ES2947159T3 - Vectores víricos para el tratamiento de la distrofia retiniana - Google Patents

Vectores víricos para el tratamiento de la distrofia retiniana Download PDF

Info

Publication number
ES2947159T3
ES2947159T3 ES13730648T ES13730648T ES2947159T3 ES 2947159 T3 ES2947159 T3 ES 2947159T3 ES 13730648 T ES13730648 T ES 13730648T ES 13730648 T ES13730648 T ES 13730648T ES 2947159 T3 ES2947159 T3 ES 2947159T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
rlbp1
seq
vector
sequence
itr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13730648T
Other languages
English (en)
Inventor
Chad Eric Bigelow
Vivian Choi
Thaddeus Peter Dryja
Seshidhar Reddy Police
Akshata Ninad Gujar
Shawn Michael Hanks
Terri Mcgee
Joanna Vrouvlianis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2947159T3 publication Critical patent/ES2947159T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14345—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14371—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6027—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses ssDNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a vectores virales que son capaces de administrar un gen heterólogo a la retina y, en particular, administrar RLBP1 a RPE y células Muller de la retina. La invención también relaciona ácidos nucleicos útiles para producir vectores virales, composiciones que comprenden los vectores virales y usos de las composiciones y vectores virales. La invención también se refiere a métodos para administrar y/o expresar un gen heterólogo en la retina, mejorar la tasa de adaptación a la oscuridad en un sujeto y tratar la distrofia retiniana asociada a RLBP1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores víricos para el tratamiento de la distrofia retiniana
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La retinosis pigmentaria (RP) se refiere a un grupo de degeneraciones heredadas de las células de los fotorreceptores (bastones y conos) de la retina que dan lugar a pérdida de visión y ceguera. Las mutaciones en cualquiera de una amplia variedad de genes pueden provocar la RP, incluidos genes que codifican proteínas que están involucradas en la fototransducción (el proceso por el cual la energía de un fotón de luz se convierte en el segmento externo de la célula fotorreceptora en una señal neuronal), el ciclo visual (producción y reciclaje de vitamina A en la retina), estructura del fotorreceptor y factores de transcripción (Phelan y Bok, 2000).
La distrofia retiniana asociada con RLBP1 es una forma rara de RP provocada por mutaciones en el gen de la proteína 1 de unión a retinaldehído (RLBP1) en el cromosoma 15. Las mutaciones en este gen provocan la ausencia de o disfunción de la proteína de unión a retinaldehído celular (CRALBP), una proteína que es importante en el ciclo visual (Hc et al., 2009). CRALBP se expresa en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE, por sus siglas en inglés) y de Müller, epitelio ciliar, iris, córnea, glándula pineal y un subconjunto de oligodendrocitos del nervio óptico y el cerebro (Saari et al., 1997). CRALBP acepta 11-c/s-retinol de la isomerasa RPE65 y actúa como un portador de este sustrato para que la 11-c/s-retinol- deshidrogenasa (RDH5) convierta el sustrato en 11-c/s-retinal. La velocidad de regeneración del cromóforo se ve muy reducida en ausencia de CRALBP funcional (Travis et al., 2007). La función de CRALBP fuera del RPE no se comprende bien, pero se ha sugerido que CRALBP en las células de Müller contribuye a la ruta visual específica de los conos que permite a las células de los conos adaptarse rápidamente a una amplia gama de intensidades lumínicas (Wang y Kefalov 2011).
La distrofia retiniana asociada con RLBP1 se caracteriza por una ceguera nocturna grave precoz y una adaptación lenta la oscuridad, seguida de una pérdida progresiva de agudeza visual, campos visuales y visión cromática que dan lugar a una ceguera legal normalmente en personas aproximadamente de mediana edad. El aspecto del fondo se caracteriza por puntos amarillos o blancos en la retina. La reducción de la agudeza visual y campo visual afecta significativamente a la calidad de vida del paciente (Burstedt y Monestam, 2010).
Las mutaciones más comunes de RLBP1 que dan lugar a distrofia retiniana asociada con RLBP1 son mutaciones recesivas, denominadas R234W y M226K (Golovleva I y Burstedt M 2012). La distrofia retiniana asociada con RLBP1 provocada por 1 o ambas de estas mutaciones terminadoras recesivas también se conoce como distrofia de Bothnia. Se ha comunicado que varias mutaciones con pérdida de función diferentes en el gen RLBP1 dan lugar a la distrofia retininana asociada con RLBP1. Por ejemplo, mutaciones en la unión exón/intrón en RLBP1 provocan distrofia de bastones y conos en Newfoundland. En la actualidad no se dispone de ningún tratamiento para la distrofia retiniana asociada con RLBP1 (Eichers et al., 2002). Den Hollander (2010) analizó la conveniencia de estrategias de terapia génica, pero en ese momento no se disponía de ninguna.
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la expresión de RLBP1 a partir de vectores víricos adenoasociados recombinantes (rAAV) que tienen una combinación del promotor seleccionado, genoma y serotipo de cápside de AAV proporciona un tratamiento potente y eficaz para la distrofia retiniana asociada con RLBP1.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un vector vírico que tiene un genoma del vector que comprende una secuencia que codifica la proteína 1 de unión a retinaldehído (RLBP1), en donde dicho vector se adapta para dirigir la expresión de una secuencia que codifica RLBP1 en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) y células de Müller de la retina, en donde dicho vector comprende una cápside del serotipo 2 u 8 de un virus adenoasociado (AAV) y dicho genoma del vector comprende en la dirección de 5' a 3':
(i) una ITR en 5';
(ii) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende en la dirección de 5' a 3': un promotor; una secuencia que codifica RLBP1; y una secuencia poliA de SV40;
en donde el promotor está ligado operablemente a la secuencia que codifica RLBP1; y
(iii) una ITR en 3';
en donde el genoma del vector comprende en la dirección de 5' a 3' las secuencias de ácido nucleico:
a) SEQ ID NO: 2, 10, 5, 6, 8 y 9;
o
b) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 23 y 9.
La presente invención proporciona además un vector vírico que tiene un genoma del vector que comprende una secuencia que codifica la proteína 1 de unión a retinaldehído (RLBP1), en donde dicho vector se adapta para dirigir la expresión de una secuencia que codifica RLBP1 en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) y células de Müller de la retina, en donde dicho vector comprende una cápside del serotipo 2 u 8 de un virus adenoasociado (AAV), en donde dicho genoma del vector comprende en la dirección de 5' a 3':
(i) una ITR en 5';
(ii) una primera secuencia de nucleótidos recombinante;
(iii) una ITR sin resolución;
(iv) una segunda secuencia de nucleótidos recombinante; y
(v) una ITR en 3',
en donde la primera y segunda secuencias de nucleótidos recombinantes son autocomplementarias;
en donde la segunda secuencia de nucleótidos recombinante comprende en la dirección de 5' a 3': (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica RLBP1; y (iii) una secuencia poliA de SV40;
en donde el promotor está ligado operablemente a la secuencia que codifica RLBP1, y
en donde el genoma vírico comprende las secuencias en la dirección de 5' a 3': SEQ ID NO: 36, 62, 63, 64, 65, 66, 1, 3, 4, 5, 6, 8 y 9.
La invención también se refiere a una composición que comprende un vector vírico como se define en las reivindicaciones, así como composiciones de vectores víricos en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones como se definen en las reivindicaciones son útiles para tratar a un sujeto que padece distrofia retiniana provocada por una mutación en el gen RLBP1 y/o mejorar la velocidad de adaptación a la oscuridad en un sujeto que padece distrofia retiniana provocada por una mutación en el gen RLBP1.
La presente invención proporciona además un ácido nucleico que comprende un casete génico, donde dicho casete génico comprende, en la dirección de 5' a 3':
(i) una ITR en 5' o una ITR sin resolución;
(ii) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia que codifica RLBP1; y
(iii) una ITR en 3';
en donde el casete génico comprende, en la dirección de 5' a 3', las secuencias:
a) SEQ ID NO: 2, 10, 5, 6, 8 y 9,
o
b) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 23 y 9,
o
c) SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 6, 8 y 9.
La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que se pueden utilizar, con los métodos de producción con rAAV conocidos en la técnica y descritos en el presente documento, para la generación de vectores víricos descritos en el presente documento. La invención se refiere a ácidos nucleicos que comprenden un casete génico, en donde el casete génico comprende, en la dirección de 5' a 3': (i) una ITR en 5' o una ITR sin resolución, (ii) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia que codifica RLBP1, y (iii) una ITR en 3'. Se contempla que el ácido nucleico puede comprender un casete génico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las SEQ ID NO: 51, 52, 53, 54 y 55. Se contempla que los ácidos nucleicos de la invención pueden ser plásmidos. Se contempla además que el ácido nucleico puede ser un plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 y 50.
La invención también se refiere a ácidos nucleicos que comprenden un casete génico, en donde el casete génico comprende, en la dirección de 5' a 3': (i) una ITR en 5', (ii) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a un gen indicador, y (iii) una ITR en 3'. Se contempla que el ácido nucleico puede comprender un casete génico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las SEQ ID NO: 56, 57, 59 y 60. Se contempla además que el ácido nucleico puede ser un plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las SEQ ID NO: 31, 32, 34 y 35.
La invención también se refiere a una composición que comprende un vector vírico como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de la distrofia retiniana provocada por una mutación en el gen RLBP1.
La invención también se refiere a una composición que comprende un vector vírico como se define en las reivindicaciones para su uso para mejorar la velocidad de adaptación a la oscuridad en un sujeto que padece distrofia retiniana provocada por una mutación en el gen RLBP1 y/o mejorar la velocidad de adaptación a la oscuridad en un sujeto que padece distrofia retiniana provocada por una mutación en el gen RLBP1.
Se definen aspectos y realizaciones adicionales de la invención en las reivindicaciones.
DEFINICIONES
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los comúnmente entendidos por los expertos en la materia a la pertenece esta invención.
El término «cápside» se refiere al recubrimiento proteico del virus o vector vírico. La expresión «cápside de AAV» se refiere al recubrimiento proteico del virus adenoasociado (AAV), que está compuesto en total por 60 subunidades, cada subunidad es una secuencia de aminoácidos, que puede ser la proteína vírica 1 (VP1), VP2 o VP3 (Muzyczka N y Berns KI 2001).
La expresión «casete génico» se refiere a un fragmento manipulable de ADN que porta, y es capaz de expresar, uno o más genes, o secuencias codificantes, de interés entre uno o más conjuntos de sitios de restricción. Se puede transferir un casete génico de una secuencia de ADN (a menudo en un vector plasmídico) a otra «cortando» el fragmento utilizando enzimas de restricción y ligándolo de nuevo en un contexto nuevo, por ejemplo, en un esqueleto plasmídico nuevo.
La expresión «gen heterólogo» o «secuencia de nucleótidos heteróloga» se referirá normalmente a un gen o secuencia de nucleótidos que no tiene un origen natural en el virus. Como alternativa, un gen o secuencia de nucleótidos heterólogos se puede referir a una secuencia vírica que se coloca en un entorno que no se produciría de manera natural (p. ej.: mediante asociación con un promotor con el que no se asocia de manera natural en el virus).
El término «ITR» o la expresión «repetición terminal invertida» se refieren al fragmento de las secuencias de ácidos nucleicos que existe en los virus adenoasociados (AAV) y/o vectores víricos adenoasociados recombinantes (rAAV) que puede formar una estructura palindrómica con forma de T, que es necesaria para completar los ciclos líticos y de vida latente de AAV (Muzyczka N y Berns KI 2001). La expresión «ITR sin resolución» se refiere a una ITR modificada tal que se reduce la resolución por parte de la proteína Rep. Una ITR sin resolución puede ser una secuencia ITR sin el sitio de resolución terminal (TRS, por sus siglas en inglés) que da lugar a una resolución baja o nula de la ITR sin resolución y que generaría un 90-95 % de vectores de AAV autocomplementarios (McCarty et al., 2003). Un ejemplo específico de una iTr sin resolución es «AITR» que tiene una secuencia de la SEQ ID NO. 1.
La expresión «ligado operablemente» se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos polinucleotídicos (p. ej., a Dn ). Normalmente, el término se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción con una secuencia que se va a transcribir. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está ligada operablemente a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. Por lo general, las secuencias reguladoras de la transcripción promotoras que están ligadas operablemente a una secuencia transcribible son contiguas a la secuencia transcribible, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como potenciadores, no necesitan estar físicamente contiguas o ubicadas muy próximas a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.
El término «promotor» se refiere a una secuencia que regula la transcripción de un gen, o secuencia nucleotídica que codifica una proteína, etc., ligado operablemente. Los promotores proporcionan la secuencia suficiente para dirigir la transcripción, así como los sitios de reconocimiento para la ARN-polimerasa y otros factores de transcripción requeridos para una transcripción eficaz y pueden dirigir la expresión específica de células Además de la secuencia suficiente para dirigir la transcripción, una secuencia promotora de la invención también puede incluir secuencias de otros elementos reguladores que están involucrados en la modulación de la transcripción (p. ej.: potenciadores, secuencias kozak e intrones). Los ejemplos de promotores conocidos en la técnica y útiles en los vectores víricos descritos en el presente documento incluyen el promotor de CMV, promotor de CBA, promotor de smCBA y los promotores derivados de un gen de inmunoglobulina, SV40, u otros genes específicos de tejidos (p. ej.: RLBP1, RPE, VMD2). Los promotores específicos también pueden incluir los descritos en la Tabla 1, por ejemplo, el promotor de «RLBP1 (corto)» (SEQ ID NO: 3), el promotor de «RLBP1 (largo)» (SEQ ID NO: 10), el promotor de RPE65 (SEQ ID NO: 11), el promotor de VMD2 (SEQ ID NO: 12) y el potenciador de CMV promotor de CBA (SEQ ID NO: 22). Además, en la técnica se conocen técnicas estándar para crear promotores funcionales mezclando y emparejando elementos reguladores conocidos. También se pueden generar «promotores truncados» a partir de fragmentos de promotores o mediante mezcla y emparejamiento de fragmentos de elementos reguladores conocidos; por ejemplo, el promotor smCBA es una forma truncada del promotor de CBA.
El término «RLBP1» se refiere a la «proteína 1 de unión a retinaldehído». El gen RLBP1 humano está ubicado en el cromosoma 15 y tiene la secuencia codificante de ácido nucleico como se expone en la Tabla 1: SEQ ID NO: 6. El «producto del gen RLBP1» también se conoce como «proteína de unión a retinaldehído celular» o «CRALBP» y es la proteína codificada por el gen RLBP1. El producto del gen RLBP1 humano (hCRALBP) tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la Tabla 1: SEQ ID NO: 7. Se pueden consultar ejemplos de secuencias codificantes de RLBP1 y productos del gen RLBP1 de otras especies en la Tabla 1 (p. ej.. las s Eq ID NO: 37-48). La expresión «secuencia codificante de RLBP1» o «CDS del GEN RLBP1» o «CDS de RLBP1» se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica el producto del gen RLBP1. Un experto en la técnica entendería que una secuencia codificante de RLBP1 puede incluir cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica un producto del gen RLBP1. La secuencia codificante de RLBP1 puede incluir o no elementos reguladores intercalados (p. ej.: intrones, potenciadores u otras secuencias no codificantes).
El término «sujeto» incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados (p. ej.: mamíferos y no mamíferos) tales como primates no humanos (p. ej.: macaco cangrejero), ratones, ratas, ovejas, perros, vacas, gallinas, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique, los términos «paciente» o «sujeto» se utilizan indistintamente en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, el término «tratar» o «tratamiento» de cualquier enfermedad o trastorno (p. ej., retinosis pigmentaria, distrofia retiniana asociada con RBLP1) se refiere a mejorar la enfermedad o trastorno, por ejemplo, ralentizando o deteniendo o reduciendo el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de esta. «Tratar» o «tratamiento» también se puede referir a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico incluidos aquellos que pueden no ser perceptibles por el paciente. «Tratar» o «tratamiento» también se puede referir a modular la enfermedad o el trastorno, ya sea físicamente (p. ej., estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (p. ej., estabilización de un parámetro físico) o ambos. Más específicamente, «tratamiento» de una distrofia retiniana asociada con RLBP1 se refiere a cualquier acción que da como resultado la mejora o conservación de la función visual y/o anatomía regional en un sujeto que padece distrofia retiniana asociada con RLBP1. «Prevenir» o «prevención», como se utiliza en el presente documento, se refiere a prevenir o retrasar la aparición o desarrollo o progresión de la enfermedad o trastorno. La «prevención» relacionada con la distrofia retiniana asociada con RLBP1 se refiere a cualquier acción que previene o ralentiza un empeoramiento de la función visual, anatomía retiniana y/o un parámetro de la enfermedad distrofia retiniana asociada con RLBP1, como se describe más adelante, en un paciente con distrofia retiniana asociada con RLBP1 y en riesgo de dicho empeoramiento. Los métodos para evaluar el tratamiento y/o prevención de enfermedades son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento más adelante.
Se pretende que la expresión «vector viral» o «vector vírico» se refiera a una partícula vírica recombinante no natural (p. ej.: un parvovirus, etc.) que funciona como un vehículo de suministro de genes y que comprende un genoma vírico recombinante empaquetado dentro de una cápside vírica (p. ej.: AAV). Un tipo específico de vector viral puede ser un «vector vírico adenoasociado recombinante) o «vector rAAV». El genoma vírico recombinante empaquetado en un vector vírico también se denomina en el presente documento «genoma del vector».
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Expresión relativa del ARNm de RLBP1 humano mediado por vector en comparación con ARNm de RLBP1 de ratón endógeno en ojos inyectados con diversos vectores víricos con una dosis de (a) 1×109 y (b) 1×108 partículas de genoma del vector (gv) por ojo.
Figura 2. Adaptación a la oscuridad en ratones RLBP1 KO (-/-) y naturales (+/+).
Figura 3. Medida de la velocidad de adaptación a la oscuridad de ratones RLBP1 KO tratados con diversos vectores víricos.
Figura 4. Medida de la mayor velocidad de adaptación a la oscuridad de ratones RLBP1 KO tratados con diversas dosis de NVS2 y NVS11. Las dosis del eje horizontal se indican en notación científica (por ejemplo, 3E6 = 3×106).
Figura 5. Medida de la mayor velocidad de adaptación a la oscuridad de ratones RLBP1 KO tratados con diversas dosis de NVS4 y NVS11. Las dosis del eje horizontal se indican en notación científica (por ejemplo, 3E6 = 3×106).
Figura 6. Medida de la mayor velocidad de adaptación a la oscuridad de ratones RLBP1 KO tratados con NVS2 preparado con diferentes métodos de purificación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de vectores víricos que expresan un gen heterólogo en las células de RPE y de Müller de la retina. La invención también se refiere a vectores víricos monocatenarios y autocomplementarios con un gen heterólogo que expresa el producto del gen RLBP1 (CRALBP).
En consecuencia, la presente invención proporciona vectores víricos recombinantes que dirigen la expresión de la secuencia que codifica RLBP1 a la retina, composiciones de vectores víricos, plásmidos útiles para generar los vectores víricos, métodos de suministrar una secuencia que codifica RLBP1 a la retina, métodos para expresar una secuencia que codifica RLBP1 en las células RPE y de Müller de la retina y métodos de uso de tales vectores víricos.
Excepto cuando se indique otra cosa, se pueden utilizar métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica para la construcción de los vectores rAAV y de parvovirus recombinantes, utilizando plásmidos recombinantes que portan un casete génico vírico, empaquetando plásmidos que expresan las secuencias rep y/o cap de parvovirus, así como células de empaquetamiento transfectadas de manera transitoria y estable. Tales técnicas son conocidas por los expertos en la técnica (p. ej.: SAMBROOK etal., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2.a Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Choi VW et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (2007)).
1. Vectores víricos
La presente invención se refiere a vectores víricos que dirigen la expresión de un gen heterólogo a las células de RPE y de Müller de la retina. Un experto en la técnica puede adaptar diversos vectores víricos conocidos en la técnica para su uso en la presente divulgación, por ejemplo, virus adenoasociados recombinantes, adenovirus recombinantes, retrovirus recombinantes, poxvirus recombinantes, baculovirus recombinantes, etc.
En particular, se contempla que el vector vírico de la invención pueda ser un vector adenoasociado recombinante (rAAV). Los AAV son virus pequeños, de ADN monocatenario que requieren un virus auxiliar para facilitar una replicación eficaz (Muzyczka N y Berns Ki 2001). El vector vírico comprende un genoma del vector y una cápside proteica. La cápside del vector vírico se puede suministrar a partir de cualquiera de los serotipos de AAV conocidos en la técnica, incluidos los serotipos de AAV humanos y no humanos identificados en la actualidad y los serotipos de AAV aún por identificar (véanse: Choi VW et al., 2005, Schmidt et al., 2008). Las cápsides víricas se pueden mezclar y emparejar con otros componentes del vector para formar un vector vírico híbrido, por ejemplo, las ITR y cápside del vector vírico pueden provenir de diferentes serotipos de AAV. En un aspecto, las ITR pueden provenir de un serotipo AAV2 mientras que la cápside procede, por ejemplo, de un serotipo AAV2 o AAV8.
Además, un experto en la técnica reconocería que la cápside del vector también puede ser una cápside mosaico (p. ej.: una cápside compuesta de una mezcla de proteínas capsídicas de diferentes serotipos) o incluso una cápside quimérica (p. ej.: una proteína capsídica que contiene una secuencia proteica exógena o no relacionada para generar marcadores y/o alterar el tropismo tisular). Se contempla que el vector vírico de la invención puede comprender una cápside de AAV2. Se contempla además que la invención puede comprender una cápside de AAV8.
La invención se refiere, en parte, a vectores víricos en donde el genoma del vector es monocatenario. En ciertos aspectos, la invención se refiere a un genoma del vector monocatenario que comprende, en la dirección de 5' a 3': (i) una ITR en 5', (ii) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia que codifica RLBP1, y (iii) una ITR en 3'. En ciertos aspectos de la invención la secuencia de nucleótidos recombinante comprende en la dirección de 5' a 3': (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica RLBP1, y (iii) una secuencia poliA de SV40. En ciertos aspectos, el promotor puede ser un promotor (corto) de RLBP1, un promotor (largo) de RLBP1 o un promotor truncado de RLBP1. En particular, la invención se refiere a un genoma del vector monocatenario que comprende una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende en la dirección de 5' a 3': un promotor (largo) de RLBP1 (SEQ ID NO:10), una secuencia que codifica RLBP1 y una secuencia poliA de SV40. Además, la invención también se refiere a un genoma del vector monocatenario que comprende una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende en la dirección de 5' a 3': un promotor (corto) de RLBP1 (SEQ ID NO: 3), una secuencia que codifica RLBP1 y una secuencia poliA de SV40. Ciertos aspectos de la invención se refieren además a un genoma del vector monocatenario que comprende una secuencia de nucleótidos recombinante empaquetada en una cápside de AAV2 o AAV8.
En ciertos aspectos de la invención el vector vírico comprende una cápside de AAV2 (codificada por la SEQ ID NO: 18) y un genoma del vector que comprende en una dirección de 5' a 3' secuencias de nucleótidos seleccionadas entre las siguientes: a) la SEQ ID NO: 2, 10, 5, 6, 8 y 9; y b) la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 23 y 9. También se divulga el vector vírico que comprende una cápside de AAV2 (codificada por la SEQ ID NO: 18) y un genoma del vector que comprende en una dirección de 5' a 3' secuencias de nucleótidos seleccionadas entre las siguientes: a) la SEQ ID NO: 2, 11, 5, 6, 8, 14, 9; y b) la SEQ ID NO: 2, 22, 5, 6, 8, 23 y 9. En ciertos aspectos, la cápside de AAV2 comprende las proteínas capsídicas VP1, VP2 y VP3 que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 68 y 69, respectivamente. En ciertos aspectos diferentes, la cápside de AAV2 puede comprender subcombinaciones de las proteínas capsídicas VP1, VP2 y/o VP3.
En ciertos aspectos de la invención el vector vírico comprende una cápside de AAV8 (codificada por la SEQ ID NO: 20) y un genoma del vector que comprende en la dirección de 5' a 3' secuencias de nucleótidos seleccionadas entre las siguientes: a) la SEQ ID NO: 2, 10, 5, 6, 8 y 9; y b) la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 23 y 9. También se divulga el vector vírico que comprende una cápside de AAV8 (codificada por la SEQ ID NO: 20) y un genoma del vector que comprende en la dirección de 5' a 3' secuencias de nucleótidos seleccionadas entre las siguientes: a) la SEQ ID NO: 2, 11, 5, 6, 8, 14, 9; y b) la SEQ ID NO: 2, 22, 5, 6, 8, 23 y 9. En ciertos aspectos, la cápside de AAV8 comprende las proteínas capsídicas VP1, VP2 y VP3 que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, 70 y 71. En ciertos aspectos diferentes, la cápside de AAV8 puede comprender subcombinaciones de las proteínas capsídicas VP1, VP2 y/o VP3.
El vector vírico también puede ser un vector AAV que comprende un genoma autocomplementario. Se han descrito previamente en la técnica vectores rAAV autocomplementarios (US7465583 y McCarty 2008) y estos se pueden adaptar para su uso en la presente invención. Un genoma autocomplementario comprende una ITR en 5' y una ITR en 3' (es decir: una ITR con resolución o ITR natural) en cualquier extremo del genoma y una ITR sin resolución (p. ej.: AITR, como se describe en el presente documento) interpuesta entre las ITR en 5' y 3'. Cada porción del genoma (es decir, entre cada ITR con resolución e ITR sin resolución) comprende una secuencia de nucleótidos recombinante, en donde cada mitad (es decir: la primera secuencia de nucleótidos recombinante y la segunda secuencia de nucleótidos recombinante) es complementaria a la otra o autocomplementaria. En otras palabras, el genoma del vector autcomplementario es esencialmente una repetición invertida donde las dos mitades están unidas por la ITR sin resolución. En ciertos aspectos la invención se refiere a un genoma del vector autocomplementario que comprende, en la dirección de 5' a 3', (i) una ITR en 5', (ii) una primera secuencia de nucleótidos recombinante, (iii) una ITR sin resolución, (iv) una segunda secuencia de nucleótidos recombinante y (v) una ITR en 3'. En ciertos aspectos de la invención la segunda secuencia de nucleótidos recombinante del genoma del vector comprende un promotor de RLBP1, una secuencia que codifica RLBP1 y una secuencia poliA de SV40 y la primera secuencia de nucleótidos recombinante es autocomplementaria a la segunda secuencia de nucleótidos. En ciertos aspectos específicos el promotor de RLBP1 tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 3. En ciertos aspectos de la invención, la segunda secuencia de nucleótidos recombinante comprende secuencias de ácido nucleico en la dirección de 5' a 3' de la SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 y 8 y la primera secuencia de nucleótidos recombinante comprende secuencias que son autocomplementarias a, o el complemento inverso de, la segunda secuencia recombinante, por ejemplo, las SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65 y 66. También se contempla que el vector vírico de la invención puede comprender un genoma autocomplementario en donde la primera secuencia de nucleótidos recombinante del genoma del vector comprende un promotor de RLBP1, una secuencia que codifica RLBP1 y una secuencia poliA de SV40 y la segunda secuencia de nucleótidos recombinante es autocomplementaria a la primera secuencia de nucleótidos recombinante.
En ciertos aspectos de la invención el vector vírico autocomplementario comprende una cápside de AAV2 (codificada por la SEQ ID NO: 18) y un genoma del vector que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias en la dirección de 5' a 3' SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9. En ciertos aspectos, la cápside de AAV2 comprende las proteínas capsídicas VP1, VP2 y VP3 que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 68 y 69, respectivamente. En ciertos aspectos diferentes, la cápside de AAV2 puede comprender subcombinaciones de las proteínas capsídicas VP1, VP2 y/o VP3.
En ciertos aspectos de la invención el vector vírico autocomplementario comprende una cápside de AAV8 (codificada por la SEQ ID NO: 20) y un genoma del vector que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias en la dirección de 5' a 3' SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9. En ciertos aspectos, la cápside de AAV8 comprende las proteínas capsídicas VP1, VP2 y VP3 que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, 70 y 71. En ciertos aspectos diferentes, la cápside de AAV8 puede comprender subcombinaciones de las proteínas capsídicas VP1, VP2 y/o VP3.
Por lo tanto, la invención también se refiere a vectores víricos como se describe en el presente documento, que comprenden un promotor truncado de RLBP1.
La invención se refiere además a un vector vírico que dirige la expresión de un gen heterólogo a las células de RPE y de Müller de la retina, en donde el vector vírico comprende una cápside de AAV8 y un genoma del vector que comprende un promotor (corto) de RLBP1 (SEQ ID NO:3) ligado operablemente a un gen heterólogo. En ciertos aspectos de la invención, el genoma del vector es un genoma autocomplementario.
También se divulgan en el presente documento métodos para expresar RLBP1 en células de RPE y células de Müller de la retina. En ciertos aspectos de la divulgación el método comprende poner en contacto las células retinianas con un vector vírico que comprende una cápside de AAV y un genoma del vector que comprende una secuencia que codifica RLBP1 ligada operablemente a un promotor de RLBP1, que puede ser un promotor (corto) de RLBP1 (SEQ ID NO:3). En ciertos aspectos de la divulgación la cápside de AAV es de AAV2. En ciertos aspectos diferentes, la cápside de AAV es de AAV8. En otros aspectos de la divulgación el método comprende poner en contacto las células retinianas con un vector vírico que comprende una cápside de AAV y un genoma del vector que comprende una secuencia que codifica RLBP1 ligada operablemente a un promotor de RLBP1, que puede ser un promotor (largo) de RLBP1 (SEQ ID NO: 10). En ciertos aspectos de la divulgación la cápside de AAV es de AAV2. En cierta divulgación diferente, la cápside de AAV es de AAV8.
En la técnica se conocen métodos para generar vectores víricos y estos permitirían al experto generar los vectores víricos de la invención (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 7465583), incluidos los vectores víricos descritos en la Tabla 4, utilizando los plásmidos descritos en la Tabla 2 y los Ejemplos.
En general, los métodos para producir los vectores rAAV se pueden aplicar para producir los vectores víricos de la invención; la principal diferencia de los métodos es la estructura de los elementos genéticos que se van a empaquetar. Para producir un vector vírico de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar secuencias de los elementos genéticos y plásmidos como se describen en la Tabla 2 para producir el genoma vírico encapsidado.
Los elementos genéticos como se describen en la Tabla 2 están en el contexto de un plásmido circular, pero un experto en la técnica apreciará que se puede proporcionar un sustrato de ADN en cualquier forma conocida en la técnica, que incluye, sin carácter limitante, plásmido, vector de ADN desnudo, cromosoma artificial bacteriano (BAC, por sus siglas en inglés), cromosoma artificial de levaduras (YAC, por sus siglas en inglés) o un vector vírico (p. ej., vectores de adenovirus, herpesvirus, virus de Epstein-Barr, AAV, baculovirus, retrovirus y similares). Como alternativa, los elementos genéticos en la Tabla 2 necesarios para producir los vectores víricos descritos en el presente documento se pueden incorporar de manera estable al genoma de una célula de empaquetamiento.
Las partículas del vector vírico de acuerdo con la invención se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica, p. ej., Introduciendo las secuencias que se van a replicar y empaquetar en una célula de empaquetamiento o permisiva, según se entienden estos términos en la técnica (p. ej., una célula «permisiva» puede ser infectada o transducida por el virus; una célula «de empaquetamiento» es una célula transformada de manera estable que proporciona funciones auxiliares).
Por ejemplo, se proporciona un método para producir un vector vírico con RLBP1, en donde el método comprende proporcionar a una célula permisiva para la replicación de parvovirus: (a) una secuencia de nucleótidos que contiene los elementos genéticos para producir un genoma del vector de la invención (como se describe detalladamente más adelante y en la Tabla 2); (b) secuencias de nucleótidos suficientes para la replicación de la secuencia del genoma del vector en (a) para producir un genoma del vector; (c) secuencias de nucleótidos suficientes para empaquetar el genoma del vector en una cápside de parvovirus, en condiciones suficientes para que se produzcan en la célula los vectores virales que comprenden el genoma del vector encapsidado dentro de la cápside del parvovirus. Preferentemente, las secuencias que codifican la cápside y/o de replicación del parvovirus son secuencias de AAV.
Se puede emplear cualquier método para introducir la secuencia de nucleótidos que portan los casetes génicos descritos más adelante en una célula hospedadora para la replicación y el empaquetamiento, incluidos, sin carácter limitante, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección, liposomas catiónicos o aniónicos y liposomas en combinación con una señal de ubicación nuclear.
Y los vectores víricos descritos en el presente documento se pueden producir utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, la transfección triple o producción de virus mediada por baculovirus. Se puede emplear cualquier célula permisiva o de empaquetamiento adecuada conocida en la técnica para producir los vectores. Se prefieren las células de mamífero. También se prefieren las líneas de células de empaquetamiento trans-complementarias que proporcionan funciones eliminadas de un virus auxiliar defectuoso en la replicación, p. ej., células 293 u otras células trans-complementarias E1a. También se prefieren células de mamífero o líneas celulares que son defectuosas para la reparación del ADN como se sabe en la técnica y estas líneas celulares presentarán una alteración en su capacidad para corregir las mutaciones introducidas en los plásmidos descritos en el presente documento.
El casete génico puede contener algunos o todos los genes cap y rep de parvovirus (p. ej., AAV). Preferentemente, sin embargo, se proporcionan algunas o todas las funciones de cap y rep en trans introduciendo un vector o vectores de empaquetamiento que codifican las proteínas de la cápside y/o Rep en la célula. De la manera más preferente, el casete génico no codifica las proteínas de la cápside o Rep. Como alternativa, se utiliza una línea de células de empaquetamiento que se transforma de manera estable para expresar los genes cap y/o rep (véanse, p. ej., Gao et al., (1998) Human Gene Therapy 9:2353; Inoue et al., (1998) J. Virol. 72:7024; Patente de EE. UU. N.° 5837484; documento WO 98/27207; Patente de EE. UU. N.° 5658785; documento WO 96/17947).
Además, las funciones del virus auxiliar se proporcionan preferentemente para que el vector viral propague nuevas partículas víricas. Tanto el adenovirus como el virus del herpes simple pueden actuar como virus auxiliares para AAV. Véase, p. ej., BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capítulo 69 (3.a ed., Lippincott-Raven Publishers). Los virus auxiliares de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, el virus del herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) varicela zóster, citomegalovirus y virus de Epstein-Barr. La multiplicidad de infección (MDI) y la duración de la infección dependerán del tipo de virus utilizado y la línea de células de empaquetamiento empleada. Se puede emplear cualquier virus auxiliar adecuado. Preferentemente, el vector auxiliar es un plásmido, por ejemplo, como describe en Xiao et al., (1998) J. Virology 72:2224. El vector se puede introducir en la célula de empaquetamiento mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, como se ha descrito anteriormente.
Se pueden obtener reservas de vector exentas del virus auxiliar contaminante mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un virus autocomplementario o monocatenario recombinante y un virus auxiliar se pueden diferenciar fácilmente en función del tamaño. Los virus también se pueden separar del virus auxiliar en función de la afinidad por un sustrato de heparina (Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973). Preferentemente, se utilizan virus auxiliares con deleciones que hacen que sean defectuosos en la replicación de manera que ningún virus auxiliar contaminante sea competente en cuanto a la replicación. Como una alternativa adicional, se puede emplear un adenovirus auxiliar que carezca de expresión génica tardía, ya que solo se requiere la expresión génica temprana de adenovirus para mediar en el empaquetamiento del duplex del virus. En la técnica se conocen mutantes de adenovirus defectuosos para la expresión génica tardía (p. ej., mutantes de adenovirus ts149 y ts100K).
Un método para proporcionar funciones auxiliares emplea un miniplásmido de adenovirus no infeccioso que porta todos los genes auxiliares requeridos para la producción eficaz de AAV (Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295; Xiao et al., (1998) J. Virology72:2224). Los títulos de rAAV obtenidos con miniplásmidos de adenovirus son 40 veces más altos que los obtenidos con los métodos convencionales de infección con adenovirus naturales (Xiao et al., (1998) J. Virology 72:2224). Esta estrategia obvia la necesidad de realizar cotransfecciones con adenovirus (Holscher et al., (1994), J. Virology 68:7169; Clark et al., (1995) Hum. Gene Ther. 6:1329; Trempe y Yang, (1993), en el Quinto Congreso sobre Parvovirus, Crystal River, Fla.).
Se han descrito otros métodos para producir una reserva de rAAV incluidos, sin carácter limitante, métodos que dividen los genes rep y cap en casetes de expresión separados para evitar la generación de AAV competentes en cuanto a la replicación (véase, p. ej., Allen et al., (1997) J. Virol. 71:6816), métodos que emplean líneas de células de empaquetamiento (véanse, p. ej., Gao et al., (1998) Human Gene Therapy 9:2353; Inoue et al., (1998) J. Virol. 72:7024; Patente de EE. UU. N.° 5837484; documento WO 98/27207; Patente de EE. UU. N.° 5658785; documento WO 96/17947), y otros sistemas exentos de virus auxiliares (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N.° 5945335 de Colosi).
También se puede utilizar herpesvirus como un virus auxiliar en métodos de empaquetamiento de AAV. El herpesvirus híbrido que codifica la proteína o proteínas Rep de AAV puede convenientemente facilitar la generación de esquemas de producción del vector AAV con mayor capacidad de cambiar la escala. Se han descrito virus del herpes simple híbridos de tipo I (HSV-I) que expresan los genes rep y cap de AAV-2 (Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986 y documento WO 00/17377).
En resumen, se proporcionan a una célula (p. ej., una célula permisiva o de empaquetamiento) el casete génico que se va a replicar y empaquetar, los genes cap de parvovirus, los genes rep de parvovirus apropiados y (preferentemente) las funciones auxiliares para producir partículas de rAAV que portan el genoma del vector. La expresión combinada de los genes rep y cap codificados por el casete génico y/o el vector o los vectores de empaquetamiento y/o la célula de empaquetamiento transformada de manera estable dan como resultado la producción de una partícula del vector vírico en la que una cápside del vector vírico empaqueta un genoma del vector vírico de acuerdo con la invención. Se permite que los vectores víricos monocatenarios o autocomplementarios se ensamblen dentro de la célula y se pueden recuperar posteriormente mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica y descrito en los ejemplos. Por ejemplo, los vectores víricos se pueden purificar mediante métodos de centrifugación con CsCl estándar (Grieger JC et al., 2006) o mediante diversos métodos de cromatografía en columna conocidos por el experto (véanse: Lock M et al., (2010), Smith RH et al., (2009) y Vadenberghe LH et al., (2010)).
Se pueden emplear los reactivos yn métodos divulgados en el presente documento para producir reservas con un título elevado de los vectores víricos de la invención, preferentemente títulos esencialmente naturales. También se prefiere que la reserva de parvovirus tenga un título de al menos aproximadamente 105 unidades de transducción (ut)/mL, más preferentemente al menos aproximadamente 106 ut/mL, más preferentemente al menos aproximadamente 107 ut/mL, aún más preferentemente al menos aproximadamente 108 ut/mL, aún más preferentemente al menos aproximadamente 109 ut/mL, todavía aún más preferentemente al menos aproximadamente 1010 ut/mL, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 1011 ut/mL, o más.
Además, los vectores víricos con RLBP1 de la invención, pueden tener una relación mejorada de unidad de transducción/partícula respecto a los vectores AAV convencionales. Preferentemente, la relación ut/partícula es inferior a aproximadamente 1:50, inferior a aproximadamente 1:20, inferior a aproximadamente 1:15, inferior a aproximadamente 1:10, inferior a aproximadamente 1:8, inferior a aproximadamente 1:7, inferior a aproximadamente 1:6, inferior a aproximadamente 1:5, inferior a aproximadamente 1:4 o menor. Normalmente, la relación ut/partícula será superior a aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3 o 1:4.
2. Ácidos nucleicos para uso en la generación del vector vírico
La invención también se refiere a ácidos nucleicos útiles para la generación de vectores víricos. En ciertos aspectos de la invención, los ácidos nucleicos útiles para la generación de vectores víricos pueden estar en forma de plásmidos. Los plásmidos útiles para la generación de vectores víricos, también denominados plásmido de vector vírico, pueden contener un casete génico Como mínimo, un casete génico de un plásmido de vector vírico contiene: un gen heterólogo y sus elementos reguladores (p. Ej.: promotor, potenciador y/o intrones, etc.), y las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV en 5' y 3'.
La composición del gen heterólogo y sus elementos reguladores dependerá del uso que se dará al vector resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia génica heteróloga incluye una secuencia indicadora, la cual tras la expresión produce una señal detectable. Tales secuencias indicadoras incluyen, sin carácter limitante, secuencias de a Dn que codifican plactamasa, p-galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina- cinasa, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas unidas a la membrana que incluyen, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína hemaglutinina de la gripe, y otras muy conocidas en la técnica, contra las que existen anticuerpos de afinidad elevada dirigidos a estas o se pueden producir mediante medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína unida a la membrana fusionada de manera apropiada con un dominio antigénico identificador de, entre otros, hemaglutinina o Myc. Por ejemplo, cuando la secuencia indicadora es gen LacZ, la presencia del vector que porta la señal se detecta mediante ensayos de la actividad beta-galactosidasa. Cuando la secuencia indicadora es una proteína fluorescente verde o luciferasa, el vector que porta la señal se puede medir visualmente mediante la producción de color o luz en un luminómetro.
Las secuencias génicas heterólogas, cuando se asocian con los elementos reguladores que impulsan su expresión, proporcionan señales detectables mediante medios convencionales, que incluyen ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia o espectrográficos de otro tipo, ensayos de clasificación celular activada por fluorescencia y ensayos inmunológicos, incluidos el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y de inmunohistoquímica.
El gen heterólogo también puede ser una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, mutantes negativos dominantes o ARN catalíticos. Las moléculas de ARNm deseables incluyen ARNt, ARNbc, ARN ribosómico, ARN catalíticos, ARNip, ARN horquillado pequeño, ARN de trans-corte y empalme y ARN antisentido. Un ejemplo de una secuencia de ARN útil es una secuencia que inhibe o anula la expresión de una secuencia de ácido nucleico diana en el animal tratado.
El gen heterólogo también se puede utilizar para corregir o mejorar deficiencias génicas, que pueden incluir deficiencias en las que los genes normales se expresan en niveles inferiores de los normales o deficiencias en las que el producto génico funcional no se expresa. Se contempla en la presente invención que la secuencia génica heteróloga pueda ser una secuencia que codifica RLBP1. Se proporcionan ejemplos de secuencias que codifican RLBP1 en la Tabla 1: las SEQ ID NOs: 6, 37, 39, 41, 43, 45 o 47.
Además del gen heterólogo, el casete génico puede incluir elementos reguladores ligados operablemente al gen heterólogo. Estos elementos reguladores pueden incluir secuencias de iniciación y terminación de la transcripción, promotoras y potenciadoras apropiadas, señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de la traducción; secuencias que potencian la estabilidad proteica; y cuando se desea, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. En la técnica se conoce un gran número de secuencias reguladoras, incluidos promotores que sean nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos del tejido, y pueden utilizarse. Las secuencias de elementos reguladores de la invención incluyen las descritas en la Tabla 1, por ejemplo, las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8, 10, 11, 12 y 22.
El casete génico puede incluir un promotor de RLBP1 con una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 o 10 ligada operablemente a un gen heterólogo. En particular, el promotor corto de RLBP1 (SEQ ID NO: 3) está ligado operablemente a una secuencia que codifica RLBP1 (SEQ ID NO: 6, 37, 39, 41,43, 45 o 47). Como alternativa, el promotor largo de RLBP1 (SEQ ID NO: 10) está ligado operablemente a una secuencia que codifica RLBP1 (SEQ ID NO: 6, 37, 39, 41, 43, 45 o 47).
Se contempla que se puedan utilizar las ITR de un serotipo 2 de AAV (p. ej.: SEQ ID NO: 2, 9, 16, 17, 36). Sin embargo, se pueden seleccionar ITR de otros serotipos adecuados entre cualquier serotipo de AAV conocido en la técnica y descrito en el presente documento. Estas ITR y otros componentes de AAV se pueden aislar fácilmente utilizando técnicas de las que disponen los expertos en la técnica a partir de cualquier serotipo de AAV conocido, o serotipos aún por identificar, por ejemplo, las secuencias de AAV se pueden obtener mediante medios adecuados sintéticos o de otro tipo mediante referencia a secuencias publicadas tales como las disponibles en la bibliografía o en bases de datos tales como, p. ej., GenBank, PubMed o similares. Como alternativa, tales componentes de AAV también se pueden aislar u obtener de fuentes académicas, comerciales o públicas (p. ej., la Colección de Cultivos Tipo Estadounidense, Manassas, Va.).
Se contempla que en ciertos aspectos de la invención, una ITR del casete génico pueda ser una ITR modificada o ITR sin resolución, secuencia sin el sitio de resolución terminal (TRS). Durante la replicación de un casete génico que comprende una ITR sin resolución, la incapacidad de la proteína Rep para resolver la ITR sin resolución dará como resultado una secuencia repetida invertida dimérica (es decir: autocomplementaria) con una ITR sin resolución (p. ej.: AITR) en el medio y una ITR natural en cada extremo. La secuencia resultante es una secuencia del genoma vírico autocomplementaria de manera que el genoma es capaz de formar una estructura en forma de horquilla tras la liberación desde la cápside (véanse también: documento US7465583 y McCarty (2008)). Se puede producir una ITR sin resolución mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la inserción en la ITR desplazará la TRS y dará como resultado una ITR sin resolución. Preferentemente, la inserción es en la región del sitio TRS. Como alternativa, la ITR se puede convertir en una sin resolución mediante deleción del sitio TRS, un ejemplo específico incluye AITR (SEQ ID NO: 1).
La invención se refiere a ácidos nucleicos que comprenden un casete génico que comprende en la dirección de 5' a 3' secuencias de ácido nucleico seleccionadas entre las siguientes: a) las SEQ ID NO: 2, 10, 5, 6, 8 y 9; y b) las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 23 y 9. También se divulgan ácidos nucleicos que comprenden un casete génico que comprende en la dirección de 5' a 3' secuencias de ácido nucleico seleccionadas entre las siguientes: a) las SEQ ID NO: 2, 11, 5, 6, 8, 14 y 9; b) las SEQ ID NO: 2, 22, 5, 6, 8, 23 y 9; c) las SEQ ID NO: 2, 10, 5, 24, 8 y 9; d) las SEQ ID NO: 2, 11, 24, 8, 14 y 9; y e) las SEQ ID NO: 2, 12, 24, 8, 14 y 9. En ciertos aspectos el ácido nucleico que comprende el casete génico puede ser un plásmido. En particular, la secuencia del plásmido puede tener una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34 y 35.
La invención también se refiere a ácidos nucleicos que comprenden un casete génico que comprende en la dirección de 5' a 3' las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 6, 8 y 9. También se divulgan ácidos nucleicos que comprenden un casete génico que comprende en la dirección de 5' a 3' las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 24, 8 y 9. En ciertos aspectos el ácido nucleico que comprende el casete génico puede ser un plásmido. En particular, la secuencia del plásmido puede tener una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 26, 31 y 50.
En la técnica se conocen muy bien los métodos para incorporar los elementos en la Tabla 2 y estos permitirían al experto generar los ácidos nucleicos y plásmidos de la invención utilizando los métodos resumidos en la Tabla 3 y los Ejemplos.
3 Composiciones farmacéuticas
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprende los vectores víricos de la invención que se formulan junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener adicionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos que son adecuados para tratar o prevenir, por ejemplo, la distrofia retiniana asociada con RLBP1 y/o la retinosis pigmentaria (RP). Los portadores farmacéuticamente aceptables potencian o estabilizan la composición o se pueden utilizar para facilitar la preparación de la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, surfactantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles.
Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar mediante diversos métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Se prefiere que la administración sea subretiniana. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para la administración subretiniana, intravítrea, intravenosa, subcutánea o tópica.
La composición debe ser estéril y fluida. Se puede mantener una fluidez adecuada, por ejemplo, utilizando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y utilizando surfactantes. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar de acuerdo con métodos muy conocidos y puestos en práctica de manera habitual en la técnica. Véanse, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a ed., 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones GMP. Normalmente, se emplea una dosis terapéuticamente eficaz o dosis eficaz del vector vírico en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los vectores víricos se pueden formular en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables mediante métodos habituales conocidos por los expertos en la técnica. Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar una única inyección intravenosa rápida, se pueden administrar varias dosis divididas durante un periodo de tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente favorable formular composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma farmacéutica unitaria, como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido.
Los niveles posológicos reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado depende de diversos factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de la composición particular de la presente invención empleada, la vía de administración, el momento de administración, la tasa de eliminación del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historial médico del paciente que se está tratando, y factores similares.
Un médico o veterinario puede comenzar con dosis de los vectores víricos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se consiga el efecto deseado. En general, las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de la distrofia retiniana asociada con RLBP1 como se describe en el presente documento, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluidos medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Es necesario titular las dosis del tratamiento para optimizar la seguridad y eficacia. Para la administración subretiniana con un vector vírico, la dosis puede variar de 1×108 genomas del vector (gv)/ojo a 1×1012 gv/ojo. Por ejemplo, la dosis puede ser de 1×108 gv/ojo, 2.5×108 gv/ojo, 5×108 gv/ojo, 7.5×108 gv/ojo, 1×109 gv/ojo, 2.5×109 gv/ojo, 5×109 gv/ojo, 7.5×109 gv/ojo, 1×1010 gv/ojo, 2.5×1010 gv/ojo, 5×1010 gv/ojo, 7.5×1010 gv/ojo, 1^1011 gv/ojo, 2.5X1011 gv/ojo, 5×1011 gv/ojo, 7.5×1011 gv/ojo, 1×1012 gv/ojo.
Los vectores víricos descritos en el presente documento se utilizan principalmente como dosis únicas por ojo, con la posibilidad de una administración repetida para tratar regiones de la retina que no se hayan cubierto en la administración anterior. La dosis de la administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.
4. Usos terapéuticos
Los vectores víricos como se describen en el presente documento se pueden utilizar a una concentración terapéuticamente útil para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el ojo, administrando a un sujeto que lo necesite, una cantidad eficaz de los vectores víricos de la invención. También se divulga un método para tratar una distrofia retiniana asociada con RLBP1, administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un vector vírico que comprende una secuencia que codifica RLBP1.
La presente invención proporciona un vector vírico que comprende una secuencia que codifica RLBP1 para su uso en el tratamiento de una distrofia retiniana asociada con RLBP1 en un sujeto.
Tabla A: Mutaciones de RLBP1 y fenotipos asociados de distrofia retiniana asociada con RLBP1. Los fenotipos de enfermedad de la distrofia retiniana asociada con RLBP1 incluyen: Retinosis pigmentaria recesiva autosómica (AARP, por sus siglas en inglés), distrofia de Bothnia (BD, por sus siglas en inglés), distrofia de bastones y conos de Newfoundland NFR D r i l n in l R inii n l n RPA F n l i n FA.
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Se ha mostrado que el uso de AAV recombinantes es factible y seguro para el tratamiento de las retinopatias (véanse, p. ej., Bainbridge et al., 2008, Houswirth et al., 2008, Maguire et al., 2008). Los vectores víricos de la invención se pueden utilizar, entre otras cosas, para tratar y prevenir la progresión de la distrofia retiniana asociada con RLBP1 y mejorar la pérdida de visión. Los vectores víricos de la invención también se pueden utilizar en pacientes en donde otra distrofia retiniana está provocada por otras mutaciones de pérdida de función en el gen RLBP1, por ejemplo, la retinosis pigmentaria recesiva autosómica, retinitis punctata albescens y fundus albipunctatus.10*5
También se divulga un método para expresar una secuencia que codifica RLBP1 en células de RPE y de Müller de la retina, administrando vectores víricos de la invención a un sujeto que lo necesita. La presente invención también se refiere a vectores víricos de la invención para su uso en la expresión de una secuencia que codifica RLBP1 en células de RPE y/o de Müller de la retina del sujeto que lo necesita. La divulgación también contempla un método para suministrar una secuencia que codifica RLBP1 a la retina, específicamente a células de RPE y/o de Müller en la retina, de un sujeto que padece distrofia retiniana asociada con RLBP1. Se contempla que la una secuencia que codifica RLBP1 se suministre a un sujeto que lo necesita poniendo en contacto la retina, células de RPE y/o de Müller del sujeto con un vector vírico como se describe en el presente documento. Como alternativa, se suministra una secuencia que codifica RLBP1 a un sujeto administrando al sujeto un vector vírico como se describe en el presente documento.
También se divulgan métodos para expresar una secuencia que codifica RLBP1 en células de RPE y/o de Müller en la retina de un sujeto que padece distrofia retiniana asociada con RLBP1, poniendo en contacto la retina del sujeto con vectores víricos de la invención. En ciertos aspectos de la divulgación, las células de RPE y/o de Müller de la retina del sujeto se ponen en contacto con vectores víricos de la invención.
Se contempla además que los vectores víricos utilizados en los métodos descritos en el presente documento comprendan una cápside de AAV2 o AAV8, y el genoma del vector comprenda una secuencia que codifica RLBP1 ligada operablemente a un promotor de RLBP1 con una secuencia de nucleótidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 3 o 10. Se contempla además que el genoma del vector pueda ser autocomplementario.
En un aspecto los vectores víricos descritos en el presente documento se pueden administrar por vía subretiniana o intravítrea utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica.
El tratamiento y/o la prevención de una enfermedad ocular tal como la distrofia retiniana asociada con RLBP1 los pueden determinar un oftalmólogo o profesional sanitario utilizando medidas relevantes desde un punto de vista clínico de la función visual y/o anatomía retiniana. El tratamiento de la distrofia retiniana asociada con RLBP1 se refiere a cualquier acción (p. ej., administración de un vector vírico descrito en el presente documento) contemplada para mejorar o conservar la función visual y/o anatomía retiniana. Además, la prevención relacionada con la distrofia retiniana asociada con RLBP1 se refiere a cualquier acción (p. ej., administración de un vector vírico descrito en el presente documento) que previene o ralentiza un empeoramiento de la función visual, anatomía retiniana y/o fenotipo de la enfermedad distrofia retiniana asociada con RLBP1, como se define en el presente documento, en un paciente en riesgo de dicho empeoramiento.
La función visual puede incluir, por ejemplo, agudeza visual, agudeza visual con baja iluminación, campo visual, campo visual central, visión periférica, sensibilidad al contraste, adaptación a la oscuridad, recuperación de una fotoagresión, discriminación de colores, velocidad de lectura, dependencia de dispositivos auxiliares (p. ej., tipo de letra grande, dispositivos de aumento, sistemas ópticos), reconocimiento facial, competencia en el manejo de un vehículo a motor, capacidad de realizar una o más actividades de la vida cotidiana y/o satisfacción comunicada por el paciente en relación con la función visual. Por lo tanto, se puede decir que se produce un tratamiento de la retinosis pigmentaria (RP), específicamente la distrofia retiniana asociada con RLBP1, cuando un sujeto tiene al menos un 10 % de disminución o ausencia de un 10 % o más de aumento en el tiempo respecto a un grado preespecificado de adaptación a la oscuridad. Además, se puede decir que se produce tratamiento de la distrofia retiniana asociada con RLBP1 cuando un sujeto muestra ceguera nocturna grave precoz y adaptación a la oscuridad lenta cuando es joven, seguidas de pérdida progresiva de la agudeza visual, campos visuales y visión cromática, lo que da lugar a ceguera legal determinada por un profesional sanitario cualificado (es decir, oftalmólogo) (Burstedt y Monestam, 2010).
Los ejemplos de medidas de la función visual incluyen agudeza visual de Snellen, agudeza visual de ETDRS, agudeza visual con poca luminosidad, rejilla de Amsler, campo visual de Goldmann, perimetría automática convencional, microperimetría, diagramas de Pelli-Robson, tarjeta SKILL, placas de color de Ishihara, prueba de color de Farnsworth D15 o D100, electrorretinografía convencional, electrorretinografía multifocal, pruebas validadas para la velocidad de lectura, reconocimiento facial, simulaciones de conducción y satisfacción comunicada por el paciente. Por tanto, puede decirse que se consigue el tratamiento la distrofia retiniana asociada con RLBP1 tras un aumento de o ausencia de pérdida de 2 o más líneas (o 10 letras) de visión en una escala de ETDRS. Además, puede decirse que se produce tratamiento de la distrofia retiniana asociada con RLBP1 cuando un sujeto presenta al menos un 10 % de aumento o ausencia de un 10 % de disminución en la velocidad de lectura (palabras por minuto). Además, puede decirse que se produce tratamiento de la distrofia retiniana asociada con RLBP1 cuando un sujeto muestra al menos un 20 % de aumento o ausencia de un 20 % de disminución en la proporción de placas identificadas correctamente en una prueba de Ishihara o discos secuenciados correctamente en una prueba de Farnsworth. Por lo tanto, el tratamiento de, por ejemplo, la distrofia retiniana asociada con RLBP1, puede determinarse mediante, por ejemplo, una mejora en la velocidad de adaptación a la oscuridad, o una mejora en, o ralentización de la velocidad de, la pérdida de la agudeza visual.
Los aspectos indeseables de la anatomía retiniana que se pueden tratar o prevenir incluyen, por ejemplo, la atrofia retiniana, atrofia del epitelio pigmentario retiniano, estrechamiento de los vasos retinianos, aglutinamiento pigmentario, puntos amarillos/blancos retinianos, líquido subretiniano.
Los ejemplos de medios para evaluar la anatomía retiniana incluyen oftalmoscopia, fotografía del fondo, angiografía con fluoresceína, angiografía con verde de indocianina, tomografía de coherencia óptica (OCT, por sus siglas en inglés), tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, oftalmoscopia por barrido con láser, microscopía confocal, óptica adaptativa, autofluorescencia del fondo, biopsia, necropsia e inmunohistoquímica. Por lo tanto, puede decirse que se trata la distrofia retiniana asociada con RLBP1 en un sujeto en función de lo determinado mediante, por ejemplo, una reducción en la velocidad de desarrollo de la atrofia retiniana.
A los sujetos que van a ser tratados con los agentes terapéuticos de la presente invención también se les pueden administrar otros dispositivos o agentes terapéuticos de eficacia conocida para tratar la distrofia retiniana tales como preparados de vitaminas y minerales, ayudas para la deficiencia visual, perros de asistencia u otros dispositivos de los que se sabe que ayudan a pacientes con deficiencia visual.
En la actualidad no se dispone de otros agentes terapéuticos aprobados para el tratamiento de la distrofia retiniana asociada con RLBP1. Según aparecen nuevas terapias, las dos se pueden administrar secuencialmente en cualquier orden o simultáneamente según esté indicado desde un punto de vista clínico.
EJEMPLOS
Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar adicionalmente la invención pero no para limitar su alcance, el cual está definido por las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Construcción de plásmidos AAV-ITR:
1.1 Clonación de plásmidos AAV-ITR:
Las secuencias de ácido nucleico de los elementos del plásmido individual se describen en la Tabla 1. Las secuencias se sintetizaron o se adquirieron de proveedores comerciales. La Tabla 2 describe elementos que existen en cada plásmido que se construyó. Se utilizaron técnicas de clonación de biología molecular estándar para generar los plásmidos como los descritos en la Tabla 3. Se utilizó el esqueleto plasmídico pAAV-MCS (Stratagene®) con resistencia a ampicilina o pUC57 con resistencia a kanamicina como el esqueleto y material de partida. Se clonaron los elementos de la secuencia individual en los sitios enzimáticos de restricción o utilizando clonación con extremos romos.
Debido a que el casete génico de resistencia a antibióticos contenido en el esqueleto plasmídico no desempeña ninguna función en la producción de los vectores AAV, un experto en la técnica podría utilizar esqueletos plasmídicos alternativos y/o casetes génicos de resistencia a antibióticos y generar los mismos vectores víricos. Hemos demostrado que se pueden generar vectores NVS2 funcionalmente equivalentes utilizando plásmidos con diferentes esqueletos. Por ejemplo, las secuencias plasmídicas SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 50 producen vectores NVS2 funcionalmente equivalentes.
1.2. Transfección plasmídica triple para producir vectores rAAV:
Los vectores víricos AAV recombinantes (rAAV) se generaron mediante métodos de transfección triple. En la técnica se conocen métodos para la transfección triple (Ferrari FK et al., 1997). Resumiendo, se utilizaron los plásmidos que contienen AAV-ITR (descritos en la Tabla 2), plásmido que contiene AAV-RepCap (que porta Rep2 y Cap2 y Cap8) y plásmido adenoauxiliar (que porta genes que facilitan que se complete el ciclo de replicación de AAV) para cotransfectar células 293. Las células se cultivaron durante 4 días. Al final del periodo de cultivo las células se lisaron y los vectores en el sobrenadante del cultivo y en el lisado celular se purificaron mediante un método estándar de centrifugación con gradiente de CsCl (método modificado basándose en Grieger JC et al., 2006). Los vectores víricos purificados se describen en la Tabla 4.
Como alternativa, se generaron vectores rAAV similares a GMP mediante los métodos de transfección y cultivo celulares descritos anteriormente. El material del cultivo celular recolectado se procesó a continuación mediante cromatografía en columna basándose en métodos descritos por Lock M et al., (2010), Smith RH et al., (2009) y Vadenberghe LH et al., (2010).
1.3. Variación de secuencias ITR en 5’:
Como se ha descrito previamente (Samulski et al., 1983; Muzyczka et al., 1984), las mutaciones dentro de las secuencias con repeticiones terminales de los plásmidos AAV se toleran bien en la generación de vectores AAV funcionales. Incluso con plásmidos en los que se habían eliminado una de las dos ITR, las secuencias de AAV se pudieron recuperar, replicar y producir viriones infecciosos, siempre que la ITR existente en el constructo contenga la secuencia ITR de AAV completa (Samulski et al., 1983; Muzyczka et al., 1984). Por lo tanto aun cuando se utiliza la SEQ.ID.NO.2 como la secuencia ITR en 5’ de todos los vectores AAV monocatenatenarios descritos en este documento; se espera que cualquier secuencia ITR en 5’ que porte el sitio de resolución terminal (es decir: las SEQ.ID.NO. 2, 16 y 17) produciría vectores con la misma funcionalidad.
Tabla 1 Secuencia del vector vírico elementos del plásmido
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
T l 2. m i i n l l mi
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000062_0002
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000068_0002
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
T l . n r i n l l mi
Figure imgf000075_0002
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000078_0002
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000079_0002
Tabla 4. Composición de vector vírico: Genoma del vector Cápside
Figure imgf000079_0003
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000080_0002
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000081_0007
Figure imgf000081_0002
Figure imgf000081_0005
Figure imgf000081_0008
Figure imgf000081_0003
Figure imgf000081_0006
Figure imgf000081_0004
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000082_0002
Figure imgf000082_0003
Figure imgf000082_0004
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000083_0002
Figure imgf000083_0003
Figure imgf000084_0003
Figure imgf000084_0002
Figure imgf000084_0005
Figure imgf000084_0004
Figure imgf000084_0006
Figure imgf000084_0007
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000085_0002
Ejemplo 2: Inyección subretiniana de vectores rAAV en ratones
2.1 Inyección subretiniana de vectores rAAV en ratones
La inyección subretiniana de un vector rAAV puede conseguir una transducción eficaz de RPE y otras células retinianas debido a que la inyección subretiniana induce una vesícula de virus concentrados en contacto íntimo con células de RPE y la retina neural. Además, el espacio subretiniano tiene un grado relativamente elevado de inmunoprivilegio y normalmente se observan muy pocos indicios de inflamación en las proximidades del sitio de inyección. Por lo tanto, la inyección subretiniana fue una vía preferida para el suministro de los vectores rAAV en la retina de ratón. Sin embargo, se pueden utilizar otras vías de suministro, por ejemplo, la inyección intravítrea.
Materiales/reactivos:
• Microscopio quirúrgico oftálmico Leica M844 F40
• Ciclopentolato al 1 %: Bausch & Lomb n.° Cat. 965911
• Fenilefrina al 2,5 %-10 %: Altaire Pharmaceuticals n.° Cat. 05626
• Proparacaína al 0,5 %: Bausch & Lomb n.° Cat NDC 54799-500-12
• Jeringuilla Hamilton de 10 |jL: VWR n.° Cat. 89184-476
• Aguja de extremo romo 33G: Hamilton n.° Cat. 7803-05
• Sal sódica de fluoresceína: Sigma n.° Cat. F6377
Artículos de prueba utilizados en este ejemplo:
• vector vírico scAAV8-pRLBP1(corto)-eGFP 1×109 gv/ojo
• vector vírico AAV8-pRLBP1(largo)-eGFP 1×109 gv/ojo
• vector vírico AAV8-pRPE-eGFP 1×109 gv/ojo
• vector vírico AAV8-VMD2-eGFP 1×109 gv/ojo
Protocolo:
La inyección subretiniana se realizó en ambos ojos o unilateralmente en el ojo derecho. Todos los procedimientos se realizaron en condiciones asépticas, utilizando reactivos, jeringuillas y equipo de protección personal apropiado estériles.
Procedimientos de inyección subretiniana:
• Las pupilas de los ratones se dilataron con 1 gota de ciclopentolato al 1 % y después 1 gota de fenilefrina al 2,5 %-10 %
• El ratón se anestesió utilizando Avertin (250 mg/kg) i.p. y una gota de Proparacina al 0,5 % por vía tópica (anestésico local) en el ojo
• Se realizó una incisión de aproximadamente 0,5 mm por vía nasal, detrás del limbo con un microbisturí
• La aguja con extremo romo en la jeringuilla Hamilton de 10 |jL se insertó tangencialmente a través de la incisión escleral hacia la retina temporal. La aguja se hizo avanzar hasta que se sintió resistencia. A continuación se inyectó lentamente 1 j L de vector rAAV diluido (que contenía fluoresceína con una concentración de 1:50) en el espacio subretiniano y se retiró la aguja a través de la incisión
• Se examinó el ojo y se confirmó el éxito de la inyección subretiniana mediante visualización de una vesícula que contenía fluoresceína. Se calificaron el éxito de la inyección y el grado de daño retiniano (hemorragia).
• Se aplicó una pomada antibiótica al ojo inmediatamente después de la inyección
2.2. Los vectores rAA V indujeron la expresión de GFP y aspectos específicos del tipo celular en la retina de ratón Para estudiar la transducción génica inducida por el vector rAAV y los aspectos específicos del tipo celular en la retina de ratón, se examinaron la expresión de eGFP en cortes transversales retinianos y preparaciones microscópicas planas (flatmounts) de RPE/retina. Una estrategia utilizada para identificar los tipos celulares que expresan eGFP fue comarcar las células positivas para eGFP con marcadores de células retinianas mediante tinción de inmunocitoquímica en criocortes.
Materiales/reactivos:
Anticuerpos primarios para la tinción de inmunocitoquímica:
• Anticuerpo anti-CRALBP: Thermo n.° cat. MA1-813
• Anticuerpo anti-GFAP: Covance n.° cat. SMI- 21
• Anticuerpo anti-Opsina azul: Millipore n.° cat. AB 5407
• Anticuerpo anti-Opsina roja: Millipore n.° cat. AB5405
• Anticuerpo anti-Vimentina: Santa Cruz n.° cat. sc-7557
• Anticuerpo anti-PKC a: C-20 Santa Cruz n.° cat. sc -208
Anticuerpos secundarios para la tinción de inmunocitoquímica:
• de cabra anti-IgG de ratón: Invitrogen n.° Cat. A11005
• de cabra anti-IgG de rata: Invitrogen n.° Cat. A11007
• de burro anti-IgG de conejo: Invitrogen n.° Cat. A21207
Otros materiales/reactivos:
• Medio de montaje Vectashield con DAPI: Vector Laboratories, Burlingame n.° Cat. H-1200),
• Sistema de obtención de imágenes de Zeiss, Software AxioVision
• Microscopio confocal LSM 510 de Zeiss, versión ZEN del software de Zeiss
Protocolo:
Se extrajo el globo ocular de un ratón y se colocó en PFA (paraformaldehído) al 4 % durante 2 horas a 25 °C y después en tampón de PBS durante 1-3 días a 4°C hasta la disección. Se extrajeron la córnea, cristalino y vítreo del globo ocular y se obtuvo una preparación microscópica plana de RPE/coroides y retina con medio de montaje Vectashield en el portaobjetos. La expresión de GFP en la preparación microscópica plana se capturó mediante un sistema de obtención de imágenes de Zeiss y se cuantificó utilizando el software AxioVision. Después de la obtención de imágenes, los portaobjetos con las preparaciones microscópicas planas retinianas se colocaron en tampón tritón al 0,25 % a 25 °C durante 30 min y después se retiraron las preparaciones microscópicas planas retinianas de los portaobjetos. Las áreas positivas para eGFP de las preparaciones microscópicas planas retinianas se cortaron, se incluyeron en OCT y se criocortaron. Se aplicó la tinción de inmunocitoquímica utilizando marcadores de células retinianas a los criocortes. Las imágenes se capturaron con un microscopio confocal LSM 510 de Zeiss y la versión ZEN del software de Zeiss.
Los procedimientos de tinción de inmunocitoquímica:
Día 1.
• secar los cortes con aire a temperatura ambiente durante 1 hora.
• colocar los portaobjetos en PBS 0,25 % de Tritón 15 min * 2
• bloquear en 1 % de BSA PBS 0,25 % de Tritón 90 min
• incubar los portaobjetos con el anticuerpo primario en 1 % de BSA PBS 0,25 % de Tritón a 4 °C durante la noche
Día 2.
• extraer los portaobjetos de 4 °C, dejarlos a 25 °C durante 30 min
• lavar los portaobjetos en PBS 0,25 % de Tritón 15 min * 2
• incubar los portaobjetos con anticuerpo secundario 1:800 a 25 °C durante 90 min
• lavar los portaobjetos en PBS 0,25 % de Tritón 15 min * 2
• montar los portaobjetos con medio de montaje Vectashield con DAPI
Tabla 5. Marcadores de células retinianas diluciones utilizados en el estudio
Figure imgf000087_0001
Tabla 6. Resultados de la inmunohistoquímica que describen la transducción de tipos celulares con vectores víricos de prueba.
Figure imgf000088_0001
Resultados:
• Todos los vectores víricos estudiados fueron funcionales en la retina de ratón.
• El vector scAAV8-pRLBP1(corto)-eGFP da lugar a la expresión selectiva de GFP en RPE y las células de Müller en la retina neural.
• AAV8-pRLBP1(largo)-eGFP da lugar a la expresión de GFP en células de RPE, de Müller y fotorreceptores en la retina neural.
• AAV8-pRPE65-eGFP y AAV8-pVMD2-eGFP da lugar a la expresión de GFP en RPE y fotorreceptores en la retina neural.
Conclusión
Estos resultados demuestran que la combinación de un promotor, conformación de genoma de AAV y secuencia de la cápside de AAV pueden dar lugar a diferentes propiedades de transducción en tipos celulares específicos, para conseguir el efecto deseado. La expresión del producto del gen RLBP1 en células de RPE y de Müller en la retina, representa la expresión en el tipo celular diana deseada. El promotor corto de RLBP1 empaquetado en un genoma autocomplementario junto con una cápside de serotipo AAV8 induce la expresión génica en células de RPE y de Müller en la retina neural sin expresión en células que no son la diana.
El promotor de RLBP1-largo empaquetado en un genoma monocatenario junto con una cápside del serotipo AAV8 induce la expresión génica en células de RPE y de Müller, que son tipos celulares diana, y también en fotorreceptores, que es un tipo celular que no es la diana.
El promotor de RPE65 y de VMD2 empaquetado en un genoma monocatenario junto con una cápside de serotipo AAV8 induce la expresión génica en células de RPE pero también en fotorreceptores, que es un tipo celular que no es la diana.
Ejemplo 3: Ensayo con ARNm para medir la expresión mediada por el vector de un transgén de RLBP1 humano respecto a la expresión endógena de ARNm de RLBP1 de ratón.
Los niveles de expresión y la especificidad tisular de un transgén transducido con rAAV variarán dependiendo del serotipo del vector, el genoma del vector, el promotor específico del tejido utilizado y la dosis inyectada. Un objetivo de la terapia de reemplazo génico es conseguir un nivel de expresión que sea suficiente para compensar la expresión del gen endógeno ausente a la vez que se evite sobreexpresar el gen en niveles tóxicos.
Se ha desarrollado un ensayo para medir la expresión mediada por el vector de ARNm de RLBP1 humano respecto a los niveles endógenos de ARNm de RLBP1 de ratón tras las inyecciones subretinianas de diversos vectores de AAV con dosis diferentes en ratones naturales. Este ensayo utilizó ensayos de expresión de genes Taqman® que contenían cebadores y sondas para detectar específicamente ADNc de RLBP1 humano o de ratón. Antes de realizar el experimento, se estudiaron los ensayos de expresión de genes Taqman® en cuanto a la especificidad de especies utilizando ADN plasmídico que contenía secuencias de ADNc de RLBP1 humano o de ratón. Resumiendo, se utilizaron reactivos Taqman® para coamplificar ADNc de RLBP1 humano o de ratón con ADNc de GAPDH de ratón como un control endógeno. Los niveles de RLBP1 humano o de ratón se normalizaron respecto al control de GAPDH interno y después se compararon estos niveles normalizados entre sí. Materiales/reactivos:
• Extracción de ARN
o Microkit RNeasy de Qiagen (Qiagen n.° cat. 74004)
o Conjunto de DNasa sin RNasa de Qiagen (Qiagen n.° cat. 79254)
o Beta-Mercaptoetanol (Sigma n.° cat. 63689)
o Esferas de 5 mm de acero inoxidable de Qiagen (Qiagen n.° cat. 69989)
° Tubo de microcentrífuga de 2,0 mL Seal Rite (USA Scientific n.° cat. 1620-2700)
o TissueLyser II de Qiagen (n.° cat. 85300)
• Síntesis de ADNc
o Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems n.° cat. 4368814) o Inhibidor de RNasa (Applied Biosystems n.° cat. N8080119)
o Ciclador térmico BioRad
• PCR de cuantificación relativa
° Mezcla maestra para PCR universal TaqMan® 2X (Applied Biosystems n.° cat. 4304437)
° Ensayo de expresión génica TaqMan® 20X para RLBP1 humano (Applied Biosystems n.° cat. 4331182: Hs00165632.m1)
° Ensayo de expresión génica TaqMan® 20X para RLBP1 de ratón (Applied Biosystems n.° cat. 4331182: Mm00445129.m1)
° Control endógeno de GAPD (GAPDH) de ratón 20X de Applied Biosystems® (Sonda VIC®/MGB, cebador limitado) (Applied Biosystems n.° cat. 4352339E)
o Dispositivo de PCR en tiempo real de Applied Biosystems modelo 7900HT.
• Artículos de prueba utilizados en este ejemplo:
o Vector vírico NVS8
o Vector vírico NVS10
o Vector vírico NVS4
o Vector vírico NVS2
o Vector vírico NVS6
Protocolo:
Al finalizar el experimento in vivo se disecó la retina neural de los ojos, se colocó en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y se congeló de manera instantánea en hielo seco. El resto de la cuenca ocular (menos la retina y el cristalino) se congeló en un tubo separado. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta el aislamiento del ARN. Se extrajo el ARN total utilizando un microkit RNeasy de Qiagen con tratamiento con DNasa. Para la homogeneización y lisis del tejido se utilizó un TissueLyzer de Qiagen. En particular, se añadió una esfera de acero inoxidable de 5 mm a cada tubo que contenía tejido mientras estaba en hielo seco. Las muestras se transfirieron a temperatura ambiente y se añadieron 350 |jL de tampón RLT que contenía un 1 % de beta-mercaptoetanol. Las muestras se procesaron en el TissueLyzer con una frecuencia de agitación de 30 Hz durante dos ciclos de 2 minutos. A continuación se siguió el protocolo estándar del microkit RNeasy de Qiagen para la extracción de ARN con tratamiento con DNasa con una modificación poco importante. Antes de la elución se permitió que la columna de ARN se secara con aire durante >10 minutos para garantizar la eliminación del etanol residual. Se almacenó en el ARN total a -80 °C hasta que estuvo listo para la síntesis de ADNc.
Se determinó la concentración de ARN total utilizando un espectrofotómetro Nanodrop. Se ajustó cada muestra a una concentración final de 50 ng/jL. Se generó ADNc utilizando el kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems. Se preparó una mezcla maestra de reactivos a partir del kit RT de ADNc de alta capacidad de manera que cada 10 jL contuvieran 2 jL de tampón RT de alta capacidad l0 x , 0,8 jL de dNTP 25X (100 mM), 2 jL de cebadores aleatorios de transcriptasa inversa, 0,4 jL de inhibidor de RNasa, 1 jL de transcriptasa inversa Multiscribe y 3,8 jL de agua sin RNasa. Se dispensaron 10 jL de la solución madre de 50 ng/jL de cada ARN total en un pocillo de una placa de amplificación por PCR de 96 pocillos y después se añadieron a cada pocillo 10 jL de la mezcla maestra RT. La placa se colocó en un ciclador térmico Bio-Rad y se usó utilizando los siguientes parámetros: 25 °C durante 10 min, 37 °C durante 120 min, 85 °C durante 5 min después se mantiene a 4 grados hasta que finaliza el programa. Se almacenó el ADNc a -20 °C antes de preparar la reacción de PCR para la cuantificación relativa.
La concentración de ADNc se ajustó a una concentración final de 20 ng/jL añadiendo 5 jL de agua sin RNasa a cada pocillo de la reacción de ADNc (esto se basa en la concentración de ARN total inicial y asumiendo un 100 % de conversión en ADNc). Para cada muestra de ADNc se preparan dos reacciones de qPCR múltiples diferentes; una utilizando sondas del ensayo de expresión Taqman para RLBP1 de ratón con el control endógeno de GAPDH de ratón, y la otra utilizando sondas del ensayo de expresión Taqman para RLBP1 humano con el control endógeno de GAPDH de ratón. Cada una de estas dos reacciones se realizaron por duplicado para cada muestra. Para cada muestra, se dispensaron 5 jL de la muestra de ADNc de 20 ng/jL en un pocillo de una placa de 385 pocillos. Se prepararon dos mezclas maestras independientes, una para el ensayo Taqman de RLBP1 de ratón y una para el ensayo de RLBP1 humano, de modo que cada 15 jL de la mezcla contuvieran 10 jL de mezcla maestra para PCR universal TaqMan® 2X, 1 jL de ensayo de expresión génica TaqMan® 20X para el RLBP1 de ratón o humano, 1 jL de control endógeno de GAPD (GAPDH) de ratón de Applied Biosystems® 20X y 3 jL de agua sin RNasa. Se dispensaron 15 jL de la mezcla maestra apropiada en el pocillo que contenía el ADNc. La placa se colocó en un dispositivo de PCR en tiempo real ABI 7900HT y se ejecutó utilizando el programa de cuantificación relativa con los siguientes parámetros: Una incubación inicial a 50 °C durante 2 min después 40 ciclos de los siguientes dos pasos, 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C.
Los resultados de la placa de cuantificación relativa se incorporaron en un documento de estudio RQ utilizando el programa ABI RQ Manager 1.2. Los datos se analizaron utilizando el contexto de umbral automático para generar un promedio y ACt promedio que es la diferencia en las lecturas de Ct del ADNc de RLBP1 (de ratón o humano) menos la Ct del GAPDH endógeno interno. Los datos se exportaron en Microsoft Excel y se utilizaron para calcular el valor de AACt sustrayendo el valor de ACt de RLBP1 de ratón del valor de ACt de RLBP1 humano para cada muestra. Se calculó la expresión relativa utilizando el cálculo 2'AACt esto expresa la expresión relativa de RLBP1 humano como un factor de cambio de la expresión de RLBP1 endógeno de ratón. Para presentar los resultados como expresión de RLBP1 humano como un porcentaje de la expresión endógena de ratón se multiplicó el valor de expresión relativa por 100.
Resultados: Expresión de ARNm
La Figura 1A muestra que NVS8, NVS4, NVS2 y NVS6 transducen con éxito tanto las células de la retina neural como las células de RPE en la parte posterior de la cuenca ocular. El vector NVS10 transduce las células de RPE pero apenas al nivel del límite de detección en la retina neural.
La Figura 1B muestra que NVS2 es el único vector que muestra expresión de ARNm en la retina neural con una dosis inferior a 1×108 gv/ojo.
Conclusión
Estos sorprendentes resultados demostraron que la combinación específica de un promotor, conformación de genoma de AAV y secuencia de la cápside de AAV pueden dar lugar a diferentes propiedades de transducción en diferentes tipos celulares en la retina. En general, todos los vectores estudiados dieron lugar con éxito a la expresión de ARNm de RLBP1 humano mediada por el vector. Más específicamente, NVS2 es el vector más potente para expresar ARNm de RLBP1 humano en las células de RPE (en la parte posterior de la cuenca ocular) y en la retina neural en las dos dosis estudiadas (1 x109 y 1×108 gv/ojo), mientras que NVS4 y NVS6 dieron lugar a una expresión del ARNm de RLBP1 humano mediada por vector detectable con la dosis de 1×109 gv/ojo, y solo en el RPE con la dosis de 1×108 gv/ojo. NVS8 y NVS10 dieron lugar a una expresión de ARNm detectable en el RPE y la retina neural con la dosis de 1×109 gv/ojo, pero casi en el límite de detección con la dosis de 1×108 gv/ojo.
Ejemplo 4: Ensayo de adaptación a la oscuridad con un electrorretinograma
Una estrategia para evaluar los tratamientos que modifican el ciclo visual es cuantificar la recuperación de la función visual en la oscuridad tras una exposición a luz brillante (es decir, adaptación a la oscuridad). La adaptación a la oscuridad después de una exposición a la luz importante está impulsada principalmente por la capacidad del ojo para regenerar fotopigmentos mediante el ciclo visual. Las modificaciones del ciclo visual conseguidas mediante el tratamiento dan lugar, por lo tanto, a un cambio en la cinética de la adaptación a la oscuridad.
Se ha desarrollado un ensayo para monitorizar la recuperación de la función visual en ratones que se basa en cuantificar la adaptación a la oscuridad utilizando un electrorretinograma (ERG). El ensayo con ERG normalmente tiene lugar durante dos días con un valor de referencia inicial y una medida de seguimiento posterior para evaluar la recuperación después de la exposición a luz que blanquea una fracción del fotopigmento (fotoblanqueamiento). Este procedimiento desarrollado para estudiar la invención determina primero la respuesta eléctrica máxima de cada ojo 5 ms después de un destello de luz durante la porción de onda-a del trazado del ERG. La prueba compara posteriormente la amplitud de la onda-a a los 5 ms 4 horas después de un fotoblanqueamiento para evaluar la fracción de la amplitud máxima recuperada en ese tiempo. Si el ciclo visual funciona de manera normal, la amplitud del ERG se aproximará a los valores iniciales en 4 horas. Un ciclo visual retrasado dará como resultado una recuperación menor de fotopigmentos con una reducción correspondiente en la recuperación de la amplitud de la onda-a en el ERG después del fotoblanqueamiento.
Materiales/reactivos:
• Sistema ERG: Diagnosys, consola Espion E2 con estimulador ganzfeld de campo completo ColorDome
• Ketamina
• Xilazina
• Fenilefrina al 2,5 %
• Ciclopentolato al 1 %
• Proparacaína al 0,5 %
• Electrodo activo: Electrodo de lente de contacto de bucle de oro (Mayo, número de parte N30)
• Electrodo de referencia: Electrodo nasofaríngeo (Grass, número de parte F-ERG-G)
• Electrodo de conexión a tierra: Electrodo con agua de platino (Grass, número de parte F-E2)
• Gotas hidratantes: Novartis, Genteal de suave a moderado
• Bomba de la jeringuilla: Harvard Apparatus, número de parte Bomba 11 Plus
Protocolo:
Los ratones se sitúan en la oscuridad durante la noche durante aproximadamente 20 horas antes de registrar los ERG iniciales. Justo antes del registro, se dilatan los ojos con 1-2 gotas de ciclopentolato al 1 % y 1-2 gotas de fenilefrina al 2,5 %. También se aplican 1-2 gotas de proparacaína al 0,5 % (un anestésico tópico). A continuación, los ratones se anestesian con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina y xilazina (100-150 mg/kg y 5-10 mg/kg, respectivamente). A continuación, se colocan tres electrodos para posibilitar registrar un ERG de un ojo por ratón. El electrodo activo en el ojo es una lente de contacto con bucle de oro, el de referencia es un electrodo nasofaríngeo situado en la boca y el de conexión a tierra es un electrodo con aguja de platino subdérmica que se sitúa en la parte trasera justo detrás de la cabeza. Los ojos se mantienen húmedos y se mantiene el contacto eléctrico de manera continua durante la aplicación de gotas hidratantes con una bomba de jeringuilla (300 μL/hora). Se registra la amplitud del ERG promediando la respuesta eléctrica a tres destellos blancos (2,7 log candela escotópica segundo por metro cuadrado) suministrados con una lámpara de xenón en la cúpula ganzfeld. La amplitud de la onda-a registrada es el voltaje medido 5 ms después del destello de xenón, evaluado utilizando prácticas de análisis de software desarrolladas a este efecto (Mathworks, Matlab).
La adaptación a la oscuridad se evalúa cuantificando la amplitud de la onda-a del ERG 4 horas después del fotoblanqueamiento. Estos experimentos normalmente ocurren 48 horas después de la determinación del valor inicial. En primer lugar se alojan los ratones en la oscuridad durante la noche al igual que con las medidas de los valores iniciales de modo que los registros del ERG ocurren aproximadamente 20 horas más tarde. Los ojos se dilatan con 1-2 gotas de fenilefrina al 2,5 % y 1-2 gotas de ciclopentolato al 1 % inmediatamente antes del fotoblanqueamiento. A continuación, se proporciona una secuencia de 16 destellos de luz (3,7 log candela escotópica segundo por metro cuadrado) al ojo lo que da como resultado el blanqueamiento de los fotopigmentos. Los ratones se colocan de nuevo en la oscuridad durante 4 horas para recuperar la función visual. A continuación, se registran los ERG utilizando el mismo protocolo usado para la determinación del valor inicial. La recuperación de la función visual para cada ojo se define como:
Figure imgf000092_0001
La Figura 2 muestra los resultados del ensayo cuando se aplica a ratones RLBP1 -/- y RLBP1 /+. Los ratones RLBP1 /+ presentan una recuperación casi completa (hasta un 96 %) 4 horas después del blanqueamiento. Por el contrario, los ratones RLBP1-/- recuperan una función visual mínima (11 %) en el mismo punto temporal debido a una cinética del ciclo visual gravemente retrasada (Saari et al., 2001). Esta ventana de 8-9 veces entre los ratones RLBP1+/+ y -/- es la ventana de ensayo que se puede lograr con los vectores de prueba inyectados en ratones RLBP1-/-.
Utilizando el ensayo de adaptación a la oscuridad con ERG descrito anteriormente, la mejora de la eficacia de adaptación a la oscuridad se estudia en ratones con desactivación de RLBP1 (KO) donde se introducen por vía subretiniana los vectores terapéuticos. Ya que la inyección subretiniana conlleva el desplazamiento de la retina neural del RPE, resulta crucial determinar si la retina neural se adhiere de nuevo al RPE para evitar resultados de falso negativo para los artículos de prueba en el ensayo con ERG. Una semana después de la inyección subretiniana de los vectores víricos en los ojos de los ratones, se realiza una tomografía de coherencia óptica (OCT, por sus siglas en inglés) para visualizar el estado de la retina. Los ojos con un desprendimiento de retina no resuelto se excluyeron de la medida por ERG.
En cada punto temporal, los ratones se adaptaron a la oscuridad durante la noche (>12 horas) y se estableció la amplitud de onda-a del ERG de cada ojo como la máxima respuesta adaptada a la oscuridad frente a la luz (100 %). Los ojos totalmente adaptados en la oscuridad se expusieron a continuación a una serie de destellos brillantes (como se ha descrito en una sección anterior) y se cuantificó la amplitud de la onda-a 4 horas más tarde. La expresión «porcentaje de normal» se define como el porcentaje de la medida de la recuperación de la segunda onda-a con respecto al valor obtenido a partir de la medida de la recuperación de la onda-a máxima.
La eficacia positiva, o efecto eficaz, se define como la diferencia entre la medida de prueba y el control negativo (sin exposición) que es estadísticamente significativa en un punto temporal dado después de la inyección.
Los artículos de prueba utilizados en este ejemplo incluyen:
• Vector vírico NVS1
• Vector vírico NVS2
• Vector vírico NVS3
• Vector vírico NVS4
• Vector vírico NVS5
• Vector vírico NVS11
Las Figuras 3A-D muestran que en los vectores víricos que expresan RLBP1 mejoran la velocidad de adaptación a la oscuridad en ratones RLBP1 KO. Las medidas de la eficacia se realizaron para cada grupo frente a controles sin exposición donde los parámetros estadísticos se calcularon utilizando un ANOVA unidireccional con una prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. Se muestra la media 3 desviaciones estándar (DE) para los ojos sin exposición (sin inyección) y los ojos que recibieron 1×109 gv/ojo del vector sin AAV de control negativo (NVS11) para todos los estudios relacionados para indicar el umbral aproximado para la eficacia (las recuperaciones de la onda-a por encima de esta línea normalmente muestran una eficacia estadísticamente significativa). Esta estrategia para presentar el grado de eficacia es similar a la presentada en las publicaciones de terapia génica (Jacobson et al., 2006 y Roman et al., 2007).
La Figura 3A muestra que con una dosis de 3×108 gv/ojo, NVS2 es eficaz para mejorar la velocidad de adaptación a la oscuridad a partir de 14 días después del tratamiento, y la eficacia perdura al menos 350 días. Una dosis de 3×108 gv/ojo de NVS4 también es eficaz durante al menos 30-204 días después del tratamiento. Se ha estudiado NVS2 a una dosis de aproximadamente 3×108 gv/ojo en el modelo en ratón RLBP1 KO en 3 experimentos independientes. En cada experimento todos los puntos temporales estudiados hasta 350 días después de la inyección del vector demostraron eficacia.
La Figura 3B muestra que NVS1 en la misma dosis (3×108 gv/ojo) demostró eficacia a partir de 84 días después de la inyección, y la eficacia se prolongó hasta al menos 350 días. NVS5 y NVS3 con la misma dosis no demostraron eficacia durante hasta 154 días después de la administración del fármaco. Los datos presentados en la Figura 3A y 3B sugirieron que aunque el genoma del vector vírico es equivalente, el vector puede tener una potencia diferente cuando se empaqueta en diferentes serotipos de cápside de AAV (NVS1 frente a NVS2). Además, la combinación específica del serotipo del vector, promotor y conformación del genoma del vector puede afectar a la potencia del vector (NVS1 porta un genoma autocomplementario mientras que NVS3 y NVS4 portan un genoma monocatenario, todos con diferentes secuencias promotoras). Este resultado confirma además que la combinación de la conformación del genoma y el serotipo de la cápside puede afectar a la eficacia de la respuesta de recuperación.
La Figura 3C muestra que, con la dosis de 1×109 gv/ojo, NVS2 es eficaz a partir de 18 días después del tratamiento, y la eficacia perdura al menos 375 días. Con la dosis de 1×109 gv/ojo, NVS11, que es un vector sin AAV de control negativo, no mostró una diferencia significativa en la mejora de la velocidad de adaptación a la oscuridad en comparación con control no inyectado (los puntos de datos individuales no se muestran, pero se presenta la línea de la media 3DE histórica a efectos comparativos). Una dosis de 1×109 gv/ojo de NVS4 también es eficaz durante al menos 30-204 días después del tratamiento.
La Figura 3D muestra que con una dosis de 3×109 gv/ojo, NVS3 y NVS5, respectivamente, son eficaces para mejorar la velocidad de adaptación a la oscuridad a partir de 26 días después del tratamiento, y la eficacia perdura al menos 371 días.
La Figura 4A demuestra que NVS2 en múltiples dosis es eficaz para mejorar la velocidad de adaptación a la oscuridad durante al menos 94 días después de la inyección. Tanto los grupos de 3×108 como de 1×109 gv/ojo fueron eficaces en comparación con controles sin exposición basándose en un ANOVA unidireccional con una prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. La Figura 4B muestra los datos de la Fig. 4A en un formato diferente. En este caso, el gráfico muestra el porcentaje de ojos/grupo con una recuperación de la onda-a superior a la definida por la media 3DE del grupo sin exposición de varios experimentos. Los resultados indican que para NVS2, un 50 % de los ojos tratados con 3×107 gv/ojo y un 100 % de los ojos tratados con 3×108 y 1x109 gv/ojo demostraron una recuperación de la onda-a eficaz, y que se estableció una curva de dosis-respuesta.
La Figura 5A demuestra que NVS4 en múltiples dosis es eficaz para mejorar la velocidad de adaptación a la oscuridad durante al menos 93 días después de la inyección. Tanto los grupos de 3×108 como de 1×109 gv/ojo fueron eficaces en comparación con controles sin exposición basándose en un ANOVA unidireccional con una prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. La Figura 5B muestra los datos de la Fig. 5A en un formato diferente. En este caso, el gráfico muestra el porcentaje de ojos/grupo con una recuperación de la onda-a superior a la definida por la media 3DE del grupo sin exposición de varios experimentos. Los resultados sugieren que para NVS4, >85 % de los ojos tratados con 3×108 y 1×109 gv/ojo mostraron un aumento en la velocidad de adaptación a la oscuridad.
La Figura 6 demuestra el aumento de la velocidad de adaptación a la oscuridad conseguida con el vector NVS2 generado mediante varios métodos de producción. NVS2 y NVS2a se produjeron ambos utilizando dos métodos de centrifugación con gradiente de CsCl diferentes mientras que NVS2b se purificó utilizando cromatografía en columna. La eficacia conseguida 84 días después de la inyección con los tres métodos de purificación es indistinguible basándose en un ANOVA unidireccional con una prueba de Tukey. Este resultado indica que 3 producciones independientes de NVS2 en 2 laboratorios independientes generaron material funcional que dio como resultado una eficacia similar en ratones RLBP1 KO.
Resumen de los resultados del Ejemplo 4:
• Los ojos en los que se inyectó el vector vírico NVS2 mostraron una mayor velocidad de adaptación a la oscuridad con dosis comprendidas entre >3×107 y 1×109 gv/ojo, donde la eficacia dura durante al menos 350 días después de la inyección en el modelo en ratón RLBP1 KO.
• Los ojos en los que se inyectó el vector vírico NVS4 mostraron una mayor velocidad de adaptación a la oscuridad con dosis comprendidas entre 3×108 y 1×109 gv/ojo y la eficacia dura durante al menos 204 días con ambas dosis.
• Los ojos en los que se inyectó el vector vírico NVS1 mostraron una mayor velocidad de adaptación a la oscuridad con la dosis de 3×108 gv/ojo y la eficacia dura durante al menos 350 días.
• Los ojos en los que se inyectaron el vector vírico NVS3 y NVS5 mostraron una mayor velocidad de adaptación a la oscuridad con la dosis de 3×109 gv/ojo y la eficacia dura durante al menos 371 días. No se observó eficacia de NVS3 y NVS5 con 3×108 gv/ojo en ningún punto temporal estudiado.
Conclusión:
El vector vírico NVS2 muestra una recuperación máxima superior a dosis equivalentes de los otros vectores estudiados. Además, la eficacia mediada por el vector NVS2 parece ser indistinguible cuando se prepara utilizando una purificación por cromatografía en columna o CsCl.
Resumen de los resultados:
Los resultados demostraron que el vector autocomplementario AAV8-pRLBP1(corto)-eGFP, la versión sustituta con gen indicador del vector terapéutico NVS2, da lugar a la expresión específica en tipos de células de Müller y de RPE sin expresión fuera de la diana detectable, donde el vector terapéutico NVS2 da lugar a al menos 350 días de recuperación de la función visual que se mide mediante la recuperación de la onda-a en ratones RLBP1 en dosis comprendidas entre >3×107 y 1x109 gv/ojo. Este casete génico específico cuando se empaqueta en un genoma monocatenario y se empaqueta con la misma cápside de serotipo 8 muestra un nivel significativamente menor de expresión génica en ratones, como lo demuestra la medida del nivel de expresión de ARNm. El mismo genoma autocomplementario que NVS2 y empaquetado en la cápside de AAV2, que es NVS1, demostró eficacia de recuperación de la onda-a (es decir, un aumento en la velocidad de adaptación a la oscuridad) en la dosis de 3×108 gv/ojo durante al menos 350 días. Este resultado sugiere que NVS2 es un vector vírico más potente que NVS1, lo que se debe probablemente a la infección más eficaz de la cápside de AAV8 que la cápside de AAV2 en los tipos celulares diana.
Los resultados también demostraron que el vector AAV8-pRLBP1(largo)-eGFP, la versión sustituta con gen indicador del vector terapéutico NVS4, dar lugar a la expresión en células de Müller y de RPE pero también en los fotorreceptores. El vector terapéutico NVS4 da lugar a al menos 204 días de eficacia en dosis comprendidas entre 3×108 y 1×109 gv/ojo. El mismo genoma en NVS4 pero empaquetado en una cápside de AAV 2, que es NVS3, da lugar a una recuperación de la onda-a eficaz con la dosis de 3×109 pero no con la dosis más baja estudiada (3×108 gv/ojo). Los resultados demostraron que el vector AAV8-pRPE65-eGFP, la versión sustituta con gen indicador del vector terapéutico NVS6, da lugar a la expresión en el tipo celular RPE con una amplia expresión fuera de la diana en los fotorreceptores. Cuando el vector terapéutico NVS5, que porta el mismo genoma que NVS6 pero se empaqueta en la cápside de AAV2, se estudia en el modelo de eficacia en ratón RLBP1 KO, los resultados demuestran que NVS5 experimenta una eficacia de recuperación de la onda-a positiva con la dosis de 3×109 gv/ojo pero no con la dosis más baja estudiada (3×108 gv/ojo).
Referencias:
Burstedt MS, Forsman-Semb K, Golovleva I, et al., (2001) Ocular phenotype of Bothnia dystrophy, an autosomal recessive retinitis pigmentosa associated with an R234W mutation in the RLBP1 gene. Arch Ophthalmol; 119:260-267.
Burstedt MS y Monestam E (2010) Self-reported quality of life in patients with retinitis pigmentosa and maculopathy of Bothnia type. Clin Ophthalmol; 4:147-54.
Choi VW, Asokan A, Haberman RA y Samulski RJ (2007) Production of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for In Vitro and In Vivo Use. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. 16:25, Suplemento 78.
Choi VW, McCarty DM y Samulski RJ (2005) AAV Hybrid Serotypes: Improved Vectors for Gene Delivery. Curr Gene Ther, 5(3):299-310.
Demirci FYK, Rigatti BW, Mah TS, et al., (2004) A novel compound heterozygous mutation in the cellular retinaldehyde-binding protein gene (RLBP1) in a patient with retinitis punctata albescens. Am J Ophthalmol.; 138:171-173.
Eichers ER, Green JS, Stockton DW, et al., (2002) Newfoundland rod-cone dystrophy, an early-onset retinal dystrophy, is caused by splice-junction mutations in RLBP1. Am J Hum Genet; 70:955-964.
Ferrari FK, Xiao X, McCarty D et al., (1997) New developments in the generation of Ad-free, high-titer rAAV gene therapy vectors. Nat Med 3(11); 1295-1297.
Fishman GA, Roberts MF, Derlacki DJ, et al., (2004) Novel mutations in the cellular retinaldehyde-binding protein gene (RLBP1) associated with retinitis punctata albescens: evidence of interfamilial genetic heterogeneity and fundus changes in heterozygotes. Arch Ophthalmol.; 122:70-75.
Golovleva I y Burstedt M (2012) Retinitis Pigmentosa in Northern Sweden - From Gene to Treatment. Marzo de 2012. Advances in Ophthalmology, capítulo 25, págs. 451-472. Publicado por InTech.
Golovleva I, Kohn L, Burstedt M, et al., (2010) Mutation spectra in autosomal dominant and recessive retinitis pigmentosa in northern Sweden. Adv Exp Med Biol. 664:255-262.
Grieger JC, Choi VW y Samulski RJ. (2006) Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1(3); 1412-1428.
Hc X, Lobsiger J y Stocker A (2009) Bothnia dystrophy is caused by domino-like rearrangements in cellular retinaldehyde-binding protein mutant R234W. Proc. Natl Acad Sci USA. 106(44): 18545-50.
Jacobson SG, Acland GM, Aguirre GD et al., (2006) Safety of Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2-RPE65 Vector Delivered by Ocular Subretinal Injection. Molecular Therapy. 13(6); 1074-1084.
Katsanis N, Shroyer NF, Lewis RA, et al., (2001) Fundus albipunctatus and retinitis punctata albescens in a pedigree with an R150Q mutation in RLBP1. Clin Genet; 59:424-429.
Kohn L, Burstedt MS, Jonsson F, et al., (2008) Carrier of R14W in carbonic anhydrase IV presents Bothnia dystrophy phenotype caused by two allelic mutations in RLBP1. Invest Opthalmol Vis Sci. 49(7): 3172-3177. Lock M, Alvira M, Vandenberghe LH, et al., (2010) Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at scale. Human Gene Therapy. 21; 1-13.
Maw MA, Kennedy B, Knight A, et al., (1997) Mutation of the gene encoding cellular retinaldehyde-binding protein in autosomal recessive retinitis pigmentosa. Nat Genet; 17:198-200.
McCarty DM (2008) Self-Complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16(10): 1648-1656.
McCarty DM, Fu H, Monohan PE et al., (2003) Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step t transduction in vivo. Gene Therapy. 10; 2112­ 2118.
Morimura H, Berson EL, Dryja TP (1999) Recessive mutations in the RLBP1 gene encoding cellular retinaldehyde-binding protein in a form of retinitis punctata albescens. Invest Ophthalmol Visual Sci; 40:1000-1004.
Muzyczka N y Berns KI (2001) Capítulo 69, Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins.
Naz S, Ali S, Riazuddin SA, et al., (2011) Mutations in RLBP1 associated with fundus albipunctatus in consanguineous Pakistani families. Br J Ophthalmol; 95:1019-24.
Nojima K, Hosono K, Zhao Y, et al., (2011) Clinical features of a Japanese case with Bothnia dystrophy. Ophthalmic Genet [publicación electrónica previa a la impresión]
Phelan JK y Bok D (2000) A Brief Review of Retinitis Pigmentosa and the Identified Retinitis Pigmentosa Genes. Mol Vis; 6:116-124.
Roman AJ, Boye SL, Aleman TS, et al., (2007) Electroretinographic Analyses of RPE65-mutant rd12 Mice: Developing an In Vivo Bioassay for Human Gene Therapy Trials of Leber Congenital Amaurosis. Mol Vis. 13; 1701-1710.
Saari JC, Huang J, Possin DE, et al., (1997) Cellular retinaldehyde-binding protein is expressed by oligodendrocytes in optic nerve and brain. Glia.; 21:259-268.
SAMBROOK et a l, (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2.a Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y)
Saari JC, Nawrot M, Kennedy BN et al., (2001) Visual Cycle Impairment in Cellular Retinaldehyde Binding Protein (CRALBP) Knockout Mice Results in Delayed Dark Adaptation. Neuron; 29:739-748.
Samulski RJ, Srivastava A, Berns KI, et al., (1983) Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids: gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33(1): 135-143.
Schmidt M, Vouteaakis A, Afione S et al., (2008) Adeno-Associated Virus Type 12 (AAV12): a Novel AAV Serotype with Sialic Acid- and Heparan Sulfate Proteoglycan-Independent Transduction Activity. J of Virology.
82(3):1399-1406.
Smith RH, Levy JR y Kotin RM. (2009) A Simplified Baculovirus-AAV Expression Vector System Coupled with One-Step Affinity Purification Yields High-Titer rAAV Stocks from Insect Cells. Molecular Therapy. 17(11); 1888­ 1896.
Travis GH, Golczak M, Moise AR, et al., (2007) Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu Rev Pharmacol Toxicol.; 47: 469-512.
Vandenberghe LH, Xiao R, Lock M, et al., (2010) Efficient Serotype-Dependent Release of Functional Vector into the Culture Medium During Adeno-Associated Virus Manufacturing. Human Gene Therapy. 21; 1251-1257.
Wang J y Kefalov JV (2011) The Cone-specific visual cycle. Progress in retinal and eye research. 30: 115-128.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un vector vírico que tiene un genoma del vector que comprende una secuencia que codifica la proteína 1 de unión a retinaldehído (RLBP1), en donde dicho vector se adapta para dirigir la expresión de una secuencia que codifica RLBP1 en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) y células de Müller de la retina, en donde dicho vector comprende una cápside del serotipo 2 u 8 de un virus adenoasociado (AAV) y dicho genoma del vector comprende en la dirección de 5' a 3':
(i) una ITR en 5';
(ii) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende en la dirección de 5' a 3': un promotor; una secuencia que codifica RLBP1; y una secuencia poliA de SV40;
en donde el promotor está ligado operablemente a la secuencia que codifica RLBP1; y
(iii) una ITR en 3';
en donde el genoma del vector comprende en la dirección de 5' a 3' las secuencias de ácido nucleico:
a) SEQ ID NO: 2, 10, 5, 6, 8 y 9;
o
b) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 23 y 9.
2. Un vector vírico que tiene un genoma del vector que comprende una secuencia que codifica la proteína 1 de unión a retinaldehído (RLBP1), en donde dicho vector se adapta para dirigir la expresión de una secuencia que codifica RLBP1 en las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) y células de Müller de la retina, en donde dicho vector comprende una cápside del serotipo 2 u 8 de un virus adenoasociado (AAV), en donde dicho genoma del vector comprende en la dirección de 5' a 3':
(i) una ITR en 5';
(ii) una primera secuencia de nucleótidos recombinante;
(iii) una ITR sin resolución;
(iv) una segunda secuencia de nucleótidos recombinante; y
(v) una ITR en 3',
en donde la primera y segunda secuencias de nucleótidos recombinantes son autocomplementarias; en donde la segunda secuencia de nucleótidos recombinante comprende en la dirección de 5' a 3':
(i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica RLBP1; y (iii) una secuencia poliA de SV40;
en donde el promotor está ligado operablemente a la secuencia que codifica RLBP1, y
en donde el genoma vírico comprende las secuencias en la dirección de 5' a 3': SEQ ID NO: 36, 62, 63, 64, 65, 66, 1, 3, 4, 5, 6, 8 y 9.
3. El vector vírico de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha cápside de serotipo 8 de AAV está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 20.
4. El vector vírico de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha cápside de serotipo 8 de AAV comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, 70 y 71.
5. El vector vírico de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha cápside de serotipo 2 de AAV está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 18.
6. El vector vírico de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha cápside de serotipo 2 de AAV comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 68 y 69.
7. Un ácido nucleico que comprende un casete génico, donde dicho casete génico comprende, en la dirección de 5' a 3': (i) una ITR en 5' o una ITR sin resolución;
(ii) una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia que codifica RLBP1; y
(iii) una ITR en 3';
en donde el casete génico comprende, en la dirección de 5' a 3', las secuencias:
a) SEQ ID NO: 2, 10, 5, 6, 8 y 9,
o
b) SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 23 y 9,
o
c) SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 6, 8 y 9.
8. El ácido nucleico de la reivindicación 7, en donde dicho casete génico comprende además una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51-61.
9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, que comprende además una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26-35 y 50.
10. Una composición que comprende el vector vírico de la reivindicación 1 o 2 y que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. La composición de la reivindicación 10 para uso en el tratamiento de un sujeto que padece distrofia retiniana provocada por una mutación en el gen RLBP1.
12. La composición de la reivindicación 10 para uso en la mejora de la velocidad de adaptación a la oscuridad en un sujeto que padece distrofia retiniana provocada por una mutación en el gen RLBP1.
13. La composición de la reivindicación 10, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste en disolventes, surfactantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y agentes isotónicos y de retraso de la absorción.
ES13730648T 2012-05-04 2013-05-02 Vectores víricos para el tratamiento de la distrofia retiniana Active ES2947159T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261642630P 2012-05-04 2012-05-04
US201361776167P 2013-03-11 2013-03-11
PCT/IB2013/053497 WO2013164793A2 (en) 2012-05-04 2013-05-02 Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2947159T3 true ES2947159T3 (es) 2023-08-02

Family

ID=48670626

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13730648T Active ES2947159T3 (es) 2012-05-04 2013-05-02 Vectores víricos para el tratamiento de la distrofia retiniana

Country Status (10)

Country Link
US (5) US9163259B2 (es)
EP (2) EP2844302B1 (es)
JP (4) JP6290185B2 (es)
CN (2) CN108753824B (es)
AR (1) AR092317A1 (es)
CA (2) CA2872447C (es)
ES (1) ES2947159T3 (es)
TW (1) TW201350581A (es)
UY (1) UY34780A (es)
WO (1) WO2013164793A2 (es)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9163259B2 (en) * 2012-05-04 2015-10-20 Novartis Ag Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11339437B2 (en) * 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
BR112017009497A2 (pt) 2014-11-05 2018-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson
ES2878451T3 (es) 2014-11-14 2021-11-18 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos moduladores
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
GB201502137D0 (en) 2015-02-09 2015-03-25 Ucl Business Plc Treatment
GB201516066D0 (en) * 2015-09-10 2015-10-28 Young & Co Llp D Treatment of retinitis pigmentosa
CA3006569A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of aav neutralizing antibodies
EP3210632B1 (en) * 2016-02-23 2022-09-28 EyeServ GmbH Gene therapy for the treatment of a retinal degeneration disease
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11951121B2 (en) 2016-05-18 2024-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating Huntington's disease
KR20240056729A (ko) 2016-05-18 2024-04-30 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
EP3485005A1 (en) 2016-07-12 2019-05-22 The University Of Manchester Gene therapy
AU2017305404B2 (en) 2016-08-02 2023-11-30 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
US10550405B2 (en) 2017-03-15 2020-02-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Rational polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same
CA3054711A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 The University Of North Carolina At Chapel Hill Polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same
US20200113972A1 (en) * 2017-04-14 2020-04-16 Rhode Island Hospital Vegf gene therapy for tendon and ligament injuries
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
AU2018302016A1 (en) 2017-07-17 2020-02-06 The Regents Of The University Of California Trajectory array guide system
JP7221275B2 (ja) 2017-08-03 2023-02-13 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖを送達するための組成物および方法
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
TWI804518B (zh) 2017-10-16 2023-06-11 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
EP4186921A1 (en) * 2018-03-23 2023-05-31 The Trustees of Columbia University in the City of New York Gene editing for autosomal dominant diseases
JP2021520232A (ja) * 2018-04-05 2021-08-19 オックスフォード ユニバーシティ イノベーション リミテッドＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 黄斑ジストロフィーを処置するための組成物及び方法
JP7560447B2 (ja) * 2018-10-25 2024-10-02 バクスアルタ インコーポレイテッド Ａａｖトリプルプラスミドシステム
US20220088222A1 (en) * 2018-12-20 2022-03-24 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for the treatment of degenerative ocular diseases
US20220154210A1 (en) * 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
AU2020344449A1 (en) * 2019-09-09 2022-04-07 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of restoring lysosomal function of retinal pigment epithelial cells by activation of TFEB
CN114650847A (zh) * 2019-09-25 2022-06-21 犹他大学研究基金会 用于表达来自vmd2启动子的组成型活性rap1a的方法和组合物
WO2021064695A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Novartis Ag Methods for measuring cralbp activity
BR112022013027A2 (pt) * 2019-12-31 2022-09-06 Swanbio Therapeutics Ltd Construtos aav-abcd1 melhorados e uso para tratamento ou prevenção de adrenoleucodistrofia (ald) e/ou adrenomieloeuropatia (amn)
CA3169945A1 (en) * 2020-04-07 2021-10-14 Dongsheng Duan Cpg-free itrs for aav gene therapy
WO2022051232A1 (en) * 2020-09-02 2022-03-10 4D Molecular Therapeutics Inc. Codon optimized rpgrorf 15 genes and uses thereof
WO2022198138A1 (en) * 2021-03-19 2022-09-22 Intergalactic Therapeutic, Inc. Ocular delivery of therapeutic agents
US11603541B2 (en) * 2021-05-06 2023-03-14 Kinase Pharma Inc. Compositions and method of making a complex able to increase production of a cetuximab-like protein (CLP) in a target cell
US20240287493A1 (en) * 2021-06-24 2024-08-29 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for treating pgm1 deficiency
EP4377460A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
EP4437117A2 (en) * 2021-12-10 2024-10-02 Aavantibio, Inc. Compositions comprising kozak sequences selected for enhanced expression
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024110625A1 (en) * 2022-11-24 2024-05-30 Universität Bern Cralbp based therapeutics for retinal disorders
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US124068A (en) * 1872-02-27 Improvement in corn-husking and shelling machines
JP3952312B2 (ja) 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
US5945335A (en) 1995-11-09 1999-08-31 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free system for producing recombinant AAV virions lacking oncogenic sequences
JP2001506132A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション Ａａｖベクターの産生における使用のためのリコンビナーゼ活性化可能ａａｖパッケージングカセット
NZ511037A (en) 1998-09-17 2005-02-25 Univ Florida Methods for treatment of degenerative retinal diseases
CA2347129A1 (en) 1998-09-22 2000-03-30 University Of Florida Methods for large-scale production of recombinant aav vectors
DE60117550T2 (de) * 2000-06-01 2006-12-07 University Of North Carolina At Chapel Hill Doppelsträngige parvovirus-vektoren
US20040208847A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-21 Fabienne Rolling Method and vectors for selectively transducing retinal pigment epithelium cells
US7339042B2 (en) * 2003-06-09 2008-03-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. Gene delivery to tumors
US7309487B2 (en) * 2004-02-09 2007-12-18 George Inana Methods and compositions for detecting and treating retinal diseases
JP2009519710A (ja) * 2005-12-16 2009-05-21 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 遺伝子発現調節エレメントのハイスループットでの特徴付けのための機能性アレイ
US7740836B2 (en) 2006-05-03 2010-06-22 Fondazione Telethon Methods and compositions for recovering or improving visual function
WO2008127675A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Tufts University Compositions and methods for retinal transduction and photoreceptor specific transgene expression
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
WO2008150459A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A method for transducing cells with primary cilia
EP2287323A1 (en) 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
WO2011034947A2 (en) 2009-09-15 2011-03-24 University Of Washington Reagents and methods for modulating cone photoreceptor activity
US9163259B2 (en) 2012-05-04 2015-10-20 Novartis Ag Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy

Also Published As

Publication number Publication date
US20160097061A1 (en) 2016-04-07
CN104470545B (zh) 2018-07-06
JP7100232B2 (ja) 2022-07-13
CA3182080A1 (en) 2013-11-07
US20140017201A1 (en) 2014-01-16
US20210047656A1 (en) 2021-02-18
CN108753824B (zh) 2023-04-11
JP6290185B2 (ja) 2018-03-07
JP2020054358A (ja) 2020-04-09
EP2844302A2 (en) 2015-03-11
WO2013164793A2 (en) 2013-11-07
JP2018108083A (ja) 2018-07-12
US20180080046A1 (en) 2018-03-22
WO2013164793A3 (en) 2014-01-16
EP3326655A1 (en) 2018-05-30
US9163259B2 (en) 2015-10-20
UY34780A (es) 2013-11-29
EP2844302B1 (en) 2023-03-15
JP2015517301A (ja) 2015-06-22
JP2022088372A (ja) 2022-06-14
JP6629364B2 (ja) 2020-01-15
CN104470545A (zh) 2015-03-25
CN108753824A (zh) 2018-11-06
US20230323398A1 (en) 2023-10-12
US10550404B2 (en) 2020-02-04
US9803217B2 (en) 2017-10-31
TW201350581A (zh) 2013-12-16
CA2872447C (en) 2023-02-21
CA2872447A1 (en) 2013-11-07
AR092317A1 (es) 2015-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2947159T3 (es) Vectores víricos para el tratamiento de la distrofia retiniana
US11723988B2 (en) Methods of expressing a polynucleotide of interest in the cone photoreceptors of a subject comprising the subretinal delivery of a therapeutically effective amount of a recombinant AAV9-derived vector
ES2826384T3 (es) Terapia génica para trastornos oculares
US20210188927A1 (en) Compositions and methods for treating age-related macular degeneration
WO2018134168A1 (en) Methods of expressing a polynucleotide of interest in the cone photoreceptors
JP2023116709A (ja) 眼疾患のための遺伝子療法
JP2023040219A (ja) 眼疾患の遺伝子治療
ES2835032T3 (es) Terapia génica para el tratamiento de una enfermedad de las células de cono retinianas
ES2947308T3 (es) Terapia génica para mejorar la visión
Khabou Development of safe and efficient aav vectors for retinal gene therapy
Matsuki Development of gene therapy for achromatopsia due to CNGA3 mutations
Surace et al. Mutation-independent treatment of autosomal dominant Retinitis Pigmentosa (adRP)
EA042590B1 (ru) Генная терапия для улучшения зрения