CN102027123B

CN102027123B - 使用人细胞表达系统重组产生可靠的人蛋白质

Info

Publication number: CN102027123B
Application number: CN200980117839.0A
Authority: CN
Inventors: 陈日东; 郑淳硕; 冯辉
Original assignee: Humanzyme Ltd
Current assignee: HUMANZYME INC.
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2029-03-12
Also published as: CA2718495A1; AU2009223115B2; US20150099295A1; EP2271762B1; EP2271762A2; CN102027123A; US8236527B2; JP2011517554A; JP5634272B2; WO2009114702A2; US20110053221A1; AU2009223115A1; US20130095062A1; WO2009114702A3; CA2718495C

Abstract

本发明涉及用于从新的人细胞系的稳定培养物中有效产生可靠的重组人蛋白质的新的表达盒和载体、由其产生的可靠重组蛋白和针对这些可靠的重组蛋白而产生的抗体。

Description

使用人细胞表达系统重组产生可靠的人蛋白质

交叉引用

本国际PCT申请要求获得2009年1月27日提交的美国临时申请顺序号61/147,627和2008年3月14日提交的61/036,667的优先权，两个申请通过引用结合到本文中。

发明领域

本发明涉及用于重组产生可靠的(authentic)人蛋白质的人表达系统。

发明概述

本发明的方面包括用于由新的人细胞系的稳定培养物有效产生可靠的重组人蛋白质的新的表达盒和载体。本发明还包括通过这些新方法以及由这些新的组分产生的可靠的重组蛋白，以及针对这些可靠的重组蛋白产生的抗体。本发明的重组产生的可靠的人蛋白质还可用于基因疗法，本文公开的载体也可用于基因疗法以在体内或体外/离体表达人蛋白质从而治疗特定疾病。

要了解的是，本发明的载体和细胞系可同时使用，也可彼此独立使用。也就是说，可将本发明的新的载体导入本发明的新的细胞系(例如HZ-293TS(见下文))和表达特定编码的人蛋白质的细胞(例如细胞因子)内。然而实际上，任何载体同样均可在本发明的细胞系中表达。同样，本文公开的任何载体可在不同的人细胞系中表达，不仅仅只在本文所述的细胞系中表达。

本发明的一个方面是促进可靠的人蛋白质在人细胞中表达的表达盒，所述表达盒包括5’-3’方向的下列序列：

(1)巨细胞病毒(CMV)增强子元件；

(2)人启动子序列，其中启动子选自(i)人β-肌动蛋白启动子，(ii)人血清白蛋白启动子，和(iii)人血纤蛋白原启动子；

(3)人珠蛋白基因内含子；和

(4)信号肽，例如免疫球蛋白超家族8信号肽或α-血纤蛋白原信号肽。

编码目标人蛋白质或其片段的需要的多核苷酸，有效连接并插入信号肽序列的下游。表达盒还可另包含聚腺苷酸化信号序列和/或终止位点序列，使得需要的多核苷酸有效连接并插入信号肽与聚腺苷酸化/终止信号序列之间。或者，需要的多核苷酸本身便可包含终止信号序列或聚腺苷酸化信号序列以帮助适当的转录终止。

对技术人员而言显然的是，无论这些调节元件如何排列和变换(permutation)，该表达盒的表达将产生融合蛋白，所述融合蛋白包含由与信号肽连接的需要的多核苷酸所编码的蛋白质或多肽。因此，可按照本发明产生信号肽/人蛋白质，然后将信号肽从融合蛋白上切割下来，留下完整的可靠的人蛋白质。在这个方面，人细胞机器在蛋白质合成期间识别切割位点。例如，在蛋白质合成期间，细胞的高尔基体与信号肽相互作用，此时信号肽与融合蛋白分离。因此，当蛋白质分泌到胞外间隙时，信号肽就已经分离。

因此，本发明的表达盒可包含下列有效连接的序列：(1)CMV即时早期增强子序列；(2)人β-肌动蛋白启动子；(3)珠蛋白基因内含子；(4)α-血纤蛋白原信号肽；(5)需要的多核苷酸；和(6)聚腺苷酸化/终止序列。技术人员应该知道，这些元件的其它变换可以不同，并可用其它序列交换。例如，如上所述，可在表达盒中采用人血清白蛋白启动子或人血纤蛋白原启动子替换人β-肌动蛋白启动子来构建表达盒。因此，本发明的表达盒可包含下列有效连接的序列：(1)CMV即时早期增强子序列；(2)人β-肌动蛋白启动子；(3)珠蛋白基因内含子；(4)免疫球蛋白超家族8信号肽；(5)需要的多核苷酸；和(6)聚腺苷酸化/终止序列。

因此，本发明的一个方面是包含需要的多核苷酸的表达载体，所述需要的多核苷酸与CMV即时早期增强子、β-肌动蛋白启动子序列、人珠蛋白基因内含子序列和免疫球蛋白超家族8信号肽有效连接，其中需要的多核苷酸有效连接信号肽并位于其下游。

本发明的另一个方面是包含需要的多核苷酸的表达载体，所述需要的多核苷酸与CMV即时早期增强子、β-肌动蛋白启动子序列、人珠蛋白基因内含子序列和α-血纤蛋白原信号肽有效连接，其中需要的多核苷酸有效连接信号肽并位于其下游。

在这一方面，本发明在表达盒中不仅限于使用人的遗传元件。例如，启动子和基因内含子序列以及信号肽可得自其它物种的基因组。例如，序列可来源于任何哺乳动物、爬行动物、鸟、鱼、昆虫、细菌、真菌、酵母、病毒或两栖动物。因此，在本发明的一个实施方案中，表达盒包含人类以外物种的启动子、内含子和信号肽的核苷酸序列，例如得自小鼠、猴、猿、大鼠、猫、狗、兔、沙鼠(gerbil)、仓鼠、豚鼠、猪、牛、或绵羊的启动子、内含子和信号肽的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，信号序列编码有助于将转录的RNA分子产物转运到细胞高尔基体或胞外间隙的序列。

本发明的另一个方面是用于在细胞中产生蛋白质的方法，所述方法包括将本发明的表达载体导入细胞中，其中所述细胞可得自与载体盒序列相同的物种，其中载体盒的基因序列在细胞内转录和翻译以产生其编码的蛋白质。在一个实施方案中，将表达载体导入细胞中，所述细胞来自与从中获得启动子、内含子和信号肽序列的物种相同的物种。在一个实施方案中，细胞和载体盒的序列两者来自任何哺乳动物、爬行动物、鸟、鱼、昆虫、细菌、真菌、酵母、病毒或两栖动物。因此，在本发明的一个实施方案中，细胞和表达盒的序列两者都来自选自人、小鼠、猴、猿、大鼠、猫、狗、兔、沙鼠、仓鼠、豚鼠、猪、牛和绵羊的物种。在一个实施方案中，细胞为人细胞。在另一个实施方案中，人细胞为人肾细胞。在一个实施方案中，人肾细胞为HEK293细胞。本发明的表达盒的序列包括有效连接信号肽下游且因此有效连接增强子、启动子和内含子的目标核酸序列或需要的多核苷酸，使得目标核酸序列或需要的多核苷酸进行表达。需要的多核苷酸的实例包括但不限于下列序列(1)-(13)以及表5中所列多核苷酸。因此，由本发明需要的多核苷酸编码的人细胞因子的实例包括但不限于激活素A、激活素B、激活素A/2xINHbA、激活素B/2xINHbB、AMH/MIS、Artemin、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/成骨蛋白、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、δ1、EGF、红细胞生成素(EPO)、酸性FGF、碱性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3配体、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/肌生成抑制蛋白(myostatin)、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGFI、IGFII、IGFIIv1、IGFIIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2、IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、抑制素A/INHa和INHbA、抑制素B/INHa和INHbB、抑制素C/INHa和INHbC、抑制素E/INHa和INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、小鼠CSF、小鼠SCF、NODAL、头蛋白、NT3(神经营养蛋白3)、制癌蛋白M、PDGFα、PDGFβ、外周营养因子、SCF、SDF1α、SHH、促生长素、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B和Wnt9A/14。本发明需要的多核苷酸可编码EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、头蛋白、SCF、促生长素、TGFβ1、TNFα或VEGF-165。

本发明方法的一个方面包括从细胞中分离所产生的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法还包括产生抗分离蛋白质的抗体。因此，本发明的另一个方面是针对蛋白质表位产生的抗体，所述蛋白质是通过本文公开的任一种本发明的方法产生的。在一个实施方案中，抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明的另一个方面是细胞，其表达本文公开的任何表达载体的盒。在一个实施方案中，细胞来自与所述盒的序列相同的物种。在一个实施方案中，细胞为人细胞。

本发明的另一个方面是用于在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括在个体的细胞中表达本文公开的任何表达载体的盒，其中基因序列的表达产生在个体中诱导免疫应答的蛋白质或RNA产物，并且其中个体的物种与盒序列的物种相同。

本发明的另一个方面是包含盒的表达载体，所述盒包含(A)人启动子序列，(B)人信号序列，(C)人基因序列，和(D)人聚腺苷酸化信号序列，其中全部序列有效连接。

在一个实施方案中，示例性CMV增强子元件的序列以SEQIDNO：27表示，其是人CMV即时早期(IE)增强子。示例性人启动子序列的序列以SEQIDNO：28表示，其是人β-肌动蛋白启动子序列。示例性人珠蛋白基因内含子的序列以SEQIDNO：29表示。信号肽的实例包括以SEQIDNO：30表示的人血纤蛋白原α链信号肽和以SEQIDNO：31表示的人免疫球蛋白超家族成员8前体信号。

包括彼此有效连接的这些元件的表达盒的实例以SEQIDNO：32和33表示。

可将任何需要的多核苷酸或目标核酸插入信号肽的下游，使得它与信号肽和表达盒的调节元件例如CMVIE增强子、人启动子和人珠蛋白内含子序列有效连接。本发明的表达盒还可包含珠蛋白基因内含子与信号肽之间的切割位点序列，使得转录后加工所产生的蛋白质包含与信号肽在其5’端连接的需要的蛋白质。信号肽可以是将蛋白质转运到胞外间隙的信号肽。本发明需要的多核苷酸包括编码细胞因子的多核苷酸。因此，本发明的一个方面是分离的重组人细胞因子，其是可靠的糖基化的，并且在结构上与体内内源性表达自人细胞的天然的相同细胞因子相当。

在本发明的一个实施方案中，重组人细胞因子与天然的细胞因子相当，因为重组人细胞因子包含以人特有的N-乙酰神经氨酸终止的糖链。在一个实施方案中，糖链与细胞因子的表面共价连接。在本发明的另一个实施方案中，糖链包含N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和半乳糖部分中的至少一种。在另一个实施方案中，可靠糖基化的细胞因子只包含来自人细胞的糖链，没有来源于任何非人类细胞的糖链部分。

在一个实施方案中，由本发明需要的多核苷酸编码的重组人细胞因子选自激活素A、激活素B、激活素A/2xINHbA、激活素B/2xINHbB、AMH/MIS、Artemin、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/成骨蛋白、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、δ1、EGF、红细胞生成素(EPO)、酸性FGF、碱性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3配体、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/肌生成抑制蛋白、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGFI、IGFII、IGFIIv1、IGFIIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2、IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、抑制素A/INHa和INHbA、抑制素B/INHa和INHbB、抑制素C/INHa和INHbC、抑制素E/INHa和INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、小鼠CSF、小鼠SCF、NODAL、头蛋白、NT3(神经营养蛋白3)、制癌蛋白M、PDGFα、PDGFβ、外周营养因子、SCF、SDF1α、SHH、促生长素、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B和Wnt9A/14。另参见表5中的“克隆的细胞因子基因表”。由本发明需要的多核苷酸编码的重组人细胞因子还选自表5列举的细胞因子。在另一个实施方案中，人重组细胞因子选自EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、头蛋白、SCF、促生长素、TGFβ1、TNFα和VEGF-165。

本发明的另一个方面是用于产生可靠的人细胞因子的重组方法，所述方法包括(1)用本文公开的表达载体中的任一种转染能够在无血清培养基中存活的人细胞，所述表达载体包含(i)编码人细胞因子序列的需要的多核苷酸和(ii)抗生素抗性基因；(2)(i)选出在暴露于含有抗生素的培养基中存活的转染细胞，所述抗生素基因对此抗生素具有抗性，(ii)将暴露于抗生素仍存活的这些细胞转移到具有低血清浓度的液体培养物中，(3)在一段时间内将血清浓度降至0％；和(4)将在无血清培养基液体培养物中生长的细胞中表达的人细胞因子分离出来，其中分离的人细胞因子是有生物活性的。在本发明的另一个方面，人细胞可用包含需要的多核苷酸(其包含细胞因子序列)的一种载体和包含抗生素抗性基因表达盒的另一种截然不同的载体共转染。因此，本发明包括使用一种载体(含有细胞因子序列和抗生素抗性基因序列两者)或使用两种载体(一种含有细胞因子基因序列，另一种含有抗生素抗性基因序列)，用于转染本发明的人细胞。

在一个实施方案中，需要的多核苷酸在具有编码人细胞因子的序列的读框中包含编码信号肽分泌序列的序列。在另一个实施方案中，需要的多核苷酸与启动子和终止子有效连接。

在一个实施方案中，无血清培养基包含一种或多种抗生素。在一个实施方案中，抗生素为新霉素(G418)、潮霉素、零霉素(zeocin)或杀稻瘟菌素。在另一个实施方案中，将血清浓度降至0％的步骤发生在一天到几周的时间内。在一个实施方案中，液体培养物的体积为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50升，或培养物超过50升，或在其中间的任何整数。

在另一个实施方案中，分离人细胞因子的步骤包括对等分的无血清液体细胞培养物进行离心，将人细胞因子从其分泌进入的上清液中俘获。在一个实施方案中，分离人细胞因子的步骤还包括使从离心步骤沉淀的人细胞返回相同或不同的无血清液体细胞培养物容器中。

在一个实施方案中，从中分离出分泌的人细胞因子的上清液只含有约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％的污染物质或不是分泌的人细胞因子的蛋白质。

在一个实施方案中，包含分泌的人细胞因子的上清液样品的纯度为至少约99％、纯度至少约98％、纯度至少约97％、纯度至少约96％、纯度至少约95％、纯度至少约94％、纯度至少约93％、纯度至少约92％、纯度至少约91％、纯度至少约90％、纯度至少约89％、纯度至少约88％、纯度至少约87％、纯度至少约86％、纯度至少约85％、纯度至少约84％、纯度至少约83％、纯度至少约82％、纯度至少约81％或纯度至少约80％。

在一个实施方案中，细胞培养物的上清液基本由表达和分泌的人细胞因子蛋白组成。

在另一个实施方案中，细胞培养物的上清液除表达和分泌的人细胞因子蛋白以外，不含其它有生物活性的蛋白质。

另一个方面是由重组方法产生的分离重组人细胞因子。在一个实施方案中，分离的重组人细胞因子选自激活素A、激活素B、激活素A/2xINHbA、激活素B/2xINHbB、AMH/MIS、Artemin、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/成骨蛋白、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、δ1、EGF、红细胞生成素(EPO)、酸性FGF、碱性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3配体、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/肌生成抑制蛋白、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN1-β1、IGFI、IGFII、IGFIIv1、IGFIIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2、IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、抑制素A/INHa和INHbA、抑制素B/INHa和INHbB、抑制素C/INHa和INHbC、抑制素E/INHa和INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、小鼠CSF、小鼠SCF、NODAL、头蛋白、NT3(神经营养蛋白3)、制癌蛋白M、PDGFα、PDGFβ、外周营养因子、SCF、SDF1α、SHH、促生长素、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B和Wnt9A/14。另参见表5中的“克隆的细胞因子基因表”。

在一个实施方案中，本文公开的方法产生的人细胞因子蛋白无一包含非人类糖链。也就是说，本发明的人细胞因子蛋白仅仅包含糖基化糖链，其通过仅在人细胞可得到的酶和底物与其蛋白质表面共价连接。

本发明的另一个方面是针对本文公开的任一种分离的重组人细胞因子产生的抗体。在一个实施方案中，抗体为单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体为多克隆抗体。

本发明的另一个方面为试剂盒，该试剂盒包含本文公开的任何分离的重组人细胞因子或抗体的至少一种。

因此，为了详细说明上述实施方案，本发明的一个方面为包含盒的表达载体，所述盒包含下列有效连接的表达元件：

(A)巨细胞病毒增强子元件序列；

(B)人启动子序列，选自(i)人肌动蛋白启动子序列，(ii)人血清白蛋白启动子序列，和(iii)人血纤蛋白原启动子序列；

(C)人珠蛋白基因内含子序列；和

(D)人信号肽序列。

在一个实施方案中，表达载体还包含位于信号肽序列下游并且与权利要求1的元件(A)、(B)、(C)和(D)有效连接的需要的多核苷酸。在另一个实施方案中，(i)需要的多核苷酸与位于表达载体上人信号肽序列下游的终止信号序列有效连接，或者(ii)需要的多核苷酸本身包含终止信号序列。

在一个实施方案中，人启动子序列为功能性人β-肌动蛋白启动子序列。在另一个实施方案中，CMV增强子元件为CMV即时早期增强子序列。在另一个实施方案中，信号肽序列为(A)包含人免疫球蛋白A基因的内含子1和接近内含子序列3’端的切割识别序列的序列，(B)α-血纤蛋白原信号肽，或(C)免疫球蛋白超家族8信号肽。

在一个实施方案中，需要的多核苷酸编码细胞因子。在另一个实施方案中，编码的细胞因子选自激活素A、激活素B、激活素A/2xINHbA、激活素B/2xINHbB、AMH/MIS、Artemin、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/成骨蛋白、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、δ1、EGF、红细胞生成素(EPO)、酸性FGF、碱性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3配体、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/肌生成抑制蛋白、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGFI、IGFII、IGFIIv1、IGFIIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2、IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、抑制素A/INHa和INHbA、抑制素B/INHa和INHbB、抑制素C/INHa和INHbC、抑制素E/INHa和INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、小鼠CSF、小鼠SCF、NODAL、头蛋白、NT3(神经营养蛋白3)、制癌蛋白M、PDGFα、PDGFβ、外周营养因子、SCF、SDF1α、SHH、促生长素、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B和Wnt9A/14。另参见表5中的“克隆的细胞因子基因表”。在另一个实施方案中，编码的细胞因子选自EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、头蛋白、SCF、促生长素、TGFβ1、TNFα和VEGF-165。

在一个实施方案中，本发明的表达载体(“pHZhag”)包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，和(iii)人β-珠蛋白内含子。

在一个实施方案中，本发明的表达载体(“pHZA”)包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMV启动子，和(ii)人血纤蛋白原亚基A信号肽。

在一个实施方案中，本发明的表达载体(“pHZI”)包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMV启动子，和(ii)人Ig超家族8信号肽。

在一个实施方案中，本发明的表达载体(“pHZhagA”)包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，和(iv)人血纤蛋白原亚基A信号肽；

在一个实施方案中，本发明的表达载体(“pHZhagI”)包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，和(iv)人Ig超家族8信号肽。

在一个实施方案中，本发明的表达载体(“pHZhag-TGFβ1”)包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子和(iv)TGFβ1。

在一个实施方案中，本发明的表达载体(“phZhagI-TGFβ1”)包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，(iv)人Ig超家族8信号肽，和(v)TGFβ1。

在任何的这类表达载体中，可将需要的多核苷酸掺入特定表达载体的信号肽的下游并与之有效连接，其中需要的多核苷酸编码蛋白质，例如人蛋白质。

因此，本发明的另一个方面是用于产生可靠的人蛋白质的重组方法，所述方法包括将本发明的任一种表达载体导入人细胞，其中需要的多核苷酸编码人蛋白质，其中需要的多核苷酸在人细胞中的表达产生可靠的人蛋白质。

在一个实施方案中，可靠的人蛋白质具有与天然形式的相同人蛋白质近似的大小、结构、分子量、糖基化形式和转录后修饰。技术人员已知各种测定法和测试法，例如用于表征蛋白质的色谱分析、凝胶分析、遗传分析、蛋白质分析、结晶学分析和组成分析；一种简单易行的方法蛋白质凝胶电泳法，其中本发明重组产生的蛋白质与天然的内源形式的相同蛋白质彼此并排以及与蛋白质标记物泳道一起电泳。

在一个实施方案中，人细胞为HZ-293TS，其是来源于HEK293T并按照本发明适用的人肾胚细胞系，保藏在ATCC，ATCC生物保藏材料保藏号为____，保藏日为____。

在一个实施方案中，所述重组方法还包括从人细胞中分离出可靠的人蛋白质。

本发明的另一个方面是重组产生的可靠的人蛋白质，所述蛋白质由表达本发明的任一种表达载体中需要的多核苷酸的人细胞产生，其中需要的多核苷酸编码人蛋白质，且其中需要的多核苷酸的表达产生可靠的人蛋白质。在一个实施方案中，需要的多核苷酸编码细胞因子。在另一个实施方案中，编码的细胞因子选自激活素A、激活素B、激活素A/2xINHbA、激活素B/2xINHbB、AMH/MIS、Artemin、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/成骨蛋白、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、δ1、EGF、红细胞生成素(EPO)、酸性FGF、碱性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3配体、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/肌生成抑制蛋白、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGFI、IGFII、IGFIIv1、IGFIIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2、IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、抑制素A/INHa和INHbA、抑制素B/INHa和INHbB、抑制素C/INHa和INHbC、抑制素E/INHa和INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、小鼠CSF、小鼠SCF、NODAL、头蛋白、NT3(神经营养蛋白3)、制癌蛋白M、PDGFα、PDGFβ、外周营养因子、SCF、SDF1α、SHH、促生长素、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B和Wnt9A/14。另参见表5中的“克隆的细胞因子基因表”。在另一个实施方案中，编码的细胞因子选自EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、头蛋白、SCF、促生长素、TGFβ1、TNFα和VEGF-165。

在一个实施方案中，重组产生的可靠的人蛋白质产生自HZ-293TS人细胞系，其保藏在ATCC，ATCC生物保藏材料保藏号为____，保藏日为____。

在一个实施方案中，糖基化形式的可靠的人蛋白质与内源形式的天然人蛋白质类似。在进一步的实施方案中，可靠的人蛋白质的大小、结构和分子量与内源形式的天然人蛋白质的大小和分子量类似。在一个实施方案中，可靠的人蛋白质为TGFβ。在另一个实施方案中，需要的多核苷酸编码头蛋白，其中需要的多核苷酸的表达在细胞中产生二硫键键合的头蛋白二聚体。

本发明的另一个方面是针对通过本文所述重组方法产生的任一种可靠的人蛋白质的表位产生的抗体。在一个实施方案中，抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体为针对G-CSF产生的单克隆抗体。

本发明的另一个方面是称为HZ-293TS(适应于在无血清培养基上增殖的人肾胚细胞系)的稳定的人细胞系，保藏在ATCC，ATCC生物保藏材料保藏号为____，保藏日为____。在本发明的一个实施方案中，HZ-293TS细胞系的细胞存活期比其它HEK293细胞类型的长。也就是说，与其它HEK293细胞类型相比，HZ-293TS细胞保持活力达3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天，或14天以上。

本发明的另一个方面是表达本文公开的任何表达载体的任何人细胞。在一个实施方案中，人细胞为HZ-293TS，保藏在ATCC，ATCC生物保藏材料保藏号为____，保藏日为____。

本发明的另一个方面是用于治疗与细胞生长、细胞增殖、细胞分化或炎症有关的疾病的方法，所述方法包括给予患有与细胞生长、增殖、分化或炎症有关的疾病的个体(A)本文所述或可通过本文所述方法获得的任一种重组产生的可靠的人蛋白质，或(B)本文公开的或可通过本文所述方法获得的任一种抗体。在一个实施方案中，所述方法包括给予患有与炎症或关节炎相关的疾病的个体针对TNFα产生的本发明的抗体。

在一个实施方案中，所述方法包括给予患有与癌症或细胞增殖有关的疾病的个体针对VEGF产生的本发明的抗体。

本发明的一个方面是针对本发明的任一种可靠的人蛋白质的表位产生的抗体作为用于检测样品中人蛋白质的诊断剂的用途。在一个实施方案中，抗体在检测人蛋白质的ELISA测定法中用作诊断剂。

在另一个实施方案中，样品是人组织样品、人细胞样品、人血液样品或人体液样品。在进一步的实施方案中，人蛋白质是细胞因子。

本发明的另一个方面是用于治疗与细胞生长、细胞增殖、细胞分化或炎症有关的疾病的方法，所述方法包括给予患有与细胞生长、增殖、分化或炎症有关的疾病的个体表达编码蛋白质的需要的多核苷酸的载体，其中在个体的细胞中表达的蛋白质有助于治疗疾病。

附图简述

图1：在9天进程中在两种不同体积的人细胞培养物(75ml与30升)之间碱性磷酸酶的蛋白质活性。

图2：SDS-PAGE凝胶显示关于TGFβ1(泳道1)、G-CSF(泳道2)、IL1β(泳道3)和VEGF165(泳道4)表达的在本发明的稳定人细胞系中细胞因子的高表达。

图3：SDS-PAGE凝胶显示对促生长素和GM-CSF的有效无标签纯化。

图4：曲线图表示在本发明的人细胞和非人类细胞(正方形)中表达后进行的GM-CSF稳定性测定。

图5：SDS-PAGE凝胶证实有活性的成熟TGFβ1的表达，众所周知所述TGFβ1难以表达。

图6：曲线图和相应的凝胶表示按照本发明的方法产生的细胞因子的活性和纯度(如SDS凝胶染色所示)。这些实例显示给人印象深刻的以下细胞因子的活性和纯度数据：GM-CSF(图6A)、IL-4(图6B)、促生长素(图6C)、TGF-β1(图6D)、VEGF-165(图6E)、TNF-α(图6F)、M-CSF(图6G)、IL-6(图6H、EPO(图6I)、IL-2(图6J)、SCF(图6K)、头蛋白(图6L)和G-CSF(图6M)。

图7：与得自非人类细胞系统中的细胞因子相比，由本发明的人细胞系统中纯化的细胞因子的SDS-PAGE凝胶分析：(A)FPO、头蛋白；(B)G-CSF、SCF、GM-SCF、促生长素；(C)IL-2、TGF-β1、IL-4和TNFα；和(D)IL6、VEGF165和M-CSF。

图8：与得自非人类细胞系统的细胞因子相比，由本发明的人细胞系统纯化的细胞因子的蛋白质印迹：(A)EPO、头蛋白；(B)GM-CSF、SCF、IL-2、促生长素；(C)IL4、TNFα、IL6和VEGF165。

图9：人和非人类细胞中VEGF165活性的比较。

图10：人和非人类细胞中IL-4活性的比较。

图11：使用(a)pHZsec载体(pHZ-TGFb1)或(b)pHZhag载体(pHZhag-TGFb1)由HEK293T表达TGFβ1的实例。TGFβ1潜在状态相关肽(latency-associatedpeptide，LAP)和成熟TGFβ1用红色箭头表示。用pHZhag-TGFβ1和pHZ-TGFβ1转染的两种细胞系在培养基中在第3天(A)、第4天(B)或第5天(C)用额外的20mM葡萄糖和未添加(D)处理。对每种处理，对第3天(d3)和第10天(d10)的样品进行凝胶电泳。对于LAP和成熟TGFβ1两者，(b)中的pHZhag-TGFβ1的表达比(a)中的pHZ-TGFβ1的表达高2-3倍。

图12：用pHZ-TGFβ1(a)和pHZhag-TGFβ1(c)转染的HFK293T细胞的细胞生长曲线。表示pHZ-TGFβ1(b)和pHZhag-TGFβ1(d)在培养期内的存活率(％)。用pHZhag-TGFβ1转染的HEK293T细胞的存活甚至在第10天(d)仍大于60％，而具有pHZ-TGFβ1的细胞在第8天(b)的存活低于60％。pHZhag-TGFβ1转染细胞的较高存活率还反映在图1(b)中凝胶上少得多的背景蛋白质。

图13：由HEK293T细胞表达的TGFβ1。(a)用另一种启动子或信号肽的表达试验：泳道1：模拟载体(阴性对照)；泳道2：pHZsec载体(CMV启动子和mIgκ信号肽)；泳道3：hag启动子；泳道4：hFbg信号肽；泳道5：hFbgB信号肽；泳道6：hFbgG信号肽；泳道7：hIg8信号肽。具有hFbgB和hFbgG信号肽的未表达。(b)使用模拟载体(阴性对照)、pHZ-TGF-β1(泳道2和3；鼠Igκ信号肽)或pHZA-TGF-β1(泳道4和5；人Fbg信号肽)的TGF-β1表达的比较。

图14：载体示图。

图15：由HEK293T(a)和HZ-293TS(b)表达人FGF8b。由HZ-293TS表达的FGF8b比由HEK293T表达的FGF8b高2-3倍是出乎意料的发现。正如凝胶下的表格中所示，悬液中的细胞其有活力的细胞密度(VCD)达到5-6百万个细胞/毫升。

图16：表达TGF-β1的不同载体的基因表达比较结果。使用不同载体在第5天悬液293T培养物中TGF-b1表达水平的比较。1，阴性对照；2，hCMV启动子与鼠IgK信号肽；3，hag启动子与鼠IgK信号肽；4，hCMV启动子与人血纤蛋白原α链信号肽；5，hCMV启动子与人Ig超家族8信号肽。潜在状态相关肽(LAP)和成熟TGF-b1用箭头表示。所有细胞约为3百万个细胞/ml，存活率90％。泳道1＝对照；泳道2＝pHZ-TGF-β1；泳道3＝pHZhag-TGF-β1(hCMVIE+β-肌动蛋白启动子+β-珠蛋白内含子+TGF-β1)；泳道4＝pHZA-TGF-β1(hCMV启动子+血纤蛋白原亚基A信号肽+TGF-β1)；泳道5＝pHZI-TGF-β1(hCMVIE+β-肌动蛋白启动子+β-珠蛋白内含子+人Ig超家族8信号肽+TGF-β1)。

图17：有效的无标签纯化。得自工程改造的人细胞的纯化重组人(A)GM-CSF、(B)IL-4、(C)IL-6和(D)头蛋白。所有细胞因子以无标签的天然蛋白质表达。开发出有效的纯化方案以产生具有天然异源糖基化(A-D)和二硫键(D)的可靠的细胞因子。

图18：难表达的细胞因子的产生。得自人细胞表达系统的纯化的重组人IL-23(A)和成熟TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3(B)。由于其糖基化和二硫键连接亚基的复杂性(A：IL-23)或者由于由潜在状态相关肽(LAP)复合成为成熟形式的精细的转化过程(B：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，人细胞表达系统有效表达的细胞因子在非人类细胞中非常难于表达或不适当地表达。

图19：重组产生的可靠的人VEGF165同二聚体。由大肠杆菌(E.coli)和工程改造的人293细胞表达VEGF165。由大肠杆菌表达的蛋白质缺乏糖基化，并且是单体和二聚体(分别为19kDa和38kDa)的混合物，而人细胞表达的蛋白质是完全糖基化的45kDa的同二聚体。

图20：更可靠：人EPO与CHOEPO。由人细胞表达的重组EPO在SDS-PAGE上的表观分子量为34kDa，与天然人血清EPO的一样(Skibeli等，2001Blood98：3626)，而CHOEPO的表观分子量为40kDa(A)。与CHOEPO相比，人EPO含有相当高的中性聚糖含量(B)。(C)人EPO和CHOEPO的酸性聚糖结构。人EPO中最丰富的聚糖为四天线复合物类型，而在CHOEPO中的是长的二天线复合物类型。符号为GlcNAc(■)，HexNAc(□)，甘露糖(●)，己糖(○)，岩藻糖(▲)，NeuAc(◆)。

图21：在本发明的人细胞中表达的IL23的效能比从昆虫细胞产生的细胞因子的效能高500倍。在人细胞中表达的可靠IL-23的效能是人Th17细胞诱导的100倍。(A)通过从用10ng/mlPMA激活的小鼠脾细胞剂量依赖性地分泌IL-17来测定IL-23活性。(B)通过在Th17极化的细胞因子存在下，用2mg/ml板结合的抗CD3和1mg/ml可溶性抗CD28刺激的人CD4+T细胞剂量依赖性地分泌IL-17，来测定IL-23活性。

图22：具有在人细胞中表达的可靠细胞因子的Th17细胞的有效分化。在Th17极化细胞因子存在下，包括滴定的IL-23在内，用2μg/mL板结合的抗CD3和1μg/mL可溶性抗CD28刺激由健康供体分离的完整CD4+T细胞。5天后，收获上清液，通过ELISA测定IL-17。参见(A)-(G)。图22(H)表示对由可靠的人TGF-β1引起的人Th17分化的流式细胞术分析。参见下文中的实施例17。

图23：用于树突细胞分化的节省成本和时间的G4方案。(A)DC产生的选定细胞因子和趋化因子的概况表明，在经脂多糖(LPS)成熟前后，在HZG4DC培养基(5ng/mlGM-CSF(可靠的人GM-CSF，在人细胞中表达)和IL-4(可靠的人IL-4，在人细胞中表达)中，未更换培养基)中产生的DC显示与在ECG4DC培养基(50ng/ml大肠杆菌GM-CSF和IL-4，两次更换培养基)中的DC有类似的概况。(B)在HZG4DC培养基中产生和成熟的DC的同种异型MLR似乎比ECG4DC培养基中的DC的甚至更好。

图24：在本发明的人细胞处理的HES细胞中表达的头蛋白呈 OCT3/4阳性。用重组产生的可靠的人头蛋白以10-20pg/ml处理，人胚胎干(hES)细胞连续表达Oct3/4，这是未分化ES细胞的标记物。Oct3/4的蛋白质印迹分析。1，阴性对照；2，阳性对照；3，可靠的头蛋白10pg/ml处理；4，可靠的头蛋白20pg/ml处理。

图25：G-CSF抗体将更准确地监测人体生物学。由本发明的人细胞表达的重组人G-CSF是可靠糖基化的，并且提供可能不存在于从非人类细胞(A)表达的蛋白质的独特表位。在蛋白质印迹中，针对独特表位而产生的单克隆抗体(HZmAb1)只识别人细胞G-CSF(B)，而针对普通表位的另一种抗体(HZmAb2)则识别两者(C)。

图26：新的细胞系(HZ-293TS)。(A)在化学成分确定的无血清培养基中适应悬液培养的新的细胞系HZ-293TS，这是一种293T细胞系。(B)1，293T和2，HZ-293TS的FGF8b表达水平的比较。(C)1，293T和2，HZ-293TS的TGF-β1表达水平的比较。在两种情况下，与来自293T细胞系的相比，来自HZ-293TS细胞系的蛋白质表达水平高出2倍。

图27：信号肽切割示意图。

发明详述

A.总则

细胞因子和本发明

细胞因子是生物用作信号转导分子的一类蛋白质和多肽。大多数细胞因子是糖蛋白，大小不超过30kDa，并与特异性高亲和力细胞表面受体结合。由于它们在免疫系统中的重要作用，因此细胞因子参与多种免疫性疾病、炎症性疾病和感染性疾病，并且广泛用于研究、诊断和治疗。目前，这些蛋白质主要在非人类细胞(例如大肠杆菌)中产生，因此，如下所述，由于缺乏相关糖基化形式而缺乏可靠性(authenticity)。此外，由于在非人类细胞表达系统中存在不当的蛋白水解加工或其它翻译后修饰，因此许多重要的细胞因子并不是市售的。参见表1。在这一方面，可靠意味着按照本发明稳定的人细胞表达方法表达的重组人细胞因子与其在体内人细胞中正常表达的天然的内源对应物(counterpart)一致，并且再现与天然对应物有关的某些特征。也就是说，例如采用本发明稳定的人细胞方法表达的重组人IFNα看起来像天然人IFNα，并且具有与天然人IFNα基本上相同的结构、生物活性、大小、分子量、折叠方式和糖基化形式。因此，通过本发明的方法表达的人蛋白质可视为“可靠的蛋白质”或“可靠的细胞因子”或“可靠的重组”蛋白质等等。其体内对应物可视为天然或内源细胞因子或蛋白质。下文中将更详细地公开通过本发明稳定的人细胞表达系统表达的蛋白质和细胞因子的这类“可靠”特征。相比之下，在本文中由大肠杆菌细胞、或由酵母或真菌细胞、或由昆虫细胞、或由非人类哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)表达的人IFNα蛋白不被视为“可靠的”人IFNα蛋白。因此，本发明的“可靠的”重组产生的蛋白质是与天然形式的蛋白质的一种或多种特征和性质高度相似的蛋白质，例如但不限于相同的结构、生物活性、大小、分子量、蛋白质折叠方式、二聚性质、二硫键结合性质和表面结合的糖基化形式。

(a)细胞因子家族

可根据每个组成成员与其它成员共有的结构相似性，以及根据其相应的一级氨基酸序列的其它相似性，对许多细胞因子进行分类。参见TheCytokineHandbook第一章，第1和2卷，第4版，编著Thomson和Lotze，两份文献通过引用其整体结合到本文中。因此，根据共有的结构特征，各个细胞因子的下列“家族”可如下分类：

(1)IL2/IL-4：代表性成员包括IL-2、IL-4、IL-5GM-CSF。

(2)IL-6/IL12：代表性成员包括IL-6和IL-12。

(3)干扰素-α/β：代表性成员包括IFN-α(多种亚型)、IFN-β、IFN-ω、和IFN-τ。

(4)肿瘤坏死因子：代表性成员包括TNF-α、LT-α(TNF-β)、LT-β、Fas配体、CD40配体、TRAIL、BAFF、APRIL、RANK和LIGHT。

(5)IL-10：代表性成员包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22和IL24。

(6)IL-17：代表性成员包括IL-17和IL-25。

(7)白介素-1：代表性成员包括IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂和IL-18。

(8)TGF-β：代表性成员包括TGF-β、骨形态发生蛋白、抑制素和激活素。

(9)趋化因子：代表性成员包括CXC亚家族(CXCLI-16)、CC亚家族(CCLI-28)、C亚家族(CLI/淋巴细胞趋化肽)和CX3C亚家族(CX3CLI/CXXXC趋化因子)。

大多数细胞因子是简单多肽或糖蛋白。其中一些可形成二聚体，一些是短暂产生的，并通过与特异性高亲和力细胞表面受体结合诱导生物反应和细胞级联。从表型上看，这类反应包括提高或降低细胞增殖速率，改变细胞分化状态，以及改变一些分化型功能物(differentiatedfunction)的表达。因此，例如白介素-1(IL-1)激活T细胞；IL-2刺激抗原活化T和B细胞的增殖；IL-4、IL-5和IL-6刺激B细胞的增殖和分化；干扰素γ(IFNγ)激活巨噬细胞；以及IL-3、IL-7和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激血细胞生成。表2(来源于microvet.arizona.edu/courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html)，通过引用结合到本文中，强调了有关某些细胞因子的来源、靶标和功能的一些额外信息。

细胞因子可作为单体和二聚体存在。就后者而言，细胞因子可作为同二聚体存在，其中相同细胞因子的两个单体通过二硫键连接在一起，或者可作为异二聚体存在，例如在IL12、IL23、IL27和IL35的情况下。在体内天然人细胞中，两种不同的细胞因子基因从基因组中表达，并且在各个细胞因子的适当残基间形成二硫键而连接在一起。在人工重组系统中，这些基因必须在不同的培养物中单独表达，提取和分离所得细胞因子蛋白，然后在进一步的结合步骤中将其连接在一起。然而按照本发明，稳定的人细胞可用两种所需要的细胞因子基因转染，因为在每种情况下，就折叠、表位呈递和糖基化而言，所得到的蛋白质产物是可靠的，两种细胞因子无疑将聚集并通过二硫键键合形成异二聚体。因此，在这种情况下，上清液可含有已形成的异二聚体。

本发明不局限于这些特定的细胞因子或编码这些特定蛋白质的多核苷酸。更确切的是，本发明的一个方面是重组表达细胞因子突变体、同源物、剪接变体或异构体，已知它们是存在的，或者是制备的以确定其对某些细胞因子参数的作用。因此，本发明还包括重组产生可靠的细胞因子变体，其包含不同于天然细胞因子序列的一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或剪接连接点(splicejunction)，或其表示可能与一些疾病或病症有关的突变的细胞因子序列。可对细胞因子DNA序列进行工程改造以包含这类突变并用于研究目的，以确定这种突变或这些突变对细胞因子功能或相关的细胞因子途径下游的作用。因此，可将所有这些蛋白质和突变体和变体设计成将克隆至本发明表达盒的多核苷酸，使得它可在本发明的人表达系统中表达，然后按照本文所述方法使用。

(b)功能和相关疾病，例如哮喘和变态反应

各种细胞因子可具有多功能，这取决于产生细胞因子的细胞和细胞因子所作用的靶细胞，其可作用于远端靶细胞(内分泌)，作用于接近产生细胞因子的细胞的靶细胞(旁分泌)或作用于产生细胞因子的同一细胞(自分泌)。

在上述已鉴定的家族中，有4种主要的细胞因子类别：

(1)干扰素：干扰素α(IFNα)由白细胞的暗黄覆盖层产生，用于治疗多种恶性肿瘤和免疫性疾病。干扰素β(IFNβ)由成纤维细胞产生，目前正在对在多发性硬化的治疗进行评价。干扰素γ(IFNγ)由活化T细胞产生，它是重要的免疫调节分子，特别在变应性疾病中。

(2)集落刺激因子：包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及白介素(IL)-3，它们可刺激多种造血前体(hematopoieticprecursor)，正在对其作为再生障碍性贫血和骨髓移植的疗法进行评价；c-Kit配体(干细胞因子)，最新研究表明它是引起骨髓干细胞分化成其各种前体元件(element)并最终分化成RBC、WBC和巨核细胞(血小板)所必需的细胞因子。

(3)肿瘤坏死因子(TNF)：TNFα由活化巨噬细胞产生，TNFβ由活化T细胞(TH和CTL两者)产生。这些分子似乎参与败血症性休克的发病机制。TNF在临床上可用于治疗人肿瘤。

(4)白介素：由多种细胞类型例如单核细胞和巨噬细胞、T细胞、B细胞和甚至非白细胞产生。参与变态反应的主要白介素为IL-4、IL-5、IL-10和IFNγ。IL-4通过使B细胞分化而引起转变成产生IgE。IFNγ可抑制这种转变并且防止特定IgE的产生。IL-10实际上可抑制IFNγ的活性，允许最初的IL-4在IgE级联中进行下去。因此，变态反应可视为过量IL-4和/或IL-10的变态原特异性产生，缺乏足够的IFNγ产生或者两者兼有。嗜酸性炎症，这种变态反应的主要组成，处于IL-5和TNFα的控制之下。

因此，可以给予患有其中涉及特定细胞因子的这类病症或疾病的个体重组产生的可靠的人细胞因子或针对其产生的抗体，例如，用于治疗多发性硬化的IFNβ。

3.糖基化与本发明

大多数蛋白质进行翻译后修饰，这可改变其理化性质，例如MW、pI、折叠、稳定性和生物活性。糖基化是最普遍的翻译后修饰类型，据估计全部血浆蛋白中80％是糖基化的，已知最重要的人天然干扰素α类的主要组成部分为糖蛋白。

糖蛋白是与蛋白质共价连接的寡糖链或糖链。这类糖链的连接是在体内由特定糖基转移酶进行的，该酶对细胞内的刺激极为敏感。糖蛋白的糖组分影响分子的功能性，因为它们影响蛋白质折叠、寡聚体装配和分泌，以及已表达蛋白质的溶解性和聚集。因此这些多糖糖链具有多种功能，最终赋予蛋白质适当的生物活性和稳定性。此外，在核和胞质中富含某些蛋白质结合聚糖，它们似乎用作调节开关(regulatoryswitch)。

与体内表达的蛋白质共价连接的这类糖链中的两种最普遍的类别为(1)在共有序列“Asn-X-Ser/Thr”内与蛋白质的天冬酰胺残基共价连接的N-聚糖糖链；其具有共同的五糖核心区并分成3种类别，(a)高甘露糖型，(b)复合型，和(c)杂合型；以及(2)通过N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)与蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基与蛋白质连接的O-聚糖。以这些方式将糖链与已表达的蛋白质连接的相应糖基化途径通常发生在细胞溶胶、内质网和高尔基复合体中，并涉及有利于其连接的糖苷酶和糖基转移酶。

虽然不受任何特定机理作用理论的束缚，但是在本发明的人细胞系统中表达的人蛋白质优于在非人类细胞中表达的对应物的原因在于其可靠的糖基化表面和适当折叠的三级结构，其原因见上文。也就是说，在体内人细胞环境中，人细胞的翻译后修饰机制使寡糖糖链或聚糖糖链与内源表达的蛋白质的外表面连接，使得天然产生的蛋白质被一系列共价连接的糖链覆盖，这还有助于延迟蛋白质通过肾脏系统从血流中清除。因此，与由非人类细胞表达的相同蛋白质相比，循环的“可靠”人蛋白质的半寿期延长。

因此，虽然非人类细胞能够从导入的表达载体中表达人多核苷酸序列，但是非人类细胞环境不适于自身进行这类翻译后修饰。因此与其适当折叠和糖基化的体内人对应物相比，所得到和表达的蛋白质必然缺乏可靠性。为此，在研究、诊断和治疗终点中使用从非人类细胞表达并纯化的人蛋白质是相形见绌并且也是不理想的。

(a)人与非人类形式

非人类细胞表达系统，例如细菌、酵母、真菌、昆虫和非人类哺乳动物系统，不产生可靠的人蛋白质。普通的细菌表达系统例如大肠杆菌细胞不会使重组哺乳动物蛋白质糖基化。酵母和真菌表达系统可表达人DNA序列，但所得到的酵母和真菌细胞的糖基化形式显著不同于人细胞的糖基化加工。例如，酵母和真菌细胞使非人类高甘露糖糖链与重组表达的人蛋白质连接。甘露糖链可能是免疫原性的，蛋白质通过肾脏途径从系统的清除快得多。昆虫细胞表达系统与酵母和真菌的类似，但与昆虫表达的蛋白质连接的甘露糖链的长度通常比在酵母系统中连接的长度短。更多详情参见Zopf和Vergis，PharmaceuticalVisions，NeoseTechnologies，Inc(www.neose.com)。

至于非人类哺乳动物细胞表达系统，中国仓鼠卵巢细胞是本领域从业人员最普遍使用的。CHO细胞的糖基化不同于人细胞的糖基化。CHO聚糖结构与人的不一样。例如，在CHO细胞中，表达的IFN-γ包括取代岩藻糖残基和高甘露糖寡糖链；在转基因小鼠细胞中，IFN-γ具有变异的N-聚糖结构，在昆虫细胞中，IFN-γ具有三甘露糖基核心结构。

也使用转基因动物来产生人蛋白质，例如在山羊奶中，但仍存在类似问题，例如糖基化不足，而且加入了非人类唾液酸(N-羟乙酰神经氨酸)。

相比之下，人蛋白质上的N-聚糖具有以N-乙酰神经氨酸封端的特定顺序。因此，本发明的一个方面是重组表达只包含人糖链的人蛋白质。也就是说，本发明的“可靠”蛋白质包含以N-乙酰神经氨酸封端的以下一种或多种成分的组合：(1)N-乙酰葡糖胺，(2)岩藻糖，(3)甘露糖，和(4)半乳糖链。参见表1和图4。因此，人细胞环境提供适当和正确的结构单元以及用于加工重组表达的可靠人蛋白质的机制。因此，在人蛋白质和人细胞因子的情况下，具有可靠糖基化形式的重组产生的可靠的人细胞因子/蛋白质包括但不限于包含以N-乙酰神经氨酸封端的以下一种或多种成分的组合的重组蛋白：(1)N-乙酰葡糖胺，(2)岩藻糖，(3)甘露糖，和(4)半乳糖糖链。

在某些情况下，不是按照本发明表达的每种个别的细胞因子蛋白都将包含与从表达过程(run)分离的其它细胞因子相同的糖基化形式或糖基化程度。因此，可能存在表达的细胞因子的亚群，其与从特定的人细胞培养物中表达的其它细胞因子相比含有或多或少的连接人糖链，或者被加工成含有长短不等的连接糖链。这并非是不利的，反而接近体内糖基化的状态。因此，当观察蛋白质凝胶时，在主要染色带周围可能出现模糊。在本发明的表达系统中，模糊不代表蛋白质污染或降解的蛋白质或碎片，相反蛋白质大小分子量的分布可归因于糖基化的程度和与重组表达的蛋白质连接的糖链的数目或相应大小。因此，更大程度是糖基化，或者较长糖链的连接将增加糖基化蛋白或细胞因子的总体表观分子量。

B.概况

本发明因此涉及用于在体外从人细胞的稳定培养物中产生可靠的蛋白质的快速和大规模的方法。将本发明的人细胞表达系统制成更易于接受编码人蛋白质的新的表达载体的导入，以及更易于接受有利于随后编码蛋白质的多核苷酸进行表达的悬浮培养基。

1.优势

使用本发明的人细胞和方法产生的人蛋白质，具有和显示比由非人类细胞表达的蛋白质更可靠的“类似于人的”性质和结构，特别就蛋白质折叠和翻译后修饰而言，例如蛋白水解切割加工和糖基化。为此，采用本发明的方法和试剂表达的人蛋白质具有更接近其内源的、天然表达的天然形式的生物活性和循环半寿期。此外，就折叠和通常可利用的二硫键形成残基而言，重组表达的人蛋白质在结构上更相当于天然蛋白质，因此比其非人类细胞表达的对应物免疫原性较少。同样，由于人细胞含有适当的人酶，所以人细胞可更容易地使表达的重组蛋白糖基化，因为与非人类细胞系统不同，其细胞环境和胞质细胞器在理论上适于识别和操纵人蛋白质。因此，在本发明稳定的人细胞培养物中表达的重组细胞因子被糖基化的糖基化形式和状态就像它们是在体内内源性产生的一样。

此外，由于重组表达的蛋白质的表面更类似于天然表面，因此其具有对于产生高亲和力抗体是理想的更可靠的表面表位。因此，这类高亲和力抗体多用于疗法、诊断及研究与发展的研究中。因为它们是针对可靠的重组表达的蛋白质产生的，因此可更特异性识别天然表达的内源对应蛋白质，较少量的抗体可给予个体，或者用于体外方法。为此，可使用针对本发明的可靠蛋白质产生的特定抗体的部分剂量来完成治疗，否则需要大得多的集中剂量，正如本文其它部分详细解释的一样。不仅仅使用较低浓度的这类抗体意味着可降低剂量频率，而且还可降低或完全消除副作用的发生。此外，本发明的人细胞系、方法和组合物使得表达人蛋白质，尤其某些细胞因子(例如TGFβ1)成为可能，这些细胞因子即使可能表达，到目前为止也是众所周知地难以在这类其它的非人类细胞中表达。例如参见实施例和图5，其采用本发明的方法，证实了TGFβ1的产生。

如本文中所述，本发明的人细胞培养物是稳定的。参见下文中的“方法”和实施例。也就是说，可以重复使用相同的细胞培养物表达任何需要的人蛋白质(例如人细胞因子)，然后分泌到上清液中。人细胞是稳定的，因为采用抗生素选择技术，针对它们在无血清培养基中生长的能力对其进行了筛选。这一点的重要性是多重的：与不能够补充的现有系统不同，可长时间地维持相同体积的人细胞。这就意味着离心出来的等分培养物中的人细胞可返回储备培养物中，使之再次增殖。

相比之下，由于现有技术的人细胞系统是不稳定的，培养物的体积只代表一次机会收获表达的蛋白质。也就是说，一旦细胞裂解或通过离心收集以分离含有蛋白质的上清液时，现有技术的人细胞实际上是死的和不可用的。因此，本发明的人细胞的再次可用性是十分吸引人的。

这不仅仅意味着相同体积的细胞可反复使用，而且本发明的方法还适于大规模加工。因为在早期建立了人细胞的稳定性，所以之后人细胞能够在任何体积的培养基中存活。参见图1。例如，在1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、11升、12升、13升、14升、15升、16升、17升、18升、19升、20升、21升、22升、23升、24升、25升、26升、27升、28升、29升、30升、31升、32升、33升、34升、35升、36升、37升、38升、39升、40升、41升、42升、43升、44升、45升、46升、47升、48升、49升、50升，或超过50升培养物，或在中间的任何整数中，维持有活力的人细胞培养物是可能的。因此，本发明的方法允许以商业上理想的产量，进行重组蛋白(例如重组表达的细胞因子)的商业化规模生产。

因此，本发明的人细胞表达系统自身适于可扩大性规模(scalability)，因此适于生产每单位时间产量提高的可靠产生的蛋白质。参见图2。由于细胞培养物利用无血清培养基，因此所得上清液基本上只含有分泌的表达重组蛋白。因此，最终产物的纯度，即重组表达的蛋白质的纯度非常高。因此，分离的表达蛋白质的浓度和生物活性高，带有细胞碎片和其它不需要的蛋白质的污染可能性低。

表达的人细胞因子的纯度及其分泌进入的上清液，在以下以方面也是十分重要的因素：在确定精确可靠的生物活性中以及为了确保针对人细胞因子产生的抗体也具有高度特异性以及本身的高结合亲和力。因此在这一方面，将无血清培养基用于稳定的人细胞培养物的生长是非常有用的，因为在表达的细胞因子洗脱液或上清液中也只有很少(如果有的话)的污染蛋白质或细胞碎片。

同样，因为重组蛋白是由人细胞分泌并进入无血清培养基的，因此将表达并分泌的蛋白质分离出来相对简单。也就是说，不需要使用“His标签”分离方案从上清液中分离出表达的蛋白质。参见图3。His标签通常是一段6个组氨酸的氨基酸残基，被工程改造导入表达盒中，使得表达的蛋白质是包括所述6个残基的融合物，随后可与涂在柱内的配偶残基结合。因此，因为不需要使用这类标签分离本发明的表达蛋白质，所以排除了产生可靠的人蛋白质的额外步骤。

因此，本发明的方法在规模上可扩大到商业水平，利用悬浮于无血清培养基中的可再使用的自身永续性人细胞培养物，这就排除了污染，提高了表达的重组蛋白的纯产率。就其折叠和糖基化状态而言，所得的重组蛋白是十分可靠的，使得重组表达的可靠蛋白质与其天然的内源对应物十分相似。

2.方法

(a)人细胞的制备

将人细胞以单层接种在培养皿的无血清培养基上。然后将在无血清培养基中存活的细胞接种到含血清的培养基中以产生工作细胞库。无血清培养基包括但不限于293SFMII、CD293、FreeStyle293、杂交瘤SFM(Invitrogen)和Ex-Cell293(JRHBiosciences)。

(b)转染

将适当浓度的质粒DNA和转染子加入含有细胞汇合层的培养皿中。可用的转染子包括但不限于FuGene6、FuGeneHD(得自Roche)；Lipofectamin、Lipofectamin2000、293fectin(Invitrogen)和聚乙烯亚胺。对质粒DNA进行工程改造以包含抗生素抗性基因，以辅助选择适当转染的人细胞。参见下列各部分。

(c)暴露于抗生素后选出转染细胞

步骤(b)的转染细胞在经胰蛋白酶处理(从培养皿板上剥离细胞)后，通过离心收获，然后悬浮于含有某种浓度的抗生素(例如400μg/ml或800μg/ml)的血清培养基中一段时间，抗生素例如新霉素(G418)、潮霉素、零霉素或杀稻瘟菌素。然后，可以收获存活的细胞集落，在另一段时间内暴露在又一轮的抗生素中。

(d)细胞适应

然后将经过抗生素处理还存活的细胞悬浮于低血清培养基中，培养基包括例如1％血清和抗生素，以确定细胞足够稳定保持存活并在液体培养基中生长。这种“适应”期可能要花几周时间，这段时间后，将细胞转移到只含有抗生素的无血清培养基中，再经“适应”一段时间。

因此，适应细胞的这类悬液代表了稳定的人细胞培养物，它经得住转染和抗生素选择的严酷条件。此外，这些细胞可连续不断地生长，并用来接种较大体积的培养物，或者还可在新鲜培养基中冷冻保存以备将来接种培养物。

(e)由悬浮的抗生素抗性人细胞产生细胞因子

质粒DNA表达细胞因子基因或编码的多核苷酸，这些是从(d)的大体积培养物悬液中连续生长的抗生素抗性人细胞中分泌出来的。因此，可将等分的大体积悬液轻缓离心以沉淀人细胞，并分离出可含有需要的细胞因子的上清液。由于人细胞在其中生长的悬液培养基是无血清或无蛋白质的，存在很少的污染细胞物质(如果有的话)，例如其它蛋白质或细胞碎片。因此，含有分泌的细胞因子的上清液相对较纯。

然后将人细胞沉淀再次悬浮，并再引入相同或不同的悬液或培养基中，重新开始表达过程。因此，整个系统是可重复的，不像现有技术的表达系统一样，细胞悬液仅可一次使用。

(f)产量

可通过本发明方法产生的蛋白质的产量可取决于用于表达需要的多核苷酸构建体的人细胞培养物的体积、细胞因子及其大小，以及培养基本身的组分基料。通过改变培养基的某些组分、温度、pH，或者通过在混合物中包括促进糖基化机制的聚糖前体，可以影响产量。因此由本发明的人细胞表达系统表达的人细胞因子的产量可为1-500mg/升，或500mg/升以上。因此，本发明包括得自本发明的人细胞表达系统的细胞因子的产量约1mg/升、约2mg/升、约3mg/升、约4mg/升、约5mg/升、约6mg/升、约7mg/升、约8mg/升、约9mg/升、约10mg/升、约20mg/升、约30mg/升、约40mg/升、约50mg/升、约60mg/升、约70mg/升、约80mg/升、约90mg/升、约100mg/升、约120mg/升、约140mg/升、约160mg/升、约180mg/升、约200mg/升、约220mg/升、约240mg/升、约260mg/升、约280mg/升、约300mg/升、约320mg/升、约340mg/升、约360mg/升、约380mg/升、约400mg/升、约420mg/升、约440mg/升、约460mg/升、约480mg/升或约500mg/升，或者约500mg/升以上。本发明还包括介于任何这些浓度之间的产量。

因此，本发明的产量可介于约10-50mg/升之间，或介于约50-100mg/升之间、或介于约100-150mg/升之间、或介于约150-200mg/升之间、或介于约200-250mg/升之间、或介于约250-300mg/升之间、或介于约300-350mg/升之间、或介于约350-400mg/升之间、或介于约400-450mg/升之间、或介于约450-500mg/升之间、或介于约500-550mg/升之间、或介于约550-600mg/升之间、或介于约600-650mg/升之间、或介于约650-700mg/升之间、或介于约700-750mg/升之间、或介于约750-800mg/升之间、或介于约800-850mg/升之间、或介于约850-900mg/升之间、或介于约900-950mg/升之间、或介于约950-1,000mg/升之间。

换句话说，按照本文公开方法制备的本发明的重组产生的可靠蛋白质的产量可为由其它细胞表达系统获得的产量的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

3.载体设计

本发明的一个方面是包含以下元件的新的表达盒：

(1)巨细胞病毒增强子元件，例如CMV即时早期增强子元件(CMVIE)；

(2)人启动子序列，选自(i)人肌动蛋白启动子，(ii)人血清白蛋白启动子，和(iii)人血纤蛋白原启动子；

(3)人珠蛋白基因内含子；和

表达载体还可包含与上述元件(1)-(4)有效连接、位于信号肽下游的目标核酸序列或需要的多核苷酸，使得它随后可在细胞中表达。

需要的多核苷酸序列可为编码需要的细胞因子或细胞因子片段的多核苷酸序列。表达盒还可包含抗生素抗性基因的序列，可将其克隆在调节元件之间用以表达细胞因子多核苷酸，或者可将其与自身的启动子和终止子有效连接，所述启动子和终止子与来自用于表达细胞因子信号肽融合蛋白的表达盒无关。

因此，本发明的表达载体包括例如下列载体：

1.pHZhag，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，和(iii)人β-珠蛋白内含子；

2.pHZA，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMV启动子，和(ii)人血纤蛋白原亚基A信号肽；

3.pHZI，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMV启动子，和(ii)人Ig超家族8信号肽；

4.pHZhagA，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，和(iv)人血纤蛋白原亚基A信号肽；

5.pHZhagI，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，和(iv)人Ig超家族8信号肽；

6.pHZhag-TGFβ1，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子和(iv)TGFβ1；和

7.phZhagI-TGFβ1，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，(iv)人Ig超家族8信号肽，和(v)TGFβ1。

对照表达盒包括：

1.pCAG，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)鸡β-肌动蛋白启动子，和(iii)兔β-珠蛋白内含子；和

2.pHZsec，包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMV启动子，和(ii)mIg-κ前导序列。

(a)克隆

可通过遗传工程领域技术人员可利用的各种方法完成细胞因子的克隆。例如，总RNA或poly-ARNA可从富含特定细胞因子表达的人组织样品(例如淋巴细胞)中纯化，并用作基因特异性RT-PCR的模板。此外，预制备的cDNA文库可购自商业来源，可采用PCR直接扩增细胞因子cDNA。再者，可以根据国立生物工程学信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)可获取的序列信息，用其基因检索号构建合成的寡核苷酸以产生细胞因子的合成基因。另外，全长cDNA克隆可获自例如IMAGE克隆集团(IMAGEcloneconsortium)(image.llnl.gov/)或Openbiosystems(Huntsville，AL)。全长细胞因子cDNA克隆获自Openbiosystems(Huntsville，AL)。克隆的细胞因子的基因检索号见表3。

细胞因子通常在其N端具有信号肽，这可通过本领域技术人员可获得的多种工具来鉴定；例如利用Swiss-Prot蛋白质知识库。某些细胞因子具有由不同转录所引起的变体，这也可通过可获得的工具来鉴定。分泌细胞因子的序列见上文中的第10小节。为了有利于快速克隆出具有不同信号肽的细胞因子，可对表达盒进行工程改造使表达的细胞因子含有信号肽。例如适于在哺乳动物细胞(例如CHO和HEK293)中产生分泌的重组蛋白的pSecTag2c(Invitrogen，CarlsbadCA)，可通过工程改造进入本发明的载体中，即通过位点定向诱变，采用合适的克隆和限制酶切消化策略，以正确的读框方向使编码信号肽的DNA整合，使之与共同连接的细胞因子序列一起进行适当的转录和翻译。例如，使用诱变引物SecTag2c-srf1f(TCCACTGGTGACGCGCCCGGGCCGGCCAGGCGCGCC)(SEQ.ID.NO：34)和SecTag2c-srf1r(GGGGCGCCTGGCCGGCCCGGGCGCGTCACCAGTGGA)(SEQ.ID.NO：35)，有可能在具有Igκ前导序列的读框内导入SrfI限制位点(参见图27)。

4.人细胞

可用于表达本发明的蛋白质的人细胞类型包括人干细胞、人前体细胞、人肾细胞、来源于人视网膜的PER-C6细胞、人胚肾细胞系。特别有用的人细胞系包括但不限于HEK293细胞及其衍生物，例如HEK293T、HEK293S和HEK293EBNA。

具体地讲，本发明提供称为HZ-293TS的新的人细胞系，在本文使该人细胞系适应无血清和化学成分确定培养基。参见实施例2。命名为HZ-293TS的细胞系保藏在ATCC，ATCC生物保藏材料保藏号为____，保藏日为____。

5.产物

(a)细胞因子

按照本发明的方法，可在人细胞中对人细胞因子进行培养基生产和大规模生产。本发明的方法成功用于生产60种以上无标签细胞因子，包括难以表达的TGF-β超家族的蛋白质。例如，用GM-CSF、IL4和VEGF165为例，本文证实了可从人细胞中表达和分离十分可靠的糖基化细胞因子，而且可用作十分优选的试剂用于随后的炎症、癌症治疗开发、干细胞研究和抗体产生。此外，本发明技术产生的人细胞因子不仅仅是更接近天然糖基化的，而且有时产生全功能复合物(fullyfunctionalcomplex)所必需的适当二硫键也是完整的。这与在某些非人类细胞中的情况不一样，其中在表达的单体之间不可能形成二硫键结合。

无需使用纯化或分离所需要的标签(例如组胺标签)就能够产生十分可靠的人蛋白质是本发明非常需要的特征。本发明的方法和载体系统允许在其结构、生化和功能特征方面十分可靠的人蛋白质表达成其天然的内源人形式；这意味着编码本发明的可靠蛋白质序列的多核苷酸不一定需要掺入组氨酸编码残基就可有助于随后表达的蛋白质的纯化和分离。因此，本发明的一个方面是用于无需使用肽标签便重组产生可靠的人蛋白质和重组产生作为“无标签”的可靠蛋白质本身的方法。因此，本发明的“可靠”蛋白质的一个方面在于它无标签。然而，这并不意味着排除了使用标签的可能，例如与本发明的方法和载体联用的His标签。也就是说，本发明还包括重组产生可靠蛋白质，其中标签(例如His标签)作为融合蛋白掺入可靠蛋白质的N端或C端以有助于其鉴定、纯化和分离。

在本发明的稳定人细胞表达系统中表达下列细胞因子是十分理想的：激活素A、激活素B、激活素A/2xINHbA、激活素B/2xINHbB、AMH/MIS、Artemin、BDNF、BMP2、BMP15/GDF9B、BMP2/BMP2A、BMP3/成骨蛋白、BMP4、BMP4/BMP2B、BMP5、BMP7/OP-1、BMP1、BMP10、BMP15/GDF9B、β-NGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、δ1、EGF、红细胞生成素(EPO)、酸性FGF、碱性FGF、FGF10、FGF5、FGF7、FGF8b、FLT3配体、G-CSF、GDF15、GDF2/BMP9、GDF3、GDF5/BMP14、GDF8/肌生成抑制蛋白、GDF9、GDNF、GM-CSF、HGF、HGH、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-γ、IFN-β1、IGFI、IGFII、IGFIIv1、IGFIIv2、IL10、IL11、IL12、IL15、IL17/IL17A、IL17F、IL1β、IL2、IL23、IL27、IL28A/IFN-λ-2、IL28B/IFN-λ-3、IL29/IFN-λ-1、IL1β、IL2、IL3、IL32、IL35、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、抑制素A/INHa和INHbA、抑制素B/INHa和INHbB、抑制素C/INHa和INHbC、抑制素E/INHa和INHbE、LEFTYB、LEFTY1/LeftyB、M-CSF、小鼠CSF、小鼠SCF、NODAL、头蛋白、NT3(神经营养蛋白3)、制癌蛋白M、PDGFα、PDGFβ、外周营养因子、SCF、SDF1α、SHH、促生长素、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4/LEFTY2/LeftyA、TNFα、TPOα、VEGF121aa、VEGF165aa、WIF1、WNT1、Wnt10A、Wnt10B/12、Wnt11、Wnt16、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8B和Wnt9A/14。另参见表5中的“克隆的细胞因子基因表”。另参见表5列表列举的细胞因子。这些细胞因子中的任一种均可在本发明的人细胞表达系统中表达。

下面的实施例和相应的附图表明，高度纯化的可靠糖基化生物活性细胞因子即EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、头蛋白、SCF、促生长素、TGFβ1、TNFα和VEGF-165的成功表达。有关证实这些细胞因子的重组表达及其相应的生物活性以及与从其它细胞系统表达的细胞因子的比较的附图和凝胶数据参见图6A-M、7A-D和8A-C。

(b)抗体

可归因于本发明的可靠糖基化、折叠和磷酸化蛋白质的另一个益处在于它们是用于产生高度特异性抗体的优良试剂。

单克隆抗体可用于测定特定细胞因子的存在或用于它们与之特异性结合的蛋白质的分离和纯化。因此，单克隆抗体可用于诊断分析、检测分析和纯化方案。因为与在非人类细胞中表达的重组细胞因子相比，由本发明的人表达系统产生的重组细胞因子被更可靠地糖基化和折叠，因此针对其产生的任何抗体在人体或人生物样品中对内源细胞因子可具有较高的亲和力。

可按照已知方法，使用用作特异性抗原的重组人干扰素来制备单克隆抗体。可同时注射一种或多种抗原。例如使用从大肠杆菌中制备的干扰素以及按照本发明之前描述的方法使用产生相同干扰素的转染人细胞制备的干扰素。当与用可靠的重组人干扰素(由转染人细胞制备)免疫的克隆中选出的抗体相比时，进行转换分析试验(Crossboardanalytictesting)的若干产生抗体的克隆选自由大肠杆菌制备的重组干扰素。通过使小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞融合接着对随后能够产生需要的抗体的克隆进行选择，来获得能够产生单克隆抗体的细胞系也是可行的。参见和Milstein，Nature(1975)，256(5517)：495-497；以及等，EurJImmunol.(1976)，6：292-295。可根据各种性质筛选针对表位产生的单克隆抗体群；即同种型和表位亲和力。一种备选技术涉及筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在其具有多个互补决定区(CDR)的外壳(coat)表面上表达scFv片段。该技术是本领域众所周知的。

使用由糖基化重组人细胞因子的分泌物制备的抗原的多克隆抗体可以产生这样的抗体：即除识别分子的蛋白质组成部分外，还识别特定重组人干扰素的糖基化组成部分。可通过使各种动物物种(例如兔、山羊、绵羊或其它动物)免疫，用采用包括在本发明内的方法制备的可靠的重组人干扰素，通常与弗氏完全佐剂一起重复注射微克到毫克量的这些干扰素之一作为抗原使动物免疫，来制备多克隆抗体。本发明包括的多克隆抗体(“pAb”)的实例包括但不限于针对EPO、FLt3、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IFN-α2A、IL-4和IL-6的pAB。

本文所使用的“抗体”是指由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽组成的蛋白质。抗体可作为完整免疫球蛋白或作为多种片段存在，包括用各种肽酶消化产生的已充分表征的片段。虽然根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是技术人员应当了解的是，抗体片段可按化学方法或采用重组DNA方法从头合成。因此，本文所使用的术语抗体还包括通过完整抗体的修饰产生的或采用重组DNA方法从头合成的抗体片段。使用术语“抗体”所包括的抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双抗体和Fd片段。此外，抗体及其片段可以是人源化抗体，例如参见EP-A-239400，其通过引用结合到本文中。

按照本发明产生的抗体的实例包括针对重组产生的可靠人IL-2、IL-4、IL-6、EPO、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FLT3L和IFN-α2A产生的多克隆抗体。所制备的单克隆抗体包括但不限于针对重组产生的可靠人IL-2、IL-4、IL-6、EPO、G-CSF、TGF-β1、IFN-α和IL-17的单克隆抗体。

(c)激酶

也非常需要在稳定的本发明人细胞表达系统中表达以下人激酶基因，从而获得重组产生的可靠的人激酶，包括但不限于：AKT1、AKT2、AMPK1、ATM、AuroraA、BTK3、CDK6、ERK5、Fyn-1、GRK5、JNK1、LYN、MAPKAPK2、MAPKAPK3、MEKK3、MKK3、MKK4、mTOR、P38-α、P70S6K2、PDK1、PKC-β、PKC-γ、PTEN、SYK和Zap70。

(d)其它蛋白质

本发明不限于只产生细胞因子和针对这些细胞因子产生的抗体。可采用本发明的稳定人细胞系，按照本发明表达其它的人蛋白质，包括但不限于激酶和其它酶。因此，本发明还包括重组产生可靠的人血浆蛋白质，其选自白蛋白、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、α-1-蛋白酶抑制剂、促凝血蛋白(bloodpro-coagulationprotein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α.-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、脱脂载脂蛋白、HDL、LDL、纤连蛋白、β-2-糖蛋白I、血纤蛋白原、纤溶酶原、纤维蛋白溶酶、纤溶酶原激活剂、纤溶酶原抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、α-胰蛋白酶内抑制剂(inter-alpha-trypsininhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血红素结合蛋白、C3补体、运铁蛋白、尿激酶、α-1-酸性糖蛋白、凝血因子、抗凝血因子(例如因子II、因子V、因子VII、因子VIII、冯维勒布兰德因子、因子VIII--冯维勒布兰德因子复合物、因子IX、因子X、因子XI、C1抑制剂、蛋白质C和蛋白质S)、受体的胞外膜蛋白或胞外域。

7.纯化

在大肠杆菌培养物中，在靶定的干扰素基因扩增到必需的量后，对于细胞和人细胞(例如HEK细胞)及其它相关人细胞的表达，进行了定制的可靠样重组分子(authentic-likerecombinant)的纯化。选出用于特定干扰素的细胞，并且专门制备特定的载体，在此选出正确的来源于人组分的启动子。选用于各种干扰素的特定的人细胞必需通过最适人细胞系的选择。由于使细胞适应细胞悬浮培养无血清培养基，因此当与含血清细胞培养基相比时，适于收获的培养基的纯化方法较易设计。

例如，可通过离心收集无血清培养基的上清液，将细胞沉淀悬浮于新鲜无血清培养基以进一步产生细胞因子。通过已知分子量使用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析或通过传统的蛋白质印迹分析，可以容易地鉴定细胞因子的表达。为了俘获细胞因子，首先将上清液加到固定化金属亲和层析(IMAC)柱上。根据其性质，一些细胞因子与IMAC柱结合，而一些细胞流经该柱。在接下来的纯化步骤中，在缓冲液交换成合适的缓冲条件后，将细胞因子流分合并液加到离子交换层析(IEX)柱。在最后的精加工步骤中，将细胞因子流分合并液加到另一个IEX或不同的亲和层析(例如肝素树脂)柱上。

(b)纯度

(i)细胞因子纯度水平

在至多3个层析步骤后，在SDS-PAGE凝胶上通过考马斯染色(图7)和通过具有可获得的抗体的蛋白质印迹(图8)，断定细胞因子的纯度超过95％。然后采用本领域技术人员可利用的已知方法(例如Bradford测定法，凝胶考马斯染色和OD280nm)，对纯的细胞因子进行了定量分析。定量后，按照生产商的手册，通过得自Lonza(Allendale，NJ)的内毒素检测试剂盒，对细胞因子进行内毒素水平分析，根据所需要的量进行等分，冻干用于商业用途。

(ii)低污染物

内毒素是由细菌和其它表达系统制备的细胞因子中常见的污染物。即使低水平的内毒素对于细胞或生物体都可能是有毒性的，必须除去。产业标准报称市售细胞因子的值为＜1.0EU/μg。本发明的方法能够产生具有超低水平内毒素污染的蛋白质，例如各种不同的人细胞因子。如下所述，按照本发明制备的细胞因子，其产生的内毒素比标准商用制备物报告的水平低10倍到1000倍。

8.测定法

有许多不同的测定系统可用于确定细胞因子的“纯度”、“活性”以及用于定量测定细胞因子的浓度或用于检测表达细胞因子的细胞。细胞因子生物测定法测定例如：(i)由细胞因子诱导的细胞增殖，(ii)趋化性，(iii)细胞毒性，(iv)诱导集落形成的能力，(v)细胞脱粒，或(vi)诱导更多细胞因子或其它化合物分泌。

(a)活性

如上所述，用于测定细胞因子活性的标准测定法包括(a)细胞因子诱导的指示细胞系的增殖；(b)细胞因子诱导的细胞凋亡；(c)细胞因子诱导的免于病毒感染的保护；和(4)细胞因子诱导的细胞因子产生。有关各种具体方法的详情为技术人员所熟知，可参见“CytokineBioassays”(www.ebioscience.com/ebioscience/appls/BAC.htm)，该文献通过引用结合到本文中。

由细胞因子诱导的生物反应显示饱和动力学(saturationkinetics)，这可用来通过剂量反应曲线对它们的量进行定量分析。这些测定法包括使用原代细胞培养物(primarycellculture)，且更常常是其生长或存活依赖于特定细胞因子的存在或以特定方式响应既定细胞因子的建立的细胞系(参见www.copewithcytokines.de/cope.cgi？key＝bioassays)。一种方法是MTT测定法，这是一种测定细胞因子对细胞增殖的作用的定量比色法。MTT测定法使用黄色的四唑盐[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑-溴化物]，其通过增殖细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶活性进行代谢，产生紫色的甲反应产物，可以使用比色计检测。

其它细胞因子测定法包括(1)免疫测定法，一般测定免疫反应性，因此是细胞因子存在的有用指标，包括(a)放射免疫测定法，(b)免疫放射测定法，和(c)酶联免疫吸附测定法。这些特殊的测定法需要细胞因子特异性抗体或标记的细胞因子、受体或抗体。因此，由本发明产生的高亲和力抗体可理想地用于实施这类免疫测定法，尤其因为体内某些细胞因子的合成常常以如此低的水平发生，以至于其存在难以通过标准免疫测定技术测定；(2)流式细胞磁珠阵列(CytometricBeadArray)将夹心免疫测定法与流式细胞术结合起来用于同时测量多种颗粒的特征，已被用来同时测定小体积的多种细胞因子；(3)用于多种细胞因子的免疫测定法是市售的；(4)体内细胞因子俘获测定法是一种可供测定体内细胞因子浓度的方法；(5)放射受体测定法通过从细胞结合的受体中置换配体来测定细胞因子的浓度；(6)反向溶血噬斑测定法(reversehemolyticplaqueassay)是免疫球蛋白分泌细胞斑测定法(immunoglobulin-secretingcellplaqueassay)改编方法，可用来检测各种分泌细胞因子的细胞，并测定由该细胞分泌的特定细胞因子的量；(7)细胞印迹测定法(cellblotassay)还可供观察由生产细胞释放细胞因子；(8)激酶受体活化测定法，其利用结合受体的配体可引起受体的酪氨酸磷酸化的事实；因此，通过测定受体磷酸酪氨酸的量而不是细胞增殖或细胞存活，可以推测出活性；(9)因子依赖性细胞系测定法(Factor-dependentcelllineassay)是其中细胞以特定方式响应各种细胞因子或新鲜分离细胞的测定法；(10)细胞因子免疫诱捕法(cytokineimmunotrapping)是用于研究细胞因子产生和消耗或降解的动力学的测定法；(11)使用探针和PCR引物进行细胞因子mRNA的RT-PCR定量测定可以设计成使细胞因子基因或其备选的剪接变体退火和扩增，例如，可以使用变体特异性引物或探针，扩增或检测例如称为HGF/NK1、HGF/NK2、HGF/NK4等的HGF的剪接变体。

具体地讲，表达的细胞因子的生物活性可根据细胞因子的性质，通过剂量依赖性细胞毒性(例如TNFα)、增殖的刺激(例如IL-2)或其它细胞因子诱导的对有效细胞增殖的抑制(例如TGF-β1)的ED50来测定。

(b)比较测定法

本文还提供通过本发明系统表达的细胞因子与在非人类细胞中表达的相同细胞因子的凝胶并行比较来证实两种蛋白质产物之间纯度和糖基化状态的差异。参见图7和图8。

9.重组产生的可靠的细胞因子的示例性治疗用途

正如前面的章节和段落中的详细描述一样，由本发明稳定的人细胞表达系统表达的细胞因子具有许多优于在其它细胞系统中产生的细胞因子的优势和益处，例如更“类似于人的”或更“可靠的”折叠、糖基化、磷酸化状态、表位呈递和天然二聚化特征。因此，按照本发明方法产生的实际蛋白质结构更类似于其天然的内源对应物。在这些可靠的重组细胞因子的治疗用途的情况下，这可解释为重要优势。对于各种细胞因子和功能之间的关系还可参见下表2。技术人员能够使特定病症和疾病与细胞因子活性异常或功能失常相互关联，因此提出抵消或纠正异常的疗法，下面将更详细论述。

在非人类细胞系统中表达的细胞因子是不可靠的，例如它们缺乏人特有的糖基化形式，与非人类糖链共价连接，或者错误折叠。此外，细胞培养物不能够补充，即在重组蛋白表达并从细胞培养物中分离后，细胞培养物不能再次使用。为此，这类非可靠的细胞因子的功效低，半寿期短，并且可诱导机体的变态反应和不良免疫原性反应。

相比之下，本发明的细胞因子是可靠的和类似于人的。因此，由本发明产生的细胞因子的功效较高且半寿期长，实际上这意味着只需给予有需要的个体较少剂量的细胞因子。较少的剂量和较长的半寿期还意味着可以减少给药频率。此外，因为本发明的细胞因子更类似于人的细胞因子，它们诱导变态反应或具有免疫原性的可能性不大。因此总的来说，需要接受治疗的个体可进入只需要他或她服用细胞因子丸剂或片剂或者注射细胞因子制剂较少且较不频繁的治疗过程，而又不必担心归因于现行非可靠细胞因子引发的免疫原性反应的副作用。参见例如与目前可获得药物有关的潜在副作用和问题，例如配制成含有重组IFN-α2a的参见www.fda.gov/cder/foi/label/2002/ifnahof081502lb.pdf和www.rocheusa.com/products/roferon/roferon_medguide_vials.pdf。

在这一方面，因为本发明提供重组产生十分可靠的人细胞因子蛋白，特殊用途所需要的细胞因子的剂量，比在不同细胞类型中由不同的构建体产生的同类细胞因子所需要的剂量显著较低。例如，比起由非可靠人白细胞干扰素引起相同效果需要每剂4千万单位，重组表达十分可靠的人白细胞干扰素只需要3-5百万IU(根据本发明产生的细胞因子的产量和可靠性分析)。这表示比现有技术产生的重组人干扰素α的功效高出log-10。因此，由3-5百万单位干扰素α产生的副作用最小(如果有的话)；而被用来产生与3-5百万单位相同效果的4千万单位会产生非常严重的副作用，包括严重的神经系统副作用。

技术人员要知道，本发明的可靠的人细胞因子的各种体内和离体治疗用途。例如，本发明包括但不限于以下细胞因子的用途：

(1)重组产生的可靠干扰素，用于治疗多发性硬化、免疫介导性疾病、癌症、自身免疫病(例如狼疮、哮喘和克罗恩病(Crohn’sDisease))和病毒性肝炎；

(2)重组产生的可靠白介素，用于治疗自身免疫(autoimmunity)、癌症；IL-6(托珠单抗)，用于治疗Castleman病；IL10、IL-11、IL-12和IL-13，用于治疗免疫细胞调变；IL-21及其受体，用于制备小鼠癌症模型；IL-1，用于治疗自身免疫病(例如类风湿性关节炎和牛皮癣)；IL-4受体和IL-5，用于治疗哮喘；IL-8，用于治疗牛皮癣；以及IL-12、IL-13、IL-17和IL-18，用于治疗TH1介导的自身免疫；

(3)FDA批准的重组产生的可靠TNF-α及其抑制剂以及改进药物，例如但不限于Enbrel(依那西普)、Remicade(英利昔单抗)、戈利木单抗(CNTO148)、Humira(阿达木单抗)、Cimzia(培舍珠单抗)、其它TNF-α抗体抑制剂，用于自身免疫和炎症；以及肿瘤坏死因子-α，用于治疗癌症和感染。

(4)重组产生的可靠趋化因子，用于治疗自身免疫病、癌症；CCR2，用作消炎药。

(5)重组产生的可靠蛋白质，用于开发用于涉及生长和集落刺激因子的有关疾病的治疗药，例如但不限于用于治疗血管生成的VEGF、血管生成抗体(阿瓦斯丁和Lucentis)、VEGF拮抗剂Macugen、多激酶抑制剂Sutent和Nexavar、VEGF单克隆和抑制剂、VEGF基因疗法；肝细胞生长因子；血小板衍生生长因子；格列卫和其它蛋白质酪氨酸激酶抑制剂；成纤维细胞生长因子；TGF结合蛋白和TGFβ信号转导抑制剂；胰岛素样生长因子；角质形成细胞生长因子；rhKGF，用于治疗口腔粘膜炎；结缔组织生长因子(CTGF)；集落刺激因子(CSF)；红细胞生成素；血小板生成素；促血管生成素；骨形态发生蛋白和生长分化因子；rhBMP-2、rhBMP-7和OPG；生长和分化因子GDF；rhGDF-5、rhBMP、抑制肌生成抑制蛋白；以及神经营养因子，用于治疗发育障碍。

可将本发明重组产生的可靠人蛋白质配制成药物、疫苗、脂质体，或者以蛋白质体内直接递送到个体或体外或离体给予细胞或细胞培养物。例如，技术人员知道，多种方法被用来修饰用于治疗用途的肽。一种方法是使肽或蛋白质与多种聚合物连接，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)。参见例如美国专利第5,091,176、5,214,131和5,264,209号，其均通过引用分别结合到本文中。

因此，本发明重组产生的可靠人蛋白质可适用于配制成用于口服或胃肠外给药的药物制剂。用于胃肠外给药的制剂包括但不限于注射用溶液剂或混悬剂和用于输注的液体制剂。对于胃肠外形式的制剂，将有效量的活性成分溶于或悬浮于无菌溶媒中，任选加入赋形剂，例如增溶剂、等渗剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂或分散剂，随后分装在密封小瓶或安瓿中。

本发明还包括本公开方法产生的可靠人蛋白质的缀合物。例如，可靠的人蛋白质可与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合产生药物组合物(其可用于人或动物)。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液。有关赋形剂的详情可参见TheHandbookofPharmaceuticalExcipients，第2版，主编Wade和Weller，美国药物协会(AmericanPharmaceuticalAssociation)，该文献通过引用结合到本文中。还可以通过直接注射给予本发明的组合物。因此，本发明的治疗组合物可配制成用于胃肠外、肌内、静脉内、皮下、眼内、口服或经皮给药。脂质体形式的人蛋白质(例如细胞因子)制品还可改进其生物活性。

可以配制本发明的治疗性可靠蛋白质，使得每天、每周或每月给药可提供需要的日剂量。技术人员应当了解的是，这类治疗组合物可方便地配制成用于较不频繁的给药，例如每2小时、4小时、6小时、8小时、10小时或12小时。

通过直接给予患者或个体或者给予患者或个体的细胞本发明的可靠人蛋白质，还可将可靠蛋白质应用于这些和其它疾病的基因疗法。然后将处理细胞再引入患者或个体体内。因此，可将编码本发明的可靠人蛋白质的需要的多核苷酸作为裸核酸构建体直接给予，还可以与宿主细胞基因组同源的侧翼序列连接，以利于内部表达盒的掺入，从而使需要的多核苷酸掺入宿主细胞基因组。个体可以是任何哺乳动物、爬行动物、鸟、鱼或两栖动物。在一个实施方案中，接受基因疗法的个体是人。可以使用本发明的任何载体直接在体内的细胞中表达需要的蛋白质，例如需要的治疗性细胞因子，从而提供治疗特定疾病(例如细胞因子相关疾病或病症)的基因疗法。

本发明包括在各种疾病和病症的基因疗法中使用本文公开的任何载体。例如，本发明包括使用本文公开的任何载体在体内表达CFTR基因(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)以治疗囊性纤维化；VIII和IX因子的基因，其缺乏分别是造成血友病A和B的原因)；引起癌细胞遭受细胞死亡或恢复到正常的称为E1A和P53的基因；增加心脏收缩能力并有助于心力衰竭的AC6基因；以及降低新血管生长(血管生成)的基因VEGF用于血管疾病。因此，在本发明的一个实施方案中，载体含有具有需要的多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸编码选自以下的治疗性蛋白质基因：CFTR基因、因子VIII基因、因子IX基因、E1A基因、P53基因、AC6基因和VEGF基因。

可使用本发明的任何载体以基因疗法治疗的基因病包括但不限于一种或多种基因的表达用于治疗脊髓小脑共济失调1型、亨廷顿舞蹈病(Huntington’sdisease)、家族性高胆固醇血症(FH)、AIDS、癌症例如黑素瘤或皮肤癌，包括将具有将抗癌蛋白(称为肿瘤坏死因子(TNF))的基因引入患者自己的癌细胞的试管样品中，然后再引入患者体内；脑癌，该方法是插入特定基因，所述基因增加癌细胞对抗击疾病中所用的普通药物的敏感性；以及前列腺癌和宫颈癌细胞；戈谢病(Gaucherdisease)是一种由突变基因引起的遗传性疾病，所述突变基因抑制称为葡糖脑苷脂酶的酶的产生。

本发明的载体还可用于解决与外科手术有关问题的基因疗法，例如手术球囊血管成形术，这是一种诱导机体免疫系统级联并引起再狭窄的手术。使用本文所述任何载体的基因疗法可以表达降低这种过度活跃的愈合反应的基因。

因此，可通过将本发明的载体(其中所述载体表达对抗或治疗遗传疾病的适当基因)引入患者体内来治疗的基因疗法的实例包括但不限于(A)用于治疗儿童和成人的肢带型肌营养不良2D型(LGMD2D)的基因转移疗法，其中所述载体在LGMD2D患者体内编码和表达rAAV1.tMCK.人-α-肌聚糖(sarcoglycan)；(B)用本文公开的表达GX-12的任何载体治疗HIV-1感染患者的基因疗法；(C)使用Ad5-yCD/mutTKSR39rep-ADP、RTVP-1、Ad.hIL-12、FP253/氟达拉滨或Ad5-CMV-NIS基因治疗前列腺癌的基因疗法；(D)使用tgAAG76(rAAV2/2.hRPE65p.hRPE65)治疗勒伯尔先天性黑矇(LeberCongenitalAmaurosis)的基因疗法；(E)治疗镰状细胞性贫血或地中海贫血的基因疗法；(F)使用BG00001(腺病毒介导的干扰素-β)治疗胸膜恶性肿瘤的基因疗法；(G)使用吞噬细胞氧化酶亚基转导的CD34造血干细胞治疗慢性肉芽肿病的基因疗法；(H)使用INGN241治疗转移性黑素瘤(intransitmelanoma)的基因疗法；(I)使用AdV-tk治疗恶性神经胶质瘤的基因疗法；(J)使用ProSavin治疗两侧性特发性帕金森病的基因疗法；(K)使用腺病毒介导的人白介素-12治疗转移性乳腺癌的基因疗法；(L)使用AAV6.SERCA2a治疗接受左心室辅助装置的患者的基因疗法；以及(M)使用rAAV2-hRPE65治疗由RPE65突变引起的勒伯尔先天性黑矇的基因疗法。

因此，这些基因的任一种可经工程改造进入本文公开任一种载体内，然后将该载体导入个体细胞内，其中所述载体表达编码的蛋白质，存在于细胞中的所述蛋白质用作对抗、纠正或以别的方式治疗主要疾病的遗传基础。可将编码治疗性蛋白质的载体导入个体外部培养的细胞中，或者可直接给予个体并在体内表达编码的蛋白质。因此，本发明包括用于体内和离体/体外治疗特定疾病的两种基因疗法。

因此，本发明的一个方面是在基因疗法中使用选自pHZhag、pHZA、pHZA、pHZI、pHZhagA和pHZhagI的载体，其中所述载体由插入该载体的表达盒表达治疗性蛋白质。在一个实施方案中，pHZhag载体包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，和(iii)人β-珠蛋白内含子。在另一个实施方案中，pHZA载体包含有效连接的以下核苷酸序列：(i)hCMV启动子，和(ii)人血纤蛋白原亚基A信号肽。在另一个实施方案中，pHZI载体包含有效连接的以下核苷酸序列(i)hCMV启动子，和(ii)人Ig超家族8信号肽。在另一个实施方案中，pHZhagA载体包含有效连接的下列核苷酸序列(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，和(iv)人血纤蛋白原亚基A信号肽。在另一个实施方案中，pHZhagI载体包含有效连接的下列核苷酸序列(i)hCMVIE，(ii)人β-肌动蛋白启动子，(iii)人β-珠蛋白内含子，和(iv)人Ig超家族8信号肽。

通过若干已知的转染技术，例如包括使用转染剂的技术，可以提高哺乳动物细胞对裸核酸载体的摄取，例如含有本发明表达盒的载体。这些转染剂的实例包括阳离子转染剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂质转染剂(lipofectant)(例如lipofectam.TM.和transfectam.TM.)。如有需要，还可将核酸构建体与转染剂混合以产生组合物。本发明的表达载体还可以是药学上可接受的载体或稀释剂以产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸缓冲盐溶液。可配制组合物用于胃肠外、肌内、静脉内、皮下、眼内或经皮给药。

所述给药途径和剂量方案仅仅作为指导，因为技术人员能够容易地确定用于任何特定个体和病况的最佳给药途径和剂量方案。

因此，本发明还包括任何本发明的重组产生的可靠蛋白质在制备治疗特定疾病或病症(例如本文公开的任何疾病或病症)的药物中的用途。因此，本发明包括重组产生的可靠的人细胞因子在制备用于治疗涉及细胞生长、细胞增殖、细胞分化和炎症的癌症和疾病异常情况的药物中的用途。因此本发明的一个方面在于重组产生的可靠的人细胞因子在制备用于治疗癌症的药物中的用途。因此本发明的一个方面在于重组产生的可靠的人细胞因子在制备用于治疗细胞增殖相关病症或疾病的药物中的用途。本发明的一个方面还在于重组产生的可靠的人细胞因子在制备用于治疗细胞生长相关病症或疾病的药物中的用途。本发明的另一个方面在于重组产生的可靠的人细胞因子在制备治疗细胞分化相关病症或疾病的药物中的用途。本发明的一个方面在于重组产生的可靠的人细胞因子在制备治疗炎症相关病症或疾病的药物中的用途。

10.针对重组产生的可靠的细胞因子产生的抗体的示例性治疗用途

已知某些细胞因子的过量表达与某些疾病和异常病理状态有关。例如，太多的TNFα与炎症和关节炎有关。因此，阻断TNFα活性并结合配体和受体的抗体有助于减轻与炎症和关节炎有关的问题。同样，通过特异性抗体结合阻断VEGF细胞因子活性是通过减少血管生成而治疗癌症和有害细胞增殖的有效机制。

因为本发明的细胞因子更类似于人的细胞因子，因此与在其它细胞系统中表达的细胞因子相比，在其表面存在更可靠的表位，而且就其体内识别和靶向其作为抗原的能力而言，针对它们产生的抗体将更可靠。因此，与不是针对本发明重组产生的可靠人蛋白质而产生的抗体相比，针对本发明重组产生的可靠人蛋白质而产生的抗体具有较高的敏感性和更高的特异性。

因此，与针对其它方法产生的细胞因子的抗体相比，针对通过本发明的方法产生的细胞因子的本发明抗体，具有较高的特异性和较高的结合亲和力。

在细胞因子的情况下，因为抗体具有较高的亲和力和特异性，所以在任何治疗方案需要给予对抗与特定细胞因子相关的疾病或病症的抗体时，可使用较低的浓度或剂量。

技术人员知道，可将本发明重组产生的可靠的人蛋白质配制成治疗性抗癌抗体，例如目前可获得的那些抗体。也就是说，可将针对本发明相关的重组产生的可靠人蛋白质的抗体配制成基于抗体的药物，例如但不限于(依决洛单抗)、(利妥昔单抗)、(曲妥珠单抗(traztuzumab))、(吉妥珠单抗(gentuzumab))、(阿仑珠单抗)、Zevalin^TM(替伊莫单抗(ibritumomab))、Erbitux^TM(西妥昔单抗)和Avastin^TM(贝伐单抗(bevicizumab))。

可以使用针对本发明重组产生的可靠人蛋白质产生的抗体或这类抗体的片段作为免疫缀合的抗癌抗体。

本发明的抗体还可用于治疗心血管疾病、感染性疾病和炎症性疾病；因此配制成药物，例如目前可获得的用于治疗这类病症和疾病的药物，例如Raptiva^TM(依法珠单抗)、(英利昔单抗)、Humira^TM(阿达木单抗)和Xolair^TM(奥马珠单抗)。

本发明的抗体还可用于移植方面，例如像Orthoclone(莫罗单抗-CD3)、(巴利昔单抗)和(达克珠单抗)一样的药物。

因此，本发明还因此包括针对任一种本发明的重组产生的可靠蛋白质而产生的任何抗体(单克隆或多克隆)在制备用于治疗特定疾病或病症(例如本文公开的任何疾病或病症)的药物中的用途。因此，本发明包括针对重组产生的可靠的人细胞因子的一个或多个表位而产生的抗体在制备用于治疗癌症和涉及细胞生长、细胞增殖、细胞分化和炎症的疾病异常情况的药物中的用途。因此，本发明的一个方面在于针对重组产生的可靠的人细胞因子而产生的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本发明的一个方面在于针对重组产生的可靠的人细胞因子而产生的抗体在制备用于治疗细胞增殖相关病症或疾病的药物中的用途。本发明的一个方面还在于针对重组产生的可靠的人细胞因子而产生的抗体在制备用于治疗细胞生长相关病症或疾病的药物中的用途。本发明的另一个方面在于针对重组产生的可靠的人细胞因子而产生的抗体在制备用于治疗细胞分化相关病症或疾病的药物中的用途。本发明的一个方面在于针对重组产生的可靠的人细胞因子而产生的抗体在制备用于治疗炎症相关病症或疾病的药物中的用途。

11.抗体和重组产生的可靠的细胞因子的示例性离体和诊断应用

技术人员还要知道，本发明的可靠蛋白质可用于诊断环境并用于在暴露和不暴露在特定的可靠人蛋白质的情况下测定候选药物和物质的筛选测定法。与不是针对本发明重组产生的可靠人蛋白质产生的抗体相比，针对本发明重组产生的可靠人蛋白质产生的抗体具有较高的敏感性和较高的特异性。这类诊断工具的一种是细胞因子磁珠阵列。参见Lambeck等，ClinicalCancerResearch13，2385(2007年4月15日)，该文献通过引用结合到本文中。该方法允许同时测量小体积血清中的多种细胞因子，例如通过使用LINCOplex试剂盒和相关方案(Lincoresearch，St.Charles，MO)。

基本上，本发明的诊断或检测方法可能需要将取自个体样品中的一种或多种细胞因子的表达水平与已知量的对照细胞因子进行比较，例如像ELISA测定法及上文第8小节中描述细胞因子生物测定法和活性测定法一样的滴定比较研究。按照本发明，可靠的人蛋白质，例如重组产生的可靠的人细胞因子可用作高灵敏性对照，因为它们在大小、结构和分子量方面与天然细胞因子十分相似。因此，将未知样品相对于已知浓度的本发明的可靠人细胞因子进行比较将是十分灵敏和准确的。根据细胞因子水平的比较结果，可以得出个体的一种或多种细胞因子的表达水平是否是异常的结论，如果异常，那么异常的表达水平是否表示或诊断出特定的疾病或病症。

因此，本发明的重组可靠的蛋白质和针对其产生的抗体可用于诊断分析中的多种不同的阵列和多重阵列(multiplexedarray)。例如，本发明包括在以下方面使用本发明的可靠的蛋白质和抗体：在多重免疫设计(MultiplexImmunoassayDesigns)中，例如夹心测定法、Antigen-downassay、竞争测定法和反相测定法；在阵列基材中，例如在96孔板中、在膜上、涂在载玻片上、沉积在流通芯片(flow-throughchip)上和黏附在多孔过滤器上；在阵列构造物中，其中蛋白质或抗体接触印在表面上，或者用于非接触分散；在检测方法中，例如比色、荧光、化学发光、表面等离子共振成像技术；在阵列处理中，例如在微液体操作和表面声波处理；以及在图像分析和数据采集方法中。

针对本发明的可靠蛋白质产生的抗体还可用于生产诊断试剂盒，用于在体外试验中检测细胞因子和相关抗原，例如ELISA测定法和人组织切片的组织学分析。因此，本发明包括试剂盒和试剂，所述试剂盒和试剂包括针对由本发明的人细胞系统产生的一种或多种细胞因子而产生的一种或多种抗体。

阻断细胞因子与其特异性受体结合并中和其作用的抗体(“中和抗体”)，在细胞因子功能的研究中，特别是疾病状态的研究中可能非常有用。因此，中和抗小鼠和抗人细胞因子抗体的体外生物测定法可用于测定特定抗体在中和细胞因子诱导的细胞增殖、细胞凋亡、病毒保护和细胞因子不当产生中的疗效。参见www.ebioscience.com/ebioscience/appls/NU.htm#protocolA。

例如，采用以世界卫生组织天然干扰素β标准(干扰素的第二版国际标准，人成纤维细胞GB23902531)为标准标定的参比标准，可对可靠的重组人干扰素β进行测定，并且与重组干扰素-β1a制品(称为)进行比较，具体特异性活性，每mg干扰素β-1a的抗病毒活性约270百万国际单位(MIU)，具体通过体外致细胞病变效应生物测定法，使用WISH细胞和水泡性口炎病毒测定。使用该方法，利比8.8mcg、22mcg和44mcg的抗病毒活性分别为约2.4MIU、6MIU或12MIU。

如前面的小节中所述，单克隆和多克隆抗体两者均可针对由本发明的方法产生的可靠的细胞因子产生。这就意味着可能产生以高效方式特异性地识别和靶向一种细胞因子的抗体，以及识别和靶向密切相关的细胞因子同源物和变体的抗体，所述同源物和变体可能通过各种剪接机制在体内产生。

至于本发明的诊断试剂盒，像用于进行ELISA测定法的试剂盒或其它免疫试剂盒一样，针对其而产生高亲和力和特异性抗体的本发明可靠的细胞因子本身可用来制备这类试剂盒的滴定标准。因此，与如果抗体是用由非人类细胞制备的细胞因子进行滴定测定的相比，当使用可靠的细胞因子和针对其产生的抗体时，标准曲线对于抗体与抗原结合测量要准确得多。因此，本发明包括这样的试剂盒，所述试剂盒不仅仅包括可靠的抗体及其片段，而且还包括由本发明的方法产生的等分的可靠细胞因子作为标准，可在例如这类测定法中绘制抗体结合标准曲线。抗体抗原结合的灵敏性可能很高。因此，使用这些可靠的细胞因子/抗体配偶体绘制标准曲线，以之为标准可对未知样品进行准确的比较和定量，可以容易和更准确地对生物样品或组织切片进行测定，并且定量测定特定细胞因子的存在和含量。

本发明的抗体还可用于制备和构建细胞因子抗体阵列，这可在一次测定中同时检测多种来源的多种人细胞因子，包括细胞裂解物、条件培养基、患者血清、血浆和尿液。这类阵列，尤其当使用本发明的抗体时，具有高灵敏度，使之可以非常低的浓度检测细胞因子蛋白，例如在pg/ml的范围。

可靠的人蛋白质和本发明的抗体还可用于筛选实验鉴定以某种方式与之相互作用的候选物质、化学试剂、化合物和其它蛋白质。例如，可分离纯化出本发明重组产生的可靠的人细胞因子，然后直接暴露于具体的候选物质中，随后在使用技术人员已知的多种测定法中的任一种进行监测，正如在上述测定法小节中所鉴定的一样，确定在蛋白质和候选物质之间是否发生任何相互作用。另参见例如表4，表4表示这类筛选实验中一种的结果，当暴露于化合物时，利用重组产生的激酶p38α鉴定并记录抑制剂IC50值。在本文其它部分更详细地描述了该实验，但此处只作为实例提及，其中本发明的蛋白质或抗体可用于离体类型的筛选实验。该项最新研究表明，在人细胞中产生的人蛋白质激酶p38α的性质与非人类细胞形式的截然不同。对于药物筛选，使用具有高可靠性的人激酶可便于研究人员避免跟从假阴性的引导，错过有希望的目标。

由本发明的方法和载体产生的蛋白质和抗体本身还可用作试剂in和ofthemselves。也就是说，可使用本发明重组产生的可靠细胞因子，例如在培养期间通过在细胞培养物中加入细胞因子以助于促进细胞生长和存活；以及如上所述，本发明的载体可用于基因疗法方案以在个体细胞内表达特定的蛋白质。

本文公开的每份文献和引文都通过引用其整体结合到本文中。下列实施例只是示例性的，绝非限制本发明的范围。

实施例

实施例1：细胞因子的克隆

可通过遗传工程领域技术人员可利用的各种方法完成细胞因子的克隆。例如，总RNA或poly-ARNA可从富于特定细胞因子表达的人组织样品(例如淋巴细胞)中纯化，并用作特异性RT-PCR的模板。此外，预制备的cDNA文库可购自商业来源，可采用PCR直接扩增细胞因子cDNA。再者，可以根据国立生物工程学信息中心可获取的序列信息，用其基因检索号构建合成的寡核苷酸以产生细胞因子的合成基因。另外，全长cDNA克隆可获自例如IMAGE克隆集团(image.llnl.gov/)或Openbiosystems(Huntsville，AL)。全长细胞因子cDNA克隆获自Openbiosystems(Huntsville，AL)。克隆的细胞因子的基因检索号见表3。

细胞因子在其N端含有信号肽，该信号肽通常在其分泌形式中丧失，并可通过本领域技术人员可获得的多种工具来鉴定(例如Swiss-Prot蛋白质知识库)。某些细胞因子具有由不同转录所引起的许多变体，这也可通过可获得的工具鉴定。选定细胞因子的序列见上文中的第10小节。

为了有利于快速克隆出具有不同信号肽的细胞因子，使用诱变引物SecTag2c-srfIf(TCCACTGGTGACGCGCCCGGGCCGGCCAGGCGCGCC)(SEQ.ID.NO27)和SecTag2c-srfIr(GGGGCGCCTGGCCGGCCCGGGCGCGTCACCAGTGGA)(SEQ.ID.NO：33)，通过位点定向诱变(QuickChange，Stratagene，Carlsbad，CA)，在具有Igκ前导序列的读框(参见下面的示意图)内导入SrfI限制位点，将适于在哺乳动物细胞(例如CHO和HEK293)中产生分泌的重组蛋白的pSecTag2c(Invitrogen，CarlsbadCA)修饰为pHZsec。参见图27的切割位点示意图。

使用得自Clontech(MountainView，CA)具有设计引物的In-Fusion^TMPCR克隆试剂盒，使分泌形式的细胞因子基因在翻译时与质粒pHZsec的SrfI位点融合。

载体

(A)pHZsec：常用的CMV表达载体对照

基于人巨细胞病毒(CMV)启动子的载体通常用于设计哺乳动物细胞表达系统中所使用的载体。参见例如可获自tools.invitrogen.com/content/sfs/productnotes/F_051025_MammalianExpressionVectors-TS-TL-MKT-HL.pdf的Invitrogen公司的“哺乳动物表达系统”的产品注释，并通过引用结合到本文中。

(B)pHZhag：具有人启动子和人内含子的载体

本文设计的pHZhag载体由人β-肌动蛋白启动子和人β-珠蛋白内含子组成。比起常用的基于CMV的载体，pHZhag载体以高得多的水平表达需要的多核苷酸或基因序列；预料不到的是，表达pHZhag载体的细胞在纯化时具有较高的细胞存活率，并产生较少的污染背景蛋白质。

使用新构建的pHZhag载体和pHZsec载体在人细胞中表达后，对细胞因子TGF-β1的表达特征进行了比较。pHZ-TGF-β1和pHZhag-TGF-β1的表达结果分别参见图11a和图11b。当用各种载体转染的细胞系达到相当的细胞密度和存活率时，然后对TGF-β1表达水平进行了比较。结果表明，与pHZsec的表达水平相比，用pHZhag载体转染的细胞表达TGF-β1的水平高2-3倍。

除了较高的表达外，还有一个预料不到的发现，与pHZsec转染的细胞相比，在第7天到第9天，pHZhag转染细胞具有较高的细胞存活率，pHZsec转染的细胞的存活率在相同时间急剧下降。

仔细来讲，通常在第7天或第8天当细胞中有活力的细胞密度(“VCD”-百万个细胞/毫升)达到3百万个细胞/mL以上(图12a)，存活率(％)达到60％左右(图12b)时，收获培养细胞。然而，pHZhag转染的细胞甚至在第10天仍保持其存活率超过60％(图12d)，VCD为3百万个细胞/mL以上(图12c)。这是用pHZhag载体的预料之外新发现。

(C)pHZA和pHZI：具有人信号肽序列的载体

设计产生十分可靠的人蛋白质的高表达载体的下一个步骤是置换鼠Igκ链前导信号肽序列，该信号肽与人蛋白质信号肽一起广泛用于CHO细胞。本文的结果表明，使用人信号肽序列改进表达水平至少2倍。

候选信号肽序列选自编码血纤蛋白原Aa链(hFbgA)、血纤蛋白原Bb链(hFbgB)、血纤蛋白原g链(hFbgG)和人免疫球蛋白超家族8前体信号肽(hIg8)的基因。蛋白质信息学分析表明，良好的信号肽具有高含量的亮氨酸(L)。在使信号肽与人免疫球蛋白超家族1、2、3和6的信号肽进行比较后，特别选择了hIg8前体信号肽，因为它具有高含量的亮氨酸残基(37％)和5个连续的亮氨酸(LLLLL)。

将各个信号肽编码序列亚克隆至pHZhag载体中，并监测TGFb1的表达。含有血纤蛋白原Aa链信号肽的载体pHZA充分表达TGFβ1。参见图13a泳道4、5和6。表达人Ig8前体信号肽的pHZI载体也充分表达TGFβ1。参见图13a泳道7。

将pHZA-TGFβ1培养到适当的细胞密度，记录其细胞存活率与pHZ-TGFβ1和pHZhag-TGFβ1的相当。表达pHZI和pHZA-TGFβ1的细胞表达TGFβ1的水平比pHZ-TGFβ1的高两倍。参见图13b。

(D)pHZhagA和pHZhagI：具有人启动子、人内含子和人信号肽序列的载体

本文设计了包含人β-肌动蛋白启动子、人内含子序列和上述人信号肽任一种(hFbg信号肽或hIg8信号肽)的载体。

pHZhag-TGF-β1和pHZhagI-TGFβ1的比较数据表明，pHZhagI-TGFb1的表达比pHZhag-TGFβ1的高约两倍，比pHZsec载体的高4倍。使用注明的构建体进行了下列比较表达研究：

启动子比较：pHZ-TGFβ1与pHZhag-TGFβ1；

信号肽比较：pHZ-TGFβ1与pHZI-TGFβ1和pHZhag-TGFβ1与pHZhagI-TGFβ1或pHZhagA-TGFβ1；和

启动子和信号肽组合比较：pHZ-TGFβ1与pHZhagI-TGFβ1或pHZhagA-TGFβ1。

这些载体的示意图参见图14。

实施例2：制备HEK细胞

将人胚肾细胞接种到100mm具有推荐培养基(通常为含有10％胎牛血清/2mML-谷氨酰胺/10mMHEPES/1xMEM非必需氨基酸的DMEM培养基)的培养皿中。细胞以此方式保持3-4代，选出附在平皿上的细胞群。然后将附在平皿上的细胞于平皿中暴露在各种无血清培养基(293SFMII、CD293、FreeStyle293、杂交瘤-SFM(得自Invitrogen)；Ex-Cell293(JRHBiosciences))中达4天，选出在无血清培养基中生长或存活的细胞。然后将这些细胞接种回10％血清培养基中以产生工作细胞库。

(A)适应无血清和化学成分确定的培养基的细胞系

HZ-293TS：HEK293T(或293T)是HEK293细胞遗传变体(ATCCCRL-11268)。采用生产商的试剂(Invitrogen)使该细胞系适应无血清和化学成分确定的培养基。使HEK293T细胞适应于悬液和完全无血清和化学成分确定的培养基是新的方法。在悬液培养物中HZ-293TS的纯度达到至少约5-6百万个细胞/毫升(VCD)(图15b，表)。命名为人细胞系HZ-293TS保藏在ATCC，ATCC生物保藏材料保藏号为____，保藏日为____。

HZ-293TS细胞系可在血清培养基中培养以贴在平皿壁上，以及在无血清和化学成分确定的培养基中培养，以悬浮在摇瓶、旋转器和生物反应器中。该特征可使HZ-293TS细胞作为单层培养物接种在血清培养基中，并进行随后的转染。然后，可使转染细胞直接进行悬液培养，或者可以在像穿梭系统(shuttlesystem)一样的悬液培养之前，在平皿中进行选择。

已有报道称有三种可供悬液培养的293细胞系：HEK293S、FreeStyle293、293EBNA。在这三种细胞系中，与能够用于目标质粒附加型扩增的293T和293EBNA相比，HEK293S和FreeStyle293属于已知重组蛋白的表达低得多的HEK293细胞系。HZ-293TS优于FreeStlye293和293EBNA的其它优势在于稳定表达目标重组蛋白的选定细胞具有多方面的可扩大规模性和连续培养(超过20代而不丧失表达水平)，虽然在悬液293EBNA和FreeStyle293中的转染多为短期内的一次收获。就重组蛋白表达水平而言，为了评价HZ-293TS的特征，采用穿梭方式(shuttleway)，将人FGF8b细胞因子转染至HZ-293TS，并与下面第2节中现有HEK293T系统的表达水平进行了比较。

HZ-293S：使HEK293细胞系(ATCCCRL-1573)适应无血清和化学成分确定的培养基。尚未测定该细胞系的重组蛋白产生。

HZ-293EBNA：使293EBNA细胞系(InvitrogenR6200&7)适应无血清和化学成分确定的培养基。虽然293EBNA像HEK293T一样具有附加型扩增能力，但是在质粒中它需要OriP(EBV复制起点)，这限制了该细胞系的进一步应用。尚未测定该细胞系的重组蛋白表达。

(B)应用HZ-293TS产生重组细胞因子

HZ-293TS细胞系由于易于在悬液培养中维持并适应单层培养，所以测定了其重组蛋白产生的能力，与表达人FGF8b细胞因子编码质粒的HEK293T进行了比较。当两个细胞系达到相当的细胞密度和存活率时，在HZ-293TS细胞中的细胞因子表达出乎意料地比293T的高2-3倍。因此，HZ-293TS成为与293T十分不同的细胞系，这可能是重组细胞因子表达较高的原因。

在本发明的HZ-293TS细胞中以比在HEK293T细胞中高得多的水平表达其它蛋白质，包括但不限于激活素A、FGFbasic、IL-1β、IL-23、VEGF165和TGFβ1的表达。有关FGFbasic和TGFβ1，可参见例如附图中提供的比较数据。

实施例3：转染

在转染前一天，将100mm培养皿的汇合细胞分传到5个培养皿(70～80％汇合)。按照生产商手册，100mm培养皿转染需要500μl无补充的DMEM培养基、10μg质粒DNA和一定量的转染细胞(FuGene6、FuGeneHD(得自Roche)；Lipofectamin、Lipofectamin2000、293fectin(Invitrogen)；聚乙烯亚胺)。将转染材料混合物滴加入培养皿中。

实施例4：抗生素选择

48小时后，在胰蛋白酶处理后经离心收获转染细胞。将细胞沉淀悬浮于5ml新鲜的10％血清培养基中。将100微升重新悬浮的细胞加入装有2ml血清培养基的6孔培养板中，所述培养基含有一定浓度的抗生素(例如400μg/ml或800μg/ml)(新霉素(G418)、潮霉素、零霉素、杀稻瘟菌素)。

每3-4天后，6孔板的培养基用包括抗生素的新鲜培养基更换达2周，然后使转染细胞生长成细胞集落，同时未转染细胞死亡。细胞集落用胰蛋白酶处理后收获，并转移到具有包括四分之一浓度的抗生素的新鲜血清培养基的平板中，使之生长两周。

实施例5：悬液适应

一旦选定的细胞在平板中生长至汇合，便用胰蛋白酶处理以从平板上剥离细胞。在胰蛋白酶处理后收获两个平板量的细胞，并悬浮于10ml包括1％血清和抗生素的无血清培养基(例如CD293)中。适应可耗时8周，根据细胞状况每3-4天更换培养基。随后，将细胞转移到无血清且仅有抗生素的培养基中。该适应耗时至多4周，根据细胞状况每3-4天更换培养基。一旦悬液适应的细胞连续生长到较大规模的生长，便在新鲜的培养基加上10％DMSO中冷冻保存以用于进一步的生产。

实施例6：表达细胞因子的稳定HEK293细胞的转染和建立

按照生产商的建议，在100mm培养皿中使用转染剂FuGene6(Roche)，将细胞因子表达质粒转染至自行进行无血清适应的293细胞系或其衍生物(例如HEK293T、HEK293S和HEK293EBNA)中。使转染细胞在补充了10％BCS、1％MEM非必需氨基酸、1％青霉素-链霉素和2mML-谷氨酰胺的DMEM培养基中生长。48小时后，在胰蛋白酶处理后经离心收获转染细胞。将细胞沉淀悬浮于5ml新鲜的10％血清培养基中。将100微升重新悬浮的细胞加入装有2ml血清培养基与一定浓度的抗生素(例如400μg/ml或800μg/ml零霉素)的6孔培养板中。

每3-4天后，6孔板的培养基用包括抗生素的新鲜培养基更换达2周，然后使转染细胞生长成细胞集落，同时未转染细胞死亡。细胞集落用胰蛋白酶处理后收获，并转移到具有包括四分之一浓度的抗生素的新鲜血清培养基的板中，使之生长两周。

一旦选定的细胞在板中生长至汇合，便用胰蛋白酶处理细胞以从板上剥离。在胰蛋白酶处理后收获两个板量的细胞，并悬浮于10ml包括1％血清和抗生素的无血清培养基(例如CD293)中。适应耗时8周，根据细胞状况每3-4天更换培养基。随后，将细胞转移到无血清且仅有抗生素的培养基中。该适应耗时4周，根据细胞状况每3-4天更换培养基。一旦悬液适应的细胞连续生长到较大规模的生长，便在新鲜的培养基加上10％DMSO中冷冻保存以用于进一步的生产。

实施例7：细胞因子的纯化

人细胞因子通过复杂的翻译后分子机制例如糖基化、磷酸化和多聚化修饰，并且进行复杂的切割和转化过程，根据外露氨基酸序列修饰其内在理化性质并使其特别在无任何标签的情况下难以纯化。本发明包括采用常规层析法的至多3个步骤开发有效的纯化方案，在SDS-PAGE产生的纯度＞95％。纯化方案由俘获固定化金属离子亲和层析法接着纯化，并用离子交换层析法精加工组成。

在生长6天后，经离心收获无血清培养基的上清液，将细胞沉淀悬浮于新鲜的无血清培养基中用于细胞因子的进一步生产。在通过已知分子量用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶或者有蛋白质印迹的PVDF膜上，鉴定细胞因子的表达。为了俘获细胞因子，首先将上清液加到固定化金属亲和层析(IMAC)柱上。根据其性质，一些细胞因子结合到IMAC柱上，而一些则流经该柱。在接下来的步骤中，在缓冲液交换成合成的缓冲条件后，将细胞因子流分合并液加到离子交换层析(IEX)柱上。在最后的精加工步骤中，将细胞因子流分合并液加到另一个IEX或不同的亲和层析(例如肝素树脂)柱上。

在至多3个层析步骤后，通过SDS-PAGE凝胶上的考马斯染色(图7)和通过具有可获得抗体的蛋白质印迹(图8)，断定细胞因子的纯度超过95％。然后，采用本领域技术人员可利用的方法(例如Bradford测定法、凝胶中的考马斯染色和OD280nm)，对纯细胞因子进行了定量测定。在定量后，按照生产商的手册，通过得自Lonza(Allendale，NJ)内毒素检测试剂盒，对细胞因子的内毒素水平进行了分析，根据所需要的量进行等分，冻干用于商业用途。

使用本发明的人细胞表达系统重组产生的GM-CSF、IL-4和IL-6是具有不同程度糖基化的糖蛋白。已公开的和本发明的有效纯化方案得到具有各种异源糖基化的GM-CSF(图17A)，IL-4和IL-6具有高纯度的截然不同的糖基化(图17B图17C)。纯化方案还用来纯化可靠的同二聚体头蛋白(图17D)。

实施例8：活性测定法

根据细胞因子的性质，通过对剂量依赖性细胞毒性(例如TNFα)、刺激增殖(例如IL-2)或抑制其它细胞因子诱导的有效细胞的增殖(例如TGF-β1)的ED₅₀来测定细胞因子的生物活性。参见图6A-M。

实施例9：对得自本发明的人细胞系统和非人类细胞的细胞因子表达进行比较分析

进行了将按照本发明的方法表达的细胞因子的纯度和糖基化程度与在非人类细胞中表达的细胞因子的纯度和糖基化程度相比较的实验。图7和图8表示与非还原和还原的非人类细胞相比，非还原和还原的人细胞中不同细胞因子的SDS-PAGE凝胶分析的并行比较。以这类方式进行比较的细胞因子包括EPO、头蛋白、G-CSF、SCF、GM-CSF、促生长素、IL-2、TGFβ1、IL-4、TNFα、IL-6、VEGF-165和M-CSF。图8表示本发明的人表达系统和非人类表达系统之间相同细胞因子的蛋白质印迹分析比较结果。该数据表明，本发明稳定的人细胞培养物表达的细胞因子的分子量和可靠的三级结构及活性与天然人细胞因子的相当，而与由非人类细胞表达的细胞因子的大小和结构截然不同。此外，针对可靠的细胞因子产生的抗体，由于可靠表位表面的呈递而具有高亲和力结合性质。

实施例10：VEGF165和IL-4比较数据

VEGF165在正常和病理血管生成中起着突出的作用。有研究表明，通过用对VEGF有特异性的单克隆抗体治疗而引起的对VEGF活性的抑制可在体内抑制肿瘤生长。目前，已从包括大肠杆菌和昆虫细胞在内的非人类细胞中生产出市售的VEGF165蛋白试剂。本文公开的本发明方法已被用来由工程改造的人293细胞生产VEGF165。图9表示对大肠杆菌与人细胞表达的VEGF165活性进行的比较，大肠杆菌表达的单体蛋白质的分子量为18kD。与本发明的VEGF165相比，本发明的VEGF165由糖基化所致而作为28kD条带迁移。人和非人类细胞系统的VEGF活性的比较参见图9。

由本发明的稳定人细胞产生的VEGF165的生物活性通过其诱导人脐静脉内皮细胞增殖的能力来测定，结果表明VEGF165的活性比大肠杆菌表达的蛋白质的高6倍。

IL-4在变应性炎症和哮喘的发生中起着至关重要的作用。目前，市售的IL4蛋白质试剂由大肠杆菌生产，其分子量为14kD(图7C)。与人细胞的IL4相比，人细胞的IL4因糖基化所致作为19kD的主要条带迁移。IL-4的生物活性通过剂量依赖性地刺激人TF-1细胞的增殖来测定。如图10所示，IL4的功效比大肠杆菌表达的细胞因子的高4倍。人和非人类细胞系统的IL4活性的比较参见图10。

在大肠杆菌中产生的细胞因子是未糖基化的，可将隐蔽或正常被掩蔽的表位暴露出来。因此，与大肠杆菌产生的蛋白质相比，抗体可能对天然人蛋白质具有不同的亲和力。的确，蛋白质印迹分析表明，针对昆虫细胞的全长蛋白质产生的单克隆抗体识别大肠杆菌的VEGF165蛋白以及可相当于微聚体(micro-aggregate)的其它高反应性种类(图8C)。相比之下，用人细胞形式的只观察到一个条带。针对大肠杆菌的全长蛋白质产生的单克隆抗体在还原条件和非还原条件下识别大肠杆菌的蛋白质。相比之下，用人细胞形式只检测到在非还原条件下的蛋白质。

实施例11：可靠的TGF-β1

转化细胞因子β(TGF-β)是十分多效性的细胞因子，用作细胞转换并调节免疫功能、增殖和上皮间充质转化。这些蛋白质作为前体产生。弗林蛋白酶样转化酶对前蛋白进行加工以产生N端潜在状态相关肽(LAP)和C端成熟TGF-β。LAP和TGF-β的二硫键结合的同二聚体在分泌后保持非共价键缔合，形成小的潜在TGF-β复合物(latentTGF-βcomplex)。LAP与潜在TGF-β结合蛋白共价键结合产生可与胞外基质相互作用的大的潜在复合物。以在CHO细胞中表达的重组蛋白或以从人血小板中纯化出来的天然蛋白质来生产市售的TGF-β蛋白质。由于复合物蛋白水解后修饰，TGF-β的产量低，无法获得经济的批量产品。本文已开发出基于有效的和本发明的人细胞的表达系统，用于大规模生产各种人细胞因子，并由工程改造的人293细胞生产十分可靠的人TGF-β1、β2和β3蛋白。所述蛋白质是非常纯的二硫键连接的25kD二聚体，可有成本效益地进行大规模生产(图18B)。

产生IL-17的CD4+T细胞(Th-17细胞)被鉴定为沿与Th1和Th2细胞分化途径截然不同的途径发生的一种独特Th细胞亚型。该发现为自身免疫病的免疫调节、宿主防御和发病机制提供了令人兴奋的新见解。最新研究表明，IL1β、IL6和IL23在驱动人Th17分化中十分重要。然而有报道称，对鼠Th17细胞分化十分重要的TGF-β1不是必须的，甚至抑制人Th17分化(McGeachy和Cua(2008)Immunity28：445，Chen和O’Shea(2008)Cytokines41：71)。在该项研究中，在得自本发明的人细胞表达系统和从昆虫细胞或细菌表达系统的Th17极化的细胞因子存在下，将从健康供体分离的完整CDE4+细胞用10μg/mL板结合的抗CD3和10μg/ml可溶性抗CD28刺激。5天后，收获上清液，通过ELISA测定IL-17。

结果表明，重组产生的可靠的人IL1β、IL6和IL23在诱导IL-17分泌时明显更有效。更重要的是，它表明重组产生的可靠的人TGF-β1在提高该作用时同样有效。相比之下，得自昆虫细胞的这种细胞因子只显示边缘效应。结果表明，通过使用更可靠的细胞因子，便可更有效地诱导Th17细胞分化，并引导对人生物学过程更准确科学的理解。在相同条件下，对得自本发明的人细胞表达系统的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3(图18B)进行的各项研究表明，所有这三种在生物学上相关的细胞因子可有效地诱导Th17细胞极化(图22E-G)。此外，在另一项研究中，在产IL-17和INF-γ细胞群的流式细胞术分析所提供的幼稚T细胞(Th0)分化成Th17细胞的情况下，在市售的TGF-β1细胞因子当中，仅可靠的TGF-β1(图22H)与人血小板衍生的天然TGF-β1(图22H的‘阳性对照’)相称(图22H)。

实施例12：可靠的VEGF

VEGF165是半胱氨酸节(cysteine-knot)生长因子超家族的成员。该细胞因子刺激内皮细胞的增殖和存活，并促进血管生成和血管通透性。在血管化组织表达的VEGF165在正常和病理血管生成中起着突出作用。有研究表明，通过用对VEGF165有特异性的单克隆抗体治疗而抑制VEGF165活性可在体内抑制肿瘤生长。

目前，由包括大肠杆菌和昆虫细胞在内的非人类细胞生产出市售的VEGF165蛋白。在本文中由工程改造的人293细胞生产可靠的VEGF165。大肠杆菌表达的蛋白质是单体和二聚体的混合物，在SDS-PAGE中的分子量为18kD和38kD。与重组产生的可靠的人VEGF165进行了比较，可靠的人VEGF165由于糖基化和二聚化所致而作为45kD的糖基化条带迁移(图19)。重组产生的可靠的人VEGF165的生物活性通过其诱导人脐静脉内皮细胞增殖的能力来测定。这些结果表明，在同样的生物测定条件下，重组产生的可靠的人VEGF165的活性比大肠杆菌表达的蛋白质的大10倍：对于重组产生的可靠的人VEGF蛋白的ED₅₀为1ng/mL，对于大肠杆菌表达的为10ng/mL(图9)。

实施例13：可靠的EPO

红细胞生成素(EPO)是34kD糖蛋白激素，与血小板生成素有关。该蛋白质通过防止早期红细胞前体(erythroidprecursor)的细胞凋亡而促进红细胞形成。有研究表明EPO的糖基化是体内生物活性所必须的。目前，市售的重组人EPO蛋白由CHO细胞生产。这些重组蛋白不同于天然人EPO，在SDS-PAGE凝胶上具有40kD的较高表观分子量(图20A)，而且中性聚糖含量较低(图20B)。重组产生的可靠的人EPO在本文中由工程改造的人293细胞生产。与文献中(Skibeli等(2001)Blood98：3626)的天然人蛋白质相似，重组产生的可靠的人EPO具有较低的表观分子量和显著较高的中性聚糖含量。此外，与CHO细胞产生的形式相比，重组产生的可靠的人EPO具有更丰富和多样化的聚糖特征。在重组产生的可靠的人EPO中最多的聚糖为四天线复合物类型，而CHOEPO中的为长的二天线复合物类型(图20C)。

实施例14：可靠IL-23

目前，作为异二聚体或融合蛋白的市售的重组IL-23细胞因子由昆虫细胞表达系统生产。重组产生的可靠的人IL-23在本文中在工程改造的人HEK293细胞的稳定细胞培养物中生产。蛋白质表达成为55kD的二硫键连接的异二聚体，且由于稳定培养物的可扩大规模性，因此可以有成本效益地生产和有效的纯化(图18A)。

产IL-17的CD4+T细胞(Th17细胞)被鉴定为沿与Th1和Th2细胞分化途径截然不同的途径发生的一种T辅助细胞的独特亚型。该发现为自身免疫病的免疫调节、宿主防御和发病机制提供了令人兴奋的新见解。最新研究表明，TGF-β1、IL-1β、IL-6和IL-23在驱动人Th17分化中十分重要(Chen和O’Shea(2008)Cytokines41：71)。得自人和昆虫细胞的IL-23的生物活性首先通过得自小鼠脾细胞(用10ng/mlPMA激活)的IL-17的剂量依赖性分泌来测定，结果表明，重组产生的可靠的人IL-23的活性高10倍(图21A)。在Th17极化的细胞因子存在下，用自健康供体分离并用10μg/ml板结合的抗CD3和10μg/ml可溶性抗CD28刺激的人CD4+细胞对活性进行进一步的测定。5天后，收获上清液，通过ELISA测定IL-17。结果显示，在两次独立的研究中，对于诱导IL-17分泌，与10ng/ml昆虫细胞产生的IL-23相比，重组产生的可靠的人IL-23的功效高出100倍，用0.1ng/ml重组产生的可靠的人IL-23达到最大诱导(图21B)。这些结果表明可靠的人细胞表达的细胞因子可以生理上相关的浓度诱导Th17细胞分化。

IL-23是IL12p40和IL23p19的糖基化异二聚体蛋白质。目前，作为异二聚体或融合蛋白的市售的重组IL-23细胞因子由昆虫细胞表达系统生产。可靠的IL-23在本文中由工程改造的人HEK293细胞的稳定细胞培养物生产。蛋白质表达成为55kD的可靠的二硫键连接的二聚体，且由于稳定培养物的可扩大规模性，因此可以有成本效益的方式生产(图18A)。

实施例15：可靠的GM-C5F和IL-4使树突细胞能够无培养基更换而进行分化

在含有5％CO₂的潮湿空气中，将纯的人外周血单核细胞以5×10⁵个细胞/ml在G4DC培养基(有关详情如下)中于37℃培养共7天。以5ng/ml的重组产生的可靠的人GM-CSF和IL-4使用HZG4DC，无需更换培养基，而按常规使用ECG4DC(50ng/ml大肠杆菌GM-CSF和IL-4，在第3天和第5天更换50％培养基)。在第6天，将脂多糖(LPS)加入一半的孔中以诱导DC成熟，而另一半孔用作假处理。在培养结束时(7天)，收获上清液用于细胞因子测定，同时通过流式细胞术对所得到的DC的表面标记、通过FITC-葡聚糖的吞噬作用进行的抗原摄取以及通过同种异型MLR引起的抗原呈递能力进行了分析。

通过Pierce细胞因子阵列测定了DC产生的选定细胞因子和趋化因子特征。数据表明，在成熟前后，在HZG4DC(5ng/ml，未更换培养基)存在下产生的DC的细胞因子和趋化因子特征与在ECG4DC(50ng/ml，更换培养基)存在下产生的DC的一样(图23A)。将在LPS成熟前后在HZG4DC或ECG4DC存在下分化的DC与同种异型人外周血T细胞一起以不同的比率一式三份培养5天。在细胞收获前的最后18小时，用3H-TdR(0.5uCi/孔)对培养物进行脉冲处理。通过β闪烁计数测量T淋巴细胞的增殖。如图23B所示，在HZG4DC或ECG4DC存在下分化的DC刺激同种异型T细胞增殖的能力一样低下，特别当DC∶T之比低时。在LPS诱导成熟后，在两种条件下分化的DC刺激同种异型T细胞增殖的能力提高。在这一方面，在HZG4DC存在下产生的DC似乎比在ECG4DC存在下产生的DC甚至更好(图23B)。因此，与在ECG4DC存在下分化的DC相比，在HZG4DC存在下分化的DC具有相似或更好的抗原呈递能力。

实施例16：可靠的头蛋白

头蛋白是分泌的同二聚体糖蛋白，是骨形态发生蛋白(BMP)的拮抗剂。在无饲养层或条件培养基(但是加入碱性FGF)的情况下对人胚胎干(hES)细胞进行培养期间，加入头蛋白使干细胞保持其未分化的多能状态。市售的头蛋白产品以多种形式生产，但其中无一是可靠的：例如非糖基化蛋白在大肠杆菌中表达；糖基化Fc-融合蛋白在NS0中表达。重组产生的可靠的人头蛋白在本文中在稳定的工程改造的人293细胞表达系统中生产。该蛋白质作为可靠糖基化的二硫键连接的二聚体表达。重组产生的可靠的人同二聚体头蛋白如此有效和持续地表达Oct3/4这种未分化hES细胞的标记，正如与阴性和阳性对照相比(图24泳道1和2)，以10pg/ml的浓度处理(图24泳道3)和20pg/ml处理(图24泳道4)的一样。参见Wang等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，330：934-942(2005)，及Itsykson等，Mol.Cell.Neurosci.30：24-36(2005)，所述文献通过引用分别结合到本文中。

实施例17：可靠G-CSF的单克隆抗体

在大肠杆菌产生的细胞因子不是糖基化的，可将隐蔽或正常被掩蔽的表位暴露出来。同样，在SF9或CHO细胞中产生的细胞因子具有非类似于人的翻译后修饰。由于这些因素，抗体可能具有不同的亲和力，这取决于它们是由人细胞表达的蛋白质抗原产生的还是由非人类细胞表达的蛋白质抗原产生的。

由本发明的人细胞表达系统产生了若干针对G-CSF的单克隆抗体，与SDS-PAGE凝胶上得自大肠杆菌的18kD相比，由其糖基化所致而具有较高的表观分子量22-25kD(图25A)上。在单克隆抗体中，HZmAbG-CSF-1只识别得自人细胞的G-CSF，不识别得自大肠杆菌的G-CSF(图25B)，而HZmAbG-CSF-2识别两种G-CSF(图25C)。这些结果表明，得自人细胞表达系统的重组细胞因子是十分优选的产生抗体的抗原，所述抗体可产生可选择性检测人血清细胞因子的独特表位位点并用作ELISA测定法的标准。

实施例18：可以在本发明的人细胞系统中表达的其它蛋白质

本发明的人表达系统不限于人细胞因子的表达。除人细胞因子以外，人蛋白质也可以在本发明稳定的人细胞表达系统中表达。例如人激酶和人磷酸酶，以及其它人蛋白质和酶也可在本发明的人细胞表达系统中进行可靠地表达，产生可靠的类似于人的重组激酶、磷酸酶、蛋白质和酶。

由于其在胞内通讯中至关重要的作用，蛋白质激酶失调涉及多达400种人类疾病，包括癌症、糖尿病、心脏病、神经系统疾病和类风湿性关节炎。因此，蛋白质激酶对于药物设计和筛选十分重要。目前，激酶主要在非人类细胞(例如大肠杆菌或昆虫细胞)中产生，由于表达系统的限制所致，其中许多需要蛋白质截短和/或体外活化步骤。按照本发明表达作为全长和在体内激活的人蛋白质激酶是可能的。用p38α为例，本文已证实，在本发明的人细胞系统中产生的人蛋白质激酶的性质和抑制特征不同于在非人类细胞系统中产生的同一激酶的形式。

按照本发明，在亚砷酸盐存在下，在人细胞中产生重组产生的可靠的人p38α并激活。将得自商家A和B的样品激酶从大肠杆菌中表达并纯化，通过MKK6体外激活，并再次纯化。SDSPAGE分析表明，在人细胞表达系统中产生的p38α是纯的，主带为60kD，次要带为内源人GST的23kD。这通过MS分析得到了证实，未发现其它污染蛋白质。可靠的p38α的Km.ATP为109±12μM，而商家制品的Km为212±26μM。观察到商家B的酶的Km为120μM。测定了14种已知激酶抑制剂的IC50值。参见表4。虽然对于两种p38α制品，SB-202190(已知的p38α选择性抑制剂)的IC50值相似(分别为0.02μM和0.03μM)，但是在两种制品之间对抑制剂的敏感性存在明显的不同。参见表4。商家A制品只对AMP-PNP(不可水解ATP类似物)敏感。然而，蛋白质的敏感性比p38α的低7倍，这与其较高Km是一致的。另一方面，p38α具有对于星形孢菌素、K252a、Ro31-8220、KT5720和SB-202190的IC50值。商家A的激酶的抑制特征与商家B的相当。参见表4。

附表

表1

表达系统	大肠杆菌	昆虫细胞	CHO细胞	人细胞
					蛋白质折叠	+	++	+++	++++
磷酸化		++	+++	++++
					蛋白水解加工		+	+++	++++
糖基化	-	差	非类似于人	可靠

表2.细胞因子及其活性

表3.示例性细胞因子的基因检索号

细胞因子	基因检索号	细胞因子	基因检索号
				红细胞生成素	BC093628	头蛋白	BC034027
G-CSF	NM_000759	SCF	BC074725
				GM-CSF	BC113999	促生长素	BC075012
IL-2	BC066255	TGF-β1	BC001180
				IL-4	BC067514	TNF	BC028148
IL-6	BC015511	VEGF165	NM_003376
				M-CSF	BC021117

表4.抑制剂IC50值

表5.克隆的细胞因子基因表

激活素A/2xINHbA	GDF5/BMP14	IL 3	TGFβ2
				激活素B/2xINHbB	GDF8/肌生成抑制蛋白	IL 32	TGFβ3
AMH/MIS	GDF9	IL 35	TGFβ4/leftY2/LeftyA
				Artemin	GDNF	IL 4	TNFα
BDNF	GM-CSF	IL 5	TPOα
				BMP15/GDF9B	HGF	IL 6	VEGF121aa
BMP2/BMP2A	IFN-α2A	IL 7	VEGF165aa
				BMP3/成骨蛋白	IFN-α2B	IL 8	WIF1
BMP4/BMP2B	IFN-γ	IL 9	WNT1
				BMP5	IFN-β1	抑制素A/INHa和INHbA	Wnt10A
BMP7/OP-1	IGF I	抑制素B/INHa和INHbB	Wnt10B/12
				β-NGF	IGF II	抑制素C/INHa和INHbC	Wnt11
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C	IGF IIv1	抑制素E/INHa和INHbE	Wnt16
				δ1	IGF IIv2	leftY1/LeftyB	Wnt2
EGF	IL 10	M-CSF	Wnt2B/13
				红细胞生成素(EPO)	IL 11	NODAL	Wnt3
酸性FGF	IL 12	头蛋白	Wnt3A
				碱性FGF	IL 15	NT3(神经营养蛋白3)	Wnt4
FGF10	IL 17	制癌蛋白M	Wnt5A
				FGF5	IL 17F	PDGFα	Wnt5B
FGF7	IL 1β	PDGFβ	Wnt6
				FGF8b	IL 2	外周营养因子	Wnt7A
FLT3配体	IL 23	SCF	Wnt7B
				G-CSF	IL 27	SDF1α	Wnt8B
GDF15	IL 28A/IFNλ2	SHH	Wnt9A/14
				GDF2/BMP9	IL 28B/IFNλ3	促生长素
GDF3	IL 29/IFNλ1	TGFβ1

序列

(1)VEGF165

DNA序列为SEQIDNO：1。

氨基酸序列为SEQIDNO：2。

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(2)G-CSF

DNA序列为SEQIDNO：3。

氨基酸序列为SEQIDNO：4。

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(3)M-CSF

DNA序列为SEQIDNO：5。

氨基酸序列为SEQIDNO：6。

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(4)IL-2

DNA序列为SEQIDNO：7。

氨基酸序列为SEQIDNO：8。

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(5)促生长素

DNA序列为SEQIDNO：9。

氨基酸序列为SEQIDNO：10。

ttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacgctatgctccgcgcccatcgtctg

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(6)TGFb1

DNA序列为SEQIDNO：11。

氨基酸序列为SEQIDNO：12。

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(7)TNFα

DNA序列为SEQIDNO：13。

氨基酸序列为SEQIDNO：14。

gtcagatcatcttctcgaaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccct

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(8)IL6

DNA序列为SEQIDNO：15。

氨基酸序列为SEQIDNO：16。

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(9)红细胞生成素(Epo)

DNA序列为SEQIDNO：17。

氨基酸序列为SEQIDNO：18。

gccccaccacgcctcatctgtgacagccgagtcctggagaggtacctcttggaggccaag

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(10)GM-CSF

DNA序列为SEQIDNO：19。

氨基酸序列为SEQIDNO：20。

gcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccag

APARSPSPSTQPWEHVNAIQ

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(11)IL4

DNA序列为SEQIDNO：21。

氨基酸序列为SEQIDNO：22。

cacaagtgcgatatcaccttacaggagatcatcaaaactttgaacagcctcacagagcag

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VKEANQSTLENFLERLKTIM

agagagaaatattcaaagtgttcgagctgataa

REKYSKCSS--

(12)头蛋白

DNA序列为SEQIDNO：23。

氨基酸序列为SEQIDNO：24。

cagcactatctccacatccgcccggcacccagcgacaacctgcccctggtggacctcatc

QHYLHIRPAPSDNLPLVDLI

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QRRGGQRCGWIPIQYPIISE

tgcaagtgctcgtgctagtaa

CKCSC--

(13)SCF

DNA序列为SEQIDNO：25。

氨基酸序列为SEQIDNO：26。

gaagggatctgcaggaatcgtgtgactaataatgtaaaagacgtcactaaattggtggca

EGICRNRVTNNVKDVTKLVA

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aatccccctggagactccagcctacactgataa

NPPGDSSLH--

SEQIDNO：27

得自CMV载体的人CMV即时早期(IE)增强子

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG

SEQIDNO：28

人β-肌动蛋白启动子

CCGGGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGGTAAGCCCGGCCAGCCGACCGGGGCAGGCGGCTCACGGCCCGGCCGCAGGCGGCCGCGGCCCCTTCGCCCGTGCAGAGCCGCCGTCTGGGCCGCAGCGGGGGGCGCATGGGGGGGGAACCGGACCGCCGTGGGGGGCGCGGGAGAAGCCCCTGGGCCTCCGGAGATGGGGGACACCCCACGCCAGTTCGGAGGCGCGAGGCCGCGCTCGGGAGGCGCGCTCCGGGGGTGCCGCTCTCGGGGCGGGGGCAACCGGCGGGGTCTTTGTCTGAGCCGGGCTCTTGCCAATGGGGATCGCAGGGTGGGCGCGGCGGAGCCCCCGCCAGGCCCGGTGGGGGCTGGGGCGCCATTGCGCGTGCGCGCTGGTCCTTTGGGCGCTAACTGCGTGCGCGCTGGGAATTGGCGCTAATTGCGCGTGCGCGCTGGGACTCAAGGCGCTAACTGCGCGTGCGTTCTGGGGCCCGGGGTGCCGCGGCCTGGGCTGGGGCGAAGGCGGGCTCGGCCGGAAGGGGTGGGGTCGCCGCGGCTCCCGGGCGCTTGCGCGCACTTCCTGCCCGAGCCGCTGGCCGCCCGAGGGTGTGGCCGCTGCGTGCGCGCGCGCCGACCCGGCGCTGTTTGAACCGGGCGGAGGCGGGGCTGGCGCCCGGTTGGGAGGGGGTTGGGGCCTGGCTTCCTGCCGCGCGCCGCGGGGACGCCTCCGACCAGTGTTTGCCTTTTATGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGGGGCGACCTCGGCTCACAGCGCGCCCGGCTATTCTCGCAG

SEQIDNO：29

人β-珠蛋白内含子

CTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTC

SEQIDNO：30

人血纤蛋白原α链信号肽(切割位点位于3’端tgac的核苷酸t和g之间)

atgttttccatgaggatcgtctgcctggtcctaagtgtggtgggcacagcatggactgac

MFSMRIVCLVLSVVGTAWTD

SEQIDNO：31

人免疫球蛋白超家族成员8前体信号肽(切割位点位于3’端cgac的核苷酸c和g之间)

atgggcgccctcaggcccacgctgctgccgccttcgctgccgctgctgctgctgctaatg

MGALRPTLLPPSLPLLLLLM

ctaggaatgggatgctgggccgac

LGMGCWAD

SEQIDNO：32

HumanZyme载体-1

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGCCGGGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGGTAAGCCCGGCCAGCCGACCGGGGCAGGCGGCTCACGGCCCGGCCGCAGGCGGCCGCGGCCCCTTCGCCCGTGCAGAGCCGCCGTCTGGGCCGCAGCGGGGGGCGCATGGGGGGGGAACCGGACCGCCGTGGGGGGCGCGGGAGAAGCCCCTGGGCCTCCGGAGATGGGGGACACCCCACGCCAGTTCGGAGGCGCGAGGCCGCGCTCGGGAGGCGCGCTCCGGGGGTGCCGCTCTCGGGGCGGGGGCAACCGGCGGGGTCTTTGTCTGAGCCGGGCTCTTGCCAATGGGGATCGCAGGGTGGGCGCGGCGGAGCCCCCGCCAGGCCCGGTGGGGGCTGGGGCGCCATTGCGCGTGCGCGCTGGTCCTTTGGGCGCTAACTGCGTGCGCGCTGGGAATTGGCGCTAATTGCGCGTGCGCGCTGGGACTCAAGGCGCTAACTGCGCGTGCGTTCTGGGGCCCGGGGTGCCGCGGCCTGGGCTGGGGCGAAGGCGGGCTCGGCCGGAAGGGGTGGGGTCGCCGCGGCTCCCGGGCGCTTGCGCGCACTTCCTGCCCGAGCCGCTGGCCGCCCGAGGGTGTGGCCGCTGCGTGCGCGCGCGCCGACCCGGCGCTGTTTGAACCGGGCGGAGGCGGGGCTGGCGCCCGGTTGGGAGGGGGTTGGGGCCTGGCTTCCTGCCGCGCGCCGCGGGGACGCCTCCGACCAGTGTTTGCCTTTTATGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGGGGCGACCTCGGCTCACAGCGCGCCCGGCTATTCTCGCAGCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCatgttttccatgaggatcgtctgcctggtcctaagtgtggtgggcacagcatggactgacGCGCCCGGGCCGGCCAGGCGCGCGCGCCGTACGTACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGGAGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGA

SEQIDNO：33

HumanZyme载体-2(下划线＝hCMVIE增强子；粗体字＝人β-肌动蛋白启动子；斜体字＝人免疫球蛋白超家族成员8前体信号肽)

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGT TACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCC ATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACG TCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGAC GTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACG TATTAGTCATCGCTATTACCATGGCCGGGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGGTAAGCCCGGCCAGCCGACCGGGGCAGGCGGCTCACGGCCCGGCCGCAGGCGGCCGCGGCCCCTTCGCCCGTGCAGAGCCGCCGTCTGGGCCGCAGCGGGGGGCGCATGGGGGGGGAACCGGACCGCCGTGGGGGGCGCGGGAGAAGCCCCTGGGCCTCCGGAGATGGGGGACACCCCACGCCAGTTCGGAGGCGCGAGGCCGCGCTCGGGAGGCGCGCTCCGGGGGTGCCGCTCTCGGGGCGGGGGCAACCGGCGGGGTCTTTGTCTGAGCCGGGCTCTTGCCAATGGGGATCGCAGGGTGGGCGCGGCGGAGCCCCCGCCAGGCCCGGTGGGGGCTGGGGCGCCATTGCGCGTGCGCGCTGGTCCTTTGGGCGCTAACTGCGTGCGCGCTGGGAATTGGCGCTAATTGCGCGTGCGCGCTGGGACTCAAGGCGCTAACTGCGCGTGCGTTCTGGGGCCCGGGGTGCCGCGGCCTGGGCTGGGGCGAAGGCGGGCTCGGCCGGAAGGGGTGGGGTCGCCGCGGCTCCCGGGCGCTTGCGCGCACTTCCTGCCCGAGCCGCTGGCCGCCCGAGGGTGTGGCCGCTGCGTGCGCGCGCGCCGACCCGGCGCTGTTTGAACCGGGCGGAGGCGGGGCTGGCGCCCGGTTGGGAGGGGGTTGGGGCCTGGCTTCCTGCCGCGCGCCGCGGGGACGCCTCCGACCAGTGTTTGCCTTTTATGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGGGGCGACCTCGGCTCACAGCGCGCCCGGCTATTCTCGCAGCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCatgggcgccctcaggcccacgctgctgccgccttcgctgccgctgctgctgctgctaatgctaggaatgggatgctgggccgacGCGCCCGGGCCGGCCAGGCGCGCGCGCCGTACGTACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGGAGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGA

Claims

1.一种表达载体，所述表达载体含有包含下列有效连接的表达元件的盒：

(A)SEQIDNO：27所示的巨细胞病毒增强子元件序列；

(B)SEQIDNO：28所示的人β-肌动蛋白启动子序列；

(C)SEQIDNO：29所示的人珠蛋白基因内含子序列；和

(D)SEQIDNO：30或SEQIDNO：31所示的人信号肽序列，其中所述载体能够使位于信号肽序列和人β-肌动蛋白启动子下游的需要的多核苷酸表达。

2.权利要求1的表达载体，其中需要的多核苷酸与元件(A)、(B)、(C)和(D)有效连接。

3.权利要求1的表达载体，其中(i)所述需要的多核苷酸与位于表达载体上人信号肽序列下游的终止信号序列有效连接，或(ii)所述需要的多核苷酸本身包含终止信号序列。

4.权利要求1的表达载体，其中需要的多核苷酸编码选自以下的细胞因子：EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、头蛋白、SCF、促生长素、TGFβ1、TNFα和VEGF-165。

5.一种用于产生可靠的人蛋白质的重组方法，所述方法包括将权利要求1的表达载体导入HEK293细胞，其中所述需要的多核苷酸编码选自以下的细胞因子：EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、M-CSF、头蛋白、SCF、促生长素、TGFβ1、TNFα和VEGF-165，其中所述需要的多核苷酸在HEK293细胞中的表达产生可靠的人蛋白质，其中所述可靠的人蛋白质在至少生物学活性、结构、分子量、糖基化形式和翻译后修饰方面具有天然形式的相同蛋白质的特征。

6.权利要求5的重组方法，所述方法还包括从HEK293细胞中分离出可靠的人蛋白质。

7.权利要求6的重组方法，所述方法还包括使HEK293细胞的提取物流过固定化金属亲和层析柱以分离出可靠的人蛋白质。

8.权利要求5的重组方法，其中所述需要的多核苷酸编码无HIS标签的多肽或蛋白质。

9.权利要求8的重组方法，所述方法还包括使HEK293细胞的提取物流过IMAC柱以分离出可靠的人蛋白质。

10.一种人细胞，所述人细胞包含权利要求1的表达载体，其中所述细胞不直接来源于人胚胎。

11.权利要求1的表达载体，其中需要的多核苷酸编码小鼠CSF或小鼠SCF。