ES2362453T3 - Un procedimiento para mejorar la eficacia de las proteínas modificadoras de la respuesta biológica y muteínas ilustrativas. - Google Patents

Un procedimiento para mejorar la eficacia de las proteínas modificadoras de la respuesta biológica y muteínas ilustrativas. Download PDF

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ES2362453T3 ES04735139T ES04735139T ES2362453T3 ES 2362453 T3 ES2362453 T3 ES 2362453T3 ES 04735139 T ES04735139 T ES 04735139T ES 04735139 T ES04735139 T ES 04735139T ES 2362453 T3 ES2362453 T3 ES 2362453T3
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Abstract

Variante de citoquina de haz de 4 hélices α, caracterizada por la sustitución de fenilalanina por valina en el dominio de unión de la citoquina.

Description

La presente invención se refiere a una variante de proteína en la que la fenilalanina se sustituye por valina en un dominio de unión que tiene una función modificadora de la respuesta biológica por unión a un receptor, ligando o sustrato. Más en particular, la presente invención se refiere a una variante de proteína que sustituye el resto de fenilalanina por valina en un dominio de hélice  que participa en la unión de una proteína citoquina humana a un receptor correspondiente.
Técnica anterior
Muchas enfermedades humanas están causadas por la pérdida de la función de proteínas debido a defectos o una cantidad insuficiente de una proteína. Para tratar dichas enfermedades, se han administrado proteínas relacionadas directamente a los pacientes. Sin embargo, muchas proteínas fisiológicamente activas usadas como medicamentos se degradan fácilmente en el suero antes de que lleguen a los tejidos diana y actúen en los mismos. Por esta razón, la mayoría de las proteínas fisiológicamente activas que tienen valor terapéutico se administran en exceso o frecuentemente a los pacientes para mantener una concentración adecuada capaz de ofrecer efectos terapéuticos satisfactorios.
Un procedimiento para resolver los problemas anteriores es conjugar proteínas fisiológicamente activas con polietilenglicol (PEGilación) o microencapsularlas. Sin embargo, estos procedimientos son difíciles porque las proteínas diana se producen principalmente en microorganismos y se purifican, y después son PEGiladas o microencapsuladas. Además, se puede producir entrecruzamiento en posiciones no deseadas, que pueden afectar negativamente a la homogeneidad de los productos finales.
Otro procedimiento implica la glicosilación. Las proteínas de superficie celular y proteínas secretoras producidas por células eucariotas son modificadas por un proceso de glicosilación. Se sabe que la glicosilación influye en la estabilidad in vivo y función de proteínas, así como en sus propiedades fisiológicas. Sin embargo, puesto que las proteínas glicosiladas sólo pueden ser producidas por células eucariotas capaces de realizar la glicosilación, su procedimiento de producción es complicado, y es difícil conseguir productos finales homogéneos que sean glicosilados en todas las posiciones deseadas.
Además, todas las técnicas convencionales mejoran los problemas asociados con la frecuencia de administración, pero no aumentan la eficacia fisiológica de las proteínas, conduciendo a una dosificación excesiva. Por ejemplo, NESP desarrollado por la Amgen Company (véase la patente de EE.UU. nº 6.586.398) mejora la frecuencia de administración prolongando las semividas de las proteínas en la sangre, pero no aumenta la eficacia de las proteínas, conduciendo a una dosificación excesiva que puede inducir la producción de anticuerpos bloqueantes.
Un procedimiento usado para mejorar la eficacia de las proteínas fisiológicamente activas es mutagenizar algunos restos de aminoácidos de una proteína natural para mejorar la actividad biológica de la proteína. Se describen variantes de proteínas relacionadas en las siguientes publicaciones de patentes: (1) patente de EE.UU. nº 5.457.
089: variantes de la eritropoyetina humana (EPO) en las que la región carboxilo terminal se alteró para aumentar la afinidad de unión de la EPO a su receptor, (2) publicación de patente internacional nº 02/077034: variantes del factor estimulador de colonias de granulocitos humano (G-CSF) en las que se alteró un epítopo de linfocito T para reducir la inmunogenicidad del G-CSF humano en seres humanos; (3) publicación de patente internacional nº 99/57147: variantes de trombopoyetina humana (TPO) preparadas sustituyendo el ácido glutamínico en la posición 115 por lisina, arginina o tirosina en una proteína TPO que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos de aminoácidos 7º al 151º de la TPO madura humana; y (4) patentes de EE.UU. nº 6.136.563 y 6.022.711 que describen variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen sustituciones de alanina en las posiciones 18, 22, 25, 26, 29, 65, 168 y 174.
Sin embargo, las variantes de proteínas mencionadas antes son formas alteradas hechas para mejorar sólo la eficacia terapéutica independientemente de cambios en la antigenicidad in vivo. Por lo tanto, la escala, grado y posición de estas alteraciones tienen un alto potencial para inducir respuestas inmunitarias en seres humanos. La antigenicidad en seres humanos puede causar efectos adversos graves (Casadevall y col. N. Eng. J. Med. 2002, vol. 346, p. 469).
imagen1
Descripción de la invención
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar variantes de proteínas modificadoras de la respuesta biológica que tengan mejor acción farmacológica, que sean capaces de maximizar los efectos modificadores de la respuesta biológica tras la administración y prevenir la formación de anticuerpos bloqueantes mediante una mejora en la eficacia de las proteínas modificadoras de la respuesta biológica convencionales, y procedimientos para preparar dichas variantes.
En un aspecto, la presente invención proporciona una variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, de una proteína que tiene una función modificadora de la respuesta biológica por unión a un receptor, ligando o sustrato.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un ADN de acuerdo con la reivindicación 6.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 7.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11.
Breve descripción de los dibujos
Los objetos, características y otras ventajas anteriores y otros de la presente invención, se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada en conjunto con los dibujos que acompañan, en los que:
La figura 1A es un alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos de dominios que participan en la unión de citoquinas de haces de 4 hélices a los correspondientes receptores;
La figura 1B es un alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos de dominios que participan en la unión de interferones a los correspondientes receptores;
La figura 2A muestra los resultados de la transferencia Western de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención (desde la banda más a la izquierda: marcador, TPO natural; TPO-[F46V]; TPO-[F128V]; TPO-[F131V]; y TPO-[F141V]);
La figura 2B muestra los resultados de la transferencia Western de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención (desde la banda más a la izquierda: marcador, EPO natural; EPO-[F48V]; EPO-[F138V]; EPO-[F142V]; y EPO-[F148V]);
La figura 2C muestra los resultados de la transferencia Western de variantes de G-CSF de acuerdo con la presente invención (desde la banda más a la izquierda: marcador, G-CSF natural; G-CSF-[F13V]; G-CSF-[F83V]; G-CSF[F113V]; G-CSF-[F140V]; G-CSF-[F144V]; y G-CSF-[F160V]);
La figura 3A es una gráfica que muestra los niveles de expresión relativos de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención, comparados con una TPO natural;
La figura 3B es una gráfica que muestra los niveles de expresión relativos de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención, comparados con una EPO natural;
La figura 3C es una gráfica que muestra los niveles de expresión relativos de variantes de G-CSF de acuerdo con la presente invención, comparados con un G-CSF natural;
imagen2
La figura 4A muestra los resultados de un ensayo ELISA de la afinidad de unión de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención a receptores de TPO;
La figura 4B muestra los resultados de un ensayo ELISA de la afinidad de unión de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención a receptores de EPO;
La figura 4C muestra los resultados de un ensayo ELISA de la afinidad de unión de variantes de G-CSF de acuerdo con la presente invención a receptores de G-CSF;
La figura 4D muestra los resultados de un ensayo ELISA de la afinidad de unión de variantes de GH de acuerdo con la presente invención a receptores de GH;
La figura 5A muestra los resultados de un ensayo de SPR de la afinidad de unión de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención a receptores de TPO;
La figura 5B muestra los resultados de un ensayo de SPR de la afinidad de unión de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención a receptores de EPO;
La figura 6A muestra los resultados de un análisis FACS de la afinidad de unión de una variante de TPO de acuerdo con la presente invención a receptores de TPO;
La figura 6B muestra los resultados de un análisis FACS de la afinidad de unión de una variante de EPO de acuerdo con la presente invención a receptores de EPO;
La figura 7A es una gráfica que muestra las velocidades de proliferación de células TF-1/c-Mpl de acuerdo con la concentración de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención;
La figura 7B es una gráfica que muestra las velocidades de proliferación de células TF-1 de acuerdo con la concentración de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención;
La figura 7C es una gráfica que muestra las velocidades de proliferación de células HL-60 de acuerdo con la concentración de variantes de G-CSF de acuerdo con la presente invención;
La figura 7D es una gráfica que muestra las velocidades de proliferación de células Nb2 de acuerdo con la concentración de variantes de GH de acuerdo con la presente invención;
La figura 8A es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo farmacocinético de una variante de TPO de acuerdo con la presente invención, en el que la variante de TPO se inyectó por vía intravenosa a conejos y se midieron los niveles en el suero de la variante de TPO;
La figura 8B es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo farmacocinético de una variante de EPO de acuerdo con la presente invención, en el que la variante de EPO se inyectó por vía intravenosa en conejos y se midieron los niveles en el suero de la variante de EPO;
La figura 8C es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo farmacocinético de una variante de EPO de acuerdo con la presente invención, en el que la variante de EPO se inyectó por vía intraperitoneal en ratones y se midieron los niveles en el suero de la variante de EPO;
Las figuras 9A, 9B y 9C son gráficas que muestran las velocidades de proliferación de eritrocitos, velocidades de proliferación de reticulocitos, y cambios de hematocritos, respectivamente, como resultado de los ensayos para evaluar la actividad in vivo de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención, en ratones a los que se inyectaron variantes de EPO por vía intraperitoneal; y
Las figuras 10A, 10B y 10C son gráficas que presentan las velocidades de proliferación de plaquetas, leucocitos y neutrófilos respectivamente, como resultado de ensayos para evaluar la actividad in vivo de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención, en ratas a las que se inyectaron variantes de TPO por vía intraperitoneal.
imagen3
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Las letras mayúsculas individuales que representan aminoácidos, como se usa en el presente documento, representan los siguientes aminoácidos de acuerdo con las abreviaturas estándar definidas por la Unión Internacional de Bioquímica:
A: Alanina; B: Asparagina o Ácido aspártico;
C: Cisteína; D: ácido aspártico; E: Ácido glutámico;
F: Fenilalanina; G: Glicina; H: Histidina;
I : Isoleucina; K: Lisina; L: Leucina;
M: Metionina; N: Asparagina; P: Prolina;
Q: Glutamina; R: Arginina; S: Serina;
T: Treonina; V: Valina; W: Triptófano;
Y: Tirosina; y Z: Glutamina o Ácido glutámico
La designación “(una letra mayúscula para un aminoácido)(posición de aminoácido)(una letra mayúscula para otro aminoácido)”, como se usa en el presente documento, significa que el primer aminoácido se sustituye por el último aminoácido en la posición de aminoácido designada en una determinada proteína. Por ejemplo, F48V indica que el resto de fenilalanina en la posición 48 de una determinada proteína se sustituye por valina. La posición de aminoácido se numera desde el extremo N de la proteína natural madura.
La expresión “variante de proteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la forma natural, por sustitución de un resto de fenilalanina por valina en una proteína que tiene función fisiológica por unión a un receptor, ligando o sustrato, en particular, en un dominio que participa en la unión a un receptor, ligando o sustrato. En la presente invención, una variante de proteína se designa por conveniencia como “nombre de la proteína-[“(una letra mayúscula para un aminoácido)(posición de aminoácido)(una letra mayúscula para otro aminoácido)]. Por ejemplo, TPO-[F131V] indica una variante de TPO en la que el resto de fenilalanina en la posición 131 de la TPO natural se sustituye por valina.
La expresión “proteínas modificadoras de la respuesta biológica”, como se usa en el presente documento, se refiere a proteínas implicadas en mantener la homeostasis en el cuerpo induciendo el inicio o la parada de diferentes respuestas biológicas que ocurren en el cuerpo multicelular, y en regular las respuestas para estar orgánicamente conectadas entre sí. Estas proteínas típicamente actúan por unión a receptores, ligandos o sustratos.
Las proteínas capaces de ser alteradas de acuerdo con la presente invención incluyen todas las proteínas que tienen función innata para modular las respuestas biológicas por unión a receptores, ligandos o sustratos. Los ejemplos no limitantes de las proteínas incluyen citoquinas, receptores de citoquinas, moléculas de adhesión, receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), enzimas, tirosina quinasas receptoras, receptores de quimioquinas, otras proteínas de superficie celular y ligandos solubles. Los ejemplos no limitantes de citoquinas incluyen CNTF (factor neutrófico ciliar), GH (hormona de crecimiento), IL-1, IL-1Ra (antagonista del receptor de interleuquina-1), lactógeno placentario (PL), cardiolifina, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF, TGF (factor de crecimiento transformante), IFN (interferón), GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos), G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos), EPO (eritropoyetina), TPO (trombopoyetina), M-CSF (factor estimulador de colonias de monocitos), LIF (factor inhibidor de leucemia), OSM (oncostatina-M), SCF (factor de citoblastos), HGF (factor de crecimiento de hepatocitos), FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), IGF (factor de crecimiento insulínico), y LPT (Leptina). Los ejemplos no limitantes de los receptores de citoquinas incluyen receptores de la hormona de crecimiento (GHR), IL-13R, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL15R, TNFR, TGFR, IFNR (p. ej., IFN-R cadena , IFN-R cadena ), interferón-R, -R y -R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMpl, gpl30, y Fas (Apo 1). Los ejemplos de receptores de quimioquinas incluyen CCR1 y CXCRM. Los ejemplos de tirosina quinasas receptoras incluyen TrkA, TrkB, TrkC, Hrk, REK7, Rse/Tyro-3, R de factor de crecimiento de hepatocitos, R de factor de crecimiento derivado de plaquetas y Flt-1. Los ejemplos de otras proteínas de superficie celular incluyen CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61, -neurexina, CTLA-4, ICOS, ICAM-1, complemento R-2 (CD21), IgER, membrana lisosomal gp-1, proteína relacionada con el receptor de microglobulina -2 y receptor de péptido natriurético.
Para mejorar la eficacia de la modulación de las respuestas biológicas para las numerosas proteínas mencionadas antes que tienen función moduladora de la respuesta biológica, la presente invención pretende proporcionar variantes de proteínas capaces de unirse a receptores, ligandos o sustratos que tienen una fuerza hidrófoba mayor que las naturales. Para este propósito, la presente invención se caracteriza por la sustitución del resto de fenilalanina por valina en un dominio de unión de cada una de las proteínas.
imagen4
La fenilalanina es un aminoácido relativamente no polar que tiene una cadena lateral aromática y un índice de hidrofobicidad conocido de 3,0. La valina es un aminoácido hidrófobo no polar que tiene una cadena lateral alifática y un índice de hidrofobicidad conocido de 4,0. Además, puesto que la valina es más pequeña que la fenilalanina, una proteína que sustituye fenilalanina por valina queda más profundamente hundida en el bolsillo de unión a un receptor, ligando o sustrato correspondiente. Por lo tanto, una proteína que sustituye el resto de fenilalanina por valina en un dominio de unión tiene una mayor fuerza hidrófoba y un espacio más profundamente hundido de modo que tiene una mayor afinidad de unión a un receptor ligando o sustrato, conduciendo a un aumento deseado de la eficacia de la modulación de la respuesta biológica.
Además, la sustitución de un resto de fenilalanina por valina, como sustitución conservativa, tiene una influencia mínima en la estructura secundaria o terciaria de una proteína y por lo tanto raramente afecta a la función de la proteína (Argos, EMBO J. 1989, vol. 8, pág. 779-85). Además, debido a que la fenilalanina está principalmente presente en una región muy hidrófoba, raramente está expuesta al exterior. Cuando dicho resto de fenilalanina se sustituye por valina, la proteína queda más profundamente hundida desde la superficie debido a la mayor hidrofobicidad de la valina. Por lo tanto, esta sustitución tiene un menor potencial para inducir la producción de anticuerpos. Una determinada proteína debe unirse principalmente a un receptor, ligando o sustrato correspondiente, para modular una respuesta biológica específica. En el caso de que esta unión sea más fuerte, mejora la eficacia de la modulación de una respuesta biológica, y todas las proteínas relacionadas se pueden alterar de acuerdo con la presente invención, y la presente invención incluye todas las variantes de proteínas resultantes.
El hecho de que dicha sustitución de un resto de fenilalanina por valina conduzca a una mayor afinidad de unión está apoyado por el descubrimiento de una mutación de FcRIIIa (CD16) expresada en células NK en enfermedades autoinmunes humanas. La proteína receptora humana tiene un polimorfismo genético. Es decir, los individuos se dividen en dos grupos: en la posición 176 en una región que participa en el reconocimiento de Fc de un ligando de anticuerpo, un grupo tiene fenilalanina y el otro un tiene valina. Los individuos que tienen fenilalanina en la posición 176 del receptor tienen una afinidad de unión debilitada por la región Fc del ligando de anticuerpo y son muy susceptibles al lupus eritematoso sistémico (LES) (Jianming Wu y col., J. Clin. Invest. 1997, vol. 100, pp. 1059-70).
Por otra parte, como se ha indicado antes, la presente invención se caracteriza por la sustitución de un resto de fenilalanina por valina en un dominio de unión de una proteína moduladora de la respuesta biológica. La expresión “dominio de unión”, como se usa en el presente documento se refiere a una parte (es decir, dominio) de una proteína que realiza su función biológica uniéndose a un receptor, ligando o sustrato, y tiene una hidrofobicidad relativamente alta y baja antigenicidad comparado con otras regiones de la proteína. Los dominios de unión de proteínas son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, algunas citoquinas e interferones de haces de 4 hélices , que se usan en una realización de la presente invención, se sabe que tienen una estructura de hélice D- y una estructura de hélice A-, respectivamente, que sirven como dominios de unión para los correspondientes receptores.
Sin embargo, un dominio de unión alterado de acuerdo con la presente invención no se limita a los dominios de unión conocidos en la técnica. Esto se debe a que en la unión de una proteína moduladora de la respuesta biológica a un receptor, ligando o sustrato, influye, además de los restos de aminoácidos implicados en la unión directa, varios otros restos de aminoácidos. Un “dominio de unión” de una proteína moduladora de la respuesta biológica, alterada de acuerdo con la presente invención, incluye además aproximadamente 50 restos de aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 25 restos de aminoácidos, y más preferiblemente aproximadamente 10 restos de aminoácidos, desde ambos extremos de un dominio de unión conocido en la técnica.
Un aspecto de la presente invención implica citoquinas que contienen típicamente varias estructuras de hélices . Entre ellas, la primera y la última hélice del extremo N son conocidas como dominios de unión que participan en la unión de las citoquinas a los correspondientes receptores de citoquinas (véase la figura 1). Las hélices  responsables de la unión de las citoquinas a los correspondientes receptores difieren de acuerdo con el tipo de citoquina, y son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en la IL-2, la segunda y quinta hélices se unen al receptor p55 entre los receptores de IL-2, la primera hélice se une al receptor p75 entre los receptores de IL-2, y la sexta hélice se une al receptor gamma (Femando Bazan, Science J. 1992, vol. 257, pág. 410-2). Como se ha descrito antes, cada una de las citoquinas tiene hélices particulares que participan en la unión, pero las hélices tienen secuencias de aminoácidos altamente conservadas. La presente invención proporciona una variante de citoquina que es capaz de unirse a un receptor de citoquina con mayor afinidad que una citoquina natural, sustituyendo un resto de fenilalanina por valina en la hélice alfa correspondiente a un dominio de unión de una citoquina.
imagen5
Un aspecto relacionado con las citoquinas implica la familia de citoquinas de haces de 4 hélices. Dichas citoquinas incluyen CNTF, EPO, Flt3L, GM-CSF, IL-2, IL-3, L-4, IL-5, L-6, IL-12p35, LPT, LIF, M-CSF, OSM, PL, SCF, TPO GCSF, GHR e IFN. Estas citoquinas tienen todas 4 hélices alfa, que se denominan hélice alfa-A, hélice alfa-B, hélice alfa-C y hélice alfa-D, respectivamente. Las hélices alfa D y A participan principalmente en la unión a receptores (Fernando Bazar, Immunology today, 1990, vol. 11 pág. 350-4, The Cytokine Facts Book, 1994, pág. 104-247).
Entre las citoquinas de haces de 4 hélices mencionadas, CNTF, EPO, Flt3L, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, L12p35, LIF, M-CSF, OSM, PL, SCF, TPO, G-CSF y GHR, tienen dominios de unión que incluye cada uno una hélice alfa-D y una región de unión a una hélice alfa-C y la hélice alfa-D. Más en particular, los dominios de unión incluyen restos de aminoácidos entre las posiciones 110 y 180 entre los restos de aminoácidos de las citoquinas de haces de 4 hélices. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona una variante de citoquina de haz de 4 hélices que es capaz de unirse a un receptor correspondiente con mayor afinidad que una natural, por sustitución de restos de aminoácidos fenilalanina por valina entre las posiciones 110 y 180 de una citoquina de haz de 4 hélices.
De las citoquinas de haces de 4 hélices mencionadas antes, los interferones (p. ej., IFN-2A, IFN-2B, IFN-, IFN-, IFN-, IFN-) tienen un dominio de unión que contiene una “hélice alfa-A”. Más en particular, el dominio de unión de interferones incluye restos de aminoácidos entre las posiciones 1 y 50. Por lo tanto, en otro aspecto la presente invención proporciona una variante de interferón que es capaz de unirse a un receptor de interferón que tiene mayor afinidad que uno natural, sustituyendo restos de aminoácidos fenilalanina por valina entre las posiciones 1 y 50 de un interferón.
Por otra parte, el dominio de unión alterado de acuerdo con la presente invención puede incluir dos o más restos de fenilalanina. Los dos o más restos de fenilalanina pueden sustituirse todos por valina. Sin embargo, debido a que este caso conduce a una gran reducción de los niveles de expresión de la proteína, preferiblemente solo se sustituye un resto de fenilalanina por valina. En relación con esto, los autores de la presente invención encontraron que cuando un resto de fenilalanina presente en una región muy hidrófoba se sustituye por valina, la proteína moduladora de la respuesta biológica tiene una eficacia muy mejorada. Por lo tanto, en la presente invención, el resto de fenilalanina que se va a sustituir por valina se selecciona preferiblemente en una región muy hidrófoba presente en el dominio de unión especificado de acuerdo con la presente invención. La hidrofobicidad para una región específica de una secuencia de aminoácidos que comprende una proteína, se puede determinar por un procedimiento conocido en la técnica (Kyte, J. y col., J. Mol. Biol. 1982, vol. 157, pág. 105-132, Hopp, T. P. y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78 (6), pág. 3824-3828).
La variante de una proteína moduladora de la respuesta biológica de acuerdo con la presente invención, se puede preparar por procedimientos sintéticos químicos conocidos en general en la técnica (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY 1983). Los procedimientos representativos, pero sin limitar, incluyen síntesis en fase líquida o sólida, condensación de fragmentos, y síntesis química con F-MOC o T-BOC (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams y col., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
Alternativamente, la variante de proteína de acuerdo con la presente invención se puede preparar por técnicas de ADN recombinante. Estas técnicas incluyen un procedimiento para preparar una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con la presente invención. Dicha secuencia de ADN se puede preparar alterando una secuencia de ADN que codifica una proteína natural. Brevemente, después de sintetizar una secuencia de ADN que codifica una proteína natural, se cambia un codón para fenilalanina por otro codón para valina mediante mutagénesis dirigida, generando así una secuencia de ADN deseada.
La preparación de una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con la presente invención, también se puede lograr mediante un procedimiento químico. Por ejemplo, se puede sintetizar una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína mediante un procedimiento químico usando un sintetizador de oligonucleótidos. Un oligonucleótido se hace basándose en una secuencia de aminoácidos de una variante de proteína deseada, y preferiblemente seleccionando un codón adecuado usado por una célula huésped que produce una variante de proteína. La degeneración en el código genético, lo que significa que un aminoácido es especificado por más de un codón, es bien conocida en la técnica. Por lo tanto, hay una pluralidad de secuencias de ADN con degeneración que codifican una variante de proteína específica, y entran todas dentro del alcance de la presente invención.
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Una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con la presente invención puede incluir o no una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal. La secuencia señal, sí está presente, debe ser reconocida por una célula huésped seleccionada para la expresión de la variante de proteína. La secuencia señal puede tener un origen procariota o eucariota o un origen combinado, y puede ser una secuencia señal de una proteína nativa. El uso de una secuencia señal se puede determinar de acuerdo con el efecto de la expresión de una variante de proteína como una forma secretora en una célula recombinante que produce la variante de proteína. Si una célula seleccionada es una célula procariota, una secuencia de ADN típicamente no codifica una secuencia señal sino que en su lugar contiene preferiblemente una metionina N-terminal para la expresión directa de una proteína deseada, y lo más preferiblemente, se usa una secuencia señal derivada de una proteína natural.
Dicha secuencia de ADN como se ha preparado antes se une operativamente a otra secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de la presente invención, y se inserta en un vector que incluye una o más secuencias de control de la expresión que regulan la expresión de la secuencia de ADN resultante. Después, un huésped se transforma o transfecta con el vector de expresión recombinante resultante. El transformante o transfectante resultante se cultiva en un medio adecuado en condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia de ADN. Se recupera una variante sustancialmente pura de una proteína moduladora de la respuesta biológica codificada por la secuencia de ADN del cultivo resultante.
El término “vector”, como se usa en el presente documento, significa una molécula de ADN que sirve como vehículo capaz de llevar establemente genes exógenos a las células huésped. Para aplicaciones útiles, un vector debe ser replicable, tener un sistema para introducirse él mismo en una célula huésped y tener marcadores seleccionables. Además, la expresión “vector de expresión recombinante”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN circular que lleva genes exógenos operativamente unidos en el mismo para ser expresados en una célula huésped. Cuando se introduce en una célula huésped, el plásmido de expresión recombinante tiene la capacidad de replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped con un número de copias alto y producir ADN heterogéneo. Como se sabe en general en la técnica, con el fin de aumentar el nivel de expresión de un gen transfectado en una célula huésped, el gen debe estar operativamente unido a secuencias funcionales reguladoras de la transcripción y la traducción en una célula huésped seleccionada como sistema de expresión. Preferiblemente, las secuencias reguladoras de la expresión y los genes exógenos pueden llevarse en un solo vector de expresión que contiene marcadores seleccionables bacterianos y un origen de replicación. En el caso de que se usen células eucariotas como sistema de expresión, el vector de expresión debe comprender además marcadores de expresión útiles en las células huésped eucariotas.
La expresión “secuencias de control de la expresión”, como se usa en el presente documento en relación con un vector de expresión recombinante, se refiere a secuencias de nucleótidos necesarias o ventajosas para la expresión de la variante de proteína de acuerdo con la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de proteína. Los ejemplos no limitantes de las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias líder, secuencias de poliadenilación, secuencias de propéptidos, promotores, potenciadores o secuencias activadoras en la dirección 5’, secuencias de péptido señal, y terminadores de la transcripción. La secuencia de control de la expresión contiene al menos una secuencia promotora.
La expresión “operativamente unido” se refiere a un estado en el que una secuencia de nucleótidos está dispuesta con otra secuencia de nucleótidos en una relación funcional. Las secuencias de nucleótidos pueden ser un gen y secuencias de control, que están unidas de forma que la expresión del gen es inducida cuando una molécula adecuada (por ejemplo, proteína activadora de la transcripción) se une a la o las secuencias de control. Por ejemplo, cuando una presecuencia o secuencia líder secretora facilita la secreción de una proteína madura, se dice que está “operativamente unida a la proteína”. Un promotor está operativamente unido con una secuencia codificante cuando regula la transcripción de la secuencia codificante. Un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante cuando está presente en una posición que permite la traducción de la secuencia codificante. Típicamente, la expresión “operativamente unida” significa que las secuencias de nucleótidos unidas están en contacto entre sí. En el caso de una secuencia líder secretora, la expresión significa que está en contacto con una secuencia codificante y está presente en un marco de lectura de la secuencia codificante. Sin embargo, un potenciador no tiene que estar necesariamente en contacto con una secuencia codificante. La unión de las secuencias de nucleótidos se puede lograr mediante ligado en sitios de reconocimiento de enzimas de restricción convenientes. En ausencia de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, se pueden usar adaptadores o conectores oligonucleótidos, que se sintetizan por procedimientos convencionales.
Con el fin de expresar una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con la presente invención, se puede usar una amplia variedad de combinaciones de células huésped y vectores como sistema de expresión. Los vectores de expresión útiles para transformar células huésped eucariotas contienen secuencias de regulación de la expresión, por ejemplo, de SV40, papilomavirus bovino, adenovirus, virus adenosociados, citomegalovirus y retrovirus. Los vectores de expresión útiles en células huésped bacterianas incluyen plásmidos bacterianos de E. coli, que se ilustran por pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, pBR322, pMB9 y derivados de los mismos, plásmidos que tienen una amplia variedad de células huésped, tales como RP4, ADN de fagos ilustrados por una amplia variedad de derivados de fagos  incluyendo  gt10,  gt11 y NM989, y otros fagos ADN, ilustrados por fagos ADN monocatenarios filamentosos, tales como M13. Los vectores de expresión útiles en células de levaduras incluyen el plásmido 2 y derivados de los mismos. Los vectores de expresión útiles en células de insectos incluyen pVL941.
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Para expresar una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con la presente invención, estos vectores pueden usar cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen las asociadas con genes estructurales de los vectores de expresión mencionados antes. Los ejemplos de secuencias de control de la expresión útiles incluyen los promotores temprano y tardío de SV40 o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp el, el sistema TAC o TRC, promotores T3 y T7, el operador principal y regiones promotoras del fago , las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas, los promotores de fosfatasas, por ejemplo, Pho5, los promotores del sistema de apareamiento de levaduras alfa y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y diferentes combinaciones de los mismos. En particular, el promotor de la ARN polimerasa T7  10 es útil para la expresión de un polipéptido en E. coli.
Las células huésped transformadas o transfectadas con el vector de expresión recombinante mencionado antes comprenden otro aspecto de la presente invención. Se puede usar una amplia variedad de células huésped mononucleares para expresar una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de la presente invención. Los ejemplos de células huésped incluyen células procariotas y eucariotas tales como E. coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Streptomyces sp., hongos o levaduras, células de insectos tales como Spodoptera frugiperda (Sf9), células animales tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de ratón, células de mono verde africano tales como COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 o BMT 10, y células humanas y vegetales de cultivo tisular. Los huéspedes preferidos incluyen bacterias tales como E. coli y Bacillus subtilis, y tejidos de mamíferos de cultivo tisular.
La transformación y transfección se pueden realizar por los procedimientos descritos en manuales experimentales (Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, 1986; Sambrook, J., y col., Basic Methods in Molecular Biology, 1989). Los procedimientos preferidos para introducir una secuencia de ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con la presente invención en un huésped, incluyen, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística e infección.
También se entenderá que todos los vectores y secuencias de control de la expresión no funcionan igual al expresar la secuencia de ADN de la presente invención. Igualmente, todos los huéspedes no funcionarán igual para un sistema de expresión idéntico. Sin embargo, los expertos en la materia pueden hacer una selección adecuada de diferentes vectores, secuencias de control de la expresión y huéspedes dentro del alcance de la presente invención, sin una sobrecarga experimental. Por ejemplo, se puede seleccionar un vector teniendo en cuenta una célula huésped porque el vector deberá replicarse en la célula huésped. Debe estudiarse el número de copias de un vector, la capacidad para controlar el número de copias y la expresión de otras proteínas codificadas por el vector, por ejemplo, un marcador antibiótico. Una secuencia de control de la expresión también puede seleccionarse teniendo en cuenta varios factores. Por ejemplo, debe estudiarse la fuerza relativa, capacidad de control y compatibilidad de la secuencia con la secuencia de ADN de la presente invención, en particular con respecto a posibles estructuras secundarias. Además, la selección de una célula huésped se puede hacer considerando la compatibilidad con un vector seleccionado, toxicidad de un producto codificado por una secuencia de nucleótidos, naturaleza secretora del producto, capacidad para plegar correctamente un polipéptido, requisitos de fermentación o cultivo, capacidad para asegurar la purificación fácil de un producto codificado por una secuencia de nucleótidos, o similares.
En el procedimiento de preparación de la variante de proteína de acuerdo con la presente invención, las células huésped se cultivan en un medio nutriente adecuado para producir un polipéptido usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden cultivar por cultivo en matraz con agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala en fermentadores de laboratorio o industriales, realizada en un medio adecuado y en condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que contiene fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en el comercio en proveedores comerciales y se pueden preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, el catálogo de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es secretado en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, se puede recuperar de lisados celulares.
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La variante de proteína moduladora de la respuesta biológica de acuerdo con la presente invención se puede recuperar por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante de proteína se puede recuperar del medio nutriente por procedimientos convencionales que incluyen, pero sin limitar, centrifugación, filtración, extracción, liofilizado, evaporación o precipitación. Además, la variante de proteína se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitar, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofobicidad y exclusión por tamaño), electroforesis, solubilidad diferencial (p. ej., precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una variante de una proteína moduladora de la respuesta biológica y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, la variante de la proteína moduladora de la respuesta biológica preferiblemente está contenida en una cantidad terapéuticamente eficaz.
El excipiente usado en la composición farmacéutica de la presente invención incluye los excipientes, adyuvantes y vehículos usados habitualmente en el campo farmacéutico, que se llaman en conjunto “excipientes farmacéuticamente aceptables”. Los excipientes farmacéuticamente aceptables no limitantes útiles en la composición farmacéutica de la presente invención incluyen agentes de intercambio iónico, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero (p. ej., albúmina de suero humano), agentes de tamponamiento (p. ej., fosfato sódico, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos saturados vegetales), agua, sales o electrolitos (p. ej., sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico y sales de cinc), sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidina, sustratos basados en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliarilato, ceras, copolímeros de bloques de polietilenopolioxipropileno, polietilenglicol, y lanolina.
La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por cualquiera de las vías habituales, si es capaz de llegar al tejido deseado. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar por vía tópica, oral, parenteral, intraocular, transdérmica, intrarrectal e intraluminal, y se puede formular como disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas y preparaciones de liberación sostenida. El término “parenteral”, como se usa en el presente documento, incluye inyección subcutánea, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intracardial, intratecal, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión.
En un aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular como disolución acuosa para la administración parenteral. Preferiblemente, se puede usar una disolución tampón adecuada, tal como disolución de Hank, disolución de Ringer o disolución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas para inyección se pueden complementar con sustancias capaces de aumentar la viscosidad de las suspensiones, que se ilustran por la carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y dextrano. Además, las suspensiones de los componentes activos, tales como la suspensión aceitosa para inyección, incluyen disolventes o excipientes lipófilos, que se ilustran por aceites grasos tales como aceite de sésamo, y ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. También se pueden usar como vehículos polímeros de amino policatiónicos no lipídicos. Opcionalmente, las suspensiones pueden contener estabilizantes o fármacos adecuados para aumentar la solubilidad de las variantes de proteínas y obtener concentraciones altas de las variantes de proteínas.
La composición farmacéutica de la presente invención está preferiblemente en forma de una preparación inyectable estéril, tal como suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Dicha suspensión se puede formular de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, usando agentes de dispersión o humectantes adecuados (p. ej. Tween 80) y agentes de suspensión. Las preparaciones inyectables estériles también pueden ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente aceptable por vía parenteral y no tóxico, tal como una disolución en 1,3-butanodiol. Los vehículos y disolventes aceptables incluyen manitol, agua, disolución de Ringer y disolución de cloruro sódico isotónica. Además, se pueden usar de forma conveniente aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede usar cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono y diglicéridos sintéticos. Además, se pueden usar ácidos grasos, tales como ácido oleico y derivados de glicéridos de los mismos, en la preparación de las preparaciones inyectables, como los aceites naturales farmacéuticamente aceptables (p. ej., aceite de oliva o aceite de ricino), y en particular, derivados polioxietilados de los mismos.
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La composición acuosa mencionada antes se esteriliza principalmente por filtración usando un filtro para eliminar bacterias, mezcla con desinfectantes o en combinación con radiación. La composición esterilizada se puede endurecer, por ejemplo, por ejemplo por liofilización para obtener un producto endurecido, y para uso práctico, el producto endurecido se disuelve en agua esterilizada o una disolución diluida esterilizada.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento en relación con la composición farmacéutica de la presente invención, significa una cantidad con la que un componente activo muestra un efecto mejorado o terapéutico frente a una enfermedad para la que se aplica la composición farmacéutica de la presente invención. La cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención puede variar de acuerdo con la edad y sexo del paciente, sitios de aplicación, frecuencia de administración, duración de la administración, tipos de formulación y tipos de adyuvantes. Típicamente, la composición farmacéutica de la presente invención se administra en cantidades menores que una proteína natural, por ejemplo, 0,01-1000 g/kg/día, más preferiblemente 0,1-500 g/kg/día, y lo más preferiblemente 1-100 g/kg/día.
Por otra parte, será evidente para los expertos en la técnica que las enfermedades a las que se aplica la presente composición pueden variar de acuerdo con el tipo de proteína. La EPO y TPO alteradas, como en una realización de la presente invención, se pueden usar para tratar además de la propia anemia, la anemia como una complicación asociada con otras enfermedades (p. ej., anemia en la enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad renal progresiva, anemia en la insuficiencia renal, anemia asociada con la infección por VIH en pacientes tratados con zidovudina (AZT), anemia asociada con la quimioterapia para el cáncer, enfermedad de Huntington (HD), anemia de células falciformes, anemia hiporregenerativa tardía por enfermedad hemolítica en recién nacidos inducida por Rh después de transfusión del intercambio en el útero). Además, el G-CSF alterado de acuerdo con la presente invención, se puede usar para tratar la propia neutropenia y la neutropenia desarrollada después de trasplante de la médula ósea o quimioterapia del cáncer, las variantes de GH se pueden usar para tratar el enanismo hipofisario y la insuficiencia renal crónica pediátrica. Sin embargo, la presente invención no se limita a estas aplicaciones.
En lo sucesivo, la presente invención proporciona variantes de interferones para cada uno de los restos de fenilalanina específicos sustituidos por valina de citoquinas de haces de 4 hélices con detalle, CNTF, EPO, Flt3L, GCSF, GM-CSF, GH, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, L-6, IL-12p35, LPT, LIF, M-CSF, OSM, PL, SCF, TPO, IFN-2A, IFN-2B, IFN-, IFN-, IFN e IFN-.
En un aspecto específico, la presente invención proporciona las siguientes variantes de proteínas: (1) una variante de CNTF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 119, 152 o 178 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de un CNTF natural; (2) una variante de EPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de una EPO natural; (3) una variante de Flt3L que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de un Flt3L natural; (4) una variante de G-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113, 140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de un G-CSF natural;
(5)
una variante de GM-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de un GM-CSF natural; (6) una variante de GH que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 139, 146,166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de una GH natural; (7) una variante de IFN-2A que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27,36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de un IFN-2A natural; (8) una variante de IFN-2B que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de un IFN-2B natural; (9) una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un IFN- natural; (10) una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 32 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de un IFN- natural; (11) una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de un IFN- natural; (12) una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 39 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de un IFN- natural; (13) una variante de IL-2 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de una IL-2 natural; (14) una variante de IL-3 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de una IL-3 natural; (15) una variante de IL-4 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 112 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de una IL-4 natural; (16) una variante de IL-5 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 69 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de una IL-5 natural; (17) una variante de IL-6 que
sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de una IL-6 natural; (18) una variante de IL-12p35 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 180 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) de una IL-12p35 natural; (19) una variante de LPT que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 92 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) de una LPT natural; (20) una variante de LIF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 156 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de un LIF natural; (21) una variante de M-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 311 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de un M-CSF natural;
(22)
una variante de OSM que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) de una OSM natural; (23) una variante de PL que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) de un PL natural; (24) una variante de SCF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de un SCF natural; y (25) una variante de TPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 131 o 141 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de una TPO natural.
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En otro aspecto específico, la presente invención proporciona las siguientes moléculas de ADN: (1) un ADN que codifica una variante de CNTF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 119,152 o 178 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de un CNTF natural; (2) un ADN que codifica una variante de EPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de una EPO natural; (3) un ADN que codifica una variante de Flt3L que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de un Flt3L natural; (4) un ADN que codifica una variante de G-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113,140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de un G-CSF natural; (5) un ADN que codifica una variante de GMCSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 103, 106, 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de un GM-CSF natural; (6) un ADN que codifica una variante de GH que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 139, 146, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de una GH natural; (7) un ADN que codifica una variante de IFN-2A que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de un IFN-2A natural; (8) un ADN que codifica una variante de IFN-2B que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de un IFN-2B natural; (9) un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un IFN- natural; (10) un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 32 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de un IFN- natural; (11) un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de un IFN- natural; (12) un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 39 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de un IFN- natural; (13) un ADN que codifica una variante de IL-2 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de una IL-2 natural; (14) un ADN que codifica una variante de IL-3 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de una IL-3 natural; (15) un ADN que codifica una variante de IL-4 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 112 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de una IL-4 natural; (16) un ADN que codifica una variante de IL-5 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 69 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de una IL-5 natural; (17) un ADN que codifica una variante de IL-6 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de una IL-6 natural; (18) un ADN que codifica una variante de IL-12p35 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 180 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) de una IL-12p35 natural; (19) un ADN que codifica una variante de LPT que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 92 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) de una LPT natural; (20) un ADN que codifica una variante de LIF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 156 o 180 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de un LIF natural; (21) un ADN que codifica una variante de M-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 311 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de un M-CSF natural; (22) un ADN que codifica una variante de OSM que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) de una OSM natural; (23) un ADN que codifica una variante de PL que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) de un PL natural; (24) un ADN que codifica una variante de SCF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de un SCF natural; y (25) un ADN que codifica una variante de TPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 131, 141 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de una TPO natural.
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En un aspecto específico adicional, la presente invención proporciona los siguientes vectores de expresión recombinantes: (1) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de CNTF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 119, 152 o 178 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de un CNTF natural; (2) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de EPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de una EPO natural; (3) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de Flt3L que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de un Flt3L natural; (4) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de G-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113, 140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de un G-CSF natural; (5) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de GM-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de un GM-CSF natural; (6) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de GH que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 139, 146, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de una GH natural; (7) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN-2A que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de un IFN-2A natural; (8) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN-2B que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de un IFN-2B natural; (9) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un IFN- natural; (10) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 32 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de un IFN- natural; (11) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 o 153 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de un IFN- natural; (12) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 39 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de un IFN- natural; (13) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-2 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de una IL-2 natural; (14) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-3 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de una IL-3 natural; (15) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-4 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 112 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de una IL-4 natural; (16) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-5 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 69 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de una IL-5 natural; (17) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-6 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de una IL-6 natural; (18) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-12p35 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 180 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) de una IL-12p35 natural; (19) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de LPT que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 92 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) de una LPT natural; (20) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de LIF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 156 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de un LIF natural; (21) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de M-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 311 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de un M-CSF natural; (22) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de OSM que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) de una OSM natural; (23) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de PL que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) de un PL natural; (24) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de SCF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de un SCF natural; y (25) un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de TPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 131 o 141 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de una TPO natural.
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En otro aspecto específico más, la presente invención proporciona las siguientes células huésped: (1) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de CNTF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 119, 152 o 178 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de un CNTF natural; (2) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de EPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de una EPO natural; (3) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de Flt3L que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de un Flt3L natural; (4) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de G-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113, 140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de un G-CSF natural;
(5) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de GM-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de un GM-CSF natural; (6) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de GH que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 139, 146, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de una GH natural; (7) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN-2A que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de un IFN-2A natural; (8) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN-2B que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de un IFN-2B natural; (9) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un IFN- natural; (10) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 32 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de un IFN- natural; (11) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de un IFN- natural; (12) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 39 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de un IFN- natural; (13) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-2 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de una IL2 natural; (14) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-3 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de una IL-3 natural; (15) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-4 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 112 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de una IL-4 natural; (16) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-5 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 69 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de una IL-5 natural; (17) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-6 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de una IL-6 natural; (18) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-12p35 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 180 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) de una IL-12p35 natural; (19) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de LPT que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 92 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) de una LPT natural; (20) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de LIF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 156 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de un LIF natural; (21) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de M-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 311 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de un M-CSF natural; (22) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de OSM que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) de una OSM natural; (23) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de PL que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) de un PL natural; (24) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de SCF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de un SCF natural; y (25) una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de TPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 131 o 141 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de una TPO natural.
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En otro aspecto específico más, la presente invención proporciona los siguientes procedimientos para preparar una variante de proteína: (1) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de CNTF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 119, 152 o 178 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de un CNTF natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (2) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de EPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de una EPO natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (3) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de Flt3L que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de un Flt3L natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (4) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de G-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113, 140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de un G-CSF natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (5) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de GM-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de un GM-CSF natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (6) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de GH que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 139, 146, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de una GH natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (7) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN-2A que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de un IFN-2A natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (8) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN-2B que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de un IFN-2B natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (9) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un IFN- natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (10) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 32 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de un IFN- natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (11) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de un IFN- natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (12) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 39 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de un IFN- natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (13) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-2 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de una IL2 natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (14) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-3 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de una IL-3 natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (15) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-4 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 112 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de una IL-4 natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (16) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-5 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 69 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de una IL-5 natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (17) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-6 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de una IL-6 natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (18) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de IL-12p35 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 180 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) de una IL-12p35 natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (19) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de LPT que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 92 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) de una LPT natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (20) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de LIF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 156 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de un LIF natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (21) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de M-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 311 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de un M-CSF natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (22) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de OSM que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) de una OSM natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (23) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de PL que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 10, 31, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) de un PL natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; (24) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de SCF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de un SCF natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante; y (25) un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido un ADN que codifica una variante de TPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 131 o 141 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de una TPO natural, y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante.
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En otro aspecto específico más, la presente invención proporciona las siguientes composiciones farmacéuticas: (1) una composición farmacéutica que comprende una variante de CNTF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 119, 152 o 178 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de un CNTF natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (2) una composición farmacéutica que comprende una variante de EPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de una EPO natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (3) una composición farmacéutica que comprende una variante de Flt3L que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de un Flt3L natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (4) una composición farmacéutica que comprende una variante de G-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113, 140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de un G-CSF natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (5) una composición farmacéutica que comprende una variante de GM-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de un GM-CSF natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (6) una composición farmacéutica que comprende una variante de GH que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 139, 146, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de una GH natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable;
(7) una composición farmacéutica que comprende una variante de IFN-2A que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de un lFN-2A natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (8) una composición farmacéutica que comprende una variante de IFN-2B que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de un IFN-2B natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (9) una composición farmacéutica que comprende una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de un IFN- natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (10) una composición farmacéutica que comprende una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 32 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de un IFN- natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (11) una composición farmacéutica que comprende una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de un IFN- natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (12) una composición farmacéutica que comprende una variante de IFN- que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 39 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de un IFN- natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (13) una composición farmacéutica que comprende una variante de IL-2 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de una IL-2 natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (14) una composición farmacéutica que comprende una variante de IL-3 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de una IL-3 natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (15) una composición farmacéutica que comprende una variante de IL-4 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 112 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de una IL-4 natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (16) una composición farmacéutica que comprende una variante de IL-5 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 69 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de una IL-5 natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (17) una composición farmacéutica que comprende una variante de IL-6 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 124 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de una IL-6 natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (18) una composición farmacéutica que comprende una variante de IL-12p35 que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 180 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) de una IL-12p35 natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (19) una composición farmacéutica que comprende una variante de LPT que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 92 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) de una LPT natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (20) una composición farmacéutica que comprende una variante de LIF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 156 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de un LIF natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (21) una composición farmacéutica que comprende una variante de M-CSF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 311 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de un M-CSF natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (22) una composición farmacéutica que comprende una variante de OSM que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) de una OSM natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (23) una composición farmacéutica que comprende una variante de PL que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) of de un PL natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; (24) una composición farmacéutica que comprende una variante de SCF que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de un SCF natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable; y (25) una composición farmacéutica que comprende una variante de TPO que sustituye el resto de fenilalanina por valina en la posición 131 o 141 de una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de una TPO natural y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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El presente propósito de mejorar la eficacia en la modulación de respuestas biológicas se logró en los siguientes ejemplos usando TPO, EPO, G-CSF y GH. Será evidente para los expertos en la materia que los siguientes ejemplos se proporcionan solo para ilustrar la presente invención y el alcance de la presente invención no está limitado a los ejemplos.
Ejemplo 1. Construcción de ADN que codifica TPO/EPO/G-CSF/GH naturales
A. Construcción de ADN que codifica la TPO natural
Se añadieron 750 l de reactivo TRIzol (MRC, EE.UU.) a tejido de la médula ósea en un tubo de microcentrífuga y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron 200 l de cloroformo al tubo y después el tubo se agitó enérgicamente durante 15 segundos. Después de incubar el tubo a temperatura ambiente durante 2-3 minutos, se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. La fase superior se transfirió a un tubo de 1,5 ml y se añadieron 500 l de isopropanol. La muestra se incubó a -70ºC durante 30 minutos y se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Después de descartar el líquido sobrenadante, el sedimento de ARN se lavó una vez con DEPC-etanol al 75% mediante mezcla vorticial y se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Se separó el líquido sobrenadante y el sedimento de ARN se secó durante 5 minutos a temperatura ambiente y después el sedimento se disolvió en 50 l de agua destilada tratada 3 veces con DEPC.
Se mezclaron 2 g de ARNm purificados como antes y 1 l de cebador oligo-dT30 (10 M, Promega, EE.UU.) y se calentaron a 70ºC durante 2 minutos y después se enfriaron inmediatamente en hielo durante 2 minutos. Después de esto, la mezcla de reacción se añadió a transcriptasa inversa M-MLV 200 U (Promega, EE.UU.), 10 l de 5x tampón de reacción (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCI 375 mM, MgCl2 15 mM, DTT 50 nM), 1 µl de dNTP (dATP 10 mM, dTTP 10 mM, dGTP 10 mM, dCTP 10 mM) y se añadió agua tratada 3 veces con DEPC para completar el volumen de 50 l. Después de mezclar suavemente, la mezcla de reacción se incubó a 42ºC durante 60 minutos.
Para amplificar el ADNc que codifica la TPO natural, se añadieron la primera cadena de ADNc como molde, cebador 1 y cebador 2 (tabla 1) a un tubo de PCR que incluía 2 U de pfu ADN polimerasa (Stratagene, EE.UU.), 10 l de 10x tampón de reacción, Tritón X-100 al 1%, BSA 1 mg/ml, 3 l de cebador 1 (10 M), 3 l de cebador 2 (10 M), 2 l de dNTP (dATP 10 mM, dTTP 10 mM, dGTP 10 mM, dCTP 10 mM) y se añadió agua destilada para completar el volumen de 100 l. Las condiciones de reacción de la PCR eran como sigue: 1 ciclo a 95ºC durante 3 min, y después 30 ciclos a 95ºC durante 30 s, a 52ºC durante 1 min y a 72ºC durante 1,5 min, y finalmente 1 ciclo a 72ºC durante 10 min para hacer el producto de la PCR con extremo completamente romo.
El producto de la PCR obtenido se separó en gel de agarosa al 0,8% (BMA, EE.UU.) y se purificó con el kit de extracción en gel Qiaex II (Qiagen, EE.UU.). Después de mezclar el ADN aislado con 15 U de EcoRI, 10 U de NotI, 3 l de 10x tampón de reacción y añadir agua destilada para completar el volumen total de 30 l, el ADN se trató con las enzimas de restricción por incubación a 37ºC durante 2 horas. El producto de la PCR se separó en gel de agarosa al 0,8% y se purificó con el kit de extracción en gel Qiaex II.
Después se mezclaron 5 g de vector pBluescript KS II (+) con 15 U de EcoRI, 10 U de NotI, 3 l de 10x tampón de reacción y se añadió agua destilada para completar el volumen total de 30 l, y el ADN se trató con las enzimas de restricción por incubación a 37ºC durante 2 horas. El vector pBluescript KS II (+) tratado con las enzimas de restricción se separó en gel de agarosa al 0,8% y se purificó con el kit de extracción en gel Qiaex II.
Se ligaron 100 ng del vector pBluescript KS II (+) digerido con 20 ng del producto de la PCR que se digirió con las mismas enzimas. Esta mezcla de ligación se incubó en un baño de agua a 16ºC durante 16 horas, produciendo así un vector recombinante que comprendía ADNc que codifica la TPO natural. Después se transformó en una E. coli Top10 (Invitrogen, EE.UU.) que se convirtió en una célula competente por el procedimiento del cloruro de rubidio. Las bacterias transformadas se cultivaron en placa de agar LB que contenía ampicilina 50 g/ml (Sigma, EE.UU.). Después de incubación durante la noche, las colonias se transfirieron a tubos con 3 ml de medio LB que contenía ampicilina 50 g/ml y después se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. El plásmido se aisló de las bacterias cultivadas con el procedimiento de lisis alcalina y se usó el procedimiento con las enzimas de restricción EcoRI/NotI para detectar la inclusión del gen clonado en el plásmido.
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B. Construcción del ADN que codifica la EPO natural
El procedimiento de clonación del ADN que codifica la EPO natural era básicamente el mismo que el usado para la 5 clonación del ADN que codifica la TPO natural.
Se usaron la primera cadena del ADNc como molde, el cebador 11 y cebador 12 (tabla 2) para la amplificación por PCR del ADN que codifica la TPO natural. El producto de la PCR y el vector de clonación, pBluescript KS II (+) se digirieron con las endonucleasas EcoRI y BamHI. El producto de la PCR digerido y el vector de clonación se ligaron
10 y transformaron en células competentes, E. coli Top10 (Invitrogen, EE.UU.). Se aisló el plásmido de las bacterias cultivadas con el procedimiento de lisis alcalina y se usó el procedimiento con las enzimas de restricción EcoRI/BamHI para detectar la existencia del gen clonado en el plásmido.
C. Construcción del ADN que codifica el G-CSF natural
15 El procedimiento de clonación del ADN que codifica el G-CSF natural era similar al usado para el ADN que codifica la TPO natural.
Se usaron leucocitos de gente sana para la extracción del ARNm, y se usaron los cebadores 21 y 22 (tabla 3) para
20 la amplificación por PCR del ADNc que codifica el G-CSF natural. Tanto el producto de la PCR como el vector de clonación, pBluescript KS II (+) se digirieron con las endonucleasas SmaI y EcoRI. El producto de la PCR digerido y el vector de clonación se ligaron y transformaron en células competentes, E. coli Top10 (Invitrogen, EE.UU.). Se aisló el plásmido de las bacterias cultivadas con el procedimiento de lisis alcalina y se usó el procedimiento con las enzimas de restricción SmaI/EcoRI para detectar la existencia del gen clonado en el plásmido.
25
D. Construcción del ADN que codifica la GH natural
El ADN que codifica la GH natural se adquirió en ATCC (ATCC nº 67097). Para añadir la secuencia líder al extremo N-terminal de este ADNc, se usaron el cebador 35 y 36 (tabla 4) para la PCR. Con el fin de completar la unión del
30 ADNc que codifica la GH natural a la secuencia líder, se llevó a cabo una PCR secundaria usando los cebadores 37 y 38 (tabla 4). El producto de la PCR y el vector de clonación, pBluescript KS II (+) se digirieron con las endonucleasas EcoRI y HindIII. Se aisló el plásmido de las bacterias cultivadas con el procedimiento de lisis alcalina y se usó el procedimiento con las enzimas de restricción EcoRI/HindIII para detectar la existencia del gen clonado en el plásmido.
35 Ejemplo 2. Construcción del ADNc que codifica las muteínas de TPO/EPO/G-CSF/GH
A. Construcción de los ADNc que codifican las muteínas de TPO
40 Se construyeron 4 muteínas de TPO, TPO-[F46V], TPO-[F128V], TPO-[F131V] y TPO-[F141V] de acuerdo con los siguientes procedimientos, para tener una sola sustitución de aminoácido de fenilalanina por valina en cada una de las posiciones, respectivamente.
Tabla 1 45 Cebadores usados en la construcción de los ADNc que codifican la TPO natural y las muteínas.
Nº de cebador
Secuencia de nucleótidos Secuencia nº
1
TPO natural Sentido directo imagen18 26
2
Sentido contrario 27
3
TPO-[F46V] Sentido directo T3
4
Sentido contrario imagen18 28
5
TPO-[F128V] Sentido directo T3
6
Sentido contrario imagen18 29
7
TPO-[F131V] Sentido directo T3
8
Sentido contrario imagen18 30
9
TPO-[F141V] Sentido directo T3
10
Sentido contrario imagen18 31
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El ADNc que codifica TPO-[F46V], TPO-[F128V], TPO-[F131V] y TPO-[F141V] se construyó por una PCR primaria usando cebadores específicos (tabla 1) y el cebador universal T3 y una PCR secundaria usando el producto de la PCR primaria y el cebador universal T7. El molde para estas reacciones era el ADNc que codifica la TPO natural clonada en pBluescript KS II (+) obtenido del ejemplo 1.
5 La PCR primaria se llevó a cabo añadiendo 2,5 U de Ex Taq (Takara, Japón), 5 l de 10x tampón, MgCl2 1 mM, dNTP 2,5 mM y se añadió agua destilada para completar el volumen total de 50 l. Las condiciones de la PCR consistían en 1 ciclo a 94ºC durante 3 min, seguido de 30 ciclos a 95ºC durante 30 s, a 60ºC durante 30 s y a 72ºC durante 30 s, y después se conectó a 1 ciclo a 72ºC durante 7 min. El producto de la PCR primaria se usó como un
10 megacebador en la PCR secundaria junto con el cebador universal T7 (10 pmol). Se usó el ADNc que codifica la TPO natural clonada en pBluescript KS II (+) como molde en la PCR secundaria. La PCR secundaria se llevó a cabo añadiendo 2,5 U de Ex Taq, 5 l de 10x tampón, dNTP 2,5 mM y se añadió agua destilada para completar el volumen total de 50 l. Las condiciones de la PCR consistían en 1 ciclo a 94ºC durante 3 min, seguido de 30 ciclos a 94ºC durante 1 min, a 58ºC durante 1 min y a 72ºC durante 1,5 min, y finalmente se conectó a 1 ciclo a 72ºC durante
15 7 min antes de la terminación.
Para minimizar los errores derivados de la síntesis del ADN, la concentración de Mg2+ se redujo a 1 mM en la PCR primaria. Los tamaños de los megacebadores amplificados eran 280 pb para TPO-[F46V], 520 pb para TPO-[F128V], 530 pb para TPO-[F131V] y 560 pb para TPO-[F141V]. En la PCR secundaria que usa megacebadores, los ADNc
20 que codifican cada una de las muteínas producidas presentaron el mismo tamaño de 1062 pb. La sustitución de fenilalanina por valina en la secuencia de nucleótidos de las muteínas de TPO individuales se verificó por secuenciación directa.
Se separó cada uno de los productos de la PCR de 1062 pb en gel de agarosa al 0,8% y se purificaron con el kit de
25 extracción en gel Qiaex II. El producto de la PCR se digirió con 15 U de EcoRI y 10 U de NotI a 37ºC durante 2 horas. El producto de la PCR digerido se separó en gel de agarosa al 0,8% y se purificó con el kit de extracción en gel Qiaex II y se ligó con pBluescript KS II (+) como se ha descrito antes. El vector de expresión recombinante que contiene el ADN que codifica TPO-[F141V] se denominó Tefficacin-4 y se depositó en el KCCM (Centro coreano de cultivo de microorganismos) conforme al Tratado de Budapest del 9 de junio, 2003. El número de acceso dado por la
30 autoridad internacional de depósito era KCCM-10500.
B. Construcción de los ADNc que codifican las muteínas de EPO
Se construyeron 4 muteínas de EPO, EPO-[F48V], EPO-[F138V], EPO-[F142V] y EPO-[F148V] de acuerdo con los
35 siguientes procedimientos, para tener una sola sustitución de aminoácido de fenilalanina por valina en cada una de las posiciones, respectivamente.
Tabla 2 Cebadores usados en la construcción de los ADNc que codifican la EPO natural y las muteínas.
Nº de cebador
Secuencia de nucleótidos Secuencia nº
11
EPO natural Sentido directo imagen18 32
12
Sentido contrario imagen18 33
13
EPO-[F48V] Sentido directo T3
14
Sentido contrario imagen18 34
15
EPO-[F138V] Sentido directo imagen18 35
16
Sentido contrario T7
17
EPO-[F142V] Sentido directo imagen18 36
18
Sentido contrario T7
19
EPO-[F148V] Sentido directo imagen18 37
20
Sentido contrario T7
El procedimiento de construcción de los ADNc que codifican las muteínas de EPO era básicamente similar al de las TPO. Los ADNc que codifican EPO-[F48V], EPO-[F138V], EPO-[F142V] y EPO-[F148V] se construyeron por una PCR primaria usando cebadores específicos (tabla 2) y el cebador universal T3 y una PCR secundaria usando el producto de la PCR primaria y el cebador universal T7. El molde para estas reacciones era el ADNc que codifica la
45 EPO natural clonada en pBluescript KS II (+) obtenido del ejemplo 1.
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La concentración de Mg2+ se ajustó a 1 mM en la PCR primaria. Los tamaños de los megacebadores amplificados eran 300 pb para EPO-[F48V], 550 pb para EPO-[F138V], 550 pb para EPO-[F142V] y 550 pb para EPO-[F148V]. En la PCR secundaria que usa megacebadores, los ADNc que codifican las muteínas individuales se amplificaron al
5 mismo tamaño de 580 pb. La sustitución de fenilalanina por valina en la secuencia de nucleótidos de las muteínas de EPO individuales se verificó por secuenciación directa.
Se separó cada uno de los productos de la PCR de 580 pb en gel de agarosa al 0,8% y se purificaron con el kit de extracción en gel Qiaex II. El producto de la PCR se digirió con 15 U de EcoRI y 10 U de BamHI a 37ºC durante 2
10 horas. El producto de la PCR digerido se ligó con pBluescript KS II (+) como se ha descrito antes y se usó para construir el vector de expresión. El vector de expresión recombinante que contiene el ADN que codifica TPO-[F141V] se denominó Refficacin-4 y se depositó en el KCCM (Centro coreano de cultivo de microorganismos) conforme al Tratado de Budapest del 9 de junio, 2003. El número de acceso dado por la autoridad internacional de depósito era KCCM-10501.
15
C. Construcción de los ADNc que codifican las muteínas del G-CSF
Se construyeron las muteínas de G-CSF, G-CSF-[F13V], G-CSF-[F83V], G-CSF-[F113V], G-CSF-[F140V], G-CSF[F144V] y G-CSF-[F160V] de acuerdo con los siguientes procedimientos, para tener una sola sustitución de
20 aminoácido de fenilalanina por valina en cada una de las posiciones, respectivamente.
Tabla 3 Cebadores usados en la construcción de los ADNc que codifican el G-CSF natural y las muteínas.
Nº de cebador
Secuencia de nucleótidos Secuencia nº
21
G-CSF natural Sentido directo 38
22
Sentido contrario imagen18 39
23
G-CSF-[F13V] Sentido directo T7
24
Sentido contrario imagen18 40
25
G-CSF-[F83V] Sentido directo imagen18 41
26
Sentido contrario T3
27
G-CSF-[F113V] Sentido directo imagen18 42
28
Sentido contrario T3
29
G-CSF-[F140V] Sentido directo imagen18 43
30
Sentido contrario T3
31
G-CSF-[F144V] Sentido directo imagen18 44
32
Sentido contrario T3
33
G-CSF-[F160V] Sentido directo imagen18 45
34
Sentido contrario T3
25 El procedimiento de construcción de los ADNc que codifican las muteínas de G-CSF era básicamente similar al de las TPO. Los ADNc que codifican G-CSF-[F13V], G-CSF-[F83V], G-CSF-[F113V], G-CSF-[F140V], G-CSF-[F144V] y G-CSF-[F160V] se construyeron por una PCR primaria usando cebadores específicos (tabla 3) y el cebador universal T3 y una PCR secundaria usando el producto de la PCR primaria y el cebador universal T7. El molde para estas reacciones era el ADNc que codifica el G-CSF natural clonado en pBluescript KS II (+) obtenido del ejemplo 1.
30 La concentración de Mg2+ se ajustó a 1 mM en la PCR primaria. Los tamaños de los megacebadores amplificados eran 600 pb para G-CSF-[F13V], 390 pb para G-CSF-[F83V], 300 pb para G-CSF-[F113V], 200 pb para G-CSF[F140V], 200 pb para G-CSF-[F144V] y 150 pb para G-CSF-[F160V]. En la PCR secundaria que usa megacebadores, los ADNc que codifican cada una de las muteínas se amplificaron al mismo tamaño de 640 pb. La
35 sustitución de fenilalanina por valina en la secuencia de nucleótidos de las muteínas de G-CSF individuales se verificó por secuenciación directa.
Se separó cada uno de los productos de la PCR de 640 pb en gel de agarosa al 0,8% y se purificaron con el kit de extracción en gel Qiaex II. El producto de la PCR se digirió con 15 U de SmaI y 10 U de EcoRI a 37ºC durante 2 40 horas y se separó en gel de agarosa al 0,8% y se purificó con el kit de extracción en gel Qiaex II. El producto de la PCR digerido se ligó con pBluescript KS II (+) como se ha descrito antes. El vector de expresión recombinante que contiene el ADN que codifica G-CSF-[F140V] se denominó Grefficacin-4 y se depositó en el KCCM (Centro coreano
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de cultivo de microorganismos) conforme al Tratado de Budapest del 17 de mayo, 2004. El número de acceso dado por la autoridad internacional de depósito era KCCM-10571.
D. Construcción de los ADNc que codifican las muteínas de GH
5 Se construyeron las muteínas de GH, GH-[F44V], GH-[F97V], GH-[F139V], GH-[F146V], GH-[F166V] y GH-[F176V] de acuerdo con los siguientes procedimientos, para tener una sola sustitución de aminoácido de fenilalanina por valina en cada una de las posiciones, respectivamente.
10 Tabla 4 Cebadores usados en la construcción de los ADNc que codifican la GH natural y las muteínas.
Nº de cebador
Secuencia de nucleótidos Secuencia nº
35
Adición de secuencia líder Sentido directo 1 46
36
Sentido contrario T3
37
Sentido directo 2 47
38
Sentido contrario T3
39
GH-[F44V] Sentido directo T7
40
Sentido contrario imagen18 48
41
GH-[F97V] Sentido directo T7
42
Sentido contrario imagen18 49
43
GH-[F139V] Sentido directo T7
44
Sentido contrario imagen18 50
45
GH-[F146V] Sentido directo T7
46
Sentido contrario imagen18 51
47
GH-[F166V] Sentido directo T7
48
Sentido contrario imagen18 52
49
GH-[F176V] Sentido directo T7
50
Sentido contrario imagen18 53
El procedimiento de construcción de los ADNc que codifican las muteínas de GH era básicamente similar al de las TPO. Los ADNc que codifican las muteínas GH-[F44V], GH-[F97V], GH-[F139V], GH-[F146V], GH-[F166V] y GH
15 [F176V] se construyeron por una PCR primaria usando cebadores específicos (tabla 4) y el cebador universal T3 y una PCR secundaria usando el producto de la PCR primaria y el cebador universal T7. El molde para estas reacciones era el ADNc que codifica la GH natural clonada en pBluescript KS II (+) obtenido del ejemplo 1.
La concentración de Mg2+ se ajustó a 1 mM en la PCR primaria. El tamaño de cada uno de los megacebadores
20 amplificados era 130 pb para GH-[F44V], 300 pb para GH-[F97V], 420 pb para GH-[F139V], 450 pb para GH[F146V], 500 pb para GH-[F166V] y 530 pb para GH-[F176V]. La sustitución de fenilalanina por valina en la secuencia de nucleótidos de las muteínas de GH individuales se verificó por secuenciación directa.
Se separó cada uno de los productos de la PCR de 650 pb en gel de agarosa al 0,8% y se purificaron con el kit de
25 extracción en gel Qiaex II. El producto de la PCR se digirió con 15 U de EcoRI y 10 U de HindIII a 37ºC durante 2 horas y se separó en gel de agarosa al 0,8% y se purificó con el kit de extracción en gel Qiaex II. El producto de la PCR digerido se ligó con pBluescript KS II (+) como se ha descrito antes.
Ejemplo 3. Expresión y purificación de las muteínas de TPO 30
A. Muteínas de TPO
a. Establecimiento de líneas celulares transfectadas usando el procedimiento de lipofección
35 Se prepararon células de ovario de hámster chino ("CHO-K1") (ATCC, CCL61) con una densidad de 1,5x105 células por placa de 35 mm que contenía medio Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM") [Gibco BRL, EE.UU.] complementado con suero bovino fetal (“FBS”) al 10%. Las células se cultivaron a 37ºC en CO2 al 5%, durante 18-24
h. En un tubo estéril se añadieron 6 l de lipofectamina a 1,5 g del vector de expresión recombinante que comprendía el ADN que codifica una muteína de TPO. El volumen de esta mezcla se ajustó a 100 l añadiendo
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DMEM exento de suero. El tubo se incubó a temperatura ambiente durante 45 min. Las células cultivadas en la placa de 35 mm se lavaron dos veces con DMEM exento de suero y se añadieron a la placa 800 l de DMEM exento de suero. Las células lavadas se aplicaron suavemente como una capa sobre el complejo de lipofectamina-ADN y después se incubaron durante 5 h a 37ºC en CO2 al 5%. Después de 5 h de incubación, se añadió 1 ml de DMEM que contenía FBS al 20% a las células transfectadas y después las células se incubaron durante 18-24 h a 37ºC, CO2 al 5%. Después de incubación, las células se lavaron dos veces con DMEM exento de suero y después se añadieron al cultivo 2 ml de DMEM que contenía FBS al 10%. Estas células se incubaron durante 72 h a 37ºC, CO2 al 5%.
b. Análisis del nivel de expresión de las muteínas de TPO usando ELISA
Se analizó en las células transfectadas con plásmido que contenía ADNc que codifica la TPO natural o muteínas el nivel de expresión de proteína usando el ensayo ELISA. Se añadió un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra TPO humana (R&D, EE.UU.) diluido a 10 g/ml con tampón de recubrimiento [bicarbonato sódico 0,1 M, (pH 9,6)] a cada uno de los pocillos de la placa de 96 pocillos (Falcon, EE.UU.) hasta 100 l por pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó con Tween-20 al 0,1% en 1X PBS (PBST) 3 veces. Después de lavar, la placa se incubó con 200 l de tampón de bloqueo (FBS al 1%, sacarosa al 5%, azida sódica al 0,05%) durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavó 3 veces con PBST. Se mezclaron los líquidos sobrenadantes cultivados (que incluían las células transfectadas) y tampón de dilución [BSA al 0,1%, Tween-20 al 0,05%, PBS IX] con diluciones seriadas. Se diluyó de la misma forma TPO humana recombinante 25 ng/ml [Calbiochem, EE.UU.] como control positivo y los líquidos sobrenadantes de CHO-K1 cultivadas no transfectadas como control negativo. Después, la placa se lavó con PBST 3 veces. Se añadió un anticuerpo de cabra dirigido contra TPO humana biotinilado (R&D, EE.UU.) diluido a 0,2 g/ml con tampón de dilución, a la placa de 96 pocillos hasta 100 l por pocillo y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó con PBST 3 veces. Se añadieron 100 l por pocillo de estreptavidina-HRP (R&D, EE.UU.) diluida a 1:200 en tampón de dilución, a la placa de 96 pocillos y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de 1 h, las placas se lavaron 3 veces con PBST, y después se llevó a cabo la reacción de coloración usando el sistema de sustrato de peroxidasa TMB en micropocillo (KPL, EE.UU.) y se leyó la D.O. a 630 nm con un lector de microplaca [BIO-RAD, modelo 550].
c. Análisis del nivel de expresión y peso molecular de muteínas de TPO usando transferencia Western
Con el fin de excluir el FBS en el medio, se usó CHO-S-SFM II (Gibco BRL, EE.UU.) para el cultivo de las células transfectadas anteriores. El medio de cultivo de CHO-S-SFM II se filtró con un filtro de jeringa de 0,2 m y se concentró con un Centricón (Mol. 30.000 Millipore, EE.UU.). Para llevar a cabo la SDS reducido-PAGE, se añadió tampón de carga de muestra que contenía -mecaptoetanol al 5% a la muestra y se calentó durante 5 min. Se usaron gel concentrador y gel separador para esta SDS-PAGE. El gel concentrador estaba compuesto de acrilamida al 3,5%, Tris 0,375 M (pH 6,8), SDS al 0,4% y el gel separador estaba compuesto de gel de acrilamida al 10%, Tris 1,5 M (pH 8,8), SDS al 0,4%. Después del tratamiento con el gel separador en la SDS-PAGE, las muestras de proteína se transfirieron a una membrana Westran (transmembrana de PVDF, S&S) que tenía poros de 4 m, a 350 mA durante 2 h en un depósito que contenía tampón de Tris 25 mM-glicina 192 mM (pH 8,3)-metanol al 20%. Después de la transferencia, se bloqueó 3 veces durante 10 minutos con leche en polvo desnatada al 5% en PBST. El anticuerpo de cabra dirigido contra TPO humana biotinilado (R&D, EE.UU.) se diluyó a 0,25 g/ml en tampón de bloqueo y se añadieron 3 ml de esta disolución y se agitó durante 6 h. La membrana se lavó con disolución de lavado 3 veces. Se diluyó la estreptavidina-HRP (R&D, EE.UU.) a 1:100 en tampón de bloqueo y se incubó durante 1
h. La membrana se lavó 3 veces con disolución de lavado. Las bandas de proteína se visualizaron por incubación con sustrato DAB (VECTOR LABORATORIES, EE.UU.) durante 10 min. Esta reacción se paró sumergiendo la membrana en agua desionizada.
En la figura 2a, las formas natural y muteínas de la TPO tienen el mismo peso molecular (55 kD).
El nivel de expresión relativo de la TPO natural y las muteínas se muestra en la figura 3a. El nivel de expresión de cada muteína de TPO se comparó con el de la TPO natural como control. El nivel de expresión de TPO-[F128V] era 1,4 veces mayor que el de la TPO natural. Pero la expresión de TPO-[F46V], -[F131V] y -[F141V] disminuyó 20%, 40% y 40% respecto a la natural, respectivamente.
B. Muteínas de EPO
Se transfectaron vectores de expresión que contenían los ADNc que codifican muteínas de EPO en células CHO-K1 y se detectó el nivel de expresión de cada una de las muteínas de EPO usando el ensayo ELISA. Y el peso molecular de la EPO natural y de cada muteína se analizó por transferencia Western.
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En la figura 2b, las formas natural y muteínas de la EPO tienen el mismo peso molecular (45 kD).
El nivel de expresión relativo de la EPO natural y de las muteínas se muestra en la figura 3b. El nivel de expresión de EPO-[F48V] y EPO-[F138V] era 1,4 y 1,2 veces mayor que el de la EPO natural, respectivamente. Pero el nivel de expresión de EPO-[F142V] y -[F148V] disminuyó 20% y 30% del de la EPO natural, respetivamente.
C. Muteínas de G-CSF
Se transfectaron vectores de expresión que contenían los ADNc que codifican las muteínas de G-CSF en células CHO-K1 y se detectó el nivel de expresión de cada una de las muteínas de G-CSF usando el ensayo ELISA. Y el peso molecular del G-CSF natural y de cada muteína se analizó por transferencia Western.
En la figura 2c, las formas natural y muteínas del G-CSF tienen el mismo peso molecular (50 kD).
El nivel de expresión relativo de las formas de G-CSF natural y muteínas se muestra en la figura 3c. El nivel de expresión del resto de las muteínas de G-CSF era similar al del G-CSF natural. El nivel de expresión de la muteína de G-CSF [F83V] era 1,9 veces mayor que el del natural. Pero los niveles de expresión de las muteínas de G-CSF [F140V] y [F144V] disminuyeron a 50% y 70% del G-CSF natural respectivamente.
D. Muteínas de GH
Se transfectaron vectores de expresión que contenían los ADNc que codifican las muteínas de GH en células CHOK1. El procedimiento para la expresión de cada una de las muteínas de GH era el mismo que el usado para la producción de TPO.
Ejemplo 4. Construcción de ADN que codifica receptores de EPO, TPO, G-CSF y GH
A. Construcción de ADN que codifica receptores de EPO y TPO
Se construyeron los ADN que codifican receptores de EPO y TPO para analizar las afinidades de unión de cada una de las muteínas de EPO y las muteínas de TPO. Se ligó el ADN que codifica el dominio extracelular de cada receptor al ADN que codifica el dominio Fc de la IgG1, de modo que la región C-terminal del dominio extracelular de cada receptor estaba fusionada con la región N-terminal del dominio Fc de la IgG1 humana. El ADNc que codifica el receptor de EPO se construyó por la PCR usando el cebador de sentido directo (cebador 51) con sitios de restricción de EcoRI y la secuencia líder del receptor de EPO y el cebador de sentido contrario (secuencia 52) con la secuencia que codifica el extremo 3’ del receptor de EPO y la secuencia que codifica el extremo 5’ del dominio Fc de la IgG. El ADNc que codifica el receptor de TPO ligado al dominio Fc de la IgG1 se construyó por la PCR usando el cebador de sentido directo (cebador 53) con sitios de restricción de HindIII y la secuencia líder del receptor de TPO y el cebador de sentido contrario (cebador 54) con la secuencia que codifica el extremo 3’ del receptor de TPO y la secuencia que codifica el extremo 5’ del dominio Fc de la IgG.
El ADNc que codifica el receptor de EPO producido como se ha descrito antes y el ADN que codifica el dominio Fc de la IgG1, se mezclaron en el mismo tubo, y se indujo la unión complementaria entre las secuencias comunes. Usando esta mezcla, se construyó el ADNc que codifica el receptor de EPO ligado al dominio Fc de la IgG1 por PCR usando el cebador de sentido directo (cebador 51) con sitios de restricción EcoRI y la secuencia líder del receptor de EPO y el cebador de sentido contrario (cebador 55) con sitios de restricción XbaI y extremo 3’ del dominio Fc de la IgG. El producto de la PCR se cortó con EcorI y XbaI y se insertó en el vector de expresión PCR-3 para la producción de la proteína de fusión de receptor de EPO-Fc.
El ADNc que codifica el receptor de TPO producido como se ha descrito antes y el ADN que codifica el dominio Fc de la IgG se mezclaron en el mismo tubo, por lo tanto se indujo la unión entre secuencias comunes. Usando esta mezcla, se construyó el ADNc que codifica el receptor de TPO ligado al dominio Fc de la IgG1 por PCR usando el cebador de sentido directo (cebador 53) con sitios de restricción EcoRI y la secuencia líder del receptor de EPO y el cebador de sentido contrario (cebador 55) con sitios de restricción XbaI y extremo 3’ del dominio Fc de la IgG. El producto de la PCR se cortó con HindI y XbaI y se insertó en el vector de expresión PCR-3 para la producción de la proteína de fusión de receptor de TPO-Fc.
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Tabla 5 Una lista de los cebadores usados en la construcción de los receptores de TPO y EPO fusionados con inmunoglobulina
Cebador nº
Secuencia de nucleótidos Secuencia nº
receptor de EPO
51 Sentido directo imagen18 54
52
Sentido contrario imagen18 55
receptor de TPO
53 Sentido directo imagen18 56
54
Sentido contrario imagen18 57
IgG1-R-XbaI
55 imagen18 58
5
B. Construcción de ADN que codifica receptores de G-CSF y GH
El ADNc que codifica el receptor de G-CSF se construyó por la PCR usando el cebador de sentido directo (cebador 56) con sitio de restricción de HindIII y la secuencia líder del receptor de G-CSF y el cebador de sentido contrario
10 (cebador 57) con el sitio de restricción de EcoRI y la secuencia que codifica el extremo 3’ del receptor de G-CSF. El ADNc que codifica el receptor de GH se construyó por la PCR usando el cebador de sentido directo (cebador 58) con sitio de restricción de EcoRI y la secuencia líder del receptor de G-CSF y el cebador de sentido contrario (cebador 59) con sitio de restricción de SpeI y la secuencia que codifica el extremo 3’ del receptor de G-CSF.
15 El producto de la PCR que codifica el receptor de G-CSF se digirió con HindIII y EcoRI y se clonó insertándolo en un vector de clonación disponible en el comercio, pBluescript KS II(+), en el sitio HindIII/EcoRI. El producto de la PCR que codifica el receptor de GH se digirió con EcoRI y SpeI, y se clonó insertándolo en un vector de clonación disponible en el comercio, pBluescript KS II(+), en el sitio EcoRI/SpeI.
20 El dominio Fc de la IgG se construyó por la PCR usando el cebador de sentido directo (cebador 60 para G-CSF, cebador 61 para GH) con la secuencia que codifica parte del extremo 5’ de la región bisagra de la IgG humana y el cebador de sentido contrario (cebador 62). Para el receptor G-CSF, el producto de la PCR que codifica el dominio Fc de la IgG humana se digirió con EcoRI y XbaI, y se clonó insertándolo en un vector de clonación disponible en el comercio, pBluescript KS II(+), en el sitio EcoRI/XbaI. Para el receptor de GH, el producto de la PCR que codifica el
25 dominio Fc de la IgG humana se digirió con SpeI y XbaI, y se clonó insertándolo en un vector de clonación disponible en el comercio, pBluescript KS II(+), en el sitio SpeI/XbaI.
Tanto el ADNc clonado que codifica el receptor de G-CSF como el dominio de Fc clonado de la IgG humana se digirieron con EcoRI/XbaI y después se ligaron para preparar el ADN que codifica el receptor de G-CSF ligado al
30 dominio Fc de la IgG humana. Esta construcción de ADN se cortó con HindIII y XbaI y se insertó en el vector de expresión PCR-3. Tanto el ADNc clonado que codifica el receptor de GH como el dominio de Fc clonado de la IgG humana se digirieron con SpeI/XbaI y después se ligaron para preparar el ADN que codifica al receptor de G-CSF ligado al dominio Fc de la IgG humana. Esta construcción de ADN se cortó con EcoRI y XbaI y se insertó en el vector de expresión PCR-3.
35
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Tabla 6 Una lista de los cebadores usados en la construcción de los receptores de G-CSF y GH fusionados con inmunoglobulina
Cebador nº
Secuencia de nucleótidos Secuencia nº
receptor de G-CSF
56 Sentido directo 59
57
Sentido contrario imagen18 60
receptor de GH
58 Sentido directo imagen18 61
59
Sentido contrario imagen18 62
IgG1-F-EcoRI
60 Sentido directo 63
IgG1-F-SpeI
61 Sentido directo 64
IgG1-R-XbaI
62 Sentido contrario 65
5 Ejemplo 5. Medición de la afinidad de unión de citoquinas y sus muteínas a cada uno de sus receptores usando ELISA
A. Unión de la TPO y muteínas de TPO al receptor de TPO
10 Se usaron los líquidos sobrenadantes de cultivo de células CHO transfectadas con vectores de expresión que llevan genes para las muteínas de la TPO para medir las interacciones de citoquina-receptor.
La proteína de fusión de receptor de TPO-Ig se purificó del líquido sobrenadante del cultivo de células CHO transfectadas con el vector de expresión recombinante que lleva el gen que codifica la proteína de fusión de receptor 15 de TPO-Fc usando una columna de Proteína A-Sepharose-4B (Pharmacia, Suecia). La proteína de fusión purificada diluida a 10 g/ml con tampón de recubrimiento [bicarbonato sódico 0,1 M, (pH 9,6)] se añadió a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos (Falcon, EE.UU.) hasta 100 l por pocillo y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó con Tween-20 al 0,1% en 1X PBS[PBST] 3 veces. Después de lavar, la placa se incubó con 200 l de tampón de bloqueo (FBS al 1%, sacarosa al 5%, azida sódica al 0,05%) durante 1 hora a temperatura
20 ambiente y después se lavó 3 veces con PBST.
Después de lavar, los líquidos sobrenadantes de los cultivos que consistían en 4 muteínas de TPO y una TPO natural, respectivamente, se diluyeron de forma seriada con tampón de dilución [BSA al 0,1%, Tween-20 al 0,05%, 1X PBS] y se añadieron a una placa de 96 pocillos recubierta con la proteína de fusión de receptor de TPO-Fc y se 25 incubaron durante 1 h. El lavado se repitió 3 veces con PBST. Se diluyeron de la misma forma una TPO humana recombinante [Calbiochem, EE.UU.] como control positivo y los líquidos sobrenadantes cultivados de CHO-K1 transfectadas como control negativo. Las placas se lavaron 3 veces con PBST. Se añadió un anticuerpo de cabra dirigido contra TPO humana biotinilado (R&D, EE.UU.) diluido a 0,2 g/ml con tampón de dilución, a la placa de 96 pocillos hasta 100 l por pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con
30 PBST. Se añadieron 100 l por pocillo de estreptavidina-HRP (R&D, EE.UU.), diluida a 1:200 en tampón de dilución, a la placa de 96 pocillos y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con PBST después de 1 h. La reacción de coloración se llevó a cabo usando el sistema de sustrato de peroxidasa TMB en micropocillo (KPL, EE.UU.) y se leyó la D.O. a 630 nm con un lector de microplaca [BIO-RAD, modelo 550].
35 La afinidad de unión de TPO-[F141V] y TPO-[F131V] al receptor de TPO aumentó comparado con la TPO natural (figura 4a). La primera muteína tenía la afinidad de unión más fuerte entre todas las muteínas de TPO.
B. Unión de EPO y muteínas de EPO al receptor de EPO
40 La medición de la afinidad de unión de la EPO natural y las muteínas al receptor era básicamente similar a la de la afinidad de unión de la TPO y muteínas de TPO al receptor de TPO.
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La afinidad de unión de EPO-[F148V] y EPO-[F142V] al receptor de EPO aumentó comparado con la EPO natural (figura 4b). Y la primera muteína tenía la afinidad de unión más fuerte entre todas las muteínas de EPO.
C. Unión de G-CSF y muteínas de G-CSF al receptor de G-CSF
La medición de la afinidad de unión del G-CSF natural y las muteínas al receptor era básicamente similar a la de la afinidad de unión de la TPO y muteínas de TPO al receptor de TPO.
Los resultados (figura 4c) mostraron que la afinidad de unión de G-CSF-[F140V], G-CSF-[F144V] y G-CSF-[F160V] al receptor de G-CSF aumentó comparado con el G-CSF natural. Y la primera muteína (G-CSF-[F140V]) tenía la afinidad de unión más fuerte entre todas las muteínas de G-CSF.
D. Unión de GH y muteínas de GH al receptor de GH
La medición de la afinidad de unión del GH natural y las muteínas al receptor era básicamente similar a la de la afinidad de unión de la TPO y muteínas de TPO al receptor de TPO.
Los resultados (figura 4d) mostraron que GH-[F139V] tenía la afinidad de unión más fuerte al receptor de GH.
Ejemplo 6. Medición de las uniones de citoquinas y sus muteínas a cada uno de sus receptores usando la SPR
A. Unión de la TPO y muteínas de TPO al receptor de TPO.
Para medir la afinidad de unión de TPO-[F141V] y TPO-[F131V] al receptor de TPO, se llevó a cabo la SPR en un instrumento BIAcore 3000 que contiene el chip Sensor CM5. Se inmovilizó el anticuerpo dirigido contra IgG humana en cada una de las celdas de flujo 1 y 2 usando la química de acoplamiento de amina. Para inactivar cualquier grupo activo, las superficies se bloquearon con etanolamina 1 M. Se añadió la proteína de fusión de receptor de TPO-Fc para unirse al anticuerpo dirigido contra IgG humana durante 2 min, con 30 l/min y después se hicieron reaccionar la TPO y muteínas de TPO para unirse al receptor de TPO.
Con la misma densidad de ligando, el aumento de la unidad de resonancia (RU) significa mayores afinidades de unión. En la figura 5a, la TPO natural, TPO-[F141V] y TPO-[F131V] tenían 10 RU, 30 RU y 20 RU, respectivamente. Este resultado mostró que TPO-[F141V] tenía la afinidad de unión más fuerte. Además los valores de KD de la TPO natural y muteína se muestran en la tabla 7.
Tabla 7 Cambios en la constante de la velocidad de la cinética de unión de la TPO natural y muteína
Kon(M-1s -1)x105
Koff(s-1)x10-2 KD(µM)=Koff/Kon Chi2 Afinidad de unión relativa
TPO natural
2,42 13,7 5,66 5,81 1
TPO-[F141V]
12,8 0,51 0,04 6,03 141
B. Muteínas de EPO
Se realizó la SPR para medir las afinidades de unión de la muteína EPO-[F148V] y EPO-[F142V] con el receptor de EPO. El procedimiento experimental era similar al de la TPO.
La figura 5b es el resultado de la SPR de la EPO natural y muteínas. En la figura 5b, EPO-[F148V] mostró 40 RU y EPO-[F142V] 30 RU. Estos resultados muestran que la EPO-[F148V] tenía la afinidad de unión más fuerte. Además, los valores de KD de las muteínas de EPO se muestran en la tabla 8.
Tabla 8 Cambios en la constante de la velocidad de la cinética de unión de la EPO natural y muteína
Kon(M-1s -1)x105
Koff(s-1)x10-2 KD(µM)=Koff/Kon Chi2 Afinidad de unión relativa
EPO natural
1,84 8,83 4,80 4,55 1
EPO-[F148V]
14,0 0,64 0,05 2,26 105
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Ejemplo 7. Medición de las afinidades de unión de citoquinas naturales y muteínas usando FACS
A. Establecimiento de la línea celular TF-1/c-Mpl
Se estableció la línea celular TF-1/c-Mpl transfectando ADNc que codifica c-Mpl en células TF-1. La expresión de c-Mpl se verificó usando análisis FACS. Se lavaron las células TF-1/c-Mpl 1 x 106/ml con tampón de PBS y se incubó anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra IgG humana c-Mpl (BD PharMingen, EE.UU.) con las células TF-1/c-Mpl. Y después se añadió anticuerpo dirigido contra IgG de ratón conjugado con FITC (molécula entera; Sigma, EE.UU.) para verificar la expresión de c-Mpl en la superficie de las células TF-1/c-Mpl. Como resultado, la gráfica de las células TF-1/c-Mpl se desplazó hacia la derecha de la de las células TF-1. Este resultado mostraba que c-Mpl, receptor de TPO, era expresado en la célula TF-1/c-Mpl.
B. Análisis FACS de las muteínas de TPO
Las células TF-1/c-Mpl 1 x 106/ml se suspendieron en tampón de PBS y se añadieron a la suspensión TPO natural y [F141V] y se incubaron a 4ºC durante 30-60 minutos, respectivamente. Se añadió anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra TPO humana biotinilado (R&D, EE.UU.) a las células anteriores y se incubaron a 4ºC durante 30-60 min. Se añadió estreptavidina-FITC (Sigma-EE.UU.) a las células anteriores y se incubaron a 4ºC durante 30-60 minutos. Las células se lavaron 2 veces con tampón de PBS para separar la estreptavidina-FITC sin reaccionar. Las células se suspendieron en tampón de PBS y se realizó análisis por citometría de flujo a 488 nm usando un dispositivo EXCALIBUR (BD, EE.UU.).
En la figura 6a, la curva de unión de la TPO-[F141V] estaba desplazada hacia la derecha respecto a la de la TPO natural. Este resultado mostraba que la TPO-[F141V] tenía una afinidad de unión al receptor mucho más fuerte que la TPO natural.
C. Análisis FACS de muteínas de EPO
El procedimiento FACS de las muteínas de EPO se llevó a cabo de forma similar al de la TPO.
En la figura 6b, la curva de unión de la EPO-[F148V] estaba desplazada hacia la derecha respecto a la de la TPO natural. Este resultado mostraba que la TPO-[F141V] tenía una afinidad de unión al receptor mucho más fuerte que la EPO natural.
Ejemplo 8. Medición de las actividades biológicas de muteínas de TPO, EPO, G-CSF y GH
A. Ensayo de proliferación celular de las muteínas de TPO
Para investigar las diferencias de la proliferación celular y las actividades biológicas entre la TPO natural y las muteínas, se usó la línea celular TF-1/c-Mpl producida antes. Las células TF-1/c-Mpl se cultivaron en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, GM-CSF 1 ng/ml a 37ºC, CO2 al 5%. Se sembraron TPO natural y de cada una de las muteínas 0,4, 1, 5, 10, 20, 40, 75 ng/ml en RPMI-1640 en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (FALCON, EE.UU.). Se añadieron 1 x 104 células de las células TF-1/c-Mpl en RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% a cada uno de los pocillos de la placa de 96 pocillos. Después de 4 días de cultivo a 37ºC, CO2 al 5%, se añadieron 20 l de disolución de MTS [3-(4,5-dimetil-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolio, sal interna, MTS] y el etosulfato de fenazina (PES; promega) y se incubaron durante 4 horas. Se leyó la
D.O. con un lector de micoplaca (BIO-RAD Modelo 550) a 490 nm.
La figura 7a muestra diferencias de la TPO natural y las muteínas en la estimulación de la proliferación celular de TF-1/c-Mpl. Se aplicó TPO a las TF-1/c-Mpl desde 0,4 ng/ml a 75 ng/ml. La proliferación celular aumentó hasta una concentración de TPO de 50 ng/ml. El potencial de proliferación celular de TF-1/c-Mpl de TPO-[F141V] era mucho más fuerte que el de la natural y era la primera en actividad biológica entre las muteínas. La actividad biológica de TPO-[F131V] era la segunda más fuerte entre las muteínas de TPO. La actividad de la TPO-[F46V] era similar a la de la natural.
B. Ensayo de proliferación celular de muteínas de EPO
La actividad biológica de las muteínas de EPO se examinó por el ensayo de proliferación celular usando células TF1 dependientes de EPO. El procedimiento experimental del ensayo de proliferación celular de las muteínas de EPO era similar al de las muteínas de TPO.
imagen28
La figura 7b muestra las diferencias de la EPO natural y las muteínas en la estimulación de la proliferación de células
5 TF-1. Se aplicó EPO a las células TF-1 desde 0,01 UI/ml a 7 UI/ml. El potencial de proliferación de células TF-1 de EPO-[F148V] era mucho más fuerte que el de la natural y era la primera en fuerza biológica entre las muteínas de EPO. Las actividades biológicas de EPO-[F142V] y EPO-[F138V] eran la segunda y tercera más fuertes entre las muteínas de EPO, respectivamente.
10 Tabla 9 Actividades biológicas de las TPO
TPO
Comparación de la actividad máxima (%)
Natural
100
Muteínas
TPO-[F46V] 107
TPO-[F128V]
63
TPO-[F131V]
119
TPO-[F141V]
146

Tabla 10 Actividades biológicas de las EPO
EPO
Comparación de la actividad máxima (%)
Natural
100
Muteínas
EPO-[F48V] 84
EPO-[F138V]
57
EPO-[F142V]
122
EPO-[F148V]
137
15
C. Muteínas de G-CSF
La actividad biológica de las muteínas de G-CSF se examinó por el ensayo de proliferación celular usando células HL-60 dependientes de G-CSF. El procedimiento experimental del ensayo de proliferación celular de las muteínas de
20 G-CSF era similar al de las muteínas de TPO.
La figura 7c muestra las diferencias del G-CSF natural y las muteínas en la estimulación de la proliferación de células HL-60. Se aplicó G-CSF a las células HL-60 desde 0,4 ng/ml a 75 ng/ml. El potencial de proliferación de células HL-60 de G-CSF-[F140V] era mucho más fuerte que el del natural y era la primera en fuerza biológica entre
25 las muteínas de G-CSF.
D. Muteínas de GH
La actividad biológica de las muteínas de GH se examinó por el ensayo de proliferación celular usando células NB2
30 dependientes de GH. El procedimiento experimental del ensayo de proliferación celular de las muteínas de GH era similar al de las muteínas de GH.
La figura 7d muestra las diferencias del GH natural y las muteínas en la estimulación de la proliferación de células NB2. Se aplicó GH a las células NB2 desde 0,4 ng/ml a 75 ng/ml. El potencial de proliferación de células NB2 de 35 GH-[F139V] era mucho más fuerte que el de la natural y era la primera en fuerza biológica entre las muteínas de GH.
Ejemplo 9. Perfiles farmacocinéticos de EPO y TPO naturales y muteínas
Se investigó la diferencia de los perfiles farmacocinéticos entre cada una de las muteínas de EPO y TPO y las
40 naturales. Se inyectó TPO o muteínas de EPO por vía intravenosa a conejos (blancos de Nueva Zelanda, 3 kg). Después se recogieron muestras de sangre de forma seriada. Las concentraciones de EPO y TPO de cada muestra se detectaron usando ensayo ELISA cuantitativo como se ha descrito antes. La inyección de las EPO en ratones (12 semanas, Balb/c, 30 g) se realizó tanto por vía intraperitoneal como intravenosa. Las muestras de sangre en tubos que contenían heparina se separaron por centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos. El líquido sobrenadante
45 que contenía plasma se usó para detectar las concentraciones en la sangre de EPO y TPO usando ELISA.
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En la figura 8a se muestran los perfiles de concentración plasmática de TPO natural y -[F141V] después de inyección intravenosa de TPO natural y -[F141V] 5 g/kg en conejos. La concentración de TPO-[F141V] disminuía más rápidamente que la de la TPO natural. La TPO-[F141V] se desplazó de la sangre a los tejidos diana periféricos rápidamente, debido a su afinidad de unión más fuerte por el receptor.
En la figura 8b se muestran los perfiles de concentración plasmática de EPO natural y EPO-[F148V] en la sangre después de inyección intravenosa de EPO natural y EPO-[F148V] 1000 UI/kg en conejos. La concentración de EPO[F148V] disminuía más rápidamente que la de la EPO natural.
En la figura 8c se muestran los perfiles de concentración plasmática después de inyección intraperitoneal de EPO natural y EPO-[F148V] 20 UI/g en ratones. La velocidad de difusión de la EPO natural era mayor que la de la EPO[F148V] en una etapa temprana y la concentración máxima en la sangre (Cmáx) de la EPO natural también era mayor que la de la EPO-[F148V]. La Cmáx de la EPO-[F148V] permanecía más tiempo que la de la EPO natural. Estos resultados sugerían que la EPO-[F148V] era más hidrófoba y tenía una afinidad de unión mayor al receptor que la
15 EPO natural. Y estos resultados conducen a la conclusión de que la EPO-[F148V] se difundía en la sangre más lentamente y se desplazaba de la sangre a los tejidos diana periféricos más rápidamente que la EPO natural.
Tabla 11 Parámetros farmacocinéticos de la EPO natural y la muteína EPO-[F148V]
Ratón
Conejo
EPO natural
muteína EPO-[F148V] EPO natural muteína EPO-[F148V]
T1/2 (semivida)
1,9 1,4 3,8 2,4
AUC
100 78 100 80
Ejemplo 10. Actividades in vivo de las muteínas de EPO
La diferencia de las actividades biológicas entre la EPO natural y las muteínas se verificó en ratones. Ratones (Balb/c de 12 semanas, 20 g, Jungang Lab Animal Inc., Corea) se trataron con radiación  a 700 Rad. Se inyectaron
25 250 ng de EPO natural y muteínas purificadas en 50 l de PBS por vía intraperitoneal 3 veces al día. Se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola. Y después se ensayaron los parámetros hematológicos de acuerdo con el ensayo de CBC común. La EPO natural se usó como control positivo y el líquido sobrenadante del cultivo de células CHO se usó como control negativo. Se recogió la sangre en tubos que contenían EDTA los días 0, 1, 2, 4, 7, 10, 15, 20, 25 y 30 después de inyección.
La figura 9 muestra los resultados del CBC en ratones a los que se había inyectado por vía intraperitoneal EPO natural y muteínas para verificar el cambio en el recuento de RBC y reticulocitos. El aumento del recuento de RBC (figura 9a) era mucho más notable en los ratones a los que se había inyectado EPO-[F148V] que en los ratones a los que se había inyectado EPO natural. Y los RBC aumentaron en los ratones a los que se había inyectado EPO
35 [F48V] y EPO-[F138V] más débilmente que en los ratones a los que se había inyectado EPO natural. El aumento del recuento de reticulocitos (figura 9b) y hematocrito era similar a los resultados del cambio en el recuento de RBC en los ratones a los que se había inyectado EPO-[F148V].
Ejemplo 11. Actividades in vivo de las muteínas de TPO
La diferencia de las actividades biológicas entre la TPO natural y las muteínas se estudió en ratones. Ratones (Balb/c de 12 semanas, 20 g, Jungang Lab Animal Inc., Corea) se trataron con radiación  a 700 Rad. Se inyectaron 250 ng de TPO natural y muteínas purificados en 50 l de PBS por vía intraperitoneal 3 veces al día. Se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola. Y después se ensayaron los parámetros hematológicos de acuerdo con el
45 ensayo de CBC común. La TPO natural se usó como control positivo y el líquido sobrenadante del cultivo de células CHO se usó como control negativo. Se recogió la sangre en tubos que contenían EDTA los días 0, 1, 4, 7, 10, 14, 18, 23, 28 y 32 después de inyección.
La figura 10 muestra los cambios del recuento de plaquetas (figura 10a), recuento de leucocitos (figura 10b) y recuento de neutrófilos (figura 10c) en ratones a los que se había inyectado por vía intraperitoneal TPO natural y muteínas. El aumento del recuento de plaquetas era el más notable en los ratones a los que se había inyectado TPO-[F141V]. Y los ratones a los que se había inyectado TPO-[F131V] eran los segundos mayores. Los ratones a los que se había inyectado TPO-[F46V] eran similares a los que se había inyectado TPO natural. Y los ratones a los que se había inyectado TPO-[F128V] mostraron un recuento de plaquetas similar al de los controles negativos a los que se había inyectado PBS (figura 10a). El aumento del recuento de leucocitos (figura 10b) y recuento de neutrófilos (figura 10c) mostró patrones similares a los vistos en el cambio en las plaquetas.
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Aplicabilidad industrial
Como es evidente a partir de los resultados anteriores de la presente invención, la sustitución del resto fenilalanina por valina, que está presente en un dominio que participa en la unión de las proteínas naturales moduladoras de la respuesta biológica a los correspondientes receptores, ligandos o sustratos, conduce a un aumento en la afinidad de unión y la actividad biológica, y reduce la producción de autoanticuerpos frente a variantes de proteínas convencionales, haciendo posible producir mejores fármacos proteínicos.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> MEDEXGEN Inc. CHUNG, Yong-Hoon LEE, Hak-sup YI, Ki-Wan HEO, Youn-Hwa KIM, Jae-Youn
<120> Un procedimiento para mejorar la eficacia de las proteínas modificadoras de la respuesta biológica y muteínas ilustrativas
<150> KR10-2003-0051846
<151> 2003-07-26
<160> 65
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 200
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CNTF: la Phe 3ª, 83ª, 98ª, 105ª, 119ª, 152ª o 178ª se sustituye por Val.
<400> 1
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<210> 2
<211> 166
<212>
PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> EPO: la Phe 48ª, 138ª, 142ª o 148ª se sustituye por Val.
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<210> 3
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PRT 5 <213> Secuencia artificial
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<220>
<223> Flt3L: la Phe 6ª, 15ª, 81ª, 87ª, 96ª o 124ª se sustituye por Val.
<400> 3
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<210> 4
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> G-CSF: la Phe 13ª, 83ª, 113ª, 140ª, 144ª o 160ª se sustituye por Val. 5 <400> 4
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<210> 5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GM-CSF: la Phe 47ª, 103ª, 106ª, 113ª o 119ª se sustituye por Val.
<400> 5 <210> 6
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> GH: la Phe 1ª, 10ª, 25ª, 31ª, 44ª, 54ª, 92ª, 97ª, 139ª, 146ª, 166ª, 176ª o 191 se sustituye por Val.
<400> 6 <210> 7
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IFN-alfa 2A: la Phe 27ª, 36ª, 38ª, 43ª, 47ª, 64ª, 67ª, 84ª, 123ª o 151ª se sustituye por Val.
<400> 7 <210> 8
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IFN-alfa 2B: la Phe 27ª, 36ª, 38ª, 43ª, 47ª, 64ª, 67ª, 84ª, 123ª o 151ª se sustituye por Val.
<400> 8 <210> 9
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IFN-beta: la Phe 8ª, 38ª, 50ª, 67ª, 70ª, 111ª o 154ª se sustituye por Val.
<400> 9
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<210> 10
<211> 146
<212>
PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> IFN-gamma: la Phe 18ª, 32ª, 55ª, 57ª, 60ª, 63ª, 84ª, 85ª, 95ª o 139ª se sustituye por Val.
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<210> 11
<211> 172
<212>
PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> IFN-omega: la Phe 27ª, 36ª, 38ª, 65ª, 68ª, 124ª o 153ª se sustituye por Val.
<400> 11
<210> 12
<211> 187
<212>
PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> IFN-tau: la Phe 8ª, 39ª, 68ª, 71ª, 88ª, 127ª, 156ª, 157ª, 159ª o 183ª se sustituye por Val.
<400> 12
<210> 13
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IL-2: la Phe 42ª, 44ª, 78ª, 103ª, 117ª o 124ª se sustituye por Val.
<400> 13
<210> 14
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IL-3: la Phe 37ª, 61ª, 107ª, 113ª o 133ª se sustituye por Val.
<400> 14
<210> 15
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IL-4: la Phe 33ª, 45ª, 55ª, 73ª, 82ª o 112ª se sustituye por Val.
<400> 15
<210> 16
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IL-5: la Phe 49ª, 69ª, 96ª o 103ª Phe se sustituye por Val.
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PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> IL-6: la Phe 73ª, 77ª, 93ª, 104ª, 124ª, 169ª o 172ª Phe se sustituye por Val.
<400> 17
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> IL-12p35: la Phe 13ª, 39ª, 82ª, 96ª, 116ª, 132ª, 150ª, 166ª o 180ª se sustituye por Val.
<400> 18
<210> 19
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> LPT: la Phe 41ª o 92ª se sustituye por Val.
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> LIF: la Phe 41ª, 52ª, 67ª, 70ª, 156ª o 180ª se sustituye por Val.
<400> 20
<210> 21
<211> 522
<212>
PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> M-CSF: la Phe 35ª, 37ª, 54ª, 67ª, 91ª, 106ª, 121ª, 135ª, 143ª, 229ª, 255ª, 311ª, 439ª, 466ª o 485ª se sustituye por Val.
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PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> OSM: la Phe 56ª, 70ª, 160ª, 169ª, 176ª o 184ª se sustituye por Val.
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<220>
<223> PL: la Phe 10ª, 31ª, 44ª, 52ª, 54ª, 92ª, 97ª, 146ª, 166ª, 176ª o 191ª se sustituye por Val.
<400> 23
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SCF: la Phe 63ª, 102ª, 110ª, 115ª, 116ª, 119ª, 126ª, 129ª, 158ª,199ª, 205ª, 207ª o 245ª se sustituye por Val.
<400> 24
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<212>
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<220>
<223> TPO: la Phe 46ª, 128ª, 131ª, 141ª, 186ª, 204ª, 240ª o 286ª se sustituye por Val.
<400> 25
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Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Variante de citoquina de haz de 4 hélices , caracterizada por la sustitución de fenilalanina por valina en el dominio de unión de la citoquina.
  2. 2.
    La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la citoquina de haz de 4 hélices  se selecciona del grupo que consiste en CNTF, EPO, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, GH, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL12p35, LPT, LIF, M-CSF, OSM, PL, SCF, TPO, IFN-2A, IFN-2B, IFN-, IFN-, IFN- e IFN-.
  3. 3.
    La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el CNTF, EPO, G-CSF, GM-CSF, GH, IL-4, IL-6, IL-12p35, LIF, OSM, PL y TPO se alteran sustituyendo un resto de fenilalanina por valina de los restos de aminoácidos entre las posiciones 110 y 180.
  4. 4.
    La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el IFN-2A, IFN-2B, IFN-, IFN, IFN- e IFN- se alteran sustituyendo un resto de fenilalanina por valina de los restos de aminoácidos entre las posiciones 1 y 50.
  5. 5.
    La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que
    - el CNTF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 119, 152 o 178 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 1;
    -la EPO se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 2;
    -el Flt3L se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 124 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 3;
    -
    el G-CSF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 113, 140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 4;
    -
    el GM-CSF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 5;
    -
    la GH se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 139, 146, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 6;
    -
    la IL-2 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO.:13;
    -
    la IL-3 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 14;
    -
    la IL-4 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 112 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 15;
    -
    la IL-5 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 69 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 16;
    -
    la IL-6 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 124, de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO.:17;
    -la IL-12p35 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 180 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 18;
    -
    la LPT se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 92 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 19;
    -
    el LIF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 156 de una secuencia de
    aminoácidos designada SEQ ID NO: 20;
    -
    el M-CSF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 311 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 21;
    -
    la OSM se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 22;
    -
    la PL se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 23;
    -
    el SCF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 24;
    -
    la TPO se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 131 o 141 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 25;
    imagen1
    -
    el IFN-2A se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 7;
    -
    el IFN-2B se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 8;
    -
    el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 9;
    -
    el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 32 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10;
    -
    el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 11;
    -
    el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 39 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 12.
  6. 6. Un ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
  7. 5.
  8. 7.
    Un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido el ADN de acuerdo con la reivindicación 6.
  9. 8.
    El vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el vector de expresión recombinante tiene un número de acceso KCCM-10500, KCCM-10501 o KCCM-10571.
  10. 9.
    Una célula huésped transformada o transfectada con el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.
  11. 10.
    Un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante.
  12. 11.
    Una composición farmacéutica que comprende la variante de proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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