ES2835032T3 - Terapia génica para el tratamiento de una enfermedad de las células de cono retinianas - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido, que comprende un módulo de expresión transgénico, que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica el promotor del gen de arrestina 3 retiniana humana (hArr3); (b) un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa 3 del canal controlado por nucleótidos cíclicos de conos humano (hCNGA3) o sus fragmentos que exhiben actividad hCNGA3, y (c) un ácido nucleico que codifica elementos reguladores.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia génica para el tratamiento de una enfermedad de las células de cono retinianas

La presente invención se refiere a un polinucleótido configurado para el tratamiento de una enfermedad de las células de cono retinianas, como la acromatopsia, que comprende dicho polinucleótido, una composición farmacéutica que comprende dicho vector de ácido nucleico, un kit que comprende dicho polinucleótido o dicho vector de ácido nucleico, y un método para preparar dicho vector de ácido nucleico.

Las distrofias retinianas hereditarias son trastornos crónicos e incapacitantes de la función visual. La acromatopsia (ACHM) es una forma específica de la misma. La ACHM se caracteriza por la disminución de la agudeza visual, nistagmo pendular, aumento de la sensibilidad a la luz (fotofobia), un pequeño escotoma central, fijación excéntrica y pérdida reducida o completa de la discriminación del color. Todos los individuos con ACHM, los llamados acromáticos, tienen una discriminación de color deficiente a lo largo de los tres ejes de la visión del color correspondientes a las tres clases de conos: el eje de conos sensibles a las longitudes de onda largas (rojo) o protán, el eje de conos sensibles las longitudes de onda intermedias (verde) o deután, y el eje de conos sensibles a las longitudes de onda cortas (azul) o deután. La mayoría de las personas tienen ACHM completa, con total falta de función de los tres tipos de conos. En raras ocasiones, los individuos tienen ACHM incompleta, en la que uno o más tipos de conos pueden estar funcionando parcialmente. Los síntomas son similares a los de las personas con ACHM completa, pero generalmente menos graves.

Se estima que la ACHM afecta a 1 de cada 40.000 nacidos vivos en todo el mundo. Se hereda de forma autosómica recesiva. En el momento de la concepción, cada hermano de un individuo afectado tiene un 25 % de posibilidades de estar afectado, un 50 % de posibilidades de ser portador asintomático y un 25 % de posibilidades de no estar afectado y no ser portador. Las pruebas de portador para familiares en riesgo y las pruebas prenatales para embarazos con mayor riesgo son posibles si se han identificado variantes patógenas en la familia.

Hay varias causas genéticas de la ACHM heredada. Actualmente se han implicado mutaciones en los siguientes genes en la ACHM: subunidad alfa 3 [CNGA3] y subunidad beta 3 [CNGBB] del canal de apertura por nucleótidos cíclicos de los conos, polipéptido 2 de la proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G) alfa de actividad transductora [GNAT2], fosfodiesterasa 6C específica de CGMP de conos alfa prima [PDE6C] y fosfodiesterasa 6H específica de CGMP de conos, gamma [PDE6H], AFT6.

La causa más común de ACHM en la población occidental son las mutaciones en los dos genes CNGA3 y CNGB3. Las mutaciones de CNGB3 (ACHM fr tipo 1, ACHM1) se encuentran en aproximadamente 50 % de los casos, y las mutaciones de CNGA3 (ACHM2) en aproximadamente el 28 % de los pacientes. Las mutaciones en CNGA3 son la causa más común de ACHM en las poblaciones china, de oriente medio y árabe y representan hasta el 60 % de los casos de ACHM. La frecuencia en otros genes implicados en ACHM, como el polipéptido 2 de la proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G) alfa de actividad transductora [GNAT2], fosfodiesterasa 6C específica de CGMP de conos alfa prima [PDE6C] y fosfodiesterasa 6H específica de CGMP de conos, gamma [PDE6H], y AFT6, es muy baja y por debajo del 1,5 %, respectivamente.

En general, el patomecanismo molecular de ACHM es la incapacidad para controlar adecuadamente o responder a niveles alterados de GMPc. El GMPc es particularmente importante en la percepción visual, ya que su nivel controla la apertura de los canales iónicos activados por nucleótidos cíclicos (CNG). La disminución de la concentración de GMPc da como resultado el cierre de los CNG y una consecuente hiperpolarización y el cese de la liberación de glutamato. Los CNG retinianos nativos están compuestos por 3 subunidades a y 1 subunidad p, que son CNGA3 y CNGB3, respectivamente, en las células de los conos.

Debido a la naturaleza genética de las distrofias retinianas hereditarias, como ACHM, los tratamientos convencionales no son aplicables. La carga de la enfermedad es tan severa que los expertos clínicos colocan a la ACHM actualmente en la parte superior de su lista de candidatos para dicha terapia.

En la actualidad, no hay ningún tratamiento disponible para la acromatopsia ligada a CNGA3 (ACHM2).

Komaromy et al., Gene therapy rescues cone function in congenital achromatopsia, Human Molecular Genetics, 19 (13): 2581 -2593 (2010), describen estudios en perros que sugieren algo prometedor para el uso de una terapia génica basada en el virus adenoasociado recombinante (rAAV) para el tratamiento de ACHM causada por mutaciones en el gen CNGB3. En los estudios caninos, los vectores rAAV usados encapsularon un módulo de expresión de CNGB3 humano (hCNGB3) que contenía un promotor de opsina rojo de conos de 2,1 kb (PR2.1) y un ADNc de CNGB3 humano (hCNGB3). Una limitación de los estudios fue que el hCNGB3 dirigido por el promotor PR2.1 se expresó solo en conos rojos y verdes, mientras que el hCNGB3 endógeno se expresó en los tres tipos de conos (conos rojos, verdes y azules). Otra limitación fue que el tamaño total del módulo de expresión utilizado (5230 pb) estaba muy por encima de la capacidad de encapsulación normal (<4,9 kb) de las partículas de AAV; las partículas de rAAV sobrecargadas afectaron drásticamente la eficiencia de encapsulación del rAAV, lo que resultó en bajos rendimientos, una mayor proporción de partículas vacías a llenas y probablemente una menor infectividad del vector.

El documento WO 2012/094560 describe vectores basados en rAAV que comprenden la secuencia codificadora de hCNGA3 bajo el control de promotores cortos específicos que comprenden secciones 5 '-NTR del gen CNGB3 y un potenciador de citomegalovirus (CMV). Según los autores, la brevedad de los promotores permitiría que el módulo de expresión de hCNGB3 encajara dentro de la capacidad de encapsulación normal de rAAV supuestamente dando como resultado varios beneficios, como mejores rendimientos, una menor proporción de partículas vacías a llenas y una mayor infectividad del vector. Sin embargo, los inventores no pudieron verificar estas características.

Pang et al., AAV-mediated gene therapy restores cone function in the Cnga3/Nrl double knockout mouse, Invest. Oftalmol. Vis. Sci. 54, resumen de la reunión, 2723 (2013), describen un vector rAAV5 que comprende la secuencia codificadora del gen hCNGA3. El vector se inyectó en el ojo de ratones con doble desactivación de CNGA3/Nrl (CNGA3/Nrl DKO). Los autores mencionan que se detuvo la degeneración del cono en los ratones tratados. Sin embargo, según los inventores en este enfoque, el rendimiento del reemplazo de genes no es satisfactorio, lo que sugiere que esta estrategia podría ser menos prometedora para el tratamiento de seres humanos que padecen distrofias retinianas hereditarias como ACHM.

Ye et al., Cone-specific promoters for gene therapy of achromatopsia and other retinal diseases, Hum. Gene ther. 27, 72-82 (2016), describen un vector AAV que expresa un gen CNGB3 humano dirigido por un promotor de L-opsina de 1,7 kb (PR1.7). La inyección subretiniana de dicho vector en ratones deficientes en CNGB3 rescató parcialmente la función de los conos. Sin embargo, a pesar de lo sugerido por los autores, hasta ahora el uso clínico de este vector no ha demostrado ser exitoso.

Dyka et al., Cone specific promotor for use in gene therapy of retinal degenerative diseases, en: Ash et al. (ed.), Retinal Diseases - Mechanisms and Experimental Therapy, capítulo 87, 695-701 (2014), describen varios promotores específicos de conos. Sin embargo, no se proporciona una estrategia razonable para el tratamiento de distrofias retinianas hereditarias como ACHM.

En este contexto, es un objeto de la presente invención proporcionar un polipéptido y un vector de ácido nucleico que aborden estas limitaciones y, por lo tanto, sean herramientas valiosas en el tratamiento de una enfermedad de las células de cono retinianas, como ACHM, en particular, ACHM2.

Este objeto se cumple mediante un polinucleótido, que comprende un módulo de expresión transgénico, y dicho módulo de expresión transgénico comprende (a) un ácido nucleico que codifica el promotor del gen de la arrestina 3 retiniana humana (hArr3), (b) un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa 3 del canal de apertura por nucleótidos cíclicos de conos humana (hCNGA3) o fragmentos de la misma que exhiben actividad hCNGA3, y (c) un ácido nucleico que codifica elementos reguladores.

El objeto subyacente de la invención se logra con la presente por completo.

Los inventores pudieron darse cuenta de que el polinucleótido de la invención incorpora los componentes esenciales de una herramienta genética que permite una terapia exitosa de una enfermedad de las células de conos de la retina, como ACHM, que se puede aplicar a un paciente humano.

Los inventores demostraron experimentalmente que los ratones deficientes en CNGA3 que recibieron una inyección subretiniana del polinucleótido según la invención como componente de un plásmido vector expresan el transgén hCNGA3 de manera eficaz y específica en las células fotorreceptoras de conos. Además, se demostró que una visión mediada por conos fue conferida a estos ratones que carecen de función de los conos desde el nacimiento.

Este hallazgo fue sorprendente. La técnica no hizo evidente que un polinucleótido que tenga una estructura como la sugerida por la invención daría como resultado una expresión del transgén de hCNGA3 dirigida en la retina. En realidad, se esperaba lo contrario. La técnica desaconseja explícitamente la solución proporcionada por la invención.

Dyka et al. (l.c.) indican que los promotores de arrestina de conos de ratón y humanos, cuando se utilizan con la intención de expresar en la retina los genes implicados en la patología de ACHM, producen una baja especificidad de tejido diana.

En el documento WO2012/094560 (l.c.) se afirma que los módulos de expresión que codifican CNG retinianos que están bajo el control de un promotor de arrestina de conos serán poco eficaes para restaurar la función visual.

En Komaromy et al. (l.c.) se indica lo mismo.

Por tanto, la alta especificidad y selectividad observadas, así como la eficacia biológica significativa del polinucleótido de la invención para restaurar la función visual, no eran evidentes para un experto en la técnica.

Como demostraron los inventores en experimentos con primates, después de ser inyectado en la retina, el polinucleótido de la invención permanecerá in situ con solo una mínima transducción de órganos fuera del objetivo. También se encontró que después de la inyección en la retina del polinucleótido de la invención no se producirá inducción de anticuerpos antifármaco contra el polinucleótido administrado. Finalmente, se encontró experimentalmente que el polinucleótido de la invención puede administrarse con éxito a las células fotorreceptoras de conos retinianas de pacientes humanos con ACHM basado en CNGA3 mediante un vector de rAAV apropiado. Esto permite llegar a la conclusión de que el polinucleótido de la invención es muy adecuado como agente activo de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad de las células de conos de la retina, como la ACHM.

Según la invención, un "polinucleótido" es una molécula de biopolímero compuesta por 13 o más monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena. Un ejemplo de un polinucleótido preferido es una molécula de ADN. Aunque el polinucleótido según la invención puede ser monocatenario o bicatenario, en una realización preferida el polinucleótido es monocatenario.

Un "promotor" es una región de ADN que facilita la transcripción de un gen en particular. Como parte del proceso de transcripción, la enzima que sintetiza el ARN, conocida como ARN polimerasa, se adhiere al ADN cerca de un gen. Los promotores contienen secuencias de ADN específicas y elementos de respuesta que proporcionan un sitio de unión inicial para la ARN polimerasa y para los factores de transcripción que reclutan a la ARN polimerasa.

El promotor del gen de la arrestina 3 retiniana humana (hArr3) se refiere a la región del ADN que facilita la transcripción de la arrestina 3 humana retiniana (X-arrestina). La secuencia de nucleótidos completa del promotor de hArr3 se describe en Li et al., Retinoic acid upregulates cone arrestin expression in retinoblastoma cells through a Cis element in the distal promoter region, Invest. Oftalmol. Vis. Sci. 43 (5): 1375-1383 (2002).

En una realización, se emplea la secuencia de nucleótidos del promotor completa. En otra realización de la invención, solo se usan partes funcionales del promotor que se requieren para una expresión dirigida de hCNGA3. En otra realización más de la invención se utilizan fusiones de las secuencias de nucleótidos antes mencionadas con otras secuencias de nucleótidos de promotores, secuencias intrónicas o secuencias de elementos reguladores.

Un "módulo de expresión transgénico" o "módulo de expresión" comprende las secuencias de genes que un vector de ácido nucleico debe entregar a las células diana. Estas secuencias incluyen el gen de interés (por ejemplo, el ácido nucleico de hCNGA3), uno o más promotores y elementos reguladores.

Los "elementos reguladores" son elementos reguladores que son necesarios para la expresión eficaz de un gen en una célula diana (por ejemplo, el ácido nucleico de hCNGA3) y, por tanto, deben incluirse en un módulo de expresión transgénico. Dichas secuencias podrían incluir, por ejemplo, secuencias de potenciadores, secuencias de policonectores que faciliten la inserción de un fragmento de ADN dentro de un vector plasmídico, o secuencias responsables del corte y empalme de intrones y la poliadenización de los transcritos de ARNm.

Un "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" es una molécula compuesta de cadenas de nucleótidos monoméricos, tales como, por ejemplo, moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico). Un ácido nucleico puede codificar, por ejemplo, un promotor, el gen de hCNGA3 o un fragmento del mismo, o elementos reguladores. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.

Un "ácido nucleico que codifica hCNGA3" se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la CNGA3 humana, en una realización de la invención, un fragmento o una variante funcional del CNGA3 humano. Un "fragmento" de hCNGA3 se refiere a un segmento o parte de hCNGA3 que todavía presenta actividad de hCNGA3. Un "variante funcional" del hCNGA3 incluye un variante de la proteína con variaciones menores como, por ejemplo, mutaciones silenciosas, polimorfismos de un solo nucleótido, mutaciones sin sentido y otras mutaciones o deleciones, que no alteran significativamente la función de la hCNGA3 de tipo salvaje.

La secuencia de aminoácidos de hCNGA3 que es codificada, al menos parcialmente, por el "ácido nucleico que codifica hCNGA3" de acuerdo con la invención se representa en la SEC ID NO:3.

El polinucleótido de la invención incluye un polinucleótido o una molécula de ácido nucleico "aislado", respectivamente, que es uno que está separado de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el que el ADN genómico está asociado naturalmente. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico "aislada" está libre de secuencias que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico del organismo del que se deriva la molécula de ácido nucleico.

En una realización preferida de la invención, dichos elementos reguladores comprenden c1) un ácido nucleico que codifica el elemento regulador postranscripcional del virus de la estomatitis de la marmota (WPRE).

Este desarrollo adicional del polinucleótido según la invención tiene la ventaja de que se mejora significativamente la expresión de hCNGA3 en las células fotorreceptoras. La expresión a largo plazo que se logra mediante la inclusión de WPRE capacita al polinucleótido para su uso en terapia génica. El WPRE contiene el promotor del gen del marco de lectura abierto del virus de la hepatitis x de la marmota (WHX ORF) y un marco de lectura abierto que codifica los primeros 61 AA de WHX en su región 30; ver Zanta-Boussif et al., V Validation of a mutated PRE sequence allowing high and sustained transgene expression while abrogating WHV-X protein synthesis: application to the gene therapy of WAS, Ther., 16 (5), 605-619 (2009).

En otra realización de la invención, en el polinucleótido según la invención, dicho WPRE es un WPRE mutado (WPREm), que comprende un WHX OR de una proteína de WHX no expresable.

Esta medida tiene la ventaja de que impide la expresión no deseada de la proteína WHX del módulo de expresión.

En otra realización de la invención, dichos elementos reguladores comprenden (c2) un ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación (pA).

Esta medida tiene la ventaja de que el polinucleótido está provisto de un elemento regulador que es importante para la exportación nuclear, la traducción y la estabilidad del ARNm que codifica hCNGA3, mejorando así la eficacia de expresión.

En una realización adicional de la invención, dicha señal de poliadenilación es una pA de la hormona de crecimiento bovina (BGH pA).

Los inventores se han dado cuenta de que esta señal de poliadenilación específica asegura resultados especialmente buenos cuando se usa junto con los elementos genéticos restantes del polinucleótido de la invención.

En otra realización, el polinucleótido de la invención comprende además un ácido nucleico que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean dicho módulo de expresión transgénico, preferiblemente comprende al menos una ITR adyacente a dicho promotor hArr3 (L-ITR) en el primer extremo del módulo de expresión, y al menos una ITR adyacente a dicha pA (R-ITR) en el segundo extremo del módulo de expresión opuesto al primer extremo.

Esta medida tiene la ventaja de que permite una replicación y una encapsulación eficaces durante la fabricación. “Flanquear” significa que las ITR están ubicadas a ambos lados del módulo de expresión transgénico, es decir, en los extremos 5 'y 3'. Por tanto, las ITR enmarcan el módulo de expresión transgénico.

En una realización de la invención, dichas ITR se derivan del serotipo 2 del virus adenoasociado (AAV) (ITR AAV2).

Como se descubrió, estas ITR específicas son particularmente adecuadas para el polinucleótido de la invención.

En otra realización de la invención, el polinucleótido comprende el siguiente orden de disposición: (a) - (b) - (c), preferiblemente (a) -(b) -(c1) -(c2), más preferiblemente (L-ITR) -(a) -(b) -(c1) -(c2) -(R-ITR).

Se ha demostrado que el orden indicado de los elementos genéticos es beneficioso para la eficacia de expresión del polinucleótido según la invención.

En otro variante, dicho promotor de hArr3 comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:1, dicho ácido nucleico que codifica hCNGA3 comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:2, dicho ácido nucleico que codifica hCNGA3 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3, dicho ácido nucleico que codifica WPREm comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:4, dicho ácido nucleico que codifica BGH pA comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:5, dicho ácido nucleico que codifica L-ITR comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 6 y/o dicho ácido nucleico que codifica R-ITR comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:7.

Esta medida tiene la ventaja de que con las secuencias de nucleótidos específicas de los respectivos elementos genéticos del polinucleótido según la invención se proporciona un manual de construcción preciso. Esto permite una síntesis fácil y que ahorra tiempo del polinucleótido, por ejemplo, por medio de un sintetizador de ácidos nucleicos.

Otro objeto de la invención es un vector de ácido nucleico que comprende el polinucleótido anteriormente mencionado según la invención. Por tanto, los aspectos, ventajas y características del polinucleótido se aplican igualmente al vector de ácido nucleico de la invención.

En variantes, el vector de ácido nucleico según la invención es un vector viral, como un vector derivado de un virus adenoasociado, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus, una virus de vaccinia/poxvirus o un herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simplex (HSV)). En las realizaciones más preferidas, el vector es un vector viral adenoasociado (AAV) (véase más adelante).

En una realización de la invención, el vector de ácido nucleico es un plásmido circular que además comprende un esqueleto que tiene una longitud de > 5.000 pb, preferiblemente > 5.500 pb.

Según la invención, el término "esqueleto" se refiere a la sección de la molécula de vector más allá del módulo de expresión o, si están presentes, las repeticiones terminales invertidas (ITR). En otras palabras, el esqueleto del vector es adyacente a los extremos 5 'y 3' del módulo de expresión o ITR, respectivamente, y forma el resto de los ácidos nucleicos del vector además del polinucleótido según la invención.

Los inventores se han dado cuenta de que un esqueleto de este tamaño preferido minimizará una encapsulación falsa o inversa del esqueleto en una partícula de virus, en lugar de una encapsulación del módulo de expresión. Por lo tanto, esta medida asegura que esencialmente solo la hCNGA3 estará disponible para una expresión en la célula diana.

En otra realización de la invención, dicho esqueleto comprende < 5 marcos de lectura abiertos (ORF), preferiblemente < 4 ORF, más preferiblemente < 3 ORF, más preferiblemente < 2 ORF, más preferiblemente < 1 ORF, muy preferiblemente 0 ORF.

Los inventores se han dado cuenta de que el esqueleto debe tener un bajo contenido de ORF, preferiblemente debe estar libre de orf, además de cualquier marcador de selección u origen de replicación (ORI), si corresponde. Esta medida tiene la ventaja de que minimizará aún más la posibilidad de expresión de productos secundarios en caso de encapsulación inversa. Además, minimiza la posibilidad de la expresión de productos secundarios durante la fabricación de vectores rAAV.

En otro variante más del vector de ácido nucleico, dicho esqueleto comprende un marcador de selección, preferiblemente un ácido nucleico que codifica resistencia a antibióticos, más preferiblemente un ácido nucleico que codifica resistencia a kanamicina (KanR).

Esta medida proporciona las condiciones previas constructivas que permiten la selección de células in vitro que incorporan el vector de ácido nucleico. Estas células se pueden usar para amplificar el vector.

En otro variante, dicho marcador de selección del esqueleto del vector de ácido nucleico está en sus extremos 5 'y 3' alejado remotamente del polinucleótido, preferiblemente alejado remotamente al máximo del polinucleótido o módulo de expresión, más preferiblemente > 1000 pb, más preferiblemente > 1.500 pb, muy preferiblemente > 1.900 pb alejado del polinucleótido o módulo de expresión.

Como se han dado cuenta los inventores, esta medida tiene la ventaja de que el ácido nucleico que codifica la resistencia (KanR) está espaciado al máximo de las ITR y los elementos reguladores del módulo de expresión, por ejemplo, el promotor.

En un desarrollo adicional del vector de ácido nucleico, el esqueleto comprende < 10 sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (RERS), preferiblemente < 5 RERS, más preferiblemente < 3 RERS, más preferiblemente < 2 RERS, más preferiblemente < 1 RERS, muy preferiblemente 0 RERS.

Esta medida tiene la ventaja de que la estabilidad del vector de ácido nucleico en las bacterias utilizadas para la amplificación del ADN aumenta significativamente.

En un desarrollo adicional del vector de ácido nucleico de acuerdo con la invención, el esqueleto comprende < 5 promotores, preferiblemente < 4 promotores, más preferiblemente < 3 promotores, más preferiblemente < 2 promotores, más preferiblemente < 1 promotores, muy preferiblemente 0 promotores.

Esta medida minimiza aún más la posibilidad de la expresión de productos secundarios en caso de encapsulación inversa que puede causar efectos adversos o interferencia con el transgén. En esta realización, se debe entender que "promotores" excluye el promotor necesario para expresar el marcador de selección, por ejemplo, el KanR, que normalmente estará representado por un promotor procariótico apropiado.

En un variante adicional del vector de ácido nucleico, dicho esqueleto comprende además un origen de replicación (ORI), preferiblemente un ORI de pUC18.

Esta medida proporciona las condiciones previas estructurales para que el vector sea replicable.

El esqueleto comprende preferiblemente como únicas secuencias codificadoras o portadoras de información el marcador de selección y el CHI y, para el resto, secuencias aleatorias, pero sin ORF, promotores o RERS.

La secuencia de nucleótidos comprendida por el esqueleto del vector se representa en el listado de secuencias adjunto bajo SEC ID NO:8.

En un variante preferido, el ácido nucleico es un vector viral adenoasociado (AAV).

En la actualidad se han identificado múltiples serotipos de virus adenoasociados (AAV), incluidos 12 serotipos humanos (AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y AAV12) y más de 100 serotipos de primates no humanos. Howarth et al., Uso de vectores virales como herramientas de transferencia de genes. Cell Biol. Toxicol. 26: 1 -10 (2010). El serotipo de las repeticiones terminales invertidas (ITR) o la secuencia de la cápsidA del vector de AAV puede seleccionarse de cualquier serotipo de AAV humano o no humano conocido. En algunas realizaciones se emplea un enfoque de pseudotipificación, en el que el genoma de un serotipo de ITR se encapsula en una cápsida de serotipo diferente. Ver, por ejemplo, Zolutuhkin et al., Production and purification of serotype 1,2, and 5 recombinant adenoassociated viral vectors, Methods, 28 (2): 158-67 (2002).

Si bien podría usarse cualquier tipo de AAV, se prefiere aún más que el serotipo de la secuencia de la cápsida de AAV y/o las repeticiones terminales invertidas (ITR) de dicho vector de AAV se seleccionen del grupo que consiste en AAV2, AAV5, AAV8, sus modificaciones o combinaciones.

Los inventores se han dado cuenta de que los subtipos AAV2, AAV5, AAV8 son particularmente adecuados para la creación del vector de ácido nucleico según la invención.

La producción, purificación y caracterización de los vectores AAV recombinantes de la presente invención se puede llevar a cabo usando cualquiera de los muchos métodos conocidos en la técnica. Para análisis de métodos de producción a escala de laboratorio, ver, por ejemplo, Clark, Recent advances in recombinant adeno-associated virus vector production, Kidney Int. 61 s: 9-1 5 (2002); Choi et al., Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use, Current Protocols in Molecular Biology, 16.25.1-16.25.24 (2007); Grieger y Samulski, Adenoassociated virus as a gene therapy vector: Vector development, production, and clinical applications. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 99: 119-145 (2005); Heilbronn y Weger, Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics, en M. Schafer-Korting (Ed.), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010); Howarth et al. (l.c.). Los métodos de producción descritos a continuación están pensados como ejemplos no limitantes.

Otro objeto de la invención se refiere a una preparación farmacéutica que comprende el vector AAV como se describe en detalle más arriba, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por tanto, los aspectos, ventajas y características del polinucleótido que comprende un vector AAV se aplican igualmente a la preparación farmacéutica de la invención.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, se hace referencia a Rowe (Ed.) (2012), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6a edición, Pharmaceutical Press. La preparación farmacéutica puede contener además aditivos. Estos incluyen cualquier compuesto o composición que sea ventajoso para la eficacia del vector de ácido nucleico de acuerdo con la invención, tales como sales, aglutinantes, disolventes, dispersantes, adyuvantes y otras sustancias comúnmente utilizadas en relación con enfoques terapéuticos génicos.

En una variante de la preparación farmacéutica, dicho vehículo farmacéuticamente aceptable comprende solución salina, preferiblemente solución salina estéril equilibrada, y opcionalmente un tensioactivo, preferiblemente poloxámero micronizado (Kolliphor® P 188 micro).

Los inventores se han dado cuenta de que con tal formulación específica se minimizan los efectos adversos inducidos por fármacos y la pérdida de partículas de rAAV en las superficies.

En una variante, la preparación farmacéutica se configura para un uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con una mutación, sustitución o deleción genética que afecta a las células de conos de la retina, más preferiblemente en el tratamiento de la acromatopsia (ACHM), en particular ACHM de tipo 2 ( ACHM2).

Con el polinucleótido y el vector de ácido nucleico descritos en detalle más arriba, los inventores proporcionan una herramienta terapéutica que, por primera vez, permite un tratamiento causativo de la acromatopsia ligada a CNGA3.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un kit que comprende (a) el polinucleótido según la invención y/o el ácido nucleico según la invención, y/o la preparación farmacéutica según la invención, y (b) instrucciones para el uso de los mismos.

Un objeto adicional de la presente invención se refiere a un método para preparar un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende insertar en un vector viral adenoasociado un polinucleótido que comprende un módulo de expresión transgénico, que comprende (a) un ácido nucleico que codifica el promotor del gen de arrestina 3 retiniana humana (hArr3); (b) un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa 3 del canal controlado por nucleótidos cíclicos de conos humano (hCNGA3) o fragmentos de la misma que exhiben actividad hCNGA3, y (c) un ácido nucleico que codifica elementos reguladores.

Otro objeto de la descripción es un método para tratar una enfermedad asociada con una mutación, sustitución o deleción genética que afecta a las células de conos de la retina, en el que el método comprende administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento el vector de ácido nucleico de acuerdo con el invención y/o la preparación farmacéutica según la invención, tratando así al sujeto. Preferiblemente, la enfermedad es ACHM, más preferiblemente ACHM de tipo 2 (ACHM2). Preferiblemente, el vector se administra por vía subrretiniana y/o intravitreal.

Los aspectos, ventajas y características del polinucleótido y del vector de ácido nucleico se aplican igualmente al kit, al método de preparación y al método de tratamiento según la invención.

Debe entenderse que las características antes mencionadas y las que se mencionan a continuación no solo pueden utilizarse en la combinación indicada en el caso respectivo, sino también en otras combinaciones o de manera aislada sin apartarse del alcance de la invención. .

La invención se explica ahora con más detalle mediante realizaciones de las que surgen aspectos, características y ventajas adicionales de la invención. Las realizaciones son de naturaleza puramente ilustrativa y no limitan el alcance de la invención. Las características mencionadas en las realizaciones específicas son características generales de la invención que no solo son aplicables en la realización específica sino también de forma aislada en el contexto de cualquier realización de la invención.

La invención se describe y explica ahora con más detalle haciendo referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.

Figura 1: Muestra la estructura del genoma del vector rAAV.hCNGA3;

Figura 2: Muestra dos realizaciones del mapa plasmídico del vector cis phArr3.hCNGA3.WPREm;

Figura 3: Muestra mediciones de ERG representativas de ratones deficientes en CNGA3 tratados en un ojo con el vector de acuerdo con la invención; y

Figura 4: Muestra imágenes confocales representativas de tinciones inmunohistológicas de hCNGA3 en ratones deficientes en CNGA3 (A3KO) tratados con el vector rAAV.hCNGA3;

Figura 5: Muestra el curso longitudinal de la agudeza visual mejor corregida (MAVC) después del tratamiento con AAV8.hCNGA3. El gráfico superior (a) muestra los datos de los ojos de estudio tratados, y el gráfico inferior (b) de los ojos de control compañeros no tratados. Cada línea representa un paciente. La MAVC se determinó mediante las tablas EDTRS estandarizadas bajo iluminación constante. El número absoluto de letras leídas correctamente por cada paciente en relación con su línea de base previa a la inyección (0) se representa frente al tiempo (días) después de la inyección. Inmediatamente después de la inyección, la MAVC disminuye en la mayoría de los pacientes, pero después de 180 días la MAVC de cada paciente mejora en comparación con el valor inicial, lo que indica una clara tendencia de mejoría no observada en los ojos de control.

Fig. 6: A, B: representan el cambio en la actividad máxima metabólica en la corteza visual después del tratamiento con AAV8.hCNGA3 (ejemplo). Antes del tratamiento (6A), este paciente acromático respondió a un patrón de contraste de luminancia (columna izquierda), pero no a un patrón de contraste cromático isoluminante (columna derecha = 0). Después del tratamiento, la señal cromática isoluminante (6B, columna derecha) alcanzó niveles similares a los de la estimulación de contraste de luminancia. C, D: señales de fMRI del mismo paciente, resueltas a lo largo del tiempo después de la presentación del estímulo. Las líneas grises presentan la amplitud de señal en respuesta a estímulos de contraste; las líneas azules, en respuesta a estímulos de contraste cromático isoluminante. Antes del tratamiento (C) , los estímulos cromáticos no producen un aumento en la amplitud de la señal de fMRI, y después del tratamiento (D) , la amplitud de la señal aumenta claramente.

Ejemplos

1. Vector de ácido nucleico de la invención

En esta realización ejemplar, el vector rAAV.hCNGA3 es un vector híbrido basado en AAV que porta el ADNc de la subunidad CNGA3 humana del canal catiónico regulado por nucleótidos cíclicos (CNG) de fotorreceptores de conos. La expresión del ADNc de hCNGA3 está bajo el control del promotor de arrestina 3 humana específico de conos (hArr3) y se mejora utilizando una secuencia de elemento regulador postranscripcional (WPRE) mutado del virus de la estomatitis de la marmota. El módulo de expresión está flanqueado por las repeticiones terminales invertidas (ITR) del AAV de serotipo 2, y el genoma recombinante está encapsulado en la cápsida del AAV de serotipo 8 , lo que da como resultado un vector híbrido AAV2/8. El módulo de expresión comprende los siguientes elementos:

• Promotor del gen de arrestina 3 humano (hArr3): 0,4 kb

• ADNc de la subunidad CNGA3 del canal catiónico activado por nucleótidos cíclicos de fotorreceptores de conos humano: 2 kb

• Elemento regulador postranscripcional del virus de la estomatitis de la marmota (WPRE) con una mutación puntual en el codón ATG del marco de lectura abierto WHV-X: 0,54 kb

• Señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH): 0,2 kb

• Repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV de serotipo 2: 0,13 kb

La estructura del genoma del vector rAAV.hCNGA3 se representa en la figura 1.

2. Plásmido de vector cis pGL2.hArr3.hCNGA3.WPREm

En una realización ejemplar, se usa el esqueleto del plásmido del vector cis pGL2.hArr3.hCNGA3.WPREm que contiene un módulo de expresión que comprende un promotor de arrestina de conos humana específica de fotorreceptores de conos de 405 pb (hArr3) [ver Li et al., Retinoic acid upregulates cone arrestin expression in retinoblastoma cells through a Cis element in the distal promoter region, Investigative ophthalmology & visual science, 43 (2002) 1375-1383; y Carvalho et al., Long-term and age-dependent restoration of visual function in a mouse model of CNGB3-associated achromatopsia following gene therapy, Human molecular genetics, 20 (2011) 3161-3175] y el ADNc de CNGA3 humano de longitud completa (2085 pb) [véase Wissinger et al., Cloning, chromosomal localization and functional expression of the gene encoding the alpha-subunit of the cGMP-gated channel in human cone photoreceptors]. El módulo de expresión también contiene un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (wpre) de 543 pb con un marco de lectura abierto WXF mutado [Zanta-Boussif etal., Validation of a mutated PRE sequence allowing high and sustained transgene expression while abrogating WHV-X protein synthesis: application to the gene therapy of WAS, Gene therapy, 16 (2009), 605-619] y una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGHpA) de 207 pb. El esqueleto del vector de 5591 pb con la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID NO:8 contiene una resistencia a la kanamicina (KanR) colocada a 1943 pb del L-ITR y a 2853 pb del R-ITR y a 2024 pb de un ori de pUC18.

El vector rAAV.hCNGA3 se produce usando una doble transfección transitoria del plásmido del vector cis y un plásmido auxiliar trans pDP8-KanR en las células de riñón embrionario humano 293 (HEK293). El lisado celular se aclara mediante centrifugación a baja velocidad y luego el vector se purifica mediante 2 rondas consecutivas de ultracentrifugación con gradientes de cloruro de cesio seguido de una etapa de filtración de flujo tangencial para la concentración y el intercambio de tampón. La suspensión del vector rAAV.hCNGA3 resultante se esteriliza luego por filtración y envasa en viales como producto farmacéutico.

En las figuras 2A,B se muestran dos realizaciones del mapa del plásmido del vector phArr3.hCNGA3.WPREm.

3. Actividad biológica y expresión transgénica conferidas por el vector rAAV.hCNGA3

Para verificar la actividad biológica y la expresión transgénica, los inventores administraron el vector rAAV.hCNGA3 en el espacio subretiniano de ratones deficientes en CNGA3 de 2 semanas de edad [Biel et al., Selective loss of cone function in mice lacking the cyclic nucleotide-gated channel CNG3, Proc Natl Acad Sci USA, 96 (13): 7553-7557 (1999)]. El procedimiento de entrega fue similar al descrito para el vector específico de ratón [Michalakis et al., Restoration of cone vision in the CNGA3-/- mouse model of congenital complete lack of cone photoreceptor function, Molecular therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 18, 2057-2063 (2010)]. Los ratones recibieron una inyección subretiniana en el ojo tratado (TE), mientras que el otro ojo no tratado (UE) sirvió como control. La eficacia del vector se evaluó a las 8 semanas después de la inyección mediante electrorretinografía (ERG), un ensayo funcional in vivo objetivo. Los ratones deficientes en CNGA3 carecen de visión mediada por conos. Por lo tanto, los protocolos ERG que ensayan específicamente la función de los conos son adecuados como una medida indirecta de la función CNGA3 y para la evaluación de la actividad biológica (BAA) del vector rAAV.hCNGA3.

Para obtener resultados representativos, consulte la figura 3: Mediciones de ERG representativas de ratones deficientes en CNGA3 tratados en un ojo (ojo tratado, rastros negros) con el vector rAAV.hCNGA3. Los rastros del ojo de control sin tratar se muestran en gris. La actividad biológica conferida por la expresión de hCNGA3 mediada por el vector rAAV.hCNGA3 es claramente evidente como la elevación de componentes de ERG específicos (parpadeo escotópico de 7 hz, parpadeo fotópico de 5 hz y flash fotópico) que están mediados por fotorreceptores de conos y no se encuentran en ratones deficientes en CNGA3 .

El tratamiento con el vector rAAV.hCNGA3 dio como resultado un claro efecto terapéutico en el ojo tratado reflejado por la elevación de componentes de ERG específicos. Después de completar las mediciones de ERG, se sacrificaron los ratones, se enuclearon los ojos y se procesaron para el análisis inmunohistológico de la expresión del transgén de hCNGA3 (ensayo de expresión del transgén, TEA). Para ello, el tejido se fijó y se criosumergió. Las criosecciones verticales se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de rata que se une a la proteína CNGA3 humana y de ratón. La inmunoseñal se detectó con un anticuerpo secundario IgG anti-rata de burro marcado con Cy3. Las imágenes confocales de las criosecciones inmunoteñidas se recogieron utilizando un microscopio de barrido láser confocal Leica SP8 SMD. El anticuerpo anti-CNGA3 también detecta la proteína CNGA3 de ratón y da una señal específica en los segmentos externos de fotorreceptores de conos de la retina de ratón de tipo salvaje y ninguna señal en la retina deficiente en CNGA3. Después del tratamiento con el vector rAAV.hCNGA3, se observó una señal clara y específica para CNGA3 en los segmentos externos de los fotorreceptores de conos en el ojo tratado, que estaba ausente en el ojo no tratado.

Para obtener resultados representativos, consulte la figura 4: Imágenes confocales representativas de tinciones inmunohistológicas de hCNGA3 en ratones deficientes en CNGA3 (A3KO) tratados con el vector rAAV.hCNGA3. El anticuerpo anti-CNGA3 (dilución de trabajo en todos los experimentos 1:50) también detecta la proteína CNGA3 de ratón y da una señal específica en los segmentos externos de fotorreceptores de conos (estructuras en forma de varilla en la parte superior de la imagen) de la retina de ratón de tipo salvaje (dos paneles a la izquierda) y ninguna señal específica en la retina de ratones deficientes en CNGA3 no tratados (dos paneles de la derecha). La señal específica para la proteína hCNGA3 codificada por el vector rAAV.hCNGA3 se muestra en el tercer panel, que está ausente en los A3KO sin tratar que se muestran en el cuarto panel. El panel dos muestra una tinción de control solo con anticuerpo secundario. Los paneles inferiores muestran una superposición de la señal CNGA3 con el marcador específico de fotorreceptores de conos aglutinina de cacahuete y el tinte nuclear Hoechst 4322.

En conclusión, el vector rAAV.hCNGA3 expresa el transgén hCNGA3 de manera eficaz y específica en fotorreceptores de conos de ratones deficientes en CNGA3 y confiere la visión mediada por conos a estos ratones que carecen de función de los conos desde el nacimiento (actividad biológica).

4. Biodistribución y desprendimiento de AAV8 después de la inyección subretiniana en primates no humanos En otro estudio, se analizó la distribución y desprendimiento del virus después de una sola administración subretiniana de un virus adenoasociado recombinante de grado clínico (rAAV) en primates no humanos. Esto es importante para una evaluación del riesgo medioambiental del método terapéutico génico según la invención.

Dieciocho primates no humanos (Macacoa fascicularis) se sometieron a vitrectomía vía pars plana 23g e inyección subretiniana en tres cohortes (dosis alta: 1x1012 genomas del vector [vg], dosis baja: 1x1011 vg, o solo vehículo). Cuatro animales adicionales recibieron inyecciones intravítreas para imitar la biodistribución via falsa. Se recolectaron muestras de tejido en la necropsia (día 91) del ojo tratado, ganglios linfáticos drenantes, glándula salival y bazo, nervio óptico, cerebro y médula espinal, corazón, pulmón, hígado, glándulas suprarrenales y gónadas. Se recolectaron muestras de sangre, orina, lagrimales y nasales de cada animal antes de la dosificación y 1, 2 y 3 días y 1, 4 y 13 semanas después de la aplicación del vector para la extracción del ADN y la cuantificación de los genomas del vector mediante qPCR.

Se encontró ADN de rAAV dependiente de la dosis en la retina tratada y el nervio óptico. También se detectaron niveles cuantificables de ADN de rAAV en el quiasma óptico de 2 animales del grupo de dosis alta. Se encontró desprendimiento transitorio en todos los biofluidos. Las concentraciones más altas se encontraron en el líquido lagrimal del grupo de dosis alta. No se detectó ADN en los tejidos de la línea germinal y, aparte de las señales esporádicas detectadas en un pequeño número de animales en los ganglios linfáticos y el bazo, todos los tejidos restantes fueron negativos. Las muestras de sangre mostraron niveles cuantificables de ADN del vector rAAV a las 24 y 72 horas después del tratamiento, pero fueron negativas en todos los demás momentos analizados.

Estos datos son relevantes para la implementación clínica de la invención, cuando los sujetos de ensayo, investigadores y reguladores están interesados en identificar los riesgos ambientales asociados con la aplicación de organismos genéticamente modificados. Si bien el vertido en biofluidos parece ocurrir de una manera dependiente de la dosis, la transducción de órganos fuera del objetivo parece mínima.

5. Respuesta inmune humoral al AAV8 subretiniano en primates no humanos

El conocimiento de la respuesta inmune humoral a la administración subretiniana única de virus adenoasociado recombinante de grado clínico (rAAV) en primates no humanos es un factor clave para el desarrollo de protocolos de ensayos clínicos seguros y eficaces para la terapia génica retiniana según la invención. Por esta razón, los inventores exploraron titulaciones de anticuerpos anti-fármaco (ADA) en primates no humanos (Macacca fascicularis) después de la administración subretiniana única de un virus pseudotipado rAAV8.

Dieciocho monos recibieron inyecciones subretinianas en tres cohortes (dosis alta: 1x1012 genomas de vectores [vg], dosis baja: 1x1011 vg, o solo vehículo) y terapia inmunosupresora concomitante equivalente a un escenario de ensayo clínico. Cuatro animales adicionales recibieron inyecciones intravítreas para imitar la biodistribución, por ejemplo, después de complicaciones quirúrgicas. Las muestras basales se compararon con las tomadas 1, 2 y 3 días y 1,4 y 13 semanas después de la aplicación del vector.

Las titulaciones de anticuerpos anti-fármaco (ADA) en todos los animales del grupo de dosis baja se mantuvieron constantes durante el período de observación de 13 semanas. El grupo subretiniano de dosis alta mostró la mayor variabilidad a lo largo del tiempo, pero sin un patrón claro de respuesta inmune humoral.

Este estudio proporciona datos relevantes para una aplicación clínica de la invención, en la que rAAV8 podría usarse para la administración subretiniana del transgén hCNGA3. Al imitar el escenario clínico con un vector de calidad clínica, cirugía e inmunosupresión concomitante, no se produjo inducción de anticuerpos anti-fármaco en primates no humanos.

6. Administración exitosa de rAAV8.CNGA3 en un paciente con acromatopsia basada en CNGA3

El objetivo de este estudio clínico de intervención (NCT02610582) fue probar los aspectos de seguridad de la terapia génica de suplementación basada en AAV8 de acuerdo con la invención en pacientes con acromatopsia basada en CNGA3.

Después de exhaustivas pruebas de seguridad en un estudio de escalada de dosis en 34 primates no humanos (NHP), los inventores seleccionaron un intervalo de dosificación de 1x1010, 5x1010 y 1x1011 genomas de vectores (vg) para un ensayo clínico exploratorio de fase I/II de escalada de dosis. Un total de 9 pacientes con mutaciones homocigotas o heterocigotas compuestas en CNGA3 recibieron una única inyección subretiniana de 1x1010 vg (n = 3), 5 x 1010 vg (n = 3), o 1x1011 vg (n = 3) cada uno en 0,2 ml de solución salina equilibrada. El tratamiento concomitante con esteroides (prednisolona 1 mg/kg/d) se inició 1 día antes de la cirugía. El criterio de valoración principal, la seguridad de la aplicación, se evaluó mediante un examen clínico y la agudeza visual mejor corregida (MAVC).

Los datos de seguridad de NHP no mostraron cambios persistentes relacionados con el elemento de prueba después de la aplicación de < 1x1012 vg 90 días después de la dosificación. En el ensayo clínico, todos los pacientes recibieron la dosis respectiva (1x1010-1x1011 vg) de forma segura y sin complicaciones quirúrgicas o posquirúrgicas como desprendimiento de retina, hemorragia o inflamación que no responde al tratamiento. La MAVC alcanzó los niveles iniciales tan pronto como 14 días después del tratamiento. Los cambios estructurales a nivel del epitelio pigmentario de la retina y los segmentos de fotorreceptores internos/externos se atribuyeron al procedimiento quirúrgico (ver arriba).

El estudio de seguridad del NHP demostró que < 1x1012 vg se puede aplicar sin secuelas relevantes. Esta fue la primera aplicación clínica de la terapia génica subretiniana mediada por AAV8 en el ojo. La aplicación fue bien tolerada y no dio lugar a una inflamación clínicamente aparente con el tratamiento concomitante con prednisolona. A pesar de que la aplicación implicó un desprendimiento macular, la agudeza visual alcanzó los niveles iniciales en 14 días.

7. Seguridad después de la administración subretiniana de AAV8.hCNGA3 en pacientes con acromatopsia

La seguridad como criterio de valoración principal se evaluó mediante el examen clínico de la inflamación ocular (lámpara de hendidura, biomicroscopía del fondo de ojo, angiografía, perimetría o electrofisiología). En la etapa actual (15 meses después de iniciado el ensayo), con todos los pacientes tratados y seguidos durante un mínimo de tres meses, no fue necesario documentar ni un solo acontecimiento adverso grave. Además, no hubo ningún acontecimiento adverso ocular que requiriera una acción adicional y ningún acontecimiento adverso no ocular que no se resuelven sin secuelas. Generalmente, esto refleja el excelente perfil de seguridad ya observado en el estudio de toxicología preclínica en NHP.

8. Eficacia después de la administración subretiniana de AAV8.hCNGA3 en pacientes con acromatopsia

Aunque no representa un objetivo principal de este estudio de seguridad, se eligieron criterios de valoración de eficacia exploratorios para seleccionar su idoneidad en estudios de eficacia futuros. Estos incluyeron la mejor agudeza visual corregida, las medidas de resultado indicadas por el paciente y otros.

Uno de los criterios de valoración más relevantes en los ensayos clínicos oculares es la agudeza visual mejor corregida. En este criterio de valoración, todos los datos disponibles en este momento de presentación de este documento indican que el tratamiento no tiene efectos nocivos sostenidos y/o sustanciales. Si bien la cirugía puede conducir a una reducción transitoria de la agudeza visual (como se esperaba), todos los pacientes con un seguimiento de al menos 6 meses muestran una mejora en la agudeza visual y todos los pacientes con un seguimiento de 12 meses continúan mostrando también una mejora en la agudeza visual. . Esto se ilustra mediante los gráficos representados en la figura 5, arriba (a) para el ojo tratado, abajo (b) para el ojo no tratado.

Las medidas de resultado indicadas por los pacientes cobran importancia en los protocolos de los ensayos, ya que normalmente reflejan parámetros importantes para la calidad de vida de nuestros pacientes. Los resultados provisionales del ensayo en curso (NCT02610582) demuestran que la gran mayoría de los pacientes del estudio indicaron una mejora rápida y relevante de su deslumbramiento, un síntoma clave, después de la inyección subretiniana de rAAV.hCNGA3. La mayoría también indicó una mejora en el reconocimiento de letras y números y en su capacidad de fijación. Estos resultados preliminares se encontraban distribuidos de manera bastante homogénea en los tres grupos de dosificación.

Se utilizó la estimulación de Ganzfeld y la resonancia magnética funcional (fMRI) para cuantificar la actividad metabólica localizada en la corteza visual que depende de los estímulos que se originan en el área tratada y el sistema de fotorreceptores de conos. Tres grupos de tres pacientes cada uno fueron tratados con dosis baja, intermedia o alta de terapia génica con AAV8.hCNGA3 en el ojo del estudio para restaurar la función de los conos local. Se realizó una resonancia magnética funcional antes y tres meses después del tratamiento. Esto permitió evaluar la (re)organización de la corteza visual, así como toda la red cerebral en estos momentos, y comparar con las respuestas correspondientes que se recopilaron de sujetos tricromáticos normales. En cada sesión de fMRI, los sujetos realizaron tres experimentos de estimulación visual en condiciones de luz mesópica: a) mapeo retinotópico, b) contraste de color isoluminante (no resuelto por retinas acromáticas) frente a contraste de luminancia, yc) rejillas de frecuencia espacial (0.3, 1, 5 ciclos por grado) con contraste bajo (3 %) y alto (50 %). Para todos los pacientes, la respuesta basal antes del tratamiento fue, como se esperaba, mucho mayor para el contraste de luminancia (columnas grises a la izquierda en la figura 6A) en comparación con los estímulos cromáticos isoluminantes (a la derecha en la figura 6A) que produjeron una respuesta muy débil o nula. En comparación con el grupo de control, todas las respuestas fueron menores y más lentas. Tres meses después se observó un aumento generalizado de la señal en todos los casos. Es importante destacar que en algunos sujetos de los grupos de dosis intermedia y alta (columna azul a la derecha de la figura 6B), la amplitud de las señales de MRI alcanzó niveles similares a los observados en respuesta a la estimulación de contraste de luminancia (columna gris a la izquierda de la figura 6B). La figura 6C (antes del tratamiento) y 6D (después del tratamiento) muestran datos similares a los de 6A y 6B, respectivamente; sin embargo, aquí las señales de fMRI se resuelven a lo largo del tiempo (en s) después de presentar los estímulos (estímulo de contraste en gris, estímulo de color isoluminante en azul). El pico de la señal se alcanza después de aproximadamente 10 s (caso representativo del grupo de dosis intermedia).

También se observó un aumento de las respuestas a frecuencias espaciales intermedias y superiores (no se muestra). Estos resultados son una indicación de la activación cerebral con estímulos cromáticos isoluminantes no resueltos sin la función de los conos y también apuntan a una plasticidad cerebral después de la terapia génica con AAV8.hCNGA3 y proporcionan la primera evidencia de activación exitosa de las vías cerebrales relacionadas con conos en estos pacientes (caso representativo del grupo de dosis intermedia).

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido, que comprende un módulo de expresión transgénico, que comprende:

(a) un ácido nucleico que codifica el promotor del gen de arrestina 3 retiniana humana (hArr3);

(b) un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa 3 del canal controlado por nucleótidos cíclicos de conos humano (hCNGA3) o sus fragmentos que exhiben actividad hCNGA3, y

(c) un ácido nucleico que codifica elementos reguladores.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que dichos elementos reguladores comprenden:

(c1) un ácido nucleico que codifica un elemento regulador postranscripcional del virus de la estomatitis de la marmota (WPRE), preferiblemente dicho WPRE es un WPRE mutado (WPREm), más preferiblemente dicho WPREm que comprende un marco de lectura abierto de la proteína X del virus de la hepatitis de la marmota (WHX) no expresable (WHX OR).

3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en el que dichos elementos reguladores comprenden

(c2) un ácido nucleico que codifica una señal de poliadenilación (pA), preferiblemente dicha pA es una pA de la hormona de crecimiento bovina (pA de BGH).

4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que además comprende un ácido nucleico que comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean dicho módulo de expresión transgénico, preferiblemente al menos una ITR es adyacente a dicho promotor de hArr3 (L-ITR) y al menos una ITR es adyacente a dicha pA (R-ITR), más preferiblemente dichas ITR se derivan de AAV de serotipo 2 (ITR AAV2).

5. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende el siguiente orden de disposición:

(a) -(b) -(c),

preferiblemente (a) -(b) -(d) -(c2),

más preferiblemente (L-ITR) -(a) -(b) -(d) -(c2) -(R-ITR).

6. Un vector de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 6, que es un plásmido circular que comprende además un esqueleto que tiene una longitud de > 5.000 pb, preferiblemente > 5.500 pb.

8. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 7, en el que dicho esqueleto comprende < 5 marcos de lectura abiertos (ORF), preferiblemente < 4 ORF, más preferiblemente < 3 o Rf , más preferiblemente < 2 ORF, más preferiblemente < 1 ORF, muy preferiblemente 0 ORF.

9. El vector de ácido nucleico de la reivindicación 7 u 8, en el que dicho esqueleto comprende < 10 sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (RERS), preferiblemente < 5 RERS, más preferiblemente < 3 RERS, más preferiblemente < 2 RERS, más preferiblemente < 1 RERS, muy preferiblemente 0 RERS.

10. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que dicho esqueleto comprende < 5 promotores, preferiblemente < 4 promotores, más preferiblemente < 3 promotores, más preferiblemente 2 < promotores, más preferiblemente < 1 promotores, muy preferiblemente 0 promotores.

11. El vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que el vector es un vector viral adenoasociado (AAV), preferiblemente el serotipo de la secuencia de la cápsida de AAV de dicho vector de AAV se selecciona del grupo que consiste en AAV2, AAV5, AAV8, o combinaciones de los mismos.

12. Una preparación farmacéutica que comprende el vector de ácido nucleico de la reivindicación 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Un kit que comprende

(a) el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y/o el vector de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 6-11 y/o la preparación farmacéutica de la reivindicación 12, y

(b) instrucciones para su uso.

14. Un método para preparar un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende insertar en un vector viral adenoasociado un polinucleótido, que comprende un módulo de expresión transgénico, que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica el promotor del gen de arrestina 3 retiniana humana (hArr3);

(b) un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa 3 del canal controlado por nucleótidos cíclicos de conos humano (hCNGA3) o sus fragmentos que exhiben actividad hCNGA3, y

(c) un ácido nucleico que codifica elementos reguladores.