BR112017001909A2 - proteínas, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetores, célula, método de terapia gênica, método para tratar uma condição, uso de um vetor e uso de uma proteína de um mamífero mutante - Google Patents

Abstract

proteínas rpe65 de mamífero mutante e porções da mesma, e ácidos nucleicos que codificam os mutantes, para uso no tratamento de uma condição relacionada à degeneração da retina em um sujeito, as proteínas rpe65 de mamífero mutantes ou porções das mesmas tendo atividade de isomerohidrolase. um método de terapia gênica para tratar uma condição relacionada à degeneração da retina em um sujeito mamífero com necessidade desse tratamento, que compreende administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína rpe65 de mamífero mutante ou uma porção da mesma. um método para tratar uma condição relacionada à degeneração da retina em um sujeito com necessidade desse tratamento, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma dentre uma proteína rpe65 de mamífero mutante ou uma porção da mesma.

Description

“PROTEÍNAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ÁCIDO NUCLEICO, VETORES, CÉLULA, MÉTODO DE TERAPIA GÊNICA, MÉTODO PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO, USO DE UM VETOR E USO DE UMA PROTEÍNA DE UM MAMÍFERO MUTANTE” Referência Remissiva aos Pedidos de Depósitos Correlatos [0001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório de patente US 62/031.472, depositado em 31 de julho de 2014, cujo pedido é integralmente incorporado ao presente pedido como referência.

Introdução [0002] A proteína de 65-kDa específica do epitélio pigmentar da retina (RPE65) é essencial para o metabolismo da vitamina A nos olhos e para manutenção da visão normal. Ela é uma enzima importante do ciclo visual retinoide que catalisa a isomerização de ésteres de all-trans retinil para 11-cis retinol (11cROL), o precursor de cromóforo de pigmentos visuais. As mutações do gene RPE65 estão associadas com distrofias retinianas herdadas como Amaurose Congênita de Leber (LCA) e Retinite Pigmentosa (RP). A terapia anterior de substituição do gene RPE65 em mutantes nulos de RPE65 de modelos de cães e camundongos exibiram efeitos promissores na degeneração da retina. No entanto, RPE65 de mamíferos, como RPE65 humana (hRPE65), tem menor atividade específica do que outras enzimas que processam retinoides, e a alta abundância de RPE65 no RPE (11 pg/olho em bovinos) é, dessa forma, necessária para gerar retinoide 11 -cis suficiente para visão normal. Essa demanda para altos níveis de hRPE65 limita a eficácia da terapia gênica de RPE65.

[0003] Vários vetores para distribuição gênica, como adenovirus (AD), vírus adeno-associado recombinante (rAAV), lentivírus, plasmídeo incorporado em nanopartículas e DNA plasmidial com eletroporação têm sido usados para distribuir DNA intacto (ou gene repórter) para tecidos oculares. A

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2/50 distribuição gênica para o espaço subrretiniano com o uso de vetores AD e lentivirais que expressam GFP mostraram expressão de GFP amplamente distribuída. Ensaios clínicos humanos recentes com o uso de rAAV que expressa RPE65 humana tipo selvagem (wt) (rAAV-hRPE65) mostraram somente aprimoramentos modestos da visão em pacientes com RP e LCA. No entanto, nenhuma terapia gênica de RPE65 anterior gerou com êxito a recuperação completa da visão, apesar da distribuição gênica bem-sucedida.

Descrição Resumida da Invenção [0004] Os conceitos inventivos atualmente divulgados incluem, mas não se limitam a, proteínas RPE65 de mamífero mutantes e porções das mesmas que incluem sequências de aminoácidos que têm pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:

e SEQ ID NO: 17; e que tem atividade de isomerohidrolase; e que tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 170 e 297.

[0005] Em certas realizações não limitantes, a substituição de aminoácido na posição 170 pode ser Lys, Arg ou His.

[0006] Em certas realizações não limitantes, a substituição de aminoácido na posição 297 pode ser Gly ou Ala.

[0007] Em certas realizações não limitantes, a proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma pode incluir uma ou mais substituições de aminoácido nas posições 2, 3 e 26.

[0008] Em certas realizações não limitantes, a substituição de aminoácido na posição 2 pode ser Tyr, Phe ou His.

[0010] Em certas realizações não limitantes, a substituição de aminoácido na posição 3 pode ser Ser, Thr ou Cys.

[0011] Em certas realizações não limitantes, a substituição de aminoácido na posição 26 pode ser Vai, Ala ou lie.

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3/50 [0012] Em certas realizações não limitantes, a proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma pode incluir substituições em cada uma das posições 2, 3, 26, 170 e 297, que podem ser, por exemplo, as descritas no presente pedido.

[0013] Em certas realizações não limitantes, a proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma tem atividade de isomerohidrolase maior que a proteína RPE65 não mutada.

[0014] Em certas realizações não limitantes, a proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma tem atividade de isomerohidrolase maior que RPE65 humana que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou RPE65 bovina que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9.

[0015] Também são divulgadas no presente pedido composições farmacêuticas que incluem uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma descrita no presente pedido, dispostas em um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0016] Também são divulgados no presente pedido ácidos nucleicos que codificam uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma descrita no presente pedido.

[0017] Em certas realizações não limitantes, o ácido nucleico pode ser disposto dentro de um vetor.

[0018] Em certas realizações não limitantes, o vetor inclui um promotor ou sequência enhancer ligada de maneira funcional ao ácido nucleico e/ou inclui um códon de parada ou uma sequência Poli-A localizada 3’ do ácido nucleico.

[0019] Em certas realizações não limitantes, o vetor inclui uma sequência promotora de RPE65 que está ligada de maneira funcional ao ácido nucleico; e/ou inclui uma sequência enhancer de CMV/promotora de β-actina de

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4/50 galinha ligada de maneira funcional ao ácido nucleico.

[0020] Em certas realizações não limitantes, o vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em adenovirus, vírus adeno-associado (AAV), nanopartículas, plasmídeos e lentivírus.

[0021] Também são divulgados no presente pedido vetores AAV que incluem os ácidos nucleicos descrito no presente pedido.

[0022] Em certas realizações não limitantes, o vetor inclui uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.

[0023] Em certas realizações não limitantes, as sequências ITR de AAV incluem uma sequência ITR de qualquer uma dentre: sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8 AAV, ou uma mistura de sequências ITR a partir dessas.

[0024] Em certas realizações não limitantes, o vetor AAV inclui uma sequência de capsídeo de AAV.

[0025] Em certas realizações não limitantes, a sequência de capsídeo de AAV inclui uma sequência de capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 que tem pelo menos 90% de identidade às sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8.

[0026] Também são divulgadas células que produzem vetores de AAV dos conceitos inventivos atualmente divulgados.

[0027] Também são divulgados métodos de terapia gênica para tratar condições relacionadas à degeneração da retina em sujeitos mamíferos com necessidade desse tratamento, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de um vetor que inclui um ácido nucleico que codifica uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, em que a proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma é expressa in vivo em células da retina do sujeito e tem atividade de isomerohidrolase. O vetor, o

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5/50 ácido nucleico e a proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma usada nesses métodos de terapia gênica podem incluir as descritas no presente pedido.

[0028] Também são divulgados métodos para tratar condições relacionadas à degeneração da retina em sujeitos com necessidade desse tratamento, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou uma porção da mesma descrita no presente pedido, mitigando assim a condição relacionada à degeneração da retina no sujeito.

[0029] Em certas realizações não limitantes, a condição relacionada à degeneração da retina é Amaurose Congênita de Leber e Retinite Pigmentosa.

[0030] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o sujeito tratado é humano.

[0031] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o sujeito tem menos que 18 anos, menos que 15 anos, menos que 12 anos, menos que 10 anos, entre cerca de 8 a 10 anos, entre cerca de 6 a 10 anos, entre cerca de 4 a 6 anos, entre cerca de 1 a 3 anos ou menos que 1 ano de idade ou menor.

[0032] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o sujeito pode ter ou estar em risco de ter degeneração da retina ou distrofia causada pela mutação de RPE65.

[0033] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor empregado pode ser administrado para um ou mais olhos do sujeito.

[0034] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor empregado pode ser administrado ao espaço subrretiniano e/ou espaço supracoroidiano de um ou mais olhos do sujeito.

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6/50 [0035] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor empregado é um vetor AAV.

[0036] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, cerca de 1x10⁸ ou mais dos genomas do vetor AAV são administrados a um ou mais olhos do sujeito.

[0037] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, cerca de 1 χ 10⁸ a cerca de 1 χ 10¹⁴ ou mais dos genomas do vetor AAV são administrados a um ou mais olhos do sujeito.

[0038] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, cerca de 1 χ 10⁹ a cerca de 1 χ 10¹³ ou mais dos genomas do vetor AAV são administrados a um ou mais olhos do sujeito.

[0039] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma é administrada em um volume de cerca de 10 microlitros (pL) a cerca de 1.000 μΙ_.

[0040] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma é administrada em um volume de cerca de 50 pL a cerca de 800 pL.

[0041] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma é administrada em um volume de cerca de 100 pL a cerca de 600 pL.

[0042] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma é administrada em um volume de cerca de 200 pL a cerca de 500 pL.

[0043] Em certas realizações não limitantes dos métodos descritos no presente pedido, o vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma descrita no presente pedido é distribuída ou introduzida em células do epitélio pigmentar da retina de um ou mais olhos do sujeito.

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7/50 [0044]Certas realizações dos conceitos inventivos atualmente divulgados incluem, mas não se limitam a, proteínas RPE65 de mamífero mutantes e porções das mesmas que incluem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17; e que tem pelo menos uma substituição de aminoácido que resulta em um aumento de cerca de 2 vezes a um aumento de cerca de 6 vezes na atividade de isomerohidrolase, em comparação à RPE65 humana tipo selvagem.

[0045]Em certas realizações não limitantes, cerca de 2 vezes a cerca de 6 vezes de aumento na atividade de isomerohidrolase é determinado pelo ensaio de atividade de isomerohidrolase in vitro.

[0046]Em certas realizações não limitantes, a substituição de aminoácido é Lys, Arg ou His na posição 170; e/ou Gly ou Ala na posição 297.

[0047] Em certas realizações não limitantes, a(s) substituição(ões) de aminoácido(s) resultam em um aumento de cerca de 3,2 vezes na atividade de isomerohidrolase, em comparação à RPE65 humana tipo selvagem.

[0048]Em certas realizações não limitantes, as substituições de aminoácidos incluem uma substituição de Lys, Arg ou His na posição 170, uma substituição de Gly ou Ala na posição 297; uma substituição de Tyr, Phe ou His na posição 2; uma substituição de Ser, Thr ou Cys na posição 3; e uma substituição de Vai, Ala ou lie na posição 26.

[0049]Em certas realizações não limitantes, as substituições de aminoácidos resultam em um aumento de cerca de 4,4 vezes na atividade de isomerohidrolase, em comparação à RPE65 humana tipo selvagem.

Breve Descrição das Figuras [0050] Várias realizações dos conceitos inventivos atualmente

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8/50 divulgados são ilustradas nos desenhos anexos. No entanto, nota-se que somente os desenhos anexos ilustram várias realizações típicas e, portanto, não se destinam a serem considerados limitantes do escopo dos conceitos inventivos atualmente divulgados. Além disso, nos desenhos anexos, algarismos de referência parecidos ou idênticos podem ser usados para identificar elementos comuns ou similares, e nem todos esses elementos podem ser assim numerados. As figuras não estão necessariamente em escala, e certas características e certas vistas das figuras podem ser mostradas exageradas em escala ou em esquema pelo interesse de clareza e concisão.

[0051] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos de RPE65 (hRPE65) humana tipo selvagem (wt) e RPE65 de galinha (cRPE65). Resíduos de aminoácidos de cRPE65 idênticos aos de hRPE65 são indicadas como ponto [0052] As Figuras 2A a 2R mostram: (A) Sequência de aminoácidos de RPE65 humana tipo selvagem (SEQ ID NO: 1); (b) Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 humana (SEQ ID NO: 2); (C) Sequência de aminoácidos de RPE65 de galinha (SEQ ID NO: 3); (D). Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de galinha (SEQ ID NO: 4); (E) Sequência de aminoácidos de RPE65 de macaco comedor de caranguejo (crab-eating macaque) (SEQ ID NO: 5); (F) Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de macaco comedor de caranguejo (crab-eating macaque) (SEQ ID NO: 6); (G) Sequência de aminoácidos de RPE65 de macaco verde (green monkey) (SEQ ID NO: 7); (H) Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de macaco verde (green monkey) (SEQ ID NO: 8); (I) Sequência de aminoácidos de RPE65 de bovino (SEQ ID NO: 9); (J) Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de bovino (SEQ ID NO: 10); (K) Sequência de aminoácidos de RPE65 de cabra (SEQ ID NO: 11); (L) Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de cabra (SEQ ID NO: 12); (M) Sequência de aminoácidos de RPE65 de cão (SEQ ID NO:

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13) ; (N) Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de cão (SEQ ID NO:

14) ; (O) Sequência de aminoácidos de RPE65 de gato doméstico (SEQ ID NO:

15) ; (P). Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de gato doméstico (SEQ ID NO: 16); (Q) Sequência de aminoácidos de RPE65 de rato (SEQ ID NO:

17) ; e (R). Sequência de ácido nucleico que codifica RPE65 de rato (SEQ ID NO:

18) .

[0053]As Figuras 3A a 3D mostram: Expressão e atividades enzimáticas de RPE65 de humanos e de galinha. Os plasmideos que expressam wt hRPE65, cRPE65 e proteína de fluorescência vermelha (rfp, controle negativo) foram transfectados separadamente em células 293A-LRAT. Os níveis de expressão e atividades enzimáticas de hRPE65 e cRPE65 foram medidos por análise Western blot (A, Pc; proteína microssomal RPE de bovino (2,5 pg), Nc; Rfp, Hum; hRPE65 e Chk; cRPE65, 20 pg cada) e ensaio de atividade de isomerohidrolase in vitro, respectivamente. AII-trans-[³H] retinol (0,2 pM) foi incubado com 125 pg de proteína celular total a partir de células que expressam rfp (B), hRPE65 (C) e cRPE65 (D) por 2 h e os retinoides gerados foram analisados por HPLC. Pico 1, ésteres de retinil; 2, 11 cROL.

[0054] As Figuras 4A a 4G mostram: Impactos de mutações sítiodirigidas na atividade de isomerohidrolase e nível de proteína de RPE65. Os plasmideos que expressam wt hRPE65 e cRPE65, e os mutantes hRPE65 indicados foram transfectados separadamente em células 293A-LRAT e cultivados por 48 h. (A a D) A quantidade igual de proteínas totais a partir de lisados celulares (20 pg) foi usada para Western blotting com o uso de um anticorpo específico para RPE65, com um anticorpo anti-p-actina como controle de carga (A; único B; duplo, C; triplo e mutantes quádruplos no 1^o conjunto experimental, e D; único, E; mutantes duplos no 2^o conjunto experimental. Pc; controle positivo (proteína microssomal RPE bovina, 2,5 pg) Nc; controle negativo (proteína de fluorescência vermelha), WT; wt hRPE65). Os níveis de

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RPE65 foram semi-quantificados por densitometria e normalizados por níveis de β-actina. (F e G) Foram realizados ensaios de atividade in vitro com o mesmo lote de amostras de análises Western blot. Atividades isomerohidrolase foram quantificadas por 11-[³H]-cis retinol gerado de 3 medições independentes e normalizado por seus níveis de proteína RPE65 relativos. Os valores foram expressos como atividade relativa (% de atividade de wt hRPE65, média ± SEM, n = 3). Nas tabelas de atividade enzimática (F e G), os resíduos humanos (o) e de galinha (·) foram indicados como círculos branco e preto, respectivamente. Os números verticais indicam as posições de resíduos candidatos. As letras acima e abaixo do painel nas tabelas (F e G) representam resíduos de aminoácidos de hRPE65 e cRPE65 nas posições indicadas, respectivamente: por exemplo, “o···” na tabela do 1⁰ conjunto experimental (F) indica um mutante triplo (T39R/N170K/Q497P) de hRPE65.

[0055]As Figuras 5A a 5C mostram: Diagrama esquemático de mutantes RPE65 humanos quiméricos e de suas atividades enzimáticas. (A) As posições de sítios candidatos em cada fragmento e sítios de restrição específicos foram representados no diagrama (barra branca; hRPE65, barra cinza; cRPE65, F1 a F6; hRPE65 quimérico substituído pelo fragmento cRPE65 correspondente). (B) Níveis de expressão de hRPE65, cRPE65 e quimeras foram medidos por análise Western blot (Pc; 2,5 pg de proteína microssomal RPE bovina, 20 pg de proteína celular total de Hum; hRPE65, Chk; cRPE65, E, F1 a F6), e níveis de proteína de RPE65 foram semi-quantificados por densitometria óssea (C). As atividades enzimáticas foram medidas por ensaio de isomerohidrolase in vitro e quantificadas com o uso de 11-[³H]-cis retinol gerado e normalizado por seus níveis de proteína RPE65 relativos (C).

[0056] As Figuras 6A a 6B mostram: Impactos das mutações sítiodirigidas e substituição de fragmento por aqueles de cRPE65 nos níveis de proteína e atividades enzimáticas de hRPE65. Os mutantes sítio-dirigidos

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11/50 identificados neste estudo (N170K e K297G) e a quimera F1 foram combinados para produzir o mutante sIMH (F1/N170K/K297G). Os mutantes ponto identificados e a quimera F1 de RPE65 foram expressos em células 293A-LRAT. As células foram coletadas 48 h após a transfecção, e os níveis de proteína de RPE65 foram confirmados por análises Western blot (A). As atividades enzimáticas foram medidas por ensaio de isomerohidrolase in vitro e quantificados por 11-[³H]-cis retinol gerado (B). As atividades de isomerohidrolase foram quantificadas por 11-[³H]-cis retinol gerado (picomole/h) e apresentadas como % de atividade de wt hRPE65 (média ± SEM, n = 3).

[0057]As Figuras 7A a 7C mostram: Análises de eficiências catalíticas em wt hRPE65 e sIMH. Foram preparados adenovirus que expressam hRPE65 e sIMH. Foram expressos separadamente wt hRPE65 e sIMH em células 293A (sem LRAT) por 24 h em MOI 100 e suas expressões foram avaliadas por análise Western blot (A). Várias concentrações de substrato em lipossoma com lisados de proteína celular total (125 pg) foram aplicados em ensaios de enzima in vitro e Km e Vmáx de wt hRPE65 (B) e sIMH (C) foram calculados através do gráfico de Michaelis-Menten de geração 11cROL, respectivamente.

[0058] As Figuras 8A a 8C mostram: As localizações de Asn170 e Lys297, e do fragmento F1 em um modelo de estrutura 3D de RPE65. As localizações de dois resíduos chaves identificados e do fragmento F1 são mostradas no modelo 3D com base na estrutura cristalina de RPE65 de bovino (acesso PDB: 3FSN). O sítio de ligação de ferro, dentro do domínio catalítico, é indicado por um círculo pontilhado laranja. O segmento desordenado (Phe109Val126), que contém um resíduo Cys palmitilado (Cys112), é mostrado por uma linha pontilhada cor-de-rosa. A entrada do túnel hidrofóbico que contém o sítio ativo é indicada por um círculo pontilhado vermelho. A localização do fragmento F1 é indicada pela linha pontilhada amarela. Ambos os resíduos de Asn170 e

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Lys297 estão localizados na superfície da proteína (A e B) e mais de 20Â distante do ferro-ll no domínio catalítico potencial (C).

[0059] A Figura 9 mostra exemplos não limitantes de substituições de mutantes alternados em várias posições de sequências de RPE65 de mamíferos.

Descrição Detalhada da Invenção [0060] Antes de descrever várias realizações de mutantes de RPE65 e métodos dos conceitos inventivos atualmente divulgados em mais detalhes a título de descrição exemplar, exemplos e resultados, entende-se que os conceitos inventivos atualmente divulgados não são limitados no pedido para os detalhes de métodos e composições conforme apresentado na descrição a seguir. Os conceitos inventivos atualmente divulgados são capazes de outras realizações ou de serem praticados ou realizados de várias maneiras. Como tal, a linguagem usada no presente pedido tem a intenção de ser dada no mais amplo escopo e significado possível; e as realizações pretendem ser exemplares, não exaustivas. Além disso, entende-se que a fraseologia e a terminologia empregada no presente pedido é para o propósito de descrição e não devem ser consideradas como limitante a menos que indicado de outra forma como isso. Além disso, na descrição detalhada a seguir, são apresentados numerosos detalhes específicos a fim de fornecer uma compreensão mais completa da divulgação. No entanto, será normalmente evidente para um técnico no assunto que os conceitos inventivos atualmente divulgados podem ser praticados sem esses detalhes específicos. Em outros casos, as características que são normalmente bem conhecidas para o técnico no assunto não foram descritas em detalhes para evitar complicação desnecessária da descrição.

[0061] A menos que definido de outro modo no presente pedido, termos científicos e técnicos usados em conexão com os conceitos inventivos atualmente divulgados deverão ter os significados que são comumente

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13/50 entendidos pelos técnicos no assunto. Além disso, a menos que de outro modo exigido por contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.

[0062] Todas as patentes, pedidos de patentes publicados e publicações de não patentes mencionadas no relatório descritivo são indicativos do nível dos técnicos no assunto ao quais pertencem os conceitos inventivos atualmente divulgados. Todas as patentes, pedidos de patentes publicados e publicações de não patentes referenciadas em qualquer porção deste pedido são expressamente incorporadas em sua totalidade como referência no presente pedido na mesma extensão, como se cada patente individual ou publicação fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada como referência.

[0063] Todas as composições e métodos para produção e aplicação dos mesmos divulgados no presente pedido podem ser produzidos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos dos conceitos inventivos atualmente divulgados tenham sido descritos em termos de realizações particulares, será evidente para os técnicos no assunto que podem ser aplicadas variações para as composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito no presente pedido sem afastamento do conceito, espírito e escopo dos conceitos inventivos. Todos esses substitutos similares e modificações normalmente evidentes para os técnicos no assunto são considerados estarem dentro do espírito, do escopo e do conceito dos conceitos inventivos conforme definido no presente pedido.

[0064] Como utilizado de acordo com os métodos e composições da presente divulgação, os seguintes termos, a menos que indicado de outra forma, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

[0065] O uso da palavra “um” ou “uma” quando usada em conjunto

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14/50 com o termo “que compreende” nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar “um”, mas também é consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um” e “um ou mais de um”. O uso do termo “ou” nas reivindicações é usado para significar “e/ou” a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas somente ou quando as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere a somente alternativas e “e/ou”. O uso do termo “pelo menos um” será entendido como incluir um bem como qualquer quantidade maior que um, incluindo, mas não se limitando a, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 ou qualquer número inteiro inclusive nesse. O termo “pelo menos um” pode se estender até 100 ou 1000 ou mais, dependendo do termo para o qual é fixado; além disso, as quantidades de 100/1000 não devem ser consideradas como limitantes, uma vez que limites mais altos também podem produzir resultados satisfatórios. Além disso, o uso do termo “pelo menos um dentre X e Y e Z” será entendido como incluindo apenas X sozinho, Y sozinho e Z sozinho, bem como qualquer combinação de X, Y e Z.

[0066] Como usado neste relatório descritivo e reivindicação(ões), as palavras “que compreende” (e qualquer forma de compreensão, como “compreende” e “compreendem”), “ter” (e qualquer forma de ter, como “tem” e “têm”), “incluindo” (e qualquer forma de incluindo, como “inclui” e “incluem”) ou “que contém” (e qualquer forma de que contém, como “contém” e “contêm”) são inclusivas ou ilimitadas e não excluem elementos ou etapas de métodos adicionais e não descritas.

[0067] O termo “ou combinações do mesmo” como usado no presente pedido refere-se a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, “A, B, C ou combinações dos mesmos” tem a intenção de incluir pelo menos um dentre: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC e se a ordem é importante em um contexto específico, também BA, CA,

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CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, expressamente incluídas estão combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, como BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, e assim por diante. O técnico no assunto entenderá que tipicamente não há limite para o número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que de outro modo evidente a partir do contexto.

[0068] Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é usado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente para a composição, o método usado para administrar a composição ou a variação que existe entre os sujeitos do estudo.

[0069] Como usado no presente pedido, o termo “substancialmente” significa que o evento ou circunstância subsequentemente descrito ocorre completamente ou que o evento ou circunstância subsequentemente descrito ocorre em uma grande extensão ou grau. Por exemplo, o termo “substancialmente” significa que o evento ou circunstância subsequentemente descrito ocorre pelo menos 90% do tempo, ou pelo menos 95% do tempo, ou pelo menos 98% do tempo.

[0070] O termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se a compostos e composições que são adequados para administração a humanos e/ou animais sem efeitos colaterais adversos indevidos como toxicidade, irritação e/ou resposta alérgica proporcional a uma relação benefício/risco razoável.

[0071] Por “biologicamente ativo” entende-se a capacidade de modificar o sistema fisiológico de um organismo sem referência à como o agente ativo tem seu efeitos fisiológicos.

[0072] Como usado no presente pedido, “puro” ou “substancialmente puro” significa que uma espécie objeto é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar é mais abundante do que

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16/50 qualquer outra espécie objeto na composição da mesma), e particularmente uma fração substancialmente purificada é uma composição em que as espécies objeto compreendem pelo menos cerca de 50 por cento (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreende mais que cerca de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais particularmente mais que cerca de 85%, mais que cerca de 90%, mais que cerca de 95% ou mais que cerca de 99%. O termo “puro” ou “substancialmente puro” também se refere a preparações onde a espécie objeto (por exemplo, o composto de peptídeo) é pelo menos 60% (p/p) puro, ou pelo menos 70% (p/p) puro, ou pelo menos 75% (p/p) puro, ou pelo menos 80% (p/p) puro, ou pelo menos 85% (p/p) puro, ou pelo menos 90% (p/p) puro, ou pelo menos 92% (p/p) puro, ou pelo menos 95% (p/p) puro, ou pelo menos 96% (p/p) puro, ou pelo menos 97% (p/p) puro, ou pelo menos 98% (p/p) puro, ou pelo menos 99% (p/p) puro, ou 100% (p/p) puro.

[0073] Os termos “sujeito” e “paciente” são usados de forma intercambiável no presente pedido e serão entendidos como se referindo a um animal de sangue quente, particularmente um mamífero. Exemplos não limitante de animais dentro do escopo e do significado deste termo incluem cães, gatos, ratos, camundongos, porquinhos da índia, cavalos, cabras, gado, ovelha, animais de zoológico, macacos do Velho e do Novo Mundo, primatas não humanos e humanos. Em humanos, tanto adultos de 18 anos como maiores, e crianças menores de 18 anos, são apropriados para tratamento.

[0074] “Tratamento” refere-se a tratamentos terapêuticos. O termo “tratamento” refere-se à administração da composição a um paciente para propósitos terapêuticos.

[0075] “Prevenção” refere-se a medidas de tratamento profilático ou preventivo. Administração a um sujeito pode ser realizada antes do

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17/50 desenvolvimento de um sintoma adverso, condição, complicação, etc., causado ou associado com a doença. Por exemplo, uma triagem (por exemplo, genética) pode ser usada para identificar sujeitos candidatos para as composições e métodos dos conceitos inventivos atualmente divulgados. Portanto, esses sujeitos incluem os triados positivos para uma quantidade insuficiente ou uma deficiência em um produto gênico funcional (proteína) ou que produzem um produto gênico parcialmente funcional ou não funcional, anormal (proteína).

[0076] Os termos “composição terapêutica e “composição farmacêutica” referem-se a uma composição contendo agente ativo que pode ser administrada a um sujeito por qualquer método conhecido na técnica ou de outro modo contemplado no presente pedido, em que a administração da composição produz um efeito terapêutico conforme descrito em outra parte no presente pedido. Além disso, as composições do conceito inventivo atualmente divulgado podem ser projetadas para fornecer liberação atrasada, controlada, estendida e/ou sustentada com o uso de técnicas de formulação que são bem conhecidas na técnica.

[0077] O termo “quantidade efetiva” refere-se a uma quantidade de um agente ativo que é suficiente para exibir um efeito terapêutico detectável, sem efeitos colaterais adversos excessivos (como toxicidade substancial, irritação e resposta alérgica) proporcional com uma relação benefício/risco razoável quando usada na maneirados conceitos inventivos. O efeito terapêutico pode incluir, por exemplo, mas não a título de limitação, uma restauração parcial ou completa da visão. Por exemplo, para avaliar um efeito benéfico sobre a função visual/da retina, os ensaios de teste de função incluem eletroretinogramas (ERGS), pupilometria e testes comportamentais (por exemplo, um curso de obstáculos com variações de luz), antes e após tratamento.

[0078] A quantidade efetiva para um paciente dependerá do tipo de

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18/50 paciente, do tamanho e estado de saúde do paciente, da natureza e gravidade da condição a ser tratada, do modo de administração, da duração do tratamento, da natureza da terapia concomitante (se existir), das formulações específicas empregadas, e similares. Dessa forma, não é possível especificar uma quantidade efetiva exata antecipadamente. No entanto, a quantidade efetiva para uma dada situação pode ser determinada por um especialista na técnica com o uso de experimentação de rotina com base nas informações fornecidas no presente pedido.

[0079] O termo “atenuar” significa um aprimoramento detectável ou mensurável em uma doença do sujeito ou sintoma do mesmo. Um aprimoramento detectável ou mensurável inclui uma diminuição, redução, inibição, supressão, limite ou controle subjetivo ou objetivo na ocorrência, frequência, gravidade, progressão ou duração da doença, ou um aprimoramento em um sintoma ou uma causa subjacente ou uma consequência da doença, ou a uma reversão da doença.

[0080] Um desfecho de tratamento bem-sucedido pode levar a um “efeito terapêutico” ou “benefício” de diminuição, redução, inibição, supressão, limite, controle ou prevenção da ocorrência, frequência, gravidade, progressão ou duração de uma doença, ou consequências da doença em um sujeito. Métodos de tratamento e usos que afetam uma ou mais causas subjacentes da doença ou sintomas adversos são, portanto, considerados benéficos. Uma diminuição ou redução na piora, como estabilizar a doença, também é um desfecho bem-sucedido de tratamento.

[0081] Um benefício terapêutico, portanto, não precisa ser a ablação completa ou reversão da doença, ou qualquer uma, a maioria ou todos os sintomas adversos, complicações, consequências ou causas subjacentes associadas com a doença. Dessa forma, um desfecho satisfatório é obtido quando há um aprimoramento incrementai, como diminuição, redução, inibição,

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19/50 supressão, limite, de controlo ou prevenção parcial, na ocorrência, frequência, gravidade, progressão ou duração, ou inibição ou reversão da doença (por exemplo, estabilização), sobre uma longa ou curta duração de tempo (horas, dias, semanas, meses, etc.). A efetividade de um método ou uso, como um tratamento que fornece um benefício ou aprimoramento terapêutico potencial de uma doença, pode ser determinado por vários métodos, como ensaios de teste de função visual/da retina incluindo eletroretinogramas (ERGS), pupillometria e testes comportamentais após tratamento, etc.

[0082] O termo “homólogo” ou “% de identidade”, como usado no presente pedido, significa um ácido nucleico (ou fragmento do mesmo) ou uma proteína (ou um fragmento da mesma) que tem um grau de homologia para o ácido nucleico ou proteína de referência natural correspondente que pode ser mais que 70%, ou mais que 80%, ou mais que 85%, ou mais que 90%, ou mais que 91%, ou mais que 92%, ou mais que 93%, ou mais que 94%, ou mais que 95%, ou mais que 96%, ou mais que 97%, ou mais que 98%, ou mais que 99%. Por exemplo, no que diz respeito a peptídeos ou polipeptídeos, a porcentagem de homologia ou identidade conforme descrito no presente pedido é tipicamente calculada como a porcentagem de resíduos de aminoácidos encontrados na menor das duas sequências que se alinham com resíduos de aminoácidos idênticos na sequência sendo comparada, quando quatro gaps em um comprimento de 100 aminoácidos podem ser introduzido para auxiliar nesse alinhamento (conforme apresentado por Dayhoff no Atlas of Protein Sequence and Structure (1972) Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.). Em uma realização, a porcentagem de homologia conforme descrito acima é calculada como a porcentagem dos componentes encontrados na menor das duas sequências que também podem ser encontrados na maior das duas sequências (com a introdução de gaps), com um componente sendo definido como uma sequência de quatro aminoácidos contíguos. Também

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20/50 incluído como substancialmente homólogo é qualquer produto proteína que pode ser isolado em virtude de reatividade cruzada com anticorpos ao produto proteína nativa. A identidade de sequência ou homologia pode ser determinada comparando as sequências alinhadas de modo a maximizar a sobreposição e identidade, ao mesmo tempo minimizando gaps de sequência. Em particular, a identidade de sequência pode ser determinada com o uso de qualquer de uma série de algoritmos matemáticos. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático usado para comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin & Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 2264-2268, modificado como em Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 5873-5877.

[0083] Em uma realização “% de identidade” representa o número de aminoácidos ou nucleotídeos que são idênticos em posições correspondentes nas duas sequências de uma proteína que têm a mesma atividade ou que codificam proteínas similares. Por exemplo, duas sequências de aminoácido tendo cada uma 100 resíduos terá 95% de identidade quando 95 dos aminoácidos em posições correspondentes são os mesmos.

[0084] Outro exemplo de um algoritmo matemático usado para comparação de sequências é o algoritmo de Myers & Miller (1988) CABIOS, 4, 11-17. Esse algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que faz parte do pacote de programa de computação de alinhamento de sequência GCG. Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácido, pode ser usada uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade de comprimento de gap de 12 e uma penalidade de gap de 4. Ainda outro algoritmo útil para identificar regiões de similaridade e alinhamento de sequência local é o algoritmo FASTA, conforme descrito em Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448.

[0085] Outro algoritmo é o programa de computação WU-BLAST (Washington University BLAST) versão 2.0 (programas executáveis WU-BLAST

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2.0 versão 2.0 para várias plataformas UNIX). Este programa é baseado no WUBLAST versão 1.4, que por sua vez é baseado nas estatísticas de alinhamento global de domínio público NCBI-BLAST versão 1.4 (Altschul & Gish (1996)). Em Methods in Enzymology (R. Doolittle, ed.) 266, 460-480; Altschul et al. (1990) Journal of Molecular Biology, 215, 403-410; Gish & States (1993) Nature Genetics, 3: 266-272; Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877; todos os quais são incorporados ao presente pedido como referência.

[0086] Em adição a esses mencionados de outro modo no presente pedido, também é feita menção dos programas BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP e PSI-BLAST, fornecidos pelo National Center for Biotechnology Information. Esses programas são amplamente usados na técnica para esse propósito e podem alinhar regiões homólogas de duas sequências de aminoácidos. Em todos os programas de pesquisa no conjunto, as rotinas de alinhamentos espaçados (gapped) estão integradas ao próprio banco de dados de busca. Os espaçamentos (gapping) podem ser desativados, se desejável. A penalidade padrão (Q) para um gap de comprimento um é Q = 9 para proteínas e BLASTP, e Q = 10 para BLASTN, mas pode ser alterada para qualquer número inteiro. A penalidade por resíduo padrão para estender um gap (R) é R = 2 para proteínas e BLASTP, e R = 10 para BLASTN, mas pode ser alterada para qualquer número inteiro. Qualquer combinação de valores para Q e R pode ser usada para alinhar as sequências de forma a maximizar a sobreposição e identidade, ao mesmo tempo minimizando gaps de sequência. A matriz de comparação de aminoácido padrão é BLOSUM62, mas outras matrizes de comparação como PAM podem ser utilizadas.

[0087] Os termos “sequência de polinucleotídeos” ou “ácido nucleico”, como usado no presente pedido, incluem qualquer sequência de polinucleotídeos que codifica um produto proteína mutante RPE65 incluindo

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22/50 polinucleotídeos sob a forma de RNA, como mRNA, ou sob a forma de DNA, incluindo, por exemplo, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzidos por técnicas químicas sintéticas ou por uma combinação das mesmas. O DNA pode ser fita dupla ou fita simples. O DNA fita simples pode ser a fita codificadora, também conhecida como a fita sense, ou pode ser a fita não codificadora, também citada como a fita antisense. A sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína mutante, ou que codifica um fragmento de uma proteína mutante pode ser substancialmente a mesma que a sequência codificadora da sequência codificadora endógena, contanto que ela codifique um produto proteína mutante biologicamente ativo. Além disso, a proteína mutante, ou fragmento de uma proteína mutante, pode ser expressa com o uso de sequência(s) de polinucleotídeos(s) que diferem no uso de códon devido à degenerescência do código genético ou variações alélicas.

[0088] Os termos “infecção”, “transdução” e “transfecção” são usados de forma intercambiável no presente pedido e significam a introdução de um gene, ácido nucleico ou sequência de polinucleotídeos nas células, de modo que o produto proteína codificado seja expresso. Os polinucleotídeos dos conceitos inventivos atualmente divulgados podem compreender sequências adicionais, como sequências codificadoras adicionais dentro da mesma unidade de transcrição, elementos de controle como promotores, sítios de ligação do ribossomo, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controle dos mesmos ou de promotores diferentes, sequências que permitem a clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de um célula hospedeira, e qualquer constructo como desejável para fornecer realizações dos conceitos inventivos atualmente divulgados.

[0089] O termo “terapia gênica”, como usado no presente pedido, significa modificação genética de células pela introdução de DNA ou RNA exógeno nessas células para os propósitos de expressão ou replicação de um

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23/50 ou mais peptídeos, polipeptídeos, proteínas, oligonucleotídeos ou polinucleotídeos in vivo para o tratamento ou prevenção de doença ou deficiências em humanos ou animais. A terapia gênica é geralmente divulgada na patente US 5.399.346. Qualquer rota de administração adequada do ácido nucleico ou proteína pode ser empregada para fornecer um sujeito com composições farmacêuticas dos conceitos inventivos atualmente divulgados. Por exemplo, parenteral (subcutânea, subretinal, supracoroidal, intramuscular, venosa, transdérmica) e formas de administração similares podem ser empregadas. Formulações de dosagem incluem injeções, implantes ou outros métodos de distribuição de terapia gênica conhecidos e efetivos.

[0090] Veículos de distribuição genética (vetores) para os ácidos nucleicos que codificam um produto proteína dos conceitos inventivos atualmente divulgados incluem qualquer vetor adequado para promover expressão do produto proteína RPE65 mutante e podem compreender opcionalmente uma sequência promotora fixado de maneira funcional que é específica para células epiteliais de pigmento retiniano (por exemplo, consulte a patente US 8.785.413). Esses veículos de distribuição gênica são bem conhecidos na técnica para os técnicos no assunto; dessa forma, suas descrições detalhadas não são consideradas necessárias no presente pedido. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica um produto proteína dos conceitos inventivos atualmente divulgados pode estar contido nos vetores de vírus adenoassociados (por exemplo, conforme divulgado nas patentes US 5.139.941, 5.436.146 e 5.622.856), um vetor adenoviral atenuado ou fraco, (por exemplo, conforme divulgado em Morsy, M. A. e Caskey, C. T. (1999) Mol. Med. Today 5:18-24; e patente US 5.935.935), vetores lentivirais (como são divulgados nas patentes US 5.665.577, 6.013.516 e 5.994.136), vetores plasmídeos ou sintéticos (não virais) (como divulgado nas patentes US 4.394.448 e 5.676.954) e/ou nanopartículas (como divulgado, por exemplo, nas patentes US 6.217.912,

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7514098 e 8.323.618). Vetores virais alternativos incluem, mas não se limitam a, vetores retrovirais (como são divulgados nas patentes US 5.672.510, 5.817.491 e 5.707.865), vetores de vírus herpes (como são divulgados na patente US 5.288.641), e vetores de vírus Sindbis e vetores de papiloma vírus (como são divulgados na patente EP 820 773). Os vetores podem ser tanto monocistrônicos, bicistrônico como multicistrônicos.

[0091] Um vetor adenoviral pode incluir essencialmente o genoma adenoviral completo (Shenk, et al. (1984) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 111:139). De maneira alternativa, o vetor adenoviral pode ser um vetor adenoviral modificado em que pelo menos uma porção do genoma adenoviral foi deletado. Os vetores adenovirais podem ser produzidos de acordo com He, et al. (1998) PNAS, 95:2590-2514; Chartier, et al. (1996) J. Virol., 70:4805-4810; e Hitt, et al. (1995) Methods in Molecular Genetics, 7:13-30. Métodos de transferência de genes em células com o uso de vetores adenovirais foram descritos em PCT/US95/15947. Foi desenvolvida uma série de vetores adenovirais para a transdução de genes em células (Berkner, et al. (1988) BioTechniques 6:616629). Foi obtido alto nível de expressão constitutiva dos produtos gênicos transduzidos. Esses vetores têm a vantagem inerente sobre os vetores retrovirais em não necessitar de células de replicação para infecção, fazendo deles vetores adequados para terapia gênica somática (Mulligan, R. C. (1993) Science 260:926-932). Foi descrita a viabilidade para transduzir genes associados com metabolismo de glicose, usando-se transferência mediada por adenovirus em hepatócitos primários de rato e mioblastos em cultura (Baque, et al. (1994) Biochem. J. 304 (Pt 3):1009-1014; Gomez-Foix, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:25129-25134).

[0092] Vetores que podem ser usados nos métodos dos conceitos inventivos atualmente divulgados são também descritos em Narfstrom, et al. (2003) “Functional and structural recovery of the retina after gene therapy in the

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RPE65 null mutation dog”. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 1663-1672; Bennett, et al. (1994) “Adenovirus vector-mediated in vivo gene transfer into adult murine retina”. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35, 2535-2542; Zhang, et al. (2008) “Distinctive gene transduction efficiencies of commonly used viral vectors in the retina”. Curr. Eye Res. 33, 81-90; Weber, et al. (2003) “Recombinant adenoassociated virus serotype 4 mediates unique and exclusive long-term transduction of retinal pigmented epithelium in rat, dog, and nonhuman primate after subretinal delivery”. Mol. Ther., 7, 774-781; Yokoi, etal. (2007) “Ocular gene transfer with self-complementary AAV vectors”. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 48, 3324-3328; Auricchio, etal. (2001) “Exchange of surface proteins impacts on viral vector cellular specificity and transduction characteristics: the retina as a model”. Hum. Mol. Genet., 10, 3075-3081; Pang, etal. (2008) “Comparative analysis of in vivo and in vitro AAV vector transduction in the neonatal mouse retina: effects of serotype and site of administration”. Vision Res., 48, 377-385; Yanez-Munoz, etal., (2006) “Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors”. Nat. Med., 12, 348-353; Bemelmans, et al. (2006) “Lentiviral gene transfer of RPE65 rescues survival and function of cones in a mouse model of Leber congenital amaurosis”. PLoS Med., 3, 1892-1903; Miyoshi, etal. (1997) “Stable and efficient gene transfer into the retina using an HIV-based lentiviral vector”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10319-10323; Farjo, et al. (2006) Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNA nanoparticles. PLoS One, 1, e38; Kachi, et al. (2005) “Nonviral ocular gene transfer.” Gene Ther., 12, 843-851; e Johnson, etal. (2008) “Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes.” Mol. Vis., 14, 2211-2226.

[0093] Uma sequência de vetor recombinante (por exemplo, lenti-, parvo-, AAV) pode ser empacotada- citada no presente pedido como uma “partícula” para infecção subsequente (transdução) de uma célula, ex vivo, in vitro ou in vivo. Quando uma sequência de vetor recombinante é encapisulada

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26/50 ou empacotada em uma partícula de AAV, as partículas também podem ser citadas como um “rAAV”. Essas partículas incluem proteínas que encapisulam ou empacotam o genoma do vetor. Exemplos particulares incluem proteínas do envelope viral, e no caso de AAV, proteínas do capsídeo.

[0094] Um vetor “genoma” refere-se à porção da sequência de plasmídeo recombinante que em última análise é empacotado ou encapsulado para formar uma partícula viral (por exemplo, AAV). Nos casos em que os plasmídeos recombinantes são usados para construir ou fabricar vetores recombinantes, o genoma do vetor não inclui a porção do “plasmídeo” que não corresponde à sequência do genoma do vetor do plasmídeo recombinante. Esta porção do genoma sem vetor do plasmídeo recombinante é citada como o “esqueleto do plasmídeo”, que é importante para clonagem e amplificação do plasmídeo, um processo que é necessário para a produção de vírus recombinantes, mas não é por si só empacotada ou encapisulada nas partículas de vírus (por exemplo, AAV).

[0095] Dessa forma, um “genoma” do vetor refere-se à porção do plasmídeo vetor que é empacotada ou encapsulada (por exemplo, AAV) e que contém uma sequência que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento da mesma. A porção do genoma sem vetor do plasmídeo recombinante é o “esqueleto do plasmídeo”, que é importante para clonagem e amplificação do plasmídeo, por exemplo, tem um marcador selecionável, como Canamicina, mas não é por si só empacotada ou encapisulada por vírus (por exemplo, AAV).

[0096] Os vetores AAV podem ser qualquer soropositivo. Os sorotipos representativos incluem AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8.

[0097] Os vetores podem incluir elementos adicionais de ácido nucleico ou de proteínas. Por exemplo, um vetor AAV pode incluir uma ou duas sequências de repetição terminal invertida (ITR) do genoma de AAV mantidas

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27/50 no vetor AAV. Sequências de ITR podem compreender ou serem baseadas em ITRs a partir de qualquer sorotipo de AAV, incluindo, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8. Tipicamente, em um vetor AAV, o ácido nucleico que codifica a proteína RPE65 mutante ou fragmento (porção) da mesma é flanqueado por sequências 5’ e/ou 3’ de ITR de AAV.

[0098] Exemplos adicionais não limitantes de sequências de ácidos nucleicos incluem elementos de controle de expressão (por exemplo, um promotor, enhancer), introns, sequência de poli-adenina, códon de parada, etc. Essas sequências que incluem elementos de controle de expressão podem estar localizadas na extremidade 5’ (isto é, “a montante”), 3, (isto é, “a jusante”) da sequência transcrita ou dentro da sequência (por exemplo, em um íntron). Essas sequências que incluem elementos de controle de expressão podem estar localizadas adjacentes ou longe da sequência transcrita (por exemplo, 1 a 10,10 a 25, 25 a 50, 50 a 100, 100 a 500, ou mais nucleotídeos do polinucleotídeo), até mesmo em distâncias consideráveis.

[0099] Um exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um promotor, que geralmente está localizado 5’ da sequência do transcrito (uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento da mesma). Outro exemplo de um elemento de controle de expressão é um enhancer, que pode estar localizado 5’ e/ou 3’ da sequência do transcrito, ou dentro da sequência do transcrito.

[0100] Um “promotor” pode se referir a uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, DNA) que está localizada adjacente a uma sequência, como uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento da mesma. Um promotor tipicamente aumenta a quantidade de ácido nucleico expresso ao qual ele é ligado de maneira funcional em comparação a uma quantidade expressa quando não existe promotor.

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28/50 [0101] Um “enhancer” pode se referir a uma sequência que está localizada adjacente à sequência, como uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento da mesma. Tipicamente os elementos enhancer estão localizados a montante de um elemento promotor mas também funcionam e podem estar localizados a jusante de um promotor, ou estar dentro de uma sequência de DNA. Portanto, um elemento enhancer pode estar localizado em 10 a 25, 25 a 50, 50 a 100 100 a 200, 200 a 300 ou mais pares de base a montante ou a jusante de uma sequência que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento da mesma. Tipicamente os elementos enhancer também aumentam a expressão de uma sequência ligada de maneira funcional.

[0102] Como usado no presente pedido, o termo “ligação funcional” ou “ligado de maneira funcional” refere-se a uma justaposição física ou funcional dos componentes então descritos a fim de permitir que os mesmos funcionem da maneira pretendida. No exemplo de um elemento de controle de expressão em ligação funcional com um ácido nucleico, a relação é de modo que o elemento de controle module a expressão do ácido nucleico. Mais especificamente, por exemplo, duas sequências de DNA ligadas de maneira funcional significa que os dois DNAs estão dispostos (cis ou trans) nessa relação em que pelo menos uma das sequências de DNA é capaz de exercer um efeito fisiológico mediante a outra sequência.

[0103] Qualquer sequência promotora específica do epitélio pigmentar da retina pode ser usada com os ácidos nucleicos que codificam a proteína RPE65 mutante ou que codificam os fragmentos. A seleção do promotor a ser empregado pode ser feita entre um amplo número de promotores nativos, constitutivos ou induzíveis que podem expressar o ácido nucleico que codifica a proteína RPE65 mutante ou que codifica o fragmento, por exemplo, em um contexto ocular.

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29/50 [0104] Em uma realização, um promotor é célula-específico. O termo “célula-específico” significa que o promotor específico selecionado para o vetor recombinante pode direcionar expressão do transgene selecionado para um tipo de célula ocular específica. Como um exemplo, o promotor é específico para expressão em células RPE. Como outro exemplo, o promotor é específico para expressão em células fotoreceptoras.

[0105] Exemplos não limitantes representativos de promotores específicos de RPE incluem o promotor RPE-65, o inibidor de tecido de promotor metaloproteinase 3 (Timp3) e o promotor tirosinase. Ainda outros promotores específicos de RPE são conhecidos na técnica (Consulte, por exemplo, promotores descritos na publicação de patente internacional documento WO 00/15822).

[0106] Exemplos representativos não limitantes de promotores fotorreceptores incluem o promotor de opsina vermelha, o promotor de opsina vermelha-verde, o promotor de opsina azul, o promotor de proteína de ligação do interfotorreceptor (IRBP) e o promotor cGMP-.beta.-fosfodiesterase (Consulte, por exemplo, os promotores descritos na publicação de patente internacional documento WO 98/48097.

[0107] Elementos de controle de expressão incluem promotores/enhancers ubíquos ou promíscuos que são capazes de dirigir expressão em muitos tipos de células diferentes. Em uma realização específica, um promotor é constitutivo. Exemplos de promotores constitutivos não limitantes representativos incluem enhancer inicial imediato de citomegalovírus (CMV)/elemento éxon 1-intron 1 de promotor de β-actina (ΰβΑ) de galinha, sequências de promotor/enhancer de vírus de sarcoma de Rous (RSV), promotor/enhancer de LTR, promotor de SV40, promotor de CMV, promotor de diidrofolato redutase e promotor de fosfoglicerol quinase (PGK).

[0108] Os vetores AAV podem incluir capsídeos de qualquer

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30/50 soropositivo. Os sorotipos de capsideo AAV representativos incluem AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8. Os vetores AAV podem incluir quimeras ou variantes de qualquer soropositivo. Variantes de capsideo AAV específicas incluem variantes de capsídeos como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8, como a sequência de capsideo com uma substituição, deleção ou inserção/adição de aminoácido.

[0109] Em certas realizações dos conceitos inventivos atualmente divulgados, composições que compreendem uma proteína RPE65 mutante (e/ou um fragmento terapeuticamente efetivo da mesma) são fornecidas em um tratamento terapêutico. De maneira alternativa, composições que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína RPE65 mutante ou um fragmento podem ser fornecidas em um tratamento de terapia gênica. São também fornecidos métodos para produzir essas composições, juntamente com métodos de uso das mesmas. Em uma realização, as composições são utilizadas para o tratamento de doenças relacionadas à degeneração da retina (distrofias) ou condições em um sujeito, incluindo, mas não se limitando a Amaurose Congênita de Leber e Retinose Pigmentar (por exemplo, retinose pigmentar recessiva autossômica). Conforme observado, um método específico de tratamento específico é por terapia gênica, por exemplo, através de vírus adeno-associado, lentivírus, plasmídeo ou nanopartícula. Em certas realizações, o tratamento resulta em uma redução na ocorrência e/ou gravidade da perda de visão em um sujeito mamífero como um humano.

[0110] Em certas realizações, os tratamentos dos conceitos inventivos atualmente divulgados usam uma composição farmacêutica que compreende um vetor que expressa a proteína RPE65 mutante desejada ou fragmento in vivo sob condições apropriadas ou adequadas ou em uma célula hospedeira adequada. As composições farmacêuticas podem compreender,

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31/50 consistir essencialmente ou consistir em um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão (virais como AAV, lenti, etc), como vetores de expressão in vivo, que compreendem, consistem essencialmente em, ou que expressam um ácido nucleico que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento, em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável, excipiente e/ou veículo. Em certas realizações, o vetor compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, e pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento, em um carreador, excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável. Dessa forma, de acordo com uma realização dos conceitos inventivos atualmente divulgados, o(s) outro(s) vetor(es) na composição compreende(m) um ácido nucleico que codifica uma proteína RPE65 mutante ou fragmento.

[0111] O carreador farmaceuticamente aceitável, veículo e/ou excipiente facilita a transfecção e/ou aprimora a preservação do vetor. Qualquer carreador, veículo e excipiente farmaceuticamente aceitável conhecido na técnica ou, de outro modo, contemplado no presente pedido, pode ser utilizado de acordo com os conceitos inventivos atualmente divulgados. Por exemplo, mas não a título de limitação, um carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser água, uma solução de NaCI 0,9% (por exemplo, salina), ou um tampão fosfato. Outros carreadores, veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nos métodos dos conceitos inventivos atualmente divulgados incluem, mas não se limitam a, poli(L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. O carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitam a administração do vetor, aumentando o nível de expressão e/ou aumentando a duração da expressão.

[0112] Doses e volumes de dose são discutidos no presente pedido na descrição geral e também podem ser determinadas pelo técnico no assunto

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32/50 a partir dessa divulgação lida em conjunto com o conhecimento na técnica, sem qualquer experimentação indevida. Por exemplo, os volumes de dose podem estar entre cerca de 0,01 e cerca de 2 mL, como entre cerca de 0,02 e cerca de 1 mL. Volumes de dose mais particulares podem estar entre cerca de 0,05 e cerca de 0,80 mL, entre cerca de 0,10 e cerca de 0,60 mL, ou entre cerca de 0,20 e cerca de 0,50 mL.

[0113] Composições terapêuticas e/ou farmacêuticas, em realizações não limitantes, conter partículas virais por dose em uma faixa, por exemplo, de cerca de 10⁴ a cerca de 10¹¹ partículas, de cerca del O⁵ a cerca de 10¹⁰ partículas, ou de cerca de 10⁶ a cerca de 10⁹ partículas. No contexto de vetores AAV, os genomas de vetor são fornecidos em uma faixa de, por exemplo, cerca de 10⁴ a cerca de 10¹⁴ genomas de vetor, de cerca de 10⁵ a cerca de 10¹³ genomas de vetor, de cerca de 10⁶ a cerca de 10¹³ genomas de vetor, de cerca de 10⁷ a cerca de 10¹³ genomas de vetor, de cerca de 10⁸ a cerca de 10¹³ genomas de vetor ou de cerca de 10⁹ a cerca de 10¹³ genomas de vetor. Essas doses/quantidades de vetor AAV são úteis nos métodos apresentados no presente pedido.

[0114] Os conceitos inventivos atualmente divulgados contemplam pelo menos uma administração para um sujeito de uma quantidade efetiva da composição terapêutica produzida de acordo com os conceitos inventivos atualmente divulgados. Esta administração pode ser através de várias rotas incluindo, mas não se limitando a, intramuscular, subcutânea, intraocular, subconjuntival, subrretiniana, supracoroidal ou intravascular.

[0115] A título de ilustração, proteína RPE65 mutante ou fragmentos que são englobados pelas proteínas/ácidos nucleicos dos conceitos inventivos atualmente divulgados incluem, mas não se limitam a, proteína RPE65 mutante ou fragmentos que são codificados pelas sequências de nucleotídeos que não são exatamente as mesmas que as sequências de nucleotídeos

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33/50 divulgadas no presente pedido, mas em que as alterações nas sequências de nucleotídeos não alteram a sequência de aminoácidos codificados, ou simplesmente resultam em substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, deleção e/ou a adição de um ou alguns aminoácidos, substituição de resíduos de aminoácidos por análogos de aminoácidos que não afetam significativamente as propriedades dos polipeptídeos codificados, e similares. Exemplos de substituições de aminoácido conservativas incluem, mas não se limitam a, substituições de glicina/alanina; substituições de valina/isoleucina/leucina; substituições de asparagina/glutamina; substituições de ácido aspártico/ácido glutâmico; substituições de serina/treonina metionina; substituições de lisina/arginina/histidina e substituições de fenilalanina/tirosina/triptofano.

[0116] Consequentemente, também incluídos nos conceitos inventivos atualmente divulgados são as proteínas RPE65 mutantes e fragmentos nos quais pelo menos um resíduo de aminoácido foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Para uma descrição detalhada da química da proteína e estrutura, consulte Schulz, G. E. etal. (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nova Yorke Creighton, T. E. (1984) Proteins: Structure and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., São Francisco. Os tipos de substituições que podem ser feitas são substituições conservativas e são definidas no presente pedido como trocas dentro de um dos seguintes grupos: (1) Resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares: por exemplo, Ala, SerThr, Gly; (2) Polar, resíduos negativamente carregados e suas amidas: por exemplo, Asp, Asn, Glu, Gin; e (3) Polar, resíduos positivamente carregados: por exemplo, His, Arg, Lys. Pro, devido à sua geometria incomum, restringe firmemente a cadeia. Alterações substanciais em propriedades funcionais são feitas selecionando substituições que são menos conservadoras, como entre, ao invés de dentro, dos grupos acima (ou dois outros grupos de

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34/50 aminoácidos não mostrados acima), que irão diferir mais significativamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto peptídico na área da substituição (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) da maior parte da massa da cadeia lateral. A maioria das substituições de acordo com os conceitos inventivos atualmente divulgados são aquelas que não produzem alterações radicais nas características da proteína. Mesmo quando é difícil predizer o efeito exato de uma substituição antes de fazê-la, o técnico no assunto entenderá que o efeito pode ser avaliado por ensaios de triagem de rotina, como um ensaio de atividade apresentado no presente pedido (por exemplo, o ensaio de atividade isomerohidrolase). Modificações de propriedades do peptídeo incluindo estabilidade redox ou térmica, hidrofobicidade, suscetibilidade à degradação proteolítica ou a tendência a se agregar com carreadores ou em multímeros são analisadas por métodos conhecidos para o técnico no assunto.

[0117] Outros tipos de substituições, variações, adições, deleções e derivados que resultam em proteína RPE65 mutante funcional ou fragmentos e homólogos, conforme descrito acima, também são englobados pelos conceitos inventivos atualmente divulgados, e um técnico no assunto sabería facilmente como fazer, identificar ou selecionar essas variantes ou derivados e como testar quanto à atividade de RPE65 dessas variantes ou derivados. Um técnico no assunto normalmente pode otimizar a expressão da proteína RPE65 mutante ou fragmentos de polipeptídeos dos conceitos inventivos atualmente divulgados para aprimorar expressão por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a, remover sítios de splice crípticos, adaptar o uso de códon introduzindo uma sequência consenso Kozak antes do códon de iniciação, alterar o uso de códon ou qualquer combinação dos mesmos.

[0118] Em certas realizações, os conceitos inventivos atualmente divulgados compreendem uma variante de ácido nucleico que tem identidade ou

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35/50 homologia de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% até pelo menos uma ou mais dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18, e que codifica uma proteína RPE65 mutante que tem identidade ou homologia de pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% a um polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17, e que inclui pelo menos uma ou mais substituições de aminoácidos descritas no presente pedido, como uma ou mais dentre as descritas na Figura 9.

[0119] Em algumas realizações, o DNA que codifica a proteína RPE65 mutante ou fragmento é um DNA que hibridiza com um DNA tipo selvagem descrito no presente pedido (por exemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 18) sob condições estringentes. Por “DNA que hibridiza sob condições estringentes” entende-se DNA obtido por hibridização de colônia, hibridização em placa ou hibridização por Southern blot com o uso de DNA que codifica proteína RPE65, especificamente incluindo DNA identificado após hibridização, com o uso de um filtro no qual DNA derivado de colônia ou placa foi imobilizado na presença de NaCI 0,7 a 1,0 M a 65^QC , e lavagem do filtro resultante com o uso de soluções 0,1 x a 2X SSC (a composição de solução 1x SSC compreende cloreto de sódio 150 mM e citrato de sódio 15 mM) a 65^QC. A hibridação pode ser realizada de acordo com um método descrito, por exemplo, em Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^a edição (Sambrook, Fritsch, & Maniatis eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

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36/50 [0120] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente pedido têm o mesmo significado como comumente compreendido por um técnico no assunto para o qual pertencem estes conceitos inventivos atualmente divulgados. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente pedido possam ser usados na prática ou testes dos conceitos inventivos atualmente divulgados da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos no presente pedido.

[0121] Abreviações usadas no presente pedido incluem: 11cROL, 11-cis retinol; AD, adenovirus; BTP, 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino] propano; cRPE65, RPE65 de galinha; HPLC, cromatografia líquida de alto desempenho; hRPE65, RPE65 humana; LCA, Amaurose Congênita de Leber; PVDF, fluoreto de polivinilideno; rAAV, vírus adeno-associado recombinante; RFP, proteína fluorescente vermelha; RPE, epitélio pigmentarda retina; RPE65, proteína de 65 kDa específica para RPE; RP, Retinite Pigmentosa; TBST, solução salina tamponada Tris com Tween-20 0,1%; wt, tipo selvagem.

[0122] Todas as aplicações, publicações, patentes e outras referências, citações no GenBank e citações no ATCC citadas no presente pedido são incorporadas ao presente pedido como referência. No caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo definições, irá controlar.

[0123] Todos as características divulgadas no presente pedido podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica divulgada no relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que serve para o mesmo propósito, equivalente ou similar. Dessa forma, a menos que expressamente indicado de outro modo, características divulgadas (por exemplo, ácido nucleico, vetor, plasmídeo, um vetor recombinante (por exemplo, rAAV), genoma de vetor ou partículas virais) são um exemplo de um gênero de características equivalentes ou similares.

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37/50 [0124] Conforme observado acima, como usado no presente pedido, as formas singulares “um/uma”, “e” e “o/a” incluem referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Dessa forma, por exemplo, referência a um “ácido nucleico” inclui uma pluralidade desses ácidos nucleicos, referência a “um vetor” inclui uma pluralidade desses vetores, e referência a “um vírus” ou “partícula” inclui uma pluralidade desses vírions/partículas.

[0125] Como usado no presente pedido, todos os valores numéricos ou faixas numéricas incluem números inteiros dentro dessas faixas e frações dos valores ou dos números inteiros dentro das faixas, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Dessa forma, para ilustrar, referência a 80% ou mais de identidade, inclui 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% etc., bem como 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5%, etc., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5%, etc., e assim por diante.

[0126] Referência a um número inteiro com mais (superior) ou menos que inclui qualquer número maior ou menor que o número de referência, respectivamente. Dessa forma, por exemplo, referência a menor que 100 inclui 99, 98, 97, etc., o tempo todo até o número 1 (um); e menor que 10 inclui 9, 8, 7, etc., o tempo todo até o número 1 (um).

[0127] Como usado no presente pedido, todos os valores numéricos ou faixas incluem frações dos valores e números inteiros dentro dessas faixas e frações dos números inteiros dentro dessas faixas, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Dessa forma, para ilustrar, referência a uma faixa numérica, como 1 a 10 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., e assim por diante. Referência a uma faixa de 1a 50 inclui, portanto 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., até e incluindo 50, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., 2,1, 2,2,

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2,3, 2,4, 2,5, etc., e assim por diante.

[0128] Referência a uma série de faixas inclui faixas que combinam os valores dos limites de diferentes faixas dentro da série. Dessa forma, para ilustrar a referência a uma série de faixas, por exemplo, de 1 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 75, 75 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 400, 400 a 500, 500 a 750, 750 a 1.000, 1.000 a 1.500,

1.500 a 2.000, 2.000 a 2.500, 2.500 a 3.000, 3.000 a 3.500, 3.500 a 4.000, 4.000 a 4.500, 4.500 a 5.000, 5.500 a 6.000, 6.000 a 7.000, 7.000 a 8.000, ou 8.000 a 9.000, inclui faixas de 1 a 20, 10 a 50, 50 a 100, 100 a 1.000, 1.000 a 3.000, 2.000 a 4.000, etc.

[0129] Os conceitos inventivos atualmente divulgados serão mais facilmente entendidos por referência aos seguintes exemplos e realizações, que são incluídos simplesmente para fins de ilustração de certos aspectos e realizações dos conceitos inventivos atualmente divulgados, e não se destinam a limitar. Os seguintes exemplos e métodos detalhados descrevem como fazer e usar as várias proteínas mutantes dos conceitos inventivos atualmente divulgados e devem ser entendidos, conforme observado acima, somente como ilustrativo e não limitações da divulgação de qualquer forma que seja. Os técnicos no assunto rapidamente reconhecerão variações apropriadas dos materiais e procedimentos descritos no presente pedido.

[0130] RPE65 cone-dominante de galinha (cRPE65 - SEQ ID NO: 3) é conhecida por possuir atividade de isomerohidrolase substancialmente maior que a de RPE65 humana (hRPE65-SEQ ID NO: 1), RPE65 de bovino (bRPE65 - SEQ ID NO: 9) ou outra proteína RPE65 de mamífero. Conforme explicado em detalhes abaixo, as atividades enzimáticas de cRPE65, hRPE65 e mutantes de hRPE65 foram medidas pelo ensaio de atividade de isomerohidrolase in vitro, e os produtos retinoides foram analisados por HPLC. Entre os mutantes dos conceitos inventivos atualmente divulgados analisados

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39/50 no presente pedido, dois mutantes de ponto únicos, N170K e K297g e um duplo mutante N170K/K297G de hRPE65 exibiram atividade catalítica significativamente maior do que de wt hRPE65. Além disso, quando um fragmento terminal amino (aminoácidos -|^Met-33^Arg) q₀ duplo mutante N170K/K297G de hRPE65 foi substituído pelo fragmento de resíduo cRPE65 33 N-terminal correspondente, a atividade de isomerohidrolase foi ainda aumentada até um nível similar àquele de cRPE65. Esta combinação mutante de isomerohidrolase altamente eficiente (S2Y/l3S/L26V/N170K/K297G-também descrito abaixo) pode ser usada, em certas realizações de terapia gênica de RPE65 da presente divulgação para melhorar a visão em sujeitos mamíferos que têm ou estão em risco de ter degeneração da retina causada por mutações RPE65, incluindo, mas não se limitando a humanos.

[0131] No trabalho atualmente divulgado, com o uso de mutagênese sítio-dirigida, uma série de resíduos de hRPE65 foram substituídos por suas contrapartes posicionais de cRPE65 (alinhamento mostrado na Figurai) e as atividades de isomerohidrolase avaliadas dos hRPE65 mutantes gerados. Os resultados são mostrados e discutidos abaixo.

Procedimentos Experimentais Mutagênese Sítiq-Dirigida [0132]CDNAs que codificam proteína hRPE65 tipo selvagem (wt) (SEQ ID NO: 1) e proteína cRPE65 (SEQ ID NO: 3) foram subclonado em vetores de clonagem conforme descrito anteriormente (Moiseyev, et al. (2005) “RPE65 Is the Isomerohydrolase in the Retinoid Visual Cycle.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 12413-12418; e Moiseyev, et al. (2008) “RPE65 from Cone-dominant Chicken Is a More Efficient Isomerohydrolase Compared with That from Roddominant Species”. J. Biol. Chem., 283, 8110-8117). Resíduos selecionados em hRPE65 foram substituídos por suas contrapartes em cRPE65 com o uso do kit de mutagênese sítio-dirigida QuickChange (Stratagene, La Jolla, CA) após o

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40/50 protocolo do fabricante. As mutações introduzidas foram confirmadas por sequenciamento de ambas as fitas com o uso do sequenciador de DNA ABI3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA) e subclonadas em um vetor de expressão, pcDNA3.1 (-) (Invitrogen Carlsbad, CA). Após a combinação de sequências, os constructos de expressão foram purificados pelo kit QIAfilter Maxi Prep (Qiagen, Valencia, CA). Além disso, o cDNA de hRPE65 (SEQ ID NO: 2) e cDNAde cRPE65 (SEQ ID NO: 4) foram individualmente subclonados no pUC18. Para gerar 6 fragmentos de restrição de hRPE65 e cRPE65, sítios de enzimas de restrição únicos foram introduzidos sem alterar a sequência de aminoácidos (consulte Figura 5A). Cada fragmento de hRPE65 foi substituído por sua contraparte de cRPE65 com o uso de sítios de enzimas de restrição introduzidos. Todos os conjuntos de primers (SEQ ID NOS: 19 a 42) usados nesse estudo são mostrados na Tabela 1.

Tabelai

Conjuntos de Primers

Nome	Sequência	SEQ ID NO.
Hum T39R-Fwd	5’-CCCCCTCTGGCTCCGCGGCAGTCTCCTTC-3’	SEQ ID NO: 19
Hum T39R-Rev	5'-GAAGGAGACTGCCGCGGAGCCAGAGGGGG-3'	SEQ ID NO: 20
Hum N170K-Fwd	5'-GGTTGATCTTTGCAAGTATGTCTCTGTC-3'	SEQ ID NO: 21
Hum N170K-Rev	5'-GACAGAGACATACTTGCAAAGATCAACC-3'	SEQ ID NO: 22
Hum C330T-Fwd	5'-GATTGTGGATCTCTGCACCTGGAAAGGATTTG-3'	SEQ ID NO: 23
Hum C330T-Rev	5'-CAAATCCTTTCCAGGTGCAGAGATCCACAATC-3'	SEQ ID NO: 24
Hum Q497P-Fwd	5'-GCCCAGGAGCAGGACCAAAGCCTGCTTATC-3'	SEQ ID NO: 25
Hum Q497P-Rev	5'-GATAAGCAGGCTTTGGTCCTGCTCCTGGGC-3'	SEQ ID NO: 26
Hum C106Y-Fwd	5'-CAGAATTTGGCACCTATGCTTTCCCAGATCCC-3'	SEQ ID NO: 27
Hum C106Y-Rev	5'-GGGATCTGGGAAAGCATAGGTGCCAAATTCTG-3'	SEQ ID NO: 28
Hum K297G-Fwd	5'-GCTGACAAAAAAAGGGGAAAGTACCTCAATAATAAATACAG-3'	SEQ ID NO: 29
Hum K297G-Rev	5'-CTGTATTTATTATTGAGGTACTTTCCCC I I I I I I I G I CAGC-3’	SEQ ID NO: 30
Hum L510M-Fwd	5'-CTGAATGCCAAGGACATGAGTGAAGTTGCCCGG-3'	SEQ ID NO: 31
Hum L510M-Rev	5'-CCGGGCAACTTCACTCATGTCCTTGGCATTCAG-3'	SEQ ID NO: 32
Hum S533A-Fwd	5'-GGACTGTTCAAAAAAGCTTGAGCATACTCCAGCAAGC-3'	SEQ ID NO: 33
Hum S533A-Rev	5'-GCTTGCTGGAGTATGCTCAAGC I I I I I IGAACAGTCC-3’	SEQ ID NO: 34
Hum Kpnl-Fwd	5'-CAGAATTTGGTACCTGTGCTTTCCCAG-3'	SEQ ID NO: 35
Hum Kpnl-Rev	5'-CTGGGAAAGCACAGGTACCAAATTCTG-3'	SEQ ID NO: 36
Hum Sall-Fwd	5'-GGGTTTCTGATTGTCGACCTCTGCTGCTGG-3'	SEQ ID NO: 37
Hum Sall-Rev	5'-CCAGCAGCAGAGGTCGACAATCAGAAACCC-3'	SEQ ID NO: 38

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Nome	Sequência	SEQ ID NO.
ChkPstl-Fwd	5'-GCAGTTCCCCTGCAGTGACAGATTTAAG-3'	SEQ ID NO: 39
ChkPstl-Rev	5'-CTTAAATCTGTCACTGCAGGGGAACTGC-3'	SEQ ID NO: 40
Chk Smal-Fwd	5'-GTGAAGTGGCCCGGGCAGAAGTGGAGG-3'	SEQ ID NO: 41
Chk Smal-Rev	5’-CCTCCACTTCTGCCCGGGCCACTTCAC-3’	SEQ ID NO: 42

Transfecção de Plasmídeo [0133] Plasmídeos construídos que expressam wt hRPE65, cRPE65 e os mutantes hRPE65 foram purificados com o uso de um kit QIAfilter Maxi Prep (Qiagen, Valencia, CA) e transfectados em células 293A-LRAT, uma linhagem celular estável que expressa LRAT humano (45), com o uso de reagente de transfecção Fugene 6 (Roche, Indianápolis, IN) ou polietilenimina (PEI, Polysciences, Inc., Warrington, PA; 1 mg/mL, pH 7,4, 2:1 de razão PEI:DNA), e os meios de cultura foram substituídos em 6 h após a transfecção. Em 48 horas após transfecção, as células foram coletadas por raspadores de células e enxaguadas duas vezes com PBS gelado. Os níveis de proteínas e atividades enzimáticas de wtRPE65 e seus mutantes foram confirmados por análises Western blot e ensaio de atividade de isomerohidrolase in vitro.

Análise Western Blot [0134] As concentrações de proteína celular totais foram medidas com o uso de um ensaio Bradford. Quantidades iguais de proteínas celulares totais (20 pg) de células 293A-LRAT que expressam wt hRPE65 e cRPE65, e mutantes hRPE65 e proteínas microssômicas bovinas RPE (2,5 pg) como controle positivo foram resolvidas por eletroforese através de 8% tampão gel de poliacrilamida SDS Tris-glicina e eletrotransferidas sobre uma membrana de PVDF immobilon (Millipore, Billerica, MA), a menos que especificado. A membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado 5% (p/vol) em TBST (solução salina tamponada com Tris com Tween-20 0,1%) por 30 minutos e subsequentemente incubada durante a noite a 4^QC com uma diluição de 1:1.000 de um anticorpo policlonal anti-RPE 65 (por exemplo, consulte Ma, et al. (2001) “Expression, purification, and MALDI analysis of RPE65.” Invest. Ophthalmol.

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Vis. Sci., 42, 1429-1435) para identificar os principais resíduos e diluição de 1:50.000 de um anticorpo monoclonal anti-p-actina (Sigma-Aldrich Louis, MO). Usamos outro anticorpo RPE65 (Moiseyev, et al. (2008) “RPE65 from Conedominant Chicken Is a More Efficient Isomerohydrolase Compared with That from Rod-dominant Species”. J. Biol. Chem., 283, 8110-8117) para comparar os níveis de expressão de cRPE65 e mutantes quiméricos de RPE65 para evitar a diferença de imunorreatividade no fragmento 3. Após quatro lavagens com TBST, a membrana foi incubada em um recipiente com proteção contra luz por

1,5 h com diluição 1:25.000 de IgG de cabra anti-camundongo conjugada com DyLight-549 e IgG de cabra anti-coelho conjugada com DyLight-649 (Pierce, Rockford, IL) e as bandas foram detectados com o uso do sistema de formação de imagens FluorChem Q (Alphalnnotech, San Leandro, CA). As intensidades de sinal foram semi-quantificadas por densitometria óssea com o uso do programa de computação AlphaView Q (Alphalnnotech, San Leandro, CA), e calculadas a partir de pelo menos 3 experimentos independentes.

Ensaio de Atividade de Isomerohidrolase [0135] As células 293A-LRAT foram transfectadas separadamente com plasmídeos que expressam RPE65 wt humana e de galinha e hRPE65 mutantes. As células 293A-LRAT que expressam proteína fluorescente vermelha (rfp) foram usadas como um controle negativo. As células foram lisadas por sonicação em um tampão de reação (1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino] propano (BTP) 10 mM, pH 8,0, NaCI 100 mM). All-trans [11,12-³H]-retinol (1 mCi/mL, 45,5 IC/mmol, American Radiolabeled Chemical, Inc., St. Louis, MO) em Ν,Ν-dimetil formamida foi usado como substrato para o ensaio de isomerohidrolase. Para cada reação, as proteínas celulares totais (125 pg) foram adicionadas em 200 pL de tampão de reação (BTP 10 mM, pH 8,0, NaCI 100 mM) contendo 0,2 pM de all-trans retinol, BSA 1% e 25 pM de proteína celular de ligação ao aldeído da retina. A reação foi interrompida e os retinoides tópicos

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43/50 foram extraídos com 300 μΙ_ de metanol frio e 300 μΙ_ de hexano. Os retinoides gerados foram analisados por HPLC de fase normal. O pico de cada isômero de retinoide foi identificado com base na sua característica de tempo de retenção e o espectro de absorção de padrões de retinoide. A atividade de isomerohidrolase foi calculada a partir da área do pico 11cROL com o uso do programa de computação Radiomatic 610TR (Perkin Elmer, Boston, MA) com 11-cis [³H]retinol sintético como padrão. Para minimizar a variação da eficiência de transfecção, todos os ensaios de atividade in vitro dos mutantes foram conduzidos lado a lado com wt hRPE65, e as atividades catalíticas foram expressas como valores relativos ao de wt hRPE65, a menos que especificado.

Resultados

Comparação de Atividades de Expressão e Enzimáticas de hRPE65 e CRPE65 [0136] Plasmídeos que expressam proteína fluorescente vermelha (rfp; controle negativo), hRPE65 e cRPE65 foram transfectadas separadamente nas células 293A-LRAT e cultivadas por 48 h. Os níveis de expressão e as atividades enzimáticas de hRPE65 e cRPE65 foram verificadas por análise Western blot (Figura 3A) e ensaio de isomerohidrolase in vitro. Tanto hRPE65 como cRPE65, mas não proteína rfp de controle negativo converteram éster alltrans retinil em 11cROL, o produto de isomerohidrolase (Figuras 3B a 3D). CRPE65 produziu níveis substancialmente mais altos de 11cROL do que de wt hRPE65 após a normalização de seu nível de proteína RPE65, indicando uma maior atividade enzimática de cRPE65.

Seleção de Mutantes [0137] Oito resíduos de várias posições em cRPE65 foram selecionadas para a análise da diferença na atividade de isomerohidrolase entre hRPE65 e cRPE65 (consulte Figurai). A fim de avaliar a contribuição desses resíduos para atividade de isomerohidrolase, uma série de mutações

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44/50 de ponto dos 8 resíduos candidatos em hRPE65 foram geradas por mutagênese sítio-dirigida. Para ensaios de atividade in vitro, o efeito da substituição de Thr na posição 39, Asn na posição 170, Cys na posição 330 e Gin na posição 497 em hRPE65 foi analisado em um primeiro conjunto experimental. A substituição de Cys na posição 106, Lys na posição 297, Leu na posição 510, e Ser na posição 533 foi analisada em um segundo conjunto experimental.

Impactos de Mutações de Ponto Sítio-Dirigidas nos Níveis de Proteínas e Atividades Catalíticas de hRPE65 [0138] Plasmídeos que expressam RPE65 e cRPE65, e os mutantes sítio-dirigidos foram transfectados separadamente em células 293ALRAT e as células transfectadas cultivadas por 48 h. A expressão de proteína foi confirmada por análise Western blot (níveis de expressão relativa de RPE65 mutantes testados são mostrados na Tabela 2), e os mesmos lotes de proteínas celulares totais foram usados para o ensaio de atividade de isomerohidrolase in vitro. Para todos os hRPE65 mutantes contendo mutações únicas, duplas e múltiplas, níveis de expressão de RPE65 foram comparáveis (Figuras 4A a 4E), enquanto que os dois mutantes de ponto únicos N170K e K297G exibiram 1,6 vezes e 1,7 vezes mais atividade enzimática do que wt hRPE65, respectivamente, após normalização por níveis de expressão total de RPE65 (Figuras 4F e 4G). Além disso, os mutantes duplos, triplos ou múltiplos testados com N170K (ou K297G) em cada conjunto experimental também não melhorou a atividade catalítica de RPE65. Esses resultados sugerem que as mutações de N170K e K297G em hRPE65 podem ser importantes para aumentar sua atividade enzimática.

TABELA 2

Níveis de Expressão de RPE65 Mutantes Gerados

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Nome do Mutante	Expressão de (% de WT d	proteína SEM)	N =
wt hRPW65	100,0	+		-
T39R	119,2	+	8,3	6
N170K	104,9	+	3,3	7
C330T	106,3	+	6,5	6
Q497P	80,6	+	8,4	6
T39R/N170K	102,3	+	10,7	5
N170K/C330T	86,2	+	8,7	5
N170K/Q497P	92,0	+	4,4	5
T39R/N170K/C330T	92,1	+	3,0	4
T39R/N170K/Q497P	87,9	+	2,2	4
T39R/N170K/C330T/Q497P	108,9	+	5,4	4
C106Y	89,0	+	5,9	5
K297G	111,3	+	7,1	7
L510M	171,0	+	11,7	4
S533A	114,9	+	9,1	5
C106Y/K297G	146,3	+	8,2	3
K297G/L510M	186,1	+	16,8	3
K297G/S533A	176,3	+	12,2	3
I220M	99,2	+	9,8	4
N170K/I220M	78,7	+	2,4	3
T39R/N170K/I220M	103,3	+	0,9	3
T39R/N170K/I220M/Q497P	96,9	+	2,8	4
N302I	130,4	+	14,1	3
K297G/N302I	145,2	+	8,0	4

Construção de RPE65 Humano Quimérico e seus Impactos sobre os Níveis de Proteína e Atividade Catalítica [0139] Para melhorar ainda a atividade catalítica de hRPE65, nós construímos RPE65 quimérico substituindo um fragmento peptídico de hRPE65 por uma contraparte de cRPE65 (Figura 5A, fragmentos F1-F6). Em 48 h após a transfecção, as células foram coletadas para análise Western blot e ensaios de isomerohidrolase in vitro. A análise Western blot mostrou que os mutantes quiméricos, exceto para uma quimera F1 (fragmento 1 substituído) exibiu nível de proteína mais alto de RPE65 do que wt hRPE65 e outros mutantes quimérico (Figuras 5B-5C). Curiosamente, mutantes quiméricos F1 e F3 mostraram aproximadamente 1,5 a 2 vezes mais atividade catalítica do que wt hRPE65, enquanto que mutantes F2, F4 e F5 quiméricos diminuíram substancialmente

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46/50 suas atividades catalíticas de hRPE65. Após a normalização por níveis de proteína RPE65, o mutante quimérico F1 mostrou atividade catalítica (106,9% de wt hRPE65) comparável à do wt hRPE65, sugerindo que a atividade catalítica melhorada da quimera F1 foi provavelmente devido ao nível de proteína aumentado da quimera F1 RPE65 (Figuras 5B, 5C). Deve-se notar que a quimera F3 exibiu maior atividade enzimática normalizada do que wt hRPE65, provavelmente devido à mutação N170K (152% de wt hRPE65). Isto é bem correlacionado com o resultado da mutação única N170K. O fragmento F1 de cRPE65 compreende os resíduos nas posições 2, 3 e 26, que são diferentes dos resíduos correspondentes em hRPE65 (S2Y, I3S e L26V).

Geração de Super-Isomerohidrolase (sIMH) por Combinação de Mutantes Altamente Ativas [0140] Foram feitas combinações de três mutantes altamente ativos encontrados a partir das séries de mutantes de ponto sítio-dirigidos e dos estudos de mutantes quiméricos. Conforme observado acima, dois mutantes únicos (N170K e K297G) mostraram atividade catalítica significativamente maior do que wt hRPE65 (Figura 6B), apesar de seus níveis de expressão terem sido similares aos de wt hRPE65 (Figura 6A). Conforme mostrado na Figura 6, um duplo mutante (N170K/K297G) de hRPE65 demonstrou atividade enzimática 3,2 vezes maior que a de wt hRPE65. Além disso, uma combinação da quimera F1 (que tem três substituições) com as mutações N170K mostrou níveis de proteína ainda maiores (2,2 vezes) e atividade catalítica do que do mutante único N170K. Após combinar todas estas mutações (S2Y/I3S/L26V/N170K/K297G) em um único mutante, (sIMH), descobriu-se que a atividade catalítica do mutante era

4,4 vezes maior que a de wt hRPE65, que é comparável à atividade de wt cRPE65 (5,8 vezes no mesmo ensaio, Figura 6B).

Mutantes Alternativos [0141 ] Conforme mostrado na Tabela 3, certas mutações com base

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47/50 na diferença entre hRPE65 e cRPE65, por exemplo, nas posições 220 e 302, tanto não aprimoraram a atividade, diminuíram a atividade como diminuíram o aprimoramento induzido por mutações nas posições 170 e 297.

Tabela 3 Atividades de Isomerohidrolase de Séries de Mutantes I220M e N302I de HRPE65.

Nome do Mutante	Atividade normalizada (% de WT ± SEM)
wt hRPE65	100
I220M	62,0	+	11,0
N170K/I220M	31,1	+	7,8
T39R/N170K/I220M	109,7	+	4,2
T39R/ N170K/I220M/Q497P	108,6	+	10,4
N302I	124,8	+	13,3
N302/K297G	107,7	+	6,9

[0142] Duas mutações de ponto, em específico, N170K e K297G, aumentaram substancialmente a atividade enzimática de hRPE65. O mutante que inclui ambas dessas mutações (N170K/K297G) mostrou uma atividade catalítica ainda melhorada (3,2 vezes de wt RPE65) de hRPE65. Além disso, a atividade desse duplo mutante foi ainda melhorada pela substituição do fragmento F1 de cRPE65 (1^Met-33^Arg; contendo 3 resíduos divergentes: Y na posição 2, S na posição 3 e V na posição 26). Como resultado, a atividade catalítica deste mutante super-isomerohidrolase (sIMH; F1/N170K/K297G) foi aproximadamente 4,4 vezes maior do que do wt hRPE65 sob a mesma condição experimental, e foi contribuída por atividade catalítica 1,9 vezes maior, mais nível de proteína 2,3 mais alto. A produção de 11 cROL por sIMH foi próxima do nível de wt cRPE65 (5,8 vezes de wt hRPE65).

[0143] Para confirmação adicional da atividade enzimática melhorada de sIMH, nós avaliamos as eficiências catalíticas de wt hRPE65 e sIMH (Figura 7). Km e Vmax calculadas sugeriram que Vmax mais alta de sIMH

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48/50 contribui principalmente para sua maior atividade enzimática (Figura 7C).

[0144] Para entender a contribuição potencial dos resíduos chave identificados para atividade catalítica mais alta de cRPE65, nós analisamos a estrutura 3D de bovinos RPE65 (acesso PDB: 3FSN) por um SwissPDB Viewer versão 4.01 (/www.expasy.org/spdbv/) e os resultados exibidos por um POV-Ray versão 3.61 (www.povray.org/). No modelo 3D, ambos os resíduos Asn170 e Lys297 estão localizados na superfície da molécula de RPE65 (Figuras 8A, B) e distantes do cofator ferro no sítio catalítico de RPE65 (Figura 8C), sugerindo que é improvável que esses dois resíduos participem diretamente na catálise do substrato. Sem se ater à teoria, especulamos que essas substituições de resíduos podem aprimorar a associação de membrana RPE65, por exemplo, para absorção mais eficiente de substrato e/ou liberação de produto (11cROL). De maneira alternativa, esses dois resíduos podem contribuir para o enovelamento apropriado de RPE65 para obter a sua conformação ativa após associação com a membrana. Curiosamente, a quimera F1 (substituída nas posições 2, 3 e 26) também revelou um aprimoramento significativo da atividade catalítica de hRPE65 devido aos níveis aumentados de proteína de RPE65. Ao contrário das outras duas substituições de resíduos, a quimera F1 na qual somente o fragmento é substituído por aquele de cRPE65 mostrou atividade catalítica similar à de wt hRPE65 após normalização por nível de proteína RPE65. O fragmento F1 contém 33 aminoácidos e somente 3 resíduos que diferem entre hRPE65 e cRPE65. Esses resíduos no fragmento F1 podería contribuir para o enovelamento apropriado para melhorar a estabilidade da hRPE65 mutante. Outra possibilidade é a contribuição da diferença na sequência de nucleotídeos. Dentre os 99 pares de bases que codificam os 33 aminoácidos no fragmento F1, existem 19 nucleotídeos diferentes entre hRPE65 e cRPE65. Estas substituições de nucleotídeos podem aprimorar a estabilidade do mRNA de hRPE65 ou contribuir para uso de códon mais eficiente, levando a níveis mais

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49/50 altos de expressão.

[0145] Como pode ser visto acima, o presente trabalho gerou, em pelo menos uma realização, um mutante hRPE65 altamente ativo (no presente pedido designado como super-isomerohidrolase (sIMH)), por substituição de 5 resíduos tipo selvagem (nas posições 2, 3, 26, 170 e 297) por resíduos das posições de aminoácidos correspondentes de cRPE65. Esta maior atividade catalítica exibida de sIMH (4,4 vezes maior que wt RPE65) após normalização pelos níveis totais de proteína celular. Em uma realização, este mutante sIMH pode ser usado em terapia de substituição do gene RPE65 para tratamento mais efetivo de distrofias da retina em sujeitos humanos. Outras substituições que podem ser feitas para formar outros mutantes dos conceitos inventivos atualmente divulgados, com base em outras sequências de RPE65 de mamífero (incluindo, mas não se limitando a outras sequências de RPE65 de mamífero descritas no presente pedido), incluem, mas não se limitam àquelas mostradas na Figura 9. Por exemplo, em uma ou mais realizações não limitantes, na posição 2, Phe ou His poderia ser usado como o aminoácido substituído em vez de Tyr, na posição 3, Thr ou Cys poderia ser usado como o aminoácido substituído ao invés de Ser, na posição 26, Ala ou lie poderia ser usado como o aminoácido substituído em vez de Vai, na posição 170, Arg ou His poderia ser usado como o aminoácido substituído em vez de Lys, e na Posição 297, Ala poderia ser usado como o aminoácido substituído em vez de Gly. Por exemplo, qualquer um dos mutantes formados baseados na SEQ ID NO: 1 também pode ser produzido em qualquer uma das sequências de RPE65 de mamífero de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.

[0146] O ensaio de atividade in vitro de mutantes indicados foi realizado conforme descrito no presente pedido e as atividades de isomerohidrolase foram expressas como atividade relativa após a normalização

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50/50 dos níveis de RPE65 (% de atividade de wt hRPE65, média ± SEM, n = 3).

[0147] Embora os conceitos inventivos atualmente divulgados tenham sido descritos no presente pedido em conjunto com certas realizações de modo que os aspectos das mesmas possam ser completamente compreendidos e apreciados, não se pretende que os conceitos inventivos atualmente divulgados sejam limitados a essas realizações específicas. Ao contrário, pretende-se que todas as alternativas, modificações e equivalentes sejam incluídas no escopo dos conceitos inventivos atualmente divulgados, conforme definido no presente pedido. Dessa forma, os exemplos descritos acima, que incluem realizações específicas, servirão para ilustrar a prática dos conceitos inventivos atualmente divulgados, ficando entendido que os particulares mostrados são a título de exemplo e para os propósitos de discussão ilustrativa de realizações particulares dos conceitos inventivos atualmente divulgados e são apresentados para fornecer o que se acredita ser a descrição mais útil e facilmente compreendida de procedimentos, bem como dos princípios e aspectos conceituais dos conceitos inventivos. Podem ser feitas mudanças na formulação das várias composições descritas no presente pedido, nos métodos descritos no presente pedido ou nas etapas ou nas sequências de etapas dos métodos descritos no presente pedido, sem se afastar do espírito e escopo dos conceitos inventivos atualmente divulgados. Além disso, embora várias realizações dos conceitos inventivos atualmente divulgados tenham sido descritas nas reivindicações no presente pedido abaixo, não se pretende que os conceitos inventivos atualmente divulgados estejam limitados a essas reivindicações específicas.

Claims (68)

1. PROTEÍNA, RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17, e que tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 170 e 297; a dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma tendo atividade de isomerohidrolase.

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita substituição de aminoácido na posição 170 ser Lys, Arg ou His; e a dita substituição de aminoácido na posição 297 ser Gly ou Ala.

3. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ainda compreender uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 2, 3 e 26.

4. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela dita substituição de aminoácido na posição 2 ser Tyr, Phe ou His; a dita substituição de aminoácido na posição 3 ser Ser, Thr ou Cys; e a dita substituição de aminoácido na posição 26 ser Vai, Ala ou lie.

5. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender substituições de aminoácidos nas posições 2, 3, 26, 170 e 297.

6. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ter atividade de isomerohidrolase maior que a proteína RPE65 não mutada.

7. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ter atividade de isomerohidrolase maior que RPE65 humana que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou RPE65 bovina que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9.

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2/10

8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, conforme definida na reivindicação 1, disposta em um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável.

9. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por codificar uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, conforme definida na reivindicação 1.

10. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela dita substituição de aminoácido na posição 170 ser Lys, Arg ou His; e a dita substituição de aminoácido na posição 297 ser Gly ou Ala.

11. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma compreender ainda uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 2, 3 e 26.

12. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela dita substituição de aminoácido na posição 2 ser Tyr, Phe ou His; a dita substituição de aminoácido na posição 3 ser Ser, Thr, or Cys; e a dita substituição de aminoácido na posição 26 ser Vai, Ala ou lie.

13. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma compreender substituições de aminoácidos nas posições 2, 3, 26, 170 e 297.

14. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser disposto dentro de um vetor.

15. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo dito vetor compreender: uma sequência promotora ou enhancer ligada de maneira funcional ao dito ácido nucleico; ou um códon de parada ou uma sequência poli-A localizada 3’ do dito ácido nucleico.

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16. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo dito vetor compreender uma sequência promotora de RPE65 ligada de maneira funcional ao dito ácido nucleico.

17. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo dito vetor compreender uma sequência promotora de β-actina de galinha/ enhancer de CMV ligada de maneira funcional ao dito ácido nucleico.

18. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo dito vetor ser selecionado a partir do grupo que consiste em adenovirus, vírus adeno-associado (AAV), nanopartículas, plasmídeos e lentivírus.

19. VETOR, viral adeno-associado (AAV), caracterizado por compreender um ácido nucleico que codifica uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

20. VETOR AAV, caracterizado por compreender um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 17.

21. VETOR AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, caracterizado pelo dito vetor compreender uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.

22. VETOR AAV, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelas ditas uma ou mais sequências ITR de AAV compreender uma sequência ITR de qualquer uma dentre: sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV2i8 AAV, ou uma mistura de sequências ITR a partir dessas.

23. VETOR AAV, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo dito vetor AAV compreender uma sequência de capsídeo de AAV.

24. VETOR AAV, de acordo com a reivindicação 23,

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4/10 caracterizado pela dita sequência de capsídeo de AAV compreender uma sequência de capsídeo VP1, VP2 e/ou VP3 que tem pelo menos 90% de identidade às sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8.

25. CÉLULA, caracterizada por produzir um vetor AAV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 24.

26. MÉTODO DE TERAPIA GÊNICA, para tratar uma condição relacionada à degeneração da retina em um sujeito mamífero com necessidade desse tratamento, caracterizado pelo dito método compreender:

administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, em que a dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma é expressa in vivo nas células da retina do dito sujeito e tem atividade de isomerohidrolase.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, codificada pelo dito ácido nucleico, compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17, e que tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 170 e 297.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela dita substituição de aminoácido na posição 170 ser Lys, Arg ou His; e a dita substituição de aminoácido na posição 297 ser Gly ou Ala.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma compreender ainda uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 2, 3 e 26.

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30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela dita substituição de aminoácido na posição 2 ser Tyr, Phe ou His; a dita substituição de aminoácido na posição 3 ser Ser, Thr, or Cys; e a dita substituição de aminoácido na posição 26 ser Vai, Ala ou lie.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pela proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ter atividade de isomerohidrolase maior que a proteína RPE65 não mutada.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ter atividade de isomerohidrolase maior que RPE65 humana que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou RPE65 bovina que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo dito vetor compreender ainda uma sequência promotora ou enhancer ligada de maneira funcional ao dito ácido nucleico que codifica a dita proteína RPE65 de mamífero mutante; ou compreender ainda um códon de parada ou uma sequência poli-A localizada 3’ do dito ácido nucleico que codifica a dita proteína RPE65 de mamífero mutante.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo dito vetor ser selecionado a partir do grupo que consiste em adenovirus, vírus adeno-associado (AAV), nanopartículas, plasmídeos e lentivírus.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo dito vetor compreender um vetor AAV que compreende uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pela sequência ITR de AAV compreender uma sequência ITR de qualquer uma dentre: sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8 AAV, ou uma mistura de sequências

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ITR a partir dessas.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo dito vetor compreender uma sequência de capsideo de AAV.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela dita sequência de capsideo de AAV compreender uma sequência de capsideo VP1, VP2 e/ou VP3 que tem pelo menos 90% de identidade às sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2Í8.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pela dita condição relacionada à degeneração da retina ser Amaurose Congênita de Leber ou Retinite Pigmentosa.

40. MÉTODO PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO relacionada à degeneração da retina em um sujeito mamífero com necessidade desse tratamento, caracterizado pelo dito método compreender:

administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, mitigando assim a dita condição relacionada à degeneração da retina no dito sujeito, a dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma tendo atividade de isomerohidrolase.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17; cuja dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma tem uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 170 e 297.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado

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7/10 pela dita substituição de aminoácido na posição 170 ser Lys, Arg ou His; e a dita substituição de aminoácido na posição 297 ser Gly ou Ala.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pela dita proteína RPE65 de mamífero mutante compreender ainda uma substituição de aminoácido em pelo menos uma das posições 2, 3 e 26.

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pela dita substituição de aminoácido na posição 2 ser Tyr, Phe ou His; a dita substituição de aminoácido na posição 3 ser Ser, Thr, or Cys; e a dita substituição de aminoácido na posição 26 ser Vai, Ala ou lie.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela dita condição relacionada à degeneração da retina ser Amaurose Congênita de Leber ou Retinite Pigmentosa.

46. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 45, caracterizado pelo dito sujeito ser humano.

47. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 46, caracterizado pelo dito sujeito ter menos que 18 anos, menos que 15 anos, menos que 12 anos, menos que 10 anos, entre cerca de 8 a 10 anos, entre cerca de 6 a 10 anos, entre cerca de 4 a 6 anos, entre cerca de 1 a 3 anos ou menos que 1 ano de idade ou menor.

48. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 46, caracterizado pelo dito sujeito ter ou estar em risco de ter degeneração ou distrofia da retina causada por mutação de RPE65.

49. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 39, caracterizado pelo dito vetor ser administrado a um ou mais olhos do dito sujeito.

50. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 39, caracterizado pelo dito vetor ser administrado ao espaço subrretiniano e/ou espaço supracoroidiano de um ou mais olhos do dito sujeito.

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51. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 39, caracterizado pelo dito vetor compreender um vetor AAV e em que 1 x10⁸ ou mais genomas do vetor AAV são administrados a um ou mais olhos do dito sujeito.

52. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 39, caracterizado pelo dito vetor compreender um vetor AAV e em que cerca de 1 χ10⁸ a cerca de 1 x10¹⁴ genomas do vetor AAV são administrados a um ou mais olhos do dito sujeito.

53. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 39, caracterizado pelo dito vetor compreender um vetor AAV e em que cerca de 1 χ10⁹ a cerca de 1 x10¹³ genomas do vetor AAV são administrados a um ou mais olhos do dito sujeito.

54. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 46, caracterizado pelo dito vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ser administrada em um volume de cerca de 10 microlitres (μΙ_) a cerca de 1.000 μΙ_.

55. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 46, caracterizado pelo dito vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ser administrada em um volume de cerca de 50 μΙ_ a cerca de 800 μΙ_.

56. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 46, caracterizado pelo dito vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ser administrada em um volume de cerca de 100 μΙ_ a cerca de 600 μΙ_.

57. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 46, caracterizado pelo dito vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ser administrada em um volume de cerca de 200 μΙ_ a cerca de 500 μΙ_.

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58. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 46, caracterizado pelo dito vetor ou proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma ser distribuída ou introduzida em células do epitélio pigmentar da retina de um ou mais olhos do dito sujeito.

59. PROTEÍNA, RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17, e que tem pelo menos uma substituição de aminoácido que resulta em um aumento de cerca de 2 vezes a um aumento de cerca de 6 vezes na atividade de isomerohidrolase, em comparação à RPE65 humana tipo selvagem.

60. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo dito aumento de cerca de 2 vezes a cerca de 6 vezes na atividade de isomerohidrolase ser determinado pelo ensaio de atividade de isomerohidrolase in vitro.

61. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada por pelo menos uma substituição de aminoácido ser Lys, Arg ou His na posição 170.

62. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada por pelo menos uma substituição de aminoácido ser Gly ou Ala na posição 297.

63. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada por pelo menos uma substituição de aminoácido incluir Lys, Arg ou His na posição 170, e uma substituição de Gly ou Ala na posição 297.

64. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelas ditas substituições de aminoácidos resultarem em um aumento de cerca de 3,2 vezes na atividade de isomerohidrolase, em

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10/10 comparação à RPE65 tipo selvagem.

65. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada por pelo menos uma substituição de aminoácido incluir: uma substituição de Lys, Arg ou His na posição 170, uma substituição de Gly ou Ala na posição 297; uma substituição de Tyr, Phe ou His na posição 2; uma substituição de Ser, Thr ou Cys na posição 3; e uma substituição de Vai, Ala ou lie na posição 26.

66. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelas ditas substituições de aminoácidos resultarem em um aumento de cerca de 4,4 vezes na atividade de isomerohidrolase, em comparação à RPE65 tipo selvagem.

67. USO DE UM VETOR, compreendendo um ácido nucleico que codifica uma proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar uma condição relacionada à degeneração da retina na forma de uma terapia gênica em um sujeito mamífero com necessidade, em que a dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da mesma é expressa in vivo nas células da retina do dito sujeito e tem atividade de isomerohidrolase.

68. USO DE UMA PROTEÍNA DE UM MAMÍFERO MUTANTE, ou porção da mesma, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar uma condição relacionada à degeneração da retina em um sujeito mamífero em necessidade, em que a dita proteína RPE65 de mamífero mutante ou porção da esma tenha atividade de isomerohidrolase.