위치의 상기 아미노산 치환은 Val, Ala 또는 Ile인 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  5. 제 1 항에 있어서,
    2번, 3번, 26번, 170번 및 297번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 돌연변이되지 않은 RPE65 단백질보다 큰 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 RPE65 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 소 RPE65보다 큰 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  8. 제 1 항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클 내에 배치되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  9. 제 1 항에 따른 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산.
  10. 제 9 항에 있어서,
    170번 위치의 아미노산 치환은 Lys, Arg 또는 His이고; 및 297번 위치의 아미노산 치환은 Gly 또는 Ala인 것을 특징으로 하는 핵산.
  11. 제 10 항에 있어서,
    돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 2번, 3번 및 26번 위치 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  12. 제 11 항에 있어서,
    2번 위치의 상기 아미노산 치환은 Tyr, Phe 또는 His이고; 3번 위치의 상기 아미노산 치환은 Ser, Thr 또는 Cys이며; 및 26번 위치의 상기 아미노산 치환은 Val, Ala 또는 Ile인 것을 특징으로 하는 핵산.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 2번, 3번, 26번, 170번 및 297번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  14. 제 9 항에 있어서,
    벡터 내에 배치되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터 또는 인핸서 서열; 또는 상기 핵산의 3'에 위치하는 정지 코돈 또는 폴리-A 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 RPE65 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 CMV 인핸서/닭 β-액틴 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 나노입자, 플라스미드 및 렌티바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  19. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터.
  20. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 AAV 벡터.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    상기 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 AAV 벡터.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 하나의 ITR 서열, 또는 이로부터의 ITR 서열의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 AAV 벡터.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV 캡시드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 AAV 벡터.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 AAV 캡시드 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 AAV 벡터.
  25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터를 생산하는 세포.
  26. 치료를 필요로 하는 포유동물 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 유전자 치료 방법에 있어서, 상기 방법은,
    돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는, 치료적 유효량의 벡터를 상기 대상에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 상기 대상의 망막 세포에서 체내에서 발현되고 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 핵산에 의해 코딩되는 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17 중 적어도 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖고; 및 170번 및 297번 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    170번 위치의 상기 아미노산 치환은 Lys, Arg 또는 His이고; 및 297번 위치의 상기 아미노산 치환은 Gly 또는 Ala인 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  29. 제 27 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 2번, 3번 및 26번 위치 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  30. 제 27 항에 있어서,
    2번 위치의 상기 아미노산 치환은 Tyr, Phe 또는 His이고; 3번 위치의 상기 아미노산 치환은 Ser, Thr 또는 Cys이며; 및 26번 위치의 상기 아미노산 치환은 Val, Ala 또는 Ile인 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  31. 제 26 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 돌연변이되지 않은 RPE65 단백질보다 큰 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  32. 제 26 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 RPE65 또는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 소 RPE65보다 큰 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  33. 제 26 항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질을 코딩하는 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터 또는 인핸서 서열을 더 포함하고; 또는 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질을 코딩하는 상기 핵산의 3'에 위치하는 정지 코돈 또는 폴리-A 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  34. 제 26 항에 있어서,
    상기 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 나노입자, 플라스미드 및 렌티바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  35. 제 26 항에 있어서,
    상기 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 AAV ITR 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 하나의 ITR 서열, 또는 이로부터의 ITR 서열의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  37. 제 26 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV 캡시드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 AAV 캡시드 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  39. 제 26 항에 있어서,
    상기 망막 변성과 관련된 질환은 레버 선천성 흑암시(Leber's Congenital Amaurosis) 또는 망막색소 변성증(Retinitis pigmentosa)인 것을 특징으로 하는 유전자 치료 방법.
  40. 치료를 필요로 하는 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    치료적 유효량의 적어도 하나의 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부를 상기 대상에 투여함으로써 상기 대상에서 망막 변성과 관련된 질환을 완화시키는 단계를 포함하고, 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 아소머로하이드롤라아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17 중 적어도 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖고; 상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 170번 및 297번 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    170번 위치의 상기 아미노산 치환은 Lys, Arg 또는 His이고; 및 297번 위치의 상기 아미노산 치환은 Gly 또는 Ala인 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  43. 제 41 항에 있어서,
    상기 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질은 2번, 3번 및 26번 위치 중 적어도 하나의 위치에서 아미노산 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  44. 제 41 항에 있어서,
    2번 위치의 상기 아미노산 치환은 Tyr, Phe 또는 His이고; 3번 위치의 상기 아미노산 치환은 Ser, Thr 또는 Cys이며; 및 26번 위치의 상기 아미노산 치환은 Val, Ala 또는 Ile인 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  45. 제 40 항에 있어서,
    상기 망막 변성과 관련된 질환은 레버 선천성 흑암시(Leber's Congenital Amaurosis) 또는 망막색소 변성증(Retinitis pigmentosa)인 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  46. 제 26 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  47. 제 26 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상은 18세 미만, 15세 미만, 12세 미만, 10세 미만, 대략 8세 내지 10세, 대략 6세 내지 10세, 대략 4세 내지 6세, 대략 1세 내지 3세 또는 1세 미만인 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  48. 제 26 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상은 RPE65 돌연변이에 의해 유발되는 망막 변성 또는 이영양증을 갖거나 가질 위험이 있는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  49. 제 26 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 대상의 하나 이상의 눈에 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  50. 제 26 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 상기 대상의 하나 이상의 눈의 망막하 공간(subretinal space) 및/또는 맥락막상 공간(suprachoroidal space)에 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  51. 제 26 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 AAV 벡터를 포함하고, 상기 대상의 하나 이상의 눈에 1×108 이상의 AAV 벡터 게놈이 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  52. 제 26 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 AAV 벡터를 포함하고, 상기 대상의 하나 이상의 눈에 대략 1×108 내지 대략 1×1014의 AAV 벡터 게놈이 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  53. 제 26 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터는 AAV 벡터를 포함하고, 상기 대상의 하나 이상의 눈에 대략 1×109 내지 대략 1×1013의 AAV 벡터 게놈이 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  54. 제 26 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 10 마이크로리터(μl) 내지 대략 1,000 μl의 부피로 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  55. 제 26 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 50 μl 내지 대략 800 μl의 부피로 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  56. 제 26 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 100 μl 내지 대략 600 μl의 부피로 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  57. 제 26 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 대략 200 μl 내지 대략 500 μl의 부피로 투여되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  58. 제 26 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터 또는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부는 상기 대상의 하나 이상의 눈의 망막 색소 상피 세포에 전달되거나 도입되는 것을 특징으로 하는 망막 변성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  59. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 및 서열번호 17 중 적어도 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖고; 및 야생형 인간 RPE65와 비교하여 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 2배 내지 대략 6배의 증가를 유발하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  60. 제 59 항에 있어서,
    상기 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 2배 내지 대략 6배의 증가는 시험관내 아소머로하이드롤라아제 활성 분석에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  61. 제 59 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 170번 위치에서 Lys, Arg 또는 His인 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  62. 제 59 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 297번 위치에서 Gly 또는 Ala인 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  63. 제 59 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 170번 위치에서 Lys, Arg 또는 His 치환 및 297번 위치에서 Gly 또는 Ala 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  64. 제 63 항에 있어서,
    상기 아미노산 치환은 야생형 인간 RPE65와 비교하여 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 3.2배의 증가를 유발하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  65. 제 59 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 아미노산 치환은, 170번 위치에서 Lys, Arg 또는 His 치환; 297번 위치에서 Gly 또는 Ala 치환; 2번 위치에서 Tyr, Phe 또는 His 치환; 3번 위치에서 Ser, Thr 또는 Cys 치환; 및 26번 위치에서 Val, Ala 또는 Ile 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
  66. 제 65 항에 있어서,
    상기 아미노산 치환은 야생형 인간 RPE65와 비교하여 아소머로하이드롤라아제 활성의 대략 4.4배의 증가를 유발하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 포유동물 RPE65 단백질 또는 이의 일부.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190038407A (ko) 2017-09-29 2019-04-08 주식회사 툴젠 망막 기능장애 질환 치료를 위한 유전자 조작
WO2019240431A1 (ko) * 2018-06-14 2019-12-19 (주) 에빅스젠 세포 투과 펩티드 및 rpe65의 융합 단백질을 포함하는 레버 선천성 흑암시 치료용 약학적 조성물

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287238B (zh) * 2016-04-11 2020-10-16 厦门继景生物技术有限责任公司 一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物
JP7067843B2 (ja) * 2016-04-28 2022-05-16 スパーク セラピューティクス インコーポレイテッド イソメロヒドロラーゼをコードするウイルスベクターについての相対効力アッセイ
CA3060578C (en) 2017-04-21 2020-07-21 Zenimax Media Inc. Systems and methods for encoder-guided adaptive-quality rendering
CN111118017B (zh) * 2018-11-01 2023-10-03 上海朗昇生物科技有限公司 治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用
WO2021007502A2 (en) * 2019-07-10 2021-01-14 Emendobio Inc. Differential knockout of a heterozygous allele of rpe65
WO2021064695A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Novartis Ag Methods for measuring cralbp activity
CN111876418B (zh) * 2020-07-17 2024-02-02 北京希诺因生物科技有限公司 先天性黑蒙模型犬的建立方法
CN116515908B (zh) * 2023-04-03 2024-04-26 苏州启辰生物科技有限公司 Rpe65基因编辑模型犬的建立方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5665577A (en) 1989-02-06 1997-09-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
US5817491A (en) 1990-09-21 1998-10-06 The Regents Of The University Of California VSV G pseusdotyped retroviral vectors
CA2162497A1 (en) 1993-06-10 1994-12-22 Sheila Connelly Adenoviral vectors for treatment of hemophilia
CA2206683A1 (en) 1994-12-12 1996-06-20 Genetic Therapy, Inc. Improved adenoviral vectors and producer cells
US5707865A (en) 1994-12-21 1998-01-13 Kohn; Donald B. Retroviral vectors for expression in embryonic cells
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
ZA969435B (en) 1995-11-16 1997-06-02 Antonomous University Of Barce Treatment of diabetes with a glucokinase gene
IT237434Y1 (it) 1997-04-17 2000-09-13 Philco Italiana Lavatrice con carrello per il suo spostamento
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
CA2337680A1 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Expression Genetics, Inc. Polyester analogue of poly-l-lysine as a soluble, biodegradable gene delivery carrier
WO2000015822A1 (en) 1998-09-17 2000-03-23 University Of Florida Methods for treatment of degenerative retinal diseases
GB0007291D0 (en) * 2000-03-24 2000-05-17 Univ York Control of aerial branching
EP1381276A4 (en) * 2001-04-13 2005-02-02 Univ Pennsylvania METHOD FOR TREATMENT OR DEVELOPMENT SLUDGE DEGRADATION
US20030003582A1 (en) * 2001-05-08 2003-01-02 Tranzyme, Inc. Trans-viral vector mediated gene transfer to the retina
RU2294192C2 (ru) 2001-05-30 2007-02-27 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Система доставки нуклеиновых кислот
US8323618B2 (en) 2007-11-07 2012-12-04 University Of Houston System Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles and uses thereof
US8785413B2 (en) 2010-09-27 2014-07-22 Florida Atlantic University Research Corporation Materials and methods for the treatment of pathological neovascularization in the eye
EP2699270B1 (en) * 2011-04-22 2017-06-21 The Regents of The University of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190038407A (ko) 2017-09-29 2019-04-08 주식회사 툴젠 망막 기능장애 질환 치료를 위한 유전자 조작
WO2019240431A1 (ko) * 2018-06-14 2019-12-19 (주) 에빅스젠 세포 투과 펩티드 및 rpe65의 융합 단백질을 포함하는 레버 선천성 흑암시 치료용 약학적 조성물

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