CN108713025A

CN108713025A - 用于治疗心脏病况和其他病理的从单个载体表达多种生物活性多肽的组合物和方法

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Publication number: CN108713025A
Application number: CN201680078586.0A
Authority: CN
Inventors: 迪姆基·S·帕特尔; 艾米特·N·帕特尔
Original assignee: Intrexon Corp
Current assignee: Precigen Inc
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2018-10-26
Also published as: US20180360992A1; HK1259137A1; JP6976244B2; SG11201803934YA; CA3004742A1; US20240148908A1; AU2016353342B2; KR20180069081A; WO2017083750A1; US11154622B2; JP2018536405A; MA43404A; AU2016353342A1; EP3387010A1; BR112018009645A2; MX2018005886A; RU2758489C2; US20220072159A1; RU2018117674A; RU2018117674A3

Abstract

本发明提供了可用于通过引入多基因表达载体来治疗可被治疗的病症的组合物和方法。更具体地，本发明提供了编码用于治疗心脏病症的多肽的载体和多核苷酸，其中所述多肽可包含细胞因子、趋化因子和/或血管生成多肽或其功能性衍生物。作为本发明的组合物，还提供了可用于连接和从单个多基因表达构建体表达功能性(生物活性)多肽的连接体。

Description

用于治疗心脏病况和其他病理的从单个载体表达多种生物活性多肽的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年11月11日提交的美国临时专利申请号 62/254,139的权益，该美国临时专利申请通过引用以其全文并入于此。

参考序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且通过引用以其全文并入于此。在2016年11月11日创建的所述ASCII副本被命名为INX00339WO_20161111_SL.txt并且大小为 271,843个字节。

技术领域

本发明提供了新的核酸和载体以及由其编码的多肽，它们用于疾病、病症和病理性病况的多基因治疗。更具体地说，本发明提供了用于多基因治疗和预防心脏疾病和病症的新的核酸、载体、多肽和方法。此外，本发明提供了新的核酸和多肽连接体，其提供了有利的从核酸和载体的蛋白质表达，可用于疾病、病症和病理性病况的多基因治疗。

背景技术

心脏疾病乃重要的未被满足的医疗需求；据估计，全球至少有 2500万名患者。此外，根据美国(U.S.)政府疾病控制和预防中心(CDC) 截止2013年的“心力衰竭情况说明书”，美国有超过500万人患有心力衰竭病况。

据估计，在每年多达825,000例新发病例的情况下有1/9死于心力衰竭。诊断后5年的平均生存率约为40％，并且再入院率在任何诊断相关组中为最高。据估计，美国每年的支出高达320亿美元。心力衰竭治疗选择包括药物治疗、侵入性装置和心脏移植。

充血性心力衰竭(CHF)描述了心脏无法提供足够的心脏输出来供应身体的代谢需求。全球目前有超过2200万人被诊断为CHF，并且在美国有超过500万名患者。由于心脏疾病的发病率和严重程度随着年龄的增长而增加，预计未来由于人口老龄化而总体发病率上升。 CHF患者的预后仍然不佳，其中五年死亡率为50％。根据美国心脏协会(AHA)的统计，2013年美国心血管疾病夺去810,000个生命，其中每3例报告的死亡病例中约占1例。终末期心力衰竭的药理学管控着眼于如下三个目标：1)改善发病率和死亡率(ACE抑制剂、血管紧张素II型I受体拮抗剂、选择的β受体阻滞剂和醛固酮拮抗剂)； 2)控制症状(利尿剂(最终噻嗪加袢利尿剂)、洋地黄(低剂量)；暂时性正性肌力药(inotropes)和选定的抗心律失常药)；和3)缓解(阿片类药物、抗抑郁药、抗焦虑药、氧气和持续的正性肌力药)。然而，随着疾病的进展，治疗选择仅限于心脏再同步化疗法(CRT)；考虑植入式心脏复律除颤器(ICD)；心脏移植和心室辅助装置(VAD)，它们既用作移植的桥梁，也越来越多地由于缺乏供体心脏而用作终极疗法。虽然接受三联免疫抑制疗法的心脏移植患者的总体5年生存率为70-80％，但作为治疗选择的心脏移植受到供体心脏持续短缺、移植候选人数量渐增以及每年的年度高支出超过100,000美元的限制。由机械辅助循环支持跨机构登记处(INTERMACS)收集的数据显示，在2006年6月23日至2013年6月30日期间，12,335名患者接受了 FDA批准的耐用机械循环支持(MCS)装置，其中自然增长率已经连续达到每年2000名患者的速度。

用于CHF治疗的细胞及基因疗法的研究越来越多，但是由于存在生物效应、细胞保留、递送时机以及缺乏机制或有限的单基因效应方面的问题而难有结果。即便如此，许多临床基因疗法试验在一年内都表现出一定的效果。尽管基因疗法具有确定的作用机制，但用于改善血管生成、干细胞归巢或收缩变力性的单个基因还不足以治疗CHF。由于CHF在瘢痕形成、收缩功能下降和细胞损失方面受多因素影响，因此多基因方法在保持这些重病患者安全的同时可更好地应对这些单个因素。

传统上，用于基因疗法的载体是单基因。近年来对更复杂的多基因载体的需求不断增加。具体而言，癌症和抗病毒治疗的联合疗法的需要刺激了该需求。联合基因疗法是药物预防癌症突变和抗性的最佳尝试。通过组合两种或三种药剂，可以获得更完整和有效的应答。援引并入

本文中所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。如果本文公开内容与并入的参考文献中的公开内容之间存在冲突，则以本文中的公开内容为准。

发明内容

越来越多的充血性心力衰竭(CHF)患者的治疗选择仍较为有限。例如，常见的CHF治疗导致放置目标左心室辅助装置(LVAD))。因此，需要通过不同方法来提供用于促进从CHF康复的生物学选择。

在具有独特基因突变(即肌钙蛋白I或重链肌球蛋白)的患者中，基于单基因的心脏疾病治疗方法是可行的。然而，在大多数具有心脏病理的患者中，终末期疾病是由多种因素引起的。因此，在这类情况下，单基因方法有可能不起作用。心脏病患者通常具有需要通过细胞募集和/或血管生成进行正性重塑的瘢痕组织。它们通常还需要通过钙或其他途径增加肌力作用。因此，将影响钙处理、细胞募集和血管生成的基因组合在一起为治疗和恢复这些终末期CHF患者提供了更合适的途径。此外，当考虑基于基因的方法来治疗心脏病症(例如但不限于CHF)时，使用病毒载体可以对抗人免疫系统，或者患者可能已经具有预先形成的抗病毒抗体(例如，抗AAV1/AAV2抗体)，其可能导致安全性和有效性问题。因此，使用在人体中具有低至无有害免疫应答且可根据需要重新给药的质粒DNA成为治疗性基因递送的有益模式。

正因为如此，本发明的一个实施方案提供了用于治疗性治疗心脏疾病和病症(例如但不限于CHF)的基于三效应物非病毒质粒的 DNA。在一个实施方案中，本发明提供了基于三效应物非病毒质粒的 DNA载体(构建体)。在本发明的特定实施方案中，称为pXoX的表达质粒编码并表达生物活性SDF1α、S100A1和VEGF，其中这三种感兴趣的效应物基因(GOI)通过本文所述的选择性设计的连接体序列分开。

治疗心脏疾病和病症(例如但不限于CHF)的多基因质粒DNA 方法基于来自其他研究(其中已使用单基因)的体外阳性、临床前和临床数据。下面描述的每种感兴趣的基因对于收缩力(inotropy)(例如，S100A1)、细胞归巢(例如，SDF-1α)和血管生成(例如，VEGF165) 具有特异性功能。包含全部三种基因的单质粒构建体而不是在分别递送的质粒上的每个单独基因，其基本原理是，如果将单基因(在单独分开的载体上)递送至细胞，则不存在可以控制将每个基因转染至细胞的量的方法。尽管比本发明的单个多基因构建体相比更为简单，但基因递送的这种可变性将使得该疗法不够安全并且不可重复。因此，在一个实施方案中，载体如pXoX组成型表达S100A1(细胞内蛋白质)、SDF-1α(分泌的蛋白质)和VEGF165(分泌的蛋白质)。使用pXoX，pDNA构建体被转录为单个mRNA，该单个mRNA通过弗林蛋白酶和P2A(fp2a)的组合活性经由切割被翻译为三个单独的功能性蛋白质。2A自切割肽编码介导被称为“核糖体跳跃”、“停止-前进” 和“终止-进行”翻译的翻译效应的序列(P2A)，该翻译效应导致在单个启动子的控制下从单个转录物mRNA共同表达多种蛋白质。组成型表达由例如但不限于CAG启动子(包含具有CMV增强子和杂合 CBA外显子1/兔β-珠蛋白内含子B的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的杂合启动子)的启动子驱动。以下所述为关于三种效应物及其包含在本发明构建体中的基本原理的进一步描述。

S100A1

S100A1是Ca2+结合EF-手型蛋白质超家族的成员(Rohde等人, J CardiovascTransl Res,vol.3,no.5,pp.525-537,2010)。S100A1为10.4 kDa的蛋白质，其作为同型二聚体主要在心肌细胞中起调节Ca2+调控的网络和通量以控制收缩功能、兴奋性、代谢、维持和存活的作用。动物和人体研究证明在心力衰竭中的S100A1表达降低(Pleger等人,Circulation,vol.115,no.19,pp.2506-2515,2007；和Remppis等人, Biochim BiophysActa,vol.1313,no.3,pp.253-257,1996)。S100A1的病毒递送已成功用于心力衰竭大型动物模型。具体地，在猪模型中评估的AAV9-S100A1基因疗法显示出对血液动力学恶化、心脏功能改善和心率正常化的保护(Rohde等人,J Mol Cell Cardiol,vol.50,no.5,pp. 777-784,2011)。在心力衰竭猪模型中使用AAV6-S100A1的另一项研究证明了S100A1过表达的安全性，证实心律失常或右心室功能障碍未增加；然而，左心室射血分数和心脏重塑显著增加(Weber等人, Gene Ther,vol.21,pp.131-138,2014)。诸如此类的研究支持在具有终末期心力衰竭的人中进行S100A1疗法的潜力。

SDF-1α

基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)是8kDa的趋化因子，其在募集心脏干细胞、抑制心肌细胞死亡以及通过与间充质干细胞上的受体 CXCR4结合而改善心脏功能方面起重要作用(Penn等人,Gene Ther, vol.19,no.6,pp.583-587,2012)。在若干临床试验中测试了编码人 SDF-1α的非病毒DNA质粒(Penn等人,Circ Res,vol.112,no.5,pp. 816-825,2013；和Chung等人,Eur Heart J,vol.36,pp.2228-2238,2015)。这些试验的结果表明，SDF-1α的过表达是相对安全的，而没有发生严重的非预期的相关不良事件，包括心律失常或进展为进一步心力衰竭发作。这项研究还表明，SDF-1α过表达可以改善以15mg或30mg 剂量心肌内注射CHF的患者的功能。此外，发现以45mg的剂量通过冠状窦逆行递送的质粒DNA是安全的。

VEGF

血管内皮生长因子(VEGF)蛋白质家族参与新血管形成、内皮细胞迁移和活化、干细胞募集和组织再生((Taimeh等人,Nat Rev Cardiol,vol.10,no.9,pp.519-530,2013)。功能失调的血管调节是心力衰竭病理生理学的重要组成部分，并且在晚期心力衰竭模型中观察到 VEGF水平降低。VEGF有许多同种型。然而，VEGF165已经用于临床前和临床模型两者。使用载体如裸质粒DNA和腺病毒的基因转移在动物模型中显示改善的侧支灌注和总体心脏功能已经证实了靶向 VEGF作为心力衰竭的治疗选择的效用。已经将VEGF165的临床应用作为直接注射的pDNA和通过具有积极但有限结果的病毒载体进行研究。在某些实施方案中，VEGF 165具有包含本文公开的VEGF191 序列的氨基酸27-191的序列。在某些实施方案中，VEGF 165具有包含本文公开的VEGF191序列的氨基酸27、28、29、30、31、32、33，或34至180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190 或191的序列。在某些实施方案中，VEGF165具有包含本文公开的 VEGF191序列的氨基酸30-185的序列。

结合每个单独基因(即，S100A1、SDF1α和VEGF165)使用的 CAG启动子已经证实了对瘢痕组织、心脏功能和重塑的单独效应。每个基因的效应在心脏组织上是独一无二的。全部三种基因的潜在增强效应仅在体外进行了测试。然而，已经证明，局部施用VEGF与SDF-1α的组合在后肢缺血的鼠模型中通过促进内皮祖细胞诱导的新血管生成而得以增强(Yu等人,J Vasc Surg,vol.50,no.3,pp.608-616, 2009)。

因此，本文提供了编码多肽的多核苷酸构建体(例如但不限于非病毒质粒载体)，该多肽包含第一功能性(即生物活性)多肽、第二功能性多肽和可选的第三功能性多肽。

本文提供了多核苷酸构建体，其编码包含S100多肽、第二功能性多肽和可选的第三功能性多肽的多肽，其中第二功能性多肽和可选的第三功能性多肽包含细胞因子、趋化因子或血管生成多肽中的任何一种。

本文提供了包含编码多肽连接体序列的多核苷酸序列的多核苷酸构建体，该多肽连接体序列用于隔开第一功能性多肽和第二功能性多肽以及可选地分离第二功能性多肽和第三功能性多肽。

提供了由本文所述的多核苷酸编码的多肽。还提供了包含至少一种本文所述的多核苷酸或载体的细胞。

本文提供了治疗心脏病况的方法，该方法包括使细胞与治疗有效量的本文所述的多核苷酸相接触。在一些情况下，所述细胞为心肌细胞。

本文提供了治疗受试者中的心脏疾病和病症(例如但不限于充血性心力衰竭(CHF))的方法，该方法包括向受试者提供治疗有效量的包含本文所述的多核苷酸或载体的组合物。在一些情况下，受试者为哺乳动物或人类受试者。在一些情况下，对受试者施用至少一种附加疗法。

本文提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所述的多核苷酸或由本文所述的多核苷酸编码的多肽和药学上可接受的赋形剂。

提供了组合物，该组合物包含：至少一种质粒微泡复合物，其中所述微泡包含脂质、气体和包含本文所述多核苷酸的质粒。在一些实施方案中，所述脂质形成包封所述气体和质粒的壳。在一些情况下，所述气体为全氟化碳气体，诸如全氟丙烷。在一些实施方案中，所述微泡复合物包含1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺甘油中的至少一种。

提供了方法，该方法包括向受试者施用本文所述的质粒微泡复合物组合物；以及使所述受试者接触足以导致至少一种微泡在预定组织或器官处超声破裂的超声能量。在一些情况下，所述至少一种微泡在所述预定组织或器官处的破裂将所述质粒递送至所述组织或器官中。在一些情况下，所述组织或器官为器官，该器官可以为心脏、肝脏或肾。

提供了治疗受试者中的心脏疾病或病症(例如但不限于充血性心力衰竭、心肌病、心律失常、心包疾病、主动脉疾病、马方综合征和冠状动脉疾病)的方法，该方法包括：向所述受试者施用一定量的本文所述的质粒微泡复合物组合物；使所述受试者接触足以导致所述至少一种微泡的超声破裂的超声能量并将所述质粒递送至所述受试者的心脏。

附图说明

在所附权利要求中具体阐述了本发明的独特且优选的特征。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案进行阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的理解，在附图中：

图1显示了通过包含本文所述连接体序列的新型载体构建体的替代构型实现心脏效应物基因的非病毒递送的方法。

图2示出了通过用SPBc2(重组酶)转染引入包含att位点萤光素酶的载体，在原代细胞中(体外)从包含本文所述连接体的构建体持久表达心肌细胞中的萤光素酶。缺乏att位点或重组酶的细胞迅速回复到基线表达水平。第2天(D2)，第5天(D5)，第9天(D9)，第14天(D14)。

图3示出了通过用本文所述的连接体分隔，在啮齿动物模型中从可以表达心脏效应物基因((编码生物活性SDF1α、S100A1和VEGF 的pXoX))的质粒载体骨架所获得的萤光素酶表达的数据。

图4示出了心力衰竭病况的各个进展阶段和相应的干预和治疗标准照护模式及方法。

图5A和图5B示出了HUVEC增殖测定。A.重组VEGF处理后的HUVEC增殖。B.示出了用VEGF转染的诱导多能干细胞(iPSC) 细胞上清液处理后的HUVEC增殖。转染iPSC细胞并温育96小时。收集上清液并用于培养HUVECS。通过CellTiter-Glo测量HUVEC增殖。

图6示出了用转染的心肌细胞-iPSC上清液处理后的HUVEC 增殖。从具有扩张型心肌病(DCM)(肥厚型心肌病(HCM))或健康对照的患者中获得心肌细胞-iPSC，证明了由本文所述的多核苷酸编码的功能性多肽(包含本文公开的连接体)的成功表达和活性。

图7示出了用单基因、双基因和三基因SDF1多肽构建体转染的iPSC-CM，其显示外周血淋巴细胞(PBL)迁移增多，证明了由本文所述的多核苷酸编码的功能性多肽(包含本文公开的连接体)的成功表达和活性。

图8示出了其中AMD3100(CXCR4拮抗剂)特异性抑制 SDF1-CXCR4依赖性迁移的迁移测定。数据显示SDF1在双基因和三基因构建体中是功能性的，因为在AMD3100的存在下迁移得到减少。

图9示出了在猪中的研究，其中生物发光图像图示了通过报道分子质粒的冠状窦的逆行灌注，还引入本文所述的连接体，导致递送至心脏并于24小时后表达所递送的报道基因。通过猪心脏冠状窦逆转输注萤光素酶表达质粒后24小时的辐射强度和分布。一式三份测试三个质粒剂量(40、80和120mg)。

图10示出了其中用表达SDF1的双基因和三基因构建体转染心肌细胞的迁移测定。使用来自iPSC CM的上清液的Jurkat细胞迁移显示经转染和SDF1蛋白质是功能性的并产生显著的迁移，证实了由本文所述的多核苷酸编码的功能性多肽(包含本文公开的连接体)的成功表达和活性。

图11示出了其中用表达SDF1的双基因和三基因构建体转染心肌细胞的迁移测定。使用来自iPSC CM的上清液的Jurkat细胞迁移显示转染和SDF1蛋白质是功能性的并且产生显著的迁移。数据显示 Jurkat细胞的剂量依赖性迁移，证实了由本文所述的多核苷酸编码的功能性多肽(包含本文公开的连接体)的成功表达和活性。

图12示出了来自扩张型心肌病受试者的心肌细胞用编码SDF1 的双基因和三基因构建体予以转染。数据显示SDF1依赖性Jurkat细胞迁移。在扩张型心肌病iPSC-CM中由双基因和三基因载体构建体表达的SDF1是功能性的。

图13示出了来自肥厚型心肌病受试者的心肌细胞用编码SDF1 的双基因和三基因构建体予以转染。数据显示SDF1依赖性Jurkat细胞迁移。在肥厚型心肌病iPSC-CM中由双基因和三基因构建体表达的SDF1是功能性的。

图14A和图14B示出了在HUVECS上进行的增殖测定。A.示出了来自DCM受试者、利用双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生能够诱导HUVEC增殖的功能性VEGF蛋白质。(注意：样品8 未在Run1、Run2中测试)。图14B示出了来自健康受试者、利用双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生能够诱导HUVEC增殖的功能性VEGF蛋白质。

图15A和图15B描绘了用编码S100A1-SDF1的双基因载体转染的293T细胞中的SDF1蛋白质表达。A.显示SDF1吸光度的ELISA 测定标准曲线。B.在293T上清液中的SDF1浓度。数据证实了由本文所述的多核苷酸编码的功能性(即生物活性)多肽(包含本文公开的连接体)的成功表达。

图16A和图16B描绘了用编码S100A1-VEGF191的双基因载体转染的293T细胞中的VEGF蛋白质表达。A.显示VEGF吸光度的 ELISA测定标准曲线。B.在293T上清液中的VEGF浓度。该数据证实了由本文所述的多核苷酸编码的功能性(即生物活性)多肽(包含本文公开的连接体)的成功表达。

图17A和图17B描绘了用编码S100A1-SDF1的双基因载体转染的293T细胞中的S100A1蛋白质表达。A.显示S100A1吸光度的 ELISA测定标准曲线。B.在293T裂解物中的S100A1浓度。该数据证实了由本文所述的多核苷酸编码的功能性(即生物活性)多肽(包含本文公开的连接体)的成功表达。

图18示出了由用单基因、双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生的S100A1浓度的条形图。

图19示出了由用单基因、双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生的SDF-1α浓度的条形图。

图20示出了由用单基因、双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生的VEGF浓度的条形图。

图21示出了由用单基因、双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生的S100A1多肽切割的Western印迹(免疫印迹)检测。

图22示出了由用单基因、双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生的SDF-1α多肽切割的Western印迹(免疫印迹)检测。

图23示出了由用单基因、双基因和三基因构建体转染的心肌细胞产生的VEGF多肽切割的Western印迹(免疫印迹)检测。

图24示出，如通过非变性PAGE和免疫印迹法所检测的，利用本发明的连接体，从三基因构建体表达的二聚体S100A1的形成。

图25A和图25B示出了来自扩张型心肌病患者与健康对照的 iPSC细胞在以下方面的比较：A.用pStuffer、编码pS100A1的载体或编码包含2A尾的S100A1的载体转染的iPSC细胞的搏动速率。 B.用pStuffer、编码pS100A1的载体或编码包含2A尾巴的S100A1 的载体的iPSC细胞的搏动速率的收缩持续时间。数据表明在编码 S100A1的载体的3’端存在2A尾不影响S100A1的功能。(pStuffer 为具有与pXoX相同的骨架构型的质粒，其中开放阅读框(ORF)被替换为非表达、大小相似的填充序列。)

图26A、图26B和图26C示出了来自扩张型心肌病患者与健康对照的iPSC细胞在以下方面的比较：A.用DNA1 (CAGStufferNXB-V2)、DNA2(CAG-S100A1(无kozak)、DNA3 (CAG-S100A1-fp2a-SDF1)、DNA4(CAG-S100A1-fp2a-SDF1-fp2a-VEGF)、 DNA 5(CAG-S100A1-CMV-SDF1-fp2a-VEGF191)转染的iPSC细胞或未转染之对照的搏动速率。B.用DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5 转染的iPSC细胞或未转染之对照的收缩速率。C.DNA1、DNA2、DNA3、 DNA4、DNA5或未转染之对照的收缩持续时间。数据显示DCM收缩特性恢复至健康对照水平。

图27A和图27B示出了编码S100A1、SDF-1α和VEGF165的三基因载体。图27A示出了编码生物活性SDF1α、S100A1和VEGF 的pXoX三基因载体的示意图。图27B鉴别了三基因载体中的单个基因元件。

图28示出了在重组酶滴定实验中关于VEGF表达的数据。数据表明VEGF整合到基因组DNA中。

图29示出了在重组酶滴定实验中关于SDF-1α表达的数据。数据表明SDF-1α整合到基因组DNA中。

图30示出了在重组酶滴定实验中关于S100A1表达的数据。数据表明S100A1整合到基因组DNA中。

图31A-C示出了通过超声心动图测量心脏结构的体内治疗结果，并且其为缩短率的函数。图31A示出了作为缩短率百分比的函数的结果。图31B示出了pStuffer构建体与pXoX构建体相比的左心室后壁厚度(cm)。图31C示出了pStuffer构建体与pXoX构建体相比的IVSd (cm)。数值以平均值±SEM表示。**P<0.001，相比于pStuffer。

图32示出了心肌细胞中PHH3(磷酸-组蛋白H3(Ser10))有丝分裂标记信号的核定位结果，其证实了心肌细胞再生。每个质粒8 只大鼠中的4只的代表性图像。比例尺是25μm。

图33示出了证明ISL-1阴性结果的成像结果，ISL-1是早期心脏祖细胞的标志物，确认祖细胞不参与再生。因此观察到的心肌细胞再生是UTMD-pXoX基因疗法的结果。每个质粒8只大鼠中的4只的代表性图像。比例尺是25μm。

具体实施方式

以下描述和实例详细说明了本发明的实施方案。应该理解，本发明不限于本文所述的特定实施方案，并且因此可以变化。本领域技术人员将认识到，本发明存在许多变化和修改，这些涵盖在本发明的范围内。

所有术语旨在被理解成它们将被本领域技术人员所理解的那样。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。以下定义补充了本领域的那些定义，并且针对本申请，并且不应归咎于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于测试本公开内容的实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。

S100蛋白质家族包括例如S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、 S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、S100A10、S100A11、 S100A12、S100A13、S100A14、S100A15和S100A16。在一些情况下是类似于S100A蛋白质的蛋白质，例如S100A7L(S100钙结合蛋白A7样)。其他S100蛋白质包括S100B、S100G、S100P和S100Z，以及其变体和片段，它们可以包含在本文所述的实施方案中。本文所述的实施方案中还包括S100蛋白质，其为可由本文所述的载体表达的伪基因产物的结果。[61]

SDF蛋白质家族包括例如由可编码内分泌家族的基质细胞衍生的α趋化因子成员的抗微生物基因编码的蛋白质。[62]本文所述的实施方案可以包含编码的蛋白质，其可以充当G蛋白偶联受体、趋化因子(CXC基序)受体4的配体，并且可以在包括胚胎发生、免疫监视、炎性反应、组织内稳态和肿瘤生长和转移在内的许多不同细胞功能中起作用。还包括编码不同同种型的转录物变体，并且所述同种型和转录物变体可以由本文所述的载体表达。在一些本文描述的实施方案中是SDF家族蛋白质，其中前两个半胱氨酸残基被一个氨基酸隔开 (C-X-C趋化因子)。以下蛋白质同种型已经在人类中鉴别并且可以由本文所述的载体表达，并且包括在本文所述的方法和组合物中： SDF-1α、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε和SDF-1θ，以及其片段和变体。

本文所述的VEGF蛋白质家族包括PDGF/VEGF生长因子家族的成员。例如，本文所述的方法和组合物中包括的可以是VEGF121、 VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、 VEGF206的剪接变体和同种型以及其片段和衍生物。[63]。

在一些情况下，S100多肽可以是S100A1及其任何功能性衍生物。在一些实施方案中，第二功能性多肽可以是血管生成多肽。血管生成多肽可以是血管内皮生长因子(VEGF)多肽。在几个实施方案中，VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206，其片段和变体。在某些实施方案中，VEGF 165具有包含本文公开的VEGF191序列的氨基酸 27-191的序列。在某些实施方案中，VEGF 165具有包含本文公开的 VEGF191序列的氨基酸27、28、29、30、31、32、33，或34至180、 181、182、183、184、185、186、187、188、189、190或191的序列。在某些实施方案中，VEGF165具有包含本文公开的VEGF191序列的氨基酸30-185的序列。在一些情况下，本文所述的VEGF多肽可以包含与本文公开的VEGF 191或VEGF165的序列具有至少45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些情况下，VEGF多肽可以包含与本文公开的VEGF 191 多肽的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或99％同一性的序列。

在其他实施方案中，第三功能性多肽可以是趋化因子。该趋化因子可以是基质细胞衍生因子1(SDF)多肽。SDF多肽可以选自SDF1、 SDF-1α、SDF-1β，其片段和变体。[62]。SDF多肽可以包含与本文公开的SDF1多肽的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

在本文所述的一些实施方案中，S100多肽可以通过第一多肽连接体连接至第二多肽。在一些情况下，该多肽连接体可以是可切割的连接体或不可切割的连接体。

本文提供了这样的实施方案，其中由本文所述的多核苷酸编码的多肽构建体可以包含钙结合蛋白(S100)多肽、第二功能性多肽并且进一步包含第三功能性多肽。在一些情况下，第三功能性多肽可以是细胞因子、趋化因子、血管生成多肽及其任何功能性衍生物中的任一种。

在某些实施方案中，第三功能性多肽可以是血管生成多肽。在一些实施方案中，该血管生成多肽可以是VEGF多肽。VEGF多肽可以选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、 VEGF189、VEGF191、VEGF206，其片段和变体。VEGF多肽可以包含与VEGF165多肽的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些情况下， VEGF多肽可以包含与VEGF191多肽具有至少45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，第三功能性多肽可以是趋化因子。在某些实施方案中，该趋化因子可以是SDF多肽。在一些实施方案中，该 SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β，其片段和变体。在一些情况下，该SDF多肽可以包含与本文所述的SDF1多肽具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，第三功能性多肽可以通过可任选可切割的第二多肽连接体连接至所述S100多肽和所述第二功能性多肽中的至少一个。多肽连接体可以独立地选自本文所述的连接体。

本文提供了编码包含至少第一多肽和第二多肽的至少一种多肽构建体的多核苷酸，其中第一多肽可以是血管生成多肽，且第二多肽可以是趋化因子或其变体或片段。在一些情况下，血管生成多肽可以是选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206，其片段和变体的VEGF多肽。多肽可以包含与VEGF多肽的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

提供了包含与VEGF191的序列具有至少45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列的VEGF 多肽。在一些情况下，第二多肽可以是SDF多肽。SDF多肽可以选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β，其片段和变体。在一些情况下，SDF多肽可以包含与SDF1的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

本文提供了改善受试者中的血管发生的方法，该方法包括向所述受试者提供治疗有效量的组合物，该组合物包含本文所述的多核苷酸或由本文所述的多核苷酸编码的多肽。

本文提供了表达载体，其包含与选自SDF1多肽、S100A1多肽、 VEGF多肽及其片段和变体的至少两种多肽可操作地连接的至少一种启动子。在一些情况下，至少两个多肽通过连接体连接。在一些情况下，至少一种启动子可以选自CAG启动子、CMV启动子、SV40启动子、腺病毒启动子、β肌动蛋白启动子、金属硫蛋白(metallothionin) 启动子、EF1a启动子、肌球蛋白轻链启动子、肌球蛋白重链启动子、 NCX1启动子和其他合适的心脏启动子。表达载体可以是心脏表达载体。

本文提供了包含至少第一多肽和第二多肽的多肽构建体，其中第一多肽可以是钙结合蛋白或其变体或片段，并且第二多肽可以是血管生成多肽、趋化因子或其变体或片段。还公开了包含至少第一多肽、第二多肽和第三多肽的多肽构建体，其中第一多肽可以是血管生成多肽或其变体或片段，第二多肽可以是趋化因子或其变体或片段；并且第三多肽可以是钙结合蛋白或其变体或片段。在一些情况下，本文所述的多肽构建体可以包含S100A1、其变体或片段。在一些情况下，多肽构建体可以包含SDF1、其变体或片段。在其他情况下，本文所述的多肽构建体可以包含VEGF、其变体或片段。

提供了药物组合物，其包含本文所述的多核苷酸或本文提供的多肽构建体，或由本文所述的多核苷酸编码的多肽构建体，以及药学上可接受的赋形剂。本文提供治疗受试者中的心脏疾病和病症的方法，该方法包括向受试者提供治疗有效量的组合物，该组合物包含本文所述的多核苷酸或本文提供的多肽构建体，或由本文所述的多核苷酸编码的多肽构建体。

在一些实施方案中，编码本文所述多肽构建体的多核苷酸构建体进一步包含通过第二连接体多肽连接至第二功能性多肽的第三功能性多肽。在一些情况下，第三功能性多肽可以选自由VEGF、SDF1、 S100A1、其变体和衍生物组成的列表。在一些情况下，第二连接体可以与本文所述的第一连接体相同或不同。在一些情况下，所述连接体和功能性多肽可以在框内表达。

本文提供了包含本文所述的多核苷酸的细胞。

本文提供了一种方法，该方法包括：使至少一个心脏细胞与编码包含至少第一多肽和第二多肽的多肽构建体的多核苷酸相接触，其中第一多肽为血管生成多肽变体或其片段；并且第二多肽为趋化因子、钙结合蛋白或其变体或片段中的至少一种。在一些实施方案中，血管生成多肽变体或其片段可以是选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、 VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206、其片段和变体的VEGF多肽。VEGF多肽可以包含与VEGF165的序列具有至少 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或 99％同一性的序列。在某些实施方案中，VEGF 165具有包含本文公开的VEGF191序列的氨基酸27-191的序列。在某些实施方案中， VEGF 165具有包含本文公开的VEGF191序列的氨基酸27、28、29、 30、31、32、33，或34至180、181、182、183、184、185、186、187、 188、189、190或191的序列。在某些实施方案中，VEGF165具有包含本文公开的VEGF191序列的氨基酸30-185的序列。在一些情况下，本文所述的VEGF多肽可以包含与本文公开的VEGF191或VEGF165 的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％或99％同一性的序列。VEGF多肽可以包含与VEGF191的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％或99％同一性的序列。在一些情况下，第二多肽可以是趋化因子。趋化因子可以是基质细胞衍生因子1(SDF)多肽。在一些情况下，用于本文提供的组合物和方法的SDF多肽可以选自SDF1、 SDF-1α、SDF-1β，其片段和变体。SDF多肽可以包含与SDF1-α具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％或99％同一性的序列。

在一些情况下，可以离体引入编码多肽构建体的多核苷酸。在某些实施方案中，可以体内引入编码多肽构建体的多核苷酸。体内引入可以选自经皮冠状动脉导管插入、冠状静脉阻塞、心脏再循环，顺行冠状动脉输注、逆行灌注、直接注射及其任何组合。

本文提供了在受试者中治疗受试者中的心脏疾病或病症(例如但不限于通过改善血管发生、心脏功能或心脏重塑)的方法，该方法包括向所述受试者施用一定量的多核苷酸，该多核苷酸编码包含SDF 多肽和S100多肽中的至少一种以及VEGF多肽的构建体。本文所述的实施方案中的VEGF多肽可以选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、 VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206，其片段和变体。VEGF多肽可以包含与VEGF165的序列具有至少45％、50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在某些实施方案中，VEGF 165具有包含本文公开的VEGF191序列的氨基酸27-191的序列。VEGF多肽可以包含与VEGF191的序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％或99％同一性的序列。SDF多肽可以选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β，其片段和变体。S100多肽可以是S100A1，其片段或变体。

在某些实施方案中，用本发明的方法和组合物治疗的受试者可具有充血性心力衰竭(CHF)。受试者可以在合适的位置有左心室辅助装置(LVAD)。受试者可能患有心肌病。心肌病可以选自扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、致心律失常性右室心肌病(ARVC)及其任何组合。

在进一步的实施方案中，用本发明的方法和组合物治疗的受试者可以具有以下疾病中的任何一种或多种：动脉瘤、动脉粥样硬化、先天性心脏缺陷、心包病症、急性失代偿性心力衰竭、心绞痛、动脉硬化性心脏病、运动员心脏综合征、房室瘘、自身免疫性心脏病、心脏的褐色萎缩、心脏淀粉样变性、心律失常、心性哮喘、心脏收缩性调节、心脏综合征x、心源性休克、心脏肥大、心肌病、心脏病恐怖症、心肾综合征、心脏毒性、心血管疾病、心脏炎、慢性风湿性心脏病、靴形心(coeur en sabot)、冠状动脉动脉瘤、冠状动脉异常、冠状动脉病、冠状动脉夹层(coronary artery dissection)、冠状动脉扩张、冠状动脉闭塞、冠状动脉窃血、冠状动脉血栓形成、冠状血管痉挛、柯萨奇病毒诱导的心肌病、舒张性心力衰竭、德雷斯勒综合征 (dressler syndrome)、杜罗齐埃病(duroziez's disease)、艾森门格综合征(eisenmenger's syndrome)、胎样心音、embryonic recall、心内膜纤维弹性组织增生、具有保留射血分数的心力衰竭、心脏肿瘤、高输出心力衰竭、高动力性心前区、高血压心脏病、特发性巨细胞心肌炎、炎性心脏病、心室间不同步、心室内不同步、缺血性心脏疾病、孤立性心房淀粉样变性、克山病(keshan disease)、kounis综合征、mydicar、心肌桥、心肌混乱、心肌破裂、心肌瘢痕、心肌顿抑、心肌炎、非细菌性血栓性心内膜炎、心门疾病(ostial disease)、外周动脉疾病、磷和非动脉粥样硬化心脏病、心包切开术后综合征、压力控制间歇性冠状窦闭塞(picso)、心肺复苏恢复、创伤性心脏骤停恢复、电轴右偏(right axis deviation)、风湿性心脏病、勒姆里尔德综合征(roemheld syndrome)、饱和脂肪和心血管疾病争论、scar-fc、shone综合征、亚急性细菌性心内膜炎、心脏瓣膜病、心室壁瘤和病毒性心肌病。

本文提供了治疗或预防受试者中的心血管病况的方法，该方法包括：向受试者施用一定量的包含S100A多肽和第二功能性多肽的构建体，其中所述第二功能性多肽为细胞因子、趋化因子和血管生成多肽中的至少一种。在一些情况下，可以对受试者进行预防性施用。在一些情况下，可以对受试者进行治疗性施用。在一些情况下，可以对受试者施用针对所述受试者的至少一次附加治疗。在一些情况下，第二功能性多肽可以是VEGF、SDF或其组合。

本文提供了方法，该方法包括向受试者施用至少一种包含编码本文所述多肽序列的多核苷酸的非病毒载体，所述多肽包含至少两种功能性蛋白质或其部分；至少一种启动子；和至少一个工程化重组位点；其中所述至少一种启动子驱动所述至少两种功能性蛋白质的表达。在一些情况下，至少一种启动子可以是组成型的。在一些情况下，至少一种启动子可以是组织特异性的。在一些情况下，至少一种启动子可以是诱导型的。在一些情况下，至少一种组织特异性启动子是肌球蛋白轻链(MLC)启动子。在一些情况下，诱导型启动子是基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮激素受体的基因开关。

诱导型启动子利用配体对所述至少两种基因的表达进行剂量调节的控制。在一些情况下，配体可以选自蜕皮类固醇、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N,N’-二酰基肼、噁二唑啉、二苯甲酰基烷基氰基肼、N-烷基-N,N’-二芳酰基肼、N-酰基-N-烷基羰基肼、N-芳酰基-N- 烷基-N’-芳酰基肼、氨基酮(arnidoketones)、3,5-二-叔丁基-4-羟基-N- 异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(R)羟基胆甾醇、 24(S)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3- 硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1,1- 二膦酸酯、保幼激素III、RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2- 二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、 RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3- 甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)及其任何组合。连接体可以是可切割的连接体。

在一些实施方案中，第一功能性多肽和第二功能性多肽通过第一连接体多肽连接，其中第一连接体多肽包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少40％、50％、60％、80％或100％同一性的序列。在一些情况下，该连接体多肽包含选自下组的序列：APVKQ(SEQ IDNO: 42)、GPVKQ(SEQ ID NO:43)、VPVKQ(SEQ ID NO:44)、IPVKQ (SEQ ID NO:45)、MPVKQ(SEQ ID NO:46)、APIKQ(SEQ ID NO: 47)、GPIKQ(SEQ ID NO:48)、VPIKQ(SEQ ID NO:49)、IPIKQ (SEQ ID NO:50)、MPIKQ(SEQ ID NO:51)、APAKQ(SEQ ID NO: 52)、GPAKQ(SEQ IDNO:53)、VPAKQ(SEQ ID NO:54)、IPAKQ (SEQ ID NO:55)、MPAKQ(SEQ ID NO:56)、APVRQ(SEQID NO: 57)、GPVRQ(SEQ ID NO:58)、VPVRQ(SEQ ID NO:59)、IPVRQ (SEQ ID NO:60)、MPVRQ(SEQ ID NO:61)、APIRQ(SEQ ID NO: 62)、GPIRQ(SEQ ID NO:63)、VPIRQ(SEQ ID NO:64)、IPIRQ (SEQ ID NO:65)、MPIRQ(SEQ ID NO:66)、APARQ(SEQ ID NO: 67)、GPARQ(SEQ IDNO:68)、VPARQ(SEQ ID NO:69)、IPARQ (SEQ ID NO:70)、MPARQ(SEQ ID NO:71)、APVKN(SEQID NO: 72)、GPVKN(SEQ ID NO:73)、VPVKN(SEQ ID NO:74)、IPVKN (SEQ ID NO:75)、MPVKN(SEQ ID NO:76)、APIKN(SEQ ID NO: 77)、GPIKN(SEQ ID NO:78)、VPIKN(SEQ ID NO:79)、IPIKN (SEQ ID NO:80)、MPIKN(SEQ ID NO:81)、APAKN(SEQ ID NO: 82)、GPAKN(SEQ IDNO:83)、VPAKN(SEQ ID NO:84)、IPAKN (SEQ ID NO:85)、MPAKN(SEQ ID NO:86)、APVRN(SEQID NO: 87)、GPVRN(SEQ ID NO:88)、VPVRN(SEQ ID NO:89)、IPVRN (SEQ ID NO:90)、MPVRN(SEQ ID NO:91)、APIRN(SEQ ID NO: 92)、GPIRN(SEQ ID NO:93)、VPIRN(SEQ ID NO:94)、IPIRN (SEQ ID NO:95)、MPIRN(SEQ ID NO:96)、APARN(SEQ ID NO: 97)、GPARN(SEQ IDNO:98)、VPARN(SEQ ID NO:99)、IPARN (SEQ ID NO:100)和MPARN(SEQ ID NO:101)。在一些情况下，多肽连接体还可以包含一个或多个GS连接体序列，例如(GS)n(SEQ ID NO: 109)、(SG)n(SEQ ID NO:110)、(GSG)n(SEQ ID NO:111)和(SGS)n (SEQ ID NO:112)，其中n可以是从零到十五的任何数字。在一些实施方案中，第一功能性多肽可以不同于第二功能性多肽。

在一些实施方案中，方法可以进一步包括向受试者施用至少一种次级载体。至少一种次级载体可以是mRNA。至少一种次级载体可以是质粒。在一些实施方案中，至少一种次级载体可以包含至少一种重组酶。重组酶可以选自单核细胞增生李斯特菌噬菌体重组酶、酿脓链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶。在一些实施方案中，可以通过重组酶将至少两种基因整合到受试者的基因组中。在一些实施方案中，至少一个重组位点可以是噬菌体基因组重组附着位点(attP) 或细菌基因组重组附着位点(attB)。在一些实施方案中，如本文在本发明中所述使用的重组酶包含位点特异性丝氨酸重组酶；例如但不限于SpBC2重组酶(参见例如2015年5月19日授权的美国专利号 9,034,650(美国公开号2006/0172377)，其通过引用以其全文并入本文)。

载体可以是优质生产规范(GMP)兼容的。

提供了包含与选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40的序列具有至少40％、50％、60％、 80％或100％同一性的序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含与选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQID NO:38 和SEQ ID NO:40的序列具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或99％同一性的序列。

提供了包含与选自SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:106的序列具有至少40％、50％、60％、80％或100％同一性的序列的多肽。在一些实施方案中，多肽包含与选自SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:106的序列具有至少45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

提供了包含与由SEQ ID NO.108的核酸序列编码的多肽序列具有至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％或99％同一性的序列的多肽。

本文提供了编码多肽构建体的多核苷酸，该多肽构建体包含通过第一连接体多肽连接的第一功能性多肽和第二功能性多肽，其中第一连接体多肽包含与序列APVKQ具有至少40％、50％、60％、80％或 100％同一性的序列。在一些情况下，该连接体多肽包含选自APVKQ (SEQ ID NO:42)的序列。在一些情况下，该连接体多肽包含选自下组的序列：APVKQ(SEQ ID NO:42)、GPVKQ(SEQ ID NO:43)、 VPVKQ(SEQ ID NO:44)、IPVKQ(SEQ ID NO:45)、MPVKQ(SEQ ID NO:46)、APIKQ(SEQ ID NO:47)、GPIKQ(SEQ ID NO:48)、 VPIKQ(SEQ ID NO:49)、IPIKQ(SEQ ID NO:50)、MPIKQ(SEQ ID NO:51)、APAKQ(SEQ ID NO:52)、GPAKQ(SEQ IDNO:53)、 VPAKQ(SEQ ID NO:54)、IPAKQ(SEQ ID NO:55)、MPAKQ(SEQ ID NO:56)、APVRQ(SEQID NO:57)、GPVRQ(SEQ ID NO:58)、 VPVRQ(SEQ ID NO:59)、IPVRQ(SEQ ID NO:60)、MPVRQ(SEQ ID NO:61)、APIRQ(SEQ ID NO:62)、GPIRQ(SEQ ID NO:63)、 VPIRQ(SEQ ID NO:64)、IPIRQ(SEQ ID NO:65)、MPIRQ(SEQ ID NO:66)、APARQ(SEQ ID NO:67)、GPARQ(SEQ ID NO:68)、 VPARQ(SEQ ID NO:69)、IPARQ(SEQ ID NO:70)、MPARQ(SEQ ID NO:71)、APVKN(SEQ IDNO:72)、GPVKN(SEQ ID NO:73)、 VPVKN(SEQ ID NO:74)、IPVKN(SEQ ID NO:75)、MPVKN(SEQID NO:76)、APIKN(SEQ ID NO:77)、GPIKN(SEQ ID NO:78)、 VPIKN(SEQ ID NO:79)、IPIKN(SEQ ID NO:80)、MPIKN(SEQ ID NO:81)、APAKN(SEQ ID NO:82)、GPAKN(SEQ ID NO:83)、VPAKN(SEQ ID NO:84)、IPAKN(SEQ ID NO:85)、MPAKN(SEQ ID NO:86)、APVRN(SEQ ID NO:87)、GPVRN(SEQ ID NO:88)、 VPVRN(SEQ ID NO:89)、IPVRN(SEQ ID NO:90)、MPVRN(SEQ IDNO:91)、APIRN(SEQ ID NO:92)、GPIRN(SEQ ID NO:93)、 VPIRN(SEQ ID NO:94)、IPIRN(SEQID NO:95)、MPIRN(SEQ ID NO:96)、APARN(SEQ ID NO:97)、GPARN(SEQ ID NO:98)、 VPARN(SEQ ID NO:99)、IPARN(SEQ ID NO:100)和MPARN(SEQ ID NO:101)。在一些情况下，多肽连接体还可以包括一种或多种GS 连接体序列，例如(GS)n(SEQ ID NO:113)、(SG)n(SEQ IDNO:114)、 (GSG)n(SEQ ID NO:115)和(SGS)n(SEQ ID NO:116)，其中n可以是从1到15的任何数字。在一些实施方案中，第一功能性多肽可以不同于第二功能性多肽。在其他情况下，所述第一和第二功能性多肽中的至少一个可以是蛋白质、激素、抗体、糖蛋白，或其衍生物或片段。

本文提供了编码包含弗林蛋白酶多肽和2A多肽的多肽构建体的多核苷酸，其中弗林蛋白酶多肽和2A多肽通过包含至少三种疏水性氨基酸的多肽连接体来连接。在一些情况下，至少三种疏水性氨基酸选自由甘氨酸(Gly)(G)、丙氨酸(Ala)(A)、缬氨酸(Val)(V)、亮氨酸(Leu)(L)、异亮氨酸(Ile)(I)、脯氨酸(Pro) (P)、苯丙氨酸(Phe)(F)、甲硫氨酸(Met)(M)、色氨酸(Trp) (W)组成的列表。

提供了由本文所述的多核苷酸编码的多肽和包含这些多肽的组合物。还提供了治疗性和/或诊断性方法，该方法包括使个体与本文公开的多核苷酸或由其表达的多肽或其衍生物或缀合物相接触。

提供了获得多肽构建体的改进表达的方法，其包括：提供编码包含第一功能性多肽和第二功能性多肽的所述多肽构建体的多核苷酸，其中所述第一功能性多肽和第二功能性多肽通过连接体多肽连接，该连接体多肽包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列；和在宿主细胞中表达所述多核苷酸，其中与不具有包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列的连接体多肽的相应多肽构建体相比，所述表达导致多肽构建体的改进表达。

如本文所用的关于参考数值的术语“约”及其语法上的等同物可以包括数值本身以及该数值加或减10％的数值范围。例如，“约10” 的量包括10以及9至11的任何量。例如，关于参考数值的术语“约” 还可以包括该数值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、 2％或1％的数值范围。

术语“心血管疾病”和“循环障碍”可互换使用，并且在本文中用于描述由循环系统的损害引起的疾病或病症，并且可以通过向受试者的心脏和/或循环系统的受损区域提供治疗有效量的本文所述多核苷酸或由本文公开的多核苷酸编码的多肽构建体来减少和/或减轻该损害。如本文所用的术语“循环损害”用于指可能由多种疾病或病症中的任何一种引起的对循环系统的损伤。可以使用本文所述的多核苷酸或由本文公开的多核苷酸编码的多肽构建体以及根据本发明的方法治疗的示例性心血管疾病包括例如心肌梗死、心肌病、外周血管疾病、先天性心脏病、其他遗传疾病，以及由缺血、意外事故、环境危害造成的损伤或创伤。另外，本文所述的治疗有效量的多核苷酸或由本文公开的多核苷酸编码的多肽构建体可以用于降低和/或消除对受试者的心脏病发作的中枢神经系统的影响，否则这种影响由所述受试者的大脑中的部位缺乏血流或缺血而引起或者由于对大脑和/或脊髓的物理损伤而出现。

如本文所用的术语“载体”或语法上的等同物可以是指能够指导感兴趣的多肽构建体表达并且可用于将感兴趣的多肽构建体转移至靶细胞中的任何多核苷酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达媒介物，以及整合载体。

基于具有选择受限(例如，通常导致目标左心室辅助装置 (LVAD)疗法的需要)的充血性心力衰竭(CHF)患者数目的增加，需要促进从CHF恢复的生物学选项。因此，本发明的一个实施方案提供基于三效应物质粒的DNA-pXoX(SDF1α、S100A1和VEGF)以改善心脏功能(例如但不限于，如通过测量来自至少在手术后30天植入目标LVADS的患者中的LVAD支持的暂时性weans的数目和持续时间所评估的)。单独植入LVAD可以导致心脏功能的改善，其中大部分发生在植入后的前30天左右。此外，通常与手术相关的炎性过程在手术后30天恢复至新的基线，该炎性过程可能导致用pXoX 治疗该高风险患者群体的风险降低。

作为在翻译期间通过弗林蛋白酶和2A自切割肽(fp2a)的组合活性经由切割而加工成单个效应物蛋白质的单一mRNA，pXoX质粒在CAG启动子的控制下组成型表达三种蛋白质(S100A1、SDF-1α 和VEGF165)。质粒骨架含有卡那霉素选择标记和源自pBR322的复制起点。pXoX质粒的图示在以下图27A和图27B中提供。

本发明还提供例如用于使用新型多基因载体、基因序列的组合、蛋白质(多肽)以及本文描述和提供的技术来治疗心脏病理、病况和病症(例如，心力衰竭、心肌病、心律失常、心包疾病、主动脉疾病、马方综合征和冠状动脉疾病)的组合物和方法中的连接体。如本文所用，术语“连接体”可意指用于分别将任何一个多核苷酸或多肽序列与另一个多核苷酸或多肽序列连接的任何多核苷酸或多肽序列(例如，第一GOI-连接体-第二GOI-连接体-第三GOI-连接体-等...)。例如，在一些情况下，连接体可以是编码融合蛋白的多核苷酸开放阅读框，使得第一多肽序列通过插入氨基酸序列共价连接(“融合”)至第二多肽序列(以此类推地连接处于相同开放阅读框中第三、第四、第五、等…后续多肽)。如本文所用的“连接体”还可以是非编码连接多核苷酸序列，如启动子(例如，CAG启动子或CMV启动子)或IRES(内部核糖体进入位点)，其起到将第一多核苷酸编码区ORF偶联至第二多核苷酸编码区(ORF)(以此类推地连接开放阅读框中的第三、第四、第五、等...后续多核苷酸)的作用。

如本文所用的基因疗法是指将感兴趣的本文所述多核苷酸(例如，DNA或RNA)转移到受试者中以治疗或预防遗传或获得性疾病或病况。感兴趣的多核苷酸可以编码期望其在体内产生的产物(例如，多肽构建体)。在一些实施方案中，感兴趣的多核苷酸也编码自杀基因。在一些情况下，基因疗法可以用于治疗本文所述的心血管病况。

载体

本文提供的可以是用于包括使用本文所述多核苷酸的病症的基因疗法的载体。载体可用于引入外源核酸，如DNA、mRNA、小干扰 RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)或反义寡核苷酸。鉴于这些大分子的大尺寸和负电荷，它们的递送可以由载剂或载体介导。特别地，感兴趣的载体包括任何附加型载体，例如，病毒载体、质粒载体、人工染色体、微环等。

基因递送系统可以分为两类：非病毒系统和重组病毒系统，其中的每一类可以在基因转移表达中具有独特的特性。非病毒载体可以包括裸质粒DNA、脂质体DNA复合物、聚合物携带的DNA和寡核苷酸。质粒可以是编码感兴趣的蛋白质的含双链环状DNA的转基因，并且还具有增强子序列和启动子序列。载体可以是非病毒载体。

载体可以包含基因或其片段或变体，其中至少一个基因、其片段或变体通过本文公开的连接体与另一个基因、其片段或变体连接。载体可以包含单基因或多基因，或其片段或变体。载体可以包含基因或其片段或变体，其中至少一个基因、其片段或变体可以通过本文公开的连接体与另一个基因、其片段或变体连接。例如，载体可以是单基因、双基因(参见例如表1)或三基因，其中至少一个基因、其片段或变体通过本文公开的连接体与另一基因、其片段或变体连接。载体可以包含1至10的若干个基因，或其片段或变体。载体可以包含1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10个基因，其片段或变体。示例性的三基因载体在图20A和图20B中显示。示例性的载体序列示于表5中。在一些情况下，载体可以单独地但是从同一RNA转录物同时表达两种、三种或更多种多肽。载体也可以包含报道分子多肽。例如，载体可以表达一种、两种、三种或更多种多肽和报道分子多肽。

在一些情况下，载体可以用至少一个基因或其片段构建。在其他情况下，载体可能含有最多10个基因或其片段。可以表达的基因或其片段可以由SEQ ID No.102至107描述。SEQ ID No.102至107 的任何同系物、同种型、前体或其修饰部分也可以由本文所述的载体表达。基因或其任何片段可以由本文所述的连接体隔开。可用于载体的各种连接体可以包含例如SEQ ID No.32至SEQ ID No.41中所示的序列。在其他情况下，可用于载体的相关连接体可以包含例如SEQ ID No.42至101中任一个所示的序列。例如，基因的一部分可以是SDF 基因(由SEQ ID NO:103编码的或与之具有60％、70％、80％、90％或 95％的同一性)、VEGF基因(由SEQ ID NO:105编码的或与之具有 60％、70％、80％、90％或95％的同一性)和S100A基因(由SEQ ID NO: 107编码的或与之具有60％、70％、80％、90％或95％的同一性)中的至少一种，其后可以是选自SDF基因(由SEQ ID NO:103编码的或与之具有60％、70％、80％、90％或95％的同一性)、VEGF基因(由 SEQ ID NO:105编码的或与之具有60％、70％、80％、90％或95％的同一性)和S100A基因(由SEQ ID NO:107编码的或与之具有60％、 70％、80％、90％或95％的同一性)的第一连接体序列、第二基因或其部分，任选地，接着是第二连接体序列，并且随后是选自SDF基因 (由SEQ ID NO:103编码的或与之具有60％、70％、80％、90％或95％的同一性)、VEGF基因(由SEQ ID NO:105编码的或与之具有60％、 70％、80％、90％或95％的同一性)和S100A基因(由SEQ ID NO:107 编码的或与之具有60％、70％、80％、90％或95％的同一性)的第三基因或其部分。例如，这些构建体的不同组合如SEQ ID No.1至SEQ ID No.31所述，并且可用于治疗目的。

载体可以是模块化的。模块化载体可以允许例如使用限制酶消化将一个基因或核酸区段(segment)置换为不同的基因或核酸区段。

感兴趣的基因和蛋白质的多基因表达可以通过载体介导。可以使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、腺伴随病毒载体等。质粒载体在避免宿主抗病毒免疫应答中是有利的。质粒可以是附加型和非整合型的，与病毒载体相比，其可以降低插入诱变的风险。在一些情况下，增强子可以用于本发明的多核苷酸构建体中。增强子可以是指可在距转录起始位点非固定距离处起作用的序列，并且可以位于转录单元的5'或3'侧。此外，增强子可以本身在内含子内以及在编码序列内。增强子的长度通常为10至300个碱基对，并且它们以顺式起作用。增强子可以是10bp至50bp、50bp至100bp、100bp至 150bp、150bp至200bp、200bp至250bp、25 0bp至300bp。增强子可以用来增强从附近启动子的转录。增强子还可以含有介导转录调节的应答元件。尽管现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素)，但也可使用来自真核细胞病毒的增强子用于一般表达。增强子-启动子组合的选择对转基因表达的水平和持续时间均具有很大的影响。举几个例子来说，增强子可以是猿猴病毒40(SV40)增强子、人免疫缺陷病毒I(HIV-1) 增强子、地松鼠肝炎病毒(GHV)增强子、腺病毒增强子、人凝血酶原(hTHGB)增强子或人C2补充基因(hC2)增强子。

在一些实施方案中，增强子序列可用于增加基因的表达。例如， CMV增强子可以增加不同细胞特异性启动子和不同细胞类型下的转基因表达，使其成为增加转基因表达水平的广泛适用的工具。

在一些情况下，可以使用微环载体。微环载体可以不同于细菌质粒载体，因为它们可能缺乏复制起点，并且可能缺乏通常在细菌质粒中发现的药物选择标记，例如，β-内酰胺酶、四环素等。微环可以基本上不含除重组酶杂交产物序列以外的载体序列，以及感兴趣的序列，即表达所需的转录序列和调节序列。在一些情况下，可以使用狗骨载体。狗骨载体可以在不使用细菌的情况下生成，并且与质粒相比可以具有减少的细菌元件。减少的细菌元件可降低载体引入到细胞中、引入到受试者中或两者的组合的毒性。

本文所述的一些实施方案包含可并入载体(包括非病毒和病毒载体(包括DNA和RNA/mRNA载体，其可以是线性或环状载体)) 中的多核苷酸(和由所述多核苷酸编码的多肽))，其中所述多核苷酸包含选自下组的构建体构型：

a)5'-(启动子)-S100-(连接体)-SDF-(连接体)-VEGF-3'；

b)5'-(启动子)-S100-(连接体)-VEGF-(连接体)-SDF-3'；

c)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-SDF1-(连接体)-VEGF-3'；

d)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-VEGF-(连接体)-SDF1-3'；

e)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-SDF1-(连接体)-VEGF165-3'；

f)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-VEGF165-(连接体)-SDF1-3'；

g)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-SDF1-(连接体)-VEGF165-3'；

h)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-VEGF165-(连接体)-SDF1-3'；

i)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-SDF1-(连接体)-VEGF191-3'；

j)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-VEGF191-(连接体)-SDF1-3'；

k)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-SDF1-(连接体)-VEGF191-3'；

l)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-VEGF191-(连接体)-SDF1-3'；

m)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-SDF-(连接体)-VEGF-3'；

n)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-VEGF-(连接体)-SDF-3'；

o)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(连接体)-VEGF-3'；

p)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(连接体)-SDF1-3'；

q)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(连接体)-VEGF165-3'；

r)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(连接体)-SDF1-3'；

s)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(连接体)-VEGF165-3'；

t)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(连接体)-SDF1-3'；

u)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(连接体)-VEGF191-3'；

v)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(连接体)-SDF1-3'；

w)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(连接体)-VEGF191-3'；

x)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(连接体)-SDF1-3'；

y)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-SDF-(fp2a)-VEGF-3'；

z)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-VEGF-(fp2a)-SDF-3'；

aa)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF-3'；

ab)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(fp2a)-SDF1-3'；

ac)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF165-3'；

ad)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1-3'；

ae)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF165-3'；

af)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1-3'；

ag)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF191-3'；

ah)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1-3'；

ai)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF191-3'；

aj)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1-3'；

ak)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-SDF-(fmdv)-VEGF-3'；

al)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-VEGF-(fmdv)-SDF-3'；

am)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF-3'；

an)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(fmdv)-SDF1-3'；

ao)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF165-3'；

ap)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1-3'；

aq)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF165-3'；

ar)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1-3'；

as)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF191-3'；

at)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1-3'；

au)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF191-3'；

av)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1-3'；

aw)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-SDF-(p2a)-VEGF-3'；

ax)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-VEGF-(p2a)-SDF-3'；

ay)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF-3'；

az)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(p2a)-SDF1-3'；

ba)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF165-3'；

bb)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1-3'；

bc)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF165-3'；

db)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1-3'；

be)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF191-3'；

bf)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1-3'；

bg)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF191-3'；

bh)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1-3'，

bi)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-SDF-(GSG-p2a)-VEGF-3'；

bk)5'-(启动子)-S100-(fp2a)-VEGF-(GSG-p2a)-SDF-3'；

bl)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF-3'；

bm)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(GSG-p2a)-SDF1-3'；

bn)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF165-3'；

bo)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1-3'；

bp)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF165-3'；

bq)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1-3'；

br)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF191-3'；

bs)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1-3'；

bt)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF191-3'；以及

bu)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1-3'；

其中“启动子”为任何转录启动子序列；

其中“S100”编码S100蛋白质家族中的任何多肽、同种型或其片段；

其中“SDF”编码SDF蛋白质家族中的任何多肽、同种型或其片段；

其中“VEGF”编码VEGF蛋白质家族中的任何多肽、同种型或其片段；

其中加括号的符号“(“和”)”表示无论编码序列还是非编码序列条件下附加核苷酸的任何数目(nt)(0至1000nt)；

其中“连接体”表示用于表达相邻生物活性多肽的任何连接体；

其中“S100A1”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO: 105的核苷酸序列或与EQ ID NO:104的氨基酸序列至少65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、99％相同或100％相同；

其中“SDF-1α”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO: 103的核苷酸序列或与SEQ ID NO:102的氨基酸序列至少65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、99％相同或100％相同；

其中“VEGF165”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO: 127的核苷酸序列或与SEQ ID NO:126的氨基酸序列至少65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、99％相同或100％相同；

其中“VEGF191”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO: 107的核苷酸序列或与SEQ ID NO:106的氨基酸序列至少65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、99％相同或100％相同；

其中“fp2a”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO:41 的核苷酸序列或与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少40％、45％、50％、 55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％相同或100％相同；

其中“fmdv”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO:35 的核苷酸序列或与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少40％、45％、50％、 55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％相同或100％相同；

其中“p2a”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO:37的核苷酸序列或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列至少40％、45％、50％、 55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％相同或100％相同；以及，

其中“GSG-p2a”在各自的多核苷酸或多肽序列的背景下与SEQ ID NO: 39的核苷酸序列或与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少40％、45％、 50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％相同或100％相同。

在一些实施方案中，本发明的先导候选治疗性多核苷酸包含可并入载体(包括非病毒载体和病毒载体(包括DNA和RNA/mRNA载体，其可以是线性或环状载体))中的多核苷酸(和由所述多核苷酸编码的多肽)，其中所述多核苷酸包含选自下组的构建体构型：

a)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-SDF1-(连接体)-VEGF191-3'；

b)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-VEGF191-(连接体)-SDF1-3'；

c)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-SDF1-(连接体)-VEGF165-3'；

d)5'-(启动子)-S100A1-(连接体)-VEGF165-(连接体)-SDF1-3'；

e)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(连接体)-VEGF191-3'；

f)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(连接体)-SDF1-3'；

g)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(连接体)-VEGF165-3'；

h)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(连接体)-SDF1-3'；

i)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF191-3'；

j)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1-3'；

k)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF165-3'；

l)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1-3'；

m)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF191-3'；

n)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1-3'；

o)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF165-3'；

p)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1-3'；

q)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF191-3'；

r)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1-3'；

s)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF165-3'；

t)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1-3'；

u)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF191-3'；

v)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1-3'；

w)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF165-3'；以及，

x)5'-(启动子)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1-3'；

其中“启动子”为任何转录启动子序列；

其中“VEGF”编码VEGF蛋白质家族中的任何多肽、同种型或其片段；其中加括号的符号“(“和”)”表示无论编码序列还是非编码序列的附加核苷酸的任何数目(nt)(0至1000nt)；

在优选的实施方案中，本发明的组合物可用于治疗充血性心力衰竭(例如，本发明的组合物可用于治疗已植入目标左心室辅助装置 (LVAD)的患者中的充血性心力衰竭)。

在优选的实施方案中，通过逆行冠状窦输注(RCSI)向患者施用本发明的组合物。

在一个实施方案，向动物模型(例如但不限于猪(猪模型)) 施用本发明的组合物，其中逆行冠状窦输注(RCSI)用于研究心肌缺血的动物模型。

在某些实施方案中，使用效应物特异性测定法在转染的健康和患病患者诱导多能干细胞(iPSC)衍生的心肌细胞中验证了pXoX中每种效应物的功能性。特别地，S100A1表现出收缩性能的改善。 SDF-1α显示出诱导Jurkat细胞和外周血淋巴细胞(PBL)的CXCR4 依赖性迁移。VEGF165表现出人脐带内皮细胞(HUVEC)增殖的增加。

在另一个实施方案中，基于场电位持续时间(MEA)的变化的评估，在健康和患病患者诱导多能干细胞(iPSC)衍生的心肌细胞中转染pXoX体外安全性测试未表现出对心脏传导的不利影响的风险，其与对心电图(ECG)的QT间隔的影响密切相关。

在另一个实施方案中，pXoX的转染将扩张型心肌病患者 iPSC-CM中的搏动速率、收缩持续时间和收缩速率恢复至与来自健康表型的iPSC-CM中所见的那些水平相当的水平。在优选的实施方案中，观察到pXoX三效应物质粒相对于单或双效应物质粒的收缩性能的最佳改善。

在某些实施方案中，本发明的载体和多核苷酸构建体包含双重基因(双基因)序列(以及由其编码的多肽)，如表1中所述的那些。

表1：载体特征-双重基因(双基因)构建体

*“CAG”和“NXB-V2”代表CAG启动子加在本发明的构建体中(如以下所示的pXoX中)发现的5'和3'元件以及新的X载体骨架形式-2：

“CAG”和“NXB-V2”载体元件的序列

启动子

启动子是载体基因组设计中的主要顺式作用元件，其可以决定表达的整体强度以及细胞特异性。启动子可以是遍在启动子、细胞特异性启动子或其组合。举几个例子来说，遍在启动子或组成型启动子可以是CMV、CBA(CAG和CBh)、EF-1α、PKG、UBC、GUSB(hGBp)、UCOE。启动子可以是在感兴趣的靶细胞内具有活性的启动子，例如，心脏启动子。在一些情况下，启动子为CAG。在其他情况下，启动子为组成型启动子，诸如Ef1a。启动子可以是人类启动子，诸如人类 Ef1a(hEf1a)。也可以使用双向启动子。例如，组成型双向启动子可以是人巨细胞病毒启动子。

在一些实施方案中，诸如其中分泌基因产物多肽的那些实施方案中，可以期望在全部或选择的细胞类型中的遍在表达。可以使用组成型启动子如人延伸因子1α亚基(EF1α)、立即早期巨细胞病毒 (CMV)、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)或泛素C(UBC)以促进大多数组织中的表达(Husain等人,2009；Qin等人,2010；Norrman等人,2010)。通常，CBA和CAG 促进组成型启动子中较大的表达(Xu等人,2001；Yin等人,2011)；然而，与CMV(约0.8kbs)或EF1α(约1.2kbs)相比，它们的约 1.7kb大小可以限制它在具有包装约束条件的载体中的使用。在一些情况下，GUSB或UBC启动子可以提供分别具有378bp和403bp的较小尺寸的遍在基因表达，但它们可能比CMV或CBA启动子弱得多(Husain等人,2009；Qin等人,2010)。因此，已经对组成型启动子进行了修饰从而在不影响其表达的情况下减小尺寸，并且诸如CBh(约 800bp)和微CBA(约800bp)的实例可以在选定的组织中促进堪称相当的甚至更高的表达(Gray等人,2011)。在一些情况下，“遍在” 启动子可能倾向于在选定的细胞类型中沉默或促进差异表达强度 (McCown等人,1996；Klein等人,1998；Gray等人,2011)。

可以使用源自巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞体病毒(RSV) 和猿猴病毒40(SV40)的病毒增强子和启动子来实现在哺乳动物细胞和组织类型的范围中(如在心肌细胞中)的高水平表达。组成型哺乳动物启动子如人泛素C(UBC)和真核翻译延伸因子1α1(EEF1A1)启动子可具有更持久的表达。组织特异性启动子可用于减少脱靶转基因表达。许多顺式作用序列，包括聚腺苷酸化信号、内含子和支架/ 基质附着区(S/MARs)52，可以在一些情况下提高转基因表达的水平和持久性。

缺乏细菌骨架的紧密DNA载体(例如微环)可以相对于全长 DNA质粒保持优异的基因表达水平和持续时间。也可以采用狗骨载体。狗骨载体可以在不使用细菌的情况下生成。在一些情况下，也可以在一些情况下使用基于脂质的DNA载体，可以采用转座子系统。例如，转座子系统可以是或可以基于重组酶phiC31、PiggyBac57、 Sleeping Beauty或其组合。

在一些情况下，可以通过使用重组酶将本文所述的心脏基因效应物载体整合到细胞基因组中，图2。重组酶可以是att位点重组酶。在一些情况下，重组酶可以从如以下文献中所述的重组酶中选择：美国专利号9,034,650；美国申请号2015/0275232；和WO2008/073154，其每一个通过引用以其全文并入本文。

可以通过编码重组酶的mRNA将重组酶引入细胞中。在某些实施方案中，可以通过使用编码重组酶的mRNA导入及表达重组酶来防止重组酶整合至细胞基因组中。在一些情况下，编码重组酶的 mRNA可以是合成的或cGMP-级的mRNA，图1。

在一些情况下，可以通过包含“自杀基因”和编码重组酶的基因的表达质粒将重组酶引入细胞中。在某些实施方案中，自杀基因和重组酶基因可通过间插内部核糖体进入位点(IRES)隔开。

在一些情况下，其中可以(例如，通过重组酶)引入或基因组整合载体的细胞可以是原代细胞(例如但不限于心肌细胞，图2)。在一些情况下，载体内编码的基因可以在细胞中的靶向基因组位置处基因组插入。

内部核糖体进入位点(IRES)元件可以允许从一个转录物表达多个基因(Mountford和Smith 1995)。如本文所用的术语“IRES”可旨在意指内部核糖体进入位点。在包含IRES序列的载体中，第一基因可以通过具有其自身5'-UTR的帽依赖性核糖体扫描机制进行翻译，而后续基因的翻译可以通过以帽依赖性的方式直接将核糖体募集至 IRES来完成。

IRES序列可以允许真核核糖体结合并在不结合5'帽端的情况下开始翻译。在某些情况下，IRES区域可以来源于病毒，诸如小核糖核酸病毒、脑心肌炎病毒、丙型肝炎病毒IRES序列。在其他情况下，IRES序列可以来源于脑心肌炎病毒。如本文所用的术语“EMCV”或“脑心肌炎病毒”是指小核糖核酸病毒属家族的脑心肌炎病毒种的任何成员分离物或毒株。实例为EMCV-R(Rueckert)毒株病毒， Columbia-SK病毒。在一些情况下，可以使用细胞IRES元件，诸如真核起始因子4G、免疫球蛋白重链结合蛋白、c-myc原癌基因、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子-1IRES或其任何组合或修饰。在一些情况下，细胞IRES在与病毒IRES相比时可以具有增加的基因表达。

如本文所用的术语“CAP”或“帽”是指经修饰的核苷酸，通常为 7-甲基鸟苷，其以3'至5'(7meG-ppp-G)连接至真核mRNA的5'端，其在从该mRNA表达蛋白质的过程中用作正常翻译起始途径中的必需元件。

病毒、细胞或其组合的IRES序列可在载体中使用。IRES可以来自脑心肌炎病毒(EMCV)或脊髓灰质炎病毒(PV)。

在一些情况下，IRES元件选自脊髓灰质炎病毒(PV)、脑脊髓炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪捷申病毒-1(PTV-1)、爱知病毒(AiV)、塞尼卡谷病毒(SVV)、丙型肝炎病毒(HCV)、猪瘟病毒(CSFV)、人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人巨细胞病毒潜伏(pUL138)、EB 病毒(EBNA-1)、疱疹病毒马立克氏病(MDV RLORF9)、SV40多顺反子19S(SV40 19S)、禾谷缢管蚜病毒(RhPV)、蟋蟀麻痹病毒 (CrPV)、茶尺蠖小RNA病毒(EoPV)、大豆尺蠖病毒(PSIV)、吸血猎蝽病毒(TrV)、蜜蜂麻痹双顺反子病毒(IAPV，KBV)、黑醋栗逆转病毒(BRV)、天竺葵花破裂病毒(PFBV)、木槿属褪绿环斑病毒(HCRSV)、十字花科感染的烟草花叶病毒(CrTMV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、贾第虫病毒(GLV)、利什曼虫RNA病毒-1(LRV-1)及其组合或修饰。

在一些情况下，IRES选自Apaf-1、XIAP、HIAP2/c-IAP1、DAP5、 Bcl-2、c-myc、CAT-1、INR、分化LEF-1、PDGF2、HIF-1a、VEGF、 FGF2、BiP、BAG-1、CIRP、p53、SHMT1、PITSLREp58、CDK1、Rpr、 hid、hsp70、grim、skl、触角足、dFoxO、dInR、Adh-Adhr、HSP101、 ADH、URE-2、GPR1、NCE102、YMR181a、MSN1、BOI1、FLO8、 GIC1及其任何组合或修饰。

当IRES元件被包含在两个开放阅读框(ORF)之间时，翻译的启动可以通过第一ORF中的规范5'-m7GpppN帽依赖性机制和 IRES元件下游的第二ORF的帽依赖性机制而发生。

在一些情况下，基因可以通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。IRES可以允许同时表达多个基因。例如，IRES序列可以允许从单个mRNA转录物产生多种蛋白质。核糖体可以以5'帽依赖性的方式与IRES结合并启动翻译。

在一些情况下，IRES序列可以为500个碱基对或可以为约500 个碱基对。IRES序列可以为300个碱基对至1000个碱基对。例如， IRES可以为300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950或1000个碱基对长。

在一些情况下，可以降低包含IRES序列的载体内的下游基因的表达。例如，IRES序列之后的基因可以比IRES序列之前的基因表达降低。相比于先前的基因，表达降低可以为1％至99％降低。

在一些情况下，可以使用病毒2A序列。2A序列可以来源于小核糖核酸病毒2A序列。小核糖核酸病毒2A序列可以选自肠道病毒 2A序列、鼻病毒2A序列、心病毒2A型序列、口疮病毒2A序列、肝病毒2A序列、虫媒病毒2A序列、嵴病毒2A序列、捷申病毒2A 序列和副肠孤病毒2A序列。

2A元件可以比IRES更短，其具有5至100个碱基对。在一些情况下，2A序列可具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90或100个碱基对长度。2A连接的基因可以在一个单一的开放阅读框中表达，并且“自切割”可以共翻译地出现在2A多肽的C-末端处的最后两个氨基酸GP之间，产生等量的共表达蛋白质。在一些情况下，包含2A序列的多肽可能不会在切割后产生等量的蛋白质。在一些情况下，在与第二种蛋白质相比时，第一种蛋白质的浓度可以高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％或最多100％。在一些情况下，当与第一种蛋白质相比时，第二种蛋白质的浓度可以高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％或最多100％。

病毒2A序列可以为约20个氨基酸。在一些情况下，病毒2A 序列可以含有共有基序Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO: 117)。共有基序序列可以起共同翻译的作用。例如，可以防止在甘氨酸和脯氨酸残基之间形成正常的肽键，其可以导致核糖体跳跃并由此导致新生多肽的“切割”。这种效应可以产生等摩尔水平的多种基因。

2A肽可允许将多种蛋白质在单个开放阅读框中翻译成多肽，所述多肽随后可通过核糖体跳跃机制(Funston,Kallioinen等人2008)“切割”成单个多肽。在一些实施方案中，“2A”序列可以包括：p2a、GSG-p2a、 T2A、E2A、F2A和BmCPV2A、BmIFV2A及其任何组合。

载体还可以包括另外的位于多顺反子基因之间的2A/弗林蛋白酶序列，以允许通过酶促切割多肽产物产生源自例如第二基因的表达产物。在一些情况下，可利用另外的连接体来促进多基因载体中多种基因之间的切割。

在一些情况下，载体可以包含IRES序列和2A序列。在其他情况下，与2A肽连接的多种基因的表达可以通过2A肽之前的间隔序列(GSG)来促进。在一些情况下，构建体可以组合间隔区、连接体、衔接子、启动子或其组合。例如，构建体可以具有带有不同2A肽的间隔区(SGSG(SEQ ID NO:118)或GSG)和弗林蛋白酶连接体(RAKR (SEQ ID NO:32))切割位点。间隔区可以是I-Ceui(编码内切核酸酶的内含子)。在某些实施方案中，两个或更多个心脏效应物基因由间插内部核糖体进入位点(IRES)隔开。

多核苷酸连接体

在本文所述的实施方案中，多核苷酸连接体可在本文所述的多核苷酸中使用。多核苷酸连接体可以是含有所需限制性位点的双链 DNA区段，可以添加其以产生与包含本文所述多核苷酸的载体兼容的末端结构。在一些情况下，多核苷酸连接体可用于修饰包含本文所述多核苷酸的载体。例如，包含多核苷酸连接体的载体修饰可以是多克隆位点的改变，或多组氨酸尾的添加。多核苷酸连接体也可用于适应平端插入DNA的末端以供克隆到载体中，该载体用限制酶切割，具有粘性末端。多核苷酸连接体的使用可以比平端连接到载体中更有效，并且可以提供在下游应用中从载体释放插入物的方法。在一些情况下，插入物可以是编码可用于治疗应用的多肽(例如，SDF1多肽、 S100A1多肽、VEGF多肽及其片段和变体)的多核苷酸序列。

多核苷酸连接体可以是寡聚体。例如，连接体的长度可以是约 5至20个核苷酸。多核苷酸连接体的长度可为或可约为5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。多核苷酸连接体可以是DNA双链、单链或其组合。在一些情况下，连接体可以是RNA。在一些情况下，多核苷酸连接体可以通过T4连接酶连接到包含本文所述的多核苷酸的载体。为了促进连接，可将过量的多核苷酸连接体添加到包含插入物和载体的组合物中。在一些情况下，插入物和载体在引入连接体之前进行预处理。例如，用甲基化酶预处理可以防止插入物DNA的不希望的切割。

多肽连接体

在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以通过编码连接体多肽的插入序列隔开。在某些情况下，连接体为易切割的连接体。在一些实施方案中，感兴趣的多肽表达为通过易切割的连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的连接体多肽可以是以下所述的任一种或两种：Furinlink、fmdv、p2a、 GSG-p2a和/或fp2a。在一些情况下，连接体为APVKQGSG(SEQ ID NO: 119)。

在某些情况下，连接体多肽可以包含氨基酸序列“RAKR”(SEQ ID NO:32)。在某些情况下，弗林蛋白酶连接体多肽可由包含 “CGTGCAAAGCGT”(CGTGCAAAGCGT)的多核苷酸序列编码。

在某些情况下，连接体多肽可以是包含下表中公开之序列的连接体：

表2连接体氨基酸序列和多核苷酸序列

在一些实施方案中，连接体可在本文所述的多核苷酸中使用。连接体可以是柔性连接体、刚性连接体、体内可切割连接体或其任何组合。在一些情况下，连接体可以将功能域连接在一起(如在柔性和刚性连接体中)或在体内释放游离功能域，如同在体内可切割连接体中那样。

连接体可以改善生物学活性、增加表达产率和实现理想的药代动力学特性。连接体还可以包含腙、肽、二硫化物或硫醚(thioesther)。

在一些情况下，本文所述的连接体序列可以包括柔性连接体。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，可以应用柔性连接体。柔性连接体可以由小的非极性(例如，Gly)或极性(例如， Ser或Thr)氨基酸组成。柔性连接体可以具有主要由Gly和Ser残基 (“GS”连接体)段组成的序列。柔性连接体的实例可以具有 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:120)的序列。通过调整拷贝数“n”，可以优化该示例性GS连接体的长度以实现功能域的适当隔离或维持必需的域间相互作用。除GS连接体外，其他柔性连接体也可用于重组融合蛋白。在一些情况下，柔性连接体也可以富含小氨基酸或极性氨基酸如Gly和Ser，但可以含有另外的氨基酸如Thr和Ala以维持柔性。在其他情况下，可以使用极性氨基酸如Lys和Glu来提高溶解度。

包含在本文所述连接体序列中的柔性连接体可以富含小氨基酸或极性氨基酸，如Gly和Ser，以提供良好的柔性和可溶性。当融合蛋白结构域需要特定的运动或相互作用时，柔性连接体可能是合适的选择。此外，虽然柔性连接体可能没有刚性结构，但它们可以用作惰性连接体以保持功能域之间的距离。可以调节柔性连接体的长度以允许适当折叠或实现融合蛋白的最佳生物活性。

在一些情况下，本文所述的连接体可以进一步包括刚性连接体。刚性连接体可以用于维持多肽结构域之间的固定距离。刚性连接体的实例可以是(举几个例子来说)：α-螺旋形成连接体、富含Pro序列、 (XP)n(SEQ ID NO:121)、X-Pro骨架、A(EAAAK)nA(n＝2-5)(SEQ ID NO:122)。在一些情况下，刚性连接体可以通过采用α-螺旋结构或通过包含多个Pro残基来表现出相对僵硬的结构。

在一些情况下，本文所述的连接体可以是可切割的。在其他情况下，连接体是不可切割的。不可切割的连接体可将功能域共价连接在一起，以在整个体内过程或体外过程中充当一个分子。连接体也可以体内切割。可以引入可切割的连接体以在体内释放游离的功能域。举几个例子来说，可通过还原剂、蛋白酶的存在来切割可切割的连接体。例如，可以利用二硫键的还原来产生可切割的连接体。在二硫键连接体的情况下，通过与硫醇如谷胱甘肽的二硫化物交换的切割事件可以产生切割。在其他情况下，重组融合蛋白中连接体的体内切割也可以通过蛋白酶实施，该蛋白酶可在病理条件(例如癌症或炎症)下于特定细胞或组织中体内表达或在某些细胞区室内受到限制。在一些情况下，可切割的连接体可允许靶向切割。例如，许多蛋白酶的特异性可以在受限区室中提供较慢的连接体切割。可切割的连接体还可以包含腙、肽、二硫化物或硫醚(thioesther)。例如，腙可以赋予血清稳定性。在其他情况下，腙可以允许在酸性区室中切割。酸性区室可具有最高为7的pH。连接体还可以包含硫醚。硫醚可以是不可还原的。硫醚可以被设计用于细胞内蛋白水解降解。

在某些实施方案中，fmdv连接体多肽包含可以与SEQ ID NO.34 至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，fmdv 连接体多肽是连接两种或更多种融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在某些情况下，fmdv连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在一些情况下，编码fmdv的ORF 包含SEQ ID NO.35的序列或由之组成。在某些实施方案中，编码fmdv 的多核苷酸与SEQ ID NO.35至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。

在某些情况下，连接体多肽可以是“p2a”连接体。在某些实施方案中，p2a多肽可以包含可以与SEQ ID NO:36至少约45％、50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或 100％相同的序列。在某些实施方案中，p2a连接体多肽可以是连接两种或更多种融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，p2a连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码p2a的ORF包含SEQ ID NO.37 的序列或由之组成。在某些情况下，编码p2a的多核苷酸与SEQ ID NO: 37可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％or 100％相同。

在一些情况下，连接体多肽可以是“GSG-P2a”连接体。在某些实施方案中，GSG-p2a连接体多肽可以包含可以与SEQ ID NO:38至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，GSG-p2a 连接体多肽可以是连接两种或更多种融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，GSG-p2a连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。编码GSG-p2a的ORF可以包含SEQ ID NO.39的序列。在一些情况下，编码GSG-p2a的多核苷酸与SEQ ID NO:39可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。

连接体多肽可以是本文提供的“fp2a”连接体。在某些实施方案中，fp2a连接体多肽可以包含可以与SEQ ID NO:40至少约45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、 99％或100％相同的序列。在某些情况下，fp2a连接体多肽可以是连接两种或更多种融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，fp2a连接体多肽可由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码fp2a连接体的多核苷酸与SEQ ID NO:41可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。

在一些情况下，连接体可以是工程化的。例如，连接体可以被设计成包含化学特性如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。序列与SEQ IDNO:42至SEQ ID NO:101的序列可以或可以大约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在其他情况下，可以在载体中使用多个连接体。例如，感兴趣的基因(例如，S100A1、 SDF-1α和VEGF165)可以通过至少两个连接体隔开，如图20A和图 20B所示。在一些情况下，基因可以通过2、3、4、5、6、7、8、9或最多10个连接体分隔。

连接体可以是工程化连接体。设计连接体的方法可以是计算的。在一些情况下，计算方法可以包括图形技术。可以使用计算方法从源自数据库的三维肽结构文库中搜索合适的肽。例如，可以使用布鲁克海文蛋白质数据库(Brookhaven Protein Data Bank)(PDB)跨越连接体的选定氨基酸之间的空间距离。

表3：连接体多肽序列：

在一些实施方案中为编码包含弗林蛋白酶多肽和2A多肽的多肽构建体的多核苷酸，其中弗林蛋白酶多肽和2A多肽通过包含至少三种疏水性氨基酸的多肽连接体连接。在一些情况下，至少三种疏水性氨基酸选自由甘氨酸(Gly)(G)、丙氨酸(Ala)(A)、缬氨酸(Val)(V)、亮氨酸(Leu)(L)、异亮氨酸(Ile)(I)、脯氨酸(Pro)(P)、苯丙氨酸(Phe)(F)、甲硫氨酸(Met)(M)、色氨酸(Trp)(W)组成的列表。在一些情况下，连接体包含本文公开的表3中提供的序列。在一些情况下，多肽连接体还可以包含一个或多个GS连接体序列，例如(GS)n(SEQ ID NO:109)、(SG)n(SEQ ID NO:110)、(GSG)n(SEQ ID NO:111)和(SGS)n(SEQID NO:112)，其中n可以是零到十五的任何数字。

提供了获得多肽构建体的改进表达的方法，该方法包括：提供编码包含第一功能性多肽和第二功能性多肽的所述多肽构建体的多核苷酸，其中所述第一功能性多肽和第二功能性多肽通过连接体多肽连接，该连接体多肽包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列；以及在宿主细胞中表达所述多核苷酸，其中与不具有包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列的连接体多肽的相应多肽构建体相比，所述表达导致多肽构建体的改进表达。在一些情况下，连接体包含本文公开的表3中提供的序列。在一些情况下，多肽连接体还可以包含一个或多个GS连接体序列，例如(GS)n(SEQ ID NO:109)、(SG)n(SEQ ID NO:110)、(GSG)n(SEQ ID NO:111)和(SGS)n(SEQ ID NO:112)，其中n可以是零到十五的任何数字。在一些情况下，与不具有包含与序列APVKQ(SEQID NO: 42)具有至少60％同一性的序列的连接体多肽的相应多肽构建体相比，改进的表达高至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在优选的实施方案中，本发明的独特方面由本发明的构建体编码的多肽的特定序列顺序提供并实现。因此，在本发明的一个方面中，特别是首先放置S100A1蛋白质实现并允许生物活性S100A1分子的功能性表达，原因在于令人惊讶地发现S100A1上的剩余2A尾不会干扰S100A1生物活性。相比之下，发现将S100A1作为第二基因放置导致通过构建体表达的基因的不完全切割。

因此，使用质谱法分析pXoX表达，如下表13中所示，显示 S100A1是唯一效应子，其没有表现出导致C-末端2A肽的去除的弗林蛋白酶切割。因此，在SDF1α或VEGF上未留下2AC-末端尾。只有S100A1具有2A连接体尾。确切的端部氨基酸序列是PG。它在PGP 序列端部的G和P之间切割。因此，如从pXoX表达的S100A1上的 C-末端连接体尾包含与(N-末端)- -RAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG-(C-末端)(SEQ ID NO: 123)融合的序列(从N-至C-末端)S101A1多肽，其在本文中被称为“2A尾”。例如，在一个实施方案中，从S100A1的起始甲硫氨酸至 fp2a切割的连接体尾的C-末端，本发明的第一GOI包含序列：MGSELETAMETLINVFHAHSGKEGDKYKLSKKELKELLQTELSGFLDAQKDVDAVDKVMKELDENGDGEVDFQEYVVLVAALTVACNNFFWENSRAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG(SEQ ID NO:124)，其可以由以下多核苷酸序列编码： ATGGGCAGCGAACTGGAAACCGCCATGGAGACTTTGATAAATGTTTTCCACGCGCATAGCGGCAAAGAAGGGGACAAGTACAAGCTGTCAAAAAAGGAGCTGAAAGAACTGCTGCAGACCGAATTGAGCGGCTTCCTGGACGCTCAGAAAGATGTCGATGCCGTCGACAAAGTGATGAAAGAGCTTGACGAGAACGGTGACGGTGAAGTCGATTTTCAGGAATATGTGGTGCTGGTGGCCGCCCTTACTGTAGCATGCAACAATTTCTTTTGGGAAAATTCACGTGCAAAGCGTGCACCGGTGAAACAGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTG GAGGAGAACCCTGGA(SEQ ID NO:125)；或编码相同氨基酸序列的简并多核苷酸，或与上面提及的2A尾至少45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸或核酸序列。

然而，如本文呈现的数据所提供的，已经证明该S100A1尾是“惰性的”——即不影响S100A1功能(生物活性)。

载体修饰

可用于本文所述的方法和组合物的多核苷酸载体可以是优质生产规范(GMP)兼容的载体。例如，GMP载体可能比非GMP载体更纯。在一些情况下，纯度可以通过生物负荷来测量。例如，生物负荷可以是在载体组合物中存在或不存在需氧菌、厌氧菌、产芽孢菌、真菌或其组合。在一些情况下，纯载体可以是低内毒素的或无内毒素的。纯度也可以通过双链引物步移测序来测量。质粒身份可以是确定载体纯度的来源。本发明的GMP载体比非GMP载体纯度高10％至99％。如通过存在生物负荷、内毒素、测序或其组合所测量的，GMP载体可以比非GMP载体纯度高10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％。

在一些情况下，使用第一基因程序结束时的终止子序列。终止子序列可确保转录物在启动第二个基因程序之前终止。例如，表达载体可以含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这样的序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'以及偶尔从3'非翻译区获得。这些区域可以含有在mRNA的非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。包含表达载体的细胞在提供所需多肽表达的条件下于体内或体外生长。

在一些情况下，可以在由载体中的多核苷酸编码的第一多肽的端部使用间隔序列。在其他情况下，可以在载体中的第二个基因的端部使用间隔序列。也可以在载体中的第一个基因和第二个基因之后使用间隔序列。

这些载体可用于表达由基因或感兴趣的基因的一部分编码的多肽。部分基因或基因可以通过使用任何(病毒性或非病毒性)方法插入。例如；一种方法可以是基于非病毒的技术。

在一些情况下，可以进行载体修饰。例如，修饰可以包括添加用于受控基因表达的诱导型基因开关、待组合的心脏效应物基因的顺序和/或选择的改变、启动子置换(例如，强的左心室特异性表达)及其组合。

在某些实施方案中，在本发明载体中的心脏效应物多肽编码序列之前的翻译起始序列包含Kozak共有序列。这可以在本文提供的描述中指示为“Kozak”＝“是”。

在某些实施方案中，在本发明载体中的心脏效应物多肽编码序列之前的翻译起始序列缺乏Kozak共有序列。这可以在本文提供的描述中指示为“Kozak”＝“否”。

在某些实施方案中，任何一种、两种或三种心脏效应物多肽(诸如SDF1、S100A1和VEGF191)的表达可以通过组成型或诱导型启动子来驱动。在某些情况下，至少两个基因的表达是相等的。在其他情况下，至少两个基因的表达是不相等的。在一些情况下，上游基因可以以比下游基因更高的浓度表达。在其他情况下，下游基因可以以比上游基因更高的浓度表达。连接体可能参与控制表达水平。例如，可切割的连接体可被工程化为使得切割更高效或更低效。

在一些情况下，诱导型启动子可以是基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮激素受体的基因开关。在一些情况下，基因开关可以选自基于蜕皮激素的受体组分，如在但不限于以下所述的任何系统中所描述的：PCT/US2001/009050(WO 2001/070816)；美国专利号7,091,038； 7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美国专利号8,105,825；8,168,426；PCT/1J52002/005235(WO 2002/066613)；美国申请号10/468,200(美国公开号20120167239)； PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美国专利号7,531,326；8,236,556； 8,598,409；PCT/U52002/005090(WO 2002/066612)；美国专利号8,715,959 (美国公开号20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美国专利号7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067； PCT/U52002/005708(WO 2002/066615)；美国申请号10/468,192(美国公开号20110212528)；PCT/US2002/005026(WO 2003/027289)；美国专利号7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；美国专利号7,935,510；8,076,454；PCT/U52008/011270 (WO 2009/045370)；美国申请号12/241,018(美国公开号20090136465)； PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美国申请号12/247,738(美国公开号20090123441)；PCT/US2009/005510(WO 2010/042189)；美国申请号13/123,129(美国公开号20110268766)；PCT/US2011/029682 (WO 2011/119773)；美国申请号13/636,473(美国公开号20130195800)； PCT/US2012/027515(WO2012/122025)；以及美国申请号14/001,943 (美国公开号20140308247)，以上每一个均通过引用以其全文并入。

在一些情况下，用于基于蜕皮激素受体的诱导型基因开关调节的剂量调节的控制的配体可以选自但不限于以下任一种：蜕皮类固醇 (诸如蜕皮激素、20-羟基蜕皮酮、百日青蜕皮酮A、幕黎甾酮A (muristerone A)等)、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N,N’- 二酰基肼，诸如美国专利号6,013,836；5,117,057；5,530,028；和5,378,726 以及美国公开申请号2005/0209283和2006/0020146所公开的那些；噁二唑啉，如美国公开申请号2004/0171651中所述；二苯甲酰基烷基氰基肼，诸如在欧洲申请号461,809中所公开的那些；N-烷基-N,N’-二芳酰基肼，诸如在美国专利号5,225,443中所公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼，诸如在欧洲申请号234,994中所公开的那些；N-芳酰基-N- 烷基-N’-芳酰基肼，诸如美国专利号4,985,461中所述的那些；氨基酮，诸如美国公开申请号2004/0049037中所述的那些；以上每一个均通过引用并入本文，以及其他类似材料，包括3,5-二叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(R)羟基胆甾醇、 24(S)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3- 硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1,1- 二膦酸酯、保幼激素III等。可用于本发明的二酰基肼配体的实例包括RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和 RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见例如美国专利申请序列号12/155,111和PCT 申请号PCT/US2008/006757，以上两者均通过引用以其全文并入本文。

在一些实施方案中，表达感兴趣的多肽的两个或三个感兴趣的基因(例如但不限于心脏效应物基因)可并入和/或在单个启动子的控制下从单个载体表达。在某些实施方案中，单个启动子为组成型启动子。在某些实施方案中，单个启动子为组成型组织特异性启动子。在某些实施方案中，单个启动子为基于小分子配体诱导型蜕皮激素受体的启动子。

在某些实施方案中，基因开关多肽的表达处于肌球蛋白轻链 (MLC)启动子的控制下。

如下所述，通过向受试者施用，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部施用来体内递送载体。或者，通常在选择已并入载体的细胞后，可将载体离体递送至细胞，如从受试者外植的细胞(例如，心肌细胞、心脏组织活检)，随后将细胞重新植入受试者。在选择之前或之后，细胞可以扩充。

采用本文所述任何核酸递送平台(例如，核转染或电穿孔)的细胞的转染效率可为或可约为20％、25％、30％、35％、40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或超过99.9％。

基因整合到细胞(例如但不限于心肌细胞)中的效率可为或可约为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.5％、99.9％或超过99.9％。

本文公开的某些方面可以利用载体。例如，可以使用的载体包括但不限于细菌：pBs、pQE-9(Qiagen)、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、 pKK223-3、pKK233-3、pDR54O、pRIT5(Pharmacia)，真核：pWL-neo、 pSv2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPv、pMSG、 pSVL(Pharmiacia)。此外，可以使用任何其他质粒和载体，只要它们在选择的宿主中是可复制和能存活的。可以将任何载体和商购获得的载体(及其变体或衍生物)工程化以包括用于所述方法中的一个或多个重组位点。这类载体可以从例如以下渠道获得：VectorLaboratories Inc.、 Invitrogen、Promega、Novagen、NEB、Clontech、BoehringerMannheim、 Pharmacia、EpiCenter、OriGenes Technologies Inc.、Stratagene、PerkinElmer、 Pharmingen和Research Genetics。其他感兴趣的载体包括真核表达载体，诸如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice (Invitrogen)、pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、 pDR2、pCMVEBNA和pYACneo(Clontech)、pSVK3、pSVL、pMSG、 pCH110和pKK232-8(Pharmacia,Inc.)、p3'SS、pXT1、pSG5、pPbac、 pMbac、pMClneo，和pOG44(Stratagene,Inc.)和pYES2、pAC360、 pBlueBa-cHis A、B及C、pVL1392、pBlueBac111、pCDM8、pcDNA1、 pZeoSV、pcDNA3pREP4、pCEP4和pEBVHis(Invitrogen,Corp.)，以及其变体或衍生物。其他载体包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、粘粒、噬菌粒、YAC's(酵母人工染色体)、BAC's(细菌人工染色体)、 P1(大肠杆菌噬箘体)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS载体、 PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A (Stratagene)、pcDNA3(Invitrogen)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pSPORT1、 pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSYSPORT1(Invitrogen)及其变体或衍生物。其他感兴趣的载体还可以包括pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、 pTrcHis2、pRSET、pBlueBa-cHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、 pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pA081S、pPICZ、pPICZA、 pPICZB、pPICZC、pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pBlue-Bac4.5、 pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、 pcDNA2.1、pYES2、pZEr01.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、 pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、 pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、 pREP7、pREP8、pREP9、pREP 10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、 pCR3.1-Uni，和来自Invitrogen的pCRBac；X ExCell、X gt11、pTrc99A、 pKK223-3、pGEX-1X T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、 pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、 pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、 pNEO，和来自Pharmacia的pUC4K；pSCREEN-lb(+)、pT7Blue(R)、 pT7Blue-2、pCITE-4-abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32L1C、pET-30LIC、 pBAC-2 cpLIC、pBACgus-2 cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、X SCREEN-1、X B1ueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、 pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、 pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、 pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、 pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、 pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3 cp、pBACgus-2 cp、 pBACsurf-1、plg、Signal plg、pYX、Selecta Vecta-Neo、Selecta Vecta-Hyg，和来自Novagen的Selecta Vecta-Gpt；pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、 pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、 pEGFP、pEGFP-1、pEGFPN、pEGFP-C、

pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、 pSEAP2-Contral、pSEAP2-启动子、pSEAP2-增强子、p I3gal-Basic、 pl3gal-Control、p I3gal-启动子、p I3gal-增强子、pCMV、pTet-Off、pTet-On、 pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、 pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、 pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、 pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、2Xgt10、Xgt11、pWE15，和来自Clontech 的X TriplEx；Lambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript IIKS+/-、 pBluescript II SK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、Lambda DASH、Lambda EMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、 pCR-Scrigt Amp、pCR-ScriptCam、pCR-Script Direct、pBS+/-、pBC KS+/-、 pBC SK+/-、Phag-escript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、 pET-3abcd、pET-llabcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、 pOPI3CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pMClneo Poly A、 pOG44、p0G45、pFRTI3GAL、pNE0I3GAL、pRS403、pRS404、pRS405、 pRS406、pRS413、pRS414、pRS415，和来自Stratagene的pRS416、pPC86、 pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、 pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、 pJG4-5、pNLexA、pYESTrp，以及其变体或衍生物。

治疗适应症

本文提供了用于改善受试者中的血管生成的方法和组合物。还提供了用于治疗心血管疾病的方法和组合物。在一些情况下，心血管疾病可以是心肌病。心肌病可以由病理异常心肌定义。可以有四种主要的心肌病分类：扩张型(DCM)、肥厚型(HCM)型、限制型(RCM) 和致心律失常型RV(ARVC)。包含本文所述多核苷酸的载体可以用于使用基因疗法治疗心肌病。在一些情况下，还在基因疗法治疗之前、期间、之后或其任何组合施用至少一种附加疗法。

在一些情况下，可以将多肽合并到本文所述的多核苷酸序列中并引入到患有病症或需要改善血管生成的受试者中。例如，受试者可以具有心肌病，并且可以通过施用本文所述的多核苷酸来治疗以治疗该病症。在一些情况下，可通过基因疗法引入编码本文所述基因或多肽的多核苷酸。可引入患有心肌病的受试者的基因和多肽可包括例如： ATP-结合盒亚家族C成员9(ABCC9)、肌动蛋白α心肌1(ACTC1)、肌动蛋白α2(ACTN2)、锚蛋白重复序列结构域1(心肌)(ANKRD1)、 BCL2相关永生基因3(BAG3)、集钙蛋白2(心肌)(CASQ2)、窖蛋白3(CAV3)、COX15同源物、细胞色素c氧化酶组装蛋白 (COX15)、晶体蛋白αB半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白3(CRYAB)、半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白3(CSRP3)、心肌营养蛋白1(CTF1)、肌间线蛋白(DES)、肌养蛋白(DMD)、DnaJ(Hsp40)同源物亚家族C成员19(DNAJC19)、桥粒溶素2(DSC2)、桥粒芯胶黏蛋白2(DSG2)、桥粒芯糖蛋白(DSP)、肌营养蛋白α(DTNA)、伊默菌素(EMD)、眼缺乏同源物4(EYA4)、四个半LIM结构域 2(FHL2)、Fukutin(FKTN)、叉头框D4(FOXD4)、半乳糖苷酶 α(GLA)、连接桥粒斑珠蛋白(JUP)、层粘连蛋白α4(LAMA4)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)、LIM结构域结合蛋白3(LDB3)、核纤层蛋白A/C(LMNA)、心脏肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)、肌球蛋白重链6，心肌α(MYH6)、肌球蛋白重链7，心肌α(MYH7)、肌球蛋白轻链2，调控，心脏，慢(MYH12)、肌球蛋白轻链3，碱；心室，骨骼，慢(MYL3)、肌球蛋白轻链激酶2(MYLK2)、肌原调节蛋白2(MYOZ2)、连接蛋白(Nexilin)(F肌动蛋白结合蛋白)(NEXN)、亲斑蛋白2(PKP2)、受磷蛋白(PLN)、AMP激活的蛋白激酶，γ2非催化亚基(PSEN1)、早老蛋白1(PSEN1)、早老蛋白2(PSEN2)、RNA结合基序蛋白20(RBM20)、兰尼碱受体2 (心脏)(RYR2)、电压门控V型钠通道α亚基(SCN5A)、琥珀酸脱氢酶复合物亚基A黄素蛋白(SDHA)、肌糖δ(SGCD)、含有血影蛋白重复序列的核膜1(SYNE1)、含有血影蛋白重复序列的核膜2(SYNE2))、Tafazzin(TAZ)、肌联蛋白-帽(视松蛋白)(TCAP)、跨膜蛋白43(TMEM43)、胸腺生成素(TMPO)、肌钙蛋白C型1 (慢)(TNNC1)、肌钙蛋白I型3(心脏)(TNNi3)、肌钙蛋白T型2(心脏)(TNNT2)、原肌球蛋白1(α)肌联蛋白(TPM1)、转甲状腺素蛋白(TTR)、肌联蛋白(TTN)、黏着斑蛋白(VCL) 及其部分的任何组合。可以引入用于治疗心血管病况和/或改善的血管生成的多肽或基因可以是VEGF、SDF1、S100A1，或其部分或其组合。

本文提供了包含由本文公开的连接体构建体附接的功能性多肽的多核苷酸构建体。还提供了用于治疗、诊断和其他治疗目的的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的多核苷酸或由其编码的多肽或其缀合物或衍生物。所公开的方法和组合物可以用于治疗疾病和病况。病况的实例可能是癌症。癌症或恶性肿瘤可包括但不限于儿童急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人髓样白血病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童期(原发性)肝癌、儿童急性淋巴母细胞白血病、儿童急性髓样白血病、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童期下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童淋巴母细胞白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma) 和相关肿瘤、外分泌性胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇病(Gaucher's disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性疾病、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐匿性原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、髓样白血病、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/ 恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞泽里综合征(sezary syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、t-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)，以及位于上述器官系统的除瘤形成之外的任何其他过度增生性疾病。

通过本文公开的连接体多肽连接的功能性多肽可以用于本文所述的方法和组合物，并且可以用于治疗恶性或恶化前病况并预防进展为瘤或恶性状态，所述病况包括但不限于上文所述的那些病症。在已知或怀疑前述进展为瘤形成或癌症的状况下，特别是在发生由增生、组织转化或最特别是发育不良组成的非肿瘤性细胞生长的情况下，显示出此类用途。发育不良常常可以是癌症的预兆，并且主要在上皮细胞中发现。它是非赘生性细胞生长的最无序形式，包括在单个细胞均一性上以及细胞结构方向上缺失。发育不良特有地发生在存在慢性刺激或炎症的情况下。可治疗的发育不良病症包括但不限于无汗性外胚层发育不良、异侧发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良(atriodigitaldysplasia)、支气管肺发育不良、大脑发育异常、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育异常、颅面骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅干骺发育不良、牙本质发育不良、骨干发育不良、外胚层发育不良、釉质发育不良、脑-眼发育不良、半肢骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮发育不良、颜面生殖器发育不良、家族性颌骨纤维性发育不良、家族性白色皱襞性发育不良、纤维肌性发育不良、骨纤维性发育不良、红润色骨发育不良、遗传性肾脏-视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨面骨发育不良、干骺端发育不良 (metaphysical dysplasia)、蒙迪尼发育不良、单骨纤维发育不良、粘膜上皮发育不良、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼-脊椎发育异常、牙源性发育异常、眼下颌支发育异常、根尖周牙骨质发育异常、多骨纤维发育异常、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育异常、视网膜发育异常、中隔-眼发育异常、脊柱骨骺发育异常以及室径向发育异常。可以治疗的另外的肿瘤前病症包括但不限于良性增殖紊乱(例如，良性肿瘤、纤维囊性病症、组织肥大、结肠息肉或腺瘤以及食管发育不良)、粘膜白斑病、角化病、鲍文氏病、慢性光化性皮炎、日光性唇炎和日光性角化病。在一些实施方案中，由本文公开的多核苷酸编码的包含至少两种通过本文公开的连接体连接的功能性多肽的多肽构建体用于抑制癌症(特别是上面列出的那些)的生长、进展和/或转移。另外的过度增生性疾病、病症和/或病况包括但不限于恶性肿瘤和相关病症的进展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症；重链病；以及实体瘤，该实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯氏瘤 (Wilm's tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

在一些实施方案中，由本文公开的多核苷酸编码的包含至少两个通过本文公开的连接体连接的功能性多肽的多肽构建体用于治疗疾病，包括但不限于免疫失调疾病和相关的自身免疫性疾病，包括III 型自身免疫性疾病，诸如免疫介导的血小板减少症如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、舍格伦综合征(syndrome)、多发性硬化症、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜 (Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安动脉炎(Takayasu's arteritis)、阿狄森病(Addison's disease)、类风湿性关节炎、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture's syndrome)、闭塞性血栓性脉管炎、舍格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、类风湿性关节炎、多发性肌炎/皮肌炎、多发性软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎和纤维化肺泡炎以及青少年糖尿病。

在一些实施方案中，由本文公开的多核苷酸编码的包含至少两个通过本文公开的连接体连接的功能性多肽的多肽构建体用于治疗传染性疾病。传染性疾病可以是由病原体感染的，诸如细菌、立克次氏体、支原体、原生动物、真菌、病毒、寄生虫或其他微生物制剂的感染。实例包括引起AIDS的人免疫缺陷病毒(HIV)、结核分枝杆菌、无乳链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、乙型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、西尼罗病毒、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人血清细小样病毒、呼吸道合胞体病毒、水痘带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、E-B病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺肿瘤病毒、登革病毒(dengue virus)、风疹病毒、恶性疟原虫、间日疟原虫、刚地弓形虫、让氏锥虫(Trypanosoma rangeli)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiensei)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本血吸虫(Schistosoma japanicum)、牛巴贝虫、柔嫩艾美耳球虫 (Elmeria tenella)、盘尾丝虫、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、旋毛虫、小泰勒尔梨浆虫(Theileria parva)、水泡绦虫、羊绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球绦虫、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、拉氏无胆甾原体 (Acholeplasma laidlawii)、唾液支原体(M.salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)。

在一些实施方案中，由本文公开的多核苷酸编码的包含至少两个通过本文公开的连接体连接的功能性多肽的多肽构建体用于与化疗剂缀合，或者此外，与化疗剂同时使用。如本文所用的“化疗剂”或 “化疗化合物”及其语法上的等同物可以是用于治疗癌症的化学化合物。

由可用于基因疗法的多核苷酸编码的基因和多肽可以顺序地、同时或前述方式的组合引入受试者。待施用于受试者的基因和多肽可以在单个多核苷酸载体上或在不同的多核苷酸载体上。在一些情况下，采用单个载体构建体用多基因载体来导入多个基因。

由本文所述的多核苷酸编码的多肽构建体：

本文所述的多核苷酸构建体可用于治疗心血管疾病和/或改善受试者中的血管发生。例如，用于心血管疗法的分子靶标可以是 VEGF-A、FGF4、肌质网Ca2+ATP酶、S100A1、β-肾上腺素能受体、腺苷酸环化酶6或其组合。在一些情况下，待引入用于心血管基因治疗的基因可以是SDF1、S100A1、VEGF191或其任何组合。

S100是涉及细胞内调节活性的Caβ+调节蛋白质家族的一部分。 S100A1可以是心脏中最丰富的S100蛋白质同种型。它可以通过增强兰尼碱受体(RYRs)和SERCA2a的活性来促进心脏收缩和舒张功能。

S100可以通过调节心肌细胞Ca2+内稳态和独立于β-肾上腺素能刺激的肌丝功能来施加深远的离子移变作用。S100A1可以以Ca2+ 依赖性方式与RyR相互作用并稳定SERCA2a-PLN复合物。S100A1 还可以减少Ca2+的舒张期泄露，并影响心脏肌联蛋白和线粒体 F1-ATP酶。

在一些实施方案中，血管生成多肽或基因可用于心血管疗法或用于改善如本文所述的血管发生。施用编码血管生成生长因子如 VEGF-A165、血管生成素、FGF126、HIF-1α26或其组合的多核苷酸。这些多肽可以促进缺血相关病况中的侧支血管的发展，诸如慢性临界性肢体缺血、心肌缺血、心绞痛或外周动脉闭塞性疾病。血管生成因子也可以诱导形成新的血管网络，这可以使其成为治疗急性冠状动脉综合征和外周血管疾病的合适治疗选择。已经在针对心血管疾病的治疗应用中探索了若干类型能表现出不同性质的血管生成因子。例如，可以使用VEGF和VEGF的亚型。VEGF的亚型可以包括：VEGF-A、 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盘生长因子(PlGF)及其组合。这些因素中的一些也会产生不同的同种型。这些VEGF亚型的细胞内信号可以主要由三种不同的酪氨酸激酶受体介导：VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。这些VEGF亚型与其同源细胞受体之间的特异性相互作用可以在内皮细胞和心肌细胞中引起不同的细胞应答。在一些情况下， VEGF-A、VEGF-A165的同种型可具有高血管生成。VEGF-A165可以与VEGFR1和VEGFR2相互作用。VEGF-A165与VEGFR1在内皮细胞上的相互作用可以有助于新形成的血管的血管稳定性。其与 VEGFR2在内皮细胞上的相互作用可诱导血管生成、血管发生和动脉生成、血管舒张、细胞存活以及细胞渗透性的增加。新形成的心肌细胞中VEGFR2的激活可以增加抗凋亡蛋白的表达并降低促凋亡蛋白的表达。在一些情况下，VEGFR2激活可诱导局部心脏干细胞在缺血区域的募集。

促血管生成因子或基因可以用本发明的载体表达。例如，促血管生成因子可以是VEGF、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)或转化生长因子β-1(TGFβ-1)、酸性纤维母细胞生长因子、血管生成素、肝细胞生长因子、白细胞介素-8、胎盘生长因子、血小板衍生生长因子、多效生长因子、增殖蛋白、肿瘤坏死因子-α及其任何组合。

在一些情况下，所使用并合并到本发明的心脏表达载体中的心脏效应物基因或多肽可选自SDF1、S100A1和VEGF191中的任一种。在某些情况下，本发明的心脏表达载体包含选自SDF1、S100A1和 VEGF191的任何两种基因或由之组成，所述基因在载体上呈连续排序的任何组合。在某些实施方案中，心脏表达载体包含编码SDF1、 S100A1和VEGF191的多核苷酸，所述基因在载体上呈连续排序的任何组合。

在某些实施方案中，SDF1编码序列包含编码SDF1多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，SDF1多肽与SEQ ID NO:102至少45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、 98％、99％或100％相同。在某些情况下，SDF1编码序列包含SDF1密码子优化的开放阅读框(ORF)，SEQ ID NO:103。

在某些实施方案中，编码SDF1的多核苷酸与SEQ ID NO:103 至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、97％、98％、99％或100％相同。

在某些情况下，S100A1编码序列包含编码S100A1多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，S100A1多肽与SEQ ID NO:104至少45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、 98％、99％或100％相同。在某些实施方案中，S100A1编码序列包含S100A1开放阅读框(ORF)或由之组成。在某些情况下，编码S100A1 的多核苷酸与SEQ IDNO:105至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。

在某些实施方案中，VEGF191编码序列可以包含编码VEGF191 多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，VEGF191多肽与SEQ ID NO: 106至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、97％、98％、99％或100％相同。

在某些情况下，VEGF191编码序列可以包含VEGF191开放阅读框(ORF)。在某些实施方案中，编码VEGF191的多核苷酸与SEQ ID NO:107至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。

表4：多肽序列和多核苷酸序列

药物组合物和制剂：

贯穿全文所述的组合物可以配制成药物药剂并用于治疗被诊断患有疾病(例如，心血管疾病)的有需要的人或哺乳动物。在一些实施方案中，本文所述的组合物用于心血管疗法或用于改善如本文所述的血管发生。这些药剂可以与一种或多种载体共同施用。

包含本文所述的多核苷酸的载体(包括编码工程化CRISPR、 TALEN、Argonaut、转座子基、ZEN、大范围核酸酶或Mega-TAL分子，转座子和/或转基因的病毒载体及非病毒载体)也可以直接施用于生物体以供体内转染或转导细胞。或者，可以施用包含本文所述的多核苷酸的裸DNA或mRNA。施用是通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径进行，所述途径包括但不限于注射、输注、局部施加和电穿孔。可以使用超过一种途径来施用特定的组合物。药学上可接受的载体部分由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。

在一些情况下，可以将包含本文所述的多核苷酸的载体与次级疗法联合或分开施用于有需要的受试者。次级疗法可以是用于改善血管发生及肺动脉高压的药剂、醛固酮受体拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、血管紧张素受体阻断剂和脑啡肽酶抑制剂、抗肾上腺素药剂、中枢作用性药(centrally acting)、抗肾上腺素药、外周作用性抗心绞痛药、抗心律失常药、I组抗心律失常药、 II组抗心律失常药、III组抗心律失常药、IV组抗心律失常药、V组抗心律失常药、抗胆碱能变时性药、抗高血压组合物、具有钙通道阻滞剂的ACE抑制剂、具有噻嗪类的ACE抑制剂、具有钙通道阻滞剂的血管紧张素II抑制剂、具有噻嗪类的血管紧张素II抑制剂、具有噻嗪类的抗肾上腺素能药(中枢)、具有噻嗪类的抗肾上腺素能药(外周)、具有噻嗪类的β受体阻滞剂、具有噻嗪类的保钾利尿剂、β-肾上腺素能阻断剂、心脏选择性β受体阻滞剂、非心脏选择性β受体阻滞剂、钙通道阻断剂、儿茶酚胺、利尿剂、碳酸酐酶抑制剂、髓袢利尿剂、保钾利尿剂、噻嗪类利尿剂、正性肌力药、外周血管扩张药、肾素抑制剂、硬化剂、血管扩张药、加压素拮抗剂、血管加压药。

抗血管生成剂也可以与本文所述的多核苷酸联合使用。用于所公开的方法和组合物的合适的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体，包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。在一些情况下，例如，在治疗癌症的组合物、制剂和方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95或100mg。

其他血管生成抑制剂包括血管抑制素、内皮抑素、干扰素、白细胞介素1(包括α和β)、白细胞介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1 和-2的组织抑制剂(TIMP-1和-2)。也可以使用小分子，包括拓扑异构酶如雷佐生(一种具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂)。

在一些情况下，例如，在治疗癌症的组合物、制剂和方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。在一些情况下，所施用的组合物或制剂的总量可以是0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、 6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100g。

方法和适应症

如本文所述，可构建包含本文所述的多核苷酸的载体并将其引入受试者。这些载体可用于基因疗法。这些载体可用于治疗接受者(例如，人)中的疾病。例如，可以向受试者施用本文所述的多核苷酸和 /或由本文所述的多核苷酸编码的多肽以治疗心血管疾病或改善受试者中的血管发生。通过本文所述的方法或通过接触或施用本文所述的组合物治疗的受试者可以是哺乳动物受试者，该哺乳动物受试者可以是人类受试者、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物或任何其他哺乳动物。

本文描述了治疗接受者中的疾病(例如，心血管疾病)的方法，该方法包括将至少一种包含至少一种本文所述的多核苷酸的载体引入患有心血管疾病的受试者。在一些情况下，将载体引入细胞。

在一些情况下，心血管疾病可以是心肌病。心肌病可以由病理异常心肌定义。可以有四种主要的心肌病分类：扩张型(DCM)、肥厚型(HCM)型、限制型(RCM)和致心律失常型RV(ARVC)。心肌病可以通过体内成像用超声心动图或越来越多用心脏MRI来诊断。DCM可以指心脏的放大，其通常影响所有四个房室，特别是在疾病的晚期。最常见的是，虽然在疾病早期LV可能会扩张，但DCM 可伴随降低的LV功能或心脏收缩功能，其中功能仅有最低限度的降低。相比之下，HCM可由LV壁厚度增加来表征，通常靶向将RV与 RV分开的隔膜。RCM在一些情况下可能是难以捉摸的，部分是因为心脏可能在形态学上接近正常，其中仅壁厚轻微增加或LV射血分数适度减少。即使利用最敏感的成像技术，RCM潜在的浸润过程也可能不容易在体内检测到。RCM可由心脏充盈受损(称为舒张期功能障碍)来表征，其减少心输出量。ARVC的特征可在于可在MRI上观察到的具有纤维脂肪浸润的RV的功能减退以及变薄。在一些情况下，可以用本发明的载体治疗心肌病患者。

本文提供的方法可用于治疗或预防疾病，该疾病包括但不限于癌症、心血管疾病、肺疾病、肝脏疾病、皮肤疾病或神经疾病。本文提供的方法可用于改善受试者中的血管发生。

如本文所用的“改善”及其语法上的等同物可以意指由本领域技术人员认识到的任何改善。例如，改善心血管疾病可意味着减轻心律失常，其可包括减少、减轻或降低不期望的效果或症状。在另一个实例中，改善疾病可意味着减轻肿瘤负荷，其可以包括减少、减轻或降低不期望的效果或症状。例如，举几个改善的例子，受试者可能经历肿瘤负荷的减少、生存期延长、完全缓解、稳定化。

另一个改善迹象可以是受试者免除治疗的天数。例如，在本文提供的施用治疗之后，接受者可以免除治疗至少或至少约1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10天或更多天。这可以表明治疗是成功的。这也可以表明没有与施用本文所述的多核酸相关联的毒性。

受试者可以免除治疗至少1天。接受者也可以免除治疗至少7 天。接受者可以免除治疗至少14天。接受者可以免除治疗至少21天。接受者可以免除治疗至少28天。接受者可以免除治疗至少60天。此外，接受者可以免除治疗至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。

另一个改善迹象可以是接受者需要减少治疗的天数。例如，在本文提供的治疗之后，接受者可能需要减少治疗施用至少1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10天或更多天。这可以表明治疗是成功的。

例如，接受者可能需要减少治疗至少1天。接受者还可能需要减少治疗至少7天。接受者可能需要减少治疗至少14天。接受者可能需要减少治疗至少21天。接受者可能需要减少治疗至少28天。接受者可能需要减少治疗至少60天。此外，接受者可能需要减少治疗至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。

在心脏病患的治疗中，经皮冠状动脉导管插入术可以是微创手术，其可以允许将均质基因递送至心脏的每个区域。在一些情况下，在患有严重冠状动脉疾病的患者中基因递送可能受到阻碍。例如，在冠状动脉输注期间，可以在不中断冠状动脉血流的情况下将载体注入导管。

在一些情况下，可以用冠状静脉阻塞实现载体在冠脉循环中的停留时间增加。例如，具有由冠状动脉和冠状静脉二者增强心肌基因表达的短阻塞的顺行冠状动脉输注可增加载体停留时间。

在其他情况下，为了使载体暴露于内皮的持续时间最大化，同时使系统分布最小化，可以使用心脏再循环方法。在这种情况下，体外装置可以使用吸收导管从冠状窦排出血液，并通过蠕动泵(V-Focus； Osprey Medical Inc.)将充氧的冠状静脉血液返回到左冠状动脉主干。利用该方法可以允许在没有全身副作用的情况下选择性施用内皮透化剂。

在一些情况下，转染功效可以与冠状动脉血流量以及暴露时间和载体浓度相关联。例如，由增加的冠状动脉血流量支持的顺行冠状动脉输注(例如使用主动脉内球囊反搏)可以进一步增强心脏基因转移。

在一些情况下，可以进行将载体直接注射到心脏。可以将载体心外膜注射或心内膜注射到目标区域。在一些情况下，直接注射可以绕开过内皮屏障。这可能导致注射部位处局部高浓度。在一些情况下，直接注射可避免暴露于循环血液。在其他情况下，将载体直接注射到心脏可避免通过循环DNA酶或中和抗体使载体失活。尽管局部施用不能完全避免一些全身载体分布，但直接载体注射还可以减少载体暴露于脱靶器官。低量高载体浓度也可以增加心肌中的载体保留。

在一些情况下，可以在胸廓切开术期间引入载体。也可以以心包方式引入载体。在一些情况下，例如如图9中所公开的，可以使用逆行灌注来引入载体。

基因疗法后，转染的细胞可以在接受者中起作用。功能可以在一些情况下确定基因疗法是否成功。例如，转染的细胞可以起作用至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天。这可以表明基因疗法是成功的。这也可以表明对所移植的细胞或载体无排斥。

在某些情况下，转染的细胞可以起作用至少1天。转染的细胞也可以起作用至少7天。转染的细胞可以起作用至少14天。转染的细胞可以起作用至少21天。转染的细胞可以起作用至少28天。转染的细胞可以起作用至少60天。

施用途径

先前，向心脏中递送治疗剂的技术已经包括心肌内施用(经心外膜或经心内膜)或顺行递送到冠状动脉中。经心外膜途径存在侵入性手术的缺点。经心内膜途径需要使用系统如NOGA装置的复杂电磁映射，该技术不适用于患有心肌变薄的患者，因为其可能引起穿孔。其他设备如Biocardia–螺旋输注导管或Celyad–C-Cath也具有壁厚的局限性。

与心肌内施用相比，顺行施用至冠状动脉中伴随着较低的生物保留[12]。此外，将生物制剂施用于冠状动脉中已显示出增加冠状动脉栓塞和ST区段升高的风险[13][14][15][16][17]。另外利用pDNA 施用，在进入靶组织之前与大血量直接接触可能会降低效果。

逆行施用

对于人类，冠状窦排出心室腔的静脉系统，这是造成大多数心脏收缩的原因。逆行递送到冠状窦的技术已被广泛用于心麻痹溶液的施用，部分原因是该溶液在整个心肌中的分布优于顺行递送[18]。此外，对于在高危经皮经腔冠状动脉血管成形术期间施用含氧血，该过程已被证明在临床上是安全的[19][20][21]。逆行施用于冠状窦中的过程涉及通过球囊导管暂时阻塞输入冠脉循环，随后针对流出的血液进行施用。这导致溶液通过毛细血管后微静脉进入心肌。与小动脉或毛细血管相比，毛细血管后微静脉具有最小的血管直径，并且从概念上将允许使材料最大转移到间质[22]。生理上，已知毛细血管后微静脉是免疫/炎性细胞穿过内皮细胞迁移的主要靶标，部分是由于粘附分子如ELAM-1[23]、ICAM-1[24]、CD18[25]和CD44[26]的表达，并且部分是因为生物力学特性。Patel等人在REVIVE试验中证明，使用与本临床前研究(Cook Regentec)中提出的相同的递送导管，超过30亿有核细胞可以安全地以60cc的体积递送到患有晚期CHF的患者的冠状窦中[27]。

逆行施用的基因疗法

在心脏再生领域，几项研究已成功地采用逆行施用。Boekstegers 等人[32]将表达β-半乳糖苷酶(beta-gal)和萤光素酶的腺病毒递送到猪心肌，比较顺行递送到冠状动脉中或经由心前静脉逆行。与顺行相比，通过逆行方法观察到基因在梗塞组织中表达以均匀性方式显著升高。Alino等人[33]报道了类似的结果，他们观察到以逆行方式用裸 DNA注射的猪心脏中eGFP的间质表达。在另一项研究中，使用逆行方法在猪中施用β-半乳糖苷酶编码质粒相比于顺行和肌内施用导致心肌基因表达更高[34]。与心肌内递送相比，这种优越的基因表达水平在其他研究中得以重现[35]。采用逆行施用也已成功进行递送蛋白质治疗剂。Von Degenfeld等人[36]报道了猪的研究，其中使用逆行施用 FGF-2蛋白来防止实验诱导的狭窄。经逆行处理的猪心肌中放射性同位素标记的FGF-2水平几乎两倍于使用顺行输注所达到的水平。另外，当通过逆行方法施用FGF-2时，报道了透壁血流量和局部心肌功能的显著改善。还报道了SDF-1αpDNA在心力衰竭患者中逆转递送的安全使用(RETRO-HF)。

因此，本发明的优选实施方案包括采用通过冠状窦逆行施用。本发明的另一个实施方案包括采用冠状动脉内或心肌内的施用途径。超声靶向微泡破坏基因传递(UTMD)

充气微泡是有用的超声造影剂。在一些实施方案中，微泡用于将本文所述的载体、基因和/或构建体递送至受试者中的组织和/或器官[65]。在一些情况下，递送可以是器官或组织特异性的。当超声接近其共振频率时，微泡振荡。随着超声能量的增加，振荡振幅增加，从而导致微泡破坏。该现象用于将本文所述的载体或组合物递送至靶器官，例如，通过施用装载有本文所述的组合物或基因疗法载体的微泡，例如通过静脉内注射，并随后暴露于超声能量，导致靶部位的微泡破坏。

在UTMD的实施方案中，将生物活性分子如本文所述的质粒载体、编码本文所述的基因构建体的多核苷酸添加到例如脂质微泡造影剂的阳离子壳中。这些携带载体的微泡可以施用于受试者，例如静脉内施用或直接施用于心脏的左心室以及其他施用选择。在一些受试者中，微泡可以通过冠状动脉内导管输注。通过在微泡的共振频率处的声空化随后进行从循环递送到靶器官。在一些实施方案中，由微泡破坏生成的机械能可导致目标区域的微脉管系统的内皮细胞中或之间的暂时性孔隙形成。在一些实施方案中，增强进入和穿过内皮细胞的转染功效，并且将编码转基因的载体沉积到周围组织中。因此，在其中通过UTMD递送本文所述的载体的一些情况下，循环中任何另外的质粒DNA剩余可通过血液中的核酸酶进行降解，从而导致对暴露于超声波声处理的器官的高度特异性靶器官转染，并降低传递至非超声组织的可能性。

实施例

实施例1：用于Att位点介导的重组的心肌细胞转染

用具有或不具有(即，加(+)或减(-))att位点和加(+) 或减(-)SpBC2重组酶的萤光素酶载体转染心肌细胞。然后随着时间的推移对萤光素酶表达进行监测以评估att位点介导的重组。为了确定SpBC2及其所提出的活性位点(Att位点)的位点特异性和功效，将心肌细胞用SpBC2质粒和含有围绕感兴趣的基因的att位点的萤火虫萤光素酶(“FLUC”或“Luc”)质粒载体共转染。所包括的对照是不含SpBC2的Att-Luc质粒(用于测量随机整合)、带有SpBC2的 No-Att-Luc质粒(用于测量非att位点特异性整合)和不含SpBC2的 No-Att-Luc质粒(用于测量瞬时表达)。通过DNAfectin(Applied Biological Materials Inc.，Richmond，BC，Canada)转染细胞，并培养超过14天，定期继代培养细胞，通过萤光素酶测定测试细胞，并收获细胞用于qPCR测定。

通过利用完全生长培养基和转染培养基(不含FBS/抗生素的 Prigrow I)进行转染。转染前至少1小时，将培养基从心肌细胞中取出并用新鲜生长培养基替换。在6孔板中为3mL/孔或在12孔板中为 1.5mL/孔。使用前将DNAfectin试剂温热至室温，并短时涡旋混合。 DNAfectin-质粒DNA复合物的各种组合在转染培养基中制备如下：

“Att-Luc”＝具有att位点和萤光素酶基因的载体；

“Luc”＝具有萤光素酶基因、无att位点的载体；

“SPBc2”＝编码SPBc2重组酶的载体；和，

“填充物”＝(或pStuffer)是具有与pXoX相同的骨架构型的质粒，其中开放阅读框(ORF)被替换为不表达、相似大小的非效应物序列。

将DNA添加到转染培养基中。混合物在室温下温育20分钟。以每孔300μL将DNAfectin-DNA复合物添加到细胞中。

传代和收获用于qPCR、萤光素酶测定

转染后48小时，从12孔板中的细胞中去除培养基。使细胞胰蛋白酶化并收获到微量离心管中。然后将细胞重新悬浮于1mL新鲜生长培养基中。将细胞以5e4细胞/孔接种到新鲜的12孔板中并测量萤光素酶。收获剩余的细胞用于qPCR。

结果：

在两周的过程中，来自Att-Luc+SPBc2重组酶的FLUC表达降低大约10倍，而来自其他转染条件(不含att位点或不含重组酶)的 FLUC表达降低100至1000倍，几乎返回到背景表达水平(数据未示出)。还观察到Att位点介导的FLUC GOI(感兴趣的基因)向心肌细胞基因组中的重组(数据未示出)。

实施例2：HUVEC增殖测定

使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖测定来评估由pXoX表达的VEGF165的功能。将血清饥饿的HUVEC用来自患者(扩张型，肥厚型)的条件培养基或用pXoX或单一效应物对照(pVEGF165阳性对照，pSDF-1α阴性对照)转染的健康iPSC衍生的心肌细胞处理。温育96小时后，使用发光测定法定量HUVEC增殖。测定重复三次 (例如，CM-1、CM-2、CM-3)。

诱导多能干细胞

用编码以下项的单基因、双基因或三基因载体转染iPSC心肌细胞：S100A1和VEGF；S100A1、SDF1和VEGF；或单独的VEGF。转染后48小时收集细胞上清液。在从转染的iPSC细胞收集的上清液中以大约1:10、1:100和1:1000的密度将HUVEC接种在6孔板上。在引入上清液后96小时，通过CellTiter-Glo测定来测量HUVEC增殖，图5A和图5B显示了实验数据。图14A和图14B显示了来源于扩张型心肌病患者的iPSC细胞的类似结果。

来自心肌病患者和健康对照的心肌细胞

从患有扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)的患者或健康对照中获得心肌细胞-iPSC细胞。用编码以下项的单基因、双基因或三基因载体转染iPSC细胞：S100A1和VEGF；S100A1、SDF1 和VEGF；或单独的VEGF。转染后48小时收集细胞上清液。在从转染的iPSC细胞收集的上清液中以大约1:10、1:100和1:1000的密度将HUVEC接种在6孔板上。在引入上清液后96小时，通过 CellTiter-Glo测定来测量HUVEC增殖，图6示出了实验数据。

结果

在两种情况下，用单基因、双基因或三基因载体构建体转染的 iPSC-CM显示HUVEC增殖增加4-10倍。因此，结果成功证明，在使用本文提供的连接体的情况下，当作为来自双基因和三基因表达载体的多基因连接构建体的一部分表达时，VEGF是功能性的(即，生物活性)(即，类似于用单一VEGF165效应物质粒的情况下所观察到的那样诱导HUVEC增殖)。

实施例3：内皮细胞管形成测定

除了HUVEC增殖测定之外，还将使用内皮细胞管形成测定 (CBA200，Cell BiolabsInc.，San Diego，CA，USA)。ECM凝胶将在4℃解冻，并使用冷却移液管嘴混合均匀。将细胞培养板(96孔) 底部涂覆ECM凝胶的薄层(50μl/孔)，将其在37℃下聚合60min。将HUVEC(2-3×10⁴个细胞)接种到从iPSC心肌细胞收集的上清液中的细胞培养板中，该iPSC心肌细胞用编码以下项的单基因、双基因或三基因载体转染：由本文所述的连接体连接的S100A1和VEGF；由本文所述的连接体连接的S100A1、SDF1和VEGF；或单独的VEGF。将150μl的上清液-HUVEC混合物添加到固化的ECM凝胶上的每个孔中。将板在37℃下温育12-18hr。并在用Calcein AM染色之后使用荧光显微镜定量内皮细胞管。随机选择三个显微镜视野并拍照。通过在4×物镜和每孔四个不同视野下计数细胞簇(结)和分支的总数来对管形成能力进行定量。结果将表示为与对照组相比分支的平均变化倍数。每个实验将进行至少三次。

实施例4：SDF-1α功能-迁移测定

使用24孔Transwell趋化室技术(Millipore，Billerica，MA， USA)进行趋化实验。简言之，从健康志愿者中获得的样品中分离外周血白细胞(PBL)，并用编码以下项的双基因或三基因载体转染：由本文所述的连接体连接的S100A1和VEGF；或由本文所述的连接体连接的S100A1、SDF1和VEGF。将200μL培养基中总共1×10⁵个PBL接种到上室(孔径，8μm)中。对于抑制实验，在接种之前，将一半的PBL与10nmol/L CXCR4拮抗剂(AMD3100)预温育30min。然后，将PBL和培养基转移到上室。然后将该室在37℃下于含有5％ CO₂的潮湿空气中温育12h。除去膜(Millipore)并用棉签擦拭其上表面以除去固着的PBL。然后将膜在室温下固定于中性福尔马林中 10min，并随后用0.1％结晶紫染色5min。在光学显微镜下(Nikon Eclipse，Nikon Instruments,Inc.，Melville，NY，USA)在10个随机高倍视野(HPF)中计数迁移到该膜的下表面的PBL的数目。

计算趋化指数(CI)以表达受到刺激的迁移：CI＝受到刺激的迁移(每个HPF的CSC数目)/随机迁移(每个HPF的CSC数目)。每个测定在一式三份的孔中进行。

结果

使用AMD3100(CXCR4拮抗剂)验证SDF1特异性迁移是成功的。AMD3100显示对SDF1-CXCR4依赖性迁移的完全抑制(样品 #2、6)。在iPSC-CM中表达的SDF1在我们的双基因和三基因构建体中是功能性的，因为在AMD3100的存在下迁移减少(样品#7、12、 13)。图7和图8显示了实验数据。用VEGF表达载体构建体进行的类似实验显示了类似结果，图6。因此，这些结果成功证明了：在使用本文提供的连接体的情况下，当作为来自双基因和三基因表达载体的多基因连接构建体的一部分表达时，SDF-1α是功能性的(即，生物活性)。

实施例5A：SDF-1α功能-Jurkat迁移测定

转染的Jurkat细胞产生支持细胞迁移的功能性SDF1蛋白

通过证明两种以下细胞类型的CXCR4介导的迁移来检测 SDF-1α的功能性：Jurkat细胞和外周血淋巴细胞(PBL)。对于Jurkat 细胞迁移，将无血清培养基中的细胞接种到transwell插入物的顶部。下室填充有来自患者(扩张型，肥大型)或用pXoX或单一效应物对照转染的健康iPSC衍生的心肌细胞的条件培养基。使用发光测定来定量2小时后通过trans-well插入物迁移到含有条件培养基的下室中的细胞的数目。

用编码SDF1的单基因、双基因和三基因基因构建体转染Jurkat 细胞。在添加药物后2小时，测量Jurkat对照细胞和暴露于AMD3100 (CXCR4拮抗剂)的Jurkat的迁移效率。图8和图10示出了实验数据。在用编码SDF1的双基因和三基因载体转染的人iPSC的上清液培养的Jurkat细胞上进行的类似实验显示了类似结果，图11。

结果

向重组SDF1的Jurkat迁移是CXCR4依赖性的。因此，这些结果成功证明，在使用本文提供的连接体的情况下，当作为来自双基因和三基因表达载体的多基因连接构建体的一部分表达时，SDF-1α是功能性的(即，生物活性)。

实施例5B：来自心肌病患者的转染心肌细胞产生支持细胞迁移的功能性SDF1蛋白

从患有扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)的患者或健康对照中获得心肌细胞-iPSC细胞(iPSC-CM)。用编码下组的单基因、双重基因(双基因)或三基因载体转染iPSC细胞：由本文所述的连接体连接的S100A1和VEGF；由本文所述的连接体连接的S100A1、SDF1和VEGF；或单独的VEGF。转染后48小时收集细胞上清液。将Jurkat细胞以约1:10、1:100和1:1000的密度在从转染的 iPSC细胞收集的上清液中接种在6孔板上。在引入上清液后96小时，测量Jurkat细胞迁移。图12示出了扩张型心肌病模型中的实验数据。图13示出了肥厚型心肌病模型中的实验数据。

结果

在两种情况下，用单基因、双基因或三基因载体构建体转染的 iPSC-CM显示HUVEC增殖增加4-10倍。

实施例6：ELISA

转染的293T细胞产生可定量的蛋白质水平

用Xogenex单基因、双重基因(双基因)、三重基因(三基因) 构建体和合适的对照构建体通过Fugene 6(Promega)转染293T细胞。在所需的时间点收获细胞上清液和裂解物。利用在Kozak序列、连接体(弗林蛋白酶-AP-F2A、GSG-P2A、弗林蛋白酶-APVKQGSG-P2A)(SEQ ID NO:119)存在或不存在或者一个没有的情况下而不同的载体，用编码由本文所述的连接体连接的S100A、SDF1、VEGF191或其各种组合的载体构建体转染293T细胞，如图15-17所总结的。通过ELISA测量所产生的蛋白质之浓度。

结果

用编码S100A、SDF1、VEGF191或其各种组合的双基因载体转染的293T细胞产生可测量的蛋白质水平。图15A和图15B示出了 SDF1蛋白质的水平。图16A和图16B示出了VEGF蛋白质的水平。图17A和图17B示出了S100A1蛋白质的水平。

实施例7：三基因表达构建体

如下表5所示，设计双重基因(双基因)、三基因和四基因(四种基因)构建体的基质(变体)。

表5-呈多基因质粒构建体设计的基质

*可选的第3连接体和基因-4增加S100A1的效价(即，增加S100A1 二聚体的产生)

在来自健康供体、具有扩张型心肌病和肥厚型心肌病的供体(患者)中的每一个的模型细胞类型(即，293T细胞、SV40转化的心肌细胞和iPSC衍生的心肌细胞)中测试多肽表达和切割效率。各种连接体(即，连接序列)组合的表达结果、切割效率结果和表达考虑的总结在下表6中示出。

表6-多肽切割/连接体/感兴趣的基因(GOI)表达差异

先导构建体构型：

((5')-CAG启动子-S100A1-fp2a(连接体)-SDF1-fp2a(连接

体)-VEGF191-(3')

(5')-CAG启动子-S100A1-fp2a(连接体)-VEGF191-fp2a(连接体)-SDF1-(3')

ELISA测定-从三基因构建体表达S100A1

与单基因pXoX对照和先前鉴别的先导候选物双基因构建体相比，进行ELISA测定以对从三基因pXoX构建体表达S100A1进行定量。用每种测试质粒构建体转染SV40转化的心肌细胞，并在所需的时间点收获细胞上清液和裂解物。用编码由本文所述并在以下表7中分别示为第一、第二和第三连接体序列(例如，fp2a、fmdv、p2a、IRES、 CMV或无连接序列)的连接体序列连接的S100A、SDF1α、VEGF191 或其各种组合的载体构建体来转染心肌细胞。通过ELISA测量所产生的蛋白质浓度。参见图18；样品编号对应于下表7中所示的样品编号。

构建体的构型和S100A1表达结果在表7(下文)中显示。

表7与其他构建体相比，从三基因的S100A1多肽表达。

ELISA测定-从三基因构建体表达SDF1α

与单基因pXoX对照和先前鉴别的先导候选物双基因构建体相比，进行ELISA测定以对从三基因pXoX构建体表达SDF1α进行定量。用每种测试质粒构建体转染SV40转化的心肌细胞，并在所需的时间点收获细胞上清液和裂解物。用编码由本文所述并在以下表8中分别示为第一、第二和第三连接体序列(例如，fp2a、fmdv、p2a、IRES、 CMV或无连接序列)的连接体序列连接的S100A、SDF1α、VEGF191 或其各种组合的载体构建体来转染心肌细胞。通过ELISA测量所产生的蛋白质浓度。参见图19；样品编号对应于下表8中所示的样品编号。

表8 与其他构建体相比，从三基因的SDF1α多肽表达。

ELISA测定-从三基因构建体表达VEGF191

与单基因pXoX对照和先前鉴别的先导候选物双基因构建体相比，进行ELISA测定以对从三基因pXoX构建体表达VEGF191进行定量。用每种测试质粒构建体转染SV40转化的心肌细胞，并在所需的时间点收获细胞上清液和裂解物。用编码由本文所述并在以下表9中分别示为第一、第二和第三连接体序列(例如，fp2a、fmdv、p2a、 IRES、CMV或无连接序列)的连接体序列连接的S100A、SDF1α、 VEGF191或其各种组合的载体构建体来转染心肌细胞。通过ELISA测量所产生的蛋白质浓度。参见图20；样品编号对应于下表9中所示的样品编号。

表9与其他构建体相比，从三基因的VEGF191多肽表达。

Western印迹(免疫印迹)测定验证从三基因构建体的S100A1、 SDF-1a和VEGF191的有效切割

通过免疫印迹和质谱分析证实了在相关细胞类型内单个效应物蛋白质的合适大小和序列的确认(如本文进一步所述的)。用pXoX 转染多个相关细胞系，并分析细胞裂解物(对于S100A1)或条件培养基(对于SDF-1α和VEGF165)。用于免疫印迹分析的对照是来自用合适的单一效应物(pS100A1、pSDF-1α、pVEGF165)转染的细胞的裂解物/条件培养基和相应的商购获得的纯化重组蛋白。

在所有测试的细胞系(来自健康个体、扩张型心肌病患者、肥大型心肌病患者的293T、SV40永生化心肌细胞、iPSC衍生的心肌细胞)中SDS-PAGE/免疫印迹结果是一致的。来自SV40永生化心肌细胞的免疫印迹数据在下文图21-23中示出，其中箭头指示每种指定的效应物蛋白质的预期大小。

对于每个GOI，根据制造商的说明书使用标准程序进行免疫印迹分析。检测试剂条件如下：

S100A1检测-将抗-S100A1抗体(R&D Systems,Inc.)稀释1:200，在4℃下与印迹一起温育过夜；将抗-羊HRP(辣根过氧化物酶)抗体 (KPL Inc.，Gaithersburg，MD，USA)稀释1:20,000，在室温(RT) 下与印迹一起温育30分钟；通过Ultra(KPL Inc.)进行信号检测；

SDF-1α检测-将抗SDF-1α抗体(R&D Systems,Inc.)稀释1:2000，在4℃下与印迹一起温育过夜；将抗-山羊HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.，West Grov，PA，USA)抗体稀释 1:20,000；在室温(RT)下与印迹一起温育30分钟；通过Ultra(KPL Inc.)进行信号检测。

VEGF检测-将抗-VEGF抗体(Abcam,Plc.，Cambridge，MA)稀释1:2000，在4℃下与印迹一起温育过夜；将抗-兔HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)抗体稀释1:20,000，在室温(RT) 下与印迹一起温育30分钟；通过Ultra(KPL Inc.)进行信号检测。

实例免疫印迹在图21、22和23中示出。

表10-来自表达各种构建体的细胞的样品在泳道1-9中示出(泳道“L” 显示多肽分子量对照梯(220、120、100、80、60、50、40、30、20、 14、6和3kDa标志物))。

结果表明，三个GOI中的每一个在从三基因构建体表达时均得以有效切割。

质谱分析-通过质谱法评估多基因表达产物。

使用质谱法验证先导候选物的裂解产物。使用标准程序进行胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶消化。用与ThermoFisher Q Exactive HF(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)接口的 Waters NanoAcquity HPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA，USA) 通过纳米LC/MS/MS*进一步分析每个凝胶消化物。使用Mascot数据库处理数据。将Mascot DAT文件解析成Scaffold软件进行验证、筛选并为每个样品创建非冗余列表。数据使用90％的最小蛋白质值、50％的最小肽值(先知分数)以及每种蛋白质需要至少两种独特的肽进行筛选。与上述Western印迹(免疫印迹)分析一致，质谱分析结果进一步证实了当从先导双基因和三基因构建体表达时S100A1、SDF-1 和VEGF的蛋白水解切割；参见表11。

*LC/MS/MS表示具有质谱(MS)的液相色谱(LC)。MS/MS 是一台质谱仪中两个质量分析仪的组合。第一个MS筛选前体离子，随后用高能量和例如氮气分裂该前体离子。然后第二个质量分析仪筛选由分裂生成的产物离子。MS/MS的优点是灵敏度提高了。

表11-通过对先导候选物构建体质谱分析所分析的多肽切割的总结

质谱法(MS)也用于评估每个GOI的端部(C-末端)处连接体氨基酸残基的存在或不存在。如上所述进行MS。结果如下表12所示。

表12-用于先导候选物构建体的C末端连接体氨基酸残基的MS分析

*“是”表示在C末端尾(其在本文中可称为“连接体尾”)存在>(多于) 2个氨基酸(AA)残基；“否”表示在C端尾存在<或＝(少于或等于) 2A。

S100A1多肽二聚化的Western印迹(免疫印迹)分析

进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以评估从双基因和三基因构建体表达的S100A1多肽的二聚体形成。针对pS100A1的单体和二聚体水平，通过天然-PAGE/免疫印迹法分析转染的293T细胞的条件培养基。结果证明从先导双基因和先导三基因候选物切割的 S100A1主要是二聚体形式，而由单一效应物构建体pS100A1表达的和由具有CMV连接体C-末端至S100A1的三基因构建体表达的 S100A1主要是单体的；参见图24。

值得注意的是，本发明的独特方面通过由本发明构建体编码的多肽的特定顺序提供并实现。因此，在本发明的一个方面中，特别是把S100A1蛋白质置于首位实现并允许生物活性S100A1分子的功能性表达，原因在于令人惊讶地发现S100A1上的剩余2A尾不会干扰 S100A1生物活性。相反，发现将S100A1作为第二基因导致通过构建体表达的基因的不完全切割。

因此，使用质谱法分析pXoX表达，如下表13中所示，其示出了S100A1是未表现出导致C-末端2A肽去除的弗林蛋白酶切割的唯一效应物。因此，在SDF1α或VEGF上没有2A C-末端尾。只有S100A1 具有2A连接体-尾存在。确切的端部氨基酸序列为PG。它在端部PGP 序列的G与P之间切割。因此，如从pXoX表达的S100A1上的C- 末端连接体尾包含与-RAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO：123)融合的序列(N至C-末端)S101A1多肽；其在本文中可称为“2A尾”。例如，在一个实施方案中，从S100A1的起始甲硫氨酸至fp2a切割的连接体尾的C-末端，本发明的第一个GOI包含序列：

MGSELETAMETLINVFHAHSGKEGDKYKLSKKELKELLQTELSGFLDAQKDVDAVDKVMKELDENGDGEVDFQEYVVLVAALTVACNNFFWENSRAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG(SEQ ID NO:124)。

然而，如通过本文呈现的数据所提供的，已经证明该S100A1 尾是“惰性的”-即不影响S100A1功能(生物活性)。

表13-从pXoX表达的蛋白质的质谱分析

实施例8：三基因载体转染

将293T细胞以每孔750,000个细胞接种在6孔板中，并在板上 37℃/5％CO₂培养箱温育过夜。第二天，使用FuGENE 6(Promega) 以单(单基因)、双(双基因)、表14的三(三基因)基因构建体和合适的对照构建体利用在OptiMEM培养基(LifeTechnologies)中稀释的100ng/ml质粒载体来转染所述细胞。转染后，将细胞温育。在72小时的期望时间点处收获细胞上清液和裂解物。

表14：pXoX三基因载体序列

表15：pXoX的组分

结果

当来自pXoX的效应物表达为单个多基因mRNA时，每种效应物的相对表达是固定的。为了确定pXoX的每种效应物的相对表达水平，对若干种相关的细胞系予以转染，并通过ELISA评估蛋白质表达。用针对每种单独的效应物(pS100A1、pSDF-1α或pVEGF165)或全部三种效应物(pXoX)的质粒来转染细胞。

因此，如表16所示，用编码S100A1、SDF-1α和VEGF165的 pXoX三基因载体转染的各种细胞产生如通过ELISA测定法所检测的可测量的蛋白质水平。测试的细胞类型包括293T细胞、SV40转化的心肌细胞、来自健康个体的iPSC-CM(心肌细胞)、来自扩张型心肌病患者的iPSC-CM和来自肥厚型心肌病患者的iPSC-CM。

在转染后72小时，收集培养基和细胞裂解物并分别分析以评估分泌蛋白质(VEGF165和SDF-1α)或细胞内蛋白质(S100A1)的表达。下表16示出了每种效应物的蛋白质水平与单独表达每种效应物的质粒所达到的水平相比较，表示为ng/mL。

表16：在各种细胞类型中检测来自单基因和三基因表达质粒的多肽表达。

实施例8：心肌细胞转染

SV40永生化心肌细胞

通过DNAfectin Plus(ABM)用Xogenex单基因、双重基因(双基因)、三基因构建体(其中至少两个基因通过本文所述的连接体连接)和合适的对照构建体来转染SV40永生化心肌细胞。6孔板用细胞外基质(ABM)包覆过夜。24小时后，将心肌细胞以225,000个细胞/孔接种到每个EMC涂覆的孔中而接种在6孔板上。将细胞在 37℃/5％CO₂下温育过夜。72小时后，将培养基从细胞中收集到2mL 深孔块中并储存用于ELISA以检测和定量蛋白质生产。

iPSC心肌细胞

通过GeneJammer转染试剂(Agilent)用Xogenex单基因、双重基因(双基因)、三基因构建体和合适的对照构建体转染iPSC心肌细胞。将12孔板用纤连蛋白(ThermoScientific)涂覆并在37℃/5％CO₂下温育1小时。将DNA酶在超纯水中重构至最终浓度为10mg/mL。使用TrypLE和1X DNA酶I将心肌细胞胰蛋白酶消化并在37℃下温育5分钟或直至细胞从烧瓶中分离。将iPSC细胞以4e5个细胞/孔接种到12孔板的每个纤连蛋白涂覆的孔中。将铺好的细胞在37℃/5％ CO₂培养箱中温育24小时。第二天，使用2μg的质粒DNA(pXoX 和对照)转染心肌细胞。

结果

用编码S100A、SDF1、VEGF165的三基因载体转染的永生化和原代心肌细胞产生可测量的蛋白质水平，图21。

实施例9：通过转染的心肌细胞定量蛋白质生产

将来自293T细胞、SV40CM和iPSC CM的裂解物在BuPH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液包(0.2M)(ThermoFisher)中以1:100稀释并通过ELISA测定进行分析。

结果

在转染的293T细胞、SV40CM和iPSC CM的细胞裂解物中检测S100A1、SDF-1α和VEGF165蛋白质，图21。

实施例10：搏动速率和收缩持续时间

为了评估pXoX的功效和由pXoX表达的S100A1的功能，来源于用pXoX或合适的对照转染的健康个体和扩张型心肌病患者(携带心脏TNNT2基因中的R173W突变)的iPSC-心肌细胞的收缩性质在Sony SI8000活细胞成像系统上进行测量。细胞收缩被记录为高分辨率和高帧速率视频(2048*20488像素，150fps，每孔10秒)。用 Sony S18000C分析仪软件对收缩视频进行进一步分析，并针对每个单独的孔取出收缩参数。根据温育30分钟内记录的收缩性质测定 iPSC-CMs对β-肾上腺素能刺激、异丙肾上腺素(ISO，100nM)的应答。在研究期间评估三个收缩参数：搏动速率、收缩速率(速度)和收缩持续时间。

结果

搏动速率和收缩持续时间指示在编码S100A1的载体的3'端存在2A尾不影响S100A1的功能，图18A和图18B。在单独的实验中，在图19A、19B和图19C中示出的搏动速率和收缩持续时间表明由转染的iPSC-CM细胞产生的蛋白质使DCM收缩特性恢复到健康对照水平。

因此，这些结果证实，与pStuffer和非转染对照相比，用pS100A1、 pS100A1-SDF-1α和pXoX改善了源自扩张型心肌病患者的iPSC-心肌细胞的体外收缩特性。(pStuffer是一种与pXoX具有相同的骨架构型的质粒，其中开放阅读框(ORF)被替换为非表达、相似大小的填充序列。)

pS100A1和pS100A1-SDF-1α显示可比较的功能性输出(增加的搏动速率，改善的可收缩持续时间)，表明在pS100A1-SDF-1α和pXoX 的S100A1的3’端处存在2A尾不影响S100A1功能。

pXoX在将扩张型心肌病患者的收缩特性恢复至健康个体中所观察到的水平中是最有效的，表明pXoX中的效应物是互补的。

实施例11：重组酶滴定

图28显示了在重组酶滴定实验中用于表达VEGF的数据，其中当转染到具有不同的pXoX三基因表达载体与重组酶之比的SV40 转化的心肌细胞中时进行ELISA分析以检测VEGF表达的持续性。在转染后第3天，SPBc2与填充物组之间在VEGF表达上没有显著差异。在转染后第10、17和24天，当萤光素酶:重组酶之比为1:0.2-1:0.04 时，SPBc2组显示比对照(填充物)组明显更多的VEGF分泌。

图29显示在重组酶滴定实验中用于表达SDF-1α的数据，其中当转染到具有不同的pXoX三基因表达载体与重组酶之比的SV40转化的心肌细胞中时进行ELISA分析以检测SDF-1α表达的持续性。在转染后第3天，SPBc2与填充物组之间的SDF1表达没有显著差异。SDF1蛋白质水平低于转染后第10天和第17天的检测限制。在转染后第24天检测到SDF1蛋白质水平，此时，当萤光素酶：重组酶之比为1∶0.2-1∶0.04时，SPBc2组显示出比对照(填充物)组明显更多的 SDF1分泌。

图30显示了在用和不用重组酶转染的心肌细胞中用于表达 S100A1的数据。在转染后第3天，SPBc2与填充物组之间的S100A1 表达没有显著差异。在转染后第10、17和24天，SPBc2组显示比对照(填充物)组明显更多的S100A1分泌。

实施例12：大鼠中的质粒骨架表达研究

pXoX具有带卡那霉素抗性基因的标准质粒骨架。此外，效应物蛋白的表达由杂合CAG启动子驱动，并利用表15中所述的合成 3’UTR/polyA尾。为了证实该骨架构型随时间的推移维持心脏中基因表达的能力，pXoX中的效应物的ORF用萤光素酶(fLuc)报道基因(pCAG-fLuc)替换，并通过活动物成像评估质粒注射射到心脏后萤光素酶表达的持续时间。使用具有CMV启动子和非表达填充序列 (pCMV-填充物)的类似质粒作为质粒大小和背景fLuc表达的对照。

为了进行该表达研究，将质粒DNA(250μg)注射到12-14周龄雌性Sprague Dawley大鼠的左心室壁(每组n＝5)。随时间的推移监测大鼠并使用活体内成像系统(IVIS)测量萤光素酶表达水平。注射pCAG-fLuc的大鼠中的萤光素酶活性最初比注射对照pCMV-fLuc构建体的大鼠中所见到的背景水平高2个对数级。如用瞬时表达质粒所预期的那样，在给药后28天表达水平逐渐下降。这些发现表明该质粒骨架能够启动蛋白质表达，其在第28天左右逐渐降低至接近对照水平。数据未示出。

实施例13：递送方法-通过猪的冠状窦逆行输注

通过冠状窦进行逆行输注是所提议的向心脏递送非病毒质粒构建体(例如但不限于pXoX)的方法。该递送方法的技术复杂性阻碍了其在诸如小鼠和大鼠的小动物模型中的评估。因此，提议将猪用于药理学和毒理学/生物分布研究。为了测试该方法的可行性，在作为测试受试者的猪中进行了前期研究。使用标准的介入技术，将球囊导管 (CookRegentec)置于导丝上方进入冠状窦。使球囊膨胀，确认闭塞，并随后输注萤光素酶报道分子质粒。用1g/mL的质粒浓度测试三种不同剂量(40mg、80mg和120mg)。研究了总共9只动物，为每个剂量提供3次重复。在每次动物输注中以10mL增量进行直至施用全部用量。以10mL/min进行输注，并且输注后球囊闭塞10分钟。

质粒输注后大约24小时，将心大静脉进行导管插入并将D-萤光素基底溶液(大约0.125mg/ml浓度)输注到冠状静脉系统。然后使动物安乐死并移出心脏。随后使用Lumina成像系统通过CCD 照相机计数评估移出心脏的生物发光。在注射分离的心脏后24小时显示萤光素酶辐射强度和分布的生物发光图像描绘于图9中，表明通过心脏细胞的质粒介导的萤光素酶表达在给药后24小时内发生。

在心脏和肺组织切片中研究了质粒介导的萤光素酶表达的进一步生物分布。在猪的120mg处理组中，RT-PCR数据进一步证实只在心脏左心室中具有萤光素酶表达(数据未示出)。在计划处死前无动物死亡。因此，该研究说明非病毒质粒如pXoX的递送是安全的、实用的并导致质粒的受限全身分布。

实施例14：使用超声靶向微泡破坏(UTMD)方法在阿霉素诱导的心肌病中通过pXoX使体内心肌细胞重新生成[64]。大鼠中阿霉素诱导的心肌病是针对充血性心力衰竭(CHF)的成熟模型。超声靶向微泡破坏(UTMD)方法用于将pXoX(其表达生物活性SDF1α、S100A1和VEGF)递送至处于阿霉素诱导的心肌病下的大鼠心脏。将已确认阿霉素诱导的心肌病的总共16只大鼠分成2组，每组8只。每组用2种质粒：(1)pStuffer，或(2)pXoX中的一种处理。pStuffer 是具有与pXoX相同的骨架构型的阴性对照质粒，其中用不表达、类似大小的“填充物”序列替换开放阅读框(ORF)。在1,2-二棕榈酰基 -sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱2.5mg/ml、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺0.5mg/ml和10％甘油与2mg溶于50ml的脂质体3000 (Invitrogen，Carlsbad，CA)中的质粒混合的溶液中制备含有质粒的脂质稳定的微泡。将0.5ml这种磷脂-质粒溶液的等分试样置于1.5ml 澄清小瓶中；剩余的顶部空间填充全氟丙烷气体(Air Products,Inc， Allentown，PA)。每个小瓶在4℃下温育30min，并随后通过牙科混汞器(VialmixTM、Bristol-Myers Squibb Medical ImagingN.Billerica、 MA)机械振荡30s。缩短率、LV后壁厚度和室间隔舒张末期以及收缩末期(IVSd)的超声心动图测量是通过在左室视图的2D胸骨旁短轴下的M型模式中用12MHz宽带换能器(S12probe、Philips Ultrasound、 Bothell、WA)获取的数字图像而进行的。

超声心动图测量心脏结构和功能的结果证实UTMD-pXoX基因疗法恢复了缩短率指数、LV后壁直径和IVSd，图31A、图31B和图 31C。数值以平均值±SEM表示。**P<0.001对于pStuffer。结果显示了超声心动图测量证实在单次UTMD-pXoX治疗后逆转已确认的 ADM心肌病，由此表明通过施用表达生物活性SDF1α、S100A1和 VEGF的(具有连接体的三基因)pXoX构建体，在充血性心力衰竭模型中成功体内治疗心肌病。

PHH3(磷酸-组蛋白H3(Ser10))有丝分裂标记信号在接受 pStuffer或pXoX质粒的大鼠的心脏细胞中的核定位的结果显示在图 32中，并证实了心肌细胞再生。PHH3有丝分裂标记确认使用 UTMD-pXoX患有确定的心力衰竭的成年大鼠心肌细胞的增殖。ISL-1 (早期心脏祖细胞的标志物)的负面结果证实了祖细胞不参与相同大鼠中的再生，图33。确认心肌细胞再生的ISL-1负面结果确实是 UTMD-pXoX基因疗法的后果。

这些结果表明施用表达生物活性SDF1α、S100A1和VEGF的 pXoX构建体可用于充血性心力衰竭模型中的心肌细胞再生和心肌病成功治疗。结果还表明，超声靶向微泡破坏(UTMD)是施用本文所述的载体和基因构建体的成功方法，例如包括用于治疗心脏病和其他病理的多基因构建体如pXoX。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

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序列表

<110> 英特拉克森公司

<120> 用于治疗心脏病况和其他病理的从单个载体表达多种生物活性多肽的组合物和方法

<130> INX00339WO2

<140> PCT/US2016/061668

<141> 2016-11-11

<150> 62/254,139

<151> 2015-11-11

<160> 127

<210> 1

<211> 5350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 1

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa 2280

gttggcagga gacgttgagt ccaaccctgg gcccatgaat gccaaggtcg ttgtggtgct 2340

tgtacttgtg ctgactgctc tgtgtctgag cgacggaaaa ccagtctccc tcagctacag 2400

gtgcccatgc cgattcttcg aatctcatgt ggcccgggcc aatgtgaagc acttgaaaat 2460

cctgaataca cccaactgcg cgttgcagat cgtggcccgc ctgaaaaata ataataggca 2520

ggtatgtatc gatccaaagc ttaagtggat ccaggagtat ctggaaaagg ctctcaataa 2580

ataaatcgat tacgctcctc tactctttga gacatcactg gcctataata aatgggttaa 2640

tttatgtaac aaaattgcct tggcttgtta actttattag acattctgat gtttgcattg 2700

tgtaaatact gttgtattgg aaaagcgtgc caagatggat tattgtaatt cagtgtcttt 2760

tttagtagcg tcacgtgcca aacactgtta gtcacagagg gcatgagaca gcctgtgctg 2820

gaacagctca gttcataggg ctatggagat ggggagaaag gggcgcttct gtcagagaca 2880

agctgtggtc tgggaaggcc ttagcactaa aagcaccaca atgagaagca accgccagaa 2940

gcagggcccg caggcctttg ttccagctgc aaagagaaag gaaaaagtgg ggaataagag 3000

ttggggctgc ggagggggtg gggagcattg tgcaggttcc gtacttgaac agaaagcagg 3060

gaccaacaca aggaaggctc gagctggcgg aataggttcc aatctgtcgc ggccgcatta 3120

ccctgttatc cctaatctcg tttaactatg actctcttaa ggtagccaaa ttccggaact 3180

ataaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 3240

taaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcg cttccgcttc 3300

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 3360

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 3420

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 3480

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 3540

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 3600

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 3660

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 3720

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 3780

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 3840

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 3900

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 3960

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 4020

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 4080

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 4140

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 4200

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacat gcgcatctga cgctcagtgg aacgaaaact 4260

cacgttaagg gattttggtc atgcctcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga 4320

tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc 4380

cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca 4440

cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg 4500

gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg cgcgccttga 4560

gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat 4620

cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt 4680

cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg 4740

atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc acttcgccca 4800

atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc 4860

ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg cagttcattc agggcaccgg 4920

acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg 4980

catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag 5040

cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat cctcattcat 5100

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttagg ctgagcatct 5160

atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa tggcaggcgc ctttttcgtt agatatgtag 5220

taagtatctt aatatacagc tttatctgtt ttttaagata cttactactt ttcttagtgg 5280

aaactattag tggctgttaa ttaagctagt actacccaag atttgacaga atgcatcgtt 5340

tgcattcgaa 5350

<210> 2

<211> 5350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 2

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aaagagccaa gagggcaccg gtgaaacaga 300

ctttgaattt tgaccttctg aagttggcag gagacgttga gtccaaccct gggcccatgg 360

gcagcgaact ggaaaccgcc atggagactt tgataaatgt tttccacgcg catagcggca 420

aagaagggga caagtacaag ctgtcaaaaa aggagctgaa agaactgctg cagaccgaat 480

tgagcggctt cctggacgct cagaaagatg tcgatgccgt cgacaaagtg atgaaagagc 540

ttgacgagaa cggtgacggt gaagtcgatt ttcaggaata tgtggtgctg gtggccgccc 600

ttactgtagc atgcaacaat ttcttttggg aaaattcata aatcgattac gctcctctac 660

tctttgagac atcactggcc tataataaat gggttaattt atgtaacaaa attgccttgg 720

cttgttaact ttattagaca ttctgatgtt tgcattgtgt aaatactgtt gtattggaaa 780

agcgtgccaa gatggattat tgtaattcag tgtctttttt agtagcgtca cgtgccaaac 840

actgttagtc acagagggca tgagacagcc tgtgctggaa cagctcagtt catagggcta 900

tggagatggg gagaaagggg cgcttctgtc agagacaagc tgtggtctgg gaaggcctta 960

gcactaaaag caccacaatg agaagcaacc gccagaagca gggcccgcag gcctttgttc 1020

cagctgcaaa gagaaaggaa aaagtgggga ataagagttg gggctgcgga gggggtgggg 1080

agcattgtgc aggttccgta cttgaacaga aagcagggac caacacaagg aaggctcgag 1140

ctggcggaat aggttccaat ctgtcgcggc cgcattaccc tgttatccct aatctcgttt 1200

aactatgact ctcttaaggt agccaaattc cggaactata aattgcgttg cgctcactgc 1260

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcataa atgaatcggc caacgcgcgg 1320

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgcgctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1380

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1440

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1500

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1560

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1620

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1680

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 1740

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 1800

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 1860

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 1920

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 1980

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2040

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2100

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 2160

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 2220

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

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a 5641

<210> 5

<211> 5332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

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<212> DNA

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<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 6

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

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<212> DNA

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<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 8

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<211> 5359

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 9

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<210> 10

<211> 5359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 11

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 12

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

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<210> 13

<211> 5665

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 13

ctagcatgaa ttttctgctc tcttgggtgc actggtcact ggcactgctg ctgtatctgc 60

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ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 1740

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 14

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

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cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3660

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<210> 15

<211> 5656

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 15

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<211> 5638

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 16

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

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<211> 5638

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 17

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

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gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

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tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

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ctgccaccca attgagacgt tggtagacat ttttcaggaa tatccagacg agattgagta 2160

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gcatcttttc gtccaggatc cgcagacttg taaatgttca tgcaagaata ccgattctag 2460

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<210> 18

<211> 5665

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 18

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

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gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

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<210> 19

<211> 5356

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 19

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

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cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

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gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

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<210> 20

<211> 5356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 20

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<211> 5647

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 21

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg cccatgccga ttcttcgaat 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

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<210> 23

<211> 5338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 23

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<210> 24

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<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

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<210> 25

<211> 5629

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 25

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<211> 5629

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

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ctagcgccac catgaatttt ctgctctctt gggtgcactg gtcactggca ctgctgctgt 60

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<210> 27

<211> 5365

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 27

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

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<210> 28

<211> 5365

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 28

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

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ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 4800

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ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt 5220

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<210> 29

<211> 5656

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 29

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg cccatgccga ttcttcgaat 120

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<210> 30

<211> 5656

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 30

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<211> 5671

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 31

ctagcgccac catgaatttt ctgctctctt gggtgcactg gtcactggca ctgctgctgt 60

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cattcgaata actataacgg tcctaaggta gcgacgtacg aaccgttggg cgcgcctggg 3780

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acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 3900

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ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc cggagcgccg gcggctgtcg 5160

aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact 5220

tcctttgtcc caaatctggc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc 5280

gggcgcgggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg 5340

cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc tccagcctcg gggctgccgc agggggacgg 5400

ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc 5460

tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt 5520

gctggttgtt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattc cctgcaggaa attgagcccg 5580

cagcctcccg cttcgctctc tgctcctcct gttcgacagt cagccgcatc ttcttttgcg 5640

tcgccagccg agccacatcg ctcagacacc g 5671

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：Furinlink1连接体"

<400> 32

Arg Ala Lys Arg

1

<210> 33

<211> 12

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：Furinlink1连接体"

<400> 33

cgtgcaaagc gt 12

<210> 34

<211> 28

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：fmdv连接体"

<400> 34

Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu

1 5 10 15

Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 35

<211> 84

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：fmdv连接体"

<400> 35

agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa gttggcagga 60

gacgttgagt ccaaccctgg gccc 84

<210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：p2a连接体"

<400> 36

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 37

<211> 57

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：p2a连接体"

<400> 37

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 38

<211> 22

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：GSG-p2a连接体"

<400> 38

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 39

<211> 66

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：GSG-p2a连接体"

<400> 39

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 40

<211> 31

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：fp2a连接体"

<400> 40

Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe

1 5 10 15

Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25 30

<210> 41

<211> 93

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 来源

<223> /注释=“未知的描述：fp2a连接体"

<400> 41

cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 60

caggctggag acgtggagga gaaccctgga cct 93

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 42

Ala Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 43

Gly Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 44

Val Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 45

Ile Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 46

Met Pro Val Lys Gln

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 47

Ala Pro Ile Lys Gln

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 48

Gly Pro Ile Lys Gln

1 5

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 49

Val Pro Ile Lys Gln

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

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Ile Pro Ile Lys Gln

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 51

Met Pro Ile Lys Gln

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 52

Ala Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 53

Gly Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 54

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 54

Val Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 55

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 55

Ile Pro Ala Lys Gln

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 56

Met Pro Ala Lys Gln

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 57

Ala Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 58

Gly Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 59

Val Pro Val Arg Gln

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 60

Ile Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 61

Met Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 62

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 62

Ala Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 63

Gly Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 64

Val Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 65

Ile Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 66

Met Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 67

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 67

Ala Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 68

Gly Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 69

Val Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 70

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 70

Ile Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 71

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 71

Met Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 72

Ala Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 73

Gly Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 74

Val Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 75

Ile Pro Val Lys Asn

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 76

Met Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 77

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 77

Ala Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 78

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 78

Gly Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 79

Val Pro Ile Lys Asn

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 80

Ile Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 81

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 81

Met Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 82

Ala Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 83

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 83

Gly Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 84

Val Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 85

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 85

Ile Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 86

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 86

Met Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 87

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 87

Ala Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 88

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 88

Gly Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 89

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 89

Val Pro Val Arg Asn

1 5

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 90

Ile Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 91

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 91

Met Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 92

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 92

Ala Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 93

Gly Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 94

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 94

Val Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 95

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 95

Ile Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 96

Met Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 97

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 97

Ala Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 98

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 98

Gly Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 99

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 99

Val Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 100

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 100

Ile Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 101

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 101

Met Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 102

<211> 89

<212> PRT

<213> 智人

<400> 102

Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys

20 25 30

Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys

35 40 45

Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys

50 55 60

Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln

65 70 75 80

Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys

85

<210> 103

<211> 317

<212> DNA

<213> 智人

<400> 103

atgaatgcca aggtcgttgt ggtgcttgta cttgtgctga ctgctctgtg tctgagcgac 60

ggaaaaccag tctccctcag ctacaggtgc ccatgccgat tcttcgaatc tcatgtggcc 120

cgggccaatg tgaagcactt gaaaatcctg tcttcgaatc tcatgtggcc cgggccaatg 180

tgaagcactt gaaaatcctg aatacaccca actgcgcgtt gcagatcgtg gcccgcctga 240

aaaataataa taggcaggta tgtatcgatc caaagcttaa gtggatccag gagtatctgg 300

aaaaggctct caataaa 317

<210> 104

<211> 94

<212> PRT

<213> 智人

<400> 104

Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val Phe

1 5 10 15

His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Lys Lys

20 25 30

Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala

35 40 45

Gln Lys Asp Val Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys Glu Leu Asp Glu

50 55 60

Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Val Val Leu Val Ala

65 70 75 80

Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe Trp Glu Asn Ser

85 90

<210> 105

<211> 282

<212> DNA

<213> 智人

<400> 105

atgggcagcg aactggaaac cgccatggag actttgataa atgttttcca cgcgcatagc 60

ggcaaagaag gggacaagta caagctgtca aaaaaggagc tgaaagaact gctgcagacc 120

gaattgagcg gcttcctgga cgctcagaaa gatgtcgatg ccgtcgacaa agtgatgaaa 180

gagcttgacg agaacggtga cggtgaagtc gattttcagg aatatgtggt gctggtggcc 240

gcccttactg tagcatgcaa caatttcttt tgggaaaatt ca 282

<210> 106

<211> 191

<212> PRT

<213> 智人

<400> 106

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly

130 135 140

Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr

145 150 155 160

Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln

165 170 175

Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

180 185 190

<210> 107

<211> 573

<212> DNA

<213> 智人

<400> 107

atgaattttc tgctctcttg ggtgcactgg tcactggcac tgctgctgta tctgcaccat 60

gcaaaatggt cccaagcagc tcccatggca gagggaggtg gacagaatca tcatgaggtt 120

gtcaaattta tggatgtcta ccagcggagc tactgccacc caattgagac gttggtagac 180

atttttcagg aatatccaga cgagattgag tacattttca agcctagctg tgtgcccttg 240

atgcgatgcg gtggctgttg caatgatgag ggactcgagt gtgtccccac cgaggaaagc 300

aatataacca tgcaaatcat gcgaatcaaa ccccaccagg gccagcatat cggcgagatg 360

tctttcttgc aacataacaa atgcgagtgt cggccaaaga aggacagggc tcgccaggaa 420

aatccctgtg gtccttgttc agagcgcagg aagcatcttt tcgtccagga tccgcagact 480

tgtaaatgtt catgcaagaa taccgattct aggtgtaagg cgaggcaact cgagcttaac 540

gagagaacct gtaggtgtga caaacctaga aga 573

<210> 108

<211> 6034

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 108

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 540

ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 600

gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 660

ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 720

cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 780

cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct 840

gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta 900

attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg 960

ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt 1020

gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg 1080

gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc 1140

cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg 1200

ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc 1260

gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc 1320

tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc 1380

gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag 1440

gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc 1500

ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg 1560

ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg 1620

cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg 1680

gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct 1740

ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg 1800

tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ccctgcagga aattgagccc 1860

gcagcctccc gcttcgctct ctgctcctcc tgttcgacag tcagccgcat cttcttttgc 1920

gtcgccagcc gagccacatc gctcagacac cgctagcatg ggcagcgaac tggaaaccgc 1980

catggagact ttgataaatg ttttccacgc gcatagcggc aaagaagggg acaagtacaa 2040

gctgtcaaaa aaggagctga aagaactgct gcagaccgaa ttgagcggct tcctggacgc 2100

tcagaaagat gtcgatgccg tcgacaaagt gatgaaagag cttgacgaga acggtgacgg 2160

tgaagtcgat tttcaggaat atgtggtgct ggtggccgcc cttactgtag catgcaacaa 2220

tttcttttgg gaaaattcac gtgcaaagcg tgcaccggtg aaacagggaa gcggagctac 2280

taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatgaatgc 2340

caaggtcgtt gtggtgcttg tacttgtgct gactgctctg tgtctgagcg acggaaaacc 2400

agtctccctc agctacaggt gcccatgccg attcttcgaa tctcatgtgg cccgggccaa 2460

tgtgaagcac ttgaaaatcc tgaatacacc caactgcgcg ttgcagatcg tggcccgcct 2520

gaaaaataat aataggcagg tatgtataga tccaaagctt aagtggatcc aggagtatct 2580

ggaaaaggct ctcaataaac gtgcaaagcg tgcaccggtg aaacagggaa gcggagctac 2640

taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatgaattt 2700

tctgctctct tgggtgcact ggtcactggc actgctgctg tatctgcacc atgcaaaatg 2760

gtcccaagca gctcccatgg cagagggagg tggacagaat catcatgagg ttgtcaaatt 2820

tatggatgtc taccagcgga gctactgcca cccaattgag acgttggtag acatttttca 2880

ggaatatcca gacgagattg agtacatttt caagcctagc tgtgtgccct tgatgcgatg 2940

cggtggctgt tgcaatgatg agggactcga gtgtgtcccc accgaggaaa gcaatataac 3000

catgcaaatc atgcgaatca aaccccacca gggccagcat atcggcgaga tgtctttctt 3060

gcaacataac aaatgcgagt gtcggccaaa gaaggacagg gctcgccagg aaaatccctg 3120

tggtccttgt tcagagcgca ggaagcatct tttcgtccag gatccgcaga cttgtaaatg 3180

ttcatgcaag aataccgatt ctaggtgtaa ggcgaggcaa ctcgagctta acgagagaac 3240

ctgtaggtgt gacaaaccta gaagataaat cgattacgct cctctactct ttgagacatc 3300

actggcctat aataaatggg ttaatttatg taacaaaatt gccttggctt gttaacttta 3360

ttagacattc tgatgtttgc attgtgtaaa tactgttgta ttggaaaagc gtgccaagat 3420

ggattattgt aattcagtgt cttttttagt agcgtcacgt gccaaacact gttagtcaca 3480

gagggcatga gacagcctgt gctggaacag ctcagttcat agggctatgg agatggggag 3540

aaaggggcgc ttctgtcaga gacaagctgt ggtctgggaa ggccttagca ctaaaagcac 3600

cacaatgaga agcaaccgcc agaagcaggg cccgcaggcc tttgttccag ctgcaaagag 3660

aaaggaaaaa gtggggaata agagttgggg ctgcggaggg ggtggggagc attgtgcagg 3720

ttccgtactt gaacagaaag cagggaccaa cacaaggaag gctcgagctg gcggaatagg 3780

ttccaatctg tcgcggccgc attaccctgt tatccctaat ctcgtttaac tatgactctc 3840

ttaaggtagc caaattccgg aactataaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3900

gggaaacctg tcgtgccagc tgcataaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3960

gcgtattggg cgcgcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 4020

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 4080

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 4140

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 4200

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 4260

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 4320

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 4380

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 4440

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 4500

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 4560

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 4620

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 4680

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 4740

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 4800

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 4860

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acatgcgcat 4920

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcct cagaagaact 4980

cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 5040

cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 5100

ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 5160

ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct 5220

cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 5280

gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct 5340

cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 5400

gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 5460

gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 5520

cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 5580

cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 5640

gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 5700

agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 5760

tcatgcgaaa cgatcctcat tcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 5820

tgaatgtatt taggctgagc atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcag 5880

gcgccttttt cgttagatat gtagtaagta tcttaatata cagctttatc tgttttttaa 5940

gatacttact acttttctta gtggaaacta ttagtggctg ttaattaagc tagtactacc 6000

caagatttga cagaatgcat cgtttgcatt cgaa 6034

<210> 109

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /注释="该序列可包含0-15个"Gly Ser"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 109

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20 25 30

<210> 110

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /注释="该序列可包含0-15个"Ser Gly"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 110

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

20 25 30

<210> 111

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /注释="该序列可包含0-15个"Gly Ser Gly"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 111

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

35 40 45

<210> 112

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /注释="该序列可包含0-15个"Ser Gly Ser"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 112

Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser

35 40 45

<210> 113

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /注释="该序列可包含1-15个"Gly Ser"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 113

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20 25 30

<210> 114

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /注释="该序列可包含1-15个"Ser Gly"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 114

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

20 25 30

<210> 115

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /注释="该序列可包含1-15个"Gly Ser Gly"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 115

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

35 40 45

<210> 116

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /注释="该序列可包含1-15个"Ser Gly Ser"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 116

Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser

35 40 45

<210> 117

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> /替换="Ile"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> /注释="该序列中给出的变异残基相对于变异位置注释中的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> 任意氨基酸

<400> 117

Asp Val Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 118

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 118

Ser Gly Ser Gly

1

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 119

Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly

1 5

<210> 120

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 120

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 任意氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> 任意氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任意氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 任意氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<223> /注释="该序列可包含2-5个"Xaa Pro"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 121

Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro

1 5 10

<210> 122

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(26)

<223> /注释="该序列可包含2-5个"Glu Ala Ala Ala Lys"重复单元，其中一些位置可能不存在"

<400> 122

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

20 25

<210> 123

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：2A尾"

<400> 123

Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe

1 5 10 15

Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

20 25 30

<210> 124

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：具有2A尾的S100A1"

<400> 124

Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val Phe

1 5 10 15

His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Lys Lys

20 25 30

Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala

35 40 45

Gln Lys Asp Val Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys Glu Leu Asp Glu

50 55 60

Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Val Val Leu Val Ala

65 70 75 80

Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe Trp Glu Asn Ser Arg Ala

85 90 95

Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu

100 105 110

Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

115 120

<210> 125

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"

<400> 125

atgggcagcg aactggaaac cgccatggag actttgataa atgttttcca cgcgcatagc 60

ggcaaagaag gggacaagta caagctgtca aaaaaggagc tgaaagaact gctgcagacc 120

gaattgagcg gcttcctgga cgctcagaaa gatgtcgatg ccgtcgacaa agtgatgaaa 180

gagcttgacg agaacggtga cggtgaagtc gattttcagg aatatgtggt gctggtggcc 240

gcccttactg tagcatgcaa caatttcttt tgggaaaatt cacgtgcaaa gcgtgcaccg 300

gtgaaacagg gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag 360

gagaaccctg ga 372

<210> 126

<211> 165

<212> PRT

<213> 智人

<400> 126

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65 70 75 80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe

115 120 125

Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser

130 135 140

Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys

145 150 155 160

Asp Lys Pro Arg Arg

165

<210> 127

<211> 495

<212> DNA

<213> 智人

<400> 127

gctcccatgg cagagggagg tggacagaat catcatgagg ttgtcaaatt tatggatgtc 60

taccagcgga gctactgcca cccaattgag acgttggtag acatttttca ggaatatcca 120

gacgagattg agtacatttt caagcctagc tgtgtgccct tgatgcgatg cggtggctgt 180

tgcaatgatg agggactcga gtgtgtcccc accgaggaaa gcaatataac catgcaaatc 240

atgcgaatca aaccccacca gggccagcat atcggcgaga tgtctttctt gcaacataac 300

aaatgcgagt gtcggccaaa gaaggacagg gctcgccagg aaaatccctg tggtccttgt 360

tcagagcgca ggaagcatct tttcgtccag gatccgcaga cttgtaaatg ttcatgcaag 420

aataccgatt ctaggtgtaa ggcgaggcaa ctcgagctta acgagagaac ctgtaggtgt 480

gacaaaccta gaaga 495

Claims

1.一种多核苷酸，其编码包含S100钙结合蛋白(S100)多肽和第二功能性多肽的多肽构建体，其中所述第二功能性多肽为细胞因子、趋化因子、血管生成多肽及其任何功能性衍生物中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述S100多肽为S100A1，其片段或变体。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的多核苷酸，其中所述第二功能性多肽为血管生成多肽。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述血管生成多肽为血管内皮生长因子(VEGF)多肽。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206，其片段和变体。

6.根据权利要求4至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF165的序列具有至少70％同一性的序列。

7.根据权利要求4至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF191的序列具有至少70％同一性的序列。

8.根据权利要求1至2中任一项所述的多核苷酸，其中所述第二功能性多肽为趋化因子。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述趋化因子为基质细胞衍生因子1(SDF)多肽。

10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。

11.根据权利要求9至10中任一项所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述S100多肽通过第一多肽连接体连接至所述第二多肽。

13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述连接体为可切割的连接体。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽构建体进一步包含第三功能性多肽。

15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽为细胞因子、趋化因子、血管生成多肽及其任何功能性衍生物中的至少一种。

16.根据权利要求14至15中任一项所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽为血管生成多肽。

17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述血管生成多肽为VEGF多肽。

18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206及其片段或变体。

19.根据权利要求17至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF165的序列具有至少70％同一性的序列。

20.根据权利要求17至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF191的序列具有至少70％同一性的序列。

21.根据权利要求14至15中任一项所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽为趋化因子。

22.根据权利要求21所述的多核苷酸，其中所述趋化因子为SDF多肽。

23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。

24.根据权利要求22至23中任一项所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。

25.根据权利要求14至24中任一项所述的多核苷酸，其中所述第三功能性多肽通过任选可切割的第二多肽连接体连接至所述S100多肽和所述第二功能性多肽中的至少一个。

26.根据权利要求12至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一和第二多肽连接体独立地选自由fp2a、p2a、GSG-p2a和fmdv组成的列表。

27.由权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。

28.一种细胞，其包含权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸。

29.一种治疗心脏病况的方法，其包括使细胞与治疗有效量的权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸相接触。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞为心肌细胞。

31.一种治疗受试者中的心肌病的方法，其包括向所述受试者提供治疗有效量的包含权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸的组合物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。

33.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，其中所述受试者用至少一种附加疗法进行治疗。

34.一种药物组合物，其包含权利要求1至26中任一项所述的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的多肽以及药学上可接受的赋形剂。

35.一种多核苷酸，其编码包含至少第一多肽和第二多肽的至少一种多肽构建体，其中：

i.所述第一多肽为血管生成多肽；

ii.所述第二多肽为趋化因子或其变体或片段。

36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述血管生成多肽为VEGF多肽，该VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206、其片段和变体。

37.根据权利要求36所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF 165的序列具有至少70％同一性的序列。

38.根据权利要求36所述的多核苷酸，其中所述VEGF多肽包含与VEGF 191的序列具有至少70％同一性的序列。

39.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述第二多肽为SDF多肽。

40.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。

41.根据权利要求39至40中任一项所述的多核苷酸，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。

42.一种改善受试者中的血管发生的方法，其包括向所述受试者提供治疗有效量的组合物，该组合物包含权利要求35至41中任一项所述的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的多肽。

43.一种表达载体，其包含与选自SDF1多肽、S100A1多肽、VEGF多肽及其片段和变体的至少两种多肽可操作地连接的至少一种启动子。

44.根据权利要求43所述的表达载体，其中所述至少两种多肽通过连接体连接。

45.根据权利要求43至44中任一项所述的表达载体，其中所述至少一种启动子选自CAG启动子、CMV启动子、SV40启动子、腺病毒启动子、β肌动蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、EF1a启动子、肌球蛋白轻链启动子、肌球蛋白重链启动子和NCX1启动子。

46.根据权利要求43至45中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体为心脏表达载体。

47.一种包含至少第一多肽和第二多肽的多肽构建体，其中：

i.所述第一多肽为钙结合蛋白或其变体或片段；

ii.所述第二多肽为血管生成多肽、趋化因子或其变体或片段。

48.一种包含至少第一多肽、第二多肽和第三多肽的多肽构建体，其中：

i.所述第一多肽为血管生成多肽或其变体或片段；

ii.所述第二多肽为趋化因子或其变体或片段；并且

iii.所述第三多肽为钙结合蛋白或其变体或片段。

49.根据权利要求47至48中任一项所述的构建体，其包含S100A1、其变体或片段。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的构建体，其包含SDF1、其变体或片段。

51.根据权利要求47至50中任一项所述的构建体，其包含VEGF、其变体或片段。

52.一种复合物，其包含与至少一种受体复合的权利要求47至51中任一项所述的构建体。

53.一种药物组合物，其包含权利要求47至51中任一项所述的构建体和药学上可接受的赋形剂。

54.一种治疗受试者中的心肌病的方法，其包括向所述受试者提供治疗有效量的包含权利要求47至51中任一项所述的构建体的组合物。

55.一种方法，其包括：使至少一个心脏细胞与编码包含至少第一多肽和第二多肽的多肽构建体的多核苷酸相接触，其中：所述第一多肽为血管生成多肽变体或其片段；并且所述第二多肽为趋化因子、钙结合蛋白或其变体或片段中的至少一种。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述血管生成多肽变体或其片段为VEGF多肽，该VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206、其片段和变体。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF 165的序列具有至少70％同一性的序列。

58.根据权利要求56所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF 191的序列具有至少70％同一性的序列。

59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述第二多肽为趋化因子。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述趋化因子为基质细胞衍生因子1(SDF)多肽。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。

62.根据权利要求60至61中任一项所述的方法，其中所述SDF多肽包含与SDF1的序列具有至少70％同一性的序列。

63.根据权利要求55至62中任一项所述的方法，其中所述编码多肽的多核苷酸是离体引入的。

64.根据权利要求55至62中任一项所述的方法，其中所述编码多肽的多核苷酸是体内引入的。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述体内引入选自经皮冠状动脉导管插入、冠状静脉阻塞、心脏再循环、顺行冠状动脉输注、逆行灌注、直接注射、超声靶向微泡破坏及其任何组合。

66.根据权利要求55至65中任一项所述的方法，其进一步包括施用至少一种附加疗法。

67.一种改善受试者中的血管发生的方法，其包括：向所述受试者施用一定量的编码包含SDF多肽和S100多肽中的至少一种以及VEGF多肽的构建体的多核苷酸。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述VEGF多肽选自VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189、VEGF191、VEGF206、其片段和变体。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF 165的序列具有至少70％同一性的序列。

70.根据权利要求68所述的方法，其中所述VEGF多肽包含与VEGF 191的序列具有至少70％同一性的序列。

71.根据权利要求67至70中任一项所述的方法，其中所述SDF多肽选自SDF1、SDF-1α、SDF-1β、其片段和变体。

72.根据权利要求67至71中任一项所述的方法，其中所述S100多肽为S100A1、其片段或变体。

73.根据权利要求67至72中任一项所述的方法，其中所述受试者患有心肌病。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述心肌病选自扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、致心律失常性右室心肌病(ARVC)及其任何组合。

75.一种治疗或预防受试者中的心血管病况的方法，其包括：向所述受试者施用一定量的包含S100A多肽和第二功能性多肽的构建体，其中所述第二功能性多肽为细胞因子、趋化因子和血管生成多肽中的至少一种。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述施用是预防性进行的。

77.根据权利要求75所述的方法，其中所述施用是治疗性进行的。

78.根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种附加治疗。

79.根据权利要求75至78中任一项所述的方法，其中所述第二功能性多肽为VEGF、SDF或其组合。

80.一种基因治疗方法，其包括向受试者施用至少一种非病毒载体，该非病毒载体包含：

a.至少两种编码功能性蛋白质或其部分的基因；

b.至少一种启动子；和

c.至少一个工程化重组位点；

其中所述至少一种启动子驱动所述至少两种基因的表达。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一种启动子是组成型的。

82.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一种启动子是组织特异性的。

83.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一种启动子是诱导型的。

84.根据权利要求82所述的方法，其中所述至少一种组织特异性启动子为肌球蛋白轻链(MLC)启动子。

85.根据权利要求83所述的方法，其中所述诱导型启动子为基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮激素受体的基因开关。

86.根据权利要求83或85所述的方法，其中所述诱导型启动子利用配体对所述至少两种基因的表达进行剂量调节的控制。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述配体选自蜕皮类固醇、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N,N’-二酰基肼、噁二唑啉、二苯甲酰基烷基氰基肼、N-烷基-N,N’-二芳酰基肼、N-酰基-N-烷基羰基肼、N-芳基-N-烷基-N’-芳基肼、氨基酮、3,5-二叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(R)羟基胆甾醇、24(S)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1,1-二膦酸酯、保幼激素III、RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)及其任何组合。

88.根据权利要求80至87中任一项所述的方法，其中所述连接体为可切割的连接体。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述连接体包含序列APVKQ(SEQ ID NO:42)、GPVKQ(SEQ ID NO:43)、VPVKQ(SEQ ID NO:44)、IPVKQ(SEQ ID NO:45)、MPVKQ(SEQ ID NO:46)、APIKQ(SEQ ID NO:47)、GPIKQ(SEQ ID NO:48)、VPIKQ(SEQ ID NO:49)、IPIKQ(SEQ IDNO:50)、MPIKQ(SEQ ID NO:51)、APAKQ(SEQ ID NO:52)、GPAKQ(SEQ ID NO:53)、VPAKQ(SEQID NO:54)、IPAKQ(SEQ ID NO:55)、MPAKQ(SEQ ID NO:56)、APVRQ(SEQ ID NO:57)、GPVRQ(SEQ ID NO:58)、VPVRQ(SEQ ID NO:59)、IPVRQ(SEQ ID NO:60)、MPVRQ(SEQ ID NO:61)、APIRQ(SEQ ID NO:62)、GPIRQ(SEQ ID NO:63)、VPIRQ(SEQ ID NO:64)、IPIRQ(SEQ ID NO:65)、MPIRQ(SEQ ID NO:66)、APARQ(SEQ ID NO:67)、GPARQ(SEQ ID NO:68)、VPARQ(SEQ IDNO:69)、IPARQ(SEQ ID NO:70)、MPARQ(SEQ ID NO:71)、APVKN(SEQ ID NO:72)、GPVKN(SEQID NO:73)、VPVKN(SEQ ID NO:74)、IPVKN(SEQ ID NO:75)、MPVKN(SEQ ID NO:76)、APIKN(SEQ ID NO:77)、GPIKN(SEQ ID NO:78)、VPIKN(SEQ ID NO:79)、IPIKN(SEQ ID NO:80)、MPIKN(SEQ ID NO:81)、APAKN(SEQ ID NO:82)、GPAKN(SEQ ID NO:83)、VPAKN(SEQ ID NO:84)、IPAKN(SEQ ID NO:85)、MPAKN(SEQ ID NO:86)、APVRN(SEQ ID NO:87)、GPVRN(SEQ IDNO:88)、VPVRN(SEQ ID NO:89)、IPVRN(SEQ ID NO:90)、MPVRN(SEQ ID NO:91)、APIRN(SEQID NO:92)、GPIRN(SEQ ID NO:93)、VPIRN(SEQ ID NO:94)、IPIRN(SEQ ID NO:95)、MPIRN(SEQ ID NO:96)、APARN(SEQ ID NO:97)、GPARN(SEQ ID NO:98)、VPARN(SEQ ID NO:99)、IPARN(SEQ ID NO:100)或MPARN(SEQ ID NO:101)。

90.根据权利要求80至89中任一项所述的方法，其中所述至少一个重组位点为噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)。

91.根据权利要求80至90中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种次级载体。

92.根据权利要求91所述的方法，其中所述至少一种次级载体为mRNA。

93.根据权利要求91所述的方法，其中所述至少一种次级载体为质粒。

94.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述至少一种次级载体包含至少一种重组酶。

95.根据权利要求92所述的方法，其中所述重组酶选自单核细胞增生李斯特菌噬菌体重组酶、酿脓链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶、耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶和SPBc2重组酶。

96.根据权利要求80至95中任一项所述的方法，其中所述至少两种基因通过所述重组酶整合到所述受试者的基因组中。

97.根据权利要求80至96中任一项所述的方法，其中所述载体是优质生产规范(GMP)兼容的。

98.一种多肽，其包含与选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40的序列具有至少60％同一性的序列。

99.根据权利要求98所述的多肽，其中所述多肽包含与选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40的序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

100.一种多肽，其包含与选自SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:106的序列具有至少60％同一性的序列。

101.根据权利要求100所述的多肽，其中所述多肽包含与选自SEQ ID NO:102、SEQ IDNO:104和SEQ ID NO:106的序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

102.一种多肽，其包含与由SEQ ID NO.108的核酸序列编码的多肽序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。

103.一种多核苷酸，其编码包含由第一连接体连接的第一功能性多肽和第二功能性多肽的多肽构建体，所述第一连接体包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列。

104.根据权利要求103所述的多核苷酸，其中所述连接体序列包含与序列APVKQ(SEQID NO:42)具有80％或100％同一性的氨基酸序列。

105.一种多核苷酸，其编码包含由第一连接体连接的第一功能性多肽和第二功能性多肽的多肽构建体，所述第一连接体包含与选自下组的序列具有至少60％、80％或100％同一性的序列：APVKQ、GPVKQ、VPVKQ、IPVKQ、MPVKQ、APIKQ、GPIKQ、VPIKQ、IPIKQ、MPIKQ、APAKQ、GPAKQ、VPAKQ、IPAKQ、MPAKQ、APVRQ、GPVRQ、VPVRQ、IPVRQ、MPVRQ、APIRQ、GPIRQ、VPIRQ、IPIRQ、MPIRQ、APARQ、GPARQ、VPARQ、IPARQ、MPARQ、APVKN、GPVKN、VPVKN、IPVKN、MPVKN、APIKN、GPIKN、VPIKN、IPIKN、MPIKN、APAKN、GPAKN、VPAKN、IPAKN、MPAKN、APVRN、GPVRN、VPVRN、IPVRN、MPVRN、APIRN、GPIRN、VPIRN、IPIRN、MPIRN、APARN、GPARN、VPARN、IPARN和MPARN，或其任何组合。

106.根据权利要求103至105中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一连接体为刚性连接体、柔性连接体、可切割连接体、自切割连接体、肽连接体、通过核糖体跳跃可切割的连接体或其任何组合。

107.根据权利要求106所述的多核苷酸，其中所述第一连接体是通过蛋白水解可切割的。

108.根据权利要求107所述的多核苷酸，其中所述第一连接体包含1-10个切割位点。

109.根据权利要求107至108中任一项所述的多核苷酸，其中所述切割是还原反应、酶促反应或两者的组合。

110.根据权利要求109所述的多核苷酸，其中所述切割包含酶促反应。

111.根据权利要求110所述的多核苷酸，其中所述包含酶促反应的切割通过蛋白酶进行。

112.根据权利要求111所述的多核苷酸，其中所述蛋白酶选自弗林蛋白酶和组织蛋白酶B。

113.根据权利要求112所述的多核苷酸，其中所述蛋白酶为弗林蛋白酶。

114.根据权利要求113所述的多核苷酸，其中所述弗林蛋白酶切割RAKR。

115.根据权利要求103至114中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一功能性多肽不同于所述第二功能性多肽。

116.根据权利要求103至115中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一和第二功能性多肽中的至少一个为蛋白质、激素、糖蛋白，或其衍生物或片段。

117.根据权利要求103至116中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含选自(GS)n、(SG)n、(GSG)n和(SGS)n的至少一个序列，其中n为1至15的数字。

118.根据权利要求103至116中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽进一步包含第二连接体。

119.根据权利要求118所述的多核苷酸，其中所述第二连接体将第三功能性多肽连接至所述第一功能性多肽或所述第二功能性多肽。

120.根据权利要求119所述的多核苷酸，其中将第三功能性多肽连接至所述第一功能性多肽或所述第二功能性多肽的所述第二连接体为自切割连接体。

121.根据权利要求120所述的多核苷酸，其中所述自切割连接体包含2A序列。

122.根据权利要求121所述的多核苷酸，其中所述2A序列为F2A序列或P2A序列。

123.根据权利要求103至122中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含Kozak序列。

124.根据权利要求103至123中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含由所述多核苷酸编码的多肽。

125.由权利要求103至124中任一项所述的多核苷酸编码的多肽，或其衍生物或变体。

126.一种药物组合物，其包含权利要求103至124中任一项所述的多核苷酸和至少一种药学上可接受的赋形剂。

127.一种治疗方法，其包括向有需要的受试者施用包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列的多核酸。

128.根据权利要求127所述的方法，其中所述序列包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)的65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或最多100％同一性。

129.根据权利要求126至127中任一项所述的方法，其中所述多核酸编码功能性多肽。

130.根据权利要求129所述的方法，其中所述功能性多肽在体内切割。

131.根据权利要求129至130中任一项所述的方法，其中所述体内切割的功能性多肽产生至少两种功能性蛋白质。

132.根据权利要求129至130中任一项所述的方法，其中所述体内切割的功能性多肽产生至少三种功能性蛋白质。

133.根据权利要求130至131中任一项所述的方法，其中所述至少两种或至少三种功能性蛋白质是治疗所述有需要的受试者的联合疗法的一部分。

134.根据权利要求124至125中任一项所述的方法，其中所述施用是预防性的、治愈性的、常规性的或其组合。

135.根据权利要求127至134中任一项所述的方法，其中所述施用是常规性的。

136.根据权利要求135所述的方法，其中所述施用包括每小时一次施用、每天一次施用、每周一次施用、每月一次施用、每年一次施用或持续施用。

137.根据权利要求127至136中任一项所述的方法，其中所述受试者患有急性疾病、慢性疾病、终末期疾病或其组合。

138.根据权利要求124至128中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症、心脏病、糖尿病、神经病症、眼部病症、病毒病症或其任何组合。

139.根据权利要求124至130中任一项所述的方法，其进一步包括至少一次次级治疗。

140.一种制备多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含由第一连接体连接的第一功能性多肽和第二功能性多肽，所述第一连接体包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列。

141.一种从载体表达基因的方法，所述载体包含与序列APVKQ(SEQ ID NO:42)具有至少60％同一性的序列，并且如通过质谱分析所测定的，所述基因的切割效率至少为50％。

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述载体包含用于表达两种生物活性多肽、三种生物活性多肽或超过三种生物活性多肽的基因。

143.根据权利要求142所述的方法，其中所述载体包含用于表达三种生物活性多肽的基因。

144.根据权利要求141至143中任一项所述的方法，其中所述基因在切割后是功能性的。

145.根据权利要求141至144中任一项所述的方法，其中所述基因的所述切割效率包括如通过质谱分析所测定的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或最多100％。

146.一种多核苷酸，其编码包含弗林蛋白酶多肽和2A多肽的多肽构建体，其中所述弗林蛋白酶多肽和所述2A多肽通过包含至少三种疏水性氨基酸的多肽连接体连接。

147.根据权利要求146所述的多核苷酸，其中所述至少三种疏水性氨基酸中的至少一种选自由甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)组成的列表。

148.根据权利要求147所述的多核苷酸，其中所述多肽连接体包含序列APVKQ、GPVKQ、VPVKQ、IPVKQ、MPVKQ、APIKQ、GPIKQ、VPIKQ、IPIKQ、MPIKQ、APAKQ、GPAKQ、VPAKQ、IPAKQ、MPAKQ、APVRQ、GPVRQ、VPVRQ、IPVRQ、MPVRQ、APIRQ、GPIRQ、VPIRQ、IPIRQ、MPIRQ、APARQ、GPARQ、VPARQ、IPARQ、MPARQ、APVKN、GPVKN、VPVKN、IPVKN、MPVKN、APIKN、GPIKN、VPIKN、IPIKN、MPIKN、APAKN、GPAKN、VPAKN、IPAKN、MPAKN、APVRN、GPVRN、VPVRN、IPVRN、MPVRN、APIRN、GPIRN、VPIRN、IPIRN、MPIRN、APARN、GPARN、VPARN、IPARN或MPARN。

149.一种获得多肽构建体的改善表达的方法，其包括：

提供编码包含第一功能性多肽和第二功能性多肽的所述多肽构建体的多核苷酸，其中所述第一功能性多肽和第二功能性多肽通过多肽连接体连接，该多肽连接体包含与序列APVKQ具有至少60％同一性的序列；以及

在宿主细胞中表达所述多核苷酸，其中与不具有包含与序列APVKQ具有至少60％同一性的序列的多肽连接体的相应多肽构建体相比，所述表达导致所述多肽构建体的改善表达。

150.根据权利要求149所述的方法，其中与不具有包含与序列APVKQ具有至少60％同一性的序列的多肽连接体的相应多肽构建体相比，所述改善表达为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

151.一种组合物，其包含：

至少一种质粒微泡复合物，其中所述微泡包含脂质、气体和包含权利要求1-27和35-41中任一项所述的多核苷酸的质粒。

152.权利要求151的组合物，其中所述脂质形成包封所述气体和质粒的壳。

153.根据权利要求151-152中任一项所述的组合物，其中所述气体为全氟化碳气体。

154.根据权利要求153所述的组合物，其中所述气体为全氟丙烷。

155.根据权利要求151-154中任一项所述的组合物，其中所述微泡复合物包含1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺甘油中的至少一种。

156.一种方法，其包括：

向受试者施用权利要求151-155中任一项所述的组合物；

使所述受试者接触足以导致至少一种微泡在预定的组织或器官处超声破坏的超声能量。

157.根据权利要求156所述的方法，其中所述至少一种微泡在所述预定的组织或器官处的破裂将所述质粒递送至所述组织或器官中。

158.根据权利要求157所述的方法，其中所述组织或器官为器官，并且所述器官为心脏。

159.一种治疗受试者中的心脏疾病或病症的方法，其包括：

向所述受试者施用一定量的包含至少一种微泡的组合物，所述微泡包含脂质、气体和包含权利要求1-27和35-41中任一项所述的多核苷酸的质粒；

使所述受试者接触足以导致所述至少一种微泡的超声破裂的超声能量并将所述质粒递送至所述受试者的心脏。

160.根据权利要求159所述的方法，其中所述脂质形成包封所述气体和质粒的壳。

161.根据权利要求159-160中任一项所述的方法，其中所述气体为全氟化碳气体。

162.根据权利要求161所述的方法，其中所述气体为全氟丙烷。

163.根据权利要求159-162中任一项所述的方法，其中所述微泡包含1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺甘油中的至少一种。

164.根据权利要求159-163中任一项所述的方法，其中所述心脏疾病或病症包括充血性心力衰竭、心肌病、心律失常、心包疾病、主动脉疾病、马方综合征和冠状动脉疾病中的至少一种。