JP2021520232A - 黄斑ジストロフィーを処置するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、（ａ）卵黄様黄斑ジストロフィー−２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする配列、及び（ｂ）ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）タンパク質をコードする配列、を含む核酸配列を含む組成物、ならびに、網膜下または脈絡膜上経路を介した対象の眼への組成物の投与を含む、対象の黄斑ジストロフィーの処置のためのこれらの組成物の使用を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１８年４月５日に出願された米国特許仮出願第６２／６５３，１３１号の利益を主張し、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の組み込み
２０１９年４月４日に作成され、サイズが７２ＫＢである「ＮＩＧＨ−０１１／００２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルの内容は、全体が本明細書で参照により組み込まれる。

開示の分野
本発明は、変性眼疾患の分子生物学、神経生物学、及び遺伝子療法処置の分野に関する。

黄斑変性症は、視野の中心が不明瞭になるか、または視力がなくなり得る病状である。黄斑変性症では、中心視力に関与する黄斑と呼ばれる網膜の一部の光受容体が、変性するか、またはなくなる。一部の場合では、黄斑変性症は、ベストロフィン−１遺伝子（ＢＥＳＴ１、ＶＭＤ２とも呼ばれる）の変異により引き起こされる。現在、この壊滅的な疾患の処置はない。従って、黄斑変性症を処置するための追加の治療アプローチに対する当該技術分野での長年の切実なニーズが存在する。本開示は、黄斑変性症の組成物及び処置方法を提供する。

本開示は、（ａ）卵黄様黄斑ジストロフィー−２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする配列、及び（ｂ）ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）タンパク質をコードする配列、を含む核酸配列を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＶＭＤ２プロモーターをコードする配列は、ヒトＶＭＤ２プロモーターをコードする。一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、ヒトＢＥＳＴ１タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、コード配列を含む。一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、ｃＤＮＡ配列を含む。

本開示は、（ａ）ユビキタスプロモーターをコードする配列、及び（ｂ）ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）タンパク質をコードする配列、を含む核酸配列を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、ヒトＢＥＳＴ１タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、コード配列を含む。一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、ｃＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ユビキタスプロモーターをコードする配列は、ＣＡＧプロモーターをコードする配列を含む。

本開示の組成物の一部の実施形態では、核酸配列はさらに、（ｃ）転写後調節エレメント（ＰＲＥ）をコードする配列を含む。一部の実施形態では、ＰＲＥをコードする配列は、天然に存在する配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、ＰＲＥをコードする配列は、天然に存在しない配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、ＰＲＥをコードする配列は、ウイルス配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、ＰＲＥをコードする配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）から単離または誘導された配列を含む。

本開示の組成物の一部の実施形態では、核酸配列はさらに、（ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、天然に存在する配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、天然に存在しない配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、哺乳動物配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、ヒト配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、哺乳動物ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子から単離または誘導された配列を含む。

本開示の組成物の一部の実施形態では、核酸配列はさらに、（ｅ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードする配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、天然に存在する配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、天然に存在しない配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、哺乳動物配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、ヒト配列から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、ウイルス配列から単離または誘導された配列を含む。

本開示の組成物の一部の実施形態では、核酸配列はさらに、（ｆ）イントロンをコードする配列、及び（ｇ）エクソンをコードする配列を含み、イントロンをコードする配列及びエクソンをコードする配列は、作動可能に連結されている。一部の実施形態では、イントロンは、ＶＭＤ２プロモーターをコードする配列とエクソンをコードする配列の間に位置し、エクソンをコードする配列は、イントロンをコードする配列と５’ＵＴＲをコードする配列の間に位置し、イントロンをコードする配列は、哺乳動物細胞によりスプライシングされる。一部の実施形態では、エクソンをコードする配列は、哺乳動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、エクソンをコードする配列は、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）ベータグロビン遺伝子から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、イントロンをコードする配列は、天然に存在しない配列を含む。一部の実施形態では、イントロンをコードする配列は、融合配列を含む。一部の実施形態では、イントロンをコードする配列は、スプライス供与部位をコードする配列、ならびにスプライス分岐点及び受容部位をコードする配列を含む。一部の実施形態では、スプライス供与部位をコードする配列は、脊椎動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、スプライス供与部位をコードする配列は、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ベータアクチン遺伝子（ＣＢＡ）から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、スプライス分岐点及び受容部位をコードする配列は、脊椎動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、スプライス分岐点及び受容部位をコードする配列は、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）ベータグロビン遺伝子から単離または誘導された配列を含む。

本開示の組成物の一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、コザック配列またはその一部をコードする配列を含む。一部の実施形態では、コザック配列をコードする配列は、ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧの核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する。一部の実施形態では、コザック配列をコードする配列は、ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡの核酸配列を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物の一部の実施形態では、ヒトＶＭＤ２プロモーターをコードする配列は、以下を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＣＡＧプロモーターをコードする配列は、以下を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、ヒトＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、以下を含むか、またはそれからなる：

本開示は、本開示の組成物を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。

本開示は、本開示のベクターを含む送達ベクターを提供する。一部の実施形態では、送達ベクターは、ウイルス送達ベクターである。一部の実施形態では、送達ベクターは、一本鎖ウイルスゲノムを含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、二本鎖ウイルスゲノムを含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、ＲＮＡ分子を含む。

本開示は、本開示のベクターを含む送達ベクターを提供する。一部の実施形態では、送達ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターから単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそれらの任意の組み合わせのＡＡＶベクターから単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導された第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導されたウイルス遺伝子をコードする配列を含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導された第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導されたウイルス遺伝子をコードする配列を含む。一部の実施形態では、送達ベクターは、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導された第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導されたウイルス遺伝子をコードする配列を含む。

本開示は、本開示の組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ＴＭＮ２００を含む。

本開示は、本開示のベクター、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ＴＭＮ２００を含む。

本開示は、本開示の送達ベクター及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ＴＭＮ２００を含む。

本開示は、本開示の組成物を含む細胞を提供する。本開示は、本開示のベクターを含む細胞を提供する。本開示は、本開示の送達ベクターを含む細胞を提供する。本開示は、本開示の医薬組成物を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、非ヒト霊長類細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の神経細胞、グリア細胞、網膜細胞、光受容細胞、桿体細胞、錐体細胞、または立方細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、光受容細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ１９細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ヒト網膜のＲＰＥから単離または誘導される。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕである。

本開示は、治療的有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、黄斑ジストロフィーを処置することを、それを必要とする対象において行う方法を提供する。

本開示は、治療的有効量の本開示のベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、黄斑ジストロフィーを処置することを、それを必要とする対象において行う方法を提供する。

本開示は、治療的有効量の本開示の送達ベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、黄斑ジストロフィーを処置することを、それを必要とする対象において行う方法を提供する。

本開示の方法の一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類、マウス、ラット、またはウサギである。一部の実施形態では、対象は、黄斑ジストロフィーを有する。

本開示の方法の一部の実施形態では、対象は、ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のコピーに変異を有する。一部の実施形態では、変異は、優性変異として遺伝性である。一部の実施形態では、優性変異は、対象においてベストの卵黄様黄斑ジストロフィー（ＢＶＭＤ）を引き起こす。一部の実施形態では、変異は、劣性変異として遺伝性である。一部の実施形態では、劣性変異は、対象において常染色体劣性ベストロフィノパチー（ＡＲＢ）を引き起こす。一部の実施形態では、変異は、ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のコピーのコード配列において生じる。一部の実施形態では、変異は、ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のコピーの非コード配列において生じる。一部の実施形態では、変異は、ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のコピーに置換、挿入、欠失、反転、転座、フレームシフト、またはそれらの組み合わせを含む。

本開示の方法の一部の実施形態では、投与は、網膜下、脈絡膜上、または硝子体内経路を介した注射または注入を含む。一部の実施形態では、投与は、網膜下経路を介した注射または注入を含む。一部の実施形態では、投与は、網膜下経路を介した２段階注射または２段階注入を含む。

本開示の方法の一部の実施形態では、治療的有効量は、端点を含む、１０〜２００μＬの容量で製剤化される。一部の実施形態では、治療的有効量は、各範囲に対し、端点を含む、１０〜５０μＬ、５０〜１００μＬ、１００〜１５０μＬ、または１５０〜２００μＬの容量で製剤化される。一部の実施形態では、治療的有効量は、端点を含む、７０〜１２０μＬの容量で製剤化され、投与は、網膜下経路を介した注射または注入を含む。一部の実施形態では、治療的有効量は、１００μＬの容量で製剤化され、投与は、網膜下経路を介した注射または注入を含む。

本開示の方法の一部の実施形態では、治療的有効量は、少なくとも１×１０^１０ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１１ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも２×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも５×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、または少なくとも１．５×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ送達ベクターの濃度を含む。一部の実施形態では、治療的有効量は、少なくとも２×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも５×１０^１２ＤＲＰ／ｍｌ、または少なくとも１．５×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ送達ベクターの濃度を含む。一部の実施形態では、治療的有効量は、少なくとも５×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ送達ベクターの濃度を含む。一部の実施形態では、治療的有効量は、少なくとも１．５×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬのＡＡＶ送達ベクターの濃度を含む。

本開示の方法の一部の実施形態では、治療的有効量は、２×１０^８ゲノム粒子（ｇｐ）、５×１０^８ｇｐ、１．５×１０^９ｇｐ、２×１０^９ｇｐ、５×１０^９ｇｐ、２×１０^１０ｇｐ、５×１０^１０ｇｐ、６×１０^１０ｇｐ、１．２×１０^１１ｇｐ、１．５×１０^１１ｇｐ、２×１０^１１ｇｐ、４．５×１０^１１ｇｐ、５×１０^１１ｇｐ、１．２×１０^１２ｇｐ、１．５×１０^１２ｇｐ、２×１０^１２ｇｐ、または５×１０^１２ｇｐの用量を含む。一部の実施形態では、対象は、マウスであり、治療的有効量は、５×１０^８ｇｐ、１．５×１０^９ｇｐ、または５×１０^９ｇｐの用量を含む。一部の実施形態では、対象は、非ヒト霊長類であり、治療的有効量は、ＡＡＶウイルス粒子の１．２×１０^１１ｇｐ、４．５×１０^１１ｇｐ、または１．２×１０^１２ｇｐの用量を含む。一部の実施形態では、対象は、ヒトであり、治療的有効量は、ＡＡＶウイルス粒子の５×１０^１０ｇｐ、１．５×１０^１１ｇｐ、５×１０^１１ｇｐ、または１．５×１０^１２の用量を含む。

本開示の方法の一部の実施形態では、組成物はさらに、ＴＭＮ２００緩衝液を含む。

本開示は、黄斑ジストロフィーの処置を、それを必要とする対象において行う際に使用される本開示の組成物を提供する。

本開示は、黄斑ジストロフィーの処置を、それを必要とする対象において行う際に使用される本開示のベクターを提供する。

本開示は、黄斑ジストロフィーの処置を、それを必要とする対象において行う際に使用される本開示の送達ベクターを提供する。

特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開の写しは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、官庁から提供される。

図１Ａ〜Ｂは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ構築物をコードするプラスミドのマップのペアである。 図１Ａ〜Ｂは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ構築物をコードするプラスミドのマップのペアである。 図２Ａ〜Ｂは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ構築物をコードするプラスミドのマップのペアである。 図２Ａ〜Ｂは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ構築物をコードするプラスミドのマップのペアである。 図３Ａ〜Ｃは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡをコードする２つのプラスミドの一連の３つのマップである。図３Ａ及び図３Ｂは、ＡｍｐＲ選択可能マーカーを有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ．ＷＰＲＥ．ｐＡプラスミドの２つのマップである。図３Ｃは、ＫａｎＲ選択マーカー及びスタッファー配列を有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ．ＷＰＲＥ．ｐＡプラスミドのマップである。 図３Ａ〜Ｃは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡをコードする２つのプラスミドの一連の３つのマップである。図３Ａ及び図３Ｂは、ＡｍｐＲ選択可能マーカーを有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ．ＷＰＲＥ．ｐＡプラスミドの２つのマップである。図３Ｃは、ＫａｎＲ選択マーカー及びスタッファー配列を有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ．ＷＰＲＥ．ｐＡプラスミドのマップである。 図３Ａ〜Ｃは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡをコードする２つのプラスミドの一連の３つのマップである。図３Ａ及び図３Ｂは、ＡｍｐＲ選択可能マーカーを有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ．ＷＰＲＥ．ｐＡプラスミドの２つのマップである。図３Ｃは、ＫａｎＲ選択マーカー及びスタッファー配列を有するＣＡＧ．ＢＥＳＴ．ＷＰＲＥ．ｐＡプラスミドのマップである。 図４は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＶＭＤ２．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡをコードするプラスミドのマップである。 図５は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＶＭＤ２．Ｉｎｔ．Ｅｘ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡをコードするプラスミドのマップである。 図６Ａ〜Ｂは、ＡＡＶ．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ、ＡＡＶ．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞、及び形質導入されていない対照におけるＢＥＳＴ１発現を示す一連の画像、すなわちそれぞれ６枚の画像及び３枚の画像である。細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔブルー色素及び抗ｈベストロフィン−１で染色される。ベストロフィン−１タンパク質は、サイトゾル全体に局在する。 図７Ａ〜Ｂは、それぞれ、ウェスタンブロット（７Ａ）及び棒グラフ（７Ｂ）の写真であり、ＡＡＶ．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ（試料１）もしくはＡＡＶ．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ（試料２）で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞または陰性対照（試料３）、におけるベストロフィン−１タンパク質及びベータアクチン対照の発現を示す。プラスミド−トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を、陽性対照として使用した。図７Ｂは、ＡＡＶ．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ（ｎ＝９）もしくはＡＡＶ．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ（ｎ＝９）で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞または形質導入されていない陰性対照（ｎ＝８）におけるベストロフィン−１タンパク質発現の定量化を示す。Ｙ軸は、正規化されたＬｉＣｏｒ値を示す。エラーバーは、±ＳＥＭである。^＊＊＊は、形質導入されていない対照と比較した場合のｐ＜０．００１を示す。 図８Ａ〜Ｂは、それぞれ、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ、またはＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞及び形質導入されていない対照由来の全細胞パッチクランプ記録データを示す単一プロット（図８Ａ）及び一連の４つのプロット（図８Ｂ）である。図８Ａでは、電流（ｐＡ）が、Ｘ軸に、−１４０から５００まで２０刻みでプロットされ、電圧（ｍＶ）が、Ｙ軸に、−２００から５００まで１００単位でプロットされる。図８Ｂでは、電流波形が示される。種々のベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３及び形質導入されていない対照の電流（Ｉ）／電圧（Ｖ）プロットが示される。左上から時計回りに：ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ、形質導入されていない対照、及びＡＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ。挿入されたスケールバー（中央）は、Ｙ軸で２５０ｐＡ、Ｘ軸で１００ミリ秒を示す。 図９Ａ〜Ｂは、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ（ｎ＝１０）、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ（ｎ＝１０）、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ（ｎ＝１１）で形質導入されたＨＥＫ２９３細胞、及び形質導入されていない対照（ｎ＝１０）の弦コンダクタンスを示す一対のプロットである。弦コンダクタンスが、Ｙ軸に、０から１０まで２単位でプロットされる。^＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示し、^＊は、ｐ＜０．０５を示し、ｎｓは、有意ではないことを示す。 図１０Ａ〜Ｂは、分化したＡＲＰＥ１９細胞におけるＢＥＳＴ１発現をアッセイするための実験手順の２つの実施形態を示す一対のフローチャートである。図１０Ａは、トランスフェクト分化ＡＲＰＥ１９細胞におけるＢＥＳＴ１発現をアッセイするための実験手順を示す。図１０Ｂは、トランスフェクト及び／または形質導入された分化ＡＲＰＥ１９細胞におけるＢＥＳＴ１発現をアッセイするための実験手順を示す。 図１０Ａ〜Ｂは、分化したＡＲＰＥ１９細胞におけるＢＥＳＴ１発現をアッセイするための実験手順の２つの実施形態を示す一対のフローチャートである。図１０Ａは、トランスフェクト分化ＡＲＰＥ１９細胞におけるＢＥＳＴ１発現をアッセイするための実験手順を示す。図１０Ｂは、トランスフェクト及び／または形質導入された分化ＡＲＰＥ１９細胞におけるＢＥＳＴ１発現をアッセイするための実験手順を示す。 図１１Ａ〜Ｂは、１ヶ月間分化したトランスフェクトＡＲＰＥ１９細胞のＢＥＳＴ１及びＺＯ−１免疫染色を示す一連の１６枚の画像（Ａ）及び６枚の画像（Ｂ）である。（Ａ）行は、上から下に、以下の構築物：トランスフェクトされていない対照、ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを有するＡＲＰＥ１９細胞を示す。列は、左から右に、Ｈｏｅｃｈｓｔで青に染色された核、緑のＺＯ−１染色（ＺＯ−１は、細胞間密着結合の細胞膜表面のマーカーである）、赤のＢＥＳＴ１染色、及びマージされた画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＺＯ−１、ＢＥＳＴ１）を示す。スケールバーは、１００ミクロン（μｍ）を示す。（Ｂ）ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡでトランスフェクトされたＡＲＰＥ１９細胞が、上の行に示される。ＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡでトランスフェクトされたＡＲＰＥ１９細胞が、下の行に示される。画像は、左から右に、ＺＯ−１（緑）及びＢＥＳＴ１（赤）、ならびにマージされた画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＺＯ−１及びＢＥＳＴ１）を示す。マージされた画像のスケールバーは、２５μｍを示す。 図１１Ａ〜Ｂは、１ヶ月間分化したトランスフェクトＡＲＰＥ１９細胞のＢＥＳＴ１及びＺＯ−１免疫染色を示す一連の１６枚の画像（Ａ）及び６枚の画像（Ｂ）である。（Ａ）行は、上から下に、以下の構築物：トランスフェクトされていない対照、ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを有するＡＲＰＥ１９細胞を示す。列は、左から右に、Ｈｏｅｃｈｓｔで青に染色された核、緑のＺＯ−１染色（ＺＯ−１は、細胞間密着結合の細胞膜表面のマーカーである）、赤のＢＥＳＴ１染色、及びマージされた画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＺＯ−１、ＢＥＳＴ１）を示す。スケールバーは、１００ミクロン（μｍ）を示す。（Ｂ）ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡでトランスフェクトされたＡＲＰＥ１９細胞が、上の行に示される。ＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡでトランスフェクトされたＡＲＰＥ１９細胞が、下の行に示される。画像は、左から右に、ＺＯ−１（緑）及びＢＥＳＴ１（赤）、ならびにマージされた画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＺＯ−１及びＢＥＳＴ１）を示す。マージされた画像のスケールバーは、２５μｍを示す。 図１２Ａ〜Ｂは、３ヶ月間分化したトランスフェクトＡＲＰＥ１９細胞のＢＥＳＴ１及びＺＯ−免疫染色を示す一連の１６枚の画像（Ａ）及び９枚の画像（Ｂ）である。（Ａ）行は、上から下に、以下の構築物：トランスフェクトされていない対照、ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを有するＡＲＰＥ１９細胞を示す。列は、左から右に、Ｈｏｅｃｈｓｔで青に染色された核、緑のＺＯ−１染色、赤のＢＥＳＴ１染色、及びマージされた画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＺＯ−１、ＢＥＳＴ１）を示す。スケールバーは、１００ミクロン（μｍ）を示す。（Ｂ）高倍率での図１２Ａの代表的な画像である。行は、上から下にＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを示す。列は、左から右にＺＯ−１を緑に染色、ＢＥＳＴ１を赤に染色、及びＨｏｅｃｈｓｔで青に染色したものを含むマージ画像を示す。マージされた画像のスケールバーは、２５μｍを示す。 図１２Ａ〜Ｂは、３ヶ月間分化したトランスフェクトＡＲＰＥ１９細胞のＢＥＳＴ１及びＺＯ−免疫染色を示す一連の１６枚の画像（Ａ）及び９枚の画像（Ｂ）である。（Ａ）行は、上から下に、以下の構築物：トランスフェクトされていない対照、ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを有するＡＲＰＥ１９細胞を示す。列は、左から右に、Ｈｏｅｃｈｓｔで青に染色された核、緑のＺＯ−１染色、赤のＢＥＳＴ１染色、及びマージされた画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＺＯ−１、ＢＥＳＴ１）を示す。スケールバーは、１００ミクロン（μｍ）を示す。（Ｂ）高倍率での図１２Ａの代表的な画像である。行は、上から下にＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを示す。列は、左から右にＺＯ−１を緑に染色、ＢＥＳＴ１を赤に染色、及びＨｏｅｃｈｓｔで青に染色したものを含むマージ画像を示す。マージされた画像のスケールバーは、２５μｍを示す。 図１３Ａ〜Ｂは、４ヶ月間分化し、４００ｎＭのドキソルビシンで前処理され、且つ３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で、（図１３Ａ）ＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥまたは（図１３Ｂ）ＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥで形質導入されたＡＲＰＥ１９細胞内のＧＦＰ蛍光をそれぞれ示す二連の８枚の画像を示す。使用されたＭＯＩは、２、４、及び８×１０^４ゲノム粒子（ｇｐ）／細胞であった。陰性対照（形質導入されていない、非処理の細胞）のスケールバーは、５０μｍを示す。各パネルの上の行は、非処理の対照細胞を示し、下の行は、４００ｎＭのドキソルビシンで前処理された細胞である。 図１３Ａ〜Ｂは、４ヶ月間分化し、４００ｎＭのドキソルビシンで前処理され、且つ３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で、（図１３Ａ）ＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥまたは（図１３Ｂ）ＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥで形質導入されたＡＲＰＥ１９細胞内のＧＦＰ蛍光をそれぞれ示す二連の８枚の画像を示す。使用されたＭＯＩは、２、４、及び８×１０^４ゲノム粒子（ｇｐ）／細胞であった。陰性対照（形質導入されていない、非処理の細胞）のスケールバーは、５０μｍを示す。各パネルの上の行は、非処理の対照細胞を示し、下の行は、４００ｎＭのドキソルビシンで前処理された細胞である。 図１４は、４ヶ月間分化し、４００ｎＭのドキソルビシンで前処理され、且つ２つの異なるＭＯＩ：１及び４×１０^４ｇｐ／細胞で、ＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ及びＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥで形質導入されたＡＲＰＥ１９細胞のＢＥＳＴ１及びＺＯ−１免疫染色を示す一連の２０枚の画像を示す。行は、上から下に、以下のウイルスベクターを含むＡＲＰＥ１９細胞を示す：形質導入していない対照、ＭＯＩ１０，０００ｇｐ／細胞のＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＭＯＩ４０，０００ｇｐ／細胞のＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＭＯＩ１０，０００ｇｐ／細胞のＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＭＯＩ４０，０００ｇｐ／細胞のＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ。列は、左から右に、Ｈｏｅｃｈｓｔで青に染色された核、緑のＺＯ−１染色、赤のＢＥＳＴ１染色、及びマージされた画像（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＺＯ−１、ＢＥＳＴ１）を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。 図１５は、マウスにおける４／８週間のｉｎ ｖｉｖｏパイロット研究プロトコールを概説する表である。 図１６は、シャム、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物が注射されてから４週間後のマウスの眼の一連の６枚の光干渉断層画像診断（ＯＣＴ）画像である。列は、左から右に、シャム、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物が注射されたマウスを示す。 図１７は、左から右に、シャム、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物が注射されてから４週間後のマウスの眼の一連の３枚のＯＣＴ画像である。示される形態学的構造は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、内網状層（ＩＰＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外網状層（ＯＰＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）である。青矢印及び赤矢印は、網膜の厚さを示す。 図１８は、シャム、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物（列、左から右）が注射されてから４週間後及び８週間後のマウスの眼の一連の１２枚のＯＣＴ画像である。正中矢状図及び偏心図が交互の行に示される。上の２行は、注射の４週間後に撮像された動物であり、下の２行は、注射の８週間後に撮像された動物である。 図１９は、シャム、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物を注射されてから４週間後の且つ抗ＢＥＳＴ１（緑）、抗ロドプシン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）で染色されたマウスの眼の一連の１２枚の蛍光顕微鏡画像である。行は、上から下に、シャムを注射された眼、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥまたはＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ粒子を注射された眼を示す。列は、左から右に、抗ＢＥＳＴ１（緑）、抗ロドプシン（赤）、ＤＡＰＩ（青）、及びマージされた画像を示す。網膜色素上皮（ＲＰＥ）、光受容体（ＰＲ）、及び網膜神経節細胞（ＲＧＣ）が下部に示される。 図２０は、列に、左から右に、シャム、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ粒子が注射されてから８週間後の且つＢＥＳＴ１（緑）、ロドプシン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）で染色されたマウスの眼の一連の１２枚の画像である。行は、上から下に、マージされた画像、抗ＢＥＳＴ１（ｈｕＢＥＳＴ１とも呼ばれる）、抗ロドプシン、及び明視野画像である。 図２１は、シャム、ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物が注射されてから４週間後の解剖されたマウスＲＰＥ及び脈絡膜複合体におけるＢＥＳＴ１タンパク質発現を示す画像である。青矢印は、組み換えヒトベストロフィン−１タンパク質を示し、赤矢印は、ＢＥＳＴ１タンパク質の示唆されるサイズを示す。ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを、対照として使用した。ＣＡＧは、哺乳動物細胞において構成的な発現を伴う強力なプロモーターである。それは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメント、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、及びウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプター間のハイブリッドである。 図２２は、マウスにおける４／１３週間のｉｎ ｖｉｖｏ概念実証（ＰｏＣ）試験プロトコールを概説する表である。 図２３は、２つの異なる投薬量（１×１０^８ＧＣ／μＬ／眼及び１×１０^９ＧＣ／μＬ／眼）のシャム、ＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物が注射された後４週間及び１３週間のマウスの眼の一連の２０枚のＯＣＴ画像である。中央矢状図（上の行）及び偏心図（下の行）が交互の行に示される。 図２４は、２つの異なる投薬量（１×１０^８ＧＣ／μＬ／眼及び１×１０^９ＧＣ／μＬ／眼）のシャム、ＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ構築物が注射されてから４週間後の且つ抗ＢＥＳＴ１（ｈｕＢＥＳＴ１、緑色）、抗ロドプシン（赤）、及びＤＡＰＩ（青色）で染色されたマウスの眼の一連の２０枚の顕微鏡画像である。明視野画像も示される（下の行）。列は、左から右に、１×１０^８ＧＣ／μＬ／眼のＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、１×１０^９ＧＣ／μＬ／眼のＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、１×１０^８ＧＣ／μＬ／眼のＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及び１×１０^９ＧＣ／μＬ／眼のＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥを示す。行は、上から下に、マージされた画像、抗ＢＥＳＴ１、抗ロドプシン、及び明視野を示す。左上の画像に示される解剖学的構造は、内顆粒層（ＩＮＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、外節（ＯＳ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、及び脈絡膜である。 図２５は、Ａ〜Ｂは、細胞または注入されたマウスＲＰＥ及び脈絡膜複合体におけるＢＥＳＴ１タンパク質の発現に注目するウェスタンブロットの画像のペアである。図２５Ａは、ｐＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ｐＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、及びｐＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３及びＡＲＰＥ−１９細胞、または陰性対照としてのトランスフェクトされていない試料におけるベストロフィン−１タンパク質及びベータアクチン対照の発現を示すウェスタンブロットである。図２５Ｂは、高用量（１×１０^９ＧＣ／μＬ／眼）または低用量（１×１０^８ＧＣ／μＬ／眼）のいずれかのＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥまたはＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ粒子のいずれかが注射されたマウス由来の単離されたＲＰＥ及び脈絡膜試料中のＢＥＳＴ１タンパク質を示すウェスタンブロットである。 図２６は、ＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥが注射されたマウスにおける免疫組織化学及びウェスタンブロットによりヒトＢＥＳＴ１発現をアッセイするための試験設計を示す表である。 図２７は、マウスにおける潜在的な毒性を評価するために提案された優良試験所基準（ＧＬＰ）試験のプロトコールを示す表である。 図２８は、４週間での毒性評価試験物質の評価のためのプロトコールを示す表である。 図２９は、非ヒト霊長類における潜在的な毒性を評価するために提案された優良試験所基準（ＧＬＰ）試験のプロトコールを示す表である。 図３０は、本開示のＢＥＳＴ１ ＡＡＶウイルスベクターを使用した、ゲノム粒子（ｇｐ）でのマウス、非ヒト霊長類、及びヒト等価用量における投与レジメンを示す表である。提案された用量に対するＢＥＳＴ１ ＡＡＶウイルスベクターは、２×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度であり、現在の適正製造基準（ＧＭＰ）標準に従って作成された。 図３１は、本開示のＢＥＳＴ１ ＡＡＶウイルスベクターのマウス、非ヒト霊長類、及びヒトにおける投与レジメン及びＤＮＡｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の必要とされる濃度及び１用量当たりのゲノム粒子（ｇｐ）数を示す表である。

詳細な説明
本開示は、黄斑変性症が多くの場合、タンパク質ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１、ＶＭＤ２としても知られる）の変異または異常な機能により引き起こされ得るという知見に関連する。黄斑は、網膜の中心付近の領域であり、中央の高解像度の色覚に関与する。黄斑の中心付近に位置する中心窩には、眼の錐体細胞光受容体が最も集中する。ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１、またはヒトＢＥＳＴ１（ｈＢＥＳＴ１）、ＶＭＤ２としても知られる）と呼ばれる遺伝子の変異は、ベストリノパチーと呼ばれる少なくとも５つの異なる網膜変性疾患に関連する。ベストリノパチーは、ベストの卵黄様黄斑ジストロフィー（ＢＶＭＤ）、常染色体劣性ベストロフィノパチー、成人発症型卵黄様黄斑ジストロフィー、常染色体優性硝子体網膜脈絡膜症、及び網膜色素変性症を含む。これらの変異は、優性（例えば、ＢＶＭＤ）または劣性のいずれかであり得る。ベストの卵黄様黄斑ジストロフィー（ＢＶＭＤ）及び常染色体劣性ベストロフィノパチーは、小児期後期または青年期に発症する黄斑変性症を引き起こし得る。しかし、一部の場合では、黄斑変性症は、成人期に始まる。しかし、発症年齢に関係なく、ベストリノパチーは、視力に壊滅的な影響を有し得、現在、既知の効果的な処置はない。ＢＥＳＴ１機能がベストロフィノパチーで果たす重要な役割を考えると、ベストフィノパチーの処置への１つのアプローチは、患者の罹患細胞に機能的なＢＥＳＴ１タンパク質を送達することである。

ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）
ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）は、主に、眼の網膜色素上皮（ＲＰＥ）に見られ、主に、基底外側の原形質膜に局在する内在性膜タンパク質である。ＢＥＳＴ１タンパク質は、イオンチャネル及び細胞内カルシウムシグナル伝達の調節因子として機能すると考えられている。ヒトＢＥＳＴ１は、アクセッション番号ＮＰ＿００４１７４．１及びＮＭ＿００４１８３．３でＮＣＢＩデータベースに見出すことができ、この内容は、全体が本明細書に参照により組み込まれる。

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、以下の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする核酸配列は、以下の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化配列を含む。一部の実施形態では、配列は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。

ＢＥＳＴ１発現
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする核酸配列はさらに、ＢＥＳＴ１転写物またはＢＥＳＴ１タンパク質発現を増強または増加させる調節エレメントをコードする配列を含む。ＢＥＳＴ１転写物またはＢＥＳＴ１タンパク質発現を増強または増加させる例示的な調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、スーパーエンハンサー、イントロン、エクソン、イントロン及びエクソンの組み合わせ、非翻訳領域をコードする配列（例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む配列、及び転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の例示的なプロモーターとしては、哺乳動物細胞においてＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列またはＢＥＳＴ１タンパク質を発現することができるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の例示的なプロモーターとしては、ヒト細胞においてＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列またはＢＥＳＴ１タンパク質を発現することができるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、哺乳動物またはヒト細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕであってよい。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的に活性であってよい。一部の実施形態では、プロモーターは、細胞型特異的であってよい。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性であってよい。

本開示の例示的な構成的に活性なプロモーターとしては、ウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本開示のウイルスプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、伸長因子−１アルファ（ＥＦ１Ａ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター及びＣＡＧプロモーター（（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、（Ａ）ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロンを含むプロモーター、ならびに（Ｇ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターの組み合わせ）を含んでもよいが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＭＶプロモーターが本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御するために使用される。一部の実施形態では、ＣＡＧプロモーターが本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする核酸配列の発現を制御するために使用される。本開示の非ウイルスプロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含んでもよいが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＢＡプロモーターは、ＣＢＡ遺伝子の第１のエクソン及びイントロンにおけるニワトリベータアクチンを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーター及びサイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモーターはさらに、ウサギベータグロビンスプライスアクセプター配列（ＣＡＧプロモーター）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＧプロモーターは、以下の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる：

本開示の例示的な細胞型特異的プロモーターとしては、ニューロンにおいて核酸またはタンパク質を発現することができるプロモーター、網膜細胞において核酸またはタンパク質を発現することができるプロモーター、光受容体において核酸またはタンパク質を発現することができるプロモーター、桿体細胞において核酸またはタンパク質を発現することができるプロモーター、及び錐体細胞において核酸またはタンパク質を発現することができるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターをコードする配列は、ヒトＶＭＤ２遺伝子（ベストロフィン−１としても知られる）をコードする配列を含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、ヒトＶＭＤ２プロモーター（ベストロフィン−１としても知られる）を含む。一部の実施形態では、ヒトＶＭＤ２プロモーターは、以下の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる：

一部の実施形態では、ヒトＶＭＤ２プロモーターは、以下の核酸配列と１００％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列及びプロモーターをコードする配列を含む核酸配列はさらに、イントロン及びエクソンを含む。イントロン及びエクソンの存在により、タンパク質発現のレベルが増加する。一部の実施形態では、イントロンは、ＶＭＤ２プロモーター及びエクソン間に配置される。イントロンがＶＭＤ２プロモーター及びエクソン間に配置される実施形態を含む一部の実施形態では、エクソンは、ＢＥＳＴコード配列の５’に配置される。

エクソンは、コード配列、非コード配列、または両方の組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、エクソンは、非コード配列を含む。一部の実施形態では、エクソンは、哺乳動物遺伝子から単離または誘導される。実施形態では、哺乳動物は、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）である。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子は、ウサギベータグロビン遺伝子を含む。一部の実施形態では、エクソンは、以下の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む：

一部の実施形態では、エクソンは、以下の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む：

イントロンは、スプライス供与部位、スプライス受容部位、または分岐点を含んでもよい。イントロンは、スプライス供与部位、スプライス受容部位、及び分岐点を含んでもよい。例示的なスプライス受容部位は、イントロンの５’末端にヌクレオチド「ＧＴ」（ｐｒｅ−ｍＲＮＡでは「ＧＵ」）を含む。例示的なスプライス受容部位は、イントロンの３’末端に「ＡＧ」を含む。一部の実施形態では、分岐点は、イントロンの３’末端の上流に、端点を含む２０〜４０ヌクレオチドにアデノシン（Ａ）を含む。イントロンは、人工的または天然に存在しない配列であってよい。あるいは、イントロンは、脊椎動物遺伝子から単離または誘導されてもよい。イントロンは、２つの配列の融合をコードする配列を含んでもよく、これらのそれぞれは、複数の脊椎動物遺伝子から単離または誘導されてもよい。一部の実施形態では、イントロン核酸配列に寄与する脊椎動物遺伝子は、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、ニワトリ遺伝子は、ニワトリベータアクチン遺伝子を含む。一部の実施形態では、イントロン核酸配列に寄与する脊椎動物遺伝子は、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、ウサギ遺伝子は、ウサギベータグロビン遺伝子を含む。一部の実施形態では、イントロンは、以下の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む：

一部の実施形態では、イントロンは、以下の核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む：

コザック配列は、リボソームにより翻訳開始部位として認識される短い配列モチーフである。コザック配列は、翻訳開始部位のすぐ上流、または周囲に配置されてもよい。脊椎動物では、コザックコンセンサス配列は、

のコンセンサス配列と少なくとも５０％の同一性を有する配列を含み、Ｒは、ＡまたはＧを表し、開始メチオニンをコードするＡＴＧは太字である。本開示の例示的なコザック配列は、

の配列を含む。一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１をコードする核酸配列を含む核酸はさらに、５’非翻訳配列（５’ＵＴＲ）をコードする配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、コザック配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、コザック配列の一部を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、コザック配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％を含む。

一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１をコードする核酸配列を含む核酸はさらに、転写応答エレメント（ＰＲＥ）をコードする核酸配列を含む。例示的なＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルスに由来するウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）を含む。一部の実施形態では、ＷＰＲＥをコードする配列は、ＢＥＳＴ１をコードする核酸配列の３’に配置される。一部の実施形態では、ＷＰＲＥをコードする配列は、ＢＥＳＴ１をコードする核酸配列及びポリＡシグナルをコードする配列間に配置される。一部の実施形態では、ＷＰＲＥをコードする配列は、以下の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む：

一部の実施形態では、ＷＰＲＥをコードする配列は、以下の核酸配列と１００％の同一性を有する核酸配列を含む：

一部の実施形態では、ＢＥＳＴ１をコードする核酸配列を含む核酸はさらに、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列を含む。ポリＡシグナルは、核外輸送を促進し、翻訳を強化し、ｍＲＮＡの安定性を向上させる。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、合成または人工の配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、哺乳動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子は、ヒト遺伝子である。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子は、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨ）である。一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、以下の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含む：

一部の実施形態では、ポリＡシグナルをコードする配列は、以下の核酸配列と１００％の同一性を有する核酸配列を含む：

ＡＡＶベクター
ベクターは、ＢＥＳＴ１をコードする核酸配列を含む核酸を含んでもよい。本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、ウイルス送達ベクターであってよい。本開示のウイルス送達ベクターは、標的細胞または組織に送達するためのウイルス送達系に本開示の核酸配列をパッケージングに必要な配列を含有してもよい。本開示の代表的なウイルス送達ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むが、これらに限定されない。

本開示のＡＡＶウイルス送達システムは、成熟ＡＡＶ粒子またはビリオンの形態、すなわち、ＡＡＶタンパク質カプシドに囲まれた核酸、であってよい。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルス送達ベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体を含んでもよい。

ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ粒子の生成に必要な機能をコードする核酸配列である。これらの機能は、ＡＡＶ粒子へのＡＡＶゲノムのカプシド形成を含む、宿主細胞におけるＡＡＶの複製及びパッケージングサイクルで機能するものを含む。天然に存在するＡＡＶは、複製欠損型であり、複製及びパッケージングのサイクルを完了するために、トランスでのヘルパー機能の提供に依存する。好ましい実施形態では、本開示のベクターのＡＡＶゲノムは、複製欠損型である。

ＡＡＶゲノムは、ポジティブセンスもしくはネガティブセンスのいずれかの一本鎖形態、または代わりに、二本鎖形態であってよい。二本鎖形態の使用は、標的細胞におけるＤＮＡ複製ステップの迂回を可能にするので、導入遺伝子発現を促進し得る。本開示のベクターのＡＡＶゲノムは、一本鎖形態であってよい。

ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの任意の天然由来の血清型、分離株、またはクレードに由来してもよい。従って、ＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡＡＶの完全なゲノムであってよい。当業者に知られるように、自然界に存在するＡＡＶは、種々の生体系に従って分類されてもよい。

ＡＡＶは、血清型に関して言及される。血清型は、ＡＡＶの多様性亜種に対応し、カプシド表面抗原の発現プロファイルにより、他の多様性亜種と区別するために使用することができる特有の反応性を有する。特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、他のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。ＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、さらには、霊長類の脳から最近同定されたＲｅｃ２及びＲｅｃ３などの組み換え血清型を含む。これらのＡＡＶ血清型のいずれも、本発明で使用されてもよい。従って、一部の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｅｃ２、またはＲｅｃ３ ＡＡＶから誘導されてもよい。

ＡＡＶ血清型の総説は、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｕｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒｅ．５：２９９−３１０及びＷｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：３１６−２７に見出され得る。ＩＴＲ配列を含むＡＡＶゲノムの、もしくはＡＡＶゲノムのエレメントの配列、ｒｅｐ遺伝子またはｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶの全ゲノム配列に対する以下のアクセッション番号から誘導されてもよい：アデノ随伴ウイルス１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；アデノ随伴ウイルス２ ＮＣ＿００１４０１；アデノ随伴ウイルス３ ＮＣ＿００１７２９；アデノ随伴ウイルス３Ｂ ＮＣ＿００１８６３；アデノ随伴ウイルス４ ＮＣ＿００１８２９；アデノ随伴ウイルス５ Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６；アデノ随伴ウイルス６ ＮＣ＿００１８６２；鳥類ＡＡＶ ＡＴＣＣ ＶＲ−８６５ ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；鳥類ＡＡＶ株ＤＡ−１ ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶ ＮＣ＿００５８８９、ＡＹ３８８６１７。

ＡＡＶはまた、クレードまたはクローンに関して言及されてもよい。これは、天然由来のＡＡＶの系統発生関係、及び共通の祖先に遡ることができるＡＡＶの系統発生群を意味し、その子孫を全て含む。さらに、ＡＡＶは、特定の分離株、すなわち、自然界に見られる特定のＡＡＶの遺伝的分離株に関して言及されてもよい。遺伝的分離株という用語は、他の天然に存在するＡＡＶとの制限された遺伝的混合を受けているＡＡＶの集団について説明し、それにより、遺伝子レベルで認識可能な異なる集団を定義する。

ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶウイルスの感染（または向性）の組織特異性を決定する。従って、本発明に従って患者に投与されるＡＡＶに使用される好ましいＡＡＶ血清型は、眼内の標的細胞の感染に対して自然な向性または高効率を有するものである。一実施形態では、本発明で使用されるＡＡＶ血清型は、感覚神経網膜、網膜色素上皮、及び／または黄斑の細胞に感染するものである。

ＡＡＶの天然由来の血清型、分離株、またはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、機能的な複製起点を提供するために、シスに作用し、細胞のゲノム由来のベクターの組み込み及び切除を可能にする。

ＡＡＶウイルス送達ベクターは、少なくとも１つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、好ましくは、複数のＩＴＲ、例えば、２つ以上のＩＴＲ、を含んでもよい。ＩＴＲのうちの１つまたはそれより多くは、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムから誘導されても、キメラまたは変異型ＩＴＲであってもよい。好ましい変異型ＩＴＲは、ｔｒｓ（末端分解部位）の欠失があるものである。この欠失は、ゲノムの継続的な複製を可能にし、コーディング配列及び相補配列の両方を含有する一本鎖ゲノム、すなわち、自己相補的なＡＡＶゲノムが生じる。これは、標的細胞におけるＤＮＡ複製の迂回を可能にし、従って、導入遺伝子発現の促進を可能にする。

例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換後に、宿主細胞の核において、本発明のウイルス送達ベクターのコンカテマー形成を助ける１つまたはそれより多くのＩＴＲを含むことが好ましい。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の存続期間中、ベクター構築物を保護し、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子の長期発現を可能にする。

一部の実施形態では、ＩＴＲエレメントは、ウイルス送達ベクターにおいて天然のＡＡＶゲノムから保持される唯一の配列である。従って、一部の実施形態では、ウイルス送達ベクターは、天然ゲノムのｒｅｐやｃａｐ遺伝子のいずれも含まず、さらに、天然ゲノムの他の任意の配列を欠いている。これは、上記の理由のために、さらには、ベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれる可能性を低減させるためにも好ましい。さらに、ＡＡＶゲノムのサイズを低減させると、導入遺伝子に加えて、ベクター内に他の配列エレメント（例えば、調節エレメント）を組み込む柔軟性の増加を可能する。一部の実施形態では、本開示のウイルス送達ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲをコードする配列を含む。一部の実施形態では、２つのＡＡＶ２ ＩＴＲをコードする配列は、以下の核酸配列を含んでも、それからなってもよい：

ＡＡＶゲノムは、長さが約４．７ｋｂの核酸配列を含んでもよい。従って、ＡＡＶウイルスベクターにより送達されるべき核酸配列が、４．７ｋｂ未満の長さである実施形態では、スタッファーまたはフィラー配列が使用されてもよい。スタッファー配列の存在は、一部の実施形態では、ウイルス粒子へのＡＡＶウイルスベクターパッケージングを助け得る。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ランダム配列を含む。本開示の例示的なスタッファー配列は、以下の核酸配列を含んでも、それからなってもよい：

一部の実施形態では、ＡＡＶウイルス送達ベクターは、ＶＭＤ２プロモーターをコードする配列、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列、及びＷＰＲＥをコードする配列を含む核酸配列を含む。この核酸配列（ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ）を含む本開示の例示的なＡＡＶウイルス送達ベクターは、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる：

一部の実施形態では、ＡＡＶウイルス送達ベクターは、ＶＭＤ２プロモーターをコードする配列、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列、イントロンをコードする配列、エクソンをコードする配列、及びＷＰＲＥをコードする配列を含む核酸配列を含む。本開示の例示的なＡＡＶウイルス送達ベクターは、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなるＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ配列をコードする核酸配列を含む：

一部の実施形態では、ＡＡＶウイルス送達ベクターは、ＣＡＧプロモーターをコードする配列、ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列、及びＷＰＲＥをコードする配列を含む核酸配列を含む。ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ配列をコードする核酸配列を含む本開示の例示的なＡＡＶウイルス送達ベクターは、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる：

本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、マーカーをコードする配列を含んでもよく、これは、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかである場合、細胞で発現され得る。例えば、本開示のベクターまたは核酸配列において、マーカーをコードする配列が本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードする配列（例えば、ＢＥＳＴ１遺伝子のコード配列を含む配列）の代わりに使用されても、それを置換してもよい。本開示の例示的なマーカーとしては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、またはｄｓＲＥＤなどのフルオロフォアタンパク質、及びＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｈｉｓ、またはＭｙｃなどの種々のエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアまたはエピトープタグは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合としてＢＥＳＴ１コード配列に融合されても、本開示のベクターを特徴づけるためにＢＥＳＴ１の代わりに使用されてもよい。本開示のマーカーを含有するベクターの例示的な使用には、遺伝子発現、例えば、発現レベル、の特徴づけ、または本開示のベクターの細胞型特異性の特徴づけが挙げられるが、これらに限定されない。

マーカーを含む本開示の例示的なベクターとしては、ＶＭＤ２．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡが挙げられる。ＶＭＤ２．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ構築物をコードする核酸配列は、以下を含むか、またはそれらからなる：

マーカーを含む本開示の例示的なベクターとしては、ＶＭＤ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡが挙げられる。ＶＭＤ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ構築物をコードする核酸配列は、以下を含むか、またはそれらからなる：

ＡＡＶ粒子
本開示のＡＡＶベクターは、患者への投与の目的のために誘導体化されているＡＡＶゲノムを含有する。そのような誘導体化は、当該技術分野で標準的であり、本発明は、ＡＡＶゲノムの任意の既知の誘導体、及び当該技術分野で既知の手法を適用することにより生成することができ得る誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノム及びＡＡＶカプシドの誘導体化は、Ｃｏｕｒａ ａｎｄ Ｎａｒｄｉ（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：９９、ならびに上で参照されたＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．及びＷｕ ｅｔ ａｌ．に概説される。

ＡＡＶゲノムの誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明のベクター由来の導入遺伝子の発現を可能にする任意の短縮または改変形態のＡＡＶゲノムを含む。最小限のウイルス配列を含むようにＡＡＶゲノムを大幅に短縮し、依然として上記の機能を保持することが可能である。これは、野生型ウイルスのベクターの組み換えのリスクを低減させるために、さらには、標的細胞におけるウイルス遺伝子タンパク質の存在による細胞性免疫応答の誘発を回避するためにも、安全上の理由から好ましい。

従って、以下の部分、すなわち１つの末端逆位反復（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）、及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子は、本発明の誘導体において除去することができ得る。しかし、一部の実施形態では、誘導体はさらに、ＡＡＶゲノムの１つまたはそれより多くのｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子または他のウイルス配列を含んでもよい。天然に存在するＡＡＶは、ヒト染色体１９の特異的部位で高頻度に組み込まれ、無視できる頻度のランダムな組み込みを示し、その結果、ベクターにおける組み込み能の保持が、治療環境において忍容され得る。

ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ粒子のパッケージング機能をコードするｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子などのパッケージング遺伝子を含む。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０またはそれらのバリアントのうちの１つまたはそれより多くをコードする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３またはそれらのバリアントなどの１つまたはそれより多くのカプシドタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のカプシドを構成する。

誘導体が、カプシドタンパク質、すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３、を含む場合、誘導体は、１つまたはそれより多くの天然に存在するＡＡＶのキメラ、シャッフル、またはカプシド改変誘導体であってもよい。特に、本発明は、同じベクター（すなわち、偽型ベクター）内のＡＡＶの異なる血清型、クレード、クローン、または分離株由来のカプシドタンパク質配列の提供を包含する。

キメラ、シャッフル、またはカプシド改変誘導体は、ウイルスベクターに１つまたはそれより多くの所望の機能を提供するように選択される。従って、これらの誘導体は、ＡＡＶ２のゲノムなどの天然に存在するＡＡＶゲノムを含むＡＡＶベクターと比較して、遺伝子送達の効率の向上、免疫原性（体液性または細胞性）の低下、向性範囲の変化、及び／または特定の細胞型の標的化の改善を示し得る。遺伝子送達の向上した効率は、細胞表面での受容体または共受容体結合の改善、内在化の改善、細胞内及び核へのトラフィッキングの改善、ウイルス粒子の脱殻の改善、ならびに一本鎖ゲノムの二本鎖形態への変換の改善により達成され得る。効率の向上は、ベクター用量が、必要とされない組織に投与することにより希釈されないような向性範囲の変更または特定の細胞集団の標的化にも関連し得る。

キメラカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶ血清型の２つまたはそれより多くのカプシドコード配列間の組み換えにより生成されたものを含む。これは、例えば、ある血清型の非感染性カプシド配列を異なる血清型のカプシド配列と共に同時トランスフェクトするマーカーレスキューアプローチにより実施されてもよく、特異的選択が、所望の特性を有するカプシド配列について選択するために使用される。異なる血清型のカプシド配列は、新規のキメラカプシドタンパク質を生成するために、細胞内での相同組み換えにより変更することができる。

キメラカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質配列を操作して、２つまたはそれより多くのカプシドタンパク質間に、例えば、異なる血清型の２つまたはそれより多くのカプシドタンパク質間に、異なる特定のカプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、または特定のアミノ酸残基を移入することにより生成されるものも含む。

シャッフルまたはキメラカプシドタンパク質は、ＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲによっても生成され得る。ハイブリッドＡＡＶカプシド遺伝子は、関連ＡＡＶ遺伝子の配列、例えば、複数の異なる血清型のカプシドタンパク質をコードするもの、をランダムにフラグメント化し、次に、配列相同性の領域に交差も生じさせ得る自己プライミングポリメラーゼ反応においてフラグメントを再び集めることにより作成することができる。いくつかの血清型のカプシド遺伝子をシャッフルすることにより、このように作成されたハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリーは、所望の機能を有するウイルスクローンを同定するためにスクリーニングすることができる。同様に、エラープローンＰＣＲが、所望の特性について選択され得るバリアントの多様なライブラリーを生じるように、ＡＡＶカプシド遺伝子をランダムに変異させるために使用されてもよい。

カプシド遺伝子の配列はまた、天然の野生型配列に対し特異的な欠失、置換、または挿入を導入するように遺伝子改変されてもよい。特に、カプシド遺伝子は、カプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内への、またはカプシドコード配列のＮ末端及び／またはＣ末端に、無関係のタンパク質またはペプチドの配列を挿入することにより改変されてもよい。無関係のタンパク質またはペプチドは、有利には、特定の細胞型のリガンドとして作用して、それにより、標的細胞への結合の改善を与えるか、またはそれにより、特定の細胞集団にベクターを標的化する特異性を改善するものであってよい。無関係のタンパク質はまた、産生プロセスの一部としてウイルス粒子の精製を支援するもの、すなわち、エピトープまたはアフィニティータグ、であってよい。挿入部位は、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、トラフィッキング、を阻害しないように選択されるであろう。当業者は、共通の一般的な知識に基づいて、挿入に適する部位を同定することができる。特定の部位は、上記で参照されたＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．に開示される。

本発明はさらに、天然ＡＡＶゲノムとは異なる順序及び構成のＡＡＶゲノムの配列の提供を包含する。本発明はまた、１つまたはそれより多くのＡＡＶ配列または遺伝子を、別のウイルス由来の配列と、または複数のウイルス由来の配列からなるキメラ遺伝子と置換することを包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２つまたはそれより多くの関連ウイルスタンパク質由来の配列からなってもよい。

本発明のＡＡＶベクターは、ある血清型のＩＴＲを有するＡＡＶゲノムまたは誘導体が異なる血清型のカプシドにパッケージされるトランスカプシド形態を含む。本発明のＡＡＶベクターはまた、２つまたはそれより多くの異なる血清型由来の未改変カプシドタンパク質の混合物がウイルスカプシドを構成するモザイク形態を含む。ＡＡＶベクターはまた、カプシド表面に吸着されるリガンドを有する化学的改変形態を含んでもよい。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含んでもよい。

従って、例えば、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／２）、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／５）、ならびにＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／８）を含む。本発明のＡＡＶベクターは、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質を含んでもよい。一実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、変異型ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含む。好ましくは、変異型ＡＡＶ８カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８ Ｙ７３３Ｆカプシドタンパク質である。

本開示のＡＡＶウイルス粒子を作製する方法は、当業者に既知であろう。本開示のＡＡＶウイルス粒子を調製する例示的であるが非限定的な方法が以下に記載される。所与のＡＡＶベクターの生成には、３つのプラスミド、すなわち送達されるべき目的の核酸配列（すなわち、ＢＥＳＴ１をコードする核酸配列）をコードするウイルス送達ベクターを含むもの、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、ならびに良好なＡＡＶ生成に必要な必須のアデノウイルス遺伝子を含有する第３のヘルパープラスミドが必要とされる。プロモーターは、パッケージング遺伝子のそれぞれに作動可能に連結されていてもよい。そのようなプロモーターの特定の例としては、ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０プロモーター（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：５５６７−５５７１）が挙げられる。例えば、ｐ５及びｐ１９プロモーターは一般に、ｒｅｐ遺伝子を発現させるために使用されるが、ｐ４０プロモーターは一般に、ｃａｐ遺伝子を発現させるために使用される。プラスミドは、ＡＡＶウイルスベクターを複製し、ＡＡＶタンパク質を転写及び翻訳し、ＡＡＶウイルス粒子にＡＡＶウイルスベクターをパッケージングすることができる好適な細胞をトランスフェクトするために使用される。例示的な好適な細胞は、ＨＥＫ２９３細胞を含む。トランスフェクション後に、細胞は、回収され溶解させる。次に、ＡＡＶ粒子は、様々な方法で溶解物から精製することができる。あるいは、ＡＡＶ粒子は、上清から精製することができる。例えば、溶解物は、ベンゾナーゼで処理して、清澄化してから１５％、２５％、４０％、及び６０％の相からなるイオジキサノール勾配に適用することができる。勾配は、１時間３０分、５９，０００ｒｐｍで遠心し、次に、４０％の画分を取り出し得る。次に、このＡＡＶ相は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ １００Ｋフィルターユニットを使用して精製及び濃縮することができる。

医薬組成物
本発明のＡＡＶベクターは、医薬組成物に製剤化されてもよい。これらの組成物は、薬品に加えて、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、緩衝剤、安定剤、または当該技術分野で周知の他の物質を含んでもよい。そのような物質は、非毒性でなければならず、活性成分の有効性を阻害してはならない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば、網膜下、直接網膜、または硝子体内注射に従って当業者により決定されてもよい。

医薬組成物は、液体として製剤化されてもよい。液体医薬組成物は、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油、または合成油などの液体担体を含んでもよい。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロース、もしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。一部の場合では、プルロン酸（ＰＦ６８）０．００１％などの界面活性剤が使用されてもよい。

罹患部位での注射の場合、活性成分は、発熱性物質不含であり、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する水溶液の形態であってよい。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、または乳酸リンガー注射などの等張性ビヒクルを使用して好適な溶液を十分に調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／または他の添加剤が含まれてもよい。

緩衝液は、ＡＡＶ遺伝子治療のための注射デバイスの貯蔵及び通過後の本開示のウイルスベクター及びベクター粒子の安定性及び生体適合性に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクター及びベクター粒子は、生体適合性及び安定性を維持するために、ＴＭＮ２００緩衝液で希釈されてもよい。ＴＭＮ２００緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨを８．０に調整）、１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び２００ｍＭのＮａＣｌを含む。

物理的なウイルスゲノム力価の決定は、ウイルスベクターまたはウイルス粒子の特徴づけの一部を成す。一部の実施形態では、物理的ウイルスゲノム力価の決定は、遺伝子治療中のウイルスベクター及びウイルス粒子の効力及び安全性を確実にする１ステップを成す。一部の実施形態では、ＡＡＶ力価を決定する方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。標準として使用されるＤＮＡの立体配座または試料調製中の酵素消化などの結果に影響を与え得る種々の可変要素がある。力価が測定され得るウイルスベクターまたは粒子調製物は、プラスミドを使用して生成された標準希釈曲線と比較されてもよい。一部の実施形態では、標準曲線で使用されるプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル立体配座にある。一部の実施形態では、標準曲線で使用されるプラスミドＤＮＡは、線形立体配座である。線状プラスミドを、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化することにより調製し、アガロースゲル電気泳動により可視化し、製造業者の使用説明書に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製することができる。標準曲線を生成するために使用されるプラスミド内で切断する他の制限酵素も適切であり得る。一部の実施形態では、標準としてのスーパーコイルプラスミドの使用により、線状プラスミドの使用と比較して、ＡＡＶベクターの力価が増加した。

ＡＡＶゲノム力価の定量化のために精製ＡＡＶベクターからＤＮＡを抽出するために、２つの酵素的方法を使用することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＤＮａｓｅ Ｉで単独で消化されてもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＤＮａｓｅ Ｉ及び追加のプロテイナーゼＫ処理で二重消化されてもよい。次に、ＱＰＣＲを、導入遺伝子配列に特異的なプライマー及びＴａｑｍａｎプローブを使用するＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施することができる。

遅延放出の場合、薬品は、例えば、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセル中で、または当該技術分野で既知の方法によるリポソーム担体系中で、持続放出用に製剤化される医薬組成物に含まれてもよい。

投薬量
本明細書で使用される場合、「Ｄｎａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）」という用語は、Ｄｎａｓｅ消化に耐性であり、それ故、本開示のＡＡＶベクターを完全にカプセル化し、Ｄｎａｓｅ消化から保護すると考えられるＡＡＶ粒子を指す。ＡＡＶ粒子はまた、用量中の投与されるゲノム粒子（ｇｐ）の総数、またはｇｐ／ｍＬ、溶液１ミリリットル（ｍＬ）当たりのゲノム粒子の数に関して定量されてもよい。本明細書で使用される場合、ゲノム粒子（ｇｐ）は、本開示のＡＡＶ送達ベクター（またはＡＡＶゲノム）のコピーを含有するＡＡＶ粒子を指す。本明細書で使用される場合、１ｍＬ当たりのゲノム含量（ＧＣ）という用語は、溶液１ｍＬ当たりのウイルスゲノムの数を指し、例えば、上記のようにｑＰＣＲにより決定されてもよい。ＧＣ及びＶＧ（ウイルスゲノム）という用語が、本開示のＡＡＶ投薬量及び濃度を特徴づけるために同義的に使用されてもよい。

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターが、単回用量として対象に投与される。

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターが薬学的に許容される担体に懸濁される液体懸濁液として製剤化されてもよい。一部の実施形態では、本開示の組成物は、１ｍＬ当たり１〜２×１０^９、１〜２×１０^１０、１〜２×１０^１１、１〜２×１０^１２、または１〜２×１０^１３のゲノム粒子（ｇｐ）の濃度で複数のＡＡＶベクターを含んでもよい。一部の実施形態では、本開示の組成物は、５×１０^１１ＤＲＰ／ｍＬ、１．５×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、５×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、１．２×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、４．５×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、１．２×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬ、１．５×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬ、または５×１０^１３ＤＲＰ／１．２×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で複数のＡＡＶベクターを含んでもよい。一部の実施形態では、本開示の組成物は、１ｍＬ当たり５×１０^１２ＤＲＰの濃度で複数のＡＡＶベクターを含んでもよい。一部の実施形態では、本開示の組成物は、１ｍＬ当たり１．５×１０^１３ＤＲＰの濃度で複数のＡＡＶベクターを含んでもよい。従って、約２×１０^１０ｇｐのＡＡＶベクターの用量を投与するために、例えば、１ｍＬ当たり約２×１０^１２ｇｐの濃度を有する医薬組成物約１０マイクロリットルの単回注射が、ｉｎ ｖｉｖｏで所望の用量を達成するであろう。

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、端点を含む、１〜５００μｌの容量を含んでもよい。本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、各範囲に対し、端点を含む、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００、５０〜２５０、１００〜２５０、２００〜２５０、５０〜１５０、１〜１００、または１〜１０μｌの容量を含んでもよい。本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、１、２、５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００μｌ、またはその間の任意の数のマイクロリットルの容量を含んでもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、１００μｌを含んでもよい。

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターの全容量が、単一の注射で注射されてもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターの容量の一部が、単回注射で注射されてもよい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターの容量の第１の部分が、第１の単回注入で注射されてもよく、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターの容量の第２の部分が、第２の単回注射で注射されてもよい。

本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、眼当たり少なくとも２×１０^７、２×１０^８、５×１０^８、１．５×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、２×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、１．２×１０^１１、２×１０^１１、４．５×１０^１１、５×１０^１１、１．２×１０^１２、１．５×１０^１２、２×１０^１２、または５×１０^１２ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、眼当たり約５×１０^１０、１．５×１０^１１、５×１０^１１、または１．５×１０^１１ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約５×１０^１１ＤＲＰの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約２×１０^１０ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約５×１０^１０ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約６×１０^１０ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約１．５×１０^１１ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約２×１０^１１ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約５×１０^１１ｇｐの投薬量で投与される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターを含む組成物またはＡＡＶベクターは、網膜下注射により、眼当たり約１．５×１０^１２ｇｐの投薬量で投与される。

投薬量または容量は、硝子体の体積に基づく種間の相対成長スケーリングに基づいて計算されてもよい。本明細書で使用される「相対成長」は、体のサイズに関する生物の変化を指す。種を比較する際に考慮すべきいくつかの要因は、体の体積、表面積、代謝率、及び独特の解剖学的、生理学的、または生化学的プロセスを含む。ヒト等価用量は、体表面積、体重、または表面積及び体重の組み合わせに正規化することができる。他の要因も考慮に入れてもよい。

送達
本発明のウイルスベクターは、網膜下、直接網膜、脈絡膜上、または硝子体内注射により対象の眼に投与されてもよい。当業者は、個々の網膜下、直接網膜、または硝子体内注射に精通しており、それらを十分に実行することができるであろう。

網膜下注射は、網膜下腔、すなわち、感覚神経網膜下への注射である。網膜下注射中、注射される物質は、光受容細胞及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）層に向けられ、それらの間に空間を生じる。注射が小さな網膜切開術により行われる場合、網膜剥離が生じ得る。注入された物質により生じる網膜の剥離した隆起層は、「ブレブ」と呼ばれる。網膜下注射により生じた穴は、注射された溶液が投与後に硝子体腔に大幅に逆流しないように十分に小さくなければならない。そのような逆流は、薬品の効果が標的ゾーンから離れる方向に向かうので、薬剤が注射される時に特に問題となるであろう。好ましくは、注射は、感覚神経網膜に自己密封式の入口点を生じる。すなわち、注射針が取り外されると、注射針により生じた穴は、注射された物質が穴から放出されることがほとんどまたは実質的にないように再密封される。

このプロセスを容易にするために、専門の網膜下注射針が市販されている（例えば、ＤＯＲＣ４１Ｇテフロン（登録商標）網膜下注射針、Ｄｕｔｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢＶ、オランダ・ザイドラント）。これらは、網膜下注射を実行するために設計された針である。

あるいは、網膜下注射は、手術顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）を使用して直接視覚的ガイダンスの下でＡＡＶ粒子を含む組成物を送達することにより実施することができる。１つの例示的アプローチは、ハミルトン注射器及び３４ゲージの針（ＥＳＳ ｌａｂｓ、ＵＫ）を用いて、後極から上網膜までの強膜トンネルアプローチを使用するものである。あるいは、網膜下注射は、ＷＰＩ注射器及び斜角のついた３５Ｇ針システム（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を使用する網膜下注射の前に、３３Ｇ針による前房穿刺術を使用して実施することができる。さらなる代替物は、ＷＰＩ Ｎａｎｏｆｉｌシリンジ（ＷＰＩ、部品番号ＮＡＮＯＦＩＬ）及び３４ゲージＷＢＩ Ｎａｎｏｆｉｌ針（ＷＰＩ、部品番号ＮＦ３４ＢＬ−２）である。

本開示のベクターまたは組成物は、脈絡膜上注射を介して投与されてもよい。脈絡膜上注射の任意の手段が、本開示のベクターまたは組成物のための潜在的な送達システムとして想定される。脈絡膜上注射は、脈絡膜と強膜の間の空間である脈絡膜上腔への注射である。従って、脈絡膜上腔への注射は、網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、または黄斑などのすぐ近くの眼の構造に組成物を送達するための可能性のある投与経路である。一部の実施形態では、脈絡膜上腔への注射は、マイクロニードル、マイクロカニューレ、またはマイクロカテーテルを使用して、眼の前部で行われる。眼の前部は、眼球赤道の前の領域を含んでも、それからなってもよい。ベクター組成物またはＡＡＶウイルス粒子は、脈絡膜上経路を介して注射部位から後方に拡散し得る。一部の実施形態では、カテーテルシステムを使用して、後眼の脈絡膜上腔に直接注射される。この実施形態では、脈絡膜上腔は、毛様体扁平部の切開を介してカテーテル挿入されてもよい。一部の実施形態では、脈絡膜上経路を介した注射または注入は、脈絡膜、ブルッフ膜、及び／またはＲＰＥ層を横断して、網膜下腔に本開示のベクターまたは組成物を送達する。本開示のベクターまたは組成物が脈絡膜上経路を介して網膜下腔に送達されるものを含む一部の実施形態では、１回またはそれより多くの注射が、強膜、毛様体扁平部、脈絡膜、ブルッフ膜、及びＲＰＥ層のうちの少なくとも１つに行われる。本開示のベクターまたは組成物が、脈絡膜上経路を介して網膜下腔に送達されるものを含む一部の実施形態では、２段階手順が、本開示のベクターまたは組成物の送達前に、脈絡膜上または網膜下腔にブレブを生じさせるために使用される。

マウスに注入するこれらの実施形態では、動物は、ケタミン（４０〜８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を含有する腹腔内注射で麻酔し、トロピカミド点眼剤（散瞳薬１％、Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ、英国）及びフェニレフリン点眼薬（フェニレフリン塩酸塩２．５％、Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ、英国）で瞳孔を完全に拡大させることができる。プロキシメタカイン点眼薬（プロキシメタカイン塩酸塩０．５％、Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ、英国）も網膜下注射の前に適用することができる。注射後、白内障の形成を予防するために、クロラムフェニコール点眼薬を適用することができ（クロラムフェニコール０．５％、Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ、英国）、麻酔をアチパメゾール（２ｍｇ／ｋｇ）で元に戻し、カルボマーゲルを適用する（Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、英国）。

注射中に網膜への損傷が発生しない限り、及び十分に小さい針が使用される限り、実質的に全ての注射された物質は、局所性網膜剥離の部位の剥離した感覚神経網膜とＲＰＥの間に局在したままである（すなわち、硝子体腔に逆流しない）。実際に、短い時間枠にわたるブレブの代表的な持続性は、通常硝子体への注射た物質の流出がほとんどないことを示す。注射物質が吸収されるにつれ、ブレブは、より長い時間枠で消散し得る。

眼、特に、網膜の視覚化が、例えば、光干渉断層画像診断法を使用して、術前に行われてもよい。

本発明のＡＡＶベクターは、第１の溶液の網膜下注射により局所性網膜剥離が生じる２段階法を使用することにより、精度及び安全性が高い状態で送達され得る。第１の溶液は、ベクターを含まない。次に、第２の網膜下注射が、第１の網膜下注射により生じたブレブの網膜下液に、ベクターを含む薬品を送達するために使用される。薬品を送達する注射が、網膜を剥離するために使用されないので、特定量の溶液が、この第２のステップで注射されてもよい。本発明のＡＡＶベクターは、（ａ）網膜下ブレブを形成するために、網膜を少なくとも部分的に剥離するのに有効な量の網膜下注射により、対象に溶液を投与すること（溶液はベクターを含まない）、及び（ｂ）ステップ（ａ）で形成されたブレブへの網膜下注射により、薬品組成物を投与すること（薬品はベクターを含む）、により送達されてもよい。

実施例１：ＣＡＧプロモーターを使用したＨＥＫ２９３細胞のベストロフィン−１タンパク質
ＷＰＲＥを用いて（ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ、図３）及びＷＰＲＥを用いずに（ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ）Ｂｅｓｔ１発現を引き起こすＣＡＧプロモーターを含有するＡＡＶ２／２ベクターで、ＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、ベストロフィン−１タンパク質の発現及び局在を試験した。図６では、形質導入されたＨＥＫ２９３細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ及び抗ヒトベストロフィン−１（ｈＢＥＳＴ１またはｈｕＢＥＳＴ１）抗体で染色した。ベストロフィン−１タンパク質は、形質導入されていない対照細胞と比較した場合、サイトゾル全体に見られた。

ウェスタンブロットから、ＨＥＫ２９３細胞におけるベストロフィン−１の発現を定量した（図７）。図７Ａでは、試料１は、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ｈＢＥＳＴ１．ｐＡベクターであり、試料２は、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ｈＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡベクターであり、試料３は、陰性対照であった。プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、陽性対照として使用した。図７Ｂでは、定量化により、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ（ｎ＝９）が、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ（ｎ＝９）よりもベストロフィン−１発現の約４倍の増加を示し（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡで、ｐ＜０．０１）、形質導入されていない対照細胞（ｎ＝８）に対して統計的に有意な増加が見られた（ｐ＜０．００１）ことが示された。ベストロフィン−１発現が、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ細胞で見られたが、これは、形質導入されていない細胞では統計的に有意ではなかった。エラーバー＝±ＳＥＭ、^＊＊＊は、形質導入されていない対照と比較した場合、ｐ＜０．００１を示す。

ベストロフィン−１を発現するＨＥＫ２９３細胞をさらに、全細胞パッチクランプ記録でアッセイした。図８Ａは、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ｐＡ、ＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ、及びＡＡＶ２／２ ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞ならびに形質導入されていない対照の電流（Ｉ）／電圧（Ｖ）プロットを示す。図８Ｂは、電流波形を示し、弦コンダクタンスが、図９に示される。

実施例２：ＶＭＤ２プロモーターを使用した培養ＡＲＰＥ１９細胞におけるベストロフィン−１タンパク質
適切に分化しＡＲＰＥ１９は、天然の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞と同様の遺伝子発現プロファイルを有することが知られており、遺伝子発現を試験するために天然のＲＰＥ細胞の代替として使用することができる。ＲＰＥ細胞においてＢＥＳＴ１発現を引き起こすＶＭＤ２及びＣＡＧプロモーターの能力を試験するために、及びＶＭＤ２プロモーター由来の発現へのイントロン−エクソン（ＩｎｔＥｘ）配列の効果を試験するために、分化ＡＲＰＥ１９細胞を使用した。

ＡＲＰＥ１９細胞をトランスフェクトし、図１０Ｂに概説されるプロトコールを使用してＢＥＳＴ１発現についてアッセイした。９６ウェルプレート中、３７℃及び５％のＣＯ_２で１〜４ヶ月、１％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充された分化培地（４．５ｇ／ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）中で、ＡＲＰＥ１９細胞を成長させた。次に、分化ＡＲＰＥ１９細胞を、１ウェル当たり各プラスミドのコピー数が３．８×１０^１０のｐＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ（ＣＡＧプロモーター）、ｐＶＭＤ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ（ＶＭＤ２プロモーター）、またはｐＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ（ＶＭＤ２プロモーター及びイントロン−エクソン構築物）のいずれかでトランスフェクトした。ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１試薬単独で処理された細胞及びトランスフェクション試薬またはプラスミドなしの細胞は、陰性対照としての役割を果たした。次に、細胞を３７℃で２日間培養した後、固定し、抗ｈＢｅｓｔ１及び抗ＺＯ１（ＺＯ−１、または閉鎖帯−１、または密着結合タンパク質１、細胞間密着結合の細胞質膜表面に位置するタンパク質とも呼ばれる）で染色した。図１１〜１３は、ＢＥＳＴ１をコードする３つのベクターでトランスフェクトされた分化ＡＲＰＥ１９細胞及びトランスフェクトされていない対照におけるＢＥＳＴ１発現を示す。

トランスフェクション前の１ヶ月間に分化したＡＲＰＥ１９細胞では、トランスフェクトされていない細胞は、発現を示さなかった。対照的に、ｐＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ及びｐＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥの両方は、分化ＡＲＰＥ１９細胞においてＢＥＳＴ１タンパク質発現を引き起こすことができた（図１１Ａを参照し、１行目、２行目、及び４行目を対比のこと）。ｐＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ（エクソン−イントロンなし）も、１ヶ月の分化ＡＲＰＥ１９細胞においてＢＥＳＴ１発現を引き起こすことができた（図１１Ｂ）が、この構築物は、イントロン−エクソン配列（ｐＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ）を含む構築物よりも低いレベルでＢＥＳＴ１を発現するようであった。３ヶ月間分化したＡＲＰＥ１９細胞において、同様の結果が得られた。ｐＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、ｐＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ及びｐＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥは全て、ＢＥＳＴ１タンパク質の発現を引き起こすことができたが、ＣＡＧプロモーターを用いる発現は、ＶＭＤ２プロモーターよりも高く、ＶＭＤ２を用いると、イントロン−エクソン配列は、発現を改善する（図１２Ａの１行目のトランスフェクトされていない対照を図１２Ｂと対比のこと）。

ＡＲＰＥ１９細胞に形質導入し、図１０に概説されるプロトコールを使用してＢＥＳＴ１発現をアッセイした。形質導入前に、分化したＡＲＰＥ１９細胞を４００ｎＭのドキソルビシンで前処理した。この薬物は、いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてＡＡＶ２形質導入効率を改善することが証明されている。処理の４時間後、細胞に種々の感染多重度（ＭＯＩ）で種々のウイルス構築物を形質導入した。

４ヶ月間分化し、４００ｎＭのドキソルビシンで前処理され、且つ２、４及び８×１０^４ｇｐ／細胞で、ＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ及びＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥで形質導入されたＡＲＰＥ１９細胞は、形質導入の１０日後、ドキソルビシンでの前処理なしの形質導入細胞と比較して、より高いＧＦＰ蛍光を示した（図１３Ａ）ＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ及びＢ）ＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥの各パネルの上及び下の行を対比のこと）。ＧＦＰ蛍光は、陰性対照として使用された形質導入されていない細胞では検出されなかった（図１３Ａ及びＢの第１の列）。

４ヶ月間分化し、４００ｎＭのドキソルビシンで前処理され、且つ１及び４×１０^４ｇｐ／細胞で、ＡＡＶ２／２．ＣＡＧ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ及びＡＡＶ２／２．ＶＭＤ２．ＩｎＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥで形質導入されたＡＲＰＥ１９細胞では、ＢＥＳＴ１発現は、形質導入の１０日後、形質導入されていない対照（１行目、図１４）と比較した抗ｈＢＥＳＴ１を用いる免疫染色により検出することができた（赤、図１４の３列目、２行目〜５行目）。

実施例３：マウスでの４／８週間のｉｎ ｖｉｖｏパイロット研究
ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ構築物がＢＥＳＴ１の発現を引き起こす能力をｉｎ ｖｉｖｏでアッセイした。４／８週間のｉｎ ｖｉｖｏパイロット研究のプロトコールを図１５に示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり６匹）に、シャム注射、ＡＡＶ２／２ ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ、またはＡＡＶ２／２ ＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶウイルス粒子のいずれかを両側に注射した。３４ゲージＮａｎｏｆｉｌ針（ＷＰＩ番号ＮＦ３４ＢＬ−２）を用いて、１μＬのＡＡＶ溶液を１×１０^９ＧＣ／μＬ／眼で網膜下に注射した。光干渉断層画像診断法を使用して、４週及び８週に眼を撮像して、網膜の菲薄化（毒性）を評価し、３匹の動物を各時点で死亡させて、免疫組織化学及びウェスタンブロットによりＢＥＳＴ１タンパク質発現をアッセイした。

４週及び８週のＯＣＴイメージングにより、シャム処理と比較した場合、ＶＭＤ２構築物のいずれもが、光受容体毒性を示さなかったことが示された（図１６〜１８）。

４週及び８週の両方の時点で、３匹の動物を死亡させ、さらにＢＥＳＴ１タンパク質発現をウェスタンブロット（図２１）及び免疫組織化学（図１９）により特徴づけた。図１９は、注射の４週後の眼の免疫組織化学の結果を示し、図２０は、注射の８週後間の眼の免疫組織化学の結果を示す。光受容細胞及びＤＡＰＩを示す抗ＢＥＳＴ１（緑）及び抗ロドプシン（赤）で眼を染色した（図１９及び２０）。ＢＥＳＴ１タンパク質発現は、ＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ及びＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡから観察された。ＶＭＤ２プロモーターは、ＲＰＥ層及び光受容体外層の結合に局在するＢＥＳＴ１発現を引き起こした。４週間注射した眼由来の解剖されたＲＰＥ／脈絡膜複合組織のウェスタンブロットは、タンパク質発現を示す（図２１）。

実施例４：マウスにおける４／１３週間のｉｎ ｖｉｖｏ概念実証試験
さらなる４週及び１３週のｉｎ ｖｉｖｏ概念実証（ＰｏＣ）試験をマウスで実施して、パイロット試験の結果を確認し、ＡＡＶウイルス粒子投薬量の効果をアッセイし、ＡＡＶ注射後の後の時点で効果を調査した。４／１３週間の概念実証試験のプロトコールの概要が図２２にされる。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１コホート当たり１２匹）が１×１０^８ＧＣ／μＬ／眼もしくは１×１０^９ＧＣ／μＬ／眼のうちのいずれかのＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥもしくはＶＭＤ２．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ．ｐＡ ＡＡＶ粒子、またはシャム注射を両側に注射した。３４ゲージＮａｎｏｆｉｌ針（ＷＰＩ番号ＮＦ３４ＢＬ−２）を用いて、１μＬのＡＡＶ溶液を網膜下に注射した。注射の４週後及び１３週後に、眼をＯＣＴで撮像した。注射の４週間後に４匹のマウスを死亡させ、注射の１３週間後に、残りの８匹を死亡させ、ＢＥＳＴ１発現を免疫組織化学及びウェスタンブロットにより特徴づけた。

４週間及び１３週間のＯＣＴ撮像により、高用量（１×１０^９ＧＣ／眼）または低用量（１×１０^８ＧＣ／眼）のいずれかのＶＭＤ２構築物（イントロン−エクソン配列を含むかまたは含まない）のいずれもが、シャム対照と比較した場合の網膜の菲薄化により明らかなような毒性を示さなかったことが示された（図２３）。抗ＢＥＳＴ１（図２４のｈｕＢＥＳＴ１）及び抗ロドプシンを用いる染色により、ＶＭＤ２がＢＥＳＴ１をＲＰＥ層に局在化させ、ＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥが注射された眼において、より多くのＢＥＳＴ１発現の傾向があったことが示された。４週間注射された眼（４）由来のプールされた解剖されたＲＰＥ／脈絡膜複合体組織のウェスタンブロットは、タンパク質発現を示す（図２５Ｂ）。

実施例５：マウスにおける優良試験所基準（ＧＬＰ）毒性評価試験
長期間にわたるＢＥＳＴ１ ＡＡＶの安全性及び発現が、マウスにおける優良試験所基準（ＧＬＰ）毒性試験で、マウスにおいて確認される。研究の概要が図２７に示される。８匹のオス及び８匹のメスのマウスのコホートに、低用量（５．０×１０^８ＧＣ／眼）、中用量（１．５×１０^９ＧＣ／眼）、または高用量（５．０×１０^９ＧＣ／眼）のＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ粒子が網膜下に且つ両側で注射される。相対成長量スケーリングを使用すると、マウスの高用量は、ヒトにおける５×１０^１２ＧＣ／ｍＬ／眼の１００μＬの用量に相当する。マウスは、４週間及び２６週間で、評価され、死亡させる。眼は、眼科検査、眼圧（ＩＯＰ）を測定するための眼圧測定、網膜の厚さのためのＯＣＴ（投与前、ならびに４週間及び１３週間の終わり）で評価される。死亡させた後に、死体解剖により、臓器の重量が評価され、左目、脳、心臓、骨格筋、肺、肝臓、腎臓、精巣、及び卵巣などの組織がｑＰＣＲのために収集される。組織病理学的評価を実施し、組織は、さらなる免疫組織化学のために、例えば、ホルマリン中に貯蔵することにより、保存される。あるいは、またはさらに、４匹のマウスの群に、ＶＭＤ２．ＩｎｔＥｘ．ＢＥＳＴ１．ＷＰＲＥ ＡＡＶ粒子の２×１０^９ＧＣ／眼及び５×１０^９ＧＣ／眼の投薬量が注射され、４週間で、より大きな毒性試験のために、プロトコールを最適化するために評価される（概要については図２８を参照のこと）。

参照による組み込み
相互参照または関連特許または出願を含む、本明細書で引用される全ての文書は、明示的に除外または別途制限されない限り、全体が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文献の引用も、それが、本明細書で開示もしくは特許請求されるいかなる発明に対する先行技術であること、または、単独で、もしくは任意の他の参考文献（複数可）との任意の組み合わせで、そのような任意の発明を教示、示唆、もしくは開示することを認めるものではない。さらに、この文書における用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれる文書における同じ用語の意味または定義と矛盾する限りにおいて、この文書においてその用語に与えられた意味または定義が適用されるものとする。

他の実施形態
本開示の特定の実施形態が例示及び説明されているが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の種々の変更及び修正を行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を含む。

Claims (85)

1. 組成物であって、
   （ａ）卵黄様黄斑ジストロフィー−２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする配列、及び
   （ｂ）ベストロフィン−１（ＢＥＳＴ１）タンパク質をコードする配列
   を含む核酸配列を含む、前記組成物。
2. 前記ＶＭＤ２プロモーターをコードする前記配列が、ヒトＶＭＤ２プロモーターをコードする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする前記配列が、ヒトＢＥＳＴ１タンパク質をコードする、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする前記配列が、コード配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記ＢＥＳＴ１タンパク質をコードする前記配列が、ｃＤＮＡ配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記核酸配列がさらに、
   （ｃ）転写後調節エレメント（ＰＲＥ）をコードする配列
   を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 前記ＰＲＥをコードする前記配列が、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）から単離または誘導された配列を含む、請求項７に記載の組成物。
8. 前記核酸配列がさらに、
   （ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルをコードする配列
   を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記核酸配列がさらに、
   （ｅ）５’非翻訳領域をコードする配列
   を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記核酸配列がさらに、
    （ｆ）イントロンをコードする配列、及び
    （ｇ）エクソンをコードする配列
    を含み、
    前記イントロンをコードする前記配列及び前記エクソンをコードする前記配列が、作動可能に連結されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記イントロンをコードする前記配列が、前記ＶＭＤ２プロモーターをコードする前記配列と前記エクソンをコードする前記配列の間に配置され、
    前記エクソンをコードする前記配列が、前記イントロンをコードする前記配列と前記５’ＵＴＲをコードする前記配列の間に配置され、
    前記イントロンをコードする前記配列が、哺乳動物細胞によりスプライスされる、請求項９または１０に記載の組成物。
12. 前記５’ＵＴＲをコードする前記配列が、コザック配列またはその一部をコードする配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
13. コザック配列をコードする前記配列が、ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧの核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１２に記載の組成物。
14. コザック配列をコードする前記配列が、ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡの核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１２に記載の組成物。
15. 前記ヒトＶＭＤ２プロモーターをコードする前記配列が、
    

    

    を含むか、またはそれからなる、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
16. 前記ヒトＢＥＳＴ１タンパク質をコードする前記配列が、
    

    

    を含むか、またはそれからなる、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 前記ポリＡシグナルをコードする前記配列が、哺乳動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. 前記ポリＡシグナルをコードする前記配列が、哺乳動物ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子から単離または誘導された配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記エクソンをコードする前記配列が、哺乳動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
20. 前記エクソンをコードする前記配列が、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）ベータグロビン遺伝子から単離または誘導された配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記イントロンをコードする前記配列が、天然に存在しない配列を含む、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 前記イントロンをコードする前記配列が、融合配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記イントロンをコードする前記配列が、
    スプライス供与部位をコードする配列、ならびに
    スプライス分岐点及び受容部位をコードする配列
    を含む、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記スプライス供与部位をコードする前記配列が、脊椎動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記スプライス供与部位をコードする前記配列が、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ベータアクチン遺伝子（ＣＢＡ）から単離または誘導された配列を含む、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記スプライス分岐点及び受容部位をコードする前記配列が、脊椎動物遺伝子から単離または誘導された配列を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
27. 前記スプライス分岐点及び受容部位をコードする前記配列が、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）ベータグロビン遺伝子から単離または誘導された配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
28. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物を含む、ベクター。
29. 前記ベクターが、プラスミドである、請求項２８に記載のベクター。
30. 請求項２８または２９のベクターを含む、送達ベクター。
31. 前記送達ベクターが、ウイルス送達ベクターである、請求項３０に記載の送達ベクター。
32. 前記送達ベクターが、一本鎖ウイルスゲノムを含む、請求項３１に記載の送達ベクター。
33. 前記送達ベクターが、二本鎖ウイルスゲノムを含む、請求項３１に記載の送達ベクター。
34. 前記送達ベクターが、ＲＮＡ分子を含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の送達ベクター。
35. 前記送達ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターから単離または誘導された配列を含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の送達ベクター。
36. 前記送達ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそれらの任意の組み合わせのＡＡＶベクターから単離または誘導された配列を含む、請求項３５に記載の送達ベクター。
37. 前記送達ベクターが、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導された配列を含む、請求項３５に記載の送達ベクター。
38. 前記送達ベクターが、血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導された配列を含む、請求項３５に記載の送達ベクター。
39. 前記送達ベクターが、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導された第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導されたウイルス遺伝子をコードする配列を含む、請求項３７または３８に記載の送達ベクター。
40. 前記送達ベクターが、血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導された第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導されたウイルス遺伝子をコードする配列を含む、請求項３７または３８に記載の送達ベクター。
41. 前記送達ベクターが、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶベクターから単離または誘導された第１の末端逆位反復（ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型ＡＡＶ８のＡＡＶベクターから単離または誘導されたウイルス遺伝子をコードする配列を含む、請求項３７または３８に記載の送達ベクター。
42. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
43. 請求項２８または２９に記載のベクター及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
44. 請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の送達ベクター及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
45. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物を含む、細胞。
46. 請求項２８または２９に記載のベクターを含む、細胞。
47. 請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の送達ベクターを含む、細胞。
48. 請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、細胞。
49. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の細胞。
50. 前記哺乳動物細胞が、非ヒト霊長類細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である、請求項４９に記載の細胞。
51. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の細胞。
52. 前記ヒト細胞が、前記網膜色素上皮（ＲＰＥ）の神経細胞、グリア細胞、網膜細胞、光受容細胞、桿体細胞、錐体細胞、または立方細胞である、請求項５１に記載の細胞。
53. 前記ヒト細胞が、光受容細胞である、請求項５１に記載の細胞。
54. 前記ヒト細胞が、ＨＥＫ２９３細胞またはＡＲＰＥ１９細胞である、請求項５１に記載の細胞。
55. 前記ヒト細胞が、ヒト網膜のＲＰＥから単離または誘導された、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の細胞。
56. 前記細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕである、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の細胞。
57. 黄斑ジストロフィーを処置することを、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１〜２７または４２〜４４のいずれか１項の組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
58. 黄斑ジストロフィーを処置することを、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項２８または２９のベクターを含む組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
59. 黄斑ジストロフィーを処置することを、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の送達ベクターを含む組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
60. 前記対象が、ヒトである、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
61. 前記対象が、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物、マウス、ラット、またはウサギである、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
62. 前記対象が、黄斑ジストロフィーを有する、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
63. 前記対象が、ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のコピーに変異を有する、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
64. 前記変異が、優性変異として遺伝性である、請求項６３に記載の方法。
65. 前記優性変異が、前記対象においてベストの卵黄様黄斑ジストロフィー（ＢＶＭＤ）を引き起こす、請求項６４に記載の方法。
66. 前記変異が、劣性変異として遺伝性である、請求項６３に記載の方法。
67. 前記劣性変異が、前記対象において常染色体劣性ベストロフィノパチー（ＡＲＢ）を引き起こす、請求項６６に記載の方法。
68. 前記変異が、ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のコピーのコード配列に生じる、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
69. 前記変異が、ＢＥＳＴ１遺伝子の一方または両方のコピーの非コード配列に生じる、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
70. 投与が、網膜下、脈絡膜上、または硝子体内経路を介した注射または注入を含む、請求項５７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
71. 投与が、網膜下経路を介した注射または注入を含む、請求項５７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
72. 投与が、網膜下経路を介した２段階注射または２段階注入を含む、請求項７１に記載の方法。
73. 前記治療的有効量が、端点を含む、１０〜２００μＬの容量で製剤化される、請求項５７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
74. 前記治療的有効量が、各範囲に対し、端点を含む、１０〜５０μＬ、５０〜１００μＬ、１００〜１５０μＬ、または１５０〜２００μＬの容量で製剤化される、請求項７３に記載の方法。
75. 前記治療的有効量が、端点を含む、７０〜１２０μＬの容量で製剤化され、前記投与が、網膜下経路を介した注射または注入を含む、請求項５７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
76. 前記治療的有効量が、１００μＬの容量で製剤化され、前記投与が、網膜下経路を介した注射または注入を含む、請求項５７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
77. 前記治療的有効量が、少なくとも１×１０^１０ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１１ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも１×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも２×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも５×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、または少なくとも１．５×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬの濃度のＡＡＶ送達ベクターを含む、請求項５９〜７６のいずれか１項に記載の方法。
78. 前記治療的有効量が、少なくとも２×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬ、少なくとも５×１０^１２ＤＲＰ／ｍｌ、または少なくとも１．５×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬの濃度のＡＡＶ送達ベクターを含む、請求項５９〜７６のいずれか１項に記載の方法。
79. 前記治療的有効量が、少なくとも５×１０^１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度のＡＡＶ送達ベクターを含む、請求項５９〜７６のいずれか１項に記載の方法。
80. 前記治療的有効量が、少なくとも１．５×１０^１３ＤＲＰ／ｍＬの濃度のＡＡＶ送達ベクターを含む、請求項５９〜７６のいずれか１項に記載の方法。
81. 前記治療的有効量が、２×１０^８ゲノム粒子（ｇｐ）、５×１０^８ｇｐ、１．５×１０^９ｇｐ、２×１０^９ｇｐ、５×１０^９ｇｐ、２×１０^１０ｇｐ、５×１０^１０ｇｐ、６×１０^１０ｇｐ、１．２×１０^１１ｇｐ、１．５×１０^１１ｇｐ、２×１０^１１ｇｐ、４．５×１０^１１ｇｐ、５×１０^１１ｇｐ、１．２×１０^１２ｇｐ、１．５×１０^１２ｇｐ、２×１０^１２ｇｐ、または５×１０^１２ｇｐの用量を含む、請求項５９〜８０のいずれか１項に記載の方法。
82. 前記対象が、マウスであり、前記治療的有効量が、５×１０^８ｇｐ、１．５×１０^９ｇｐ、または５×１０^９ｇｐの用量を含む、請求項５９〜８０のいずれか１項に記載の方法。
83. 前記対象が、非ヒト霊長類であり、前記治療的有効量が、ＡＡＶウイルス粒子の１．２×１０^１１ｇｐ、４．５×１０^１１ｇｐ、または１．２×１０^１２ｇｐの用量を含む、請求項５９〜８０のいずれか１項に記載の方法。
84. 前記対象が、ヒトであり、前記治療的有効量が、ＡＡＶウイルス粒子の５×１０^１０ｇｐ、１．５×１０^１１ｇｐ、５×１０^１１ｇｐ、または１．５×１０^１２ｇｐの用量を含む、請求項５９〜８０のいずれか１項に記載の方法。
85. 前記組成物がさらに、ＴＭＮ２００緩衝液を含む、請求項５７〜８４のいずれか１項に記載の方法。

Images