CN101384620B - 提高生物反应调节蛋白功效的方法和典型变异蛋白 - Google Patents
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Abstract
揭示一种蛋白变体,该蛋白变体是位于通过与相应受体、配体或底物结合有生物反应调节功能蛋白结合区的苯丙氨酸被缬氨酸所取代生成的。同时,本发明揭示编码该蛋白变体的DNA,结合DNA的重组表达载体,转移或转染重组表达载体的宿主细胞,制备蛋白变体的方法,含培养宿主细胞和从培养基中分离蛋白变体的方法。进一步说,本发明揭示一种含蛋白变体的药物配比和药物学可接受载体。
Description
技术领域
本发明研制出一种蛋白质变体,其结合区的苯丙氨酸残基被缬氨酸所取代,在该区域与受体、配体或底物结合能够发挥生物反应修饰功能。更准确地说,本发明研制出一种蛋白质变体,其位于α螺旋区人细胞因子与相应受体结合区的苯丙氨酸残基被缬氨酸所替代。
背景技术
人类许多疾病由蛋白质缺陷或不足引起的功能缺失造成。要治疗这种疾病只须给病人直接服用相应蛋白质。然而,许多有生理活性的蛋白质药用后常常还没到达发挥作用的靶点在血清里就会被降解。因此对于多数有生理活性和治疗价值的蛋白质,患者常常过量、过于频繁服用以维持能够发挥满意治疗效果的适当的浓度水平。
要解决上述问题可以结合聚乙烯乙二醇(聚乙二醇化)或者将有生理活性的蛋白质装入微胶囊。然而这些方法过于繁琐,因为靶蛋白最初由微生物产生,已经经过提纯。此外,计划之外的位点可能会发生交联进而影响最终产品的同质性。
另一种解决途径是糖基化,即对细胞表面蛋白和真核细胞分泌蛋白进行糖基化修饰。它可以影响活体蛋白质稳定性、功能和生理属性。但是因为糖基化蛋白质依赖于具有此功能的真核细胞而且生产过程复杂,难以制造出在所有目标位点都完成糖基化的同质终产品。
此外,传统方法虽然可以降低服药频率,但是不能提高蛋白质的生理功效,这样会导致过量服药。例如,安进公司开发的NESP(参见U.S.Pat.No.6,586,398)通过延长蛋白质血内半排出期来降低服药频率,但是无法增强生理功效而导致过量服用,还可能诱导阻断抗体生成。
通过诱导野生型蛋白质氨基酸残基发生突变能够改善其生物活性。以下特许刊物刊登了相关蛋白质变体:(1)美国,专利号:5,457,089,人红细胞生成素(EPO)变体通过改变羧基末端能够增强与受体结合力。(2)国际专利,出版物号:02/077034,人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)变体,改变T细胞抗原表位降低对人粒细胞集落刺激因子的免疫原性。(3)国际专利,出版物:99/57147,人血小板生成素(TPO)变体,在位点115用赖氨酸、精氨酸或酪氨酸取代谷氨酸,其余从7号到151号位点构成同成熟人血小板生成素。(4)美国,专利号:6,136,563和6,022,711,人生长激素变体在18、22、25、26、29、65、168和174位发生丙氨酸取代。
然而上述蛋白质变体侧重改善治疗效果而没有关注体内抗原性的改变。因此不同规模、程度、位点的改变可能引起不同程度的免疫反应。抗原性可能引起严重的副反应。(Casadevall et al.N.Eng.J.Med.2002,vol.346,p.469).
发明内容
本发明通过增强生物反应修饰蛋白功效、改良制备蛋白变体工艺,提供一种新型生物反应修饰蛋白变体,它的药理活性有所增强,能够最大限度发挥原有功效并能有效防止阻断抗体形成。
一方面,本发明研制出一种蛋白质变体,其结合区的苯丙氨酸残基被缬氨酸所替代,在该区域与受体、配体或底物结合能够发挥生物反应修饰功能。
另一方面,本发明研制出一种编码蛋白变体的DNA,该蛋白变体结合区的苯丙氨酸残基被缬氨酸所替代,在该区域与受体、配体或底物结合能够发挥生物反应修饰功能。
进一步说,本发明研制出一种与编码蛋白变体DNA相结合的重组载体,其结合区的苯丙氨酸残基被缬氨酸所替代,在该区域与受体、配体或底物结合能够发挥生物反应修饰功能。
再进一步,本发明研制出一种被DNA编码蛋白质变体重组载体所转化或转染的宿主细胞,其结合区的苯丙氨酸残基被缬氨酸所替代,在该区域与受体、配体或底物结合能够发挥生物反应修饰功能。
更加深入,本发明研制出一种制备蛋白质变体的方法,包括怎样培养被DNA编码蛋白质变体重组载体所转化或转染的宿主细胞,其结合区的苯丙氨酸残基被缬氨酸所替代,在该区域与受体、配体或底物结合能够发挥生物反应修饰功能,也包括如何从培养基残渣中分离蛋白质变体。
更加准确地说,本发明研制出一种药理成分和一种药理学可接受载体,其中包括蛋白质变体,其结合区的苯基丙氨酸残基被缬氨酸所替代,在该区域与受体、配体或底物结合能够发挥生物反应修饰功能。
附图说明
通过以下详细介绍和附带图纸你可以清楚了解上述和其他目标、该发明特色和其他优点。
图1A显示了位于4-螺旋细胞活素受体结合区域的多氨基酸序列。
图1B显示了位于干扰素受体结合区域的多氨基酸序列。
图2A显示了利用本技术取得的血小板生成素(TPO)变体的免疫印记成像。(从最左边依次为:标记、野生型TPO、TPO-[F46V]、TPO-[F128V]、TPO-[F131V]和TPO-[F141V])
图2B显示了利用本技术取得的红细胞生成素变体(EPO)的免疫印记成像。(从最左边依次为:标记、野生型EPO、EPO-[F48V]、EPO-[F138V]、EPO-[F142V]和EPO-[F148V])
图2C显示了利用本技术取得粒细胞集落刺激因子(G-CSF)变体的免疫印记成像。(从最左边依次为:标记、野生型G-CSF、G-CSF-[F13V]、G-CSF-[F83V]、G-CSF-[F113V]、G-CSF-[F140V]、G-CSF-[F144V]和G-CSF-[F160V])
图3A显示了同野生型TPO相比,利用本技术取得的TPO变体的相对表达水平。
图3B显示了同野生型EPO相比,利用本技术取得的EPO变体的相对表达水平。
图3C显示了同野生型G-CSF相比,利用本技术取得的G-CSF变体的相对表达水平。
图4A通过ELISA化验显示了利用本技术取得的TPO变体与受体结合的亲和力。
图4B通过ELISA化验显示了利用本技术取得的EPO变体与受体结合的亲和力。
图4C通过ELISA化验显示了利用本技术取得的G-CSF变体与受体结合的亲和力。
图4D通过ELISA化验显示了利用本技术取得的GH变体与受体结合的亲和力。
图5A显示了通过SPR化验利用本技术取得的TPO变体与受体结合的亲和力。
图5B显示了通过SPR化验利用本技术取得的EPO变体与受体结合的亲和力。
图6A显示了通过FACS分析,利用本技术取得的TPO变体与受体结合的亲和力。
图6B显示了通过FACS分析,利用本技术取得的EPO变体与受体结合的亲和力。
图7A显示了通过分析利用本技术取得的TPO变体浓度测得的TF-1/c-Mpl细胞增殖率。
图7B显示了通过分析利用本技术取得的EPO变体浓度测得的TF-1细胞增值率。
图7C显示了通过分析利用本技术取得的G-CSF变体浓度测得的HL60细胞增值率。
图7D显示了通过分析利用本技术取得的GH变体浓度测得的Nb2细胞增值率。
图8A显示了利用本技术取得的TPO变体的药物动力学测试,在实验中,给兔子静脉注射TPO变体,并测量其血清水平。
图8B显示了利用本技术取得的EPO变体的药物动力学测试,在实验中,给兔子静脉注射EPO变体,并测量其血清水平。
图8C显示了利用本技术取得的EPO变体的药物动力学测试,在实验中,给小鼠腹膜注射EPO变体,并测量其血清水平。
图9A、9B、9C分别显示了红血球增值率、网状细胞增殖率和血细胞比容变化,反应体内利用本技术取得的EPO变体活性。在实验中给小鼠腹膜注射EPO变体。
图10A、10B、10C分别显示了血小板、白细胞、嗜中性粒细胞增殖率变化,反应活体利用本技术取得的TPO变体活性。在实验中,给小鼠腹膜注射TPO变体。
具体实施方式
依照国际生化联盟关于氨基酸缩写的规定,现用单个大写字母代表相应氨基酸。
A:丙氨酸;B:天冬酰胺酸或天冬氨酸
C:胱氨酸;D:天冬氨酸;E:谷氨酸
F:苯丙氨酸;G:甘氨酸;H:组胺酸
I:异亮氨酸;K:赖氨酸 L:亮氨酸
M:蛋氨酸;N:天冬酰胺酸;P:脯氨酸
Q:谷甘氨酸 R:精氨酸S:丝氨酸
T:苏氨酸;V:缬氨酸;W:色氨酸
Y:酪氨酸 Z:谷氨酰胺或谷氨酸
以下这种命名法“(代表某种氨基酸的大写字母)(氨基酸位点)(代表另一种氨基酸的大写字母)”表示:前一个氨基酸在指定位点被后一个所取代。例如,F48V表明位于某蛋白48位的苯丙氨酸被缬氨酸所取代。氨基酸位点从成熟野生型蛋白质N端算起。
本文中提及的“蛋白质变体”是指氨基酸序列异于野生型的蛋白质,比如某种同受体、配体或底物结合具有生理活性的蛋白质的苯丙氨酸残基被缬氨酸所取代,尤其当这种替代发生在结构域时。方便起见本项发明提及的蛋白质变体命名为:“蛋白质名称-[(代表某种氨基酸的大写字母)(氨基酸位点)(代表另一种氨基酸的大写字母)]”例如,TPO-[F131V]指代一种野生型131位点原苯丙氨酸残基被缬氨酸所取代生成的TPO变体。
“生物反应修饰蛋白”指的是通过诱导、中止、调节发生于多细胞个体中多种多样的生物反应,来维持躯体稳态的一类蛋白,它们通常通过与受体、配体或底物结合来发挥功效。
本项发明能够改变全部通过结合受体、配体或底物具有固有调节生物反应功能的蛋白质。
非限制性蛋白质包括细胞活素及其受体、粘附分子、肿瘤坏死因子(TNF)受体、酶、受体酪氨酸激酶、化学活素受体、其他细胞表面蛋白和可溶性配体。非限制性细胞活素包括CNTF(细胞神经滋养因子)、GH(生长激素)、IL-1,1L-1Ra(白介素-1受体拮抗剂)、胎盘催乳激素(PL)、心磷脂、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、1L-17、TNF、TGF(转化生长因子)、IFN(干扰素)、GM-CSF(粒细胞-单核细胞集落刺激因子)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、EPO(促红细胞生成素)、TPO(血小板生成素)、M-CSF(单核细胞集落刺激因子)、LIF(白血病抑制因子)、OSM(制瘤素-M)、SCF(干细胞因子)、HGF(肝细胞生长因子)、FGF(纤维原细胞生长因子)、IGF(胰岛素样生长因子)和LPT(瘦素)。
非限制性细胞活素受体包括生长激素受体(GHR)、IL-13R、IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、L-5R、IL-6R、L-7R、IL-9R、IL-15R、TNFR、TGFR、IFNR(例如,IFN-γR α链、IFN-γR)、interferon-αR、-βR和-γR、GM-CSFR、G-CSFR、EPOR、cMpl、gpl30和Fas(Apo1)。化学活素受体包括CCR1和CXCR1-4。受体酪氨酸激酶包括TrkA、TrkB、TrkC、Hrk、REK7、Rs e/Tyro-3、肝细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子受体和Flt-1。
其他细胞表面蛋白包括CD2、CD4、CD5、CD6、CD22、CD27、CD28、CD30、CD31、CD40、CD44、CD100、CD137、CD150、LAG-3、B7、B61、β-neurexin、CTLA-4、ICOS、ICAM-1、补体R-2(CD21)、IgER、溶酶体膜gp-1、α2-微球蛋白受体相关蛋白、促尿钠排泄肽受体。
本发明研制出能结合相比野生型有较强疏水性的受体、配体或底物的蛋白质变体,以提高上述多种蛋白质的生物反应调节功能,本发明的特色是在每种蛋白的结构域用缬氨酸取代苯丙氨酸残基。
苯丙氨酸基本上属于非极性氨基酸,有一个芳香支链,疏水指数达到3.0。缬氨酸属于非极性氨基酸,有一个脂肪支链,疏水指数达到4.0。此外,当体积较小的缬氨酸取代苯丙氨酸后,蛋白质可以在镶嵌模式下更紧密地与相应受体、配体或底物结合,增加疏水性、亲和力,进而提高生物反应调节功效。
此外因为用缬氨酸替代苯丙氨酸属于保守替代,对蛋白质的二级和三级结构影响降到最低,这样很少影响蛋白质功能的发挥(Argos,EMBO J.1989,vol.8,pp779-85)。还因为苯丙氨酸主要位于强疏水区域,难以暴露出来,当它被缬氨酸所取代时,缬氨酸的强疏水性会使蛋白质远离表面。因此这种替代诱导抗体产生的恶可能性较小。某种蛋白应当首先同相应受体、配体或底物结合再调节某种生物反应。结合越紧密,调节生物反应功效越强,本项发明可以改造所有相关蛋白质,生产所有蛋白变体。
人自身免疫病NK细胞表达的FcγRIIIa(CD16)发生突变可以证明苯丙氨酸为缬氨酸所取代后蛋白质亲和力增强。人受体蛋白具有基因多形性,即人群分为两组:位于识别抗体配体的Fc段的176位点,一组人是苯丙氨酸,另一组是缬氨酸。受体176位点是苯丙氨酸的个体与抗体配体Fc段结合时亲和力较低,对系统性红斑狼疮易感性很高。(Jianming Wu et al.J.Clin.Invest.1997,vol.100,pp.1059-70)
另一方面,如上所述,本发明特别之处在于位于有生物反应修饰作用蛋白结构域的苯丙氨酸残基为缬氨酸所取代。这里所说的“结构域”是指通过与受体、配体或底物结合能够发挥生物功能蛋白质的一部分(或某区域),相对该蛋白上其他区域,该区域有强疏水性和抵抗原性,该术语在技术领域家喻户晓。例如,用来指代本发明的某些4-α螺旋束细胞活素和干扰素分别具有D-α螺旋结构和A-α螺旋结构,这些结构就是与相应受体结合的结构域。
然而根据本发明更改的结构域不局限于技术领域为人熟知的结构域。因为生物反应调节蛋白与受体、配体或底物的结合同时受到与之直接结合和其它几个氨基酸残基的影响。根据本发明更改的生物反应调节蛋白结构域还包括技术领域为人熟知的结构域中从两端算起的约50个氨基酸残基,或者更适宜说约25个甚至约10个氨基酸残基。
本发明包括通常含有几个α螺旋结构的细胞活素,其中位于N段的第一和最后位螺旋被称作与相应受体结合的结构域(见图1)。技术领域普遍接受细胞活素与相应受体结合的α螺旋因细胞活素种类而异。例如,IL-2第二和第五个螺旋与IL-2受体中的p55α受体结合,第一个螺旋与IL-2受体中的p75γ受体结合,第六个螺旋与γ受体结合。(Fernando Bazan,Science J.1992,vol.257,pp.410-2).如上所述,细胞活素不同的螺旋结构参与与不同受体的结合,但是螺旋结构氨基酸序列很相近。本发明研制出一种细胞活素变体,它位于结构域中的α螺旋的苯丙氨酸残基为缬氨酸所取代,与野生型相比具有更高的受体亲和力。
细胞活素包括4-螺旋束细胞活素家族,例如CNTF、EPO、Flt3L、GM-CSF、IL-2、IL-3、L-4、IL-5、L-6、IL-12p35、LPT、LIF、M-CSF、OSM、PL、SCF、TPO、G-CSF、GHR和IFN。它们都具有四个α螺旋结构,分别命名为A-α螺旋、B-α螺旋、C-α螺旋和D-α螺旋。与受体结合的主要是A-α螺旋和D-α螺旋。(Fernando Bazan,Immunology today,1990,vol.11 pp.350-4,The Cytokine Facts Book,1994,pp.104-247)
上述4-螺旋束细胞活素家族中,CNTF、EPO、Flt3L、GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、L-12p35、LPT、LIF、M-CSF、OSM、PL、SCF、TPO、G-CSF和GHR都包括一个D-α螺旋和C-α螺旋与D-α螺旋的联合区。结合区包括4-螺旋束细胞活素家族中位于110和180位点间的氨基酸残基。综上,本发明研制出一种4-螺旋束细胞活素变体,该家族中位于110和180位点间苯丙氨酸残基为缬氨酸所取代,与野生型相比具有更高的受体亲和力。
上述4-螺旋束细胞活素家族中,干扰素(例如IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IFN-τ)结合区中包含一个A-α螺旋。具体说来,干扰素的结合区包括处于位点1到50间的氨基酸残基。因此,本发明研制出一种干扰素变体,它位于1和50位点间的苯丙氨酸残基为缬氨酸所取代,与野生型相比具有更高的受体亲和力。
另一方面,根据本技术修饰的结合区可能包括两个或以上苯丙氨酸残基,它们可能都会被缬氨酸所取代。然而因为这样会导致蛋白表达水平下降,最好只有一个苯丙氨酸被取代。关于这一点,本发明发现当位于高疏水区域的苯丙氨酸残基被缬氨酸所取代后,生物反应调节蛋白功效会明显改善。因此,本发明选择用位于高疏水区域的苯丙氨酸残基来被缬氨酸所取代。某一氨基酸序列某特殊区域的疏水性可以确定(Kyte,J.et al.J.Mol.Biol.1982,vol.157,pp.105-132,Hopp,T.P.et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1981,vol.78(6),pp.3824-3828)。
可以根据技术领域广为人知的化学合成方法利用本发明来制造生物反应调节蛋白变体(Creighton,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman and Co.,NY 1983)。这里举出几种常用方法,但不限于此,比如液相、固相合成法、片段浓缩法、F-MOC、T-BOC化学合成法(Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins,Williams et al.,Eds.,CRC Press,BocaRaton Florida,1997;A Practical Approach,Atherton & Sheppard,Eds.,IRLPress,Oxford,England,1989)。
本发明改造的生物反应调节蛋白变体也可采用DNA重组技术制备。该技术包括准备编码本发明改造的蛋白变体的DNA序列,可以通过改变编码野生型蛋白的DNA序列来获得。简言之,合成编码野生型蛋白的DNA序列之后,通过点突变使含有苯丙氨酸的密码子变成含有缬氨酸的密码子,以此合成目标DNA序列。
同时,制备编码本发明改造蛋白变体的DNA序列也可通过化学方法,例如利用寡核苷酸合成器。基于目标蛋白变体的氨基酸序列,或者不如说选择产生此种蛋白变体宿主细胞采用的适宜密码子来合成寡核苷酸。技术领域普遍认同遗传密码存在简并性,即有些氨基酸有几个密码子为之编码。本发明涵盖众多简并性编码蛋白变体的DNA序列。
编码本发明改造蛋白变体的DNA序列可能包括也可能不包括编码信号序列的DNA序列。如果存在的话,信号序列应该能够被表达蛋白变体的宿主细胞识别。信号序列可能来自原核或真核细胞,或者同时来自这两种细胞,或者属于固有蛋白的信号序列。通过检测以重组细胞分泌物形式表达的蛋白变体水平可以评价信号序列水平。如果宿主细胞是原核细胞,DNA序列通常不编码信号序列而是更倾向于N端含有蛋氨酸来直接表达目标蛋白。一般采用从野生型蛋白衍生的信号序列。
把用上述方法制备的DNA序列与其它编码本发明改造蛋白的DNA序列结合在一起,插入包含调节结果DNA序列表达的一个或多个表达调控序列的载体。这样宿主细胞就转化或转染有结果重组表达载体。转化株和转染株在适宜DNA序列表达的条件下进行培养。从培养基中取得编码DNA序列的高纯度生物反应调节蛋白变体。
“载体”是指能稳定地将外源性基因携带入宿主细胞的DNA分子。为了方便应用,载体应该能够复制、能够将自身引入宿主细胞并且具有可供选择的标记物。此外,“重组表达载体”是指能将外源性基因带入宿主细胞的环状DNA分子。重组表达质体在被引入宿主细胞后,无论宿主染色体DNA是不是在大量复制都能够自身复制产生异种DNA。技术领域普遍接受:为了提高宿主内传染基因表达水平,该基因应该同宿主表达系统中转录、翻译调节序列合理连接起来。如果表达调控序列和外源性基因能被装入带有细菌选择标记和复制起点的单表达载体,效果会更好。如果选用真核细胞作表达系统,表达载体应该包含适用于真核宿主细胞的表达标记物。
与重组表达载体连用的“表达调控序列”是指对于该发明改造的蛋白变体必要或有益的核苷序列。调控序列可能与编码蛋白变体的核苷序列同源或异源。非限制性表达调控序列包括前导序列、多腺苷酸序列、末端肽、启动子、增强子或上游活化序列、信号肽序列和转录终止子。表达调控序列至少包含一个启动子序列。
“适宜结合”是指不同核苷序列的结合状态能够保障应有功能的正常发挥。核苷序列可能是基因或调控序列,当适宜分子(例如,转录活化蛋白)结合到调控序列时,就可以诱导基因表达。举例来说,如果前序列或分泌前导能够协助成熟蛋白分泌,就称之为“与蛋白结合适宜”。当启动子调节编码序列转录时,它与编码序列结合适宜。如果核糖体结合位点允许编码序列翻译正常进行,就说它与编码序列结合适宜。通常“适宜结合”指核苷序列彼此相连。就分泌型前导序列而言,它的适宜结合是指与编码序列相连,且位于该序列的领头区段。然而增强子不一定要和编码序列相连。核苷序列连接可以在方便的限制酶识别位点完成。没有限制酶识别位点时,可应用传统方法合成的寡核苷酸结合体。
为了表达编码本发明改造蛋白变体DNA序列,有多种宿主细胞和载体重组体可供选择。可用于转化真核宿主细胞的载体包含诸如SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、细胞巨化病毒、逆转录病毒等表达调控序列。细菌宿主载体包含从大肠杆菌中提取的质体(例如pET、pRSET、pBluescript、pGEX2T、pUC、pBR322和pMB9)及其衍生物,来自多种宿主细胞的质体,如RP4、抗菌素DNA,多种λ抗菌素衍生物如λgt10、λgt11和NM989,其它抗菌素DNA如丝状单链DNA抗菌素(例M13)。适用于酵母细胞的表达载体含2μ质体及其衍生物。适用于昆虫细胞的表达载体含pVL 941。
为了表达编码本发明改造蛋白变体DNA序列,这些载体有多种表达调控序列可供选择。这些有用的表达调控序列包括那些与上述载体的结构基因相关的那些序列。有用的表达调控序列包括SV40或腺病毒、乳糖系统、trp系统、TAC或TRC系统的早期和晚期启动子,T3和T7启动子、噬菌体λ操纵子和启动子的主要区域、fd蛋白衣调控区、3-磷酸甘油酯激酶和其它糖酵解酶的启动子、磷脂酶启动子,例如Pho5、酵母α杂交体统启动子、调控原核或/和真核细胞及其病毒基因表达的其他序列。特别地,T7 RNA聚合酶启动子Φ10有助于大肠杆菌多肽的表达。
经上述重组载体转化或转染的宿主细胞还包含本发明的另外一方面成果。有多种单核宿主细胞可以用来表达编码本发明改造蛋白变体的DNA序列。
这样的宿主细胞包括诸如大肠杆菌、假单细胞菌、杆菌、链霉菌、真菌、酵母等原核或真核细胞,诸如SpodoptFrugiperda(Sf9)这样的昆虫细胞,诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或小鼠细胞等动物细胞,非洲绿猴细胞例如:COS1、COS7、BSC1、BSC40或BMT10,人组织培养细胞和植物细胞。常常选用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌和哺乳动物的组织培养细胞作宿主细胞。
可以根据基础实验入门里描述的方法对宿主细胞进行转化或转染(Davis et al.,Bas ic Methods in Molecular Biology,1986;Sambrook,J.,et al.,Basic Methodsin Molecular Biology,1989)。一般采用钙磷酸盐转染法、DEAE右旋糖苷介导转染法、转位法、显微注射、阳离子脂介导转染法、电穿孔法、转导变异、刮载法、弹道介导和感染法将编码本发明改造蛋白变体的DNA序列载入宿主细胞。
在表达编码本发明改造蛋白变体的DNA序列时,所有载体和表达调控序列发挥的功能不尽相同。同样,在同样的表达系统里所有宿主细胞发挥的功能也不尽相同。然而,技术熟练的人不需做很多实验就能选出本发明所要求的适宜的载体、表达调控序列和宿主。例如,选择载体时应该也把宿主考虑在内,因为载体需要能够在宿主内部复制。
应该仔细斟酌载体的复制量、控制复制量的能力、该载体编码的其他蛋白的表达(比如抗体标记物)。同时选择表达调控序列时也应该考虑多方面的因素,比如相对强度、调控能力、与本发明中DNA序列的兼容性,尤其要注意与二级结构相关的因素。选择宿主时应该考虑与载体的兼容性、核苷序列编码产物的毒性、产物的分泌属性、正确折叠多肽链的能力、发酵条件、组织培养条件、核苷序列编码产物是否容易提纯等等。
制备本发明改造蛋白变体的过程中,把宿主细胞放在适宜多肽生存成的营养环境中培养,如摇暖培养,小或大规模实验室或工业发酵桶发酵(要求培养基条件适宜多肽表达和/或分离)。要求培养基按照规范程序配制,含有适量碳、氮和无机盐。培养基可以从供货商那里购得也可依据公布的配比自行配制(如American TypeCulture Collection目录)。如果多肽分泌入培养基,它应该能再直接复原;如果没有分泌入培养基,它应该能从细胞溶解产物中复原。
本发明改造的生物反应调节蛋白变体能通过以下传统方法复原,但不限于这几种方法,如:离心、过滤、提取、喷雾烘干、蒸发或沉淀法。蛋白变体能通过以下传统方法提纯,但不限于这几种方法,如:色谱法(离子交换、亲和力、疏水性、大小筛选)、电泳、差别溶解度(铵硫酸盐沉淀)、SDS-PAGE或提取法。
本发明研制出生产生物反应调节蛋白变体的药物配比和药剂学上可接受的载体。本发明研制出的药物配比是治疗有效剂量。
本发明药物配比中的载体包括制药领域常用的载体、佐剂、赋形剂,这些统称为药剂学可接受载体。本发明药物配比中的非限制性药剂学可接受载体包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲剂(如磷酸钠、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、植物饱和脂肪酸的偏甘油酯混合物)、水、盐、电解质(如硫酸精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素底物、聚乙烯乙二醇、羟甲基纤维素钠盐、多芳基化合物、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-阻断共聚物、聚乙烯乙二醇和羊毛脂。
服用本发明的药物配比可以随意采用常用方式,只要采用该方式能够达到目标组织即可,如局部用药、口服、非肠道使用、眼内使用、经皮、直肠内使用,可制成溶液、悬浮液、药片、药丸、胶囊或缓释形式。非肠道使用包括皮下、鼻内、静脉内、腹膜内、机内、关节内、滑膜内、干内、心内、鞘内、病灶内和颅内注射或灌输技术。
本发明的药物配比可以制备成水溶液采用非肠道服用。如果合理地选用Hank溶液、注射溶液或生理盐等缓冲溶液,效果会更好。注射水悬浊液可以同时补充能够提高粘性的物资,如羧甲基纤维素钠盐、山梨醇、右旋糖苷。此外,有效成分悬浊液如注射油性悬浊液,包括亲脂性溶剂或载体,如芝麻油等脂肪酸和油酸乙酯、甘油三酯、脂质体等合成脂肪酸酯。聚阳离子非脂氨基聚合物也可作为载体。悬浮液可以适当添加稳定剂或药物来增加蛋白变体溶解度,同时获得高浓度蛋白变体溶液。
本发明的药物配比若经过消毒处理,采用注射方式会更好,如制成水性或油性悬浊液进行注射。悬浊液可采用适宜分散或润湿物质(如Tween 80)和悬浮物质。也可以制成消毒供注射溶液或无毒非肠道注射可接受稀释液或溶剂,如1,3-丁二醇溶液。可接受载体和溶剂包括甘露醇、水、注射溶液和等渗氯化钠溶液。此外,习惯上采用消毒的非挥发性油作溶剂或悬浊液溶液。这样可以采用刺激性小的非挥发性油,如合成的单或双甘油酯。另外,油酸、甘油酯衍生物等脂肪酸可以同制药可接受的天然油脂(如橄榄油和蓖麻油)一样用来制备注射用药,尤其是聚氧乙基衍生物。
上述水性配比主要通过滤去细菌、掺入消毒剂或联合应用辐射进行消毒。经过消毒成分会变硬,如通过冰冻烘干来获得变硬的产品,实际应用中,再把它溶于消过毒的水或稀释液中。
与本发明药物配比相关的“治疗有效剂量”是指应用本发明药物成分时治疗疾病时有效成分的剂量达到改善的或治疗的效果。本发明药物配比的治疗有效剂量因病人的年龄、性别、应用部位、服药频率、服药持续时间,药品形式是仿制还是佐剂而异。通常,与野生型蛋白产品相比,服药本发明药物剂量应酌减,如0.01-1000μg/kg/天,更适宜0.1-500μg/kg/天,最好1-100μg/kg/day。
另一方面,技术领域资深人士接受本发明配比类型不同的蛋白适用于治疗不同类型的疾病。作为本发明代表的EPO和TPO可以用来治疗单独的或作为其它疾病并发症(如肠炎、更加严重的肾病、肾衰竭引发的贫血、用齐多夫定(AZT)治疗HIV感染者并发的贫血、肿瘤化疗引发的贫血、亨廷顿疾病(HD)、镰刀型红细胞贫血、子宫交换输血后新生儿次再生性贫血联合Rh溶血性疾病)的贫血。此外,本发明改造的G-CSF可以用来治疗原发性和骨髓移植、肿瘤化疗诱导的嗜中性白血球减少症。GH变体可以用来治疗侏儒症、儿科慢性肾功能衰竭。然而,本发明的应用范畴远不止于此。
以下,本发明研制出4-螺旋束细胞活素缬氨酸取代苯丙氨酸残基生成的干扰素变体,详细地说,包括CNTF、EPO、Flt3L、G-CSF、GM-CSF、GH、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、L-6、IL-12p35、LPT、LIF、M-CSF、OSM、PL、SCF、TPO、IFN-α2A、IFN-α2B、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω和IFN-τ。
另一方面,本发明提供以下蛋白变体:(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)的3、83、98、105、119、152或178位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成CNTF变体。(2)野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)的48、138、142或148位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成EPO变体。(3)野生型Flt3L氨基酸序列(SEQID NO.:3)的6、15、81、87、96或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成Flt3L变体。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:4)的13、83、113、140、144或160位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成G-CSF变体。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)的47、103、106、113或119位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GM-CSF变体。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID NO.:6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GH变体。(7)野生型IFN-α2A氨基酸序列(SEQ ID NO.:7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-α2A变体。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID NO.:8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-a2B变体。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID NO.:9)的8、38、50、67、70、111或154位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-β变体。(10)野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ ID NO.:10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-γ变体。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID NO.:11)的27、36、38、65、68、124或153位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-ω变体。(12)野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ ID NO.:12)的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-τ变体。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO.:13)的42、44、78、103、117或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-2变体。(14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO.:14)的37、61、107、113或133位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-3变体。(15)野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO.:15)的33、45、55、73、82或112位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-4变体。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID NO.:16)的49、69、96或103位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-5变体。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO.:17)的73、77、93、104、124、169或172位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-6变体。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO.:18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-12p35变体。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO.:19)的41或92位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LPT变体。(20)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO.:20)的41、52、67、70、156或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LIF变体。(21)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:21)的35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成M-CSF变体。(22)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO.:22)的56、70、160、169、176或184位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成OSM变体。(23)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO.:23)的10、31、44、52、54、92、97、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成PL变体。(24)野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO.:24)的63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207或245位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成SCF变体。(25)野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:25)的46、128、131、141、186、204、240或286位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成TPO变体。
另一方面,本发明提供以下DNA分子:(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)的3、83、98、105、119、152或178位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成CNTF变体,编码此变体的DNA。(2)野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)的48、138、142或148位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成EPO变体,编码此变体的DNA。(3)野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)的6、15、81、87、96或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成Flt3L变体,编码此变体的DNA。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:4)的13、83、113、140、144或160位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成G-CSF变体,编码此变体的DNA。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)的47、103、106、113或119位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GM-CSF变体,编码此变体的DNA。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID NO.:6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GH变体,编码此变体的DNA。(7)野生型IFN-α2A氨基酸序列(SEQ ID NO.:7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-α2A变体,编码此变体的DNA。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID NO.:8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-a2B变体,编码此变体的DNA。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID NO.:9)的8、38、50、67、70、111或154位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-β变体,编码此变体的DNA。(10)野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ ID NO.:10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-γ变体,编码此变体的DNA。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID NO.:11)的27、36、38、65、68、124或153位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-ω变体,编码此变体的DNA。(12)野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ ID NO.:12)的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-τ变体,编码此变体的DNA。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO.:13)的42、44,、78、103、117或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-2变体,编码此变体的DNA。(14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQID NO.:14)的37、61、107、113或133位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-3变体,编码此变体的DNA。(15)野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO.:15)的33、45、55、73、82或112位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-4变体,编码此变体的DNA。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQID NO.:16)的49、69、96或103位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-5变体,编码此变体的DNA。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO.:17)的73、77、93、104、124、169或172位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-6变体,编码此变体的DNA。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO.:18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-12p35变体,编码此变体的DNA。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO.:19)的41或92位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LPT变体,编码此变体的DNA。(20)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO.:20)的41、52、67、70、156或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LIF变体,编码此变体的DNA。(21)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:21)的35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成M-CSF变体,编码此变体的DNA。(22)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO.:22)的56、70、160、169、176或184位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成OSM变体,编码此变体的DNA。(23)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO.:23)的10、31、44、52、54、92、97、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成PL变体,编码此变体的DNA。(24)野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO.:24)的63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207或245位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成SCF变体,编码此变体的DNA。(25)野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:25)的46、128、131、141、186、204、240或286位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成TPO变体,编码此变体的DNA。
本发明提供以下重组表达载体:(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)的3、83、98、105、119、152或178位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成CNTF变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(2)野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)的48、138、142或148位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成EPO变体,装有编码此变体DNA适宜载体。(3)野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)的6、15、81、87、96或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成Flt3L变体,装有编码此变体DNA适宜载体。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:4)的13、83、113、140、144或160位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成G-CSF变体,装有编码此变体DNA适宜载体。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)的47、103、106、113或119位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GM-CSF变体,装有编码此变体DNA适宜载体。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID NO.:6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GH变体,装有编码此变体DNA适宜载体。(7)野生型IFN-α2A氨基酸序列(SEQ ID NO.:7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-α2A变体,装有编码此变体DNA适宜载体。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID NO.:8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-a2B变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID NO.:9)的8、38、50、67、70、111或154位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-β变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(10)野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ ID NO.:10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-γ变体,装有编码此变体DNA适宜载体。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID NO.:11)的27、36、38、65、68、124或153位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-ω变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(12)野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ ID NO.:12)的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-τ变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO.:13)的42、44、78、103、117或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-2变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO.:14)的37、61、107、113或133位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-3变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(15)野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO.:15)的33、45、55、73、82或112位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-4变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID NO.:16)的49、69、96或103位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-5变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO.:17)的73、77、93、104、124、169或172位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-6变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO.:18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-12p35变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO.:19)的41或92位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LPT变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(20)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO.:20)的41、52、67、70、156或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LIF变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(21)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:21)的35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成M-CSF变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(22)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO.:22)的56、70、160、169、176或184位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成OSM变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(23)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO.:23)的10、31、44、52、54、92、97、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成PL变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(24)野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO.:24)的63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207或245位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成SCF变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。(25)野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:25)的46、128、131、141、186、204、240或286位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成TPO变体,装有编码此变体DNA的适宜载体。
进一步说,本发明提供以下宿主细胞:(1)被编码CNTF变体DNA的适宜载体转染的宿主细胞,CNTF变体由野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)的3、83、98、105、119、152或178位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(2)被编码EPO变体DNA的适宜载体转染的宿主细胞,EPO变体由野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)的48、138、142或148位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(3)被编码Flt3L变体DNA的适宜载体转染的宿主细胞,Flt3L变体由野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ IDNO.:3)的6、15、81、87、96或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(4)被编码G-CSF变体DNA的适宜载体转染的宿主细胞,G-CSF变体由野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:4)的13、83、113、140、144或160位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(5)被编码GM-CSF变体DNA的适宜载体转染的宿主细胞,GM-CSF变体由野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)的47、103、106、113或119位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(6)被编码GH变体的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,GH变体由野生型GH氨基酸序列(SEQ ID NO.:6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GH变体。(7)被编码IFN-α2A变体的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IFN-α2A变体由野生型IFN-α2A氨基酸序列(SEQ ID NO.:7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(8)被编码IFN-a2B变体的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IFN-a2B变体由野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID NO.:8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(9)被编码IFN-β变体的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IFN-β变体由野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID NO.:9)的8、38、50、67、70、111或154位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(10)被编码IFN-γ变体的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IFN-γ变体由野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ IDNO.:10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(11)被编码IFN-ω变体氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IFN-ω变体由野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID NO.:11)的27、36、38、65、68、124或153位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(12)被编码IFN-τ变体氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IFN-τ变体由野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ ID NO.:12)的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(13)被编码IL-2氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IL-2变体由野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO.:13)的42、44、78、103、117或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(14)被编码IL-3氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IL-3变体由野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO.:14)的37、61、107、113或133位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(15)被编码IL-4氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IL-4变体由野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO.:15)的33、45、55、73、82或112位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(16)被编码IL-5氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IL-5变体由野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID NO.:16)的33、45、55、73、82或112位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(17)被编码IL-6氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IL-6变体由野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO.:17)的73、77、93、104、124、169或172位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(18)被编码IL-12p35氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IL-12p35变体由野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO.:18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(19)被编码IL-12p35氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,IL-12p35变体由野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO.:19)的41或92位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(20)被编码LIF氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,LIF变体由野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO.:20)的41、52、67、70、156或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(21)被编码LIF氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,LIF变体由野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO.:21)的35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(22)被编码OSM氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,OSM变体由野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO.:22)的56、70、160、169、176或184位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(23)被编码PL氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,PL变体由野生型PL氨基酸序列(SEQ IDNO.:23)的10、31、44、52、54、92、97、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(24)被编码SCF氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,SCF变体由野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO.:24)的10、31、44、52、54、92、97、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。(25)被编码SCF氨基酸序列的DNA的适宜载体转染的宿主细胞,SCF变体由野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO.:25)的46、128、131、141、186、204、240或286位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成。
进一步说,本发明提供以下制备蛋白变体的方法:(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)的3、83、98、105、119、152或178位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成CNTF变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(2)野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)的48、138、142或148位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成EPO变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(3)野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)的6、15、81、87、96或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成Flt3L变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:4)的13、83、113、140、144或160位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成G-CSF变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)的47、103、106、113或119位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GM-CSF变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID NO.:6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GH变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(7)野生型IFN-α2A氨基酸序列(SEQ ID NO.:7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-α2A变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ IDNO.:8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-a2B变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID NO.:9)的8、38、50、67、70、111或154位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-β变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(10)野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ ID NO.:10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-γ变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID NO.:11)的27、36、38、65、68、124或153位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-ω变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(12)野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ ID NO.:12)的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-τ变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO.:13)的42、44、78、103、117或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-2变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO.:14)的37、61、107、113或133位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-3变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(15)野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO.:15)的33、45、55、73、82或112位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-4变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID NO.:16)的49、69、96或103位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-5变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO.:17)的73、77、93、104、124、169或172位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-6变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO.:18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-12p35变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO.:19)的41或92位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LPT变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(20)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO.:20)的41、52、67、70、156或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LIF变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(21)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:21)的35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成M-CSF变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(22)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO.:22)的56、70、160、169、176或184位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成OSM变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(23)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO.:23)的10、31、44、52、54、92、97、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成PL变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(24)野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO.:24)的63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207或245位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成SCF变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。(25)野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:25)的46、128、131、141、186、204、240或286位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成TPO变体,培养装有编码此变体DNA适宜载体宿主细胞的方法和把它从培养基分离出来的方法。
再进一步说,本发明提供以下药物配比:(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ IDNO.:1)的3、83、98、105、119、152或178位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成CNTF变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(2)野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)的48、138、142或148位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成EPO变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(3)野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)的6、15、81、87、96或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成Flt3L变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:4)的13、83、113、140、144或160位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成G-CSF变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)的47、103、106、113或11位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GM-CSF变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID NO.:6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成GH变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(7)野生型IFN-α2A氨基酸序列(SEQ ID NO.:7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-α2A变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID NO.:8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-a2B变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID NO.:9)的8、38、50、67、70、111或154位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-β变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(10)野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ ID NO.:10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-γ变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID NO.:11)的27、36、38、65、68、124或153位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-ω变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(12)野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ IDNO.:12)的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IFN-τ变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO.:13)的42、44,、78、103、117或124位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-2变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO.:14)的37、61、107、113或133位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-3变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(15)野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO.:15)的33、45、55、73、82或112位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-4变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID NO.:16)的49、69、96或103位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-5变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO.:17)的73、77、93、104、124、169或172位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-6变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO.:18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成IL-12p35变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO.:19)的41或92位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LPT变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(20)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO.:20)的41、52、67、70、156或180位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成LIF变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(21)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO.:21)的35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成M-CSF变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(22)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO.:22)的56、70、160、169、176或184位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成OSM变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(23)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO.:23)的10、31、44、52、54、92、97、146、166、176或191位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成PL变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(24)野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO.:24)的63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207或245位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成SCF变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。(25)野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID NO.:25)的46、128、131、141、186、204、240或286位点上苯丙氨酸残基被缬氨酸取代生成TPO变体,包含此变体的药物配比和制药学可接受载体。
现以TPO、EPO、G-CSF和GH为例来说明本发明改造蛋白变体如何提高化学反应调节功能。很显然对于技术领域人士,本发明可以通过这些例子来阐释,但不仅限于适用于这些例子。
编码TPO/EPO/G-CSF/GH野生型DNA结构
A.编码TPO野生型DNA结构
骨髓组织中添加750μl TRIzol(MRC.,USA)放入微试管离心机室温培养5分钟。往试管中添加200μl氯仿,振荡15秒钟,室温培养2至3分钟,4℃下15,000r/m离心15分钟。取上清液,转入1.5ml试管,添加500μl异丙醇。取样-70℃培养30分钟,4℃下15,000r/m离心15分钟。弃去表面悬浮物,用75%DEPC-乙醇溶液涡流冲洗RNA球状小体,4℃下15,000r/m离心15分钟。弃去表面悬浮物,RNA球状小体室温干燥5分钟,之后溶于50μl DEPC处理过的3°蒸馏水。
2μg mRNA净化提纯方法如上,混合1μl寡dT30引物(10μM,Promega,USA)70℃加热2分钟,立即冰冻降温2分钟。之后,反应混合物中加入200U M-MLV逆转录酶(Promega,USA),10μl 5X反应缓冲剂(250mM Tris-HCl,pH 8.3,375mM KCI,15mM MgCl2,50nM DTT),1μl dNTP(10mM dATP,10mM dTTP,10mM dGTP,10mM dCTP)和DEPC处理过的3°水使总量达到50μl。轻轻混合均匀,42℃培养60分钟。
为了放大cDNA编码野生型TPO活性,选用第一条cDNA作模板,往含有2UpfuDNA聚合酶(Stratagene,USA)、10μl 10X反应缓冲液、1%Triton X-100、1mg/mlBSA、3μl引物1(10μM)、3μl引物2(10μM)、2μl of dNTP(10mM dATP、10mM dTTP、10mM dGTP、10mM dCTP)的PCR试管中添加引物1和引物2(表1),再加入蒸馏水使总量达到10μl。PCR反应所需条件如下:95℃每次3分钟,1轮,接着95℃每次30秒,52C每次1分钟,72C每次1.5分钟,30轮,最后72℃每次10分钟,1轮直至反应彻底结束。
将得到的PCR反应产品分离,放入0.8%琼脂培养基(BMA,USA),用Qiaex II凝胶提取法(Qiagen,USA)提纯。分离出的DNA与15U EcoRI混合后,加入10U NotI、3μl 10X反应缓冲液和3°蒸馏水使总量达到30μl,37℃培养DNA2小时。将PCR反应产品分离,放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化。
将5μg pBluescript KS II(+)载体与15U EcoRI、10U NotI、3μl 10X反应缓冲液混合,加入3°蒸馏水使总量达到30μl,37℃培养DNA2小时。将限制性pBluescript KS II(+)载体分离,放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化。
将100ng消化的pBluescript KS II(+)载体与20ng经同样酶消化的PCR产品混合。将混合物置于16℃水浴16小时,这样就制成了含有编码野生型TPO cDNA的重组载体。接着,把它转入经过氯化铷处理的Top10大肠杆菌(Invitrogen,USA)。转化后的细菌置于包含50μl/ml氨比西林(Sigma,USA)的LB琼脂板培养。隔夜培养,将菌簇置于含有50μl/ml氨比西林的3ml LB介质,37℃培养16小时。用碱溶解法从培养细菌中分离出质粒,用EcoRI/NotI限制检测质粒克隆基因的内容物。
B.克隆编码野生型EPO DNA的方法基本同克隆编码野生型TPO DNA的方法。
取第一条cDNA链作模板,取引物11和引物12来放大(见表2)做编码野生型EPO DNA在PCR反应中的表现。用EcoRI和BamHI核酸内切酶消化PCR产物、克隆载体和pBluescript KS II(+)。将消化的PCR产物和克隆载体结合转入活性大的大肠杆菌Top10(lnvitrogen,USA)。
用碱溶解法从培养细菌中分离出质粒,用EcoRI/BamHI限制检测质粒克隆基因的内容物
C.克隆DNA编码野生型G-CSF的方法与克隆DNA编码野生型TPO的方法类似。
选用健康人的白细胞进行mRNA提取,取引物21和引物22来放大(见表3)编码野生型G-CSF cDNA在PCR反应中的表现。用EcoRI和SmaI核酸内切酶消化PCR产物、克隆载体和pBluescript KS II(+)。将消化的PCR产物和克隆载体结合转入活性大的大肠杆菌E.coli Top10(lnvitrogen,USA)。用碱溶解法从培养细菌中分离出质粒,用SmaI/EcoRI限制检测质粒克隆基因是否存在。
D.编码野生型GH的DNA结构。编码野生型GH的DNA购自ATCC(ATCC No.67097)。在PCR法中采用引物35和引物36(见表4)在cDNA的N末端添加先导序列。再次用PCR法中采用引物37和引物38(见表4)保证全部编码野生型GH的cDNA都能与先导序列结合。用EcoRI和HindiIII核酸内切酶消化PCR产物、克隆载体和pBluescript KS II(+)。用碱溶解法从培养细菌中分离出质粒,用EcoRI/HindiIII限制检测质粒克隆基因是否存在。
例2:编码TPO/EPO/G-CSF/GN突变蛋白cDNA结构
A.编码TPO突变蛋白cDNA结构
在TPO、TPO-[F46V]、TPO-[F128V]、TPO-[F131V]和TPO-[F141V]的各自位点用缬氨酸取代苯丙氨酸可以得到四种突变蛋白。
表1
构建编码野生型TPO以及突变蛋白的cDNA所用引物
制备编码TPO-[F46V]、TPO-[F128V]、TPO-[F131V]和TPO-[F141V]的cDNA时,在一级PCR反应中用到指定引物(见表1)和通用引物T3,在二级PCR反应中用到一级反应产物和通用引物T7。这些反应模板是例1中通过pBluescript KS II(+)克隆制得的编码野生型TPO的cDNA。
一级PCR反应需要2.5U Ex taq(Takara,Japan)、5μl 10X缓冲剂、1mMMgCl2、2.5mM dNTP再加入D.W使总量达到50μl。PCR反应所需条件如下:94℃每次3分钟,1轮,接着95℃每次30秒,60℃每次30秒,72℃每次30秒,30轮,最后72℃每次7分钟,1轮。一级PCR反应产物作为二级反应大引物和通用引物T7(10pmole)一起在二级反应中发挥作用。pBluescript KS II(+)克隆的编码野生型TPO的cDNA在二级反应中作为模板。二级PCR反应需要2.5U Ex taq、5μl 10X缓冲剂、2.5mM dNTP再加入D.W使总量达到50μl。PCR反应所需条件如下:94℃每次3分钟,1轮,接着94℃每次1分钟,58℃每次1分钟,72℃每次1.5分钟,30轮,最后72℃每次7分钟,1轮直至反应结束。
为降低DNA合成过程发生错误的概率,在一级PCR反应中Mg2+浓度降到1mM,大引物体积放大到TPO-[F46V]:280b.p、TPO-[F128V]:520b.p、TPO-[F131V]:530b.p、TPO-[F141V]:560b.p。二级PCR反应应用大引物时,编码所有变异蛋白的cDNA大小都是1062b.p。可以通过直接测序法证实独个TPO变异蛋白核苷酸序列中的苯丙氨酸为缬氨酸所取代。
所有1062b.p大小的PCR产品都被放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化。PCR产品放入15U EcoR1和10U AM 37℃条件中消化2小时。将经消化的PCR产品放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化,再同上与pBluescript KS II(+)结合。含有编码TPO-[F141V]的DNA的重组载体被称为Tefficacin-4,并且依据2003年6月9日达成的布达佩斯条约在KCCM(KoreanCulture Center of Microorganisms)进行沉淀处理。国际信托授权的登记注册号为KCCM-10500。
B.编码EPO突变蛋白的cDNA结构
在EPO、EPO-[F48V]、EPO-[F138V]、EPO-[F142V]和EPO-[F148V]的各自位点用缬氨酸取代苯丙氨酸可以得到四种突变蛋白。
<表2>制备编码野生型EPO和变异蛋白cDNA所用到的引物
制备编码EPO变异蛋白cDNA的方法与制备编码TPO变异蛋白cDNA的方法基本相同。制备编码EPO-[F48V]、EPO-[F138V]、EPO-[F142V]和EPO-[F148V]的cDNA时,在一级PCR反应中用到指定引物(见表2)和通用引物T3,在二级PCR反应中用到一级反应产物和通用引物T7。这些反应模板是例1中通过pBluescript KS II(+)克隆制得的编码野生型EPO的cDNA。
在一级PCR反应中Mg2+浓度调整到1mM,大引物体积放大到EPO-[F48V]:300b.p、EP0-[F138V]:550b.p、EPO-[F142V]:550b.p、EPO-[F148V]:550b.p。二级PCR反应应用大引物时,编码所有变异蛋白的cDNA大小都是580b.p。可以通过直接测序法证实独个EPO变异蛋白核苷酸序列中的苯丙氨酸为缬氨酸所取代。
所有580b.p大小的PCR产品都被放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化。PCR产品放入15U EcoR1和10U BamHI 37℃条件中消化2小时。将经消化的PCR产品同上与pBluescript KS II(+)结合制备表达载体。含有编码TPO-[F141V]的DNA的重组载体被称为Refficacin4,并且依据2003年6月9日达成的布达佩斯条约在KCCM(KoreanCulture Center of Microorganisms)进行沉淀处理。国际授权代码KCCM-10501。
C.编码G-CSF突变蛋白的cDNA结构
在G-CSF、G-CSF[F13V]、G-CSF[F83V]、G-CSF[F113V]、G-CSF[F140V]、G-CSF[F144V]G-CSF[F160V]的各自位点用缬氨酸取代苯丙氨酸可以得到四种突变蛋白。
<表3>制备编码野生型G-CSF和变异蛋白cDNA所用到的引物
制备编码G-CSF变异蛋白cDNA的方法与制备编码TPO变异蛋白cDNA的方法基本相同。制备编码G-CSF[F13V]、G-CSF[F83V]、G-CSF[F113V]、G-CSF[F140V]、G-CSF[F144V]和G-CSF[F160V]的cDNA时,在一级PCR反应中用到指定引物(见表3)和通用引物T3,在二级PCR反应中用到一级反应产物和通用引物T7。这些反应模板是例1中通过pBluescript KS II(+)克隆制得的编码野生型G-CSF的cDNA。
在一级PCR反应中Mg2+浓度调整到1mM,大引物体积放大到G-CSF[F13V]:600b.p、G-CSF[F83V]:390b.p、G-CSF[F113V]:300b.p、G-CSF[F140V]:200b.p、G-CSF[F144V]:200b.p和G-CSF[F160V]:150b.p。二级PCR反应应用大引物时,编码所有变异蛋白的cDNA大小都是640b.p。可以通过直接测序法证实独个G-CSF变异蛋白核苷酸序列中的苯丙氨酸为缬氨酸所取代。
所有640b.p大小的PCR产品都被放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化。PCR产品放入15U SmaI和10U EcoRI 37℃条件中消化2小时。将经消化的PCR产品放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化,再同上与pBluescript KS II(+)结合。含有编码G-CSF-[F140V]的DNA的重组载体被称为Grefficacin4,并且依据2004年5月17日达成的布达佩斯条约在KCCM(KoreanCulture Center of Microorganisms)进行沉淀处理。
国际信托授权的登记注册号为KCCM-10571。
D.编码GH突变蛋白的cDNA结构
在GH、GH-[F44V]、GH-[F97V]、GH-[F139V]、GH-[F146V]、GH-[F166V]和GH-[F176V]的各自位点用缬氨酸取代苯丙氨酸可以得到四种突变蛋白。
<表4>制备编码野生型GH和变异蛋白cDNA所用到的引物
制备编码GH变异蛋白cDNA的方法与制备编码TPO变异蛋白cDNA的方法基本相同。制备编码GH-[F44V]、GH-[F97V]、GH-[F139V]、GH-[F146V]、GH-[F166V]和GH-[F176V]的cDNA时,在一级PCR反应中用到指定引物(见表4)和通用引物T3,在二级PCR反应中用到一级反应产物和通用引物T7。这些反应模板是例1中通过pBluescript KS II(+)克隆制得的编码野生型GH的cDNA。
在一级PCR反应中Mg2+浓度调整到1mM,大引物体积放大到GH-[F44V]:130b.p、GH-[F97V]:300b.p、GH-[F139V]:420b.p、GH-[F146V]:450b.p、H-[F166V]:500b.p和GH-[F176V]:530b.p。可以通过直接测序法证实独个GH变异蛋白核苷酸序列中的苯丙氨酸为缬氨酸所取代。
所有650b.p大小的PCR产品都被放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化。PCR产品放入15U EcoR1和10U HindiIII 37℃条件中消化2小时。将经消化的PCR产品放入0.8%琼脂培养基,用Qiaex II凝胶提取法净化,再同上与pBluescript KS II(+)结合。
例3.TPO变异蛋白的表达和提纯
A.TPO变异蛋白
a.用脂转染法建立转染细胞链。准备中国仓鼠卵巢细胞(″CHO-K1″)(ATCC,CCL61)置于含有Dulbecco修饰Eagle介质(″DMEM″)[Gibco BRL,USA]和10%牛胎血清(″FBS″)的35mm大小的培养皿中,每皿1.5x105个。于37℃5%CO2环境中培养18-24小时。往1.5μg含有编码TPO变异蛋白DNA重组表达载体的消毒试管中添加6μl脂质体转染试剂。添加不含血清的DMEM使混合物总量达到100μl,室温培养45分钟。将在35mm培养皿中生长的细胞用不含血清的DMEM清洗两次,再加入800μl不含血清的DMEM。将冲洗过的细胞轻轻覆盖在脂质体转染试剂-DNA复合体,于37℃5%CO2环境中培养5小时,之后往转染细胞中加入1ml含有20%FBS的DMEM,于37℃5%CO2环境中培养18-24小时。接着将转染细胞用不含血清的DMEM清洗两次,再加入2ml含有10%FBS的DMEM,于37℃5%CO2环境中培养72小时。
b.用ELISA分析TPO变异蛋白的表达水平。用ELISA检验法分析用质体转染的含有编码野生型TPO蛋白和变异蛋白cDNA的表达水平。将山羊抗人TPO多克隆抗体(R&D,USA)用被覆缓冲液[0.1M Sodium bicarbonate,(pH 9.6)]稀释成10μg/ml,接种于96孔培养板中(Falcon,USA),每孔100μl,室温培养1小时。用0.1%Tween-20 1X PBS(PBST)冲洗培养板三次。之后用200μl阻隔缓冲液(1%FBS,5%sucrose,0.05%sodium azide)室温培养1小时,用PBST冲洗三次。
将培养的表面悬浮物(含转染细胞)用稀释缓冲液[0.1%BSA,0.05%Tween-20,1X PBS]连续稀释。25ng/ml重组人TPO[Calbiochem,USA]作正面对照,未转染的CHO-K1培养的表面悬浮物作反面对照,二者同比例稀释。对照组和实验组置于室温培养1小时。培养板用PBST冲洗三次。生物素化山羊抗人TPO抗体(R&D,USA)稀释成0.2μl/mg,接种于96孔培养板中(Falcon,USA),每孔100μl,室温培养1小时。用PBST冲洗培养板三次。将稀释至1∶200的Streptavidin-HRP(R&D,USA)接种于96孔培养板中(Falcon,USA),每孔100μl,室温培养1小时。用PBST冲洗培养板三次。用TMB微孔过氧化酶底物系统(KPL,USA)做染色反应,之后用200ml阻隔缓冲液(1%FBS,5%sucrose,0.05%sodium azide)室温培养1小时,用PBST冲洗三次。在630nm处用酶标仪读出O.D[BIO-RAD,Model 550]。
c.用蛋白质印迹法分析TPO变异蛋白分子量和表达水平。为了去除介质中的FBS使用CHO-S-SFM II(Gibco BRL,USA)培养上述转染细胞。CHO-S-SFMII的培养媒介用0.2μm注射过滤器滤过,用离心装置(Mol.30,000 Millipore,USA)浓缩。做SDS-PAGE实验时,向试验组添加含5%β-巯基乙醇的缓冲剂,加热5分钟。SDS-PAGE实验过程中用到积层凝胶和流动凝胶。
积层凝胶由3.5%丙烯酰胺、0.375M Tris缓冲液(pH6.8)、0.4%SDS组成,流动凝脂由10%丙烯酰胺凝胶、1.5M Tris缓冲液(pH8.8)、0.4%SDS组成。SDS-PAGE流动凝脂处理后,试验组蛋白转移至含有25mM Tris-192mM糖胶(pH 8.3)及20%甲醇混合缓冲液储器里的350mA 4μm Westran(PVDF转移膜,S&S)中,处理两小时。之后用含5%脱脂奶粉的PBST处理10分钟阻断3次。生物酰素山羊抗人TPO抗体(R&D,USA)用阻隔缓冲液稀释成0.25μg/ml,添加3ml该溶液振荡6小时。用冲洗液洗膜三次。链霉抗生物素蛋白-HRP(R&D,USA)用阻隔缓冲液稀释成1∶100培养1小时。用冲洗液洗膜三次。用DAB底物(VECTOR LABORATORIES,USA)培养10分钟使蛋白带显像。将膜浸入去离子水终止反应。
图2a中TPO野生型和变异蛋白的分子量相同,都是55kD。
图3a显示了TPO野生型和变异蛋白的相对表达水平。
TPO变异蛋白的表达水平,对照组是TPO野生型的表达水平。
TPO-[F128V]的表达水平是野生型TPO蛋白的1.4倍。但是TPO-[F46V],-[F131V]和-[F141V]的表达水平分别是野生型TPO蛋白的20%、40%和40%。
B.EPO变异蛋白
将含有编码EPO变异蛋白cDNA的表达载体转染至CHO-K1细胞,每个EPO变异蛋白用ELISA法测试其表达水平。用蛋白质印迹法分析EPO野生型和变异蛋白的分子量。
图2b中EPO野生型和变异蛋白的分子量相同,都是45kD。
图3b显示了EPO野生型和变异蛋白的相对表达水平。
EPO-[F48V]和-[F138V]表达水平分别是野生型EPO蛋白的1.4倍和1.2倍。但是EPO-[F142V]和-[F148V]的表达水平分别是野生型EPO蛋白的20%和30%。
C.G-CSF变异蛋白
将含有编码G-CSF变异蛋白cDNA的表达载体转染至CHO-K1细胞,每个G-CSF变异蛋白用ELISA法测试其表达水平。用蛋白质印迹法分析G-CSF野生型和变异蛋白的分子量。
图2c中G-CSF野生型和变异蛋白的分子量相同,都是50kD。
图3c显示了G-CSF野生型和变异蛋白的相对表达水平。G-CSF变异蛋白的表达水平与野生型G-CSF蛋白表达水平相似。G-CSF变异蛋白-[F83V]是野生型G-CSF蛋白的1.9倍。但是G-CSF变异蛋白-[F140V]和-[F144V]的表达水平分别是野生型G-CSF蛋白的50%和70%。
D.GH变异蛋白
将含有编码GH变异蛋白cDNA的表达载体转染至CHO-K1细胞。
GH变异蛋白的表达方法同TPO变异蛋白的表达方法。
例4.编码EPO、TPO、G-CSF和GH受体的DNA结构
A.编码EPO和TPO受体的DNA结构。
构造编码EPO和TPO受体的DNA以分析EPO和TPO变异蛋白的亲和力。编码每个受体细胞外结构域的DNA与编码IgG1 Fc区的DNA结合,这样每个受体细胞外结构域的C端就能够与人IgG1 Fc区的N端结合。在PCR法中,用限制位点EcoRI的有意义引物(引物51)、EPO的先导序列、反意引物(引物52)、EPO受体的3’端和IgG Fc区的5’端来构造编码EPO受体的cDNA。
在PCR法中,用限制位点HindiIII的有意义引物(引物53)、TPO的先导序列、反意引物(引物54)、TPO受体的3’端和IgG Fc区的5’端来结合编码TPO受体的cDNA与IgG1 Fc区。将按照上面介绍的方法制备编码EPO受体的cDNA和编码IgG1 Fc区的DNA装入同一试管混合,这样来诱导共同序列的互补结合。
在PCR法中,用限制位点EcoRI的有意义引物(引物51)、EPO的先导序列、限制位点aI的反意引物(引物55)和IgG Fc区的3’端来结合编码EPO受体的cDNA与IgG1 Fc区。用EcoRI和Xbal来切割PCR产品,随后将产品装入PCR-3表达载体为EPO载体-Fc融合蛋白作准备。
将按照上面介绍的方法制备编码TRO受体的cDNA和编码IgG1 Fc区的DNA装入同一试管混合,这样来诱导共同序列的互补结合。在PCR法中,用限制位点EcoRI的有意义引物(引物53)、EPO的先导序列、用限制位点MaI的反意引物(引物55)和IgGFc区的3’端来结合编码TPO受体的cDNA与IgG1 Fc区。用Hindi和Xbal来切割PCR产品,随后将产品装入PCR-3表达载体为TPO载体-Fc融合蛋白作准备。
<表5>用于将TPO和EPO受体与免疫球蛋白结合的引物
B.编码G-CSF和GH受体的DNA结构。
在PCR法中,用限制位点HindiIII的有意义引物(引物56)、G-CSF的先导序列、用限制位点EcoRI的反意引物(引物57)、G-CSF受体的3’端来构造编码G-CSF受体的cDNA。在PCR法中,用限制位点EcoRI的有意义引物(引物58)、G-CSF的先导序列、用限制位点SpeI的反意引物(引物59)、G-CSF受体的3’端来构造编码GH受体的cDNA。
编码G-CSF受体的PCR产品用HindiIII和EcoRI消化,装入可以购到的克隆载体,用pBluescript KS II(+)处理HindiIII/EcoRI位点。编码GH受体的PCR产品用EcoRI和SpeI消化,装入可以购到的克隆载体,用pBluescript KS II(+)处理EcoRJI SpeI位点。
在PCR法中,用有意义引物(G-CSF:引物60、GH:引物61)、人IgG铰链区5’端的序列和反意引物(引物62)来构造人IgG的Fc区。对于G-CSF受体,编码人IgG的Fc区的PCR产品用EcoRI/XbaI消化,装入可以购到的克隆载体,用pBluescript KS II(+)处理EcoRI/XbaI位点。对于GH受体,编码人IgG的Fc区的PCR产品用SpeI和Xbal消化,装入可以购到的克隆载体,用pBluescript KS II(+)处理SpeI site/Xbal位点。
克隆的编码G-CSF受体的cDNA和人IgG的Fc区用EcoRI/XbaI消化,再结合起来来制备与人IgG的Fc区相连的编码G-CSF受体的DNA。该法制得的DNA用HindIII和XbaI切割,再装入PCR-3表达载体。克隆的编码GH受体的cDNA和人IgG的Fc区用Spell/XbaI消化,再结合起来来制备与人IgG的Fc区相连的编码G-CSF受体的DNA。该法制得的DNA用EcoRI和XbaI切割,再装入PCR-3表达载体。
<表6>用于将G-CSF和GH受体与免疫球蛋白结合的引物
例5.用ELISA法分析细胞活素及其变异蛋白与相应受体结合的亲和力。
A.TPO及其变异蛋白与TPO受体结合的亲和力。选用转染携带TPO变异蛋白基因载体的CHO培养基表面悬浮物质来测量细胞活素与受体间的相互作用。
TPO受体Ig融合蛋白用蛋白A凝胶-4B柱(Pharmacia,Sweden)从转染携带TPO载体Fc融合蛋白基因载体的CHO培养基表面悬浮物质中提纯。将提纯的融合蛋白用被覆缓冲液[0.1M Sodium bicarbonate,(pH 9.6)]稀释成10μg/ml,接种于96孔培养板中(Falcon,USA),每孔100μl,室温培养1小时。用含0.1%Tween-20 IX PBS[PBST]冲洗培养板三次。之后用200μl阻隔缓冲液(1%FBS,5%sucrose,0.05%sodium azide)室温培养1小时,用PBST冲洗三次。
冲洗后,含四种TPO变异蛋白和一种TPO野生型蛋白的培养表面悬浮物质分别连续地用[0.1%BSA,0.05%Tween-20,1XPBS]进行缓冲稀释,接种于96孔含TPO受体Fc融合蛋白的培养板中(Falcon,USA),培养1小时。用PBST冲洗三次。作为正面对照的重组人TPO[Calbiochem,USA]和作为反面对照的未转染CHO-K1培养基表面悬浮物质同比例稀释。用PBST冲洗培养板三次。生物素化山羊抗人TPO抗体(R&D,USA)稀释至0.2μg/ml,接种于96孔培养板中,每孔100μl,室温培养1小时。用PBST冲洗三次。
链霉亲和素-HRP(R&D,USA)稀释至1∶200,接种于96孔培养板中,每孔100μl,室温培养1小时。1小时后用PBST冲洗三次。用TMB微孔过氧化酶底物系统(KPL,USA)做染色反应,在630nm处用酶标仪读出O.D[BIO-RAD,Model 550]。
TPO-[F141V]和TPO-[F131V]与TPO受体的亲和力强于野生型TPO蛋白与其受体的亲和力(表4a)。在所有TPO变异蛋白中TPO-[F141V]与其受体的亲和力最强。
B.EPO和EPO变异蛋白与EPO受体的结合
EPO及其变异蛋白与EPO受体结合的测量方法类似于TPO及其变异蛋白与TPO受体结合的测量方法。
EPO-[F148V]和EPO-[F142V]与EPO受体的亲和力强于野生型EPO蛋白与其受体的亲和力(表4b)。在所有EPO变异蛋白中EPO-[F148V]与其受体的亲和力最强。
C.G-CSF和G-CSF变异蛋白与G-CSF受体的结合。G-CSF及其变异蛋白与G-CSF受体结合的测量方法类似于TPO及其变异蛋白与TPO受体结合的测量方法。
G-CSF-[F140V]、G-CSF-[F144V]和G-CSF-[F160V]与G-CSF受体的亲和力强于野生型G-CSF蛋白与其受体的亲和力(表4c)。在所有G-CSF变异蛋白中G-CSF-[F140V]与其受体的亲和力最强。
D.GH和GH变异蛋白与GH受体的结合。GH及其变异蛋白与GH受体结合的测量方法类似于TPO及其变异蛋白与TPO受体结合的测量方法。
在所有GH变异蛋白中GH-[F139V]与其受体的亲和力最强(表4d)。
例6.用SPR法测量细胞活素及其变异蛋白同相应受体的亲和力
A.TPO及其变异蛋白与TPO受体结合的亲和力。用含CM5传感器芯片的BIAcore3000进行SPR法来测量TPO-[F141V]和TPO-[F131V]与TPO受体的亲和力。用胺耦合化学方法把抗人IgG固定在流式细胞1、2上。用1M氨基乙醇封锁表面使活性基团失活。加入TPO受体Fc融合蛋白使之在30μl/min情况下与抗人IgG结合2分钟,接着引发TPO及其变异蛋白与TPO受体结合的反应。
当配体密度相同时,共振单位(RU)增加意味着亲和力提高。如图5a所示,野生型TPO、TPO-[F141V]和TPO-[F131V]的共振单位分别10RU、30RU和20RU,说明其中TPO-[F141V]亲和力最强。此外,表7显示了野生型和TPO变异蛋白的KD值。
<表7>野生型和TPO变异蛋白结合动力学速率常数的变化
Kon(M-1s-1)×105 | Koff(S-1)×10-2 | KD(uM)=Koff/Kon | Chi2 | 相对亲和力 | |
野生型TPO | 2.42 | 13.7 | 5.66 | 5.81 | 1 |
TPO-[F141] | 12.8 | 0.51 | 0.04 | 6.03 | 141 |
B.EPO变异蛋白
用SPR法测量EPO变异蛋白-[F148V]和EPO-[F 142V]与EPO受体的亲和力。实验步骤类似于测量TPO变异蛋白亲和力的测量方法。
图5b显示用SPR法测量EPO野生型和其变异蛋白与EPO受体的亲和力。图5b显示EPO-[F148V]的共振单位为40RU,EPO-[F142V]的共振单位为30RU,说明其中EPO-[F148V]亲和力最强。此外,表8显示了野生型和EPO变异蛋白的KD值。
<表8>野生型和EPO变异蛋白结合动力学速率常数的变化
Kon(M-1s-1)×105 | Koff(S-1)×10-2 | KD(uM)=Koff/Kon | Chi2 | 相对亲和力 | |
野生型EPO | 1.84 | 8.83 | 4.80 | 4.55 | 1 |
EPO-[F148] | 14.0 | 0.64 | 0.05 | 2.26 | 105 |
例7.用FACS法测量野生型细胞活素及其变异蛋白同相应受体的亲和力
A.建立TF-1/c-Mpl细胞链
用编码c-Mpl的cDNA转染TF-1细胞建立TF-1/c-Mpl细胞链。
用FACS法检验c-Mpl表达。用PBS缓冲液清洗1x106/ml的TF-1/c-Mpl细胞,用TF-1/c-Mpl细胞培养净化c-Mpl鼠抗人单克隆抗体(BD PharMingen,USA)。加入FITC共轭抗鼠IgG(整个分子;Sigma,USA)验证TF-1/c-Mpl细胞表面c-Mpl表达水平。
结果显示,代表TF-1/c-Mpl的曲线较代表TF-1的曲线右移,说明c-Mpl、TPO受体在TF-1/c-Mpl细胞表面得以表达。
B.用FACS法分析TPO变异蛋白
取1x106/ml的TF-1/c-Mpl细胞悬浮于PBS缓冲液,加入TPO野生型和变异蛋白TPO-[F141V],4℃分别培养30-60分钟。
往上述细胞中添加生物素酰化山羊抗人TPO多克隆抗体(R&D,USA),在4℃培养30-60分钟。往上述细胞中添加链霉亲和素-FITC(Sigma,USA),在4℃培养30-60分钟。用PBS缓冲液冲洗两次去掉未反应的链霉亲和素-FITC。细胞悬浮于PBS缓冲液,用EXCALIBUR(BD,U.S.A.)公司生产的流式细胞仪在488nm处观察。
在图6a中,与野生型TPO相比TPO-[F141V]的结合曲线发生右移,说明TPO-[F141V]与受体结合的亲和力强于野生型TPO。
C.用FACS法分析EPO变异蛋白。用FACS法分析EPO变异蛋白的步骤类似于分析TPO变异蛋白的步骤。
在图6b中,与野生型TPO相比EPO-[F148V]的结合曲线发生右移,说明TPO-[F141V1]与受体结合的亲和力强于野生型EPO。
例8.测量TPO、EPO、G-CSF和GH变异蛋白的生物学活性。
A.TPO变异蛋白的细胞增殖检验
采用上文中的TF-1/c-Mpl细胞链来研究TPO野生型和变异蛋白细胞增殖和生物活性的差异。TF-1/c-Mpl生长于含用10%牛胎血清、1ng/ml GM-CSF 37℃5%CO2的DMEM介质中。
分别取RPMI-1640的0.4、1、5、10、20、40、75ng/ml的TPO野生型和变异蛋白,接种到96孔培养板(FALCON,USA)。在96孔培养板中每孔中添加含10%牛胎血清的RPMI-1640,其中含1x104个TF-1/C-Mpl细胞。在37℃5%CO2,20μlP55MTS溶液[3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-arboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt,MTS]中培养4天,加入乙硫吩嗪(PES;promega)培养4小时。在490nm处用酶标仪读出O.D[BIO-RAD,Model 550]。
图7a显示TPO野生型和变异蛋白激发TF-1/c-Mpl细胞增殖时的差异。从0.4ng/ml到75ng/ml的TPO添加到TF-1/c-Mpl细胞中。TPO浓度达到50ng/ml时,细胞增殖率提高。TPO-[F141V]激发TF-1/c-Mpl细胞增殖的能力远远强于野生型蛋白,并且在TPO变异蛋白中生物活性最强。其次为TPO-[F131V],TPO-[F46V]活性与野生型类似。
B.EPO变异蛋白的细胞增殖检验
用EPO依赖性TF-1细胞进行EPO变异蛋白的细胞增殖检验测试其生物活性。EPO变异蛋白的细胞增殖检验步骤类似于TPO变异蛋白的细胞增殖检验步骤。
图7b显示EPO野生型和变异蛋白激发TF-1细胞增殖时的差异。从0.01IU/ml到7IU/lnQ.的EPO添加到TF-1细胞中。EPO-[F148V]激发TF-1细胞增殖的能力远远强于野生型蛋白,并且在EPO变异蛋白中生物活性最强。其次为EPO-[F142V],EPO-[F138V]活性与野生型类似。
<表9>TPO的生物活性
<表10>EPO的生物活性
C.用G-CSF依赖性HL-60细胞进行G-CSF变异蛋白的细胞增殖检验测试其生物活性。G-CSF变异蛋白的细胞增殖检验步骤类似于TPO变异蛋白的细胞增殖检验步骤。
图7c显示G-CSF野生型和变异蛋白在激发HL-60细胞增殖时的差异。从0.4ng/ml到75ng/ml的G-CSF添加到HL-60细胞中。G-CSF-[F140V]激发HL-60细胞增殖的能力远远强于野生型蛋白,并且在G-CSF变异蛋白中生物活性最强。
GH变异蛋白
用GH依赖性NB2细胞进行GH变异蛋白的细胞增殖检验测试其生物活性。GH变异蛋白的细胞增殖检验步骤类似于TPO变异蛋白的细胞增殖检验步骤。
图7d显示GH野生型和变异蛋白在激发NB2细胞增殖时的差异。从0.4ng/ml到75ng/ml的GH添加到NB2细胞中。GH-[F139V]激发NB2细胞增殖的能力远远强于野生型蛋白,并且在GH变异蛋白中生物活性最强。
例9.EPO-和TPO-野生型与变异蛋白的药物动力学资料
研究EPO-和TPO-野生型与变异蛋白药物动力学方面的差异,给兔子(NewZealand White,3kg)静脉注射TPO或TPO变异蛋白,连续取血样,用ELISA法定量测量EPO和TPO浓度。
给小鼠(12weeks,Balb/c,30g)腹膜、静脉注射EPO蛋白,用含肝磷脂的试管收集血样,以3,000r/m离心10分钟。用ELISA法使用含血浆的表面悬浮物质测量EPO和TPO的血液浓度。
给兔子注射5μl/kg TPO野生型蛋白和TPO-[F141V],图8a显示上述两种物质的血浆浓度。TPO-[F141V]比野生型TPO蛋白浓度下降块。由于TPO-[F141V]与受体结合亲和力更强,它更快地从血液转移至周围组织。
给兔子注射1000I.U/kg EPO野生型蛋白和EPO-[F148V],图8b显示上述两种物质的血浆浓度。EPO-[F148V]比野生型EPO蛋白浓度下降快。给小鼠腹膜内注射20I.U/g EPO野生型蛋白和EPO-[F148V],图8c显示上述两种物质的血浆浓度。EPO野生型蛋白初期比EPO-[F148V]弥散速率大,最高血浓度(Cmax)也比后者高。EPO-[F148V1的Cmax持续时间长于野生型TPO。以上结果表明与野生型EPO相比,EPO-[F148V]有更强的疏水性和受体亲和力。综上,相比野生型EPO,EPO-[F148V]弥散入血速度更慢,从血弥散到外周组织速度更快。
<表11>EPO野生型和EPO-[F148V]变异蛋白药物动力学参数
例10.EPO变异蛋白的体内活性。
用小鼠检查EPO野生型和变异蛋白的生物活性。
用700Radγ射线照射小鼠(12weeks Balb/c,20g,Jungang Lab Animal Inc.,Korea)。腹膜内注射50μl含250ng经提纯EPO野生型和变异蛋白的PBS,每天3次。
尾部静脉取血,用一般CBC检验进行血液参数检验。野生型EPO作正面对照,CHO细胞培养表面悬浮物作负面对照。注射后第0、1、2、4、7、10、15、20、25和30天用含EDTA的试管收集血样。
图9显示腹膜内注射EPO野生型和变异蛋白小鼠的CBC结果,来验证红细胞和网状细胞计数的变化。注射EPO-[F148V]的小鼠中红细胞RBC计数(图9a)的变化比注射野生型EPO的小鼠中红细胞计数变化更明显。注射EPO-[F48V]和EPO-[138V]的小鼠中红细胞增加幅度小于注射野生型EPO的小鼠中红细胞增加幅度。网状细胞计数(图9b)和血细胞比容的增加类似于注射EPO-[F148V]的小鼠中红细胞计数的变化。
例11.TPO变异蛋白的体内活性
用小鼠研究TPO野生型和变异蛋白生物活性的差别。
用700Radγ射线照射小鼠(12weeks Balb/c,20g,Jungang Lab Animal Inc.,Korea)。腹膜内注射50μl含250ng经提纯TPO野生型和变异蛋白的PBS,每天3次。
尾部静脉取血,用一般CBC检验进行血液参数检验。野生型TPO作正面对照,CHO细胞培养表面悬浮物作负面对照。注射后第0、1、4、7、10、14、18、23、28和32天用含EDTA的试管收集血样。
图10显示腹膜内注射TPO野生型和变异蛋白的小鼠体内血小板计数(图10a)、白细胞计数(图10b)和嗜中性粒细胞计数(图10c)变化。
注射TPO-[F141V]的小鼠体内血小板增加最为显著,其次为注射TPO-[F131V]的小鼠。注射TPO-[F46V]的小鼠体内血小板变化类似于注射野生型TPO的小鼠。注射TPO-[F128V]的小鼠体内血小板的变化类似于负面对照组注射PBS(图10a)小鼠体内血小板的变化。白细胞计数(图10b)和嗜中性粒细胞计数(图10c)的变化趋势类似于血小板。
根据以上对本发明的介绍,显然:在野生型生物反应调节蛋白与相应受体、配体或底物结合区内,缬氨酸对苯丙氨酸残基的取代能够提高结合亲和力和生物活性,减少针对常规蛋白变体的自身抗体的产生,以此来改良蛋白药物。
Claims (3)
1.一种EPO变体,其中,所述EPO是通过缬氨酸取代SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列的第142或148位的苯丙氨酸残基而被改变。
2.一种DNA,其中,该DNA编码权利要求1所述的EPO变体。
3.一种药物组合物,其中,该药物组合物含有权利要求1所述的EPO变体以及药物学可接受载体。
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