CN1279059C - 生物活性提高的人粒细胞集落刺激因子的Fc融合蛋白 - Google Patents
生物活性提高的人粒细胞集落刺激因子的Fc融合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1279059C CN1279059C CN02126839.8A CN02126839A CN1279059C CN 1279059 C CN1279059 C CN 1279059C CN 02126839 A CN02126839 A CN 02126839A CN 1279059 C CN1279059 C CN 1279059C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- csf
- human
- zone
- variant
- sport
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本文公开了一类在摩尔基础上,生物活性比rhG-CSF更高的人G-CSF的Fc融合蛋白。这类hG-CSF-L-vFc融合蛋白含有人G-CSF、约20个或更少氨基酸的柔性肽接头、和人IgG Fc变体。这种Fc变体无裂解性,且显示极小的不良Fc-介导的副作用。本文还公开了一种高表达水平制备或产生这种融合蛋白的方法。这类hG-CSF-L-vFc融合蛋白表现出血清半衰期延长,且生物活性增加,从而改善药物动力学和药效,因此在一段时间内所需的注射次数较少。
Description
技术领域
本发明涉及Fc融合蛋白。具体而言,本发明涉及生物活性提高的人粒细胞集落刺激因子的Fc融合蛋白。本发明还涉及产生该Fc融合蛋白的CHO-衍生的细胞系。
背景技术
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是20千道尔顿的糖蛋白,其促进祖细胞的增生并诱导它们分化成嗜中性白细胞。另外,G-CSF延长成熟嗜中性白细胞的存活并激活它们的功能。人G-CSF(hG-CSF)是由单核细胞、巨噬细胞、成纤维母细胞和内皮细胞产生的(参见,如Moore,Annu.Rev.Immunol.,9:159-191,1991;Nicola,Annu.Rev.Biochem.,58:45-77,1991)。G-CSF的生物作用受其与骨髓造血祖细胞和骨髓系的细胞表面上表达的G-CSF受体(G-CSF-Rc)的相互作用的介导。与G-CSF结合后,受体被激活并经历同源二聚,随后磷酸化酪氨酸激酶的Janus家族。随后,发生一系列细胞内的信号转导,从而增加祖细胞的数量,祖细胞成熟为嗜中性白细胞,从而在成熟的嗜中性白细胞中进一步激活因子的功能(参见,如Demetri等人.,Blood,78:2791-2808,1991)。因此,G-CSF不仅在血细胞生成中起调节和维持的关键作用,而且在宿主对感染和炎症的抵抗中也起重要作用。
在因接受化疗而中性白细胞减少的患者的治疗中广泛使用重组人G-CSF(rhG-CSF)。施用rhG-CSF能有效地恢复这些患者中性白细胞的功能,使与感染相关的事件减少。使用rhG-CSF能强化剂量或调节对癌症患者有益的化疗剂。除化疗引发的中性白细胞减少以外,rhG-CSF还可用于治疗骨髓移植后的骨髓抑制、急性白血病、再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合症、严重慢性中性粒细胞减少症、和移植时外周血祖细胞的转移(参见,如Welte等人.,Blood,88:1907-1929,1996)。
静脉内或皮下给药后,rhG-CSF血清浓度的消除半衰期约为3-4小时。rhG-CSF的安全性及患者对rhG-CSF的耐受性良好,仅有髓骨痛为常见和明显的副作用。rhG-CSF相对较低的毒性,使得可以开发长效作用的衍生物以减少每天一次或每天两次注射安排的不便。已有报道说将聚乙二醇(PEG)连接于各种蛋白质(包括G-CSF),能得到因半衰期长而体内效力较高的衍生物(参见,如Zalipsky等人,“PEG化学:生物技术和生物医药的应用”,第347-370页,1992)。通常PEG缀合的蛋白质比它们未经修饰的亲代蛋白质的体外生物活性低(Eliason等人,Stem Cells,18:40-45,2000)。而这些经修饰的蛋白质体内效力的增加至少部分是因为按其分子量的增加而降低了肾的清除作用(Yamaoda等人,J.Pharmaceut.Sci.,83:601-606,1994)。我们出乎意料地发现,如本发明所述地将人IgG衍生的Fc区域连接于hG-CSF的C末端,可以提供延长hG-CSF的半衰期而增加它的效力同时提高它的生物活性。
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天。已有报道说融合蛋白可将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)的区域结合(参见,如Capon等人,Nature,337:525-531,1989;Chamow等人,Trends Biotechnol.,14:52-60,1996;美国专利No.5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通过IgG Fc绞链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白质,形成类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源,Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体外药物动力学特性。这种方法已被用于一些临床上很重要的细胞因子(如IL-2和IFN-α2a)和可溶性受体(如TNF-Rc和IL-5-Rc)(参见,如美国专利No.5,349,053和6,224,867)。通过如本发明所公开的和/或所述,将含有G-CSF的融合蛋白连接于人IgG蛋白质的Fc区域,可延长G-CSF的循环半衰期和/或增加它的生物活性。
已有人报道了促红细胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)。与EPO单体相比,含有2个的完整EPO区域(相隔3到7氨基酸肽接头)的融合蛋白表现出减弱的活性(Qiu等人,J.Biol.Chem.,273:11173-11176,1998)。然而,当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时,二聚体EPO分子表现出提高相当多的体外和体内的活性(参见,如Sytkowski等人,J.Biol.Chem.,274:24773-24778,1999;美国专利No.6,187,564)。两个造血生长因子间的肽接头的长度非常重要,可能是因为其对这些分子形式的柔韧性的作用,但也不限于这个解释。我们发现本方法可应用于其它治疗性蛋白质(包括G-CSF)。我们还用其于如柔性肽接头。
在大部分已报道的Fc融合蛋白分子中,绞链区作为Fc区域与细胞因子或可溶性受体间的间隔,使这分子的这两部分能分别行使功能(参见,如Ashkenazi等人,Current Opinion in Immunology,9:195-200,1997)。在hG-CSF和Fc部分间带有合适肽接头的人G-CSF融合蛋白(hG-CSF-L-Fc)比rhG-CSF的活性高,其体外活性至少是rhG-CSF的2倍(以摩尔计)。本发明发现,在人G-CSF和人IgG Fc变体间添加的肽接头以两种方式提高hG-CSF-L-Fc的体外生物活性:(1)保持Fc区域与G-CSF上G-CSF-Rc结合位点的距离,和(2)保持一个G-CSF和另一个G-CSF区域的距离,从而使G-CSF区域能分别与粒细胞祖细胞上的G-CSF-Rc反应。对本发明而言,优选长度为约20个或更少氨基酸的柔性肽接头。更优选的是长度至少为2个氨基酸的肽接头。另外,甚至优选使用包含两个或多个选自以下氨基酸的肽接头:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。
人免疫球蛋白的Fc区域在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导通过两种主要机制:(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)的结合,由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体,或(2)与第一补体成分C1的C1q部分的结合,引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径,从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中,IgG1和IgG3能有效地结合FcγR。IgG4与FcγR的结合亲和力比IgG1或IgG3的低一个数量级,而IgG2与FcγR的结合低得难以测定。人IgG1和IgG3还能有效地结合C1q,并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱,而IgG4表现极端缺乏激活补体级联的能力(参见,如Jefferis等人,Immunol.Rev.,163:59-76,1998)。对应用于人的治疗而言,当hG-CSF-L-Fc结合于祖细胞或骨髓系的其它细胞表面上的G-CSF-Rc时,融合蛋白的Fc区域必须不会介导不良效应子功能而裂解或除去这些细胞。因此,hG-CSF-L-Fc的Fc区域必须是非裂解性的,即在结合FcγRs和C1q而触发效应子功能方面,Fc必须是无活性的。显然,没有一种天然的IgG同种型适合产生hG-CSF-L-Fc融合蛋白。为了得到非裂解性的Fc,必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变,以减少其效应子功能。
通过比较人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列,CH2区域氨基末端附近的Fc部分显示在IgG Fc与FcγRs的结合中起作用。已用基因工程抗体证明在234位到237位基序的重要性(参见,如Duncan等人,Nature,332:563-564,1988)。按Kabat等人(Seguences of Proteins of ImmunologicalInterest,,第5版,United States Department of Health and Human Services,1991)所述的EU编号体系将氨基酸残基编号。在四种人IgG同种型中,IgG1和IgG3与FcγRs的结合最好,且具有相同的序列Leu234-Leu-Gly-Gly237(图1仅显示了IgG)。在以低亲和力与FcγRs结合的IgG4中,其序列含有单个氨基酸取代,Phe取代234位的Leu。在不结合FcγRs的IgG2中,两个取代和一个缺失形成Val234-Ala-Gly237(图1)。为了减少Fc与FcγR的结合和ADCC活性,用Ala替代IgG4中的Leu235(参见,如Hutchins等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:11980-11984,1995)。在此基序中已用IgG2序列中的Pro233-Val-Ala235替代Glu233-Leu-Leu235来改变IgG1。这种替代使IgG1变体缺失了在小鼠中由FcγR-介导清除靶细胞的能力(参见,如Isaacs等人,J.Immunol.,161:3862-3869,1998)。
对FcγR与C1q结合非常重要的第二部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近(参见,如Duncan等人,Nature,332:738-740,1988)。在四种人IgG同种型中,这部分中仅有一个位点显示取代:用IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331替代IgG4中的Ser330和Ser331(图1)。Ser330的存在不影响FcγR与C1q的结合。用Ser替代Pro331使IgG1失去了与C1q的结合亲和力,而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4的补体固定活性(参见,如Tao等人,J.Exp.Med.,178:661-667,1993;Xu等人,J.Biol.Chem.,269:3469-3474,1994)。
我们发现可以设计至少三种Fc变体(vFc)和/或用于产生hG-CSF-L-vFc融合蛋白(图1)。人IgG2不结合FcγR,但显示出极弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的补体活性更低,而且依旧是FcγR非结合子。IgG4Fc在激活补体级联中有缺陷,且它与FcγR的结合亲和力比最高活性的同种型(IgG1)的低约一个数量级。与天然Fcγ4相比,具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1低的效应子功能。这些Fc变体都比天然人IgG Fc更适于制备G-CSF融合蛋白。在非裂解Fc的制备中也可引入其它替换,而不影响循环半衰期或导致不良的构型变化。
本发明有许多优点。血清中hG-CSF-L-cFc融合蛋白增高的活性和存在时间的延长,能减低剂量以及减少注射的频率。药物血清浓度的波动的减少意味着安全性和耐受性的改善。注射频率的减低能使患者有更好的顺应性和生活质量。因此具有非裂解Fc变体的hG-CSF-L-vFc融合蛋白能显著也有益于各种与免疫系统或造血系统相关的病症的治疗,包括癌症的化疗、白血病、贫血、AIDS、骨髓移植和慢性中性白细胞减少症。
发明内容
本发明的一方面涉及一种hG-CSF-L-vFc融合蛋白。这种hG-CSF-L-vFc融合蛋白含有人G-CSF、肽接头(以L表示)和人IgG Fc变体(以vFc表示)。较佳地,使用约20或更小(较佳地为约2)氨基酸长度的柔性肽和含有或由以下2个或多个氨基酸构成的柔性肽接头:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。IgG Fc变体是无裂解性的,且与天然IgG Fc相比含有氨基酸突变。
本发明的另一实施例为人Ig Fc,它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和HC3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU计数系统确定)含有氨基酸突变。据信这些氨基酸突变能降低Fc的效应子功能。
在本发明的另一实施例中,公开了一种从哺乳动物细胞系如CHO-衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法。用让重组融合蛋白在其生长培养基中超过10(较佳地为30)μg/106细胞的条件下培养转染的细胞系24小时。这些hG-CSF-L-vFc融合蛋白的特征为且表现出增加的/提高的生物活性,较佳地其体外活性至少是rhG-CSF的2倍(2X)(摩尔基础),而且延长其血清半衰期而无不良副作用,改善了药物动力学和药效,从而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。
本发明的另一方面提供了一种制备含有人G-CSF、柔性肽接头和人IgG Fc变体的重组融合蛋白的方法,这种方法包括:(a)生成CHO-衍生的细胞系;(b)用让重组融合蛋白在其生长培养基中每24小时期间内,每106个细胞表达超过10μg(较佳地为30μg)的条件下培养这种细胞系;和(c)纯化步骤(b)表达的蛋白质,其中重组融合蛋白的特征为且表现出增加的/提高的生物活性,较佳地其体外活性至少是rhG-CSF的2倍(2X)(摩尔基础)。当较佳地在人G-CSF和人IgG Fc变体间存在柔性肽接头,而此柔性肽接头含有或由约20个或更少(但不能少于2个)氨基酸;且柔性肽接头由2个或更多选自以下的氨基酸构成:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸;且其中人IgG Fc变体含有绞链区、CH2和CH3区域,它们选自:具有Pro331Ser突变的人IgG2、具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4、和具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1。
附图说明
图1显示了人IgG1、IgG2、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列。比较这三个部分:氨基酸区域228、234-237和330-331。用粗斜体显示这些变体的氨基酸突变。将EU计数系统用于氨基酸残基。
图2显示了分别用于phGFP表达载体作为HindIII-EcoRI片段的(A)hG-CSF-L-vFcγ2、(B)hG-CSF-L-vFcγ4和(C)hG-CSF-L-vFcγ1的核苷酸序列及它们演绎的氨基酸序列。氨基酸残基-30到-1是人G-CSF的前导肽。成熟的蛋白质含有人G-CSF(氨基酸残基1-174)、肽接头(氨基酸残基175到190)和Fc变体(vFcγ2的氨基酸残基191到418,vFcγ4的氨基酸残基191到419,和vFcγ1的氨基酸残基191到417)。在Fc区域中,粗体的核苷酸和相应的氨基酸突变还用下划线标出。
具体实施方式
1.构建编码hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白的基因
融合蛋白是用数个DNA片段构建而成的。用从人膀胱癌5637细胞系制备的RNA,通过逆转录和聚合酶链式反应(PCR)得到编码人G-CSF的前导肽和成熟蛋白质的基因。为了便于克隆,将引入限制性酶内切位点(HindIII)的SEQ ID NO:1用作5’寡核苷酸的引物。表1列出了用于克隆hG-CSF-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。3’引物(SEQ ID NO:2)除去了G-CSF末端密码子并引入了BamHI位点。将如此获得的长度约为600bp的DNA片段插入到接受载体(如pUC19)的HindIII和BamHI位点,得到phGCS质粒。由DNA测序验证人G-CSF基因的序列。
用从人白细胞制备的RNA和合适的5’(SEQ ID NO:3)和3’(SEQ IDNO:4)引物,通过逆转录和PCR得到编码人IgG2的Fc区域(Fcγ2)的基因。将得到的含有IgG2的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fcγ2的DNA片段作为模板,产生Fcγ2Pro331Ser变体,其中Fcγ2中331位的Pro被Ser替代。为了引入此突变,产生两个片段,然后用天然Fcγ2作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ ID NO:3作为5’引物并用SEQ ID NO:5作为3’引物生成5’片段。用SEQ ID NO:6作为5’引物并用SEQ ID NO:4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO:7作为5’引物和SEQ ID NO:4作为3’引物,将这两个片段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。SEQID NO:7引物含有编码16氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI限制性内切酶位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点,得到pL-vFcγ2质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备hG-CSF-L-vFcγ2融合基因,用HindIII和BamHI从phGCSF质粒上切下hG-CSF片段,然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将纯化的片段插入pL-vFcγ2质粒肽接头的5’末端,得到phG-CSF-L-vFcγ2质粒。该融合基因含有hG-CSF、Gly-Ser肽接头和Fcγ2变体基因。
在hG-CSF和Fc部分间存在的(且彼此化学结合)的肽接头(较佳地为柔性接头)增加了hG-CSF区域的柔性且提高了它的生物活性。对本发明而言,优选的是长度为约20个或更少氨基酸的肽接头。当一种氨基酸在本发明的范围之内时,优选长度约为20到2个氨基酸的柔性肽接头。宜使用含有或由2个或更多选自以下氨基酸构成的肽接头:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。一种肽接头的例子含有Gly-Ser肽构件,如GlyGlyGlyGlySer。图2A显示了含有编码hG-CSF序列的融合基因、16-氨基酸肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGLyGlyGlyGlySer)和Fcγ2Pro331Ser变体。
然后将编码hG-CSF-L-vFc融合蛋白的完整基因插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点。最终的表达载体质粒(称为phGFP2)含有在哺乳动物相比中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动子-增强子。该质粒还含有选择性标记物,从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性,而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外,当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷时,phGFP2表达载体含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因,从而存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增hG-CSF-L-vFcγ2融合基因和DHFR基因(参见,如美国专利No.4,399,216)。
2.构建编码hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白
由于绞链区域中重链间二硫键的分解,人IgG4部分会形成半抗体分子。而这在其它三种人IgG同种型中却没有观察到。用Pro(在IgG1和IgG2中的该位置发现的残基)替代Ser228的单氨基酸取代,从而形成IgG4完整的抗体分子(参见,例如Angal等人,Molec.Immunol.,30:105-108,1993;Owens等人,Immunotechnology,3:107-116,1997;美国专利No.6,204,007)。含有Leu235Ala突变以降低FcR结合的Fcγ4变体与这种附加的Ser228Pro突变也会产生同型融合蛋白制备物。
用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO:8)和3’引物(SEQ ID NO:9),通过逆转录和PCR得到编码人IgG4的Fc区域(Fcγ4)的基因。将得到的含有IgG4的绞链、CH2和CH3区域完整序列的Fcγ4的DNA片段作为模板,产生Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体(vFcγ4),其中Ser228和Leu235分别被Pro和Ala替代。用3’引物(SEQ ID NO:9)和含有Leu235Ala突变的5’引物(SEQ ID NO:10)扩增CH2和CH3区域。用SEQ ID NO:12作为5’引物和SEQ ID NO:9作为3’引物,在PCR中将这种扩增的片段与合成的长度为60个碱基(且含有Ser228Pro和Leu235Ala突变)的寡核苷酸(SEQ ID NO:11)连接起来。SEQ ID NO:12引物含有编码16氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点,得到pL-vFcγ4质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备hG-CSF-L-vFcγ4融合基因,用HindIII和BamHI从phGCSF质粒上切下hG-CSF片段,然后插入pL-vFcγ4质粒肽接头的5’末端,得到phG-CSF-L-vFcγ4质粒。此融合基因含有hG-CSF,一种16氨基酸Gly-Ser肽接头,和Fcγ4变体基因,然后将其插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为phGFP4。图2B显示了融合基因,含有编码hG-CSF、16个氨基酸肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体的序列。
3.构建编码hG-CSF-vFcγ1融合蛋白的基因
人IgG1重链的绞链区域含有包括3个半胱氨酸的15氨基酸残基(GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro)。在这3个半胱氨酸残基中,第2和第3个参与两个重链间二硫键的形成。第1个半胱氨酸残基参与该二硫键与IgG轻链的结合。由于Fc融合蛋白分子中不存在轻链,该半胱氨酸残基可能与其它半胱氨酸残基配对,而导致非特异性二硫键合。可以将Fcγ1的绞链区域切短,以消除第1个半胱氨酸残基(AspLysThrHisThrCysProProCys Pro)。用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO:13)和3’引物(SEQ ID NO:4),通过逆转录和PCR得到编码Fcγ1区域的基因。将得到的含有Fcγ1截短绞链区域和CH2及CH3完整序列的DNA配对用作模板,产生有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变(vFcγ1)的Fcγ1变体(vFcγ1)。
一种引入这些突变的方法如下:产生两个片段,然后用天然Fcγ1作为模板在重叠PCR中将它们装配起来。用SEQ ID NO:14作为5’引物并用SEQ ID NO:5作为3’引物生成5’片段。此5’引物含有Leu234Val、Leu235Ala突变,3’引物含有Pro331Ser突变。用SEQ ID NO:6作为5’引物并用SEQ ID NO:4作为3’引物生成3’片段。然后用SEQ ID NO:14作为5’引物和SEQ ID NO:4作为3’引物,将5’和3’片段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。用SEQ ID NO:16作为5’引物、SEQ ID NO:4作为3’引物,用PCR将如此扩增的长度约650bp的片段和合成的55碱基的寡核苷酸(SEQ ID NO:15)(含有Leu234Val和Leu235Ala)连接起来。SEQ ID NO:16引物含有编码16氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的序列。将得到的长度约为700bp的DNA片段插入接受载体(如pUC19)的BamHI和EcoRI位点,得到pL-vFcγ1质粒。用DNA测序验证该基因的序列。
为了制备hG-CSF-L-vFcγ1融合基因,用HindIII和BamHI从phGCSF质粒上切下hG-CSF片段,然后插入pL-vFcγ1质粒肽接头的5’末端,得到phG-CSF-L-vFcγ1质粒。此融合基因含有hG-CSF(一种16-氨基酸Gly-Ser肽接头),然后将Fcγ1变体基因插入哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和EcoRI位点(如hG-CSF-L-vFcγ2融合蛋白所述)。将这种最终表达的载体质粒命名为phGFP1。图2C显示了融合基因,含有编码hG-CSF、16个氨基酸的肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)、和有Ser234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1变体的序列。
4.在转染的细胞系中融合蛋白的表达
已生成了两种不同的rhG-CSF:从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)产生的糖基化的形式和细菌细胞产生的未糖基化的形式。糖基化的rhG-CFS含有吸附于133位苏氨酸残基的O-连接的寡糖,约占它分子量的4%。通过抑制聚合和构象的改变,这种碳水化合物链起到稳定蛋白质分子的作用(Oh-eda等人,J.Biol.Chem.,265:11432-11435,1990)。在用rhG-CSF进行的体外研究中,由CHO细胞产生的糖基化的形式的生物活性比细菌细胞产生的未糖基化的形式高(Nissen,Eur.J.Cancer,30A Suppl 3:S12-S14,1994)。另外,从CHO细胞衍生的rhG-CSF在结构特性和生物活性上与其天然对应物没有区别(Kubota等人,Biochem.(Tokyo),107:486-492,1990)。在健康志愿者的随机交叉研究中,糖基化rhG-CSF的周围血祖细胞的活动性比未糖基化的rhG-CSF强25到30%(参见,如Hoglund,Med.Oncol.,15:229-233,1998;Hoglund等人,Eur.J.Haematol.,59:177-183,1997)。为了得到最适合临床使用的蛋白质,如下在CHO-细胞中产生hG-CSF-L-vFc融合蛋白。
将重组phGFP1、phGFP2或phGFP4表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系,以表达hG-CSF-vFc融合蛋白。为了稳定高水平的表达,优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见,例如美国专利No.4,818,679)。一种优选的转染方法是电穿孔。也可以使用其它方法,包括磷酸钙共沉降、脂转染和原生质融合。在电穿孔中,用设置为250V电场和960μFd电容的Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA),在比色杯内的2-5×107个细胞中加入10μg用BspCI线性化的质粒DNA。在转染2天后,将培养基改成含0.18mg/ml G418的生长培养基。用抗人IgG Fc ELISA,测试对选择用药具有抗性的转染子的融合蛋白分泌。也可用抗-hG-CSF分析的ELISA进行表达的融合蛋白的定量。通过极限稀释96-孔组织培育板,亚克隆产生高水平Fc融合蛋白的孔。
为了实现融合蛋白较高水平的表达,宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中,用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。用极限稀释亚克隆能在高达1μg/ml MTX培养基中生长的转染子。测定分泌率对亚克隆的细胞系进行进一步的分析。分泌率水平超过约10(较佳地约30)μg/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系适应使用无血清生长培养基的悬浮培养。然后用条件培养基纯化融合蛋白。
5.融合蛋白的纯化和定性
用1N NaOH将含有融合蛋白的条件培养基滴定到pH7到8,然后用0.45微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Prosep A柱上。待融合蛋白结合于Prosep A后,弃去流出的组分。用PBS洗涤该柱,直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH为3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的融合蛋白。用0.4体积的1M K2HPO4中和,合并含有纯化对比的组分,并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤,并存储在4℃。在非还原条件下,由SDS-PAGE测得纯化的hG-CSF-L-vFc蛋白质的分子量范围为90到110kDa。在还原条件下,纯化的蛋白迁移至约50kDa。用BSA作为标准,通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。
6.体外生物分析
测得转染子或纯化蛋白质的悬浮液刺激鼠成髓细胞NFS-60细胞的增生(Shirafuji等人,Exp.Hematol.,17:116-119,1989)。NFS-60细胞应答rhG-CSF,而不应答rhGM-CSF或hM-CSF。将细胞维持在生长培养基(RPMI-1640培养基,含有10%FCS和1ng/ml鼠IL-3)。收集对数期的NFS-60细胞,并用分析培养基洗涤(不含鼠IL-3的生长培养基)。将每份共1×104个细胞的NFS-60样品(50μl)加到96孔组织培育板的各孔中。用50μl含有各种浓度hG-CSF-L-vFc融合蛋白或rhG-CSF对照(各从0.01到100nM)的分析培养基培养这些细胞。在各孔中添加10μl MTT(用PBS配制成2.5mg/ml)之前,在37℃、5%CO2湿润培养箱中培养该平板4天。4小时后,加入每孔100μl 10%SDS的0.01N HCl溶解细胞和甲
(Formazan)。然后在550nm读取该平板(参考光束设为690nm)。OD读数相对于rhG-CSF或融合蛋白的浓度作图。S形曲线的拐点表示产生50%最大效果(ED50)的浓度。因此可定量地比较hG-CSF-L-vFc相对于rhG-CSF的生物活性。较佳地,在摩尔基础上,重组融合蛋白的特性为且应表现出比rhG-CSF高至少2倍(2X)的活性。在本发明的一实施例中,hG-CSF-L-vFc融合蛋白的特异性活性范围约为1.5到6×109单位/μmol,而rhG-CSF约为0.75到3.0×109单位/μmol(以这种细胞的增生分析为基础)。
也可测试转染子或纯化蛋白悬浮液刺激人骨髓祖细胞增生和分化形成集落(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM))的能力。方法如下。洗涤用Ficoll-Pague离心的人骨髓的低密度细胞,并以1×106细胞/ml悬浮在含有5%FCS的Iscove改进的Dulbecco培养基(IMDM)中。37℃、5%CO2,将这些富含祖细胞的细胞在组织培育板上培养过夜,除去粘附的细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞)。然后用含有5%FCS的IMDM将悬浮液中的细胞调节成1×105细胞/ml。混合0.3ml细胞、15μl 20μg/ml干细胞因子、2.4ml甲基纤维素和0.3ml含若干浓度hG-CSF-L-vFc(或rhG-CSF对照)的培养基用于分析。将1ml这种细胞混合物置于35-mm培养皿上。然后将此培养皿置于37℃、5%CO2中10-14天,然后计数集落量。以rhG-CSF的浓度对hG-CSF-L-vFc浓度作剂量反应曲线图。
7.大鼠中体内药物动力学研究
通过尾静脉进行静脉注射或通过皮下注射,将100单位的rhG-CSF或hG-CSF-L-vFc融合蛋白注射入平均体重约为500g的Fisher大鼠(HarlanBioproducts for Science,Indianapolis,IN)。注射相同体积的PBS作为对照。注射后,在不同时间点(0、0.2、1、4、24、48、96和168小时)从眼球后采集一系列0.5ml的样品。每个时间点3只大鼠。将全血收集在含有抗凝剂的试管中,除去细胞,并在-70℃冷冻血浆直到进行分析。
将血浆样品用于NFS-60细胞分析,测定hG-CSF-介导的细胞增生的活性。在96孔培育板的各孔中加入每50μl重量为1×104细胞的样品。用50μl含有各种浓度滴定过的血液样品的分析培养基培养这些细胞。将平板在37℃、5%CO2湿润培养箱中放置4天。用10μl MTT(用PBS配的2.5mg/ml溶液)染色活细胞。4小时后,每孔加入100μl 10%SDS的0.0lNHCl溶液溶解细胞和甲
(Formazan)。然后在550nm读取该平板(参考光束是690nm)。将血清样品的活性对时间点作图,用于循环时间的计算。hG-CSF-L-vFc的活性比hG-CSF对照的降低慢许多,表明大鼠中融合蛋白的半衰期较长。
以上实施例仅起说明的作用。不能也不应将它们视为对本发明范围或精神的限制。本领域技术人员可以理解可使用许多相当于本发明目的的各种变化或替代,而本发明的目的仅由本说明书和所附权利要求书定义4。
表1.寡核苷酸的序列
SEQ ID NO:1
5’-cccaagcttcccagacccatggctggacct-3’
SEQ ID NO:2
5’-cggatccgggctgggcaaggtggcgta-3’
SEQ ID NO:3
5’-gagcgcaaatgttgtgtcga-3’
SEQ ID NO:4
5’-ggaattctcatttacccggagacaggga-3’
SEQ ID NO:5
5’-tggttttctcgatggaggctgggaggcct-3’
SEQ ID NO:6
5’-aggcctcccagcctccatcgagaaaacca-3’
SEQ ID NO:7
5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcag
agcgcaaatgttgtgtcga-3’
SEQ ID NO:8
5’-gagtccaaatatggtccccca-3’
SEQ ID NO:9
5’-ggaattctcatttacccagagacaggga-3’
SEQ ID NO:10
5’-cctgagttcgcggggggacca-3’
SEQ ID NO:11
5’-gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcgcgg
ggggacca-3’
SEQ ID NO:12
5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagag
tccaaatatggtccccca-3’
SEQ ID NO:13
5’-gacaaaactcacacatgccca-3’
SEQ ID NO:14
5’-acctgaagtcgcggggggaccgt-3’
SEQ ID NO:15
5’-gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcgcggggggac
cgt-3’
SEQ ID NO:16
5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagac
aaaactcacacatgccca-3’
Claims (5)
1.一种重组hG-CSF-L-vFc融合蛋白,其特征在于,所述的融合蛋白由人G-CSF、肽接头和人IgG Fc变体构成;其中,所述的肽接头为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer,它存在于人G-CSF和人IgG Fc变体之间;该人IgG Fc变体选自:
331位Pro突变为Ser的人IgG2的绞链、CH2和CH3区域;
228位Ser突变为Pro、235位Leu突变为Ala的人IgG4的绞链、CH2和CH3区域;和
234位Leu突变为Val、235位Leu突变为Ala和331位Pro突变为Ser的人IgG1的绞链、CH2和CH3区域。
2.如权利要求1所述的重组hG-CSF-L-Fc融合蛋白,其特征在于,所述的人IgG Fc变体为331位的Pro突变为Ser的人IgG2的绞链、CH2和CH3区域。
3.如权利要求1所述的重组hG-CSF-L-Fc融合蛋白,其特征在于,所述的人IgG Fc变体为228位Ser突变为Pro、235位Leu突变为Ala的人IgG4的绞链、CH2和CH3区域。
4.如权利要求1所述的重组hG-CSF-L-Fc融合蛋白,其特征在于,所述的人IgG Fc变体为234位Leu突变为Val、235位Leu突变为Ala和331位Pro突变为Ser的人IgG1的绞链、CH2和CH3区域。
5.一种产生权利要求1所述的hG-CSF-L-vFc融合蛋白的CHO-衍生的细胞系,其特征在于,该细胞系含有编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列,所述融合蛋白由人G-CSF、肽接头和人IgG Fc变体构成,其中,所述的肽接头为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer,它存在于人G-CSF和人IgG Fc变体之间;该IgG Fc变体选自:
331位Pro突变为Ser的人IgG2的绞链、CH2和CH3区域;
228位Ser突变为Pro、235位Leu突变为Ala的人IgG4的绞链、CH2和CH3区域;和
234位Leu突变为Val、235位Leu突变为Ala和331位Pro突变为Ser的人IgG1的绞链、CH2和CH3区域。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/968,362 | 2001-10-01 | ||
US09/968,362 US6797493B2 (en) | 2001-10-01 | 2001-10-01 | Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1410450A CN1410450A (zh) | 2003-04-16 |
CN1279059C true CN1279059C (zh) | 2006-10-11 |
Family
ID=25514159
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN02126839.8A Expired - Lifetime CN1279059C (zh) | 2001-10-01 | 2002-07-15 | 生物活性提高的人粒细胞集落刺激因子的Fc融合蛋白 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6797493B2 (zh) |
CN (1) | CN1279059C (zh) |
Families Citing this family (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2001283496A1 (en) * | 2000-07-25 | 2002-02-05 | Immunomedics, Inc. | Multivalent target binding protein |
US7737260B2 (en) | 2003-11-13 | 2010-06-15 | Hanmi Pharm. Co., Ltd | Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof |
US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
WO2003064625A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Sequitur, Inc. | Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency |
US7361740B2 (en) * | 2002-10-15 | 2008-04-22 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
US7365168B2 (en) * | 2002-10-15 | 2008-04-29 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
US7217797B2 (en) * | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
EP3192872A1 (en) | 2003-08-26 | 2017-07-19 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for treatment of bacterial infections |
US8188032B2 (en) * | 2003-10-10 | 2012-05-29 | National Institutes Of Health (Nih) | G-CSF transferrin fusion proteins |
JP2007531707A (ja) * | 2003-10-15 | 2007-11-08 | ピーディーエル バイオファーマ, インコーポレイテッド | IGの重鎖定常領域の位置250、314および/または428の変異誘発によるFc融合タンパク質血清半減期の改変 |
US8110665B2 (en) * | 2003-11-13 | 2012-02-07 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier |
US20080193441A1 (en) * | 2003-11-18 | 2008-08-14 | Iconic Therapeutics, Inc. | Homogeneous Preparations of Chimeric Protein |
WO2005121174A2 (en) * | 2004-06-04 | 2005-12-22 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Novel g-csf polypeptides, polynucleotides, modulators thereof, and methods of use |
US7910101B2 (en) * | 2004-10-25 | 2011-03-22 | Centocor, Inc. | Melanocortin receptor binding mimetibodies, compositions, methods and uses |
US7566456B2 (en) * | 2005-06-23 | 2009-07-28 | Haiming Chen | Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases |
UA97628C2 (ru) | 2005-08-16 | 2012-03-12 | Ханми Холдингз Ко., Лтд. | Способ получения fc-фрагмента иммуноглобулина, свободного от начального метионинового остатка, в массовом масштабе |
US7625564B2 (en) | 2006-01-27 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo |
AU2008232592A1 (en) * | 2007-03-29 | 2008-10-09 | University Of Southern California | Fusion proteins with cleavable spacers and uses thereof |
CN105175553B (zh) * | 2007-05-30 | 2019-11-22 | 浦项工科大学校产学协力团 | 免疫球蛋白融合蛋白 |
ES2415604T3 (es) * | 2007-05-30 | 2013-07-26 | Postech Academy-Industry- Foundation | Proteínas de fusión de inmunoglobulina |
BRPI0814465B1 (pt) | 2007-07-26 | 2021-11-23 | Novagen Holding Corporation | Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica |
CN101361968B (zh) | 2007-08-06 | 2011-08-03 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用 |
CN101157729B (zh) * | 2007-10-23 | 2011-01-12 | 南京大学 | 一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用 |
WO2010102982A1 (en) * | 2009-03-10 | 2010-09-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for improving the yield of a polypeptide |
US8637637B2 (en) | 2010-01-12 | 2014-01-28 | Bill Nai-Chau Sun | Fc fusion proteins of human growth hormone |
CN107098958B (zh) | 2010-03-26 | 2021-11-05 | 达特茅斯大学理事会 | Vista调节性t细胞介体蛋白、vista结合剂及其用途 |
US10745467B2 (en) | 2010-03-26 | 2020-08-18 | The Trustees Of Dartmouth College | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
US20150231215A1 (en) | 2012-06-22 | 2015-08-20 | Randolph J. Noelle | VISTA Antagonist and Methods of Use |
CN102260343A (zh) * | 2010-05-25 | 2011-11-30 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 重组人g-csf二聚体在治疗神经损伤疾病中的用途 |
CN102380091A (zh) | 2010-08-31 | 2012-03-21 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22在治疗病毒性肝炎中的应用 |
CN102380090A (zh) * | 2010-08-31 | 2012-03-21 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | G-csf二聚体在治疗嗜中性粒细胞减少症中的应用 |
US9938353B2 (en) | 2011-06-24 | 2018-04-10 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules |
US10400029B2 (en) * | 2011-06-28 | 2019-09-03 | Inhibrx, Lp | Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof |
EP2726092B1 (en) | 2011-06-28 | 2019-06-19 | Inhibrx, LP | Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof |
EP2737905B1 (en) | 2011-07-25 | 2019-09-11 | Generon (Shanghai) Corporation Ltd. | Use of g-csf dimer in preparation of medicament for treatment of neurodegenerative diseases |
EP2776061B1 (en) * | 2011-11-07 | 2019-08-14 | MedImmune, LLC | Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof |
WO2013075027A2 (en) * | 2011-11-17 | 2013-05-23 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Anti-sil6xr complex binding domains and methods of use |
CN103182072B (zh) | 2011-12-27 | 2017-05-03 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素‑22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途 |
CN102558358A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-11 | 张海涛 | 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用 |
CA2896951A1 (en) * | 2012-01-10 | 2013-07-18 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules |
CN103215340A (zh) * | 2012-01-19 | 2013-07-24 | 江苏粒福特生物科技有限公司 | 一种新颖的粒细胞制备及其抗癌活性检测方法 |
CN103044554B (zh) * | 2012-05-14 | 2014-08-27 | 旭华(上海)生物研发中心有限公司 | 重组二聚化人尿胰蛋白酶抑制剂、其制备方法及其应用 |
US9890215B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-02-13 | King's College London | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
EP2864352B1 (en) * | 2012-06-22 | 2018-08-08 | The Trustees Of Dartmouth College | Novel vista-ig constructs and the use of vista-ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
CA2884704C (en) | 2012-09-07 | 2023-04-04 | Randolph J. Noelle | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
KR102073748B1 (ko) * | 2013-01-31 | 2020-02-05 | 한미약품 주식회사 | 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법 |
CN103539860B (zh) * | 2013-11-01 | 2014-12-03 | 广州优联康医药科技有限公司 | 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白 |
CN104623637A (zh) | 2013-11-07 | 2015-05-20 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用 |
US11014987B2 (en) | 2013-12-24 | 2021-05-25 | Janssen Pharmaceutics Nv | Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same |
MX369173B (es) | 2013-12-24 | 2019-10-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anticuerpos y fragmentos anti-vista. |
CN107073109B (zh) | 2014-06-11 | 2021-08-06 | 凯西·A·格林 | Vista激动剂和拮抗剂抑制或增强体液免疫的用途 |
WO2016090347A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Immunext, Inc. | Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators |
US11820807B2 (en) | 2015-06-12 | 2023-11-21 | Ubi Pharma Inc | Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof |
BR112017027870A2 (pt) | 2015-06-24 | 2018-08-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista |
EP3313875A4 (en) | 2015-06-24 | 2018-12-26 | Board of Regents of the University of Texas System | Methods and compositions for treatment of symptoms associated with intracranial hemorrhage |
BR112018016461A2 (pt) | 2016-02-12 | 2019-10-01 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista, usos dos mesmos e métodos de identificação dos mesmos |
CN109072242A (zh) * | 2016-02-23 | 2018-12-21 | 科罗拉多州立大学董事会法人团体 | 用于治疗神经损伤的基于肽的方法 |
WO2017181143A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Generon (Shanghai) Corporation, Ltd. | Use of il-22 in treating necrotizing enterocolitis |
MX2018012469A (es) | 2016-04-15 | 2019-07-04 | Immunext Inc | Anticuerpos vista antihumanos y uso de los mismos. |
WO2019212429A2 (en) * | 2018-05-04 | 2019-11-07 | İlkogen İlaç Sanayi̇ Ve Ti̇caret A.Ş. | Stable hybrid fc fusion g-csf formulation |
AU2020220651A1 (en) | 2019-02-13 | 2021-09-09 | Ilkogen Ilac Sanayi Ve Ticaret A.S. | A long-acting G-CSF for preventing neutropenia or reducing duration of neutropenia |
CN111825770B (zh) * | 2019-04-16 | 2023-06-09 | 成都医学院 | 长效白介素21-Fc融合蛋白及其用途 |
US11267858B2 (en) * | 2019-05-31 | 2022-03-08 | Spectrum Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treatment using G-CSF protein complex |
US11684655B2 (en) | 2019-05-31 | 2023-06-27 | Spectrum Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating neutorpenia using G-CSF protein complex |
CN115703840A (zh) * | 2021-08-06 | 2023-02-17 | 上海康岱生物医药技术股份有限公司 | 抗Her-2抗体-粒细胞调节因子融合蛋白及其制法和应用 |
CN113480667B (zh) * | 2021-08-17 | 2023-03-28 | 长春萤火虫生物科技有限公司 | 一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5116964A (en) | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
US5349053A (en) | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
KR940005500B1 (ko) * | 1991-12-17 | 1994-06-20 | 삼성전관 주식회사 | 칼라 음극선관용 전자총 |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
ATE240395T1 (de) | 1994-03-29 | 2003-05-15 | Celltech Therapeutics Ltd | Antikörper gegen e-selektin |
US5723125A (en) | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
US6242195B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-06-05 | Genentech, Inc. | Methods for determining binding of an analyte to a receptor |
US6291661B1 (en) * | 1998-07-02 | 2001-09-18 | Immunex Corporation | flt3-L mutants and method of use |
-
2001
- 2001-10-01 US US09/968,362 patent/US6797493B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-07-15 CN CN02126839.8A patent/CN1279059C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-15 US US10/800,497 patent/US7226759B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-15 US US10/800,449 patent/US7232668B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1410450A (zh) | 2003-04-16 |
US20030082679A1 (en) | 2003-05-01 |
US20040265973A1 (en) | 2004-12-30 |
US20040259209A1 (en) | 2004-12-23 |
US6797493B2 (en) | 2004-09-28 |
US7232668B2 (en) | 2007-06-19 |
US7226759B2 (en) | 2007-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1279059C (zh) | 生物活性提高的人粒细胞集落刺激因子的Fc融合蛋白 | |
CN1267453C (zh) | 生物活性提高的人促红细胞生成素的Fc融合蛋白 | |
JP6709456B2 (ja) | インターロイキン15タンパク複合体およびそれらの用途 | |
DE60025832T2 (de) | Mehrere zytokin-antikörper komplexen | |
CN100467488C (zh) | Il-7融合蛋白 | |
US11028398B2 (en) | Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region | |
US20100041586A1 (en) | Method of improving efficacy of biological response-modifying proteins and the exemplary muteins | |
US5472857A (en) | DNA encoding canine granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) | |
CA2295149A1 (en) | Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker | |
EP2576624B1 (en) | Recombinant human g-csf dimer and use thereof for the treatment of neurological diseases | |
CN1057862A (zh) | 粒细胞菌落刺激因子的突变蛋白 | |
CN112142859A (zh) | 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用 | |
CN1150458A (zh) | 用于刺激造血的通式为gm-csf-l-epo或epo-l-gm-csf的杂合分子 | |
CN102875683B (zh) | 长效重组人生长激素的Fc融合蛋白 | |
US7344858B2 (en) | Glycosylated human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) isoform | |
Schooltink et al. | Designing cytokine variants by phage-display | |
CN1500811A (zh) | 人干扰素与无裂解性的人IgGFc变体的融合蛋白及制备 | |
EP0174999A1 (en) | Expression improvement methods and agents therefor. | |
EP4034146A1 (en) | Conjugated chimeric proteins | |
MXPA06001037A (en) | A method of improving efficacy of biological response-modifying proteins and the exemplary muteins | |
TW201714894A (zh) | 免疫球蛋白融合蛋白質 | |
TW201716445A (zh) | 免疫球蛋白融合蛋白質 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: GENERON (SHANGHAI) Corp.,Ltd. Assignor: PHARMAB, Inc. Contract record no.: 2011990000945 Denomination of invention: Fc fusion protein of human granulocyte colony stimulin with enhanced bioactivity Granted publication date: 20061011 License type: Exclusive License Open date: 20030416 Record date: 20110928 |
|
CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20061011 |
|
CX01 | Expiry of patent term |