JP6709456B2 - インターロイキン15タンパク複合体およびそれらの用途 - Google Patents
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Description
該可溶性融合タンパク(I)はIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり;該可溶性融合タンパク(II)はIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり;
該可溶性融合タンパク(I)および/または可溶性融合タンパク(II)は1以上のアミノ酸変異から生成したCysを有し、ジスルフィド結合は可溶性融合タンパク(II)と可溶性融合タンパク(I)に存在する対応したCysの対形成により形成される。
本発明の他の好ましい実施態様において、IL-15タンパク複合体で、該アミノ酸Cys変異部位はIL-15ポリペプチドまたはその機能性フラグメント上のL45, Q48, V49, L52, E53, C88またはE89で、好ましくはL52, E53またはE89で、より好ましくはL52で生じる。
本明細書において、アミノ酸の1文字コードおよび3文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558に記載されているとおりである。
以下に、実施例を参照して本発明を更に説明する;しかしながら、本発明の範囲は、それらに限定されない。
本発明の実施例において、具体的条件が記載されていない場合、試験は、通常、慣用条件下、または原料または製品の製造者が提案する条件下で行う。Sambrook et al., Molecμlar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecμlar Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY参照。試薬の供給源が具体的に与えられていない場合、試薬は、市販で入手できる慣用試薬である。
IL-15は、癌とウイルス性疾患治療の有望なサイトカインである。それは、IL-15Rα(IL-15レセプターα)によってT細胞とNK細胞の表面に位置するIL-15レセプターβ/γに例示され、それにより活性化T細胞の増殖が刺激される。従って、IL-15とIL-15レセプターαの結合能を増加させることは、さまざまなリンパ細胞の機能を著しく高め、免疫療法にとって非常に重要である。
材料:
真核生物発現ベクターpcDNA3.1 (+)(Life technologies, Cat. No. V790-20);IL-15(DNA配列1)、IL-15 Rα ECD、IL15Rα-sushi+(73)およびIgG1Fc DNAフラグメントは遺伝子合成会社(GENEWIZ, Inc., Suzhou)により合成された。
プライマーは遺伝子合成会社(GENEWIZ, Inc., Suzhou)により合成された。
1.フラグメント連結
IL-15Rα-ECD-Fcフラグメント:オーバーラップPCRを用いて、IL-15Rα-ECD、リンカーペプチドおよびFc(DNA配列2)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりIL-15Rα-ECD-Fcフラグメントを形成した。
Fc-IL-15Rα-ECDフラグメント:オーバーラップPCRを用いて、Fc、リンカーペプチドおよびIL-15Rα-ECD(DNA配列3)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりFc-IL-15Rα-ECDフラグメントを形成した。
IL-15Rα-sushi+-Fcフラグメント:オーバーラップPCRを用いて、IL-15Rα-sushi+、リンカーペプチドおよびFc(DNA配列4)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりIL-15Rα-sushi+-Fcフラグメントを形成した。
Fc-IL-15Rα-sushi+フラグメント:オーバーラップPCRを用いて、Fc、リンカーペプチドおよびIL-15Rα shushi+(DNA配列5)の順で3つのDNAフラグメントを結合することによりFc-IL-15Rα-sushi+フラグメントを形成した。
Cys変異を含む遺伝子フラグメントは、点変異により得た、たとえば:
IL-15 (L52C):52位上で、LはCに変異した(DNA配列6)
IL15Rα-ECD (S40C)-Fc:40位上で、SはCに変異した(DNA配列7)
Fc-IL-15Rα ECD (S40C)フラグメント:(DNA配列8)
IL-15Rα-shushi+ (S40C)-Fcフラグメント:(DNA配列9)
Fc-IL-15Rα-shushi+ (S40C) フラグメント:(DNA配列10)
制限エンドヌクレアーゼKpnI部位、Kozak配列およびシグナルペプチド配列は、PCRにより遺伝子フラグメントの5'-末端に導入した。KpnI部位と遺伝子フラグメントの配列を以下に示す:
ggtaccttgtgcccgggcgccaccATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGC(下線の配列は。KpnI制限部位、イタリックの配列はシグナルペプチドである);終止コドンTGAおよびNotI制限酵素部位は、それぞれ3つのフラグメントの3'-末端に導入した。
上記遺伝子フラグメントは、KpnIおよびNotI制限酵素部位によりベクターpcDNA3.1 (+)に挿入してpcDNA3.1-IL-15、pcDNA3.1-IL-15Rα-ECD-Fc、pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-EC、pcDNA3.1-IL-15Rα-shushi+-Fc、pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-sushi+などの発現ベクターを作成した。対応する発現プラスミドが得られた。
KOD kit (TOYOBO Cat.KOD-201)を、2.5μL 10 × KOD バッファー、2.5μL 2mM dNTPs、1μLプライマー1 (10μM)、1μLプライマー2 (10μM)、0.5μL KOD plus、1μL 25mM MgSO4および16μL ddH2Oを含む25μL 系(system)で部位特異的変異に使用した。合成方法は次の通りである:94°C 2分間, 94°C 30秒間, 55°C 30秒間, 68°C 11分間, 25サイクルの増幅後, PCR増幅は次の更なる68°C 11分で終了した。PCR生成物は、1μLのDpnI(NEB Cat. R0176L)で5時間消化し、次いでDH5aコンピテント細胞中にトランスフォームした。その後、クローンを配列決定のためにピックアップして望みのプラスミドpcDNA3.1-IL-15(L52C), pcDNA3.1-IL-15Rα-ECD(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-ECD(S40C), pcDNA3.1-IL-15Rα-shushi+(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-IL-15Rα-sushi+(S40C)および他の変異体遺伝子を得た。本発明の実施例に関与するタンパク複合体1は、DNA配列6および7を含む発現ベクターを発現することにより得られた。本発明の実施例に関与するタンパク複合体3は、DNA配列6および9を含む発現ベクターを発現することにより得られた。本発明の実施例に関与するタンパク複合体4は、DNA配列6および10を含む発現ベクターを発現することにより得られた。本発明の実施例に関与するタンパク複合体2は、DNA配列6および8を含む発現ベクターを発現することにより得られた。
以下の配列をベクター作成に用いた。単一の横線はシグナルペプチドDNA配列を表し、破線はペプチドリンカーDNA配列を表し、そして二重の横線は変異DNA配列を表す。
IL-15 (DNA配列1, 配列番号10):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCAACTGGGTGAATGTAATTAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCGAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGCGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCTTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA
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ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCTGA
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCAACTGGGTGAATGTAATTAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCGAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCATGTGAGTCCGGCGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCTTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGA
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTTGA
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGAC
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAGTGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCTGA
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本発明で提供するIL-15タンパク複合体は、可溶性融合タンパク(I)および可溶性融合タンパク(II)から成り;該可溶性融合タンパク(I)は生物活性ポリペプチドまたはその機能性フラグメントに共有的に結合したIL-15ポリペプチドを含む;可溶性融合タンパク(II)は生物活性ポリペプチドまたはその機能性フラグメントに共有的に結合したIL-15Rαポリペプチドを含む;該可溶性融合タンパク(I)または可溶性融合タンパク(II)は、1以上のアミノ酸変異部位に由来するCysを有し、ジスルフィド結合は可溶性融合タンパク(II)および可溶性融合タンパク(I)に存在する対応するCysのペアリング(対形成)により形成される。
1)融合タンパク質は2つの主要な分子成分を含み、その1つはIL-15生物活性を有する分子であり、他方はIL-15Rαまたはその機能性フラグメントを有するFc融合分子である;
2)IL-15生物活性を有する分子成分は、野生型IL-15またはIL-15機能性変異体に基づいて1以上のアミノ酸部位でシステイン変異を有し、これらのシステイン変異部位は、IL-15Rαまたはその機能性フラグメント上の対応するシステイン変異部位と対になってジスルフィド結合を形成する;
3)IL-15Rαまたは機能性フラグメントを有するFc融合分子成分は、IL-15Rαの完全な細胞外ドメインフラグメントまたはsushiドメインの短縮形を含むIL-15Rα機能性フラグメントに基づいて1以上のアミノ酸部位でシステイン変異を有している。これらのシステインは、IL-15またはその機能性変異体上の対応するシステイン変異部位と対になってジスルフィド結合を形成する;
4)融合タンパク質は、2つのプラスミドで単一の細胞株を同時導入または作成することによって安定に発現させることができ、単一分子が慣用の分離方法によって得られる。
IL-15 (配列番号1):(ヒトインターロイキン15アミノ酸配列、また対照IL-15配列)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISCESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
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タンパク複合体のリストは、次の通りである:
1.タンパク質の発現
IL-15/IL-15Rαタンパク質を、FreeStyle 293細胞(GIBCO, Cat#R79007)を用いることにより一時的にトランスフェクトして発現させた。FreeStyle 293細胞は、1%の最終濃度でΜltra Low IgG ウシ胎児血清(μltra low immunoglobμlins FBS, GIBCO, Cat # 16250078)を補充したFreeStyle 293発現培地(GIBCO, Cat#12338018)中で浮遊培養した。IL-15/IL-15Rα発現プラスミドおよびトランスフェクション試薬PEI (Polysciences, Cat#239662)を準備し、IL-15とIL-15Rαの2つのプラスミドを1:1~9:1の範囲の比率で、プラスミドの全量は100ug/100ml細胞、プラスミドのPEIに対する比率は質量で1:2 で同時導入した。トランスフェクションの日の細胞密度は1×106/mlであった。1LのFreeStyle 293細胞を調製してトランスフェクトした。50mlのOpti-MEM (GIBCO, Cat # 11058021)培地をプラスミドと混合し、5分間静置して、ろ過した。更に50mlのOpti-MEM培地をPEIと混合し、5分間静置して、ろ過した。プラスミドは、PEIと混合して、15分間静置した。プラスミドとPEIの混合物をゆっくりと細胞に加え、振とう培養器中、130rpm、37°C、8% CO2で培養した。5日後、上清はタンパク質精製のために遠心分離で収集した。
IL-15融合タンパクのアフィニティークロマトグラフィー
上清は、高速遠心分離後に細胞培養液から収集し、GE のProtein Aカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーに付した。クロマトグラフィーで用いた平衡化バッファーは1×PBS (pH7.4)であった。細胞上清をロードして結合させた後、PBSでUVがベースラインに戻るまで洗浄し、次いで目的タンパク質を溶出バッファー(酸性度、pH2.5-5)で溶出した。pHをTrisで中性に調整して、目的タンパク質を保存した。
アフィニティークロマトグラフィーで得られた生成物のpHを、pIよりも1-2 pH単位低く又は高くなるように調節した。次いで、サンプルは適切に希釈して、サンプルの伝導率を5ms/cm以下にコントロールした。対応するpH条件下でNaCl-グラジエント溶出を、カチオン交換またはアニオン交換などの技術分野で慣用のイオン交換カラムクロマトグラフィー法を用いることにより、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等のpHに対応する適切な緩衝液を用いて行った。異なる吸収ピークに対応する目的タンパク質をSDS-PAGEを用いて集め、保存した。
イオン交換クロマトグラフィーで得られた生成物を限外ろ過で濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーにロードして、目的の生成物を高純度で得るために、GE Superdex200 gelなどを用いて可能性のあるポリマーや他の成分を除去した。得られたタンパク質の純度はSDS-PAGEとSEC-HPLCにより検出できる。タンパク質の濃度は、UV分光光度法により測定した。
新鮮なPBMC(ヒト末梢血単核球、Shanghai Blood Center)を10%FBSを含むRPMI1640培地(Thermo Fisher Chemical Products Co., Ltd (Beijing), Cat No. SH30809.01B)中で培養し、遠心分離して、5×105 細胞/mlの細胞密度に再懸濁した。90μlを96穴プレートの各ウェルに添加した。サンプルは、PBSで異なる濃度に一定の倍数で希釈した。10μlを96穴プレートの各ウェルに加えて、37°C、5% CO2で48時間インキュベーター中で培養した。その後、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay kitでの細胞増殖の検出のために50μlを採取した。
1.主要材料
Mo7e(ヒト巨核球白血病細胞株)は、Peking Union Medical Collegeから購入した;
IL-15はNovoprotein, Cat No. C016から購入し、IL-15類縁体は自社製造で得た;
細胞計数Kit-8 (CCK-8)は、WST, Cat No. EX660から購入した;
GM-CSFは、NOVOProtein, Cat No. CC79から購入した。
1)Mo7eを改良RPMI-1640培地(2.05mM L-グルタミン, 10% FBSおよび15ng/ml GM-CSF含有)中、37°C (5% CO2)でインキュベーター中で培養した;
2)良い状態のMo7e細胞を室温、150 × gで5分間遠心分離した。上清は廃棄した;
3)細胞ペレットはGM-CSFフリー培地で2回洗浄し、次いで計数した;
4)細胞濃度を調整し、細胞数2×104 /ウェルおよび容量90μl (GM-CSF-free)で96穴プレートに蒔き、培養用細胞インキュベーター中に置いた;
5)IL-15とその類縁体は、PBSで4倍希釈し、10μl/ウェルを、96穴プレートでの細胞インキュベーション2時間後、細胞培養系に添加した。各濃度は3重に繰り返し、ブランクウェル(PBSのみ添加)はコントロールとして用いた;
6)細胞プレートはインキュベーター中で3日間培養した;
7)全ての試験ウェルに10μlのCCK-8を加え、インキュベーター中で3時間培養した;
8)450nm (OD450)での吸光度を測定した。
1.動物試験方法
32匹のC57BL/6マウス(SPF, Shanghai Super B&K Laboratory Animal Corp. Ltd.)を、4群、各群8マウスに分けた。1.5×105のB16F10細胞を尾静脈経由でマウスに静脈内注射した(Cell Resource Center, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, TCM36)。PBS、2μgのIL-15および5μgまたは15μgのタンパク複合体3を1日目にマウスに腹腔内注射した。2-3日毎に1回、体重を量り、14日目に各群から1匹のマウスを殺し、肺転移を観察した。全てのマウスは、16日目に屠殺した。全てのマウスの肺を取り出し、重量を量って、黒色の肺の塊を観察して、写真を撮り、次いで肺をホルマリンで固定して、黒色の塊の数をカウントした。
PBS群におけるマウスの肺は、多数の転移性黒色腫が成長していることを示した(73±43)。IL-15群の肺は、多数の黒色腫の塊(65±29)、PBS群の約 90%を示した。タンパク複合体3 - 5μg群の肺は、黒色腫の塊の部分的な転移(30±16)、PBS群の約41%を示した。タンパク複合体3 -15μg群の肺は、黒色腫の塊の部分的な転移(24±13)、PBS群の約33%を示した。
B16F10マウスモデルにおいて、タンパク複合体3の効力は、図8に見られるように、IL-15のものより著しく優れていた。
PBS群における相対的肺重量は、図9に見られるように、タンパク複合体3群のものより著しく高かった。
投与中に各群で体重の著しい減少は観察されなかったが、図10に見られるように、投与量が著しい毒性を持たないことを示唆している。
他の投与群を用いた他のB16F10マウスモデル試験において、タンパク複合体3の投与量を0.5ug/マウスに減らした時、我々は、著しい抗腫瘍活性を観察したが、一方で最大耐用量が30ug/マウスのとき、明らかな異常症状は観察されなかった。
要約すると、タンパク複合体3は、マウスの肺におけるB16F10細胞の転移を阻害することができ、用量依存性の効果を有していて、良い安全窓を有している。
1.動物試験方法
1.1マウスは、5日間実験室の環境に順化させた。
1.2腫瘍細胞の移植
C57BL/6マウス(SPF, Shanghai Xi Puer Bei Kai Experimental Animal Co., Ltd.)は、B16F10細胞(5×106/マウス)を用いて右肋骨の皮下に接種した。腫瘍は7日間成長させた。腫瘍の容積が160±40 mm3になった時、動物を4群、各群7マウスにランダムに分けた(d0)。
1.3投与量と方法
各群に第1日と第5日に1回、計2回、PBS、またはIL-15(2μg)、またはタンパク複合体3(5μg)、またはタンパク複合体3(15μg)を用いて試験薬物を腹腔内に注射した。マウスは2日毎に腫瘍容積と体重を測定し、データを記録した。
1.4統計
Excel統計ソフトウェア:平均値はavgとして計算する;SDはSTDEVとして計算する;SEMはSTDEV/SQRTとして計算する;異なる群間のP値はTTESTとして計算する。
腫瘍容積(V)は、V=1/2×Llength×Lshort 2:として計算する。
相対的容積(RTV)=VT/V0
腫瘍阻害率(%)= (CRTV-TRTV)/CRTV (%)
V0およびVTは、それぞれ試験の始めと試験の終わりの腫瘍容積を表す。CRTVおよびTRTVは、それぞれブランクコントロール群(PBS)および試験の終わりでの試験群の相対的腫瘍容積を表す。
移植したB16F10細胞腫瘍は非常に急速に成長したため、試験は9日目にストップした。B16F10腫瘍に対するIL-15タンパク質の成長阻害効果は、表1に示した。それぞれ1日目と5日目の1回投与の後、IL-15は9日目に移植したB16F10細胞腫瘍の成長を阻害しなかった。しかしながら、タンパク複合体3-5μg群およびタンパク複合体3-15μg群における阻害率は、それぞれ30%および73%であり、タンパク複合体3-15μg群は腫瘍の成長を著しく阻害することができた。
1.動物試験方法
SDラット(n=2、Sipur-Bikai Experimental Animal Co., Ltd.により供給)に、終夜絶食後、投与量188μg/kgおよび容量5mlで腹腔内注射により投与した。0.2ml血液サンプルを、ラットの後眼窩神経叢を通じて投与前および投与後、0.5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 11h, 24h, 48h, 72hおよび96hに採取した。血液サンプルはチューブに集めて、30分間 4°Cでチューブに保ち、次いで10分間3500 rpmで遠心分離して、血清を単離した。-80oCで保存した。ラットは、投与2時間後に餌を与えた。
ラット血清におけるタンパク複合体3は、抗IL-15抗体でコーティングしたELISAプレートで捕捉した。抗ヒトIgG Fc抗体を濃度曲線を検出するために用いた。ラットにおけるタンパク複合体3の測定したin vivo半減期は、約13.7hであった(図10)。IL-15のin vivo半減期は、1hより少ないことが報告されており(J Immunol 2006; 177:6072-6080)、これはタンパク複合体3が著しく延長したin vivo半減期を有することを示している。
Claims (20)
- 可溶性融合タンパク(I)および可溶性融合タンパク(II)から成るIL-15タンパク複合体であって、
該可溶性融合タンパク(I)が、IL-15ポリペプチドであり;
該可溶性融合タンパク(II)が、IL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントであり;
該可溶性融合タンパク(I)または該可溶性融合タンパク(II)が1以上のアミノ酸変異に由来するCysを有し、ジスルフィド結合が可溶性融合タンパク(II)と可溶性融合タンパク(I)に存在する対応するCysの対形成により形成され、
アミノ酸Cys変異がIL-15ポリペプチド上のV49, L52またはE53で生じ、
アミノ酸Cys変異がIL-15Rαポリペプチド上のL42またはS40で生じ、
IL-15Rαの機能性フラグメントが、ヒトインターロイキン15 Rα活性を持つsushiドメインを含む、IL-15Rαの細胞外ドメインフラグメントの短縮形である、IL-15タンパク複合体。 - 可溶性融合タンパク(I)および/または可溶性融合タンパク(II)がFcフラグメントまたはその変異体に共有結合している、請求項1に記載のIL-15タンパク複合体。
- 可溶性融合タンパク(I)の配列が配列番号2である、請求項1に記載のIL-15タンパク複合体。
- 可溶性融合タンパク(II)がIL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントおよびFcフラグメントによって構成される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体。
- IL-15Rαポリペプチドまたはその機能性フラグメントはFcフラグメントのN末端に結合する、請求項4項に記載のIL-15タンパク複合体。
- Fcフラグメントは配列番号9に示される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体。
- 可溶性融合タンパク(II)の配列が、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8から成る群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体。
- 可溶性融合タンパク(I)および可溶性融合タンパク(II)の下記の組み合わせ:
から選択される、請求項1に記載のIL-15タンパク複合体。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体をコードする、核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含む、DNAベクター。
- 請求項10に記載のDNAベクターを含む、宿主細胞。
- 方法が:
請求項11に記載の宿主細胞を請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体を発現するのに十分な条件下で培養し;
IL-15タンパク複合体を発現させて精製することを含む、
請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体の製造方法。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含有する、医薬組成物。
- 生物材料の処理に使用するための請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の治療有効量。
- IL-15介在性疾患または障害の治療のための薬物の製造における、請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の使用。
- 疾患または障害が、感染症、癌、血液疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患から成る群から選択される、請求項15に記載の使用。
- 癌は、メラノーマ、結腸直腸癌、皮膚癌、リンパ腫、腎細胞癌、肝臓癌、肺癌、胃癌および乳癌から成る群から選択され;
感染症は、痘瘡ウイルス感染症、HIV感染症、細菌感染症、真菌感染症およびHBV感染症から成る群から選択され;
血液疾患は、貧血症、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群およびT細胞大顆粒リンパ球性白血病から成る群から選択され;
自己免疫疾患は、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、胃炎および粘膜炎から成る群から選択される、請求項16に記載の使用。 - IL-15タンパク複合体または医薬組成物が、小分子阻害剤または抗体薬物と組み合わせて投与される、請求項15〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 小分子阻害剤は、標的化学療法剤または放射線治療剤から選択され;
抗体薬物は、抗CD20、抗PD1、抗PDL1、抗Her2、抗EGFRおよび抗c-MET抗体から選択される、請求項18に記載の使用。 - 細胞免疫療法が特にDC, CIK, DC-CIK, ECIK, NK, CAS-T, BiAb-T, TCR-TおよびCAR-Tの腫瘍免疫療法である、細胞免疫療法のための薬物の製造における、請求項1〜8のいずれか1項に記載のIL-15タンパク複合体、または請求項13に記載の医薬組成物の使用。
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