BR112020020204A2

BR112020020204A2 - Composições e métodos para tratamento da distrofia macular

Info

Publication number: BR112020020204A2
Application number: BR112020020204-5A
Authority: BR
Inventors: Cristina Martinez-Fernandez De La Camara; Robert Maclaren; Gregory S. Robinson
Original assignee: Oxford University Innovation Limited; Nightstarx Limited
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2021-01-19
Also published as: PH12020551641A1; US20190307900A1; JP2021520232A; TW202003052A; CA3096088A1; PE20210918A1; CN113056561A; CO2020013690A2; SG11202009759SA; CL2020002561A1; MX2020010477A; KR20210005040A; EA202092069A1; IL277779A; US20230149566A1; EP3775233A1; AU2019247864A1; MA52199A; RU2020132890A; JOP20200253A1

Abstract

composições e métodos para tratamento da distrofia macular. a presente invenção refere-se a uma composição que com-preende uma sequência de ácido nucleico compreendendo (a) uma sequência que codifica um promotor da distrofia macular viteliforme-2 (vmd2) e (b) uma sequência que codifica uma proteína bestrofina-1 (best1), bem como o uso dessas composições para o tratamento da distrofia macular em um sujeito, compreendendo a administração da composição ao olho de um sujeito por uma via sub-retiniana ou supracoroidal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM-

POSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DA DISTROFIA MACULAR". PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório USSN 62/653,131, depositado em 5 de abril de 2018, cujo conteúdo é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O conteúdo do arquivo de texto denominado "NIGH- 011/002WO0 SegqList.txt", que foi criado em 4 de abril de 2019 e tem 72 KB de tamanho, é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[0003] A invenção refere-se aos campos da biologia molecular, neurobiologia e tratamentos de terapia gênica para doenças oculares degenerativas.

FUNDAMENTOS

[0004] A degeneração macular é uma condição médica que pode resultar em visão turva ou falta de visão no centro do campo visual. Na degeneração macular, os fotorreceptores na parte da retina chamada mácula, que é responsável pela visão central, degeneram ou morrem. Em alguns casos, a degeneração macular é causada por mutações no gene Bestrofina-1 (BEST1, também chamado de VMD?2). Atualmente, não há tratamento para esta doença devastadora. Existe, portanto, há muito tempo, uma necessidade na técnica de abordagens terapêuticas adicionais para tratar a degeneração macular. A divulgação fornece composições e métodos de tratamento para degeneração macular.

SUMÁRIO

[0005] A divulgação fornece uma composição que compreende uma sequência de ácido nucleico compreendendo: (a) uma sequência que codifica um promotor da distrofia macular viteliforme-2 (VMD2) e (b) uma sequência que codifica uma proteína Bestrofina-1 (BEST1). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o promotor VMD2 codifica um promotor VMD2 humano. Em algumas modalidades, a se- quência que codifica a proteína BEST1 codifica uma proteína BEST1 humana. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a proteí- na BEST1 compreende uma sequência de codificação. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a proteína BEST1 compreende uma sequência de cDNA.

[0006] A divulgação fornece uma composição que compreende uma sequência de ácido nucleico compreendendo: (a) uma sequência que codifica um promotor ubíquo e (b) uma sequência que codifica uma proteína Bestrofina-1 (BEST1). Em algumas modalidades, a se- quência que codifica a proteína BEST1 codifica uma proteína BEST1 humana. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a proteí- na BEST1 compreende uma sequência de codificação. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a proteína BEST1 compreende uma sequência de cDNA. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um promotor ubíquo compreende uma sequência que codifica um promotor CAG.

[0007] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequência de ácido nucleico compreende ainda: (c) uma sequência que codifica um elemento regulador pós-transcricional (PRE). Em al- gumas modalidades, a sequência que codifica o PRE compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o PRE compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o PRE compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência viral. Em algumas modalidades, a sequência que codi-

fica o PRE compreende uma sequência isolada ou derivada de um ví- rus da hepatite da marmota (WPRE).

[0008] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequência de ácido nucleico compreende ainda: (d) uma sequência que codifica um sinal de poliadenilação (poliA). Em algumas modalida- des, a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma se- quência isolada ou derivada de uma sequência de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência isolada ou deri- vada de uma sequência de mamífero. Em algumas modalidades, a se- quência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência iso- lada ou derivada de uma sequência humana. Em algumas modalida- des, a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma se- quência isolada ou derivada de um gene do Hormônio de Crescimento Bovino (BGH) de mamífero.

[0009] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequência de ácido nucleico compreende ainda: (e) uma sequência que codifica uma região não traduzida (UTR) 5'. Em algumas modali- dades, a sequência que codifica a UTR 5' compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência de ocorrência natural. Em al- gumas modalidades, a sequência que codifica a UTR 5' compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a UTR 5' compreende uma sequência isolada ou derivada de uma se- quência de mamífero. Em algumas modalidades, a sequência que co- difica a UTR 5' compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência humana. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a UTR 5' compreende uma sequência isolada ou derivada de uma sequência viral.

Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequên- cia de ácido nucleico compreende ainda: (f) uma sequência que codifi- ca um íntron e (g) uma sequência que codifica um éxon, em que a se- quência que codifica o íntron e a sequência que codifica o éxon são operacionalmente ligadas. Em algumas modalidades, o íntron está lo- calizado entre a sequência que codifica o promotor VMD?2 e a sequên- cia que codifica o éxon, em que a sequência que codifica o éxon está localizada entre a sequência que codifica o íntron e a sequência que codifica a UTR 5', e em que a sequência que codifica o íntron é dividi- da por uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a sequên- cia que codifica o éxon compreende uma sequência isolada ou deriva- da de um gene de mamífero. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o éxon compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene da beta globina de coelho (Oryctolagus cuniculus). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o íntron compreende uma sequência de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o íntron compreende uma sequência de fusão. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o íntron compre- ende uma sequência que codifica um sítio doador de splice e uma se- quência que codifica um ponto de ramificação de splice e um sítio aceptor. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sítio doador de splice compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene de vertebrado. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sítio doador de splice compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene da beta actina (CBA) de galinha (Gallus gallus). Em algumas modalidades, a sequência que codifica o ponto de ramificação e o sítio aceptor de splice compreende uma sequência iso- lada ou derivada de um gene de vertebrado. Em algumas modalida- des, a sequência que codifica o ponto de ramificação e sítio aceptor de splice compreendem uma sequência isolada ou derivada de um gene da beta globina de coelho (Oryctolagus cuniculus).

[0010] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequência que codifica a UTR 5' compreende uma sequência que codifica uma sequência de Kozak ou uma porção da mesma. Em al- gumas modalidades, a sequência que codifica uma sequência de Ko- zak tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de ácido nu- cleico de GCCRCCATGG. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma sequência de Kozak compreende ou consiste na sequên- cia de ácido nucleico de GGCACCATGA.

[0011] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequência que codifica o promotor VMD2 humano compreendem ou consistem em 1 AATTCTGTCA TTTTACTAGG GTGATGAAAT TCCCAAGCAA CACCATCCTT TTCAGATAAG 61 GGCACTGAGG CTGAGAGAGG AGCTGAAACC TACCCGGGGT CACCACACAC AGGTGGCAAG 121 GCTGGGACCA GAAACCAGGA CTGTTGACTG CAGCCCGGTA TTCATTCTTT CCATAGCCCA 181 CAGGGCTGTC AAAGACCCCA GGGCCTAGTC AGAGGCTCCT CCTTCCTGGA GAGTTCCTGG 241 CACAGAAGTT GAAGCTCAGC ACAGCCCCCT AACCCCCAAC TCTCTCTGCA AGGCCTCAGE 301 GGTCAGAACA CTGGTGGAGC AGATCCTTTA GCCTCTGGAT TTTAGGGCCA TGGTAGAGEG 361 GGTGTTGCCC TAAMATTCCAG CCCTGGTCTC AGCCCAACAC CCTCCAAGAA GAAATTAGAG 421 GGGCCATGGC CAGGCTGTGC TAGCCGTTGC TTCTGAGCAG ATTACAAGAA GGGACTAAGA 481 CAAGGACTCC TTTGTGGAGG TCCTGGCTTA GGGAGTCAAG TGACGGCGGC TCAGCACTCA 541 CGTGGGCAGT GCCAGCCTCT AAGAGTGGGC AGGGGCACTG GCCACAGAGT CCCAGGGAGT 601 CCCACCAGCC TAGTCGCCAG ACC (SEQ ID NO: 1).

[0012] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequên- cia que codifica o promotor CAG compreende ou consiste em 1 ATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC CCCCCCeTCcE 301 CCACCCCCAA TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT GGGGGCEGEG 361 GGGGGGGEGG GGCGCGCGCC AGGCGEGECG GGGCEGEGCG AGGGGCGGGG CGEGECCAGE 421 CGGAGAGGTG CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC TTTTATGGCG 481 AGGCGGCGGC GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC GGCGGECEGG AGTCGCTGCG 541 CGCTGCCTTC GCCCCGTGCCE CCGCTCCGCCE GCCGCCTCGCE GCCGCCCGCCE CCGGCTCTGA 601 CTGACCGCGT TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC GGGCTGTAAT 661 TAGCGCTTGG TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG CCTTGAGGGG

721 CTCCGGGAGG GCCCTTTGTG CGGGGEGAGC GGCTCGGGEC TGTCCGCGEGE GGGACGGCTG 781 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGEGETT CGGCTTCTGG CGTEGTGACCG GCEGGCTCTAG 841 AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA CAGCTCCTGG GCAACGTGCT 901 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT C(SEQ ID NO: 2).

[0013] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequência que codifica a proteína BEST1 humana compreende ou consiste em 1 ATGACCATCA CTTACACAAG CCAAGTGGCT AATGCCCGCT TAGGCTCCTT CTCCCGCCTG 61 CTGCTGTGCT GGCGGGGCAG CATCTACAAG CTGCTATATG GCGAGTTCTT AATCTTCCTG 121 CTCTGCTACT ACATCATCCG CTTTATTTAT AGGCTGGCCC TCACGGAAGA ACAACAGCTG 181 ATGTTTGAGA AACTGACTCT GTATTGCGAC AGCTACATCC AGCTCATCCC CATTTCCTTC 241 GTGCTGGGCT TCTACGTGAC GCTGGTCGTG ACCCGCTGGT GGAACCAGTA CGAGAACCTG 301 CCGTGGCCCG ACCGCCTCAT GAGCCTGGTG TCGGECTTCG TCGAAGGCAA GGACGAGCAA 361 GGCCGGCTGC TGCGGCGCAC GCTCATCCGC TACGCCAACC TGGGCAACGT GCTCATCCTG 421 CGCAGCGTCA GCACCGCAGT CTACAAGCGC TTCCCCAGCG CCCAGCACCT GGTGCAAGCA 481 GGCTTTATGA CTCCGGCAGA ACACAAGCAG TTGGAGAAAC TGAGCCTACC ACACAACATG 541 TTCTGGGTGC CCTGGGTGTG GTTTGCCAAC CTGTCAATGA AGGCGTGGCT TGGAGGTCÇA 601 ATCCGGGACC CTATCCTGCT CCAGAGCCTG CTGAACGAGA TGAACACCTT GCGTACTCAG 661 TGTGGACACC TGTATGCCTA CGACTGGATT AGTATCCCAC TGGTGTATAC ACAGGTGGTG 721 ACTGTGGCGG TGTACAGCTT CTTCCTGACT TGTCTAGTTG GGCGGCAGTT TCTGAACCCA 781 GCCAAGGCCT ACCCTGGCCA TGAGCTGGAC CTCGTTGTGC CCGTCTTCAC GTTCCTGCAG 841 TTCTTCTTCT ATGTTGGCTG GCTGAAGGTG GCAGAGCAGC TCATCAACCC CTTTGGAGAG 901 GATGATGATG ATTTTGAGAC CAACTGGATT GTCGACAGGA ATTTGCAGGT GTCCCTGTTG 961 GCTGTGGATG AGATGCACCA GGACCTGCCT CGGATGGAGC CGGACATGTA CTGGAATAAG 1021 CCCGAGCCAC AGCCCCCCTA CACAGCTGCT TCCGCCCAGT TCCGTCGAGC CTCCTTTATG 1081 GGCTCCACCT TCAACATCAG CCTGAACAAA GAGGAGATGG AGTTCCAGCC CAATCAGGAG 1141 GACGAGGAGG ATGCTCACGC TGGCATCATT GGCCGCTTCC TAGGCCTGCA GTCCCATGAT 1201 CACCATCCTC CCAGGGCAAA CTCAAGGACC AAACTACTGT GGCCCAAGAG GGAATCCCTT 1261 CTCCACGAGG GCCTGCCCAA AAACCACAAG GCAGCCAAAC AGAACGTTAG GGGCCAGGAA 1321 GACAACAAGG CCTGGAAGCT TAAGGCTGTG GACGCCTTCA AGTCTGCCCC ACTGTATCAG 1381 AGGCCAGGCT ACTACAGTGC CCCACAGACG CCCCTCAGCC CCACTCCCAT GTTCTTCCCC 1441 CTAGAACCAT CAGCGCCGTC AAAGCTTCAC AGTGTCACAG GCATAGACAC CAAAGACAAA 1501 AGCTTAAAGA CTGTGAGTTC TGGGGCCAAG AAAAGTTTTG AATTGCTCTC AGAGAGCGAT 1561 GGGGCCTTGA TGGAGCACCC AGAAGTATCT CAAGTGAGGA GGAAAACTGT GGAGTTTAAC 1621 CTGACGGATA TGCCAGAGAT CCCCGAAAAT CACCTCAAAG AACCTTTGGA ACAATCACCA 1681 ACCAACATAC ACACTACACT CAMAGATCAC ATGGATCCTT ATTGGGCCTT GGAAAACAGG 1741 GATGAAGCAC ATTCCTAA (SEQ ID NO: 3).

[0014] A divulgação fornece um vetor que compreende uma com- posição da divulgação. Em algumas modalidades, o vetor é um plas- mídeo.

[0015] A divulgação fornece um vetor de entrega que compreende

7IT8 o vetor da divulgação. Em certas modalidades, o vetor de entrega é um vetor de entrega viral. Em algumas modalidades, o vetor de entre- ga compreende um genoma viral de fita simples. Em algumas modali- dades, o vetor de entrega compreende um genoma viral de fita dupla. Em algumas modalidades, o vetor de entrega compreende uma molé- cula de RNA.

[0016] A divulgação fornece um vetor de entrega que compreende o vetor da divulgação. Em algumas modalidades, o vetor de entrega compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor de vírus adeno-associado (AAV). Em algumas modalidades, o vetor de entrega compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVB, AAV9, AAV1O, AAV11 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o vetor de entrega compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAV2. Em algumas mo- dalidades, o vetor de entrega compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor de AAV do sorotipo AAV8. Em algumas modali- dades, o vetor de entrega compreende uma sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) e uma segunda ITR isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAV2 e uma se- quência que codifica um gene viral isolado ou derivado de um vetor de AAV de sorotipo AAV2. Em algumas modalidades o vetor de entrega compreende uma sequência que codifica uma primeira repetição ter- minal invertida (ITR) e uma segunda ITR isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAV8 e uma sequência que codifica um ge- ne viral isolado ou derivado de um vetor de AAV de sorotipo AAV8. Em algumas modalidades, o vetor de entrega compreende uma sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) e uma se- gunda ITR isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAV2 e uma sequência que codifica um gene viral isolado ou derivado de um vetor de AAV de sorotipo AAV8.

[0017] A divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende uma composição da divulgação e um veículo farmaceuti- camente aceitável. Em algumas modalidades, o veículo farmaceutica- mente aceitável compreende TMN200.

[0018] A divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende um vetor da divulgação um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende TMN200.

[0019] A divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende um vetor de entrega da divulgação e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o veículo farmaceu- ticamente aceitável compreende TMN200.

[0020] A divulgação fornece uma célula que compreende uma composição da divulgação. A divulgação fornece uma célula que com- preende um vetor da divulgação. A divulgação fornece uma célula que compreende um vetor de entrega da divulgação. A divulgação fornece uma célula que compreende uma composição farmacêutica da divul- gação. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula de pri- mata não humano, uma célula de roedor, uma célula de rato ou uma célula de coelho. Em algumas modalidades, a célula é uma célula hu- mana. Em algumas modalidades, a célula humana é uma célula neu- ronal, uma célula da glia, uma célula retiniana, uma célula fotorrecep- tora, uma célula tipo bastonete, uma célula tipo cone ou uma célula cuboide do epitélio pigmentar da retina (RPE). Em algumas modalida- des, a célula humana é uma célula fotorreceptora. Em algumas moda- lidades, a célula humana é uma célula HEK293 ou uma célula AR- PE19. Em algumas modalidades, a célula humana é isolada ou deri- vada de um RPE de uma retina humana. Em algumas modalidades, a célula é in vivo, in vitro, ex vivo ou in situ.

[0021] A divulgação fornece um método de tratamento da distrofia macular em um sujeito em necessidade, compreendendo a adminis- tração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da divulgação.

[0022] A divulgação fornece um método de tratamento da distrofia macular em um sujeito em necessidade, compreendendo administrar, ao sujeito, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composi- ção compreendendo o vetor da divulgação.

[0023] A divulgação fornece um método de tratamento da distrofia macular em um sujeito em necessidade, compreendendo a adminis- tração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da divulgação.

[0024] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um prima- ta não humano, um cachorro, um gato, um roedor, um camundongo, um rato ou um coelho. Em algumas modalidades, o sujeito tem distro- fia macular.

[0025] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o sujeito tem uma mutação em uma ou em ambas as cópias de um gene BEST1. Em algumas modalidades, a mutação é hereditária como uma mutação dominante. Em algumas modalidades, a mutação dominante causa a Distrofia Macular Viteliforme de Best (BVMD) no sujeito. Em algumas modalidades, a mutação é hereditária como uma mutação recessiva. Em algumas modalidades, a mutação recessiva causa Bes- trofinopatia Autossômica Recessiva (ARB) no sujeito. Em algumas modalidades, a mutação ocorre em uma sequência de codificação de uma ou ambas as cópias de um gene BEST1. Em algumas modalida- des, a mutação ocorre em uma sequência não codificante de uma ou ambas as cópias de um gene BEST1. Em algumas modalidades, a mutação compreende uma substituição, uma inserção, uma deleção, uma inversão, uma translocação, um frameshift ou uma combinação destes em uma ou em ambas as cópias de um gene BEST1.

[0026] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a administração compreende uma injeção ou uma infusão por uma via sub-retiniana, supracoroidal ou intravítrea. Em algumas modalidades, a administração compreende uma injeção ou uma infusão por via sub- retiniana. Em algumas modalidades, a administração compreende uma injeção em duas etapas ou uma infusão em duas etapas por via sub- retiniana.

[0027] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a quantidade terapeuticamente eficaz é formulada em um volume entre e 200 uL, incluindo os valores limite. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é formulada em um volume entre 10 e 50 uL, entre 50 e 100 uL, entre 100 e 150 ul ou entre 150 e 200 UL, incluindo os valores limite, para cada intervalo. Em algumas moda- lidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é formulada em um vo- lume entre 70 e 120 uL, incluindo os valores limite, e em que a admi- nistração compreende uma injeção ou uma infusão por via sub- retiniana. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é formulada em um volume de 100 yuL e em que a administração compreende uma injeção ou uma infusão por via sub-retiniana.

[0028] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma concentração de um vetor de entrega de AAV de pelo menos 1x10º*º DRP/mL, pelo me- nos 1x10** DRP/mL, pelo menos 1x10*? DRP/mL, pelo menos 2x10!? DRP/mL, pelo menos 5x10"*? DRP/mL ou pelo menos 1,5x10º*? DRP/mL. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz com- preende uma concentração de um vetor de entrega de AAV de pelo me- nos 2x10*? DRP/mL, pelo menos 5x10*? DRP/mL ou pelo menos

1,5x10*? DRP/mL. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuti- camente eficaz compreende uma concentração de um vetor de entre- ga de AAV de pelo menos 5x10º*? DRP/mL. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma concentração de um vetor de entrega de AAV de pelo menos 1,5xX10º? DRP/mL.

[0029] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma dose de 2x108 partículas de genoma (gp), 5x10º gp, 1,5x10º gp, 2x10º gp, 5x10º gp, 2x10*º gp, 5xX10*º gp, 6x10*º gp, 1,2x10* gp, 1,5xX10* gp, 2x10** gp, 4,5xX10*! gp, 5x10*! gp, 1,2x10? gp, 1,5x107? gp, 2x107? gp ou 5x10? gp. Em algumas modalidades, o sujeito é um camundongo e em que a quan- tidade terapeuticamente eficaz compreende uma dose de 5x10º gp, 1,5x10º gp ou 5x10º gp. Em algumas modalidades, o sujeito é um prima- ta não humano e em que a quantidade terapeuticamente eficaz compre- ende uma dose de 1,2x10* gp, 4,5x10*! gp ou 1,2x10"? gp de partículas virais de AAV. Em algumas modalidades, o sujeito é humano e em que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma dose de 5x10º gp, 1,5x10* gp, 5x10*! gp ou 1,5x10? gp de partículas virais de AAV.

[0030] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, a composição compreende ainda um tampão TMNZ200.

[0031] A divulgação fornece uma composição da divulgação para uso no tratamento de distrofia macular em um sujeito em necessidade.

[0032] A divulgação fornece um vetor da divulgação para uso no tratamento da distrofia macular em um sujeito em necessidade.

[0033] A divulgação fornece um vetor de entrega da divulgação para uso no tratamento de distrofia macular em um sujeito em neces- sidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0034] O arquivo de pedido ou patente contém pelo menos uma figura executada em cor. As cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com figura(s) colorida(s) serão fornecidas pelo Es- critório mediante a solicitação e pagamento da taxa necessária.

[0035] As Figuras 1A-B são um par de mapas de um plasmídeo que codifica o construto VMD2.IntEx.BEST1.WPRE.pA com ITRs de AAV?2.

[0036] As Figuras 2A-B são um par de mapas de um plasmídeo que codifica o construto VMD2.BEST1.WPRE.pA com ITRs de AAV?2.

[0037] As Figuras 3A-C são uma série de três mapas de dois plasmídeos que codificam CAG.BEST1.WPRE.pA com ITRs de AAV?2. As Figuras 3A e 3B são dois mapas de um plasmídeo CAG.BEST. WPRE.pA com um marcador selecionável AmpR. A Figura 3C é um mapa de um plasmídeo CAG.BEST.WPRE.pA com um marcador sele- cionável KanR e uma sequência stuffer.

[0038] A Figura 4 é um mapa de um plasmídeo que codifica VMD?2.GFP.WPRE.pA com ITRs de AAV?2.

[0039] A Figura 5 é um mapa de um plasmídeo que codifica VMD?2.Int.Ex.GFP.WPRE.pA com ITRs de AAV?2.

[0040] As Figuras 6A-B são, cada uma, uma série de imagens, 6 imagens e 3 imagens, respectivamente, mostrando a expressão de BEST1 em células HEK293 transduzidas com AAV.CAG.BEST1.pA, AAV.CAG.BEST1.WPRE.pA e um controle não transduzido. As células são coradas com corante azul Hoechst e anti-hBestrofina-1. A proteína bestrofina-1 está localizada em todo o citosol

[0041] As Figuras 7A-B são uma imagem de um Western Blot (7A) e um gráfico de barras (7B), respectivamente, mostrando a ex- pressão da proteína Bestrofina-1 e um controle de beta actina em célu- las HEK293 transduzidas com AAV.CAG.BEST1.pA (amostra 1) ou AAV.CAG.BEST1.WPRE.pA (amostra 2) ou um controle negativo (amostra 3). Células HEK293 transfectadas com plasmídeo foram usadas como um controle positivo. A Figura 7B mostra a quantificação da expressão da proteína Bestrofina-1 em células HEK293 transduzi- das com AAV.CAG.BEST1.pA (n = 9) ou AAV.CAG.BEST1.WPRE.pA (n = 9) ou um controle negativo não transduzido (n = 8). O eixo Y mos- tra o valor LiCor normalizado. As barras de erro são +SEM. *** indica p <0,001 quando comparado ao controle não transduzido.

[0042] As Figuras 8A-B são um gráfico único (8A) e uma série de quatro gráficos (8B), respectivamente, mostrando dados de registro de patch clamp de células inteiras das células HEK293 transduzidas com vetores AAV2/2 CAG.BEST1.pA, AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA ou AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA, bem como um controle não transduzido. Na Figura 8A, a Corrente (pA) é representada no eixo X de -140 a 500 em incrementos de 20, enquanto a Voltagem (em mV) é traçada no eixo Y de -200 a 500 em unidades de 100. Na Figura 8B, as formas de onda de corrente são mostradas. Os gráficos de corrente (|)/voltagem (V) de HEK293 transduzidos com os diferentes vetores e um controle não transduzido são mostrados, no sentido horário a partir do canto superior esquerdo: AAV2/2 CAG.BEST1.pA, AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE:pA, controle não transduzido e AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA. A barra de escala inserida (centro) mostra 250 pA no eixo Y e 100 milissegundos no eixo X.

[0043] A Figura 9A-B é um par de gráficos que mostram a condu- tância de corda de células HEK293 transduzidas com AAV2/2 CAG.BEST1.pA (n = 10), AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA (n = 10), AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA (n = 11) e um controle não transduzido (n = 10). A condutância da corda é representada no eixo Y de 0 a 10 em unidades de 2. **** indica p <0,0001, * indica p<0,05, ns significa não significativo.

[0044] As Figuras 10A-B são um par de fluxogramas que mos- tram duas modalidades de um procedimento experimental para o en- saio da expressão de BEST1 em células ARPE19 diferenciadas. A Fi-

gura 10A mostra um procedimento experimental para testar a expres- são de BEST1 em células ARPE19 diferenciadas transfectadas. A Fi- gura 10B mostra um procedimento experimental para testar a expres- são de BEST1 em células ARPE19 diferenciadas transfectadas e/ou transduzidas.

[0045] As Figuras 11A-B são uma série de 16 imagens (A) e 6 imagens (B) mostrando a imunocoloração de BEST1 e ZO-1 de células ARPE189 transfectadas que foram diferenciadas por 1 mês. (A) As |li- nhas, de cima para baixo, mostram células ARPE19 com os seguintes construtos: controle não transfectado, CAG.BEST1.WPRE, VMD?2. BEST1.WPRE e VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE. As colunas da esquerda para a direita mostram: núcleos corados comHoechst em azul, colora- ção ZO-1 em verde (ZO-1 é um marcador da superfície da membrana citoplasmática de junções intercelulares estreitas), BEST1 em verme- lho e uma imagem mesclada (Hoechst, ZO-1, BEST1). As barras de escala mostram 100 mícrons (um). (B) Mostradas na linha superior es- tão as células ARPE19 transfectadas com VMD2.BEST1.WPRE.pA. Na linha inferior são mostradas as células ARPE19 transfectadas com VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE.pA. As imagens da esquerda para a direita mostram ZO-1 (verde) e BEST1 (vermelho), e uma imagem mesclada (Hoechst, ZO-1 e BEST1). A barra de escala nas imagens mescladas indica 25 um.

[0046] As Figuras 12A-B são uma série de 16 imagens (A) e 9 imagens (B) mostrando imunocoloração BEST1 e ZO- de células AR- PE19 transfectadas que foram diferenciadas por 3 meses. (A) As |i- nhas, de cima para baixo, mostram células ARPE19 com os seguintes construtos: controle não transfectado, CAG.BEST1.WPRE, VMD?2. BEST1.WPRE e VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE. As colunas da esquerda para a direita mostram: núcleos corados com Hoechst em azul, colora- ção ZO-1 em verde, BEST1 em vermelho e uma imagem mesclada

(Hoechst, ZO-1, BEST1). As barras de escala mostram 100 mícrons (um). (B) Imagens representativas da Figura 12A em maior ampliação. As linhas de cima para baixo mostram CAG.BEST1.WPRE, VMD?2. BEST1.WPRE e VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE. As colunas da esquerda para a direita mostram a coloração de ZO-1 em verde, BEST1 em vermelho e uma imagem mesclada incluindo Hoechst em azul. A barra de escala nas imagens mescladas indica 25 um.

[0047] As Figuras 13A-B mostram duas séries de 8 imagens, ca- da uma mostrando fluorescência GFP em células ARPE19 diferencia- das por 4 meses, pré-tratadas com doxorrubicina 400 nM e transduzi- das com (Figura 13A) AAV2/2.CAG.GFP.WPRE ou (Figura 13B) AAV2/2.VMD2.InEx.GFP.WPRE em 3 multiplicidades de infecção (MOI) diferentes. As MOIs usadas foram 2, 4 e 8 x 10º partículas de genoma (gp)/célula. As barras de escala no controle negativo (células não transduzidas e não tratadas) indicam 50 um. A linha superior em cada painel indica células de controle não tratadas, a linha inferior são células pré-tratadas com doxorrubicina 400 nM.

[0048] A Figura 14 é uma série de 20 imagens que mostra a imu- nocoloração BEST1 e ZO-1 de células ARPE19 diferenciadas por 4 meses, pré-tratadas com doxorrubicina 400 nM e transduzidas com AAV2/2.CAG.BEST1.WPRE e AAV2/2.VMD?2.InEx. BEST1.WPRE em duas MOIs diferentes: 1 e 4 x 10º gp/célula. As linhas, de cima para baixo, mostram células ARPE19 com os seguintes vetores virais: con- trole não transduzido, AAV2/2.CAG.BEST1.WPRE em uma MOI de

10.000 gp/célula, AAV2/2.CAG.BEST1.WPRE em uma MOI de 40.000 gp/célula, AAV2/2.VMD2.InEx.BEST1.WPRE em uma MOI de 10.000 gp/célula e AAV2/2.VMD2.InEx.BEST1.WPRE em uma MOI de 40.000 gp/célula. As colunas da esquerda para a direita mostram: núcleos co- rados com Hoechst em azul, coloração ZO-1 em verde, BEST1 em vermelho e uma imagem mesclada (Hoechst, ZO-1, BEST1). As barras de escala mostram 50 um.

[0049] A Figura 15 é uma tabela que descreve um protocolo de estudo piloto in vivo de 4/8 semanas em camundongos.

[0050] A Figura 16 é uma série de 6 imagens de tomografia de coerência óptica (OCT) de olhos de camundongo quatro semanas após serem injetados com construtos de AAV simulados, VMD?2. BEST1.WPRE ou VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE. As colunas, da esquer- da para a direita, mostram camundongos injetados com construtos de AAV simulados, VMD2.BEST1.WPRE e VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE.

[0051] A Figura 17 é uma série de 3 imagens de OCT de olhos de camundongo quatro semanas após serem injetados com, da esquerda para a direita: construtos de AAV simulados, VMD2.BEST1.WPRE ou VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE. As estruturas morfológicas indicadas são a célula ganglionar retinal (RGC), a camada plexiforme interna (IPL), a camada nuclear interna (INL), a camada plexiforme externa (OPL), a camada nuclear externa (ONL), o epitélio pigmentado da retina (RPE). As setas azuis e vermelhas indicam a espessura da retina.

[0052] A Figura 18 é uma série de 12 imagens de OCT de olhos de camundongo quatro e oito semanas após serem injetados com construtos de AAV simulados, VMD2.BEST1.WPRE ou VMD?2.IntEx. BEST1.WPRE (colunas, da esquerda para a direita). As vistas médio sagital e descentralizadas são mostradas em linhas alternadas. As du- as filas superiores são imagens de animais em 4 semanas após a inje- ção e as duas filas inferiores são imagens de animais em 8 semanas após a injeção.

[0053] A Figura 19 é uma série de 12 imagens de microscopia flu- orescente de olhos de camundongo quatro semanas após a injeção de construtos de AAV simulados, VMD2.BEST1.WPRE ou VMD?2.IntEx. BEST1.WPRE e corados com anti BEST1 (verde), anti rodopsina (vermelho) e DAPI (azul). As linhas mostram, de cima para baixo,

olhos com injeção simulada, olhos com partículas AAV VMD2.BEST1. WPRE ou VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE. As colunas, da esquerda para a direita, mostram anti BEST1 (verde), anti rodopsina (vermelho), DAP! (azul) e uma imagem mesclada. O epitélio pigmentar da retina (RPE), fotorreceptores (PR) e células ganglionares da retina (RGC) são indi- cados na parte inferior.

[0054] A Figura 20 é uma série de 12 imagens de olhos de ca- mundongos oito semanas após a injeção com partículas de AAV, em colunas da esquerda para a direita: simulada, VMD2.BEST1.WPRE ou VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE e coradas para BEST1 (verde), rodopsina (vermelho) e DAP! (azul). As linhas, de cima para baixo, são uma ima- gem mesclada, anti-BEST1 (também chamado de huBEST1), anti- rodopsina e uma imagem de campo claro.

[0055] A Figura 21 é uma imagem de um western blot que mostra a expressão da proteína BEST1 em RPE de camundongo dissecado e complexo coroide quatro semanas após a injeção com construtos de AAV simulados, CAG.BEST1.WPRE, VMD2.BEST1.WPRE ou VMD?2. Intéx.BEST1.WPRE. A seta azul indica uma proteína bestrofina-1 hu- mana recombinante, enquanto a seta vermelha indica o tamanho su- gerido da proteína BEST1. CAG.BEST1.WPRE foi usado como um controle. CAG é um forte promotor com expressão constitutiva em cé- lulas de mamíferos. É um híbrido entre o elemento potenciador do ci- tomegalovírus (CMV), o promotor da beta actina de galinha (CBA) e o aceptor de splice do gene da beta globina de coelho.

[0056] A Figura 22 é uma tabela que descreve um protocolo de estudo de prova de conceito (PoC) de 4/13 semanas in vivo em ca- mundongos.

[0057] A Figura 23 é uma série de 20 imagens de OCT de olhos de camundongo quatro semanas e 13 semanas após a injeção com construtos de AAV simulado, VMD?2.Intéx.wBEST1.WPRE ou VMD?2.

BEST1.WPRE em duas dosagens diferentes (1x10º GC/ul/olho e 1x10º GC/uL/olho). As vistas médio sagital (linha superior) e descen- tralizadas (linha inferior) são mostradas em linhas alternadas.

[0058] A Figura 24 é uma série de 20 imagens de microscopia de olhos de camundongo quatro semanas após a injeção com construtos de AAV simulado, VMD2.IntEx.BEST1.WPRE ou VMD2.BEST1.WPRE em duas dosagens diferentes (1x10º GC/uL/olho e 1x10º GC/uL/olho) e corado com anti-BEST1 (huBEST1, verde), anti-rodopsina (verme- lho) e DAPI (azul). Também são mostradas imagens de campo claro (linha inferior). As colunas, da esquerda para a direita, mostram VMD?2. Intéx.BEST1.WPRE em 1x10º GC/uL/olho, VMD2.Intéx.BEST1.WPRE em 1x10º GC/uL/olho, VMD2.BEST1.WPRE em 1x108 GC/uL/olho e VMD?2.BEST1.WPRE a 1x10º GC/uL/olho. As linhas, de cima para bai- xo, mostram: uma imagem mesclada, anti-BEST1, anti-rodopsina e campo claro. As estruturas anatômicas indicadas na imagem superior esquerda são a camada nuclear interna (INL), a camada nuclear ex- terna (ONL), o segmento externo (OS), o epitélio pigmentar da retina (RPE) e a coroide.

[0059] As Figuras 25A-B são um par de imagens de western blots observando a expressão da proteína BEST1 em células ou RPE de camundongo injetado e complexo coroide. A Figura 25A é um western blot que mostra a expressão da proteína Bestrofina-1 e um controle de beta actina em células HEK293 e ARPE-19 transfectadas com pCAG.BEST1.WPRE, pVMD2.BEST1.WPRE e pVMD?2.InEx.BEST1. WPRE ou uma amostra não transfectada como controle negativo. À Figura 25B é um western blot que mostra a proteína BEST1 em amos- tras isoladas de RPE e coroide de camundongos injetados com uma dose alta (1x10º GC/uL/olho) ou baixa (1x108 GC/uL/olho) de partícu- las AAV VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE ou VMD2.BEST1.WPRE.

[0060] A Figura 26 é uma tabela que mostra um projeto de estudo para o ensaio da expressão de BEST1 humana por imuno-histoquií- mica e Western blot em camundongos injetados com AAV2/2.VMD?2. InEx.BEST1.WPRE.

[0061] A Figura 27 é uma tabela que mostra um protocolo para um estudo proposto de boas práticas de laboratório (BPL) para avaliar a toxicidade potencial em camundongos.

[0062] A Figura 28 é uma tabela que mostra um protocolo para a avaliação de materiais de estudo de avaliação de toxicidade em 4 se- manas.

[0063] A Figura 29 é uma tabela que mostra um protocolo para um estudo proposto de boas práticas de laboratório (BPL) para avaliar a toxicidade potencial em primatas não humanos.

[0064] A Figura 30 é uma tabela que mostra um regime de dosa- gem em camundongos, primatas não humanos e doses equivalentes humanas em partículas de genoma (gp) usando um vetor viral BEST1 AAV da divulgação. O vetor viral BEST1 AAV para as doses propostas está na concentração de 2x10"? DRP/mL e é feito de acordo com as normas de boas práticas de fabricação (GMP) atuais.

[0065] A Figura 31 é uma tabela que mostra um regime de dosa- gem e as concentrações necessárias de partículas resistentes a DNAse (DRP) e o número de partículas de genoma (gp) por dose em camundongo, primata não humano e humano de um vetor viral BEST1 AAV da divulgação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0066] A divulgação refere-se à descoberta de que, em muitos ca- sos, a degeneração macular pode ser causada por mutações ou pela função anormal da proteína Bestrofina-1 (BEST1, também conhecida como VMD?2). A mácula é uma região próxima ao centro da retina e é responsável pela visão central em cores de alta resolução. A fóvea, localizada perto do centro da mácula, contém a maior concentração de fotorreceptores de células cônicas no olho. Mutações em um gene de- nominado Bestrofina-1 (BEST1 ou BEST1 humano (hBEST1), também conhecido como VMD2) estão associadas a pelo menos cinco doen- ças degenerativas retinais distintas, chamadas de bestrinopatias. As bestrinopatias compreendem a distrofia macular viteliforme de Best (BVMD), bestrofinopatia autossômica recessiva, distrofia macular viteli- forme de início na idade adulta, vitreoretinocoroidopatia autossômica dominante e retinite pigmentosa. Essas mutações podem ser dominan- tes (por exemplo, BVMD) ou recessivas. A Distrofia Macular Vitelifor- me de Best (BVMD) e a Bestrofinopatia Autossômica Recessiva po- dem causar degeneração macular com início no final da infância ou na adolescência. No entanto, em alguns casos, a degeneração macular começa na idade adulta. No entanto, independentemente da idade de início, as bestrinopatias podem ter um efeito devastador na visão e atualmente não há tratamento eficaz conhecido. Dado o papel funda- mental que a função de BEST1 desempenha nas bestrofinopatias, uma abordagem para o tratamento da bestofinopatia é fornecer uma proteína BEST1 funcional às células afetadas do paciente. Bestrofina -1 (BEST1)

[0067] Bestrofina-1 (BEST1) é uma proteína de membrana integral encontrada principalmente no epitélio pigmentar da retina (RPE) do olho e localiza-se predominantemente na membrana plasmática baso- lateral. Acredita-se que a proteína BEST1 funcione como um canal iô- nico e um regulador da sinalização do cálcio intracelular. BEST1 hu- mana pode ser encontrada no banco de dados NCBI com os números de acesso NP 004174.1 e NM 004183.3, cujos conteúdos são incor- porados por referência em sua totalidade a este documento.

[0068] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma sequência que codifica uma proteína BEST1 da divulgação com- preende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo me-

nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a se- quência de: 1 MTITYTSQVA NARLGSFSRL LLCWRGSIYK LLYGEFLIFL LCYYIIRFIY RLALTEEQOL 61 MFEKLTLYCD SYIQLIPISF VLGFYVTLVV TRWWNQYENL PWPDRLMSLV SGFVEGKDEQ 121 GRLLRRTLIR YANLGNVLIL RSVSTAVYKR FPSAQHLVOA GFMTPAEHKO LEKLSLPHNM 181 FWVPWVWFAN LSMKAWLGGR IRDPILLOSL LNEMNTLRTO CGHLYAYDWI SIPLVYTOVV 241 TVAVYSFFLT CLVGROQFLNP AKAYPGHELD LVVPVFTFLO FFFYVGWLKV AEQLINPFGE 301 DDDDFETNWI VDRNLOVSLL AVDEMHODLP RMEPDMYWNK PEPQPPYTAA SAQFRRASFM 361 GSTFNISLNK EEMEFOQPNQE DEEDAHAGII GRFLGLOSHD HHPPRANSRT KLLWPKRESL 421 LHEGLPKNHK AAKQNVRGOE DNKAWKLKAV DAFKSAPLYQ RPGYYSAPQOT PLSPTPMFFP 481 LEPSAPSKLH SVTGIDTKDK SLKTVSSGAK KSFELLSESD GALMEHPEVS QVRRKTVEFN 541 LTDMPEIPEN HLKEPLEQSP TNIHTTLKDH MDPYWALENR DEAHS (SEQ ID NO: 4).

[0069] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma sequência que codifica uma proteína BEST1 da divulgação com- preende ou consiste na sequência de aminoácidos: 1 MTITYTSQVA NARLGSFSRL LLCWRGSIYK LLYGEFLIFL LCYYIIRFIY RLALTEEQOL 61 MFEKLTLYCD SYIQLIPISF VLGFYVTLVV TRWWNQYENL PWPDRLMSLV SGFVEGKDEQ 121 GRLLRRTLIR YANLGNVLIL RSVSTAVYKR FPSAQHLVOA GFMTPAEHKO LEKLSLPHNM 181 FWVPWVWFAN LSMKAWLGGR IRDPILLOSL LNEMNTLRTO CGHLYAYDWI SIPLVYTOVV 241 TVAVYSFFLT CLVGROQFLNP AKAYPGHELD LVVPVFTFLO FFFYVGWLKV AEQLINPFGE 301 DDDDFETNWI VDRNLOVSLL AVDEMHODLP RMEPDMYWNK PEPQPPYTAA SAQFRRASFM 361 GSTFNISLNK EEMEFOQPNQE DEEDAHAGII GRFLGLOSHD HHPPRANSRT KLLWPKRESL 421 LHEGLPKNHK AAKQNVRGOE DNKAWKLKAV DAFKSAPLYQ RPGYYSAPQOT PLSPTPMFFP 481 LEPSAPSKLH SVTGIDTKDK SLKTVSSGAK KSFELLSESD GALMEHPEVS QVRRKTVEFN 541 LTDMPEIPEN HLKEPLEQSP TNIHTTLKDH MDPYWALENR DEAHS(SEQ ID NO: 4).

[0070] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína BEST1 da divulgação compreende ou consiste em um ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pe- lo menos pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 ATGACCATCA CTTACACAAG CCAAGTGGCT AATGCCCGCT TAGGCTCCTT CTCCCGCCTG 61 CTGCTGTGCT GGCGGGGCAG CATCTACAAG CTGCTATATG GCGAGTTCTT AATCTTCCTG 121 CTCTGCTACT ACATCATCCG CTTTATTTAT AGGCTGGCCC TCACGGAAGA ACAACAGCTG 181 ATGTTTGAGA AACTGACTCT GTATTGCGAC AGCTACATCC AGCTCATCCC CATTTCCTTC 241 GTGCTGGGCT TCTACGTGAC GCTGGTCGTG ACCCGCTGGT GGAACCAGTA CGAGAACCTG 301 CCGTGGCCCG ACCGCCTCAT GAGCCTGGTG TCGGGCTTCG TCGAAGGCAA GGACGAGCAA 361 GGCCGGCTGC TGCGGCGCAC GCTCATCCGC TACGCCAACC TGGGCAACGT GCTCATCCTG

421 CGCAGCGTCA GCACCGCAGT CTACAAGCGC TTCCCCAGCG CCCAGCACCT GGTGCAAGCA 481 GGCTTTATGA CTCCGGCAGA ACACAAGCAG TTGGAGAAAC TGAGCCTACC ACACAACATG 541 TTCTGGGTGC CCTGGGTGTG GTTTGCCAAC CTGTCAATGA AGGCGTGGCT TGGAGGTCÇA 601 ATCCGGGACC CTATCCTGCT CCAGAGCCTG CTGAACGAGA TGAACACCTT GCGTACTCAG 661 TGTGGACACC TGTATGCCTA CGACTGGATT AGTATCCCAC TGGTGTATAC ACAGGTGGTG 721 ACTGTGGCGG TGTACAGCTT CTTCCTGACT TGTCTAGTTG GGCGGCAGTT TCTGAACCCA 781 GCCAAGGCCT ACCCTGGCCA TGAGCTGGAC CTCGTTGTGC CCGTCTTCAC GTTCCTGCAG 841 TTCTTCTTCT ATGTTGGCTG GCTGAAGGTG GCAGAGCAGC TCATCAACCC CTTTGGAGAG 901 GATGATGATG ATTTTGAGAC CAACTGGATT GTCGACAGGA ATTTGCAGGT GTCCCTGTTG 961 GCTGTGGATG AGATGCACCA GGACCTGCCT CGGATGGAGC CGGACATGTA CTGGAATAAG 1021 CCCGAGCCAC AGCCCCCCTA CACAGCTGCT TCCGCCCAGT TCCGTCGAGC CTCCTTTATG 1081 GGCTCCACCT TCAACATCAG CCTGAACAAA GAGGAGATGG AGTTCCAGCC CAATCAGGAG 1141 GACGAGGAGG ATGCTCACGC TGGCATCATT GGCCGCTTCC TAGGCCTGCA GTCCCATGAT 1201 CACCATCCTC CCAGGGCAAA CTCAAGGACC AAACTACTGT GGCCCAAGAG GGAATCCCTT 1261 CTCCACGAGG GCCTGCCCAA AAACCACAAG GCAGCCAAAC AGAACGTTAG GGGCCAGGAA 1321 GACAACAAGG CCTGGAAGCT TAAGGCTGTG GACGCCTTCA AGTCTGCCCC ACTGTATCAG 1381 AGGCCAGGCT ACTACAGTGC CCCACAGACG CCCCTCAGCC CCACTCCCAT GTTCTTCCCC 1441 CTAGAACCAT CAGCGCCGTC AAAGCTTCAC AGTGTCACAG GCATAGACAC CAAAGACAAA 1501 AGCTTAAAGA CTGTGAGTTC TGGGGCCAAG AAAAGTTTTG AATTGCTCTC AGAGAGCGAT 1561 GGGGCCTTGA TGGAGCACCC AGAAGTATCT CAAGTGAGGA GGAAAACTGT GGAGTTTAAC 1621 CTGACGGATA TGCCAGAGAT CCCCGAAAAT CACCTCAAAG AACCTTTGGA ACAATCACCA 1681 ACCAACATAC ACACTACACT CAMAGATCAC ATGGATCCTT ATTGGGCCTT GGAAAACAGG 1741 GATGAAGCAC ATTCCTAA (SEQ ID NO: 3).

[0071] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína BEST1 da divulgação compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de: 1 ATGACCATCA CTTACACAAG CCAAGTGGCT AATGCCCGCT TAGGCTCCTT CTCCCGCCTG 61 CTGCTGTGCT GGCGGGGCAG CATCTACAAG CTGCTATATG GCGAGTTCTT AATCTTCCTG 121 CTCTGCTACT ACATCATCCG CTTTATTTAT AGGCTGGCCC TCACGGAAGA ACAACAGCTG 181 ATGTTTGAGA AACTGACTCT GTATTGCGAC AGCTACATCC AGCTCATCCC CATTTCCTTC 241 GTGCTGGGCT TCTACGTGAC GCTGGTCGTG ACCCGCTGGT GGAACCAGTA CGAGAACCTG 301 CCGTGGCCCG ACCGCCTCAT GAGCCTGGTG TCGGECTTCG TCGAAGGCAA GGACGAGCAA 361 GGCCGGCTGC TGCGGCGCAC GCTCATCCGC TACGCCAACC TGGGCAACGT GCTCATCCTG 421 CGCAGCGTCA GCACCGCAGT CTACAAGCGC TTCCCCAGCG CCCAGCACCT GGTGCAAGCA 481 GGCTTTATGA CTCCGGCAGA ACACAAGCAG TTGGAGAAAC TGAGCCTACC ACACAACATG 541 TTCTGGGTGC CCTGGGTGTG GTTTGCCAAC CTGTCAATGA AGGCGTGGCT TGGAGGTCÇA 601 ATCCGGGACC CTATCCTGCT CCAGAGCCTG CTGAACGAGA TGAACACCTT GCGTACTCAG 661 TGTGGACACC TGTATGCCTA CGACTGGATT AGTATCCCAC TGGTGTATAC ACAGGTGGTG 721 ACTGTGGCGG TGTACAGCTT CTTCCTGACT TGTCTAGTTG GGCGGCAGTT TCTGAACCCA 781 GCCAAGGCCT ACCCTGGCCA TGAGCTGGAC CTCGTTGTGC CCGTCTTCAC GTTCCTGCAG 841 TTCTTCTTCT ATGTTGGCTG GCTGAAGGTG GCAGAGCAGC TCATCAACCC CTTTGGAGAG 901 GATGATGATG ATTTTGAGAC CAACTGGATT GTCGACAGGA ATTTGCAGGT GTCCCTGTTG

961 GCTGTGGATG AGATGCACCA GGACCTGCCT CGGATGGAGC CGGACATGTA CTGGAATAAG 1021 CCCGAGCCAC AGCCCCCCTA CACAGCTGCT TCCGCCCAGT TCCGTCGAGC CTCCTTTATG 1081 GGCTCCACCT TCAACATCAG CCTGAACAAA GAGGAGATGG AGTTCCAGCC CAATCAGGAG 1141 GACGAGGAGG ATGCTCACGC TGGCATCATT GGCCGCTTCC TAGGCCTGCA GTCCCATGAT 1201 CACCATCCTC CCAGGGCAAA CTCAAGGACC AAACTACTGT GGCCCAAGAG GGAATCCCTT 1261 CTCCACGAGG GCCTGCCCAA AAACCACAAG GCAGCCAAAC AGAACGTTAG GGGCCAGGAA 1321 GACAACAAGG CCTGGAAGCT TAAGGCTGTG GACGCCTTCA AGTCTGCCCC ACTGTATCAG 1381 AGGCCAGGCT ACTACAGTGC CCCACAGACG CCCCTCAGCC CCACTCCCAT GTTCTTCCCC 1441 CTAGAACCAT CAGCGCCGTC AAAGCTTCAC AGTGTCACAG GCATAGACAC CAAAGACAAA 1501 AGCTTAAAGA CTGTGAGTTC TGGGGCCAAG AAAAGTTTTG AATTGCTCTC AGAGAGCGAT 1561 GGGGCCTTGA TGGAGCACCC AGAAGTATCT CAAGTGAGGA GGAAAACTGT GGAGTTTAAC 1621 CTGACGGATA TGCCAGAGAT CCCCGAAAAT CACCTCAAAG AACCTTTGGA ACAATCACCA 1681 ACCAACATAC ACACTACACT CAAAGATCAC ATGGATCCTT ATTGGGCCTT GGAAAACAGG 1741 GATGAAGCAC ATTCCTAA (SEQ ID NO: 3).

[0072] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína BEST1 da divulgação compreende uma sequência otimizada por códons. Em al- gumas modalidades, a sequência foi otimizada por códons para ex- pressão em uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a se- quência foi otimizada por códons para expressão em uma célula hu- mana. Expressão de BEST1

[0073] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína BEST1 da divulgação compreende ainda uma sequência que codifica um elemen- to regulador que potencializa ou aumenta a transcrição de BEST1 ou a expressão da proteína BEST1. O elemento regulador exemplar que potencializa ou aumenta a transcrição de BEST1 ou a expressão da proteína BEST1 inclui, mas não está limitado a, um promotor, um in- tensificador, um super potencializador, um íntron, um éxon, uma com- binação de um íntron e um éxon, uma sequência que codifica uma re- gião não traduzida (por exemplo, uma região não traduzida (UTR) 5' ou uma UTR 3'), uma sequência que compreende um sinal de poliade- nilação (poliA) e um elemento regulador pós-transcricional (PRE).

[0074] Promotores exemplares da divulgação incluem, mas não estão limitados a, aqueles promotores capazes de expressar uma se- quência que codifica uma proteína BEST1 ou uma proteína BEST1 em uma célula de mamífero. Promotores exemplares da divulgação inclu- em, mas não estão limitados a, aqueles promotores capazes de ex- pressar uma sequência que codifica uma proteína BEST1 ou uma pro- teína BEST1 em uma célula humana. Em algumas modalidades, a cé- lula de mamífero ou humana pode estar in vivo, ex vivo, in vitro ou in situ. Em algumas modalidades, o promotor pode ser constitutivamente ativo. Em algumas modalidades, o promotor pode ser específico ao tipo de célula. Em algumas modalidades, o promotor pode ser indutí- vel.

[0075] Promotores constitutivamente ativos exemplares da divul- gação incluem, mas não estão limitados a, um promotor viral. Os pro- motores virais da divulgação podem incluir, mas não estão limitados a, um promotor de vírus símio 40 (SV40), um promotor de citomegaloví- rus (CMV), promotor de ubiquitina C (UBC), promotor de fator de alon- gamento-1 alfa (EFIA), um promotor de fosfoglicerato quinase 1 (PGK) e um promotor CAG (uma combinação de um (C) elemento po- tencializador precoce de citomegalovírus (CMV), (A) o promotor com- preendendo o primeiro éxon e o primeiro íntron do gene da beta actina de galinha, e (G) o aceptor de splice do gene da beta globina de coe- lho). Em algumas modalidades, um promotor CMV é usado para con- trolar a expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína BEST1 da divulgação. Em algumas modalidades, um promotor CAG é usado para controlar a expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína BEST1 da divulgação. Os promotores não virais da divulgação podem incluir, mas não estão limi- tados a, um promotor da beta actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o promotor CBA compreende a beta actina de galinha, o primeiro éxon e íntron do gene CBA. Em algumas modalidades, o promotor compreende o promotor da beta actina de galinha e os ele- mentos intensificadores precoces do citomegalovírus. Em algumas modalidades, o promotor compreende ainda uma sequência de acep- tor de splice da beta globina de coelho (o promotor CAG). Em algumas modalidades, o promotor CAG compreende ou consiste em uma se- quência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pe- lo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 ATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC ATAGTAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA 61 CGTCAATGGG TGGAGTATTT ACGGTAAACT GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT 121 ATGCCAAGTA CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC 181 CAGTACATGA CCTTATGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT AGTCATCGCT 241 ATTACCATGG TCGAGGTGAG CCCCACGTTC TGCTTCACTC TCCCCATCTC CCCCCCeTcE 301 CCACCCCCAA TTTTGTATTT ATTTATTTTT TAATTATTTT GTGCAGCGAT GGGGGCEGEG 361 GGGGGCGEGG GGCGCGCGCC AGGCGGGECG GGGCEGEGCG AGGGGCGGGGS CGEGECÇSAGE 421 CGGAGAGGTG CGGCGGCAGC CAATCAGAGC GGCGCGCTCC GAAAGTTTCC TTTTATGGCG 481 AGGCGGCGGC GGCGGCGGCC CTATAAAAAG CGAAGCGCGC GGCEGECEGS AGTCGCTGCG 541 CGCTGCCTTC GCCCCGTGCCE CCGCTCCGCCE GCCGCCETCGCE GCCGCCCGCCE CCGGCTCTGA 601 CTGACCGCGT TACTCCCACA GGTGAGCGGG CGGGACGGCC CTTCTCCTCC GGGCTGTAAT 661 TAGCGCTTGG TTTAATGACG GCTTGTTTCT TTTCTGTGGC TGCGTGAAAG CCTTGAGGGG 721 CTCCGGGAGG GCCCTTTGTG CGGEGEGAGCE GGCTCGEGEC TETCCGCEGE GEGACEGCTGE 781 CCTTCGGGGG GGACGGGGCA GGGCGEGETT CGGCTTCTGG CGTETGACCG GCEGGCTCTAG 841 AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA CAGCTCCTGG GCAACGTGCT 901 GGTTATTGTG CTGTCTCATC ATTTTGGCAA AGAATTGGAT C (SEQ ID NO: 2).

[0076] Promotores específicos do tipo de célula exemplares da divulgação incluem, mas não estão limitados a, um promotor capaz de expressar um ácido nucleico ou uma proteína em um neurônio, um promotor capaz de expressar um ácido nucleico ou uma proteína em uma célula retiniana, um promotor capaz de expressar um ácido nu- cleico ou uma proteína em um fotorreceptor, um promotor capaz de expressar um ácido nucleico ou uma proteína em uma célula tipo bas- tonete e um promotor capaz de expressar um ácido nucleico ou uma proteína em uma célula tipo cone. Em algumas modalidades, uma se- quência que codifica um promotor específico de tecido compreende uma sequência que codifica um gene VMD2 humano (também conhe-

cido como Bestrofina-1). Em algumas modalidades, um promotor es- pecífico de tecido compreende um promotor VMD2 humano (também conhecido como Bestrofina-1). Em algumas modalidades, o promotor VMD?2 humano compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 AATTCTGTCA TTTTACTAGG GTGATGAAAT TCCCAAGCAA CACCATCCTT TTCAGATAAG 61 GGCACTGAGG CTGAGAGAGG AGCTGAAACC TACCCGGGGT CACCACACAC AGGTGGCAAG 121 GCTGGGACCA GAAACCAGGA CTGTTGACTG CAGCCCGGTA TTCATTCTTT CCATAGCCCA 181 CAGGGCTGTC AAAGACCCCA GGGCCTAGTC AGAGGCTCCT CCTTCCTGGA GAGTTCCTGG 241 CACAGAAGTT GAAGCTCAGC ACAGCCCCCT AACCCCCAAC TCTCTCTGCA AGGCCTCAGE 301 GGTCAGAACA CTGGTGGAGC AGATCCTTTA GCCTCTGGAT TTTAGGGCCA TGGTAGAGEG 361 GGTGTTGCCC TAAMATTCCAG CCCTGGTCTC AGCCCAACAC CCTCCAAGAA GAAATTAGAG 421 GGGCCATGGC CAGGCTGTGC TAGCCGTTGC TTCTGAGCAG ATTACAAGAA GGGACTAAGA 481 CAAGGACTCC TTTGTGGAGG TCCTGGCTTA GGGAGTCAAG TGACGGCGGC TCAGCACTCA 541 CGTGGGCAGT GCCAGCCTCT AAGAGTGGGC AGGGGCACTG GCCACAGAGT CCCAGGGAGT 601 CCCACCAGCC TAGTCGCCAG ACC(SEQ ID NO: 1).

[0077] Em algumas modalidades, o promotor do VMD2 humano compreende ou consiste em uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 AATTCTGTCA TTTTACTAGG GTGATGAAAT TCCCAAGCAA CACCATCCTT TTCAGATAAG 61 GGCACTGAGG CTGAGAGAGG AGCTGAAACC TACCCGGGGT CACCACACAC AGGTGGCAAG 121 GCTGGGACCA GAAACCAGGA CTGTTGACTG CAGCCCGGTA TTCATTCTTT CCATAGCCCA 181 CAGGGCTGTC AAAGACCCCA GGGCCTAGTC AGAGGCTCCT CCTTCCTGGA GAGTTCCTGG 241 CACAGAAGTT GAAGCTCAGC ACAGCCCCCT AACCCCCAAC TCTCTCTGCA AGGCCTCAGE 301 GGTCAGAACA CTGGTGGAGC AGATCCTTTA GCCTCTGGAT TTTAGGGCCA TGGTAGAGEG 361 GGTGTTGCCC TAAMATTCCAG CCCTGGTCTC AGCCCAACAC CCTCCAAGAA GAAATTAGAG 421 GGGCCATGGC CAGGCTGTGC TAGCCGTTGC TTCTGAGCAG ATTACAAGAA GGGACTAAGA 481 CAAGGACTCC TTTGTGGAGG TCCTGGCTTA GGGAGTCAAG TGACGGCGGC TCAGCACTCA 541 CGTGGGCAGT GCCAGCCTCT AAGAGTGGGC AGGGGCACTG GCCACAGAGT CCCAGGGAGT 601 CCCACCAGCC TAGTCGCCAG ACC (SEQ ID NO: 1).

[0078] Em algumas modalidades das composições da divulgação, a sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica uma proteína BEST1 e uma sequência que codifica um pro- motor, compreende ainda um íntron e um éxon. A presença de um ín- tron e um éxon aumenta os níveis de expressão de proteínas. Em al-

gumas modalidades, o íntron é posicionado entre o promotor VMD2 e o éxon. Em algumas modalidades, incluindo aquelas modalidades em que o íntron está posicionado entre o promotor VMD?2 e o éxon, o éxon está posicionado a 5' da sequência de codificação BEST.

[0079] O éxon pode compreender uma sequência de codificação, uma sequência não codificante ou uma combinação de ambas. Em algumas modalidades, o éxon compreende uma sequência não codifi- cante. Em algumas modalidades, o éxon é isolado ou derivado de um gene de mamífero. Nas modalidades, o mamífero é um coelho (Oryc- tolagus cuniculus). Em algumas modalidades, o gene de mamífero compreende um gene da beta globina de coelho. Em algumas modali- dades, o éxon compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pe- lo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: CTCCTGGGCA ACGTGCTGGT TATTGTGCTG TCTCATCATT TTGGCAAAGA ATT (SEQ ID NO: 6).

[0080] Em algumas modalidades, o éxon compreende uma se- quência de ácido nucleico com 100% de identificação com a sequência de ácido nucleico de: CTCCTGGGCA ACGTGCTGGT TATTGTGCTG TCTCATCATT TTGGCAAAGA ATT (SEQ ID NO: 6).

[0081] Os íntrons podem compreender um sítio doador de splice, um sítio aceptor ou um ponto de ramificação de splice. Os íntrons po- dem compreender um sítio doador de splice, um sítio aceptor e um ponto de ramificação de splice. Sítios aceptores de splice exemplares compreendem os nucleotídeos "GT" ("GU" no pré-mRNA) na extremi- dade 5' do íntron. Sítios aceptores de splice exemplares compreendem um "AG" na extremidade 3' do íntron. Em algumas modalidades, o ponto de ramificação compreende uma adenosina (A) entre 20 e 40 nucleotídeos, incluindo os valores limite, a montante da extremidade 3' do íntron. O íntron pode ser uma sequência artificial ou de ocorrência não natural. Alternativamente, o íntron pode ser isolado ou derivado de um gene de vertebrado. O íntron pode compreender uma sequência que codifica uma fusão de duas sequências, cada uma das quais pode ser isolada ou derivada de uma pluralidade de genes de vertebrados. Em algumas modalidades, um gene de vertebrado que contribui para a sequência de ácido nucleico do íntron compreende um gene de gali- nha (Gallus gallus). Em algumas modalidades, o gene de galinha compreende o gene da beta actina de galinha. Em algumas modalida- des, um gene de vertebrado que contribui para a sequência de ácido nucleico do íntron compreende um gene de coelho (Oryctolagus cuni- culus). Em algumas modalidades, o gene de coelho compreende o ge- ne da beta globina de coelho. Em algumas modalidades, o íntron com- preende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 GTGCCGCAGG GGGACGGCTG CCTTCGGGEG GEACGGGGCA GGGCGEGETT CGGCTTCTGG 61 CGTGTGACCG GCGGCTCTAG AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA 121 CAG (SEQ ID NO: 7).

[0082] Em algumas modalidades, o íntron compreende uma se- quência de ácido nucleico com 100% de identificação com a sequência de ácido nucleico de: 1 GTGCCGCAGG GGGACGGCTG CCTTCGGGEG GGACGGGECA GGGCEGEGTT CGGCTTCTGG 61 CGTGTGACCG GCGGCTCTAG AGCCTCTGCT AACCATGTTC ATGCCTTCTT CTTTTTCCTA 121 CAG (SEQ ID NO: 7).

[0083] As sequências de Kozak são motivos de sequência curta que são reconhecidos pelo ribossomo como o sítio de início da tradu- ção. As sequências de Kozak podem ser posicionadas imediatamente a montante ou ao redor do sítio de início da tradução. Em vertebrados, a sequência de consenso de Kozak compreende uma sequência com pelo menos 50% de identidade com a sequência de consenso de gccRccATGG, em que R representa um A ou G e o ATG que codifica a metionina inicial está em negrito. Uma sequência de Kozak exemplar da divulgação compreende uma sequência de GGCACCATGA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende uma sequên- cia de ácido nucleico que codifica BEST1, compreende ainda uma se- quência que codifica uma sequência não traduzida 5' (5' UTR). Em al- gumas modalidades, a 5' UTR compreende uma sequência de Kozak. Em algumas modalidades, a 5' UTR compreende uma porção de uma sequência de Kozak. Em algumas modalidades, a 5' UTR compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% de uma sequência de Kozak.

[0084] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreen- de uma sequência de ácido nucleico que codifica BEST1 compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um elemento de resposta transcricional (PRE). PREs exemplares compreendem um PRE da marmota (WPRE), que é derivado do vírus da hepatite da marmota. Em algumas modalidades, uma sequência que codifica um WPRE é posicionada a 3' da sequência de ácido nucleico que codifica BEST1. Em algumas modalidades, uma sequência que codifica um WPRE é posicionada entre a sequência de ácido nucleico que codifica BEST1 e a sequência que codifica um sinal de poliA. Em algumas mo- dalidades, uma sequência que codifica um WPRE compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 ATCGATAATC AACCTCTGGA TTACAAAATT TGTGAAMAGAT TGACTGGTAT TCTTAACTAT 61 GTTGCTCCTT TTACGCTATG TGGATACGCT GCTTTAATGC CTTTGTATCA TGCTATTGCT 121 TCCCGTATGG CTTTCATTTT CTCCTCCTTG TATAAATCCT GGTTGCTGTC TCTTTATGAG 181 GAGTTGTGGC CCGTTGTCAG GCAACGTGGC GTGGTGTGCA CTGTGTTTGC TGACGCAACC 241 CCCACTGGTT GGGGCATTGC CACCACCTGT CAGCTCCTTT CCGGGACTTT CGCTTTCCCC 301 CTCCCTATTG CCACGGCGGA ACTCATCGCC GCCTGCCTTG CCCGCTGCTG GACAGGGGCT 361 CGGCTGTTGG GCACTGACAA TTCCGTGGTG TTGTCGGGGA AATCATCGTC CTTTCCTTGG 421 CTGCTCGCCT GTGTTGCCAC CTGGATTCTG CGCGGGACGT CCTTCTGCTA CGTCCCTTCG 481 GCCCTCAATC CAGCGGACCT TCCTTCCCGC GGCCTGCTGC CGGCTCTGCG GCCTCTTCCG

541 CGTCTTCGCC TTCGCCCTCA GACGAGTCGG ATCTCCCTTT GGGCCGCCTC CCC (SEQ ID NO: 8).

[0085] Em algumas modalidades, uma sequência que codifica um WPRE compreende uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 ATCGATAATC AACCTCTGGA TTACAAAATT TGTGAAAGAT TGACTGGTAT TCTTAACTAT 61 GTTGCTCCTT TTACGCTATG TGGATACGCT GCTTTAATGC CTTTGTATCA TGCTATTGCT 121 TCCCGTATGG CTTTCATTTT CTCCTCCTTG TATAAATCCT GGTTGCTGTC TCTTTATGAG 181 GAGTTGTGGC CCGTTGTCAG GCAACGTGGC GTGGTGTGCA CTGTGTTTGC TGACGCAACC 241 CCCACTGGTT GGGGCATTGC CACCACCTGT CAGCTCCTTT CCGGGACTTT CGCTTTCCCC 301 CTCCCTATTG CCACGGCGGA ACTCATCGCC GCCTGCCTTG CCCGCTGCTG GACAGGGGCT 361 CGGCTGTTGG GCACTGACAA TTCCGTGGTG TTGTCGGGGA AATCATCGTC CTTTCCTTGG 421 CTGCTCGCCT GTGTTGCCAC CTGGATTCTG CGCGGGACGT CCTTCTGCTA CGTCCCTTCG 481 GCCCTCAATC CAGCGGACCT TCCTTCCCGC GGCCTGCTGC CGGCTCTGCG GCCTCTTCCG 541 CGTCTTCGCC TTCGCCCTCA GACGAGTCGG ATCTCCCTTT GGGCCGCCTC CCC (SEQ ID NO: 8).

[0086] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreen- de uma sequência de ácido nucleico que codifica BEST1 compreende ainda uma sequência que codifica um sinal de poliadenilação (poliA). O sinal de poliA facilita a exportação nuclear, potencializa a tradução e aumenta a estabilidade do mMRNA. Em algumas modalidades, a se- quência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência sin- tética ou artificial. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene de mamífero. Em algumas modalidades, o gene de mamífero é um gene humano. Em algumas modalidades, o gene de mamífero é um gene do hormônio do crescimento bovino (BGH). Em algumas mo- dalidades, a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 CGCTGATCAG CCTCGACTGT GCCTTCTAGT TGCCAGCCAT CTGTTGTTTG CCCCTCCCCC 61 GTGCCTTCCT TGACCCTGGA AGGTGCCACT CCCACTGTCC TTTCCTAATA AAATGAGGAA 121 ATTGCATCGC ATTGTCTGAG TAGGTGTCAT TCTATTCTGG GGGGTGGGGT GGGGCAGGAC 181 AGCAAGGGGG AGGATTGGGA AGACAATAGC AGGCATGCTG GGGATGCGGT GGGCTCTATG 241 GCTTCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCTGGGG (SEQ ID NO: 9).

[0087] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o sinal poliA compreende uma sequência de ácido nucleico com 100% de identidade com a sequência de ácido nucleico de: 1 CGCTGATCAG CCTCGACTGT GCCTTCTAGT TGCCAGCCAT CTGTTGTTTG CCCCTCCCCC 61 GTGCCTTCCT TGACCCTGGA AGGTGCCACT CCCACTGTCC TTTCCTAATA AAATGAGGAA 121 ATTGCATCGC ATTGTCTGAG TAGGTGTCAT TCTATTCTGG GGGGTGGGET GGGGCAGGAC 181 AGCAAGGGGG AGGATTGGGA AGACAATAGC AGGCATGCTG GGGATGCGGT GGGCTCTATG 241 GCTTCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCTGGGG (SEQ ID NO: 9). Vetores AAV

[0088] Um vetor pode compreender o ácido nucleico que compre- ende uma sequência de ácido nucleico que codifica BEST1. Em algu- mas modalidades das composições da divulgação, o vetor pode ser um vetor de entrega viral. Os vetores de entrega viral da divulgação podem conter sequências necessárias para empacotar uma sequência de ácido nucleico da divulgação em um sistema de entrega viral para entrega a uma célula ou tecido alvo. Os vetores de entrega viral típicos da divulgação incluem, mas não estão limitados a, vetores lentivirais, retrovirais ou virais adeno-associados (AAV).

[0089] Um sistema de entrega viral de AAV da divulgação pode estar na forma de uma partícula ou vírion de AAV maduro, isto é, ácido nucleico rodeado por uma capsídeo de proteína de AAV. Em algumas modalidades, o vetor de entrega viral de AAV pode compreender um genoma do AAV ou um derivado do mesmo.

[0090] Um genoma do AAV é uma sequência de ácido nucleico que codifica as funções necessárias para a produção de uma partícula de AAV. Essas funções incluem aquelas que operam no ciclo de repli- cação e empacotamento do AAV em uma célula hospedeira, incluindo a encapsidação do genoma de AAV em uma partícula do AAV. Os AAVs de ocorrência natural são deficientes em replicação e dependem do fornecimento de funções auxiliares em trans para a conclusão de um ciclo de replicação e empacotamento. Em modalidades preferenci- ais, um genoma do AAV de um vetor da divulgação é deficiente em replicação.

[0091] O genoma do AAV pode estar na forma de fita simples, de sentido positivo ou negativo, ou alternativamente na forma de fita du- pla. O uso de uma forma de fita dupla permite ignorar a etapa de repli- cação do DNA na célula alvo e, assim, pode acelerar a expressão do transgene. O genoma do AAV de um vetor da divulgação pode estar na forma de fita simples.

[0092] O genoma do AAV pode ser de qualquer sorotipo derivado naturalmente, isolado ou clado de AAV. Assim, o genoma do AAV po- de ser o genoma completo de um AAV que ocorre naturalmente. Como conhecido pelos versados na técnica, os AAVs que ocorrem na natu- reza podem ser classificados de acordo com vários sistemas biológi- cos.

[0093] Os AAVs são referidos em termos de seu sorotipo. Um so- rotipo corresponde a uma subespécie variante do AAV que, devido ao seu perfil de expressão de antígenos de superfície do capsídeo, tem uma reatividade distinta que pode ser usada para distingui-la de outras subespécies variantes. Um vírus com um sorotipo do AAV específico não apresenta reação cruzada eficiente com anticorpos neutralizantes específicos para qualquer outro sorotipo do AAV. Os sorotipos do AAV incluem AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVO9, AAV1O e AAV11, e também sorotipos recombinantes, como Rec2 e Rec3, recentemente identificados no cérebro de primata. Qualquer um destes sorotipos do AAV pode ser usado na invenção. Assim, em al- gumas modalidades, um vetor do AAV da invenção pode ser derivado de um AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVO9, AAV10, AAV11, Rec2 ou Rec3 AAV.

[0094] Revisões de sorotipos de AAV podem ser encontradas em Choi et al. (2005) Cur. Gene There. 5: 299-310 e Wu et al. (2006) Mo- lecular Therapy 14: 316-27. As sequências de genomas do AAV ou de elementos de genomas do AAV incluindo sequências de ITR, genes rep ou cap podem ser derivadas dos seguintes números de acesso para se- quências de genoma completo do AAV: Vírus adeno-associado 1 NC 002077, AFO63497; Vírus adeno-associado 2 NC 001401; Vírus adeno-associado 3 NC 001729; Vírus adeno-associado 3B NC 001863; Vírus adeno-associado 4 NC 001829; Vírus adeno-associado 5 Y 18065, AFO85716; Vírus adeno-associado 6 NC 001862; AAV Aviário ATCC VR-865 AY 186198, AY629583, NC 004828; cepa de AAV Aviário DA- 1 NC 006263, AY629583; AAV Bovino NC 005889, AY388617.

[0095] AAV também pode ser referido em termos de clados ou clones. Isso se refere à relação filogenética de AAVs derivados natu- ralmente, bem como a um grupo filogenético de AAVs que pode ser rastreado até um ancestral comum e inclui todos os seus descenden- tes. Além disso, os AAVs podem ser referidos em termos de um isola- do específico, ou seja, um isolado genético de um AAV específico en- contrado na natureza. O termo isolado genético descreve uma popula- ção de AAVs que foi submetida a uma mistura genética limitada com outros AAVs de ocorrência natural, definindo assim uma população reconhecivelmente distinta em um nível genético.

[0096] O sorotipo do AAV determina a especificidade do tecido da infecção (ou tropismo) de um vírus AAV. Consequentemente, os soro- tipos do AAV preferenciais para uso em AAVs administrados a pacien- tes de acordo com a invenção são aqueles que têm tropismo natural para ou uma alta eficiência de infecção de células alvo dentro do olho. Em uma modalidade, os sorotipos de AAV para uso na invenção são aqueles que infectam células da retina neurossensorial, do epitélio pigmentar da retina e/ou da mácula.

[0097] O genoma do AAV de um sorotipo derivado naturalmente, isolado ou clado do AAV compreende pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida (ITR). Uma sequência de ITR atua em cis para fornecer uma origem funcional de replicação e permite a integra- ção e excisão do vetor do genoma de uma célula.

[0098] Um vetor de entrega viral do AAV pode incluir pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida (ITR), preferencialmente mais de uma ITR, tal como duas ITRs ou mais. Uma ou mais das ITRs podem ser derivadas de genomas de AAV com diferentes sorotipos ou podem ser uma ITR quimérica ou mutante. Uma ITR mutante prefe- rencial é aquela que tem uma deleção de um trs (sítio de resolução terminal). Essa deleção permite a replicação contínua do genoma para gerar um genoma de fita simples que contém sequências codificantes e complementares, ou seja, um genoma de AAV autocomplementar. Isso permite o desvio da replicação do DNA na célula alvo e assim, permite a expressão acelerada do transgene.

[0099] A inclusão de uma ou mais ITRs é preferencial para auxiliar a formação de concatâmero de um vetor de entrega viral da invenção no núcleo de uma célula hospedeira, por exemplo, após a conversão de DNA de vetor de fita simples em DNA de fita dupla pela ação das polimerases de DNA da célula hospedeira. A formação de tais conca- tâmeros epissomais protege o construto do vetor durante a vida da cé- lula hospedeira, permitindo assim a expressão prolongada do transge- ne in vivo.

[00100] Em algumas modalidades, os elementos de ITR são as úni- cas sequências retidas do genoma de AAV nativo no vetor de entrega viral. Assim, em algumas modalidades, um vetor de entrega viral não inclui os genes rep ou cap do genoma nativo e, além disso, não possui quaisquer outras sequências do genoma nativo. Isto é preferencial pe- las razões descritas acima e também para reduzir a possibilidade de integração do vetor no genoma da célula hospedeira. Além disso, a redução do tamanho do genoma de AAV permite maior flexibilidade na incorporação de outros elementos de sequência (como elementos re-

guladores) dentro do vetor, além do transgene. Em algumas modalida- des, o vetor de entrega viral da divulgação compreende sequências que codificam ITRs de AAV2. Em algumas modalidades, as sequên- cias que codificam as duas ITRs de AAV2 podem compreender ou consistir em uma sequência de ácido nucleico de: 1 ctgegegete getegeteac tgaggecgec cgggcaaage cegggegteg ggegacettt 61 ggtegecegg cctceagtgag cgagegageg cgcagagagg gagtggccaa ctecatceact 121 aggggttcct tgtagttaat gatt (SEQ ID NO: 10). e/ou 1 tgegegeteg ctegeteact gaggeeggge gaccaaaggt cgccegacge cegggetttg 61 ccegggegge cteagtgage gagegagege gcagagettt ttgcaaaage ctaggectec 121 aaaaaagect cceteactact tetgg (SEQ ID NO: 11).

[00101] O genoma de AAV pode compreender uma sequência de ácido nucleico de cerca de 4,7 kb de comprimento. Assim, nas modali- dades em que a sequência de ácido nucleico a ser entregue por um vetor viral de AAV tem menos de 4,7 kb de comprimento, uma se- quência stuffer ou de enchimento pode ser usada. A presença de uma sequência stuffer pode, em algumas modalidades, auxiliar no empaco- tamento do vetor viral de AAV na partícula viral. Em algumas modali- dades, a sequência stuffer compreende uma sequência aleatória. Uma sequência stuffer exemplar da divulgação pode compreender ou con- sistir na sequência de ácido nucleico de: 1 GATGTAACCA TATACTTAGG CTGGATCTTC TCCCGCGAAT TTTAACCCTC ACCAACTACG 61 AGATATGAGG TAAGCCAAAA AAGCACGTAG TGGCGCTCTC CGACTGTTCC CAAATTGTAA 121 CTTATCGTTC CGTGAAGGCC AGAGTTACTT CCCGGCCCTT TCCATGCGCG CACCATACCC 181 TCCTAGTTCC CCGGTTATCT TTCCGAAGTG GGAGTGAGCG AACCTCCGTT TACGTCTTGT 241 TACCAATGAT GTAGCTATGC ACTTTGTACA GGGTGCCAAC GGGTTTCACÇA ATTCACAGAT 301 AGTGGGGATC CCGGCAAAGG GCCTATATTT GCGGTCCAAC TTAGGCGTAA ACCTCGATGC 361 TACCTACTCA GACCCACCTC GCGCGGGGTA AATAAGGCAC TCATCCCAGC TGGTTCTTGG 421 CGTTCTACGC AGCGACATGT TTATTAACAG TTGTCTGGCA GCACAAAACT TTTACCATGG 481 TCGTAGAAGC CCCCCAGAGT TAGTTCATAC CTAATGCCAC AAATGTGAÇA GGACGCCGAT 541 GGGTACCGGA CTTTAGGTCG AGCACAGTTC GGTAACGGAG AGACCCTGCG GCGTACTTCA 601 TTATGTATAT GGAACGTGCC CAAGTGACGC CAGGCAAGTC TCAGCTGGTT CCTGTGTTAG 661 CTCGAGGGTA GACATACGAG CTGATTGAAC ATGGGTTGGG GGCCTCGAAC CGTCGAGGAC 721 CCCATAGTAC CTCGGAGACC AAGTAGGGCA GCCTATAGTT TGAAGCAGAA CTATTTCGGG 781 GGGCGAGCCC TCATCGTCTC TTCTGCGGAT GACTCAAÇAC GCTAGGGACG TGAAGTCGAT 841 TCCTTCGATG GTTATAAATC AAAGACTCAG AGTGCTGTCT GGAGCGTGAA TCTAACGGTA 901 CGTATCTCGA TTGCTCGGTC GCTTTTCGCA CTCCGCGAAA GTTCGTACCG CTCATTCACT

961 AGGTTGCGAA GCCTATGCTG ATATATGAAT CCAAACTAGA GCAGGGCTCT TAAGATTCGG 1021 AGTTGTAAAT ACTTAATACT CCAATCGGCT TTTACGTGCA CCACCGCGGG CGGCTGEACAA 1081 GGGTCTCACA TCGAGAAACA AGACAGTTCC GGGCTGGAAG TAGCGCCGGC TAAGGAAGAC 1141 GCCTGGTACG GCAGGACTAT GAAACCAGTA CAAAGGCAAC ATCCTCACTT GGGTGAACGG 1201 AAACGCAGTA TTATGGTTAC TTTTTGGATA CGTGAAMACAT ATCCCATGGT AGTCCTTAGA 1261 CTTGGGAGTC TATCACCCCT AGGGCCCATA TCTGGAAATA GACGCCAGGT TGAATCCGTA 1321 TTTGGAGGTA CGATGGAACA GTCTGGGTGG GACGTGCTTC ATTTATACCC TGCGCAGGCT 1381 GGACCGAGGA CCGCAAGGTG CGGCGGTGCA CAAGCAATTG ACAACTAACC ACCGTGTATT 1441 CATTATGGTA CCAGGAACTT TAAGCCGAGT CAATGAAGCT CGCATTACAG TGTTTACCGC 1501 ATCTTGCCGT TACTCACAAA CTGTGATCCA CCACAAGTCA AGCCATTGCC TCTCTGACAC 1561 GCCGTAAGAA TTAATATGTA AACTTTGCGC GGGTTGACTG CGATCCGTTC AGTCTCGTCC 1621 GAGGGCACAA TCCTATTCCC ATTTGTATGT TCAGCTAACT TCTACCCATC CCCCGAAGTT 1681 AAGTAGGTCG TGAGATGCCA TGGAGGCTCT CGTTCATCCC GTGGGACATC AAGCTTCCCC 1741 TTGATAAAGC ACCCCGCTCG GGTGTAGCAG AGAAGACGCC TTCTGAATTG TGCAATCCCT 1801 CCACCTTATC TAAGCTTGCT ACCAATAATT AGCATTTTTG CCTTGCGACA GACCTCCTAC 1861 TTAGATTGCC ACACATTGAG CTAGTCAGTG AGCGATAAGC TTGACGCGCT TTCAAGGGTC 1921 GCGAGTACGT GAACTAAGGC TCCGGACAGG ACTATATACT TGGGTTTGAT CTCGCCCCGA 1981 CAACTGCAAMA CCTCAACTTT TTTAGATTAT ATGGTTAGCC GAAGTTGCAC GAGGTGGCGT 2041 CCGCGGACTG CTCCCCGAGT GTGGCTCTTT CATCTGACAA CGTGCAACCC CTATCGCGGC 2101 CGATTGTTTC TGCGGACGAT GTTGTCCTCA TAGTTTGGGC ATGTTTCCCT TGTAGGTGTG 2161 AAACCACTTA GCTTCGCGCC GTAGTCCCAA TGAAMAAMACCT ATGGACTTTG TTTTGGGTAG 2221 CACCAGGAAT CTGAACCGTG TGAATGTGGA CGTCGCGCGC GTAGACCTTT ATCTCCGGTT 2281 CAAGCTAGGG ATGTGGCTGC ATGCTACGTT GTCACACCTA CACTGCTCGA AGTAAATATG 2341 CGAAGCGCGC GGCCTGGCCG GAGGCGTTCC GCGCCGCCAC GTGTTCGTTA ACTGTTGATT 2401 GGTGGCACAT AAGCAATATC GTAGTCCGTC AAATTCAGCT CTGTTATCCC GGGCGTTATG 2461 TGTCAAATGG CGTAGAACGG GATTGACTGT TTGACGGTAG (SEQ ID NO: 12).

[00102] Em algumas modalidades, o vetor de entrega viral de AAV compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um promotor VMD2, uma sequência que codifi- ca uma proteína BEST1 e uma sequência que codifica um WPRE. Um exemplo de vetor de entrega viral AAV da divulgação compreendendo esta sequência de ácido nucleico (VMD2.BEST1.WPRE.pA) compre- ende ou consiste na sequência de ácido nucleico de: 1 TAGCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GCCCGGGCAA AGCCCGGGCG TCGGGCEGACE 61 TTTGGTCGCC CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC 121 ACTAGGGGTT CCTTGTAGTT AATGATTAAC CCGCCATGCT ACTTATCTAC GTAGCCATGC 181 TCTAGGTAAA TTCTGTCATT TTACTAGGGT GATGAAATTC CCAAGCAAÇA CCATCCTTTT 241 CAGATAAGGG CACTGAGGCT GAGAGAGGAG CTGAAACCTA CCCGGGGTCA CCACACACAG 301 GTGGCAAGGC TGGGACCAGA AACCAGGACT GTTGACTGCA GCCCGGTATT CATTCTTTCC 361 ATAGCCCACA GGGCTGTCAA AGACCCCAGG GCCTAGTCAG AGGCTCCTCC TTCCTGGAGA 421 GTTCCTGGCA CAGAAGTTGA AGCTCAGCAC AGCCCCCTAA CCCCCAACTC TCTCTGCAAG

481 GCCTCAGGGG TCAGAACACT GGTGGAGCAG ATCCTTTAGC CTCTGGATTT TAGGGCCATG 541 GTAGAGGGGG TGTTGCCCTA AATTCCAGCC CTGGTCTCAG CCCAACACCC TCCAAGAAGA 601 AATTAGAGGG GCCATGGCCA GGCTGTGCTA GCCGTTGCTT CTGAGCAGAT TACAAGAAGG 661 GACTAAGACA AGGACTCCTT TGTGGAGGTC CTGGCTTAGG GAGTCAAGTG ACGGCGGCTC 721 AGCACTCACG TGGGCAGTGC CAGCCTCTAA GAGTGGGCAG GGGCACTGGC CACAGAGTCC 781 CAGGGAGTCC CACCAGCCTA GTCGCCAGAC CGGCACCATG ACCATCACTT ACACAAGCCA 841 AGTGGCTAAT GCCCGCTTAG GCTCCTTCTC CCGCCTGCTG CTGTGCTGGC GGGGCAGCAT 901 CTACAAGCTG CTATATGGCG AGTTCTTAAT CTTCCTGCTC TGCTACTACA TCATCCGCTT 961 TATTTATAGG CTGGCCCTCA CGGAAGAACA ACAGCTGATG TTTGAGAMAC TGACTCTGTA 1021 TTGCGACAGC TACATCCAGC TCATCCCCAT TTCCTTCGTG CTGGGCTTCT ACGTGACGCT 1081 GGTCGTGACC CGCTGGTGGA ACCAGTACGA GAACCTGCCG TGGCCCGACC GCCTCATGAG 1141 CCTGGTGTCG GGCTTCGTCG AAGGCAAGGA CGAGCAAGGC CGGCTGCTGC GGCGCACGCT 1201 CATCCGCTAC GCCAACCTGG GCAACGTGCT CATCCTGCGC AGCGTCAGCA CCGCAGTCTA 1261 CAAGCGCTTC CCCAGCGCCC AGCACCTGGT GCAAGCAGGC TTTATGACTC CGGCAGAACA 1321 CAAGCAGTTG GAGAMACTGA GCCTACCACA CAACATGTTC TGGGTGCCCT GGGTGTGGTT 1381 TGCCAACCTG TCAATGAAGG CGTGGCTTGG AGGTCGAATC CGGGACCCTA TCCTGCTCCA 1441 GAGCCTGCTG AACGAGATGA ACACCTTGCG TACTCAGTGT GGACACCTGT ATGCCTACGA 1501 CTGGATTAGT ATCCCACTGG TGTATACACA GGTGGTGACT GTGGCGGTGT ACAGCTTCTT 1561 CCTGACTTGT CTAGTTGGGC GGCAGTTTCT GAACCCAGCC AAGGCCTACC CTGGCCATGA 1621 GCTGGACCTC GTTGTGCCCG TCTTCACGTT CCTGCAGTTC TTCTTCTATG TTGGCTGGCT 1681 GAAGGTGGCA GAGCAGCTCA TCAACCCCTT TGGAGAGGAT GATGATGATT TTGAGACCAA 1741 CTGGATTGTC GACAGGAATT TGCAGGTGTC CCTGTTGGCT GTGGATGAGA TGCACCAGGA 1801 CCTGCCTCGG ATGGAGCCGG ACATGTACTG GAATAAGCCC GAGCCACAGC CCCCCTACAC 1861 AGCTGCTTCC GCCCAGTTCC GTCGAGCCTC CTTTATGGGC TCCACCTTCA ACATCAGCCT 1921 GAACAAAGAG GAGATGGAGT TCCAGCCCAA TCAGGAGGAC GAGGAGGATG CTCACGCTGG 1981 CATCATTGGC CGCTTCCTAG GCCTGCAGTC CCATGATCAC CATCCTCCCA GGGCAAACTC 2041 AAGGACCAAMA CTACTGTGGC CCAAGAGGGA ATCCCTTCTC CACGAGGGCC TGCCCAAAAA 2101 CCACAAGGCA GCCAAMACAGA ACGTTAGGGG CCAGGAAGAC AACAAGGCCT GGAAGCTTAA 2161 GGCTGTGGAC GCCTTCAAGT CTGCCCCACT GTATCAGAGG CCAGGCTACT ACAGTGCCCC 2221 ACAGACGCCC CTCAGCCCCA CTCCCATGTT CTTCCCCCTA GAACCATCAG CGCCGTCAAA 2281 GCTTCACAGT GTCACAGGCA TAGACACCAA AGACAMAAGC TTAAAGACTG TGAGTTCTGG 2341 GGCCAAGAAMA AGTTTTGAAT TGCTCTCAGA GAGCGATGGG GCCTTGATGG AGCACCCAGA 2401 AGTATCTCAA GTGAGGAGGA AAACTGTGGA GTTTAACCTG ACGGATATGC CAGAGATCCC 2461 CGAAMAATCAC CTCAAMAGAAC CTTTGGAACA ATCACCAACC AACATACACA CTACACTCAA 2521 AGATCACATG GATCCTTATT GGGCCTTGGA AAACAGGGAT GAAGCACATT CCTAATCTAG 2581 CGGCCGCGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA TAATCAACCT CTGGATTACA AAATTTGTGA 2641 AAGATTGACT GGTATTCTTA ACTATGTTGC TCCTTTTACG CTATGTGGAT ACGCTGCTTT 2701 AATGCCTTTG TATCATGCTA TTGCTTCCCG TATGGCTTTC ATTTTCTCCT CCTTGTATAA 2761 ATCCTGGTTG CTGTCTCTTT ATGAGGAGTT GTGGCCCGTT GTCAGGCAAC GTGGCGTGGT 2821 GTGCACTGTG TTTGCTGACG CAACCCCCAC TGGTTGGGGC ATTGCCACCA CCTGTCAGCT 2881 CCTTTCCGGG ACTTTCGCTT TCCCCCTCCC TATTGCCACG GCGGAACTCA TCGCCGCCTG 2941 CCTTGCCCGC TGCTGGACAG GGGCTCGGCT GTTGGGCACT GACAATTCCG TGGTGTTGTC 3001 GGGGAAATCA TCGTCCTTTC CTTGGCTGCT CGCCTGTGTT GCCACCTGGA TTCTGCGCGEG 3061 GACGTCCTTC TGCTACGTCC CTTCGGCCCT CAATCCAGCG GACCTTCCTT CCCGCEGCCT 3121 GCTGCCGGCT CTGCGGCCTC TTCCGCGTCT TCGCCTTCGC CCTCAGACGA GTCGGATCTC

3181 CCTTTGGGCC GCCTCCCCGG CGECCGCGCA CCGTCGACTC GCTGATCAGC CTCGACTGTG 3241 CCTTCTAGTT GCCAGCCATC TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA 3301 GGTGCCACTC CCACTGTCCT TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA TTGTCTGAGT 3361 AGGTGTCATT CTATTCTGGG GGGTGGGGCTGE GGGCAGGACA GCAAGGGGGA GGATTGGGAA 3421 GACAATAGCA GGCATGCTGG GGATGCGGTG GGCTCTATGG CTTCTGAGGC GGAAAGAACC 3481 AGCTGGGGCT CGACTAGAGC ATGGCTACGT AGATAAGTAG CATGGCGGGT TAATCATTAA 3541 CTACAAGGAA CCCCTAGTGA TGGAGTTGGC CACTCCCTCT CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC 3601 TGAGGCCGGG CGACCAAAGG TCGCCCGACG CCCEGGECEGC CTCAGTGAGC GAGCGAGCGEC 3661 GCAGAGCTTT TTGCAAMAAGC CTAGGCCTCC AAAAAAGCCT CCTCACTACT TCTGGAATAG 3721 CTCAGAGGCC GAGGCGGCCT CGGCCTCTGC ATAMATAAAA AAAATTAGTC AGCCATGGGG 3781 CGGAGAATGG GCGGAACTGG GCGGAGTTAG GGGCGGGATG GGCGGAGTTA GGGGCEGEAC 3841 TATGGTTGCT GACTAATTGA GATGCATGCT TTGCATACTT CTGCCTGCTG GGGAGCCTGG 3901 GGACTTTCCA CACCTGGTTG CTGACTAATT GAGATGCATG CTTTGCATAC TTCTGCCTGC 3961 TGGGGAGCCT GGGGACTTTC CACACCCTAA CTGACACACA TTCCACAGCT GCATTAATGA 4021 ATCGGCCAAC GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC 4081 ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG 4141 GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC 4201 CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAMAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC 4261 CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA 4321 CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC 4381 CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT 4441 AGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG 4501 CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC 4561 AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTAGCAGA 4621 GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT 4681 AGAAGAACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT 4741 GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTITTT TGTTTGCAAG 4801 CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG 4861 TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA 4921 AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA 4981 TATGAGTAAMA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG 5041 ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCTGC AAACCACGTT GTGTCTCAAA 5101 ATCTCTGATG TTACATTGCA CAAGATAAAA ATATATCATC ATGAACAATA AAACTGTCTG 5161 CTTACATAMA CAGTAATACA AGGGGTGTTA TGAGCCATAT TCAACGGGAA ACGTCTTGCT 5221 CGAGGCCGCG ATTAMATTCC AACATGGATG CTGATTTATA TGGGTATAAA TGGGCTCGCG 5281 ATAATGTCGG GCAATCAGGT GCGACAATCT ATCGATTGTA TGGGAAGCCC GATGCGCCAG 5341 AGTTGTTTCT GAAACATGGC AAAGGTAGCG TTGCCAATGA TGTTACAGAT GAGATGGTCA 5401 GACTAAACTG GCTGACGGAA TTTATGCCTC TTCCGACCAT CAAGCATTTT ATCCGTACTC 5461 CTGATGATGC ATGGTTACTC ACCACTGCGA TCCCCGGGAA AACAGCATTC CAGGTATTAG 5521 AAGAATATCC TGATTCAGGT GAAAATATTG TTGATGCGCT GGCAGTGTTC CTGCGCCGGT 5581 TGCATTCGAT TCCTGTTTGT AATTGTCCTT TTAACAGCGA TCGCGTATTT CGTCTCGCTC 5641 AGGCGCAATC ACGAATGAAT AACGGTTTGG TTGATGCGAG TGATTTTGAT GACGAGCGTA 5701 ATGGCTGGCC TGTTGAACAA GTCTGGAAAG AAATGCATAA GCTTTTGCCA TTCTCACCGG 5761 ATTCAGTCGT CACTCATGGT GATTTCTCAC TTGATAACCT TATTTTTGAC GAGGGGAAAT 5821 TAATAGGTTG TATTGATGTT GGACGAGTCG GAATCGCAGA CCGATACCAG GATCTTGCCA

5881 TCCTATGGAA CTGCCTCGGT GAGTTTTCTC CTICATTACA GAAACGGCTT TTTCAAAAAT 5941 ATGGTATTGA TAATCCTGAT ATGAATAAAT TGCAGTTTCA TTTGATGCTC GATGAGTTTT 6001 TCTAAGGGCG GCCTGCCACC ATACCCACGC CGAAACAAGC GCTCATGAGC CCGAAGTGGC 6061 GAGCCCGATC TTCCCCATCG GTGATGTCGG CGATATAGGC GCCAGCAACC GCACCTGTGG 6121 CGCCGGTGAT GCCGGCCACG ATGCGTCCGG CGTAGAGGAT CTGGCTAGCG ATGACCCTGC 6181 TGATTGGTTC GCTGACCATT TCCGGGTGCG GGACGGCGTT ACCAGAAMACT CAGAAGGTTC 6241 GTCCAACCAA ACCGACTCTG ACGGCAGTTT ACGAGAGAGA TGATAGGGTC TGCTTCAGGG 6301 TGACCGATGT AACCATATAC TTAGGCTGGA TCTTCTCCCG CGAATTTTAA CCCTCACCAA 6361 CTACGAGATA TGAGGTAAGC CAAAAAAGCA CGTAGTGGCG CTCTCCGACT GTTCCCAAAT 6421 TGTAACTTAT CGTTCCGTGA AGGCCAGAGT TACTTCCCGG CCCTTTCCAT GCGCGCACCA 6481 TACCCTCCTA GTTCCCCGGT TATCTTTCCG AAGTGGGAGT GAGCGAACCT CCGTTTACGT 6541 CTTGTTACCA ATGATGTAGC TATGCACTTT GTACAGGGTG CCAACGGGTT TCACAATTCA 6601 CAGATAGTGG GGATCCCGGC AAMAGGGCCTA TATTTGCGGT CCAACTTAGG CGTAAACCTC 6661 GATGCTACCT ACTCAGACCC ACCTCGCGCG GGGTAAATAA GGCACTCATC CCAGCTGGTT 6721 CTTGGCGTTC TACGCAGCGA CATGTTTATT AACAGTTGTC TGGCAGCACA AAACTTTTAC 6781 CATGGTCGTA GAAGCCCCCC AGAGTTAGTT CATACCTAAT GCCACAAATG TGACAGGACG 6841 CCGATGGGTA CCGGACTTTA GGTCGAGCAC AGTTCGGTAA CGGAGAGACC CTGCGGCGTA 6901 CTTCATTATG TATATGGAAC GTGCCCAAGT GACGCCAGGC AAGTCTCAGC TGGTTCCTGT 6961 GTTAGCTCGA GGGTAGACAT ACGAGCTGAT TGAACATGGG TTGGGGGCCT CGAACCGTCG 7021 AGGACCCCAT AGTACCTCGG AGACCAAGTA GGGCAGCCTA TAGTTTGAAG CAGAACTATT 7081 TCGGGGGGCG AGCCCTCATC GTCTCTTCTG CGGATGACTC AACACGCTAG GGACGTGAAG 7141 TCGATTCCTT CGATGGTTAT AAATCAAAGA CTCAGAGTGC TGTCTGGAGC GTGAATCTAA 7201 CGGTACGTAT CTCGATTGCT CGGTCGCTTT TCGCACTCCG CGAAAGTTCG TACCGCTCAT 7261 TCACTAGGTT GCGAAGCCTA TGCTGATATA TGAATCCAAA CTAGAGCAGG GCTCTTAAGA 7321 TTCGGAGTTG TAAATACTTA ATACTCCAAT CGGCTTTTAC GTGCACCACC GCGGGCEGCT 7381 GACAAGGGTC TCACATCGAG AAACAAGACA GTTCCGGGCT GGAAGTAGCG CCGGCTAAGG 7441 AAGACGCCTG GTACGGCAGG ACTATGAAAC CAGTACAAAG GCAACATCCT CACTTGGGTG 7501 AACGGAAACG CAGTATTATG GTTACTTTTT GGATACGTGA AACATATCCC ATGGTAGTCC 7561 TTAGACTTGG GAGTCTATCA CCCCTAGGGC CCATATCTGG AAATAGACGC CAGGTTGAAT 7621 CCGTATTTGG AGGTACGATG GAACAGTCTG GGTGGGACGT GCTTCATTTA TACCCTGCGC 7681 AGGCTGGACC GAGGACCGCA AGGTGCGGCG GTGCACAAGC AATTGACAAC TAACCACCGT 7741 GTATTCATTA TGGTACCAGG AACTTTAAGC CGAGTCAATG AAGCTCGCAT TACAGTGTTT 7801 ACCGCATCTT GCCGTTACTC ACAAACTGTG ATCCACCACA AGTCAAGCCA TTGCCTCTCT 7861 GACACGCCGT AAGAATTAAT ATGTAAMACTT TGCGCGGGTT GACTGCGATC CGTTCAGTCT 7921 CGTCCGAGGG CACAATCCTA TTCCCATTTG TATGTTCAGC TAACTTCTAC CCATCCCCCG 7981 AAGTTAAGTA GGTCGTGAGA TGCCATGGAG GCTCTCGTTC ATCCCGTGGG ACATCAAGCT 8041 TCCCCTTGAT AAAGCACCCC GCTCGGGTGT AGCAGAGAAG ACGCCTTCTG AATTGTGCAA 8101 TCCCTCCACC TTATCTAAGC TTGCTACCAA TAATTAGCAT TTTTGCCTTG CGACAGACCT 8161 CCTACTTAGA TTGCCACACA TTGAGCTAGT CAGTGAGCGA TAAGCTTGAC GCGCTTTCAA 8221 GGGTCGCGAG TACGTGAACT AAGGCTCCGG ACAGGACTAT ATACTTGGGT TTGATCTCGC 8281 CCCGACAACT GCAAACCTCA ACTTTTTTAG ATTATATGGT TAGCCGAAGT TGCACGAGGT 8341 GGCGTCCGCG GACTGCTCCC CGAGTGTGGC TCTTTCATCT GACAACGTGC AACCCCTATC 8401 GCGGCCGATT GTTTCTGCGG ACGATGTTGT CCTCATAGTT TGGGCATGTT TCCCTTGTAG 8461 GTGTGAAACC ACTTAGCTTC GCGCCGTAGT CCCAATGAAA AACCTATGGA CTTTGTTTTG 8521 GGTAGCACCA GGAATCTGAA CCGTGTGAAT GTGGACGTCG CGCGCGTAGA CCTTTATCTC

8581 CGGTTCAAGC TAGGGATGTG GCTGCATGCT ACGTTGTCAC ACCTACACTG CTCGAAGTAA 8641 ATATGCGAAG CGCGCGGCCT GGCCGGAGEC GTTCCGCGCC GCCACGTGTT CGTTAACTGT 8701 TGATTGGTGG CACATAAGCA ATATCGTAGT CCGTCAAATT CAGCTCTGTT ATCCCGGGCG 8761 TTATGTGTCA AATGGCGTAG AACGGGATTG ACTGTTTGAC GGTAGGGTGA CCTAAGCCAG 8821 ATGCTACACA ATTAGGCTTG TACATATTGT CGTTAGAACG CGGCTACAAT TAATACATAA 8881 CCTTATGTAT CATACACATA CGATTTAGGT GACACTATAG AATACACGGA ATTAATTC (SEQ ID NO: 13). Tabela 1.Características da sequência de plasmídeos de VMD?. BEST1.WPRE.pA Fer o Wnimo [Nóximo [Comprimento [Direção | bGH pA polyA signal | 3.220 3.488 Origem do rep o rep origin 4.230 4.849 620 “reverse” pBR322 Sequência *stuffer gerada aleatoria- | Stuffer 6.306 8.805 2.500 nenhuma mente

[00103] Em algumas modalidades, o vetor de entrega viral de AAV compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um promotor VMD2, uma sequência que codifi- ca uma proteína BEST1, uma sequência que codifica um íntron, uma sequência que cofifica um éxon e uma sequência que codifica um WPRE. Um exemplo de vetor de entrega viral AAV da divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma se- quência VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE.pA compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico de: 1 TAGCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GCCCGGGCAA AGCCCGGGCG TCGGGCEGACE 61 TTTGGTCGCC CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC 121 ACTAGGGGTT CCTTGTAGTT AATGATTAAC CCGCCATGCT ACTTATCTAC GTAGCCATGC 181 TCTAGGTAAMA TTCTGTCATT TTACTAGGGT GATGAAMATTC CCAAGCAACA CCATCCTTTT 241 CAGATAAGGG CACTGAGGCT GAGAGAGGAG CTGAAACCTA CCCGGGGTCA CCACACACAG

301 GTGGCAAGGC TGGGACCAGA AACCAGGACT GTTGACTGCA GCCCGGTATT CATTCTTTCC 361 ATAGCCCACA GGGCTGTCAA AGACCCCAGG GCCTAGTCAG AGGCTCCTCC TTCCTGGAGA 421 GTTCCTGGCA CAGAAGTTGA AGCTCAGCAC AGCCCCCTAA CCCCCAACTC TCTCTGCAAG 481 GCCTCAGGGG TCAGAACACT GGTGGAGCAG ATCCTTTAGC CTCTGGATTT TAGGGCCATG 541 GTAGAGGGGG TGTTGCCCTA AATTCCAGCC CTGGTCTCAG CCCAACACCC TCCAAGAAGA 601 AATTAGAGGG GCCATGGCCA GGCTGTGCTA GCCGTTGCTT CTGAGCAGAT TACAAGAAGG 661 GACTAAGACA AGGACTCCTT TGTGGAGGTC CTGGCTTAGG GAGTCAAGTG ACGGCGGCTC 721 AGCACTCACG TGGGCAGTGC CAGCCTCTAA GAGTGGGCAG GGGCACTGGC CACAGAGTCC 781 CAGGGAGTCC CACCAGCCTA GTCGCCAGAC CGGGTGCCGC AGGGGGACGG CTGCCTTCGG 841 GGGGGACGGG GCAGGGCGGG GTTCGGCTTC TGGCGTETGA CCGGCEGGCTC TAGAGCCTCT 901 GCTAACCATG TTCATGCCTT CTTCTTTTTC CTACAGCTCC TGGGCAACGT GCTGGTTATT 961 GTGCTGTCTC ATCATTTTGG CAMAGAATTG GCACCATGAC CATCACTTAC ACAAGCCAAG 1021 TGGCTAATGC CCGCTTAGGC TCCTTCTCCC GCCTGCTGCT GTGCTGGCGG GGCAGCATCT 1081 ACAAGCTGCT ATATGGCGAG TTCTTAATCT TCCTGCTCTG CTACTACATC ATCCGCTTTA 1141 TTTATAGGCT GGCCCTCACG GAAGAACAAC AGCTGATGTT TGAGAAACTG ACTCTGTATT 1201 GCGACAGCTA CATCCAGCTC ATCCCCATTT CCTTCGTGCT GGGCTTCTAC GTGACGCTGG 1261 TCGTGACCCG CTGGTGGAAC CAGTACGAGA ACCTGCCGTG GCCCGACCGC CTCATGAGCC 1321 TGGTGTCGGG CTTCGTCGAA GGCAAGGACG AGCAAGGCCG GCTGCTGCGG CGCACGCTCA 1381 TCCGCTACGC CAACCTGGGC AACGTGCTCA TCCTGCGCAG CGTCAGCACC GCAGTCTACA 1441 AGCGCTTCCC CAGCGCCCAG CACCTGGTGC AAGCAGGCTT TATGACTCCG GCAGAACACA 1501 AGCAGTTGGA GAAACTGAGC CTACCACACA ACATGTTCTG GGTGCCCTGG GTGTGGTTTG 1561 CCAACCTGTC AATGAAGGCG TGGCTTGGAG GTCGAATCCG GGACCCTATC CTGCTCCAGA 1621 GCCTGCTGAA CGAGATGAAC ACCTTGCGTA CTCAGTGTGG ACACCTGTAT GCCTACGACT 1681 GGATTAGTAT CCCACTGGTG TATACACAGG TGGTGACTGT GGCGGTGTAC AGCTTCTTCC 1741 TGACTTGTCT AGTTGGGCGG CAGTTTCTGA ACCCAGCCAA GGCCTACCCT GGCCATGAGC 1801 TGGACCTCGT TGTGCCCGTC TTCACGTTCC TGCAGTTCTT CTTCTATGTT GGCTGGCTGA 1861 AGGTGGCAGA GCAGCTCATC AACCCCTTTG GAGAGGATGA TGATGATTTT GAGACCAACT 1921 GGATTGTCGA CAGGAATTTG CAGGTGTCCC TGTTGGCTGT GGATGAGATG CACCAGGACC 1981 TGCCTCGGAT GGAGCCGGAC ATGTACTGGA ATAAGCCCGA GCCACAGCCC CCCTACACAG 2041 CTGCTTCCGC CCAGTTCCGT CGAGCCTCCT TTATGGGCTC CACCTTCAAC ATCAGCCTGA 2101 ACAMAGAGGA GATGGAGTTC CAGCCCAATC AGGAGGACGA GGAGGATGCT CACGCTGGCA 2161 TCATTGGCCG CTTCCTAGGC CTGCAGTCCC ATGATCACCA TCCTCCCAGG GCAAACTCAA 2221 GGACCAAACT ACTGTGGCCC AAGAGGGAAT CCCTTCTCCA CGAGGGCCTG CCCAAAAACC 2281 ACAAGGCAGC CAAACAGAAC GTTAGGGGCC AGGAAGACAA CAAGGCCTGG AAGCTTAAGG 2341 CTGTGGACGC CTTCAAGTCT GCCCCACTGT ATCAGAGGCC AGGCTACTAC AGTGCCCCAC 2401 AGACGCCCCT CAGCCCCACT CCCATGTTCT TCCCCCTAGA ACCATCAGCG CCGTCAAAGC 2461 TTCACAGTGT CACAGGCATA GACACCAAAG ACAMAAGCTT AAAGACTGTG AGTTCTGGGG 2521 CCAAGAAAAG TTTTGAATTG CTCTCAGAGA GCGATGGGGC CTTGATGGAG CACCCAGAAG 2581 TATCTCAAGT GAGGAGGAAA ACTGTGGAGT TTAACCTGAC GGATATGCCA GAGATCCCCG 2641 AAAATCACCT CAAAGAACCT TTGGAACAAT CACCAACCAA CATACACACT ACACTCAAAG 2701 ATCACATGGA TCCTTATTGG GCCTTGGAAA ACAGGGATGA AGCACATTCC TAATCTAGCG 2761 GCCGCGAATT CGATATCAAG CTTATCGATA ATCAACCTCT GGATTACAAA ATTTGTGAAA 2821 GATTGACTGG TATTCTTAAC TATGTTGCTC CTTTTACGCT ATGTGGATAC GCTGCTTTAA 2881 TGCCTTTGTA TCATGCTATT GCTTCCCGTA TGGCTTTCAT TTTCTCCTCC TTGTATAAAT 2941 CCTGGTTGCT GTCTCTTTAT GAGGAGTTGT GGCCCGTTGT CAGGCAACGT GGCGTGGTGT

3001 GCACTGTGTT TGCTGACGCA ACCCCCACTG GTTGGGGCAT TGCCACCACC TGTCAGCTCC 3061 TTTCCGGGAC TTTCGCTTTC CCCCTCCCTA TTGCCACGGC GGAACTCATC GCCGCCTGCC 3121 TTGCCCGCTG CTGGACAGGG GCTCGGCTGT TGGGCACTGA CAATTCCGTG GTGTTGTCGEG 3181 GGAAMATCATC GTCCTTTCCT TGGCTGCTCG CCTGTGTTGC CACCTGGATT CTGCGCGGÇA 3241 CGTCCTTCTG CTACGTCCCT TCGGCCCTCA ATCCAGCGGA CCTTCCTTCC CGCEGCCTEC 3301 TGCCGGCTCT GCGGCCTCTT CCGCGTCTTC GCCTTCGCCC TCAGACGAGT CGGATCTCCC 3361 TTTGGGCCGC CTCCCCGGCG GCCGCGCACC GTCGACTCGC TGATCAGCCT CGACTGTGCC 3421 TTCTAGTTGC CAGCCATCTG TTGTTTGCCC CTCCCCCGTG CCTTCCTTGA CCCTGGAAGG 3481 TGCCACTCCC ACTGTCCTTT CCTAATAAAA TGAGGAAATT GCATCGCATT GTCTGAGTAG 3541 GTGTCATTCT ATTCTGGGGG GTGGGGCGTGGGE GCAGGACAGC AAGGGGGAGG ATTGGGAAGA 3601 CAATAGCAGG CATGCTGGGG ATGCGGTGGG CTCTATGGCT TCTGAGGCGG AAAGAACCAG 3661 CTGGGGCTCG ACTAGAGCAT GGCTACGTAG ATAAGTAGCA TGGCGGGTTA ATCATTAACT 3721 ACAAGGAACC CCTAGTGATG GAGTTGGCCA CTCCCTCTCT GCGCGCTCGC TCGCTCACTG 3781 AGGCCGGGCG ACCAMAGGTC GCCCGACGCC CGEGGCEGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCEC 3841 AGAGCTTTTT GCAAAAGCCT AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC TGGAATAGCT 3901 CAGAGGCCGA GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAMAAAA AATTAGTCAG CCATGGGGCG 3961 GAGAATGGGC GGAACTGGGC GGAGTTAGGG GCGGGATGGG CGGAGTTAGG GGCGGGACTA 4021 TGGTTGCTGA CTAATTGAGA TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGGG 4081 ACTTTCCACA CCTGGTTGCT GACTAATTGA GATGCATGCT TTGCATACTT CTGCCTGCTG 4141 GGGAGCCTGG GGACTTTCCA CACCCTAACT GACACACATT CCACAGCTGC ATTAATGAAT 4201 CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC 4261 TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT 4321 AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA 4381 GCAAMAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC 4441 CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAMACC CGACAGGACT 4501 ATAMAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT 4561 GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG 4621 CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA 4681 CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA 4741 CCCGGTAAGA CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC 4801 GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG 4861 AAGAACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG 4921 TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA 4981 GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC 5041 TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG 5101 GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAMATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA 5161 TGAGTAAMACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT 5221 CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCTGCAA ACCACGTTGT GTCTCAAAAT 5281 CTCTGATGTT ACATTGCACA AGATAAMAAAT ATATCATCAT GAACAATAAA ACTGTCTGCT 5341 TACATAAMACA GTAATACAAG GGGTGTTATG AGCCATATTC AACGGGAAAC GTCTTGCTCG 5401 AGGCCGCGAT TAAATTCCAA CATGGATGCT GATTTATATG GGTATAAMATG GGCTCGCGAT 5461 AATGTCGGGC AATCAGGTGC GACAATCTAT CGATTGTATG GGAAGCCCGA TGCGCCAGAG 5521 TTGTTTCTGA AACATGGCAA AGGTAGCGTT GCCAATGATG TTACAGATGA GATGGTCAGA 5581 CTAMACTGGC TGACGGAATT TATGCCTCTT CCGACCATCA AGCATTTTAT CCGTACTCCT 5641 GATGATGCAT GGTTACTCAC CACTGCGATC CCCGGGAAAA CAGCATTCCA GGTATTAGAA

5701 GAATATCCTG ATTCAGGTGA AAATATTGTT GATGCGCTGG CAGTGTTCCT GCGCCGGTTG 5761 CATTCGATTC CTGTTTGTAA TTGTCCTTTT AACAGCGATC GCGTATTTCG TCTCGCTCAG 5821 GCGCAATCAC GAATGAATAA CGGTTTGGTT GATGCGAGTG ATTTTGATGA CGAGCGTAAT 5881 GGCTGGCCTG TTGAACAAGT CTGGAAMAGAA ATGCATAAGC TTTTGCCATT CTCACCGGAT 5941 TCAGTCGTCA CTCATGGTGA TTTCTCACTT GATAACCTTA TTTTTGACGA GGGGAAATTA 6001 ATAGGTTGTA TTGATGTTGG ACGAGTCGGA ATCGCAGACC GATACCAGGA TCTTGCCATC 6061 CTATGGAACT GCCTCGGTGA GTTTTCTCCT TCATTACAGA AACGGCTTTT TCAAMAAATAT 6121 GGTATTGATA ATCCTGATAT GAATAAATTG CAGTTICATT TGATGCTCGA TGAGTTTTTC 6181 TAAGGGCGGC CTGCCACCAT ACCCACGCCG AAACAAGCGC TCATGAGCCC GAAGTGGCGA 6241 GCCCGATCTT CCCCATCGGT GATGTCGGCG ATATAGGCGC CAGCAACCGC ACCTGTGGCG 6301 CCGGTGATGC CGGCCACGAT GCGTCCGGCG TAGAGGATCT GGCTAGCGAT GACCCTGCTG 6361 ATTGGTTCGC TGACCATTTC CGGGTGCGGG ACGGCGTTAC CAGAAACTCA GAAGGTTCGT 6421 CCAACCAMAC CGACTCTGAC GGCAGTTTAC GAGAGAGATG ATAGGGTCTG CTTCAGGGTG 6481 ACCGATGTAA CCATATACTT AGGCTGGATC TTCTCCCGCG AATTTTAACC CTCACCAACT 6541 ACGAGATATG AGGTAAGCCA AAMAAAGCACG TAGTGGCGCT CTCCGACTGT TCCCAAATTG 6601 TAACTTATCG TTCCGTGAAG GCCAGAGTTA CTTCCCGGCC CTTTCCATGC GCGCACCATA 6661 CCCTCCTAGT TCCCCGGTTA TCTTTCCGAA GTGGGAGTGA GCGAACCTCC GTTTACGTCT 6721 TGTTACCAAT GATGTAGCTA TGCACTTTGT ACAGGGTGCC AACGGGTTTC ACAATTCACA 6781 GATAGTGGGG ATCCCGGCAA AGGGCCTATA TTTGCGGTCC AACTTAGGCG TAAACCTCGA 6841 TGCTACCTAC TCAGACCCAC CTCGCGCGGG GTAAATAAGG CACTCATCCC AGCTGGTTCT 6901 TGGCGTTCTA CGCAGCGACA TGTTTATTAA CAGTTGTCTG GCAGCACAAMA ACTTTTACCA 6961 TGGTCGTAGA AGCCCCCCAG AGTTAGTTCA TACCTAATGC CACAAATGTG ACAGGACGCC 7021 GATGGGTACC GGACTTTAGG TCGAGCACAG TTCGGTAACG GAGAGACCCT GCGGCGTACT 7081 TCATTATGTA TATGGAACGT GCCCAAGTGA CGCCAGGCAA GTCTCAGCTG GTTCCTGTGT 7141 TAGCTCGAGG GTAGACATAC GAGCTGATTG AACATGGGTT GGGGGCCTCG AACCGTCGAG 7201 GACCCCATAG TACCTCGGAG ACCAAGTAGG GCAGCCTATA GTTTGAAGCA GAACTATTTC 7261 GGGGGGCGAG CCCTCATCGT CTCTTCTGCG GATGACTCAA CACGCTAGGG ACGTGAAGTC 7321 GATTCCTTCG ATGGTTATAA ATCAAAGACT CAGAGTGCTG TCTGGAGCGT GAATCTAACG 7381 GTACGTATCT CGATTGCTCG GTCGCTTTTC GCACTCCGCG AAAGTTCGTA CCGCTCATTC 7441 ACTAGGTTGC GAAGCCTATG CTGATATATG AATCCAAACT AGAGCAGGGC TCTTAAGATT 7501 CGGAGTTGTA AATACTTAAT ACTCCAATCG GCTTTTACGT GCACCACCGC GGGCGGCTGA 7561 CAAGGGTCTC ACATCGAGAA ACAAGACAGT TCCGGGCTGG AAGTAGCGCC GGCTAAGGAA 7621 GACGCCTGGT ACGGCAGGAC TATGAAMACCA GTACAAMAGGC AACATCCTCA CTTGGGTGAA 7681 CGGAAACGCA GTATTATGGT TACTTTTTGG ATACGTGAAA CATATCCCAT GGTAGTCCTT 7741 AGACTTGGGA GTCTATCACC CCTAGGGCCC ATATCTGGAA ATAGACGCCA GGTTGAATCC 7801 GTATTTGGAG GTACGATGGA ACAGTCTGGG TGGGACGTGC TTCATTTATA CCCTGCGCAG 7861 GCTGGACCGA GGACCGCAAG GTGCGGCGGT GCACAAGCAA TTGACAACTA ACCACCGTGT 7921 ATTCATTATG GTACCAGGAA CTTTAAGCCG AGTCAATGAA GCTCGCATTA CAGTGTTTAC 7981 CGCATCTTGC CGTTACTCAC AAACTGTGAT CCACCACAAG TCAAGCCATT GCCTCTCTGA 8041 CACGCCGTAA GAATTAATAT GTAAACTTTG CGCGGGTTGA CTGCGATCCG TTCAGTCTCG 8101 TCCGAGGGCA CAATCCTATT CCCATTTGTA TGTTCAGCTA ACTTCTACCC ATCCCCCGAA 8161 GTTAAGTAGG TCGTGAGATG CCATGGAGGC TCTCGTTCAT CCCGTGGGAC ATCAAGCTTC 8221 CCCTTGATAA AGCACCCCGC TCGGGTGTAG CAGAGAAGAC GCCTTCTGAA TTGTGCAATC 8281 CCTCCACCTT ATCTAAGCTT GCTACCAATA ATTAGCATTT TTGCCTTGCG ACAGACCTCC 8341 TACTTAGATT GCCACACATT GAGCTAGTCA GTGAGCGATA AGCTTGACGC GCTTTCAAGG

8401 GTCGCGAGTA CGTGAACTAA GGCTCCGGAC AGGACTATAT ACTTGGGTTT GATCTCGCCC 8461 CGACAACTGC AMACCTCAAC TTTTTTAGAT TATATGGTTA GCCGAAGTTG CACGAGGTGG 8521 CGTCCGCGGA CTGCTCCCCG AGTGTGGCTC TTTCATCTGA CAACGTGCAA CCCCTATCGC 8581 GGCCGATTGT TTCTGCGGAC GATGTTGTCC TCATAGTTTG GGCATGTTTC CCTTGTAGGT 8641 GTGAAMACCAC TTAGCTTCGC GCCGTAGTCC CAATGAAAAA CCTATGGACT TTGTTTTGGG 8701 TAGCACCAGG AATCTGAACC GTGTGAATGT GGACGTCGCG CGCGTAGACC TTTATCTCCG 8761 GTTCAAGCTA GGGATGTGGC TGCATGCTAC GTTGTCACAC CTACACTGCT CGAAGTAAAT 8821 ATGCGAAGCG CGCGGCCTGG CCGGAGGCGET TCCGCGCCGCE CACGTGTTCG TTAACTGTTG 8881 ATTGGTGGCA CATAAGCAAT ATCGTAGTCC GTCAAATTCA GCTCTGTTAT CCCGGGCGTT 8941 ATGTGTCAAA TGGCGTAGAA CGGGATTGAC TGTTTGACGG TAGGGTGACC TAAGCCAGAT 9001 GCTACACAAT TAGGCTTGTA CATATTGTCG TTAGAACGCG GCTACAATTA ATACATAACC 9061 TTATGTATCA TACACATACG ATTTAGGTGA CACTATAGAA TACACGGAAT TAATTC (SEQ ID NO: 14). Tabela 2.Características da sequência de plasmídeos de VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE.pA Nome Tipo Mínimo — Máximo “Comprimento Direção Promotor VMD2 - ss e e e o ee Emo e e e mo ese eres rs as dr nene eres as dr mem polyA signa Origem do rep Sequência stuffer gerada aleatori-

[00104] Em algumas modalidades, o vetor de entrega viral de AAV compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um promotor CAG, uma sequência que codifica uma proteína BEST1 e uma sequência que codifica um WPRE. Um exemplo de vetor de entrega viral AAV da divulgação compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência CAG.BEST1.WPRE.pA compreende ou consiste na sequência de áci- do nucleico de: 1 TAGCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GCCCGGGCAA AGCCCGGGCGE TCGGGE-

CGACC 61 TTTGGTCGCC CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC 121 ACTAGGGGTT CCTTGTAGTT AATGATTAAC CCGCCATGCT ACTTATCTAC GTAGCCATGC 181 TCTAGGTACC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA ATAGGGACTT 241 TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA GTACATCAAG 301 TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC 361 ATTATGCCCA GTACATGACC TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC TACGTATTAG 421 TCATCGCTAT TACCATGGTC GAGGTGAGCC CCACGTTCTG CTTCACTCTC CCCATCTCCC 481 CCCCCTCCCC ACCCCCAATT TTGTATTTAT TTATTITTTA ATTATTTTGT GCAGCGATGG 541 GGGCGGEGEGS GGEGEGEGEG CGCECECCAG GCEGEGCEGE GCGEGECEASG GGGCEGEGCÇE 601 GGGCGAGGCG GAGAGGTGCG GCGGCAGCCA ATCAGAGCGG CGCGCTCCGA AAGTTTCCTT 661 TTATGGCGAG GCGGCGGCEGG CGGCGGCCCT ATAAAAAGCG AAGCGCGCEG CEGECEGÇAÇS 721 TCGCTGCGCG CTGCCTTCGCE CCCGTGCCCE GCTCCGCCGCE CGCCETEGEGE CGCCEGCCEE 781 GGCTCTGACT GACCGCGTTA CTCCCACAGG TGAGCGGGCG GGACGGCCCT TCTCCTCCGG 841 GCTGTAATTA GCGCTTGGTT TAATGACGGC TTGTTTCTTT TCTGTGGCTG CGTGAAAGCC 901 TTGAGGGGCT CCGGGAGGGC CCTTTGTGCG GGGGGAGCGG CTCGEGECTS TCCGCEGEGE 961 GACGGCTGCC TTCGGGGEGG ACGGGGCAGG GCGGGETTCG GCTTCTGGCG TGTGACCGEGC 1021 GGCTCTAGAG CCTCTGCTAA CCATGTTCAT GCCTTCTTCT TTTTCCTACA GCTCCTGGGC 1081 AACGTGCTGG TTATTGTGCT GTCTCATCAT TTTGGCAAAG AATTGGATCC GCGGCCGCAG 1141 CTTGGTACCG CCACCATGAC CATCACTTAC ACAAGCCAAG TGGCTAATGC CCGCTTAGGC 1201 TCCTTCTCCC GCCTGCTGCT GTGCTGGCGG GGCAGCATCT ACAAGCTGCT ATATGGCGAG 1261 TTCTTAATCT TCCTGCTCTG CTACTACATC ATCCGCTTTA TTTATAGGCT GGCCCTCACG 1321 GAAGAACAAC AGCTGATGTT TGAGAAACTG ACTCTGTATT GCGACAGTTA CATCCAGCTC 1381 ATCCCCATTT CCTTCGTGCT GGGCTTCTAC GTGACGCTGG TCGTGACCCG CTGGTGGAAC 1441 CAGTACGAGA ACCTGCCGTG GCCCGACCGC CTCATGAGCC TGGTGTCGGG CTTCGTCGAA 1501 GGCAAGGACG AGCAAGGCCG GCTGCTGCGG CGCACGCTCA TCCGCTACGC CAACCTGGGC 1561 AACGTGCTCA TCCTGCGCAG CGTCAGCACC GCAGTCTACA AGCGCTTCCC CAGCGCCCAG 1621 CACCTGGTGC AAGCAGGCTT TATGACTCCG GCAGAACACA AGCAGTTGGA GAAACTGAGC 1681 CTACCACACA ACATGTTCTG GGTGCCCTGG GTGTGGTTTG CCAACCTGTC AATGAAGGCG 1741 TGGCTTGGAG GTCGAATCCG GGACCCTATC CTGCTCCAGA GCCTGCTGAA CGAGATGAAC 1801 ACCTTGCGTA CTCAGTGTGG ACACCTGTAT GCCTACGACT GGATTAGTAT CCCACTGGTG 1861 TATACACAGG TGGTGACTGT GGCGGTGTAC AGCTTCTTCC TGACTTGTCT AGTTGGGCGG 1921 CAGTTTCTGA ACCCAGCCAA GGCCTACCCT GGCCATGAGC TGGACCTCGT TGTGCCCGETC 1981 TTCACGTTCC TGCAGTTCTT CTTCTATGTT GGCTGGCTGA AGGTGGCAGA GCAGCTCATC 2041 AACCCCTTTG GAGAGGATGA TGATGATTTT GAGACCAACT GGATTGTCGA CAGGAATTTG

2101 CAGGTGTCCC TGTTGGCTGT GGATGAGATG CACCAGGACC TGCCTCGGAT GGAGCCGGAC 2161 ATGTACTGGA ATAAGCCCGA GCCACAGCCC CCCTACACAG CTGCTTCCGC CCAGTTCCGT 2221 CGAGCCTCCT TTATGGGCTC CACCTTCAAC ATCAGCCTGA ACAAAGAGGA GATGGAGTTC 2281 CAGCCCAATC AGGAGGACGA GGAGGATGCT CACGCTGGCA TCATTGGCCG CTTCCTAGGC 2341 CTGCAGTCCC ATGATCACCA TCCTCCCAGG GCAAMACTCAA GGACCAAMACT ACTGTGGCCC 2401 AAGAGGGAAT CCCTTCTCCA CGAGGGCCTG CCCAAAAACC ACAAGGCAGC CAAACAGAAC 2461 GTTAGGGGCC AGGAAGACAA CAAGGCCTGG AAGCTTAAGG CTGTGGACGC CTTCAAGTCT 2521 GCCCCACTGT ATCAGAGGCC AGGCTACTAC AGTGCCCCAC AGACGCCCCT CAGCCCCACT 2581 CCCATGTTCT TCCCCCTAGA ACCATCAGCG CCGTCAAAGC TTCACAGTGT CACAGGCATA 2641 GACACCAAAG ACAAAAGCTT AAAGACTGTG AGTTCTGGGG CCAAGAAMAAG TTTTGAATTG 2701 CTCTCAGAGA GCGATGGGGC CTTGATGGAG CACCCAGAAG TATCTCAAGT GAGGAGGAAA 2761 ACTGTGGAGT TTAACCTGAC GGATATGCCA GAGATCCCCG AAAATCACCT CAAAGAACCT 2821 TTGGAACAAT CACCAACCAA CATACACACT ACACTCAAAG ATCACATGGA TCCTTATTGG 2881 GCCTTGGAAMA ACAGGGATGA AGCACATTCC TAAGAGCTCA AGCTTATCGA TAATCAACCT 2941 CTGGATTACA AAATTTGTGA AAGATTGACT GGTATTCTTA ACTATGTTGC TCCTTTTACG 3001 CTATGTGGAT ACGCTGCTTT AATGCCTTTG TATCATGCTA TTGCTTCCCG TATGGCTTTC 3061 ATTTTCTCCT CCTTGTATAA ATCCTGGTTG CTGTCTCTTT ATGAGGAGTT GTGGCCCGTT 3121 GTCAGGCAAC GTGGCGTGGT GTGCACTGTG TTTGCTGACG CAACCCCCAC TGGTTGGEÇGC 3181 ATTGCCACCA CCTGTCAGCT CCTTTCCGGG ACTTTCGCTT TCCCCCTCCC TATTGCCACG 3241 GCGGAACTCA TCGCCGCCTG CCTTGCCCGC TGCTGGACAG GGGCTCGGCT GTTGGGCACT 3301 GACAATTCCG TGGTGTTGTC GGGGAAMATCA TCGTCCTTTC CTTGGCTGCT CGCCTGTGTT 3361 GCCACCTGGA TTCTGCGCGG GACGTCCTTC TGCTACGTCC CTTCGGCCCT CAATCCAGCG 3421 GACCTTCCTT CCCGCGGCCT GCTGCCGGCT CTGCGGCCTC TTCCGCGTCT TCGCCTTCGC 3481 CCTCAGACGA GTCGGATCTC CCTTTGGGCC GCCTCCCCGC ATCGATACCG TCGACTCGCT 3541 GATCAGCCTC GACTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCETEC 3601 CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAMAAT GAGGAAATTG 3661 CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGECTEGEG CAGGACAGCA 3721 AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGCTT 3781 CTGAGGCGGA AAGAACCAGC TGGGGCTCGA CTAGAGCATG GCTACGTAGA TAAGTAGCAT 3841 GGCGGGTTAA TCATTAACTA CAAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC TCCCTCTCTG 3901 CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG CCCGACGCCC GEGCEGCCTC 3961 AGTGAGCGAG CGAGCGCGCA GAGCTTTTTG CAAAAGCCTA GGCCTCCAAA AAAGCCTCCT 4021 CACTACTTCT GGAATAGCTC AGAGGCCGAG GCGGCCTCGG CCTCTGCATA AATAMAAAAA 4081 ATTAGTCAGC CATGGGGCGG AGAATGGGCG GAACTGGGCG GAGTTAGGGG CGGGATEGEC 4141 GGAGTTAGGG GCGGGACTAT GGTTGCTGAC TAATTGAGAT GCATGCTTTG CATACTTCTG 4201 CCTGCTGGGG AGCCTGGGGA CTTTCCACAC CTGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT 4261 TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG GACTTTCCAC ACCCTAACTG ACACACATTC 4321 CACAGCTGCA TTAATGAATC GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT 4381 CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT 4441 CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA 4501 ACATGTGAGC AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGET 4561 TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT 4621 GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC 4681 GCTCTCCTGT TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA 4741 GCGTGGCGCT TTCTCATAGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT

4801 CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCEGCC TTATCCGGTA 4861 ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG 4921 GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC 4981 CTAACTACGG CTACACTAGA AGAACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA 5041 CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG 5101 GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAMAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT 5161 TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG 5221 TCATGAGATT ATCAAAAAGG ATCTTCACCT AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA 5281 AATCAATCTA AAGTATATAT GAGTAAACTT GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG 5341 AGGCACCTAT CTCAGCGATC TGTCTATTTC GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG 5401 TGTAGATAAC TACGATACGG GAGGGCTTAC CATCTGGCCC CAGTGCTGCA ATGATACCGC 5461 GAGACCCACG CTCACCGGCT CCAGATTTAT CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG 5521 AGCGCAGAAG TGGTCCTGCA ACTTTATCCG CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG 5581 AAGCTAGAGT AAGTAGTTCG CCAGTTAATA GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTACAG 5641 GCATCGTGGT GTCACGCTCG TCGTTTGGTA TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT 5701 CAAGGCGAGT TACATGATCC CCCATGTTGT GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC 5761 CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC 5821 ATAATTCTCT TACTGTCATG CCATCCGTAA GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA 5881 CCAAGTCATT CTGAGAATAG TGTATGCGGC GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAATAC 5941 GGGATAATAC CGCGCCACAT AGCAGAACTT TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT 6001 CGGGGCGAAA ACTCTCAAGG ATCTTACCGC TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC 6061 GTGCACCCAA CTGATCTTCA GCATCTTTTA CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA 6121 CAGGAAGGCA AAATGCCGCA AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA 6181 TACTCTTCCT TTTTCAATAT TATTGAAGCA TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT 6241 ACATATTTGA ATGTATTTAG AAAAATAAAC AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA 6301 AAGTGCCACC TGACGTCTAA GAAACCATTA TTATCATGAC ATTAACCTAT AAAAATAGGC 6361 GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA 6421 TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC 6481 GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG 6541 AGCAGATTGT ACTGAGAGTG CACCATTCGA CGCTCTCCCT TATGCGACTC CTGCATTAGG 6601 AAGCAGCCCA GTAGTAGGTT GAGGCCGTTG AGCACCGCCG CCGCAAGGAA TGGTGCATGC 6661 AAGGAGATGG CGCCCAACAG TCCCCCGGCC ACGGGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA 6721 CAAGCGCTCA TGAGCCCGAA GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA 6781 TAGGCGCCAG CAACCGCACC TGTGGCGECCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCETAG 6841 AGGATCTGGC TAGCGATGAC CCTGCTGATT GGTTCGCTGA CCATTTCCGG GTGCGGGACG 6901 GCGTTACCAG AAACTCAGAA GGTTCGTCCA ACCAAACCGA CTCTGACGGC AGTTTACGAG 6961 AGAGATGATA GGGTCTGCTT CAGTAAGCCA GATGCTACAC AATTAGGCTT GTACATATTG 7021 TCGTTAGAAC GCGGCTACAA TTAATACATA ACCTTATGTA TCATACACAT ACGATTTAGG 7081 TGACACTATA GAATACACGG AATTAATTC (SEQ Id NO: 15).

Tabela 3. Características da sequência de plasmídeos de CAG.BEST1.WPRE.PA Nome Tipo Mínimo Máximo Comprimento Direção

Nome Tipo Mínimo Máximo Comprimento Direção amp prom promotor 6.223 6.251 29 “reverse” [omeampR [eme ssa fer fer eee [omeBa ame ssa ssa To eee Origem do rep o replicação emo ae Tr e o een certeza Inserção — do Histórico — de | <1133 1.138 >6 nenhuma Edições STR no arqui- vo de sequên- cia ficial LTR 64 183 120 “forward” REP1

[00105] Em algumas modalidades das composições da divulgação, um vetor pode compreender uma sequência que codifica um marca- dor, que pode ser expresso em uma célula quando a célula está in vi- tro ou in vivo. Por exemplo, em um vetor ou sequência de ácido nu- cleico da divulgação, uma sequência que codifica um marcador pode ser usada no lugar de ou pode substituir uma sequência que codifica uma proteína BEST1 da divulgação (por exemplo, uma sequência que compreende uma sequência de codificação de um gene BEST1). Mar- cadores exemplificativos da divulgação incluem, mas não estão limita- dos a, proteínas de fluoróforo, como GFP, YFP ou dsRED, bem como várias tags de epítopo, como FLAG, HA, His ou Myc. O fluoróforo ou tag de epítopo podem ser fundidos à sequência de codificação de BEST1, por exemplo, como uma fusão terminal N ou C, ou podem ser usados no lugar de BEST1 para caracterizar um vetor da divulgação. Usos exemplificativos para um vetor que contém um marcador da di- vulgação incluem, mas não estão limitados a, caracterização da ex- pressão gênica, por exemplo, os níveis de expressão, ou caracteriza- ção da especificidade do tipo de célula de um vetor da divulgação.

[00106] Um vetor exemplificativo da divulgação que compreende um marcador inclui VMD2.GFP.WPRE.pA. Uma sequência de ácido nucleico que codifica um construto de VMD2.GFP.WPRE.pA compre- ende ou consiste em: 1 TAGCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GCCCGGGCAA AGCCCGGGCG TCGGGCEGACE 61 TTTGGTCGCC CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC 121 ACTAGGGGTT CCTTGTAGTT AATGATTAAC CCGCCATGCT ACTTATCTAC GTAGCCATGC 181 TCTAGGTAAMA TTCTGTCATT TTACTAGGGT GATGAAMATTC CCAAGCAACA CCATCCTTTT 241 CAGATAAGGG CACTGAGGCT GAGAGAGGAG CTGAAACCTA CCCGGGGTCA CCACACACAG 301 GTGGCAAGGC TGGGACCAGA AACCAGGACT GTTGACTGCA GCCCGGTATT CATTCTTTCC 361 ATAGCCCACA GGGCTGTCAA AGACCCCAGG GCCTAGTCAG AGGCTCCTCC TTCCTGGAGA 421 GTTCCTGGCA CAGAAGTTGA AGCTCAGCAC AGCCCCCTAA CCCCCAACTC TCTCTGCAAG 481 GCCTCAGGGG TCAGAACACT GGTGGAGCAG ATCCTTTAGC CTCTGGATTT TAGGGCCATG 541 GTAGAGGGGG TGTTGCCCTA AATTCCAGCC CTGGTCTCAG CCCAACACCC TCCAAGAAGA 601 AATTAGAGGG GCCATGGCCA GGCTGTGCTA GCCGTTGCTT CTGAGCAGAT TACAAGAAGG 661 GACTAAGACA AGGACTCCTT TGTGGAGGTC CTGGCTTAGG GAGTCAAGTG ACGGCGGCTC 721 AGCACTCACG TGGGCAGTGC CAGCCTCTAA GAGTGGGCAG GGGCACTGGC CACAGAGTCC 781 CAGGGAGTCC CACCAGCCTA GTCGCCAGAC CGGCACCATG AGCAAGGGCG AGGAACTGTT 841 CACTGGCGTG GTCCCAATTC TCGTGGAACT GGATGGCGAT GTGAATGGGC ACAAATTTTC 901 TGTCAGCGGA GAGGGTGAAG GTGATGCCAC ATACGGAAAG CTCACCCTGA AATTCATCTG 961 CACCACTGGA AAGCTCCCTG TGCCATGGCC AACACTGGTC ACTACCCTGA CCTATGGCGT 1021 GCAGTGCTTT TCCAGATACC CAGACCATAT GAAGCAGCAT GACTTTTTCA AGAGCGCCAT 1081 GCCCGAGGGC TATGTGCAGG AGAGAACCAT CTTITTTCAAA GATGACGGGA ACTACAAGAC 1141 CCGCGCTGAA GTCAAGTTCG AAGGTGACÇAC CCTGGTGAAT AGAATCGAGC TGAAGGGCAT

1201 TGACTTTAAG GAGGATGGAA ACATTCTCGG CCACAAGCTG GAATACAACT ATAACTCCCA 1261 CAATGTGTAC ATCATGGCCG ACAAGCAAAA GAATGGCATC AAGGTCAACT TCAAGATCAG 1321 ACACAACATT GAGGATGGAT CCGTGCAGCT GGCCGACCAT TATCAACAGA ACACTCCAAT 1381 CGGCGACGGC CCTGTGCTCC TCCCAGACAA CCATTACCTG TCCACCCAGT CTGCCCTGTC 1441 TAAAGATCCC AACGAAAAGA GAGACCACAT GGTCCTGCTG GAGTTTGTGA CCGCTGCTGG 1501 GATCACACAT GGCATGGACG AGCTGTACAA GTGAAAGCTT ATCGATAATC AACCTCTGGA 1561 TTACAAMAATT TGTGAAAGAT TGACTGGTAT TCTTAACTAT GTTGCTCCTT TTACGCTATG 1621 TGGATACGCT GCTTTAATGC CTTTGTATCA TGCTATTGCT TCCCGTATGG CTTTCATTTT 1681 CTCCTCCTTG TATAMATCCT GGTTGCTGTC TCTTTATGAG GAGTTGTGGC CCGTTGTCAG 1741 GCAACGTGGC GTGGTGTGCA CTGTGTTTGC TGACGCAACC CCCACTGGTT GGGGCATTGC 1801 CACCACCTGT CAGCTCCTTT CCGGGACTTT CGCTTTCCCC CTCCCTATTG CCACGGCGGA 1861 ACTCATCGCC GCCTGCCTTG CCCGCTGCTG GACAGGGGCT CGGCTGTTGG GCACTGACAA 1921 TTCCGTGGTG TTGTCGGGGA AATCATCGTC CTTTCCTTGG CTGCTCGCCT GTGTTGCCAC 1981 CTGGATTCTG CGCGGGACGT CCTTCTGCTA CGTCCCTTCG GCCCTCAATC CAGCGGACCT 2041 TCCTTCCCGC GGCCTGCTGC CGGCTCTGCG GCCTCTTCCG CGTCTTCGCC TTCGCCCTCA 2101 GACGAGTCGG ATCTCCCTTT GGGCCGCCTC CCCGGCEGCC GCGCACCGTC GACTCGCTGA 2161 TCAGCCTCGA CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC CCCCGTECCT 2221 TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA 2281 TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GEGTGGGGCA GGACAGCAAG 2341 GGGGAGGATT GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGCTTCT 2401 GAGGCGGAAMA GAACCAGCTG GGGCTCGACT AGAGCATGGC TACGTAGATA AGTAGCATGG 2461 CGGGTTAATC ATTAACTACA AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG 2521 CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCGECCTCAG 2581 TGAGCGAGCG AGCGCGCAGA GCTTTTTGCA AAAGCCTAGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA 2641 CTACTTCTGG AATAGCTCAG AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT 2701 TAGTCAGCCA TGGGGCGGAG AATGGGCGGA ACTGGGCGGA GTTAGGGGCG GGATGGGCEG 2761 AGTTAGGGGC GGGACTATGG TTGCTGACTA ATTGAGATGC ATGCTTTGCA TACTTCTGCC 2821 TGCTGGGGAG CCTGGGGACT TTCCACACCT GGTTGCTGAC TAATTGAGAT GCATGCTTTG 2881 CATACTTCTG CCTGCTGGGG AGCCTGGGGA CTTTCCACAC CCTAACTGAC ACACATTCCA 2941 CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT 3001 TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA 3061 GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC 3121 ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT 3181 TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 3241 CGAAMACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCEC 3301 TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC 3361 GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC 3421 AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC 3481 TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT 3541 AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT 3601 AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC 3661 TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT 3721 TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAMAAMAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG 3781 ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAMAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC 3841 ATGAGATTAT CAAAAMAGGAT CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA

3901 TCAATCTAAMA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG 3961 GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCTGCAAACC 4021 ACGTTGTGTC TCAAAMATCTC TGATGTTACA TTGCACAAGA TAAAAATATA TCATCATGAA 4081 CAATAAAACT GTCTGCTTAC ATAAACAGTA ATACAAGGGG TGTTATGAGC CATATTCAAC 4141 GGGAAACGTC TTGCTCGAGG CCGCGATTAA ATTCCAACAT GGATGCTGAT TTATATGGGT 4201 ATAMRATGGGC TCGCGATAAT GTCGGGCAAT CAGGTGCGAC AATCTATCGA TTGTATGGGA 4261 AGCCCGATGC GCCAGAGTTG TTTCTGAAAC ATGGCAAAGG TAGCGTTGCC AATGATGTTA 4321 CAGATGAGAT GGTCAGACTA AACTGGCTGA CGGAATTTAT GCCTCTTCCG ACCATCAAGC 4381 ATTTTATCCG TACTCCTGAT GATGCATGGT TACTCACCAC TGCGATCCCC GGGAAAACAG 4441 CATTCCAGGT ATTAGAAGAA TATCCTGATT CAGGTGAAAA TATTGTTGAT GCGCTGGCAG 4501 TGTTCCTGCG CCGGTTGCAT TCGATTCCTG TTTGTAATTG TCCTTTTAAC AGCGATCGCG 4561 TATTTCGTCT CGCTCAGGCG CAATCACGAA TGAATAACGG TTTGGTTGAT GCGAGTGATT 4621 TTGATGACGA GCGTAATGGC TGGCCTGTTG AACAAGTCTG GAAAGAAMATG CATAAGCTTT 4681 TGCCATTCTC ACCGGATTCA GTCGTCACTC ATGGTGATTT CTCACTTGAT AACCTTATTT 4741 TTGACGAGGG GAAATTAATA GGTTGTATTG ATGTTGGACG AGTCGGAATC GCAGACCGAT 4801 ACCAGGATCT TGCCATCCTA TGGAACTGCC TCGGTGAGTT TTCTCCTTCA TTACAGAAAC 4861 GGCTTTTTCA AAAATATGGT ATTGATAATC CTGATATGAA TAAATTGCAG TTTCATTTGA 4921 TGCTCGATGA GTTTTTCTAA GGGCGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA CAAGCGCTCA 4981 TGAGCCCGAA GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA TAGGCGCCAG 5041 CAACCGCACC TGTGGCGCCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCGTAG AGGATCTGGC 5101 TAGCGATGAC CCTGCTGATT GGTTCGCTGA CCATTTCCGG GTGCGGGACG GCGTTACCAG 5161 AAACTCAGAA GGTTCGTCCA ACCAAACCGA CTCTGACGGC AGTTTACGAG AGAGATGATA 5221 GGGTCTGCTT CAGGGTGACC GATGTAACCA TATACTTAGG CTGGATCTTC TCCCGCGAAT 5281 TTTAACCCTC ACCAACTACG AGATATGAGG TAAGCCAAAA AAGCACGTAG TGGCGCTCTC 5341 CGACTGTTCC CAAATTGTAA CTTATCGTTC CGTGAAGGCC AGAGTTACTT CCCGGCCCTT 5401 TCCATGCGCG CACCATACCC TCCTAGTTCC CCGGTTATCT TTCCGAAGTG GGAGTGAGCG 5461 AACCTCCGTT TACGTCTTGT TACCAATGAT GTAGCTATGC ACTTTGTACA GGGTGCCAAC 5521 GGGTTTCACA ATTCACAGAT AGTGGGGATC CCGGCAAAGG GCCTATATTT GCGGTCCAAC 5581 TTAGGCGTAA ACCTCGATGC TACCTACTCA GACCCACCTC GCGCGGGGTA AATAAGGCAC 5641 TCATCCCAGC TGGTTCTTGG CGTTCTACGC AGCGACATGT TTATTAACAG TTGTCTGGCA 5701 GCACAAMAACT TTTACCATGG TCGTAGAAGC CCCCCAGAGT TAGTTCATAC CTAATGCCAC 5761 AAATGTGACA GGACGCCGAT GGGTACCGGA CTTTAGGTCG AGCACAGTTC GGTAACGGAG 5821 AGACCCTGCG GCGTACTTCA TTATGTATAT GGAACGTGCC CAAGTGACGC CAGGCAAGTC 5881 TCAGCTGGTT CCTGTGTTAG CTCGAGGGTA GACATACGAG CTGATTGAAC ATGGGTTGGG 5941 GGCCTCGAAC CGTCGAGGAC CCCATAGTAC CTCGGAGACC AAGTAGGGCA GCCTATAGTT 6001 TGAAGCAGAA CTATTTCGGG GGGCGAGCCC TCATCGTCTC TTCTGCGGAT GACTCAACAC 6061 GCTAGGGACG TGAAGTCGAT TCCTTCGATG GTTATAAMATC AAAGACTCAG AGTGCTGTCT 6121 GGAGCGTGAA TCTAACGGTA CGTATCTCGA TTGCTCGGTC GCTTTTCGCA CTCCGCGAAA 6181 GTTCGTACCG CTCATTCACT AGGTTGCGAA GCCTATGCTG ATATATGAAT CCAAACTAGA 6241 GCAGGGCTCT TAAGATTCGG AGTTGTAAAT ACTTAATACT CCAATCGGCT TTTACGTGCA 6301 CCACCGCGGG CGGCTGACAA GGGTCTCACA TCGAGAAMACA AGACAGTTCC GGGCTGGAAG 6361 TAGCGCCGGC TAAGGAAGAC GCCTGGTACG GCAGGACTAT GAMACCAGTA CAAAGGCAAC 6421 ATCCTCACTT GGGTGAACGG AAMACGCAGTA TTATGGTTAC TTTTTGGATA CGTGAAACAT 6481 ATCCCATGGT AGTCCTTAGA CTTGGGAGTC TATCACCCCT AGGGCCCATA TCTGGAAATA 6541 GACGCCAGGT TGAATCCGTA TTTGGAGGTA CGATGGAACA GTCTGGGTGG GACGTGCTTC

6601 ATTTATACCC TGCGCAGGCT GGACCGAGGA CCGCAAGGTG CGGCGGTGCA CAAGCAATTG 6661 ACAACTAACC ACCGTGTATT CATTATGGTA CCAGGAACTT TAAGCCGAGT CAATGAAGCT 6721 CGCATTACAG TGTTTACCGC ATCTTGCCGT TACTCACAAA CTGTGATCCA CCACAAGTCA 6781 AGCCATTGCC TCTCTGACAC GCCGTAAGAA TTAATATGTA AACTTTGCGC GGGTTGACTG 6841 CGATCCGTTC AGTCTCGTCC GAGGGCACAA TCCTATTCCC ATTTGTATGT TCAGCTAACT 6901 TCTACCCATC CCCCGAAGTT AAGTAGGTCG TGAGATGCCA TGGAGGCTCT CGTTCATCCC 6961 GTGGGACATC AAGCTTCCCC TTGATAMAGC ACCCCGCTCG GGTGTAGCAG AGAAGACGCC 7021 TTCTGAATTG TGCAATCCCT CCACCTTATC TAAGCTTGCT ACCAATAATT AGCATTTTITG 7081 CCTTGCGACA GACCTCCTAC TTAGATTGCC ACACATTGAG CTAGTCAGTG AGCGATAAGC 7141 TTGACGCGCT TTCAAGGGTC GCGAGTACGT GAACTAAGGC TCCGGACAGG ACTATATACT 7201 TGGGTTTGAT CTCGCCCCGA CAACTGCAAMA CCTCAACTTT TTTAGATTAT ATGGTTAGCC 7261 GAAGTTGCAC GAGGTGGCGT CCGCGGACTG CTCCCCGAGT GTGGCTCTTT CATCTGACAA 7321 CGTGCAACCC CTATCGCGGC CGATTGTTTC TGCGGACGAT GTTGTCCTCA TAGTTTGGGC 7381 ATGTTTCCCT TGTAGGTGTG AAMACCACTTA GCTTCGCGCC GTAGTCCCAA TGAAAAACCT 7441 ATGGACTTTG TTTTGGGTAG CACCAGGAAT CTGAACCGTG TGAATGTGGA CGTCGCGCGC 7501 GTAGACCTTT ATCTCCGGTT CAAGCTAGGG ATGTGGCTGC ATGCTACGTT GTCACACCTA 7561 CACTGCTCGA AGTAAMATATG CGAAGCGCGC GGCCTGGCCG GAGGCGTTCC GCGCCGCCAC 7621 GTGTTCGTTA ACTGTTGATT GGTGGCACAT AAGCAATATC GTAGTCCGTC AMATTCAGCT 7681 CTGTTATCCC GGGCGTTATG TGTCAMATGG CGTAGAACGG GATTGACTGT TTGACGGTAG 7741 GGTGACCTAA GCCAGATGCT ACACAATTAG GCTTGTACAT ATTGTCGITA GAACGCGGCT 7801 ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT TAGGTGACAC TATAGAATAC 7861 ACGGAATTAA TTC (SEQ ID NO: 16).

Tabela 4.Características da sequência de plasmídeos de VMD2.GFP.WPRE.pA Nome Tipo Mínimo Máximo Comprimento Direção Sequência *stuffer gerada aleatoria- | Stuffer 5.241 7.740 2.500 nenhuma mente Lana O met fer dar Je Je rep origin 3.165 3.784 620 “reverse” pBR322 Fe Tr e er

EA LL promotor 189 811 623 “forward” 585 a +38

[00107] Um vetor exemplificativo da divulgação que compreende um marcador inclui VMD.IntEx.GFP.WPRE.pA.

Uma sequência de ácido nucleico que codifica um construto de VMD.IntEx.GFP.WPRE.pA compreende ou consiste em: 1 TAGCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GCCCGGGCAA AGCCCGGGCG TCGGGCEGACE 61 TTTGGTCGCC CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC 121 ACTAGGGGTT CCTTGTAGTT AATGATTAAC CCGCCATGCT ACTTATCTAC GTAGCCATGC 181 TCTAGGTAAA TTCTGTCATT TTACTAGGGT GATGAAATTC CCAAGCAACÇA CCATCCTTTT 241 CAGATAAGGG CACTGAGGCT GAGAGAGGAG CTGAAACCTA CCCGGGGTCA CCACACACAG 301 GTGGCAAGGC TGGGACCAGA AACCAGGACT GTTGACTGCA GCCCGGTATT CATTCTTTCC 361 ATAGCCCACA GGGCTGTCAA AGACCCCAGG GCCTAGTCAG AGGCTCCTCC TTCCTGGAGA 421 GTTCCTGGCA CAGAAGTTGA AGCTCAGCAC AGCCCCCTAA CCCCCAACTC TCTCTGCAAG 481 GCCTCAGGGG TCAGAACACT GGTGGAGCAG ATCCTTTAGC CTCTGGATTT TAGGGCCATG 541 GTAGAGGGGG TGTTGCCCTA AATTCCAGCC CTGGTCTCAG CCCAACACCC TCCAAGAAGA 601 AATTAGAGGG GCCATGGCCA GGCTGTGCTA GCCGTTGCTT CTGAGCAGAT TACAAGAAGG 661 GACTAAGACA AGGACTCCTT TGTGGAGGTC CTGGCTTAGG GAGTCAAGTG ACGGCGGCTC 721 AGCACTCACG TGGGCAGTGC CAGCCTCTAA GAGTGGGCAG GGGCACTGGC CACAGAGTCC 781 CAGGGAGTCC CACCAGCCTA GTCGCCAGAC CGGGTGCCGC AGGGGGACEG CTGCCTTCGG 841 GGGGGACGGG GCAGGGCGGG GTTCGGCTTC TGGCGTETÇSGA CCGGCEGCTC TAGAGCCTCT 901 GCTAACCATG TTCATGCCTT CTTCTTTTTC CTACAGCTCC TGGGCAACGT GCTGGTTATT 961 GTGCTGTCTC ATCATTTTGG CAAAGAATTG GCACCATGAG CAAGGGCGAG GAACTGTTCA 1021 CTGGCGTGGT CCCAATTCTC GTGGAACTGG ATGGCGATGT GAATGGGCAC AAATTTTCTG 1081 TCAGCGGAGA GGGTGAAGGT GATGCCACAT ACGGAAMAGCT CACCCTGAAA TTCATCTGCA 1141 CCACTGGAAA GCTCCCTGTG CCATGGCCAA CACTGGTCAC TACCCTGACC TATGGCGTGC 1201 AGTGCTTTTC CAGATACCCA GACCATATGA AGCAGCATGA CTTTTTCAAG AGCGCCATGC 1261 CCGAGGGCTA TGTGCAGGAG AGAACCATCT TTTTCAAAGA TGACGGGAAC TACAAGACCC 1321 GCGCTGAAGT CAAGTTCGAA GGTGACACCC TGGTGAATAG AATCGAGCTG AAGGGCATTG 1381 ACTTTAAGGA GGATGGAAAC ATTCTCGGCC ACAAGCTGGA ATACAACTAT AACTCCCACA 1441 ATGTGTACAT CATGGCCGAC AAGCAAAAGA ATGGCATCAA GGTCAACTTC AAGATCAGAC 1501 ACAACATTGA GGATGGATCC GTGCAGCTGG CCGACCATTA TCAACAGAAC ACTCCAATCG 1561 GCGACGGCCC TGTGCTCCTC CCAGACAACC ATTACCTGTC CACCCAGTCT GCCCTGTCTA 1621 AAGATCCCAA CGAAAAGAGA GACCACATGG TCCTGCTGGA GTTTGTGACC GCTGCTGGGA 1681 TCACACATGG CATGGACGAG CTGTACAAGT GAAAGCTTAT CGATAATCAA CCTCTGGATT 1741 ACAAAATTTG TGAAAGATTG ACTGGTATTC TTAACTATGT TGCTCCTTTT ACGCTATGTG 1801 GATACGCTGC TTTAATGCCT TTGTATCATG CTATTGCTTC CCGTATGGCT TTCATTTTCT 1861 CCTCCTTGTA TAAATCCTGG TTGCTGTCTC TTTATGAGGA GTTGTGGCCC GTTGTCAGGC 1921 AACGTGGCGT GGTGTGCACT GTGTTTGCTG ACGCAACCCC CACTGGTTGG GGCATTGCCA 1981 CCACCTGTCA GCTCCTTTCC GGGACTTTCG CTTTCCCCCT CCCTATTGCC ACGGCGGAAC 2041 TCATCGCCGC CTGCCTTGCC CGCTGCTGGA CAGGGGCTCG GCTGTTGGGC ACTGACAATT 2101 CCGTGGTGTT GTCGGGGAAA TCATCGTCCT TTCCTTGGCT GCTCGCCTGT GTTGCCACCT 2161 GGATTCTGCG CGGGACGTCC TTCTGCTACG TCCCTTCGGC CCTCAATCCA GCGGACCTTC 2221 CTTCCCGCGG CCTGCTGCCG GCTCTGCGGC CTCTTCCGCG TCTTCGCCTT CGCCCTCAGA 2281 CGAGTCGGAT CTCCCTTTGG GCCGCCTCCC CGGCGECCGCE GCACCGTCGA CTCGCTGATC 2341 AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC

2401 CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA TAAAATGAGG AAATTGCATC 2461 GCATTGTCTG AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGECTEGGE GTGEGECAGE ACAGCAAGGEG 2521 GGAGGATTGG GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGATGCG GTGGGCTCTA TGGCTTCTGA 2581 GGCGGAAAGA ACCAGCTGGG GCTCGACTAG AGCATGGCTA CGTAGATAAG TAGCATGGCG 2641 GGTTAATCAT TAACTACAAG GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG 2701 CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGEC GGCCTCAGTG 2761 AGCGAGCGAG CGCGCAGAGC TTTTTGCAAA AGCCTAGGCC TCCAAAAAAG CCTCCTCACT 2821 ACTTCTGGAA TAGCTCAGAG GCCGAGGCGG CCTCGGCCTC TGCATAAMATA AAAAAAATTA 2881 GTCAGCCATG GGGCGGAGAA TGGGCGGAAC TGGGCGGAGT TAGGGGCGGG ATGGECEGAG 2941 TTAGGGGCGG GACTATGGTT GCTGACTAAT TGAGATGCAT GCTTTGCATA CTTCTGCCTG 3001 CTGGGGAGCC TGGGGACTTT CCACACCTGG TTGCTGACTA ATTGAGATGC ATGCTTTGCA 3061 TACTTCTGCC TGCTGGGGAG CCTGGGGACT TTCCACACCC TAACTGACAC ACATTCCACA 3121 GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT TTGCGTATTG GGCGCTCTTC 3181 CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG CGGTATCAGC 3241 TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG GATAACGCAG GAAAGAACAT 3301 GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT 3361 CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG 3421 AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC 3481 TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGGAAGCGET 3541 GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA 3601 GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA 3661 TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA 3721 CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA 3781 CTACGGCTAC ACTAGAAGAA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC CAGTTACCTT 3841 CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT 3901 TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT 3961 CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAMAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT 4021 GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC 4081 AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA TCAGTGAGGC 4141 ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT GCCTGACTCC TGCAAMACCAC 4201 GTTGTGTCTC AAAATCTCTG ATGTTACATT GCACAAGATA AAAATATATC ATCATGAACA 4261 ATAMAACTGT CTGCTTACAT AAACAGTAAT ACAAGGGGTG TTATGAGCCA TATTCAACGG 4321 GAAACGTCTT GCTCGAGGCC GCGATTAAAT TCCAACATGG ATGCTGATTT ATATGGGTAT 4381 AAATGGGCTC GCGATAATGT CGGGCAATCA GGTGCGACAA TCTATCGATT GTATGGGAAG 4441 CCCGATGCGC CAGAGTTGTT TCTGAAMACAT GGCAAAGGTA GCGTTGCCAA TGATGTTACA 4501 GATGAGATGG TCAGACTAAA CTGGCTGACG GAATTTATGC CTCTTCCGAC CATCAAGCAT 4561 TTTATCCGTA CTCCTGATGA TGCATGGTTA CTCACCACTG CGATCCCCGG GAAAACAGCA 4621 TTCCAGGTAT TAGAAGAATA TCCTGATTCA GGTGAAMAATA TTGTTGATGC GCTGGCAGTG 4681 TTCCTGCGCC GGTTGCATTC GATTCCTGTT TGTAATTGTC CTTTTAACAG CGATCGCGTA 4741 TTTCGTCTCG CTCAGGCGCA ATCACGAATG AATAACGGTT TGGTTGATGC GAGTGATTTT 4801 GATGACGAGC GTAATGGCTG GCCTGTTGAA CAAGTCTGGA AAGAAATGCA TAAGCTTTTG 4861 CCATTCTCAC CGGATTCAGT CGTCACTCAT GGTGATTTCT CACTTGATAA CCTTATTTTT 4921 GACGAGGGGA AATTAATAGG TTGTATTGAT GTTGGACGAG TCGGAATCGC AGACCGATAC 4981 CAGGATCTTG CCATCCTATG GAACTGCCTC GGTGAGTTTT CTCCTTCATT ACAGAAACGG 5041 CTTTTTCAMA AATATGGTAT TGATAATCCT GATATGAATA AATTGCAGTT TCATTTGATG

5101 CTCGATGAGT TTTTCTAAGG GCGGCCTGCC ACCATACCCA CGCCGAAACA AGCGCTCATG 5161 AGCCCGAAGT GGCGAGCCCG ATCTTCCCCA TCGGTGATGT CGGCGATATA GGCGCCAGCA 5221 ACCGCACCTG TGGCGCCGGT GATGCCGGCC ACGATGCGTC CGGCGTAGAG GATCTGGCTA 5281 GCGATGACCC TGCTGATTGG TTCGCTGACC ATTTCCGGGT GCGGGACGGC GTTACCAGAA 5341 ACTCAGAAGG TTCGTCCAAC CAAMACCGACT CTGACGGCAG TTTACGAGAG AGATGATAGG 5401 GTCTGCTTCA GGGTGACCGA TGTAACCATA TACTTAGGCT GGATCTTCTC CCGCGAATTT 5461 TAACCCTCAC CAACTACGAG ATATGAGGTA AGCCAAMAAAA GCACGTAGTG GCGCTCTCCG 5521 ACTGTTCCCA AATTGTAACT TATCGTTCCG TGAAGGCCAG AGTTACTTCC CGGCCCTTTC 5581 CATGCGCGCA CCATACCCTC CTAGTTCCCC GGTTATCTTT CCGAAGTGGG AGTGAGCGAA 5641 CCTCCGTTTA CGTCTTGTTA CCAATGATGT AGCTATGCAC TTTGTACAGG GTGCCAACGG 5701 GTTTCACAAT TCACAGATAG TGGGGATCCC GGCAAAGGGC CTATATTTGC GGTCCAACTT 5761 AGGCGTAAMAC CTCGATGCTA CCTACTCAGA CCCACCTCGC GCGGGGTAAA TAAGGCACTC 5821 ATCCCAGCTG GTTCTTGGCG TTCTACGCAG CGACATGTTT ATTAACAGTT GTCTGGCAGC 5881 ACAAMAACTTT TACCATGGTC GTAGAAGCCC CCCAGAGTTA GTTCATACCT AATGCCACAA 5941 ATGTGACAGG ACGCCGATGG GTACCGGACT TTAGGTCGAG CACAGTTCGG TAACGGAGAG 6001 ACCCTGCGGC GTACTTCATT ATGTATATGG AACGTGCCCA AGTGACGCCA GGCAAGTCTC 6061 AGCTGGTTCC TGTGTTAGCT CGAGGGTAGA CATACGAGCT GATTGAACAT GGGTTGGGGG 6121 CCTCGAACCG TCGAGGACCC CATAGTACCT CGGAGACCAA GTAGGGCAGC CTATAGTTTG 6181 AAGCAGAACT ATTTCGGGGG GCGAGCCCTC ATCGTCTCTT CTGCGGATGA CTCAACACGC 6241 TAGGGACGTG AAGTCGATTC CTTCGATGGT TATAAATCAA AGACTCAGAG TGCTGTCTGG 6301 AGCGTGAATC TAACGGTACG TATCTCGATT GCTCGGTCGC TTTTCGCACT CCGCGAAAGT 6361 TCGTACCGCT CATTCACTAG GTTGCGAAGC CTATGCTGAT ATATGAATCC AAACTAGAGC 6421 AGGGCTCTTA AGATTCGGAG TTGTAAMATAC TTAATACTCC AATCGGCTTT TACGTGCACC 6481 ACCGCGGGCG GCTGACAAGG GTCTCACATC GAGAAACAAG ACAGTTCCGG GCTGGAAGTA 6541 GCGCCGGCTA AGGAAGACGC CTGGTACGGC AGGACTATGA AACCAGTACA AAGGCAACAT 6601 CCTCACTTGG GTGAACGGAA ACGCAGTATT ATGGTTACTT TTTGGATACG TGAAMACATAT 6661 CCCATGGTAG TCCTTAGACT TGGGAGTCTA TCACCCCTAG GGCCCATATC TGGAAATAGA 6721 CGCCAGGTTG AATCCGTATT TGGAGGTACG ATGGAACAGT CTGGGTGGGA CGTGCTTCAT 6781 TTATACCCTG CGCAGGCTGG ACCGAGGACC GCAAGGTGCG GCGGTGCACA AGCAATTGAC 6841 AACTAACCAC CGTGTATTCA TTATGGTACC AGGAACTTTA AGCCGAGTCA ATGAAGCTCG 6901 CATTACAGTG TTTACCGCAT CTTGCCGTTA CTCACAMACT GTGATCCACC ACAAGTCAAG 6961 CCATTGCCTC TCTGACACGC CGTAAGAATT AATATGTAAA CTTTGCGCGG GTTGACTGCG 7021 ATCCGTTCAG TCTCGTCCGA GGGCACAATC CTATTCCCAT TTGTATGTTC AGCTAACTTC 7081 TACCCATCCC CCGAAGTTAA GTAGGTCGTG AGATGCCATG GAGGCTCTCG TTCATCCCGT 7141 GGGACATCAA GCTTCCCCTT GATAAAGCAC CCCGCTCGGG TGTAGCAGAG AAGACGCCTT 7201 CTGAATTGTG CAATCCCTCC ACCTTATCTA AGCTTGCTAC CAATAATTAG CATTTTTGCC 7261 TTGCGACAGA CCTCCTACTT AGATTGCCAC ACATTGAGCT AGTCAGTGAG CGATAAGCTT 7321 GACGCGCTTT CAAGGGTCGC GAGTACGTGA ACTAAGGCTC CGGACAGGAC TATATACTTG 7381 GGTTTGATCT CGCCCCGACA ACTGCAAACC TCAACTTTTT TAGATTATAT GGTTAGCCGA 7441 AGTTGCACGA GGTGGCGTCC GCGGACTGCT CCCCGAGTGT GGCTCTTTCA TCTGACAACG 7501 TGCAACCCCT ATCGCGGCCG ATTGTTTCTG CGGACGATGT TGTCCTCATA GTTTGGGCAT 7561 GTTTCCCTTG TAGGTGTGAA ACCACTTAGC TTCGCGCCGT AGTCCCAATG AAAAACCTAT 7621 GGACTTTGTT TTGGGTAGCA CCAGGAATCT GAACCGTGTG AATGTGGACG TCGCGCECET 7681 AGACCTTTAT CTCCGGTTCA AGCTAGGGAT GTGGCTGCAT GCTACGTTGT CACACCTACA 7741 CTGCTCGAAG TAAATATGCG AAGCGCGCGG CCTGGCCGGA GGCETTCCGCE GCCGCCACGET

7801 GTTCGTTAAC TGTTGATTGG TGGCACATAA GCAATATCGT AGTCCGTCAA ATTCAGCTCT 7861 GTTATCCCGG GCGTTATGTG TCAAATGGCG TAGAACGGGA TTGACTGTTT GACGGTAGGG 7921 TGACCTAAGC CAGATGCTAC ACAATTAGGC TTGTACATAT TGTCGTTAGA ACGCGGCTAC 7981 AATTAATACA TAACCTTATG TATCATACAC ATACGATTTA GGTGACACTA TAGAATACAC 8041 GGAATTAATT C (SEQ ID NO: 17). Tabela 5. Características da sequência de plasmídeos de VMD?2.IntEx.GFP.WPRE.pA Nome Tipo Mínimo Máximo — Comprimento Direção Sequência stuffer gerada aleatoriamen- | Stuffer 5.419 7.918 2.500 nenhuma te Origem do rep s rep origin 3.343 3.962 620 “reverse” pBR322 en ve as 25 BR see [o me rm ese es eso e Ts Tese Promotor VMD2 -585 promotor 189 811 623 “forward” a +38

ATA Partículas de AAV

[00108] Os vetores de AAV da divulgação contêm um genoma de AAV que foi derivatizado para o propósito de administração a pacien- tes. Tal derivatização é padrão na técnica, e a invenção abrange o uso de qualquer derivado conhecido de um genoma de AAV e derivados que podem ser gerados pela aplicação de procedimentos conhecidos na técnica. A derivatização do genoma de AAV e do capsídeo de AAV são revisados em Coura e Nardi (2007) Virology Journal 4: 99 e em Choi et al. e Wu et al., referenciados acima.

[00109] Derivados de um genoma de AAV incluem quaisquer for- mas truncadas ou modificadas de um genoma de AAV que permitem a expressão de um transgene de um vetor da invenção in vivo. É possí- vel truncar o genoma de AAV significativamente para incluir uma se-

quência viral mínima, ainda retendo a função acima. Isto é preferível por razões de segurança para reduzir o risco de recombinação do ve- tor com o vírus do tipo selvagem e também para evitar o desencadea- mento de uma resposta imunológica celular pela presença de proteí- nas de gene viral na célula alvo.

[00110] As seguintes porções podem, portanto, ser removidas em um derivado da invenção: uma sequência de repetição terminal inver- tida (ITR), os genes de replicação (rep) e de capsídeo (cap). No entan- to, em algumas modalidades, os derivados podem adicionalmente in- cluir um ou mais genes rep e/ou cap ou outras sequências virais de um genoma de AAV. O AAV de ocorrência natural se integra com uma alta frequência em um sítio específico no cromossomo humano 19 e mos- tra uma frequência desprezível de integração aleatória, de modo que a retenção de uma capacidade integrativa no vetor pode ser tolerada em um ambiente terapêutico.

[00111] O genoma de AAV compreende genes de empacotamento, tais como genes rep e/ou cap que codificam funções de empacota- mento para uma partícula de AAV. O gene rep codifica uma ou mais dentre as proteínas Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 ou variantes des- tas. O gene cap codifica uma ou mais proteínas de capsídeo, como VP1, VP2 e VP3 ou variantes destas. Essas proteínas constituem o capsídeo de uma partícula de AAV.

[00112] “Quando um derivado compreende proteínas de capsídeo, isto é, VP1, VP2 e/ou VP3, o derivado pode ser um derivado quiméri- co, embaralhado ou modificado por capsídeo de um ou mais AAVs de ocorrência natural. Em particular, a invenção abrange o fornecimento de sequências de proteínas de capsídeo de diferentes sorotipos, cla- dos, clones ou isolados de AAV dentro do mesmo vetor (isto é, um ve- tor pseudotipado).

[00113] Derivados quiméricos, embaralhados ou modificados por capsídeo são selecionados para fornecer uma ou mais funcionalidades desejadas para o vetor viral. Assim, esses derivados podem apresen- tar maior eficiência de entrega de genes, imunogenicidade (humoral ou celular) reduzida, uma faixa de tropismo alterada e/ou direcionamento aprimorado de um tipo de célula particular em comparação com um vetor de AAV que compreende um genoma de AAV de ocorrência na- tural, como o de AAV2. O aumento da eficiência da entrega de genes pode ser efetuado por meio de um receptor aprimorado ou uma liga- ção de correceptor na superfície da célula, internalização aprimorada, tráfego aprimorado na célula e para o núcleo, desencapsulamento da partícula viral aprimorado e conversão aprimorada de um genoma de fita simples para a forma de fita dupla. A eficiência aumentada também pode estar relacionada a uma faixa de tropismo alterada ou a um dire- cionamento de uma população de células específica, de modo que a dosagem do vetor não seja diluída pela administração em tecidos no quais não é necessária.

[00114] Proteínas de capsídeo quiméricas incluem as geradas por recombinação entre duas ou mais sequências de codificação de cap- sídeo de sorotipos de AAV de ocorrência natural. Isso pode ser reali- zado, por exemplo, por uma abordagem de resgate de marcador em que sequências de capsídeo não infecciosas de um serótipo são co- transfectadas com sequências de capsídeo de um sorotipo diferente, e a seleção dirigida é usada para selecionar sequências de capsídeo com as propriedades desejadas. As sequências de capsídeo dos dife- rentes sorotipos podem ser alteradas por recombinação homóloga dentro da célula para produzir novas proteínas de capsídeo quiméri- cas.

[00115] Proteínas de capsídeo quiméricas também incluem as ge- radas por manipulação de sequências de proteínas de capsídeo para transferir domínios de proteína de capsídeos específicos, loops de su-

perfície ou resíduos de aminoácidos específicos entre duas ou mais proteínas de capsídeo, por exemplo, entre duas ou mais proteínas de capsídeo de diferentes sorotipos.

[00116] As proteínas de capsídeo embaralhadas ou quiméricas também podem ser geradas por embaralhamento de DNA ou por PCR propensa a erros. Genes de capsídeo de AAV híbridos podem ser cri- ados por fragmentação aleatória das sequências de genes de AAV re- lacionados, por exemplo, aqueles que codificam proteínas de capsídeo de vários sorotipos diferentes e, em seguida, remontando subsequen- temente os fragmentos em uma reação de polimerase de autoativa- ção, que também pode causar crossovers em regiões de homologia de sequência. Uma biblioteca de genes de AAV híbridos criados desta maneira através do embaralhamento dos genes de capsídeo de vários sorotipos pode ser triada para identificar clones virais com uma funcio- nalidade desejada. Da mesma forma, a PCR propensa a erros pode ser usada para mutar aleatoriamente os genes de capsídeo de AAV para criar uma biblioteca diversa de variantes que podem então ser selecionadas para uma propriedade desejada.

[00117] As sequências dos genes de capsídeo também podem ser geneticamente modificadas para introduzir deleções, substituições ou inserções específicas em relação à sequência do tipo selvagem nativa. Em particular, os genes de capsídeo podem ser modificados por meio da inserção de uma sequência de uma proteína ou peptídeo não rela- cionados dentro de um quadro de leitura aberto de uma sequência de codificação de capsídeo ou no terminal N e/ou C de uma sequência de codificação de capsídeo. A proteína ou peptídeo não relacionados po- dem ser vantajosamente os que atuam como um ligante para um tipo de célula particular, conferindo assim uma ligação aprimorada a uma célula alvo ou aprimorando a especificidade de direcionamento do ve- tor para uma população de células particular. A proteína não relacio-

nada também pode ser a que auxilia na purificação da partícula viral como parte do processo de produção, isto é, um epítopo ou tag de afi- nidade. O sítio de inserção será selecionado de modo a não interferir com outras funções da partícula viral, por exemplo, internalização, trá- fego da partícula viral. A pessoa versada na técnica pode identificar sítios adequados para inserção com base em seu conhecimento geral comum. Sítios particulares são divulgados em Choi et al., referenciado acima.

[00118] A invenção abrange, adicionalmente, o fornecimento de se- quências de um genoma de AAV em uma ordem e configuração dife- rentes das de um genoma de AAV nativo. A invenção também abrange a substituição de uma ou mais sequências ou genes de AAV por se- quências de outro vírus ou por genes quiméricos compostos por se- quências de mais de um vírus. Tais genes quiméricos podem ser com- postos por sequências de duas ou mais proteínas virais relacionadas de diferentes espécies virais.

[00119] Os vetores de AAV da invenção incluem formas transcapsi- dadas em que um genoma ou derivado de AAV possuindo uma ITR de um sorotipo são empacotados no capsídeo de um sorotipo diferente. Os vetores de AAV da invenção também incluem formas de mosaico em que uma mistura de proteínas de capsídeo não modificadas de dois ou mais sorotipos diferentes constitui o capsídeo viral. Um vetor de AAV também pode incluir formas quimicamente modificadas con- tendo ligantes adsorvidos à superfície do capsídeo. Por exemplo, tais ligantes podem incluir anticorpos para direcionar um determinado re- ceptor de superfície celular.

[00120] Assim, por exemplo, os vetores de AAV da invenção inclu- em os que possuem um genoma de AAV2? e proteínas de capsídeo de AAV2 (AAV2/2), os que possuem um genoma de AAV? e proteínas de capsídeo de AAV5 (AAV2/5) e os que possuem um genoma de AAV2 e proteínas de capsídeo de AAV8 (AAV2/8). Um vetor de AAV da in- venção pode compreender uma proteína de capsídeo de AAV mutan- te. Em uma modalidade, um vetor de AAV da invenção compreende uma proteína de capsídeo de AAV8 mutante. De preferência, a proteí- na do capsídeo de AAV8 mutante é uma proteína de capsídeo Y733F de AAVB.

[00121] Os métodos de preparação de partículas virais de AAV da divulgação serão conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Um método exemplificativo, mas não limitativo, de preparação de partícu- las virais de AAV da divulgação é descrito abaixo. Para a geração de um determinado vetor de AAV, três plasmídeos são necessários: um compreendendo o vetor de entrega viral que codifica a sequência de ácido nucleico de interesse a ser entregue (ou seja, a sequência de ácido nucleico que codifica BEST1), um plasmídeo que codifica os ge- nes rep e cap, e um terceiro plasmídeo auxiliar que contém os genes adenovirais necessários para a geração de AAV bem-sucedida. Um promotor pode estar operacionalmente ligado a cada um dos genes de empacotamento. Exemplos específicos de tais promotores incluem os promotores p5, p19 e p40 (Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 76: 5567-5571). Por exemplo, os promotores p5 e p19 são, de forma geral, usados para expressar o gene rep, enquanto o promotor p40 é, de forma geral, usado para expressar o gene cap. Os plasmí- deos são usados para transfectar células adequadas que são capazes de replicar o vetor viral de AAV, transcrever e traduzir a proteína de AAV e empacotar o vetor viral de AAV em uma partícula viral de AAV. Células adequadas exemplificativas compreendem células HEK293. Após a transfecção, as células são coletadas e lisadas. As partículas de AAV podem então ser purificadas a partir do lisado por meio de uma variedade de métodos. Alternativamente, as partículas de AAV podem ser purificadas a partir do sobrenadante. Por exemplo, o lisado pode ser tratado com Benzonase e clareado antes de ser aplicado a um gradiente de iodixanol composto de fases de 15%, 25%, 40% e 60%. Os gradientes podem girar a 59.000 rpm por 1 hora e 30 minu- tos, e a fração de 40% é então retirada. Esta fase de AAV pode então ser purificada e concentrada usando uma unidade de filtro Amicon UI- tra-15 100K. Composições Farmacêuticas

[00122] Os vetores de AAV da invenção podem ser formulados co- mo composições farmacêuticas. Estas composições podem compre- ender, além do medicamento, um veículo, diluente, excipiente, tam- pão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente ativo. A natureza preci- sa do veículo ou outro material pode ser determinada pela pessoa ver- sada de acordo com a via de administração, por exemplo, injeção sub- retiniana, retinal direta ou intravítrea.

[00123] A composição farmacêutica pode ser formulada como um líquido. As composições farmacêuticas líquidas podem incluir um veí- culo líquido, tal como água, petróleo, animal ou óleos vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, cloreto de magné- sio, dextrose ou outra solução de sacarídeo, ou glicóis, tais como eti- lenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol, podem ser incluídos. Em alguns casos, um surfactante, tal como ácido plurônico (PF68) a 0,001%, pode ser usado.

[00124] Para injeção no local de aflição, o ingrediente ativo pode estar na forma de uma solução aquosa apirogênica e com pH, isotoni- cidade e estabilidade adequados. A pessoa versada na técnica é bem capaz de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer ou Injeção de Ringer com Lactato. Conservantes, estabilizantes, tam-

pões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos conforme necessário.

[00125] Os tampões podem ter um efeito sobre a estabilidade e bi- ocompeatibilidade dos vetores virais e partículas de vetor da divulgação após armazenamento e passagem através de dispositivos de injeção para terapia gênica de AAV. Em algumas modalidades, os vetores vi- rais e partículas de vetor da divulgação podem ser diluídos em tampão TMN 200 para manter a biocompatibilidade e estabilidade. O tampão TMN 200 compreende 20 mM de Tris (pH ajustado para 8,0), IMM de MgCl2 em 200 mM NaCl.

[00126] A determinação do título do genoma viral físico compreende parte da caracterização do vetor viral ou partícula viral. Em algumas modalidades, a determinação do título do genoma viral físico compre- ende uma etapa para garantir a potência e a segurança de vetores vi- rais e partículas virais durante a terapia gênica. Em algumas modali- dades, um método para determinar o título de AAV compreende PCR quantitativa (QPCR). Existem diversas variáveis que podem influenciar os resultados, como a conformação do DNA utilizado como padrão ou a digestão enzimática durante o preparo da amostra. O vetor viral ou a preparação de partícula cujo título pode ser medidos pode ser compa- rado com uma curva de diluição padrão gerada usando um plasmídeo. Em algumas modalidades, o DNA de plasmídeo usado na curva pa- drão está na conformação superenrolada. Em algumas modalidades, o DNA de plasmídeo usado na curva padrão está na conformação linear. O plasmídeo linearizado pode ser preparado, por exemplo, por diges- tão com a enzima de restrição Hindlll, visualizado por eletroforese em gel de agarose e purificado usando o QIAquick Gel Extraction Kit (Qia- gen) seguindo as instruções do fabricante. Outras enzimas de restri- ção que cortam dentro do plasmídeo usado para gerar a curva padrão também podem ser apropriadas. Em algumas modalidades, o uso de plasmídeo superenrolado como padrão aumentou o título do vetor de AAV em comparação com o uso de plasmídeo linearizado.

[00127] Para extrair o DNA de vetores de AAV purificados para quantificação do título do genoma de AAV, dois métodos enzimáticos podem ser usados. Em algumas modalidades, o vetor de AAV pode ser singularmente digerido com DNase |. Em algumas modalidades, o vetor de AAV pode ser duplamente digerido com DNase | e um trata- mento com proteinase K adicional. A QPCR pode então ser realizada com o CFX Connect Real-Time PCR Detection System (BioRad) usando primers e sonda Tagman específicos para a sequência trans- gênica.

[00128] Para entrega desacelerada, o medicamento pode ser inclu- ído em uma composição farmacêutica que é formulada para entrega lenta, tal como em microcápsulas formadas a partir de polímeros bio- compatíveis ou em sistemas de veículos lipossomais de acordo com métodos conhecidos na técnica. Dosagens

[00129] Tal como utilizado neste documento, o termo "partícula re- sistente a Dnase (DRP)" refere-se a partículas de AAV que são resis- tentes à digestão por Dnase e, portanto, acredita-se serem capazes de encapsular completamente e proteger o vetor de AAV da divulgação da digestão por Dnase. As partículas de AAV também podem ser quantificadas em termos do número total de partículas de genoma (gp) administradas em uma dosagem, ou gp/mL, o número de partículas de genoma por mililitro (mL) de solução. Conforme utilizado neste docu- mento, partícula de genoma (gp) refere-se a partículas de AAV que contêm uma cópia de um vetor de entrega de AAV (ou genoma de AAV) da divulgação. Conforme utilizado neste documento, o termo teor de genoma (GC) por mL refere-se ao número de genomas virais por mL de solução, e pode ser determinado, por exemplo, por qPCR, con-

forme descrito acima. Os termos GC e VG (genomas virais) podem ser usados como sinônimos para caracterizar as dosagens e concentra- ções de AAV da divulgação.

[00130] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são administrados a um sujeito como uma dose única.

[00131] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV podem ser formulados como uma suspensão líquida em que os vetores de AAV são suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composições da divulgação podem compreender vários vetores de AAV a uma concentração de 1- 2x10º, 1-2x10%º, 1-2x10%, 1-2x107? ou 1-2x10? partículas de genoma (gp) por mL. Em algumas modalidades, as composições da divulgação podem compreender vários vetores de AAV a uma concentração de 5x10"* DRP/mL, 1,5x10º DRP/ mL, 5x10*? DRP/ mL, 1,2x10? DRP/mL, 4,5x10*? DRP/mL, 1,2x101? DRP/mL, 1,5x10*? DRP/mL ou 5x10º? DRP/1,2x10*? DRP/mL. Em algumas modalidades, as composi- ções da divulgação podem compreender vários vetores de AAV a uma concentração de 5x10*? DRP por mL. Em algumas modalidades, as composições da divulgação podem compreender vários vetores de AAV a uma concentração de 1,5x10*? DRP por mL. Assim, para admi- nistrar uma dose de vetor de AAV de cerca de 2x10"º gp, por exemplo, uma única injeção de cerca de 10 microlitros de uma composição far- macêutica com uma concentração de cerca de 2x 10? gp por mL atin- girá a dose desejada in vivo.

[00132] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV podem compreender um volume entre 1 e 500 ul, incluindo os valores limite. Em algumas modalidades das composições da divulga-

ção, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV podem compreender um volume entre 10-500, 50-500, 100- 500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200- 250, 50-150, 1-100 ou 1-10 ul, incluindo os valores limite para cada faixa. Em algu- mas modalidades das composições da divulgação, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV podem com- preender um volume de 1, 2, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ul ou qualquer número de microlitros entre estes. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV podem compreender 100 ul.

[00133] Em algumas modalidades das composições da divulgação, um volume inteiro de uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV podem ser injetado em uma única injeção. Em algumas modalidades, uma porção de um volume de uma compo- sição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV pode ser injetada em uma única injeção. Em algumas modalidades, uma primei- ra porção de um volume de uma composição que compreende um ve- tor de AAV ou um vetor de AAV pode ser injetada em uma primeira injeção única, e uma segunda porção de um volume de uma composi- ção que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV pode ser injetada em uma segunda injeção única

[00134] Em algumas modalidades das composições da divulgação, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são administrados a uma dosagem de pelo menos 2x107, 2x10º, 5Xx108, 1,5x10º, 2x10ºº, 5x10º, 2x107º%º, 5x10%, 6x10%, 1,2x101, 2x10, 4,5X107, 5x107!, 1,2x107?, 1,5x102?, 2x107? ou 5x10*? gp por olho. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são administrados a uma dosagem de cerca de 5x10%º%, 1,5x10], 5x107! ou 1,5x10! gp por olho. Em algumas mo- dalidades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são administrados a uma dosagem de cerca de 5x10"! DRP por olho por meio de injeção sub-retiniana. Em algumas modali- dades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um ve- tor de AAV são administrados a uma dosagem de cerca de 2x10*º gp por olho por meio de injeção sub-retiniana. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são administrados a uma dosagem de cerca de 5x10*º gp por olho por meio de injeção sub-retiniana. Em algumas modalidades, o vetor de AAV é administrado a uma dosagem de cerca de 6x10"º gp por olho, por meio de injeção sub-retiniana. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são administrados a uma dosagem de cerca de 1,5x10** gp por olho por meio de injeção sub-retiniana. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são administrados a uma dosagem de cerca de 2x10*' gp por olho por meio de injeção sub-retiniana. Em algumas modalidades, uma compo- sição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são ad- ministrados a uma dosagem de cerca de 5x10** gp por olho por meio de injeção sub-retiniana. Em algumas modalidades, uma composição que compreende um vetor de AAV ou um vetor de AAV são adminis- trados a uma dosagem de cerca de 1,5x10*? gp por olho por meio de injeção sub-retiniana.

[00135] As dosagens ou volumes podem ser calculados com base na escala alométrica entre as espécies com base no volume vítreo. "Alometria", conforme utilizado neste documento, refere-se às mudan- ças nos organismos em relação ao tamanho do corpo. Alguns fatores a serem levados em consideração ao comparar espécies incluem vo- lume corporal, área de superfície, taxa metabólica e processos anatô- micos, fisiológicos ou bioquímicos únicos. A dosagem equivalente hu- mana pode ser normalizada para área de superfície corporal, peso corporal ou uma combinação de área de superfície e peso. Outros fa- tores também podem ser levados em consideração. Entrega

[00136] Os vetores virais da invenção podem ser administrados ao olho de um sujeito por meio de injeção sub-retiniana, retiniana direta, supracoroidal ou intravítrea. Uma pessoa versada na técnica estará familiarizada e bem capaz de realizar injeções sub-retinianas, retinia- nas diretas ou intravítreas individuais.

[00137] As injeções sub-retinianas são injeções no espaço sub- retiniano, ou seja, abaixo da retina neurossensorial. Durante uma inje- ção sub-retiniana, o material injetado é direcionado e cria um espaço entre a célula fotorreceptora e as camadas de epitélio pigmentar da retina (RPE). Quando a injeção é realizada por meio de uma pequena retinotomia, pode ocorrer um descolamento de retina. A camada ele- vada descolada da retina que é gerada pelo material injetado é cha- mada de "bolha". O orifício criado pela injeção sub-retiniana deve ser suficientemente pequeno para que a solução injetada não reflua signi- ficativamente de volta para a cavidade vítrea após a administração. Tal refluxo seria particularmente problemático quando um medicamento é injetado, porque os efeitos do medicamento seriam direcionados para longe da zona alvo. De preferência, a injeção cria um ponto de entrada auto-selante na retina neurossensorial, isto é, uma vez que a agulha de injeção é removida, o orifício criado pela agulha é selado novamen- te, de modo que muito pouco ou praticamente nenhum material injeta- do seja entregue através do orifício.

[00138] Para facilitar este processo, agulhas de injeção sub-retini- anas especializadas estão disponíveis comercialmente (por exemplo, agulha para injeção sub-retiniana de Teflon DORC 41G, Dutch Ophthalmic Research Centre International BV, Zuidland, Holanda). Es- tas são agulhas projetadas para realizar injeções sub-retinianas.

[00139] —Alternativamente, as injeções sub-retinianas podem ser rea- lizadas entregando-se a composição que compreende partículas de AAV sob orientação visual direta usando um microscópio operacional (Leica Microsystems, Alemanha). Uma abordagem exemplificativa é a de usar uma abordagem de túnel escleral através do pólo posterior até a retina superior com uma seringa Hamilton e agulha de calibre 34 (ESS labs, Reino Unido). Alternativamente, injeções sub-retinianas podem ser realizadas usando uma paracentese de câmara anterior com uma agulha 33G antes da injeção sub-retiniana usando uma se- ringa WPI e um sistema de agulha 35G chanfrada (World Precision Instruments, Reino Unido). Uma alternativa adicional é uma seringa WPI Nanofil (WPI, parte tNANOFIL) e uma agulha WBI Nanofil de ca- libre 34 (WPI, parte %& NF34BL-2).

[00140] Os vetores ou composições da divulgação podem ser ad- ministrados por meio de injeção supracoroidal. Qualquer meio de inje- ção supracoroidal é considerado um sistema de entrega potencial para um vetor ou uma composição da divulgação. Injeções supracoroidais são injeções no espaço supracoroidal, que é o espaço entre a coroide e a esclera. A injeção no espaço supracoroidal é, portanto, uma via de administração potencial para a entrega de composições em estruturas oculares próximas, como a retina, o epitélio pigmentar da retina (RPE) ou a mácula. Em algumas modalidades, a injeção no espaço supraco- roidal é feita em uma porção anterior do olho usando uma microagu- lha, microcânula ou microcateter. Uma porção anterior do olho pode compreender ou consistir em uma área anterior ao equador do olho. À composição do vetor ou as partículas virais de AAV podem se difundir posteriormente a partir de um local de injeção por meio de uma via su- pracoroidal. Em algumas modalidades, no espaço supracoroidal no olho posterior, injeta-se diretamente usando um sistema de cateter. Nesta modalidade, o espaço supracoroidal pode ser cateterizado por meio de uma incisão na pars plana. Em algumas modalidades, uma injeção ou uma infusão por uma via supracoroidal atravessa a coroide, a membrana de Bruch e/ou a camada RPE para entregar um vetor ou uma composição da divulgação em um espaço sub-retiniano. Em al- gumas modalidades, incluindo aquelas em que um vetor ou uma com- posição da divulgação são entregues em um espaço sub-retiniano por meio de uma via supracoroidal, uma ou mais injeções são feitas em pelo menos uma dentre a esclera, a pars plana, a coroide, a membra- na de Bruch e a camada RPE. Em algumas modalidades, incluindo aquelas em que um vetor ou uma composição da divulgação é entre- gue a um espaço sub-retiniano por meio de uma via supracoroidal, um procedimento de duas etapas é usado para criar uma bolha em um espaço supracoroidal ou sub-retiniano antes da entrega de um vetor ou uma composição da divulgação.

[00141] Nas modalidades em que os camundongos são injetados, os animais podem ser anestesiados por injeção intraperitoneal conten- do cetamina (40-80 mg/kg) e xilazina (1-10 mg/kg), e as pupilas são totalmente dilatadas com colírio de tropicamida (1% de Mydriaticum, Bausch & Lomb, Reino Unido) e colírios de fenilefrina (2,5% de clori- drato de fenilefrina, Bausch & Lomb, Reino Unido). Colírios de proxi- metacaína (0,5% de cloridrato de proximetacaína, Bausch & Lomb, Reino Unido) também podem ser aplicados antes da injeção sub- retinal. Após a injeção, colírios de cloranfenicol podem ser aplicados (0,5% de cloranfenicol, Bausch & Lomb, Reino Unido) e a anestesia revertida com atipamezol (2mg/kg) e gel de carbômero pode ser apli- cado (Viscotears, Novartis, Reino Unido) para prevenir a formação de catarata.

[00142] A menos que ocorra dano à retina durante a injeção, e con- tanto que uma agulha suficientemente pequena seja usada, substanci- almente todo o material injetado permanece localizado entre a retina neurossensorial descolada e o RPE no local do descolamento retinal localizado (ou seja, não reflui para a cavidade vítrea). De fato, a per- sistência típica da bolha ao longo de um curto período de tempo indica que geralmente há pouco escape do material injetado no vítreo. A bo- lha pode se dissipar ao longo de um período de tempo mais longo, conforme o material injetado é absorvido.

[00143] As visualizações do olho, em particular da retina, por exemplo usando tomografia de coerência óptica, podem ser feitas no pré-operatório.

[00144] Os vetores de AAV da invenção podem ser entregues com maior precisão e segurança através do uso de um método de duas etapas em que um descolamento retinal localizado é criado pela inje- ção sub-retiniana de uma primeira solução. A primeira solução não compreende o vetor. Uma segunda injeção sub-retiniana é então usa- da para entregar o medicamento que compreende o vetor no fluido sub-retiniano da bolha criada pela primeira injeção sub-retiniana. Co- mo a injeção que entrega o medicamento não está sendo usada para descolar a retina, um volume específico de solução pode ser injetado nesta segunda etapa. Um vetor de AAV da invenção pode ser entre- gado por meio de: (a) administração de uma solução ao sujeito por in- jeção sub-retiniana em uma quantidade eficaz para pelo menos desco- lar parcialmente a retina para formar uma bolha sub-retiniana, em que a solução não compreende o vetor; e (b) administração de uma com- posição de medicamento por injeção sub-retiniana na bolha formada pela etapa (a), em que o medicamento compreende o vetor.

EXEMPLOS Exemplo 1: Proteína bestrofina-1 em células HEK293 usando o promotor CAG

[00145] Células HEK293 foram transduzidas com um vetor AAV2/2 contendo o promotor CAG que conduz a expressão de Best1 com um

WPRE (AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA, Figura 3) e sem um WPRE (AAV2/2 CAG.BEST1.pA), e a expressão e localização da proteína Bestrofina-1 foram examinadas. Na Figura 6, células HEK293 transdu- zidas foram coradas com Hoechst e um anticorpo de Bestrofina-1 anti- humano (hBEST1 ou huBEST1). A proteína bestrofina-1 foi encontrada em todo o citosol quando comparada às células controle não transdu- zidas.

[00146] A expressão de bestrofina-1 em células HEK293 foi quanti- ficada a partir de Western Blot (Figura 7). Na Figura 7A, a amostra 1 era o vetor AAV2/2 CAG.hBEST1.pA; a amostra 2 era o vetor AAV2/2 CAG.hBEST1.WPRE.pA e a amostra 3 era um controle negativo. Célu- las HEK293 transfectadas com plasmídeo foram usadas como um con- trole positivo. Na Figura 7B, a quantificação mostrou que AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA (n=9) mostrou um aumento de aproximada- mente 4 vezes na expressão de Bestrophin-1 sobre AAV2/2 CAG.BEST1.pA (n=9) (p<0,01 por ANOVA de uma via com Teste de Comparações Múltiplas de Tukey), e foi observado um aumento esta- tisticamente significativo sobre as células de controle não transduzidas (n=8) (p<0,001). Embora a expressão de Bestrofina-1 tenha sido ob- servada nas células AAV2/2 CAG.BEST1.pA, isso não foi estatistica- mente significativo em relação às células não transduzidas. Barras de erro = +SEM e *** indica p<0,001 quando comparado ao controle não transduzido.

[00147] As células HEK293 que expressam Bestrofina-1 foram adi- cionalmente testadas com registro de patch clamp de célula inteira. À Figura 8A mostra os gráficos de Corrente (1) /Tensão (V) de células HEK293 transduzidas com os vetores AAV2/2 CAG.BEST1.pA, AAV2/2 CAG.BEST1.WPRE.pA e AAV2/2 CAG.GFP.WPRE.pA, bem como um controle não transduzido. A Figura 8B mostra as formas de onda atuais, e a condutância da corda é mostrada na Figura 9.

Exemplo 2: Proteína bestrofina-1 em células ARPE19 cultivadas usando o promotor VMD2

[00148] ARPE19 apropriadamente diferenciados são conhecidos por terem perfis de expressão gênica semelhantes aos das células do epitélio pigmentar da retina (RPE) nativas e podem ser usados como uma alternativa às células de RPE nativas para testar a expressão gê- nica. Células ARPE19 diferenciadas foram usadas para testar a capa- cidade dos promotores VMD2 e CAG para acionar a expressão de BEST1 em células de RPE e para testar o efeito da sequência íntron- éxon (IntEx) na expressão do promotor VMD?2.

[00149] As células ARPE19 foram transfectadas e testadas quanto à expressão de BEST1 usando o protocolo descrito na Figura 10B. As cé- lulas ARPE19 foram cultivadas em meio de diferenciação (DMEM com 4,5 g/| de glicose, L-glutamina e 1mM de piruvato de sódio suplementado com 1% de soro fetal bovino (FBS) por 1-4 meses a 37 ºC e 5% de CO> em 96 placas de poço. Células ARPE19 diferenciadas foram então trans- fectadas com pCAG.BEST1.WPRE (promotor CAG), pvVMD.BEST1. WPRE (promotor VMD2) ou pVMD?2.IntEx.BEST1.WPRE (promotor VMD?2 e um construto íntron-éxon) a 3,8x10*º número de cópias de cada plasmídeo por poço. As células tratadas com o reagente TranslT- LT1 por si só e as células sem reagente de transfecção ou plasmídeo serviram como controles negativos. As células foram então cultivadas por 2 dias a 37 ºC antes de serem fixadas e coradas com Anti-hBest1 e Anti-ZO1 (também chamado de ZO-1 ou zonula occludens-1, ou pro- teína de junção estreita 1, uma proteína localizada na superfície de membrana citoplasmática de junções estreitas intercelulares). As Figu- ras 11-13 mostram a expressão de BEST1 em células ARPE19 dife- renciadas transfectadas com os três vetores que codificam BEST1 e um controle não transfectado.

[00150] Em células ARPE19 que foram diferenciadas por um mês antes da transfecção, as células não transfectadas não mostraram ex- pressão. Em contraste, tanto o pCAG.BEST1I.WPRE quanto o PVMD?2.IntEx.BEST1.WPRE foram capazes de acionar a expressão da proteína BEST1 em células ARPE19 diferenciadas (ver Figura 11A, contraste a primeira, segunda e quarta linhas). pvMD2.BEST1.WPRE (sem éxon-íntron) também foi capaz de acionar a expressão de BEST1 em células ARPE189 diferenciadas por 1 mês (Figura 11B), embora es- te construto parecesse expressar BEST1 em níveis mais baixos do que o construto com a sequência íntron-éxon (pVMD?2.IntEx.BEST1. WPRE). Em células ARPE19 que foram diferenciadas por três meses, resultados semelhantes foram obtidos: pCAG.BEST1.WPRE, pVMD?2. Intéx.BEST1.WPRE e pvMD2.BEST1.WPRE foram todos capazes de acionar a expressão da proteína BEST1, embora a expressão com o promotor CAG tenha sido maior do que com o promotor VMD2 e, com o promotor VMD2, a sequência íntron-éxon aprimora a expressão (contraste a primeira linha da Figura 12A, o controle não transfectado, com a Figura 12B).

[00151] As células ARPE19 foram transduzidas e testadas quanto à expressão de BEST1 usando o protocolo descrito na Figura 10. Célu- las ARPE19 diferenciadas foram pré-tratadas com 400 nM de doxorru- bicina antes da transdução. Este fármaco demonstrou aprimorar a efi- ciência de transdução de AAV2 em vários modelos in vitro. Quatro ho- ras após o tratamento, as células foram transduzidas com os diferen- tes construtos virais em diferentes multiplicidades de infecção (MOlIs).

[00152] Células ARPE19 diferenciadas por 4 meses, pré-tratadas com 400mM de doxorrubicina e transduzidas com AAV2/2.CAG.GFP. WPRE e AAV2/2.VMD?2.InEx.GFP.WPRE em 2, 4 e 8 x 10º gp/célula mostraram fluorescência GFP mais alta em comparação com células transduzidas sem pré-tratamento com doxorrubicina 10 dias após a transdução (contraste as linhas superior e inferior de cada painel da

Figura 13A) AAV2/2.CAG.GFP.WPRE e B) AAV2/2.VMD2.InEx. GFP.WPRE). A fluorescência de GFP não foi detectada em células não transduzidas, usadas como controles negativos (primeira coluna da Figura 13Ae B).

[00153] Em células ARPE19 diferenciadas por 4 meses, pré- tratadas com 400 nM de doxorrubicina e transduzidas com AAV2/

2.CAG.BEST1.WPRE e AAV2/2.VMD2.InEx.BESTI1.WPRE a 1 e 4x 10º gp/célula, a expressão de BEST1 pode ser detectada por imunoco- loração com anti-hBEST1 (vermelho, terceira coluna, segunda à quinta linhas da Figura 14) em comparação com o controle não transduzido (primeira linha, Figura 14) 10 dias após a transdução. Exemplo 3: Estudo piloto in vivo de 4/8 semanas em camundon- gos

[00154] A capacidade dos construtos de VMD2.BEST1.WPRE e VMD?2.IntEx.wBEST1.WPRE para conduzir a expressão de BEST1 foi testada in vivo. O protocolo do estudo piloto in vivo de 4/8 semanas é mostrado na Figura 15. Camundongos C57BL/6 (6 por grupo) foram injetados bilateralmente com uma injeção simulada, partículas virais de AAV AAV2/2 VMD2.BEST1.WPRE ou AAV2/2 VMD?2.IntEx.BEST1. WPRE. 1 uL de solução de AAV foi injetado sub-retinalmente com uma agulha Nanofil de calibre 34 (WPI tNF34BL-2) a 1x10º GC/uL/olho. Os olhos foram fotografados usando tomografia de coerência óptica em 4 e 8 semanas para avaliar o afinamento da retina (toxicidade), e 3 ani- mais foram sacrificados em cada ponto de tempo para testar a expres- são da proteína BEST1 por imuno-histoquímica e Western Blot.

[00155] A geração de imagens de OCT em 4 e 8 semanas mostrou que nenhum dos construtos de VMD2 mostrou toxicidade de fotorre- ceptores quando comparado ao tratamento simulado (Figuras 16-18).

[00156] Três animais foram sacrificados em ambos os pontos de tempo de 4 e 8 semanas, e a expressão da proteína BEST1 foi poste-

riormente caracterizada por western blot (Figura 21) e imuno- histoquímica (Figura 19). A Figura 19 mostra os resultados de imuno- histoquímica para olhos quatro semanas após a injeção, enquanto a Figura 20 mostra os resultados de imuno-histoquímica para olhos oito semanas após a injeção. Os olhos foram corados com anti-BEST1 (verde) e anti-Rodopsina (vermelho), que marca as células fotorrecep- toras, e DAPI (Figuras 19 e 20). A expressão da proteína BEST1 foi observada em VMD2.BEST1.WPRE.pA e VMD?2.IntEx.wBEST1.WPRE. pA. Expressão de BEST1 acionada pelo promotor VMD?2 localizada na conjunção da camada de RPE e da camada externa do fotorreceptor. O Western Blot no tecido do complexo de RPE/coroide dissecado de olhos injetados de quatro semanas mostra expressão de proteína (Fi- gura 21).

Exemplo 4: Prova de estudo de conceito de 4/13 semanas in vivo em camundongos

[00157] Um estudo adicional de prova de conceito (PoC) in vivo de 4 e 13 semanas foi realizado em camundongos para confirmar os re- sultados do estudo piloto, avaliar o efeito da dosagem de partículas virais de AAV e observar os efeitos em pontos de tempo posteriores após a injeção de AAV. Um esboço do protocolo para o estudo de Prova de Conceito de 4/13 semanas é apresentado na Figura 22. Ca- mundongos C57BL/6 (12 por coorte) foram injetados bilateralmente com partículas de AAV VMD?2.IntEx.wBEST1.WPRE ou VMD2.BEST1. WPRE.pA em 1x108 GC/ul/olho ou 1x10º GC/uL/olho, ou com uma injeção de simulação. 1 ul de solução de AAV foi injetado sub- retinalmente com uma agulha Nanofil de calibre 34 (WPI tNF34BL-2). Os olhos foram fotografados com OCT em 4 e 13 semanas após a in- jeção. Quatro camundongos foram sacrificados quatro semanas após a injeção, e os oito restantes 13 semanas após a injeção, e a expres- são de BEST1 foi caracterizada por imuno-histoquímica e Western

TTIT8 blot.

[00158] A geração de imagem de OCT em 4 semanas e 13 sema- nas mostrou que nenhum dos construtos de VMD2 (com ou sem a se- quência íntron-éxon) na dose alta (1x10º GC/olho) ou na dose baixa (1x108 GC/olho) mostrou toxicidade, conforme evidenciado pelo afina- mento da retina quando comparado com o controle de simulação (Fi- gura 23). A coloração com anti-BEST1 (huBEST1 na Figura 24) e anti- Rodopsina mostrou que a BEST1 acionada por VMD?2 localizada na camada de RPE, com uma tendência de mais expressão de BEST1 em olhos injetados VMD2.IntEx.BEST1.WPRE. O Western Blot no te- cido do complexo de RPE/coroide dissecado agrupado de olhos inje- tados (4) de quatro semanas mostra expressão de proteína (Figura 25B). Exemplo 5: Estudo de avaliação de toxicidade de Boas Práticas de Laboratório (BPL) em camundongos

[00159] A segurança e a expressão de AAV de BEST1 durante lon- gos períodos de tempo são verificadas em camundongos com um es- tudo de toxicidade de Boas Práticas de Laboratório (BPL) em camun- dongos. Um esboço do estudo é apresentado na Figura 27. Coortes de 8 camundongos machos e 8 fêmeas são injetados sub-retinalmente e bilateralmente com uma dose baixa (5,0 x 108 GC/olho), média (1,5 x10º GC/olho) ou alta (5,0 x 10º GC/olho) de partículas de AAV VMD?2.IntEx.BEST1.WPRE. Usando a escala de volume alométrica, a dose alta de camundongo é equivalente a uma dose de 100 ul a 5x10*? GC/mL/olho em humanos. Os camundongos são avaliados e sacrificados em 4 semanas e 26 semanas. Os olhos são avaliados com um exame oftálmico, tonometria para medir a pressão intraocular (PIO), OCT para espessura da retina (pré-dose e ao final de 4 e 13 semanas). Após o sacrifício, as necropsias avaliam os pesos dos ór- gãos e tecidos, como o olho esquerdo, cérebro, coração, músculo es-

quelético, pulmão, fígado, rim, testículos e ovários são coletados para qPCR. São realizadas avaliações histopatológicas, e os tecidos são reservados, por exemplo, por armazenamento em formalina, para imu- no-histoquímica adicional. Alternativamente, ou adicionalmente, gru- pos de 4 camundongos são injetados com dosagens de 2 x 10º GC/olho e 5x10º GC/olho de partículas de AAV VMD?2.IntEx.BEST1. WPRE e avaliados em 4 semanas para otimizar protocolos para o es- tudo de toxicidade maior (ver a Figura 28 para um esboço).

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00160] Todos os documentos citados neste documento, incluindo qualquer pedido ou patente relacionados ou referenciados, é incorpo- rado neste documento por referência na sua totalidade, a menos que expressamente excluído ou limitado de outra forma. A citação de qual- quer documento não é uma admissão de que é técnica anterior com respeito a qualquer invenção divulgada ou reivindicada aqui ou sozi- nha, ou em qualquer combinação com qualquer outra referência ou referências, ensinamentos, sugestões ou divulgações de qualquer in- venção. Além disso, na medida em que qualquer significado ou defini- ção de um termo neste documento conflita com algum significado ou definição do mesmo termo em um documento incorporado por referên- cia, o significado ou definição atribuído a esse termo neste documento irá prevalecer.

OUTRAS MODALIDADES

[00161] Embora modalidades particulares da divulgação tenham sido ilustradas e descritas, várias outras mudanças e modificações po- dem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da divulgação. O escopo das reivindicações anexas inclui todas as mudanças e modifi- cações que estão dentro do escopo desta divulgação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de: uma sequência de ácido nucleico compreendendo: (a) uma sequência que codifica um promotor da distrofia macular viteliforme-2 (VMD?2), e (b) uma sequência que codifica uma proteína Bestrofina-1 (BEST1).

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que a sequência que codifica o promotor VMD?2 codi- fica um promotor VMD2 humano.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizada pelo fato de que a sequência que codifica a proteína BEST1 codifica uma proteína BEST1 humana.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a proteína BEST1 compreende uma sequência de codificação.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a proteína BEST1 compreende uma sequência de cDNA.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nu- cleico compreende ainda: (c) uma sequência que codifica um elemento regulador pós- transcricional (PRE).

7. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zada pelo fato de que a sequência que codifica o PRE compreende uma sequência isolada ou derivada de um vírus da hepatite da marmo- ta (WPRE).

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nu- cleico compreende ainda: (d) uma sequência que codifica um sinal de poliadenilação (poliA).

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nu- cleico compreende ainda: (e) uma sequência que codifica uma região 5' não traduzi- da.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nu- cleico compreende ainda: (f) uma sequência que codifica um íntron, e (9) uma sequência que codifica um éxon, em que a sequência que codifica o íntron e a sequência que codifica o éxon estão operacionalmente ligadas.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o íntron está localizada entre a sequência que codifica o promotor VMD?2 e a se- quência que codifica o éxon, em que a sequência que codifica o éxon está localizada en- tre a sequência que codifica o íntron e a sequência que codifica a 5 'UTR, e em que a sequência que codifica o íntron passa pelo pro- cesso de splicing por uma célula de mamífero.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a 5' UTR compreende uma sequência que codifica uma sequência de Kozak ou uma porção dela.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, carac-

terizada pelo fato de que a sequência que codifica uma sequência de Kozak tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de ácido nucleico de GCCRCCATGG.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 12, carac- terizada pelo fato de que a sequência que codifica uma sequência de Kozak compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de GGCACCATGA.

15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 2 a 14, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o promotor VMD2 humano compreende ou consiste em 1 AATTCTGTCA TTTTACTAGG GTGATGAAAT TCCCAAGCAA CACCATCCTT TTCAGATAAG 61 GGCACTGAGG CTGAGAGAGG AGCTGAAACC TACCCGGGGT CACCACACAC AGGTGGCAAG 121 GCTGGGACCA GAAACCAGGA CTGTTGACTG CAGCCCGGTA TTCATTCTTT CCATAGCCCA 181 CAGGGCTGTC AAAGACCCCA GGGCCTAGTC AGAGGCTCCT CCTTCCTGGA GAGTTCCTGG 241 CACAGAAGTT GAAGCTCAGC ACAGCCCCCT AACCCCCAAC TCTCTCTGCA AGGCCTCAGG 301 GGTCAGAACA CTGGTGGAGC AGATCCTTTA GCCTCTGGAT TTTAGGGCCA TGGTAGAGGG 361 GGTGTTGCCC TAAATTCCAG CCCTGGTCTC AGCCCAACAC CCTCCAAGAA GAAATTAGAG 421 GGGCCATGGC CAGGCTGTGC TAGCCGTTGC TTCTGAGCAG ATTACAAGAA GGGACTAAGA 481 CAAGGACTCC TTTGTGGAGG TCCTGGCTTA GGGAGTCAAG TGACGGCGGC TCAGCACTCA 541 CGTGGGCAGT GCCAGCCTCT AAGAGTGGGC AGGGGCACTG GCCACAGAGT CCCAGGGAGT 601 CCCACCAGCC TAGTCGCCAG ACC (SEQ ID NO: 1).

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 15, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica a proteína BEST1 humana compreende ou consiste em 1 ATGACCATCA CTTACACAAG CCAAGTGGCT AATGCCCGCT TAGGCTCCTT CTCCCGCCTG 61 CTGCTGTGCT GGCGGGGCAG CATCTACAAG CTGCTATATG GCGAGTTCTT AATCTTCCTG 121 CTCTGCTACT ACATCATCCG CTTTATTTAT AGGCTGGCCC TCACGGAAGA ACAACAGCTG 181 ATGTTTGAGA AACTGACTCT GTATTGCGAC AGCTACATCC AGCTCATCCC CATTTCCTTC 241 GTGCTGGGCT TCTACGTGAC GCTGGTCGTG ACCCGCTGGT GGAACCAGTA CGAGAACCTG 301 CCGTGGCCCG ACCGCCTCAT GAGCCTGGTG TCGGGCTTCG TCGAAGGCAA GGACGAGCAA 361 GGCCGGCTGC TGCGGCGCAC GCTCATCCGC TACGCCAACC TGGGCAACGT GCTCATCCTG 421 CGCAGCGTCA GCACCGCAGT CTACAAGCGC TTCCCCAGCG CCCAGCACCT GGTGCAAGCA 481 GGCTTTATGA CTCCGGCAGA ACACAAGCAG TTGGAGAAAC TGAGCCTACC ACACAACATG 541 TTCTGGGTGC CCTGGGTGTG GTTTGCCAAC CTGTCAATGA AGGCGTGGCT TGGAGGTCGA 601 ATCCGGGACC CTATCCTGCT CCAGAGCCTG CTGAACGAGA TGAACACCTT GCGTACTCAG 661 TGTGGACACC TGTATGCCTA CGACTGGATT AGTATCCCAC TGGTGTATAC ACAGGTGGTG 721 ACTGTGGCGG TGTACAGCTT CTTCCTGACT TGTCTAGTTG GGCGGCAGTT TCTGAACCCA 781 GCCAAGGCCT ACCCTGGCCA TGAGCTGGAC CTCGTTGTGC CCGTCTTCAC GTTCCTGCAG 841 TTCTTCTTCT ATGTTGGCTG GCTGAAGGTG GCAGAGCAGC TCATCAACCC CTTTGGAGAG

901 GATGATGATG ATTTTGAGAC CAACTGGATT GTCGACAGGA ATTTGCAGGT GTCCCTGTTG 961 GCTGTGGATG AGATGCACCA GGACCTGCCT CGGATGGAGC CGGACATGTA CTGGAATAAG 1021 CCCGAGCCAC AGCCCCCCTA CACAGCTGCT TCCGCCCAGT TCCGTCGAGC CTCCTTTATG 1081 GGCTCCACCT TCAACATCAG CCTGAACAAA GAGGAGATGG AGTTCCAGCC CAATCAGGAG 1141 GACGAGGAGG ATGCTCACGC TGGCATCATT GGCCGCTTCC TAGGCCTGCA GTCCCATGAT 1201 CACCATCCTC CCAGGGCAAA CTCAAGGACC AAACTACTGT GGCCCAAGAG GGAATCCCTT 1261 CTCCACGAGG GCCTGCCCAA AAACCACAAG GCAGCCAAAC AGAACGTTAG GGGCCAGGAA 1321 GACAACAAGG CCTGGAAGCT TAAGGCTGTG GACGCCTTCA AGTCTGCCCC ACTGTATCAG 1381 AGGCCAGGCT ACTACAGTGC CCCACAGACG CCCCTCAGCC CCACTCCCAT GTTCTTCCCC 1441 CTAGAACCAT CAGCGCCGTC AAAGCTTCAC AGTGTCACAG GCATAGACAC CAAAGACAAA 1501 AGCTTAAAGA CTGTGAGTTC TGGGGCCAAG AAAAGTTTTG AATTGCTCTC AGAGAGCGAT 1561 GGGGCCTTGA TGGAGCACCC AGAAGTATCT CAAGTGAGGA GGAAAACTGT GGAGTTTAAC 1621 CTGACGGATA TGCCAGAGAT CCCCGAAAAT CACCTCAAAG AACCTTTGGA ACAATCACCA 1681 ACCAACATAC ACACTACACT CAMAGATCAC ATGGATCCTT ATTGGGCCTT GGAAAACAGG 1741 GATGAAGCAC ATTCCTAA (SEQ ID NO: 3).

17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 8 a 16, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene de mamífero.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, carac- terizada pelo fato de que a sequência que codifica o sinal de poliA compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene do Hor- mônio de Crescimento Bovino (BGH) de mamífero.

19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 10 a 18, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifi- ca o éxon compreende uma sequência isolada ou derivada de um ge- ne de mamífero.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, carac- terizada pelo fato de que a sequência que codifica o éxon compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene da beta globina de coelho (Oryctolagus cuniculus).

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 10 a 20, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifi- ca o Íntron compreende uma sequência de ocorrência não natural.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, carac-

terizada pelo fato de que a sequência que codifica o íntron compreen- de uma sequência de fusão.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, carac- terizada pelo fato de que a sequência que codifica o íntron compreen- de uma sequência que codifica um sítio doador de splice, e uma sequência que codifica um ponto de ramificação de splice e um sítio aceptor.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, carac- terizada pelo fato de que a sequência que codifica o sítio doador de splice compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene de vertebrado.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, carac- terizada pelo fato de que a sequência que codifica o sítio doador de splice compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene da beta actina de galinha (Gallus gallus) (CBA).

26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifi- ca o ponto de ramificação de splice e o sítio aceptor compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene de vertebrado.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, carac- terizada pelo fato de que a sequência que codifica o ponto de ramifica- ção de splice e o sítio aceptor compreende uma sequência isolada ou derivada de um gene da beta globina de coelho (Oryctolagus cunicu- lus).

28. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

27.

29. Vetor, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o vetor é um plasmídeo.

30. Vetor de entrega, caracterizado pelo fato de que com- preende o vetor de acordo com a reivindicação 28 ou 29.

31. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 30, ca- racterizado pelo fato de que o vetor de entrega é um vetor de entrega viral.

32. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 31, ca- racterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende um ge- noma viral de fita simples.

33. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 31, ca- racterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende um ge- noma viral de fita dupla.

34. Vetor de entrega, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma molécula de RNA.

35. Vetor de entrega, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 30 a 34, caracterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma sequência isolada ou derivada de um vetor de vírus adeno-associado (AAV).

36. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma se- quência isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVI1O, AAV11 ou qualquer combinação destes.

37. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma se- quência isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAV2.

38. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma se- quência isolada ou derivada de um vetor de AAV de sorotipo AAVB8.

39. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 37 ou

38, caracterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) e uma segunda ITR isolada ou derivada de um vetor de AAV de soro- tipo AAV2 e uma sequência que codifica um gene viral isolado ou deri- vado de um vetor de AAV de sorotipo AAV?2.

40. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) e uma segunda ITR isolada ou derivada de um vetor de AAV de soro- tipo AAV8 e uma sequência que codifica um gene viral isolado ou deri- vado de um vetor de AAV de sorotipo AAV8.

41. Vetor de entrega, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que o vetor de entrega compreende uma sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) e uma segunda ITR isolada ou derivada de um vetor de AAV de soro- tipo AAV2 e uma sequência que codifica um gene viral isolado ou deri- vado de um vetor de AAV de sorotipo AAV8.

42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor como definido na reivindicação 28 ou 29, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

44. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de entrega como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 41, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

45. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

27.

46. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor como definido na reivindicação 28 ou 29.

47. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de entrega como definido em qualquer uma das reivindicações a 41.

48. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivin- dicações 42 a 44.

49. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 48, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de mamí- fero.

50. Célula, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula de primata não humano, uma célula de roedor, uma célula de camundongo, uma célu- la de rato ou uma célula de coelho.

51. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula humana.

52. Célula, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que a célula humana é uma célula neuronal, uma célula da glia, uma célula retiniana, uma célula fotorreceptora, uma célula tipo bastonete, uma célula tipo cone ou uma célula cuboide do epitélio pigmentar da retina (RPE).

53. Célula, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que a célula humana é uma célula fotorreceptora.

54. Célula, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que a célula humana é uma célula HEK293 ou uma célula ARPE19.

55. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 a 53, caracterizada pelo fato de que a célula humana é isolada ou derivada de um RPE da retina humana.

56. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações

51 a 55, caracterizada pelo fato de que a célula está in vivo, in vitro, ex vivo ou in situ.

57. Método de tratamento da distrofia macular em um sujei- to em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar, ao sujeito, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 42 a 44.

58. Método de tratamento da distrofia macular em um sujei- to em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar, ao sujeito, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo o vetor como definido na reivindicação 28 ou 29.

59. Método de tratamento da distrofia macular em um sujei- to em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar, ao sujeito, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo o vetor de entrega como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 41.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 59, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 59, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um primata não humano, um cão, um gato, um roedor, um camundongo, um rato, ou um coelho.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 61, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem distrofia macular.

63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 62, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma muta- ção em uma ou em ambas as cópias de um gene BEST1.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracteriza-

do pelo fato de que a mutação é hereditária como uma mutação domi- nante.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que a mutação dominante causa a Distrofia Macular Viteliforme de Best (BVMD) no sujeito.

66. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracteriza- do pelo fato de que a mutação é hereditária como uma mutação re- cessiva.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do pelo fato de que a mutação recessiva causa a Bestrofinopatia Au- tossômica Recessiva (ARB) no sujeito.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 63 a 67, caracterizado pelo fato de que a mutação ocorre em uma sequência codificante de uma ou ambas as cópias de um gene BEST1.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 63 a 67, caracterizado pelo fato de que a mutação ocorre em uma sequência não codificante de uma ou ambas as cópias de um ge- ne BEST1.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 69, caracterizado pelo fato de que a administração compre- ende uma injeção ou uma infusão por via sub-retiniana, supracoroidal ou intravítrea.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 69, caracterizado pelo fato de que a administração compre- ende uma injeção ou uma infusão por via sub-retiniana.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracteriza- do pelo fato de que a administração compreende uma injeção em duas etapas ou uma infusão em duas etapas por via sub-retiniana.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 57 a 72, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti- camente eficaz é formulada em um volume entre 10 e 200 uL, incluin- do os valores limites.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracteriza- do pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz é formulada em um volume entre 10 e 50 uL, entre 50 e 100 uL, entre 100 e 150 ul ou entre 150 e 200 uL, incluindo os valores limites, para cada intervalo.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 72, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti- camente eficaz é formulada em um volume entre 70 e 120 uL, incluin- do os valores limites, e em que a administração compreende uma inje- ção ou uma infusão por via sub-retiniana.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 72, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti- camente eficaz é formulada em um volume de 100 yuL e em que a ad- ministração compreende uma injeção ou uma infusão por uma via sub- retiniana.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 76, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti- camente eficaz compreende uma concentração de um vetor de entre- ga de AAV de pelo menos 1x10ºº DRP/mL, pelo menos 1x10"! DRP/mL, pelo menos 1x10*? DRP/mL, pelo menos 2x10*? DRP/mL, pelo menos 5x10*? DRP/mL ou pelo menos 1,5x10*? DRP/mL.

78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 76, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti- camente eficaz compreende uma concentração de um vetor de entre- ga de AAV de pelo menos 2x10*? DRP/mL, pelo menos 5x10"? DRP/mL ou pelo menos 1,5x10º*? DRP/mL.

79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 76, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti-

camente eficaz compreende uma concentração de um vetor de entre- ga de AAV de pelo menos 5x10"? DRP/mL.

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 76, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti- camente eficaz compreende uma concentração de um vetor de entre- ga de AAV de pelo menos 1,5x10º? DRP/mL.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 80, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuti- camente eficaz compreende uma dose de 2x10º partículas de genoma (gp), 5x108 gp, 1,5x10º gp, 2x10º gp, 5xX10º gp, 2x10*º gp, 5x10º gp, 6x10º gp, 1,2x10* gp, 1,5x10*! gp, 2xX10*! gp, 4,5x10*' gp, 5x10** gp, 1,2x10*? gp, 1,5x10"? gp, 2x10º? gp ou 5x10? gp.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 80, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um camun- dongo e em que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma dose de 5x10º gp, 1,5x10º gp ou 5x10º gp.

83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 80, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um primata não humano e em que a quantidade terapeuticamente eficaz compre- ende uma dose de 1,2x10* gp, 4,5x10*' gp ou 1,2x10? gp de partícu- las virais de AAV.

84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 59 a 80, caracterizado pelo fato de que o sujeito é humano e em que a quantidade terapeuticamente eficaz compreende uma dose de 5x10*º gp, 1,5x10*! gp, 5x10* gp ou 1,5x10? gp de partículas virais de AAV.

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 57 a 84, caracterizado pelo fato de que a composição compreen- de ainda um tampão TMN200.