ES2828037T3 - Complejo de proteína interleuquina-15 y utilización del mismo - Google Patents
Complejo de proteína interleuquina-15 y utilización del mismoInfo
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Abstract
Complejo de proteína IL-15 que consiste en una proteína de fusión soluble I y una proteína de fusión soluble II, en el que la proteína de fusión soluble I es un polipéptido IL-15 o un fragmento funcional del mismo y la proteína de fusión soluble II es un polipéptido IL-15Rα o un fragmento funcional del mismo, en el que la proteína de fusión soluble I y/o la proteína de fusión soluble II posee Cys resultante de una o más mutaciones de aminoácidos y se forma un enlace disulfuro mediante apareamiento de la Cys correspondiente presente en la proteína de fusión soluble II y la proteína de fusión soluble I, en el que la mutación del aminoácido Cys se produce en L45, Q48, V49, L52, E53, C88 o E89 en el polipéptido IL-15 o un fragmento funcional del mismo, y/o en el que la mutación del aminoácido Cys se produce en K34, L42, A37, G38 o S40 en el polipéptido IL-15Rα o fragmento funcional del mismo.
Description
DESCRIPCIÓN
Complejo de proteína interleuquina-15 y utilización del mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un complejo de proteína IL-15 y usos del mismo, y se refiere además a un complejo soluble de proteína IL-15/IL-15Ra y a su utilización como agente terapéutico particular para el cáncer y las enfermedades autoinmunitarias.
Antecedentes de la invención
La interleuquina-15 (IL-15), descubierta por Grabstein et al. en 1994, es una citoquina de aproximadamente 12 a 14 kD, que desempeña una función en la respuesta inmunitaria normal en los organismos, tal como la estimulación de la proliferación de las células T, las células B y las células asesinas naturales (NK).
IL-15 es un miembro de una familia de citoquinas de haces pequeños de cuatro hélices a. IL-15 requiere la unión a su receptor para ejercer actividad biológica. El receptor de IL-15 consiste en tres subunidades de receptor: receptor a de IL-15 (IL-15Ra), receptor p de IL-2 (IL-2Rp, también conocido como IL-15Rp o CD122) y Yc (también conocido como CD132). IL-15Ra contiene un dominio Sushi, que es capaz de unirse a IL-15, y resulta esencial para las funciones biológicas de IL-15 después de la unión.
Recientemente se ha encontrado que el complejo formado por IL-15 y su receptor IL-15Ra puede potenciar significativamente la actividad biológica de IL-15. Los estudios indican que el complejo formado por iL-15 y el receptor soluble IL-15Ra es significativamente superior a IL-15 específicamente en la estimulación de la proliferación de linfocitos CD8+ de memoria y células NT/NKT. IL-15/IL-15Ra expande e induce significativamente la proliferación de las células CD122-high, incluyendo los linfocitos T CD8+ de memoria que han sido estimulados por antígenos. El complejo IL-15/IL-15Ra es más de 10 veces más potente que IL-15 por sí solo en la estimulación de la proliferación de las células T CD8+ de memoria y en el mantenimiento de su supervivencia; el mecanismo podría estar relacionado con la presentación trans.
Debido a que IL-15 ha sido uno de los más prometedores en el campo de la inmunoterapia tumoral, el NIH inició la investigación del tratamiento de IL-15 en el campo tumoral e intentó llevarlo a la fase clínica I. Sin embargo, IL-15 adolece de las desventajas de que es de pequeño peso molecular, presenta una semivida in vivo corta, la dosis repetida es de difícil control y hay una elevada probabilidad de que cause efectos secundarios inmunitarios sistémicos. Existe la necesidad urgente de encontrar un enfoque que pueda incrementar la semivida in vivo y que estimule o potencie la actividad biológica de IL-15 in vivo. Existen muchas compañías domésticas y extranjeras de instituciones de investigación dedicadas a investigaciones relacionadas con la inmunoterapia de IL-15, por ejemplo la patente n° CN100334112C (Shanghai Haixin Biotechnology Co., Ltd.), relacionada con la proteína homodimérica IL-15-IgG4_h-Fc para el tratamiento antimicrobiano de infecciones; la introducción del enlace disulfuro entre las moléculas de complejo de IL-15 e IL-15Ra de la presente invención podría incrementar la estabilidad molecular y bioactividad, simplificando simultáneamente el procedimiento de fabricación.
Descripción resumida de la invención
La presente invención proporciona una molécula de proteína con una semivida in vivo prolongada, una actividad in vitro incrementada y una actividad antitumoral significativa diseñada y preparada mediante métodos de ingeniería genética.
La presente invención proporciona un complejo de proteína IL-15 tal como se define en la reivindicación 1 que comprende una proteína de fusión soluble (I) y una proteína de fusión soluble (II), en el que:
la proteína de fusión soluble (I) es un polipéptido IL-15 o un fragmento funcional del mismo; la proteína de fusión soluble (II) es un polipéptido IL-15Ra o un fragmento funcional del mismo,
en el que la proteína de fusión soluble (I) y/o la proteína de fusión soluble (II) poseen Cys resultante de una o más mutaciones de aminoácidos según se define en la reivindicación 1 y se indica posteriormente; se forma un enlace disulfuro mediante apareamiento de la Cys correspondiente presente en la proteína de fusión soluble (II) y en la proteína de fusión soluble (I).
En una realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15 en el que dicha proteína de fusión soluble (I) y/o proteína de fusión soluble (II) se une covalentemente a un fragmento Fc o a un mutante del mismo.
En otra realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15, en el que la proteína de fusión soluble (II) se une covalentemente a un fragmento Fc o a un mutante del mismo.
En otra forma de realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15, en el que dicha mutación de aminoácidos Cys se produce en el polipéptido IL-15 o en un fragmento funcional del mismo.
En otra forma de realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15, en el que el sitio de mutación del aminoácido Cys se produce en L45, Q48, V49, L52, E53, C88 o E89 en el polipéptido IL-15 o fragmento funcional del mismo, preferentemente en L52, E53 o E89, más preferentemente en L52.
En otra realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15, en el que la secuencia de la proteína de fusión soluble (I) es SEC ID n° 2.
En otra forma de realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15, en el que dicha mutación de aminoácidos Cys se produce en el polipéptido IL-15Ra o en un fragmento funcional del mismo.
En otra realización preferente de la invención, un complejo de proteína IL-15, en el que dicho sitio de mutación de aminoácido Cys se produce en K34, L42, A37, G38 o S40 del polipéptido IL-15Ra o fragmento funcional del mismo, preferentemente en A37, G38 o S40, más preferentemente en S40.
En otra realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15, en el que dicha proteína de fusión soluble (II) se constituye mediante recombinación de un polipéptido IL-15Ra o un fragmento funcional del mismo y un fragmento Fc, preferentemente el polipéptido IL-15Ra o un fragmento funcional del mismo unido al extremo N-terminal del fragmento Fc; más preferentemente, el fragmento Fc se muestra en SEC ID n° 9.
En otra realización preferente de la invención, un complejo de proteína IL-15, en el que la secuencia de dicha proteína de fusión soluble (iI) se selecciona del grupo que consiste en SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7 y SEC ID n° 8, preferentemente SEC ID n° 5 o SEC ID n° 6.
En otra realización preferente de la presente invención, un complejo de proteína IL-15 seleccionado de las combinaciones siguientes de una proteína de fusión soluble (I) y una proteína de fusión soluble (II):
La presente invención se refiere además a un ácido nucleico, codificante del complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra tal como se ha indicado anteriormente.
La presente invención se refiere además a un vector de ADN, que comprende un ácido nucleico tal como se ha indicado anteriormente.
La presente invención se refiere además a una célula huésped, que comprende un vector de ADN tal como se ha indicado anteriormente.
La presente invención se refiere además a un método para preparar un complejo de proteínas de IL-15/IL-15Ra tal como se ha indicado anteriormente, en el que el método comprende: cultivar la célula huésped de la presente invención bajo condiciones suficientes para la expresión del complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra tal como se ha indicado anteriormente, expresando y purificando el complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra.
La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende el complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra de la presente invención y un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere además a un método para estimular o inhibir la respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende: administrar en el mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz del complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra según la presente invención, o la composición farmacéutica según la presente invención.
La presente invención se refiere además a la utilización del complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra según la presente invención, o la composición farmacéutica según la presente invención, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por IL-15, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedad sanguínea y enfermedad autoinmune. El cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de piel, linfoma, carcinoma de células renales, tumor sólido, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer de estómago y cáncer de mama; la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en infección por virus de la viruela, infección por el VIH, infección bacteriana, infección fúngica e infección por el VHB; la enfermedad sanguínea se selecciona del grupo que consiste
en anemia, leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásico y leucemia linfocítica granular de células T grandes; la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de esclerosis múltiple, soriasis, artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias, gastritis e inflamación mucosal. El complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra o la composición farmacéutica puede utilizarse sola o en combinación con otros fármacos. El otro fármaco es un inhibidor de molécula pequeña o un fármaco de anticuerpo; el inhibidor o inhibidores de molécula pequeña se seleccionan preferentemente de los agentes quimioterapéuticos o radioterapéuticos dirigidos, más preferentemente de uno o más agentes alquilantes; el fármaco o fármacos de anticuerpo se seleccionan preferentemente de uno o más anticuerpos monoclonales, más preferentemente el anticuerpo o anticuerpos anti-CD20, anti-PDl, anti-PDLl, anti-Her2, anti-EGFR y anti-c-MET.
La presente invención se refiere además a un método para tratar o prevenir una enfermedad, que incluye, aunque sin limitación, el tratamiento quimioterapéutico, radioterapéutico, quirúrgico, etc. El antígeno asociado a la enfermedad se expresa en dicha enfermedad. El método comprende administrar en el paciente un complejo de proteínas IL-15/IL-15Ra tal como se ha indicado anteriormente o una composición farmacéutica tal como se ha indicado anteriormente; formar un complejo de unión específico entre las células que expresan antígeno asociado a enfermedad y las células inmunitarias que expresan IL-l5Ra, suficiente para activar dichas células inmunitarias y eliminar dichas células que expresan antígeno asociado a la enfermedad mediante las células inmunitarias. Las células que expresan antígeno asociado a enfermedad preferentemente son células tumorales o células infectadas por virus. Las células inmunitarias son preferentemente células T, células LAK o células NK. La enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad infecciosa, cáncer, enfermedad sanguínea y enfermedad autoinmune. El cáncer es preferentemente se seleccionado del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de piel, linfoma, carcinoma de células renales, tumor sólido, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer de estómago y cáncer de mama. La enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en infección por virus de la viruela, infección por el VIH, infección bacteriana, infección fúngica e infección por el VHB. La enfermedad sanguínea se selecciona del grupo que consiste en anemia, leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásico y leucemia linfocítica granular de células T grandes. La enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, soriasis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria, gastritis e inflamación mucosal.
La presente invención se refiere además a un método de terapia de combinación para tratar o prevenir una enfermedad, que comprende administrar en el paciente un complejo de proteínas IL-l5/IL-15Ra tal como se ha indicado anteriormente o una composición farmacéutica tal como se ha indicado anteriormente, en combinación con otros fármacos, tales como un inhibidor de molécula pequeña o un fármaco de anticuerpos. El inhibidor o inhibidores de molécula pequeña se seleccionan preferentemente de los agentes quimioterapéuticos o radioterapéuticos dirigidos, más preferentemente de uno o más agentes alquilantes; el fármaco o fármacos de anticuerpos se seleccionan preferentemente de uno o más anticuerpos monoclonales, más preferentemente el anticuerpo o los anticuerpos anti-CD20, anti-PDl, anti-PDLl, anti-Her2, anti-EGFR y anti-c-MET.
Para una mejor comprensión de la presente exposición, se definen específicamente determinados términos técnicos y científicos posteriormente. A menos que se defina específicamente en otro sitio en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos generalmente presentan el mismo significado que el comprendido comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente exposición.
Términos
Tal como se utiliza en la presente memoria, el código de una letra y el código de tres letras para aminoácidos son tal como se indica en J. Biol. Chem. 243, p3558, 1968.
En la presente invención, el “complejo de proteínas” o “proteína de complejo” de la presente invención se refiere a una proteína formada mediante la unión de dos proteínas monoméricas diferentes.
En la presente invención, la proteína monomérica (es decir, la proteína de fusión soluble (I) o la proteína de fusión soluble (II)) a partir de la que se constituye el complejo de proteínas puede ser una proteína de fusión o una proteína no de fusión.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “proteína de fusión” se refiere a un producto proteína obtenido mediante la unión de las regiones codificantes de dos o más genes mediante la utilización de un método de recombinación genética, un método químico u otros métodos adecuados, y la expresión del gen recombinante bajo el control de una secuencia reguladora idéntica. En algunas realizaciones de la presente invención, la proteína de fusión soluble (I) es una proteína monomérica obtenida mediante expresión por fusión o no fusión de IL-15 o una variante de la misma con un polipéptido biológicamente activo, tal como un fragmento Fc, y la proteína de fusión soluble (II) es una proteína monomérica obtenida mediante expresión por fusión o no fusión de IL-15Ra o una variante de la misma con un polipéptido biológicamente activo, tal como un fragmento Fc. En las proteínas de fusión de la invención, las regiones codificantes de dos o más genes pueden fusionarse mediante una o más secuencias codificantes del conector o conectores peptídicos en uno o varios sitios. El conector peptídico también puede utilizarse para construir la proteína de fusión de la invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “IL-15” o “fragmento funcional” puede ser cualquier IL-15 (interleuquina-15) o un mutante de la misma, tal como IL-15 humana o no humana de mamífero o IL-15 de no mamífero. Los mamíferos no humanos ejemplares comprenden cerdos, conejos, monos, chimpancés, ratones y similares; los no mamíferos comprenden pollos y similares. Preferentemente, es IL-15 humana y fragmentos funcionales de la misma. Se encuentra una molécula de interleuquina-15 humana madura (SEC ID n° 1) en la base de datos UniProtKB, número de acceso P40933, 49-162aa. La expresión “fragmento funcional de IL-15” se refiere a un mutante obtenido mediante una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, con efectos alterados sobre la función biológica u otras propiedades de IL-15. Dichas alteraciones de aminoácidos pueden incrementar o reducir la interacción entre IL-15 y su receptor IL-15Ra o IL-15Rp; o incrementar o reducir la actividad biológica de IL-15, tal como su actividad en la estimulación de la proliferación de las células inmunitarias, o dichas mutaciones de aminoácidos establecerán enlaces covalentes entre IL-15 y su receptor, o provocarán que el enlace covalente sea más estable. Por ejemplo, IL-15 (L52C), es decir, en la posición 52, la leucina L es sustituida por cisteína C (SEC ID n° 2) y determinado aminoácido en IL-15Ra correspondiente a dicho sitio es sustituido por C para formar un enlace disulfuro con el mismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “IL-15Ra” o “fragmento funcional” puede ser cualquier IL-15Ra o un mutante del mismo, tal como IL-15Ra humano o no humano de mamífero o IL-15Ra de no mamífero. Los mamíferos no humanos ejemplares comprenden cerdos, conejos, monos, chimpancés, ratones y similares; los no mamíferos comprenden pollos y similares. Preferentemente es IL-15Ra humano, más preferentemente una parte de dominio extracelular del receptor a de la interleuquina-15 humana, denominada IL-15Ra ECD (SEC ID n° 3); ver la base de datos UniProtKB, número de acceso Q13261, 31-205aa. La expresión “fragmento funcional de IL-15Ra”, preferentemente es una forma acortada del fragmento de dominio extracelular de IL-15Ra que es una molécula que comprende un dominio Sushi obtenido mediante una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, con actividad de receptor a de interleuquina-15 humana, tal como IL-15Ra-sushi (SEC ID n° 4).
La expresión “fragmento Fc” se refiere a una región de cadena constante de inmunoglobulina humana, especialmente el extremo C-terminal o una parte de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, sin actividad de unión a antígeno, y es un sitio para la interacción entre la molécula de anticuerpo y la molécula efectora o las células. Por ejemplo, una región Fc de inmunoglobulina puede comprender dos o más dominios de la cadena pesada CH1, CH2, CH3 y CH4 en combinación con una región bisagra de inmunoglobulina. Según la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada, las inmunoglobulinas pueden dividirse en diferentes categorías, principalmente en cinco clases de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Algunos de ellos pueden dividirse adicionalmente en subtipos (isotipos), p.ej., IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 e IgA-2 y diferentes genotipos.
La expresión “fragmento Fc” preferentemente comprende por lo menos una región bisagra de inmunoglobulina y las regiones CH2 y CH3 de IgG. Más preferentemente comprende un dominio CH2, un dominio CH3 y una región bisagra de inmunoglobulina, la posición de aminoácido inicial de la región bisagra puede modificarse.
La expresión “conector peptídico (conector)” en la presente invención es un péptido utilizado para conectar IL-15 o IL-15Ra con una variante de Fc, a fin de garantizar el plegamiento correcto y estabilidad de la proteína. El “conector peptídico” de la presente invención es preferentemente (GGGGS)n, en donde n puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5 o más, preferentemente n es 2 a 4. En el caso de que la secuencia del conector peptídico sea excesivamente corta, el plegamiento avanzado de la estructura de dos proteínas puede resultar afectado y, de esta manera, interferir una con otra; en el caso de que la secuencia del conector peptídico sea excesivamente larga, aparece el problema de la inmunogenicidad, ya que la secuencia misma del conector peptídico es un nuevo antígeno.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “complejo de proteínas” es preferentemente un producto de los genes coexpresados, por ejemplo coexpresados en células procarióticas, tales como E. coli, o coexpresadas en células eucarióticas, tales como 293 y c Ho .
Tal como se utiliza en la presente memoria, “coexpresión” se refiere a que se expresan múltiples genes juntos en una célula para generar simultáneamente sus productos. Dichos genes pueden encontrarse presentes simultáneamente y controlarse y expresarse por separado o en común. En la presente invención, preferentemente se coexpresan dos genes en una célula eucariótica. El producto obtenido mediante coexpresión de genes conduce a la formación de un complejo de manera eficiente y fácil.
La “administración” o “tratamiento”, tal como se aplica a los materiales biológicos, tales como un sujeto experimental, célula, tejido, órgano o líquido biológico animal o humano se refiere al contacto de un agente farmacéutico, terapéutico o diagnóstico exógeno, o la composición con el material biológico que incluye un sujeto, célula, tejido, órgano o líquido biológico animal o humano. La “administración” o “tratamiento” puede referirse, p.ej., a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula comprende poner en contacto un reactivo con la célula, así como poner en contacto un reactivo con un líquido, en donde el líquido se encuentra en contacto con la célula. La “administración” o “tratamiento” significa además tratamientos in vitro y ex vivo, p.ej., de una célula, con un reactivo, diagnóstico, compuesto ligante o con otra célula. El “tratamiento”, tal como se aplica a un ser humano, animal o a un sujeto, se refiere al tratamiento terapéutico, a medidas profilácticas o preventivas, a aplicaciones de investigación y diagnósticas. El “tratamiento” tal como se aplica a un ser humano, animal
o a un sujeto, o célula, tejido u órgano, comprende poner en contacto un agonista de IL-15 o antagonista de IL-15, con un ser humano o animal, un sujeto, una célula, tejido, compartimiento fisiológico o líquido fisiológico. El “tratamiento de una célula” comprende la situación en la que el agonista de IL-15 o antagonista de IL-15 entra en contacto con el receptor de IL-15, p.ej., en fase líquida o en fase coloidal, y también comprende la situación en que el agonista o antagonista no entra en contacto con la célula o el receptor.
El término “tratar” se refiere a administrar una gente terapéutico internamente o externamente, tal como un complejo de proteína IL-5 de la presente invención o una composición que lo contiene, en un paciente que sufre de una o más enfermedades o condiciones seleccionadas de “inmune” o “cáncer”. Dicho agente terapéutico es conocido que posee un efecto terapéutico sobre dichas enfermedades o condiciones. Típicamente, el agente terapéutico se administra en una cantidad eficaz para aliviar una o más enfermedades o condiciones en el paciente o en la población que debe tratarse, mediante inducción de la regresión de dichas enfermedades o condiciones o mediante la inhibición de la progresión de dichas enfermedades o condiciones en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que resulta eficaz para aliviar cualquier enfermedad o condición particular (también denominada “cantidad terapéuticamente eficaz”) puede variar según varios factores, tales como el estado de enfermedad, la edad y el peso corporal del paciente, y la capacidad del fármaco de inducir una respuesta deseada en el paciente.
La expresión “enfermedad inmunitaria” o “trastorno inmunitario” incluye, p.ej., la inflamación patológica, el trastorno inflamatorio y la enfermedad o trastorno autoinmune. La expresión “enfermedad inmunitaria” también se refiere a infección, infección persistente y trastorno proliferativo, tal como cáncer, tumor y angiogénesis. La expresión “enfermedad cancerosa” incluye, p.ej., cáncer, células de cáncer, tumor, angiogénesis y lesión precancerosa, p.ej., displasia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “reacción en cadena de la polimerasa”, o “PCR”, se refiere a un procedimiento o técnica de amplificación descrito en, p.ej., la patente US n° 4.683.195. Generalmente, la información de secuencia de los extremos de la zona de interés o más allá de la zona de interés necesita encontrarse disponible, de manera que pueden diseñarse cebadores oligonucleótidos. Dichos cebadores presentarán una secuencia idéntica o similar a la de la cadena contraria al molde que debe amplificarse.
El término “opcional” u “opcionalmente” se refiere a que el suceso o situación que sigue puede producirse, aunque ello no resulta necesario, y la descripción incluye casos en los que el suceso o circunstancia ocurre y en los que no ocurre. Por ejemplo, “opcionalmente contiene 1 a 3 regiones variables de cadena pesada de anticuerpo” se refiere a que la región variable de cadena pesada de anticuerpo puede encontrarse, aunque no necesariamente, presente. En caso de presencia, puede haber 1, 2 o 3.
La expresión “composición farmacéutica” se refiere a una mezcla que contiene uno o más compuestos según la presente invención o una sal o profármaco fisiológica/farmacéuticamente aceptable de los mismos con otros componentes químicos, así como componentes adicionales, tales como portadores y excipientes fisiológica/farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica presenta como objetivo estimular la administración en un organismo, facilitando la absorción del ingrediente activo y ejerciendo de esta manera un efecto biológico.
La transformación de la célula huésped con el ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales bien conocidas por el experto en la materia. Los transformantes obtenidos se cultivan mediante la utilización de métodos convencionales para expresar el polipéptido codificado por el gen de la invención. El medio de cultivo puede seleccionarse de entre diversos medios de cultivo convencionales basándose en las células huésped utilizadas. Las células huésped crecen bajo las condiciones apropiadas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la estructura cristalina del complejo de IL-15 y el receptor a, p, y.
La figura 2 muestra residuos en la interfaz de IL-15 e IL-15Ra (receptor a).
La figura 3 muestra las posiciones relativas de los residuos candidatos mutantes situados en IL-15 e IL-15Ra. La figura 4 es un diagrama del modelo de un enlace disulfuro entre L52C en IL-15 y S40C en IL-15Ra.
La figura 5 indica el análisis de Western para la detección de la etiqueta de His en los productos moleculares coexpresados 1 a 9 en la presente invención.
La figura 6 indica el análisis de Western para la detección de la parte Fc en los productos moleculares coexpresados 1 a 18 en la presente invención.
La figura 7 muestra un diagrama estructural de los complejos de proteínas 1, 2, 3 y 4 de la presente invención. La figura 8 muestra el efecto del complejo de proteínas de la presente invención sobre los tumores metastásicos pulmonares en ratones, “* ” en la figura representa p<0,05 vs. PBS.
La figura 9 muestra el efecto del complejo de proteínas sobre el peso pulmonar relativo (peso pulmonar/peso corporal) de ratones.
La figura 10 muestra el efecto del complejo de proteínas sobre el peso corporal de ratones.
La figura 11 muestra la semivida del complejo de proteínas 3 en ratas.
Descripción detallada de la invención
A continuación, en la presente memoria se describe adicionalmente la presente invención en referencia a ejemplos; sin embargo, el alcance de la presente invención no se encuentra limitada a los mismos.
En los ejemplos de la presente invención, en donde no se indican condiciones específicas, los experimentos se llevan a cabo generalmente bajo condiciones convencionales, o bajo condiciones propuestas por los fabricantes de materiales o productos. Ver Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY. En donde no se proporciona específicamente el origen de los reactivos, los reactivos son reactivos convencionales disponibles comercialmente.
Ejemplo 1. Selección y verificación de mutantes
IL-15 es una citoquina prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades víricas. Puede presentarse a IL-15 receptor p/Y situado sobre la superficie de las células T y las células NK por IL-15Ra (IL-15 receptor a), estimulando de esta manera la proliferación de las células T activadas. Por lo tanto, el incremento de la capacidad de unión de IL-15 e Il-15 receptor a potenciará significativamente las funciones de una diversidad de linfocitos, lo que resulta muy importante para la inmunoterapia.
Puede observarse que los tres receptores se unen a IL-15 en tres orientaciones diferentes, respectivamente, respecto a la estructura del complejo cristalino de IL-15 y el receptor a, p, y (ID de PDB: 4GS7) (Fig. 1). Por lo tanto, en el caso de que los residuos presentes en la interfaz entre IL-15 y el receptor a sean modificados, la unión de IL-15 a los receptores p y Y no resultará afectada.
Los presentes inventores seleccionan la estructura del cocristal (ID de PDB: 2Z3Q) de IL-15 y del receptor a como la estructura inicial (la estructura cristalina del receptor a en dicha estructura es ligeramente más larga que la estructura en 4GS7). Los residuos situados en la interfaz de IL-15 y el receptor a se resumen a partir de la estructura (Tabla 1). Se fijó el valor de corte en 6 A respecto de la molécula contraria (fig. 2).
Tabla 1. Residuos en la interfaz de contacto de IL-15 y el complejo cristalino del receptor a
Se llevó a cabo un barrido de disulfuros en la interfaz entre IL-15 y el receptor a mediante la utilización del barrido de disulfuros en el MOE del software de simulación. El principio básico del barrido es la búsqueda de una combinación de residuos situada en IL-15 e IL-15 receptor a, respectivamente, dentro del intervalo de longitudes de enlaces disulfuro, de manera que se obtiene la combinación siguiente de residuos (Tabla 2) y las posiciones relativas de residuos mutantes candidatos (figura 3).
Tabla 2. Combinación de los residuos mutados en IL-15 e IL-15 receptor a
La selección para la combinación de mutaciones se llevó a cabo según los principios siguientes. 1. No seleccionar los residuos próximos al enlace disulfuro intramolecular, de manera que se evite el error de correspondencia y para evitar el apareamiento incorrecto del enlace disulfuro intramolecular original. 2. Intentar seleccionar los residuos que no afectarán a la estructura tridimensional de la proteína tras la mutación. 3. Seleccionar los residuos que minimizarán el efecto sobre la energía de la estructura completa tras la mutación.
Con el fin de cumplir el requisito 1, anteriormente, de la estructura cristalina del complejo, puede observarse que en la estructura de IL-15 se forman enlaces disulfuro intramoleculares entre C35 y C85, y entre C42 y C88, respectivamente.
Por lo tanto, resulta posible excluir la posibilidad de que E87 y E89, cadena arriba y cadena abajo de C88, respectivamente, sean residuos candidatos en IL-15, y excluir la posibilidad de queP67 y K34 en el receptor a correspondiente sean residuos candidatos. Además, resulta necesario excluir la posibilidad de un enlace disulfuro formado por el residuo C88 en IL-15 con el residuo A37 en el receptor a. En la estructura del receptor a, C29 y C63 forman un enlace disulfuro. No se encontraron residuos candidatos próximos a la pareja.
A fin de cumplir el requisito 2, anteriormente, se analizó el complejo de cristalización. En primer lugar, la totalidad de L45, Q48, V49, L52 y E53 se encontraban situados en la hélice alfa en la estructura de IL-15. Además, la totalidad de L45, Q48 y V49 se encontraba situada en la parte intermedia de la hélice alfa. En el caso de que dichos residuos se muten a Cys, la torsión de la cadena lateral causada por la formación del enlace disulfuro puede presentar una influencia sobre la estructura de la hélice alfa original y afectar después a la totalidad de la estructura de la proteína. Por lo tanto, los residuos L52 y E53 en IL-15 se consideraron preferentes. En segundo lugar, en la estructura de IL-15 receptor alfa, L42 estaba situado en el pliegue beta; la totalidad de A37, G38 y S40 se encontraban situados en el bucle. Por lo tanto, los residuos A37, G38 y S40 presentes en IL-15 receptor alfa se consideraron preferentes. En vista de las dos estructuras, L52 de IL-15 y S40 de IL-25 receptor alfa se consideraron preferentes para la mutación a Cys, y finalmente condujeron a la formación de un enlace disulfuro intermolecular.
Con el fin de cumplir el requisito 3 anterior, se llevó a cabo un barrido de alaninas en todos los residuos anteriormente indicados mediante la utilización del software computacional Discovery Studio. Los resultados de cambio de energía calculados en las mutaciones (Tabla 3) muestran que L52A presente en IL-15 afectaron mínimamente a la estabilidad estructural, y S40A presente en IL-15 Receptor a afectó en grado mínimo a la estabilidad estructural. Por lo tanto, a partir de los resultados anteriores, L52 de IL1-5 y S40 de IL-15 receptor alfa pueden considerarse candidatos preferentes para la mutación a Cys, y finalmente para la formación del enlace disulfuro intermolecular (figura 4).
Tabla 3. Resultado del barrido de alaninas
En resumen, se diseñó un total de 8 pares de residuos de mutación. De entre ellos, L52 de IL-15 y S40 de IL-25 receptor alfa se consideraron preferentes para la mutación a Cys, y finalmente condujeron a la formación de enlace disulfuro.
Basándose en los 8 pares anteriormente indicados de residuos de mutación, se diseñaron las moléculas para la verificación de la expresión celular. Existen dos formas. Una es la molécula de fusión IL-15-Fc con mutación de Cys coexpresada con IL-15Ra con mutación de Cys (combinaciones 10 a 18) y la otra es Il-15-6his con mutación de Cys coexpresada con la molécula de fusión IL-15Ra-Fc con mutación de Cys (combinaciones 1 a 9). El sobrenadante celular obtenido de la coexpresión se sometió a análisis de Western. Su parte de marcaje de las combinaciones de producto de coexpresión 1 a 9 puede detectarse con anticuerpo anti-ratón-His (anticuerpo primario, abcam, ab14923) y anticuerpo de cabra antiratón-HRP (anticuerpo secundario, Jackson, 115-035-062) y la parte Fc de las combinaciones de producto de coexpresión 1 a 18 se detectaron con anticuerpo de cabra anti-Fc humano-HRP (Jackson, 109-035-098). Las combinaciones de coexpresión específicas se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Combinaciones de coexpresión de diferentes mutaciones
Tabla 4 (continuación)
El análisis de Western mostró que la coexpresión mediante apareamiento de IL-15 fusionado con Fc e IL-15Ra presentaba una tendencia a resultar en no correspondencia y a reducir la cantidad del producto diana que se apareaba correctamente. Sin embargo, tras la fusión con Fc, el apareamiento de IL-15Ra fusionado con Fc e IL-15 puede resultar en una molécula individual correctamente apareada. Entre ellos, los niveles de expresión de las combinaciones de coexpresión 5, 6 y 7 eran más elevados, el producto era altamente homogéneo y el tamaño de las bandas concordaba con lo esperado (figs. 5 y 6). Los resultados concuerdan bien con la predicción a partir de la simulación. Considerando los resultados de tanto la simulación por ordenador como las propiedades de los productos expresados por las células, los sitios de mutación de aminoácido Cys en IL-15 se seleccionaron en L45, Q48, V49, L52, E53, C88 o E89, preferentemente en L52, E53 o E89, más preferentemente L52. Los sitios de mutación de aminoácido Cys en IL-15Ra se seleccionaron en K34, L42, A37, G38 o S40, preferentemente en A37, G38 o S40, más preferentemente en S40. La más preferente es la mutación L52C en IL-15 apareada con S40C en IL-15Ra. Además, la estabilidad del complejo de proteína IL-15 puede mejorarse mediante la selección de dos o más parejas de enlaces disulfuro o introduciendo otras mutaciones no de cisteína entre IL-15 e IL-15Ra.
Ejemplo 2. Construcción de vectores relacionados
Materiales:
Vector de expresión eucariótico pcDNA3.1 (+) (Life Technologies, n° de cat. V790-20); IL-15 (secuencia de ADN n° 1), IL-15Ra ECD, IL15Ra-sushi+(73) y fragmento de ADN de IgG1-Fc fueron sintetizados por la compañía de síntesis génica (GENEWIZ, Inc., Suzhou);
los cebadores fueron sintetizados por la compañía de síntesis génica (GENEWIZ, Inc., Suzhou).
Procedimiento:
1. Ligamiento de fragmentos
Fragmento IL-15Ra-ECD-Fc: se utilizó PCR de solapamiento para formar el fragmento IL-15Ra-ECD-Fc mediante la unión de tres fragmentos de ADN en el orden de IL-15Ra-ECD, conector peptídico y Fc (secuencia de ADN n° 2).
Fragmento Fc-IL-15Ra-ECD: se utilizó PCR de solapamiento para formar fragmento Fc-IL-15Ra-ECD, mediante la unión de tres fragmentos de ADN en el orden de Fc, conector peptídico y IL-15Ra-ECD (secuencia de ADN n° 3). Fragmento IL-15Ra-sushi+-Fc: se utilizó PCR de solapamiento para formar el fragmento IL-15Ra-sushi+-Fc, mediante la unión de tres fragmentos de ADN en el orden de IL-15Ra-sushi+, conector peptídico y Fc (secuencia de ADN n° 4). Fragmento Fc-IL-15Ra-sushi+: se utilizó PCR de solapamiento para formar un fragmento Fc-IL-15Ra-sushi+, mediante la unión de tres fragmentos de ADN en el orden de Fc, conector peptídico y IL-15Ra-sushi+ (secuencia de ADN n° 5). Los fragmentos génicos que contenían la mutación de Cys se obtuvieron mediante mutación puntual, por ejemplo:
IL-15 (L52C): en la posición 52, se mutó L a C (secuencia de ADN n° 6)
IL15Ra-EcD (S40C)-Fc: en la posición 40, se mutó S en C (secuencia de ADN n° 7)
Fragmento Fc-IL-15Ra-ECD (S40C): (secuencia de ADN n° 8)
Fragmento IL-15Ra-sushi+ (S40C)-Fc: (secuencia de ADN n° 9)
Fragmento Fc-IL-15Ra-sushi+ (S40C): (secuencia de ADN n° 10).
2. Introducción de sitios de restricción y secuencia de péptido de señal:
El sitio Kpnl de endonucleasa de restricción, secuencia de Kozak y la secuencia de péptido de señal se introdujeron en el extremo 5'-terminal del fragmento génico mediante PCR. La secuencia entre el sitio Kpnl y el fragmento génico se muestra posteriormente (SEC ID n° 21):
GGTACCTTGTGCCCGGGCGCCACCATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGG CCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTCGGTGC (la secuencia subrayada es el sitio de restricción Kpnl; la secuencia en cursiva es el péptido de señal); el codón de terminación TGA y el sitio de enzima de restricción Notl se introdujeron en el extremo 3'-terminal de los tres fragmentos, respectivamente.
3. Construcción de vectores de expresión
Los fragmentos génicos anteriormente indicados se insertaron en el vector pcDNA3.1 (+) mediante los sitios de enzima de restricción Kpnl y Notl para construir los vectores de expresión, tales como pcDNA3.1-IL-15, pcDNA3.1-lL-15Ra-ECD-Fc, pcDNA3.1-Fc-lL-15Ra-EC, pcDNA3.1-lL-15Ra-sushi+-Fc, pcDNA3.1-Fc-lL-15Ra-sushi+, etc. Se obtuvieron los plásmidos de expresión correspondientes.
4. Mutaciones dirigidas a sitio en los genes
Se utilizó el kit de KOD (TOYOBO, n° de cat. KOD-201) para la mutación dirigida a sitio, con 25 pl de sistema que comprendía 2,5 pl 10 * tampón de KOD, 2,5 pl de dNTP 2mM, 1pl de cebador 1 (10 pM), 1 pl de cebador 2 (10 pM), 0,5 pl de KOD plus, 1 pl de MgSO4 25 mM y 16 pl de ddH2O. El procedimiento de síntesis fue el siguiente: 94°C durante 2 min, 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, 68°C durante 11 min, durante 25 ciclos de amplificación; la amplificación por PCR se terminó tras 11 min adicionales a 68°C. El producto de PCR se digirió con 1 pl de Dpnl (NEB, n° de cat. R0176L) durante 5 horas y después se transformó en células DH5a competentes. Después, se recolectó el clon para la secuenciación a fin de obtener los plásmidos deseados: pcDNA3.1-lL-15(L52C), pcDNA3.1-lL-15Ra-ECD(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-lL-15Ra-ECD(S40C), pcDNA3.1-lL-15Ra-sushi+(S40C)-Fc, pcDNA3.1-Fc-lL-15Rasushi+(S40C) y los demás genes mutantes. El complejo de proteínas 1 implicado en el ejemplo de la presente invención se obtuvo mediante la expresión del vector de expresión que contenía las secuencias de ADN 6 y 7. El complejo de proteínas 3 implicado en el ejemplo de la presente invención se obtuvo mediante la expresión del vector de expresión que contenía las secuencias de ADN 6 y 9. El complejo de proteínas 4 implicado en el ejemplo de la presente invención se obtuvo mediante la expresión del vector de expresión que contenía las secuencias de ADN 6 y 10. El complejo de proteínas 2 implicado en el ejemplo de la presente invención se obtuvo mediante la expresión del vector de expresión que contenía las secuencias de ADN 6 y 8.
Construcción de secuencia de nucleótidos de plásmido de expresión
Se utilizaron las secuencias siguientes para la construcción del vector; la línea horizontal sencilla representa una secuencia de ADN del péptido de señal, la línea discontinua representa una secuencia de ADN de conector peptídico y la doble línea horizontal representa una secuencia de ADN mutado.
IL-15 (secuencia de ADN n° 1, SEC ID n° 10):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGC
TCTCGGTGCAACTGGGTGAATGTAATTAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATT
C AATCT AT GCATATT GATGCT ACTTT ATATACGGAAAGT GAT GTT C ACCCG AGTTGC
A A AGTAACAGCA ATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCC
GGCG AT GC AAGT ATT C AT GATAC AGT AG AAAAT CT GAT C AT CTT AGC AAAC AAC AG TTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGG AGGAAAAA AAT ATT AAAGAATTTTT GC AGAGTTTT GT AC AT ATTGTC C AAAT GTTC A TCAACACTTCTTGA
IL-15Ra-ECD-Fc (secuencia de ADN n° 2, SEC ID n° 11):
AT GGAC AT GCGGGT GCC AGCCCAGCT GCTGGGCCT GTT GCT GCTGT GGTTCCCC GGC TCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTC AAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGT AA AGCCGGC ACCT C C AGCC T GACCGAGTGCGT GTT GAACAAGGCC ACCAAT GTC GC CCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACG CCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCC TCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCG GCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCC ACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGAC AAC AGCC AAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGT ATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAG CG AACCT AAGT CCTCT GAT AAG ACCC AC AC AT GT CCCCCCT GCCCAGCT CCTG AGCT
c t t g g g c g g a c c t t c c g t g t t t c t g t t c c c c c c a a a g c c c a a g g a t a c c c t t a t g a t c a g c a g a a c a c c c g a a g t t a c t t g c g t g g t c g t g g a c g t t t c t c a c g a a g a t c c t g a a g t g a a a t t c a a c t g g t a c g t g g a t g g c g t g g a g g t g c a c a a t g c t a a g a c t a a g c c c c g t g a a g a g c a g t a c a a c t c t a c c t a c c g g g t c g t t t c a g t g c t g a c t g t t c t c c a t c a g g a c t g g c t c a a c g g g a a g g a g t a t a a g t g c a a g g t g t c t a a c a a g g c a c t g c c c g c a c c c a t c g a g a a g a c c a t t t c t a a g g c c a a g g g t c a a c c a c g g g a g c c a c a g g t t t a c a c a t t g c c t c c c a g t c g g g a g g a g a t g a c a a a g a a t c a a g t g t c a c t t a c a t g t c t t g t g a a g g g c t t c t a c c c c t c a g a c a t c g c c g t g g a g t g g g a g a g c a a c g g a c a a c c a g a a a a c a a c t a c a a g a c c a c a c c t c c t g t g c t c g a t t c a g a t g g t t c c t t t t t c t t g t a c a g c a a a c t c a c c g t t g a c a a g a g t c g g t g g c a g c a a g g a a a t g t g t t c a g c t g t t c t g t g a t g c a c g a g g c c c t g c a c a a c c a t t a t a c c c a a a a a t c t c t c a g c c t t t c t c c c g g c a a g t g a
Fc-IL-15Ra-ECD (secuencia de ADN n° 3, SEC ID n° 12):
a t g g a c a t g c g g g t g c c a g c c c a g c t g c t g g g c c t g t t g c t g c t g t g g t t c c c c g g c t c t c g g t g c g a a c c t a a g t c c t c t g a t a a g a c c c a c a c a t g t c c c c c c t g c c c a g c t
CCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACC CTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAA GATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAA GACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGA CTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAAC
GGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAG TGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCA GATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAA GGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAA AAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAG TGGTjG^GCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCG TGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTAC ATTT GT AACT CTGGTTT C AAGCGT AAAGCCGGC ACCT CC AGCCT GACCGAGTGCGTG TTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCG CGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAG GCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCA TCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCA GCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGT CCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCC GCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTTGA
IL-15Ra-shushi+ (73)-Fc (secuencia de ADN n° 4, SEC ID n° 13):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGC TCTGGGTGC AT C ACCT GCCCTCC ACCT ATGTCC GTGGA AC ACGC AG AC ATCTGGGTC AAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGT AAAGCCGGC AC CTC£AGCCT G ACCGAGT GCGT GTT G AAC AAGGCC AC C AATGTCGC CCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACG CGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACC CACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTG TTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTG CGT GGTC GT GG ACGTTTCT C ACGAAG ATCCT G AAGT G AAATTCAACT GGTACGT GG ATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCT
ACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAG GAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCAT TTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTC GGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTAC CCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACA AGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCA CCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCAC GAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA C
Fc-IL-15Ra-shushi+ (73) (secuencia de ADN n° 5, SEC ID n° 14):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGC TCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCT CCTGAGCTCTTGGGCGGACCTT CC GTGTTTCT GTT CC C CCC AAAGCCC A AGGAT ACC CTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAA GAT CCTGA AGTGA AATTC A ACT GGT ACGT GGATGGCGT GG AGGT GC AC AAT GCT AA GACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGA CTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAAC AAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACG GG AGCC AC AGGTTTAC AC ATT GCCT CC C AGT CGGGAGG AG ATG AC A AAGA ATCAAG TGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCA GATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAA GGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAA AAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAG
t g g t g g c g g a g g g t c a g g a g g t g g t g g a a g c a t c a c c t g c c c t c c a c c t a t g t c c g T GGAAC ACGCAGACAT CT GGGT C AAGAGCT AC AGCTT GT ACT CCC GCG AGCGCT AC ATTTGTAACTCTGC.TTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTCCAGCCTGACCGAGTGCGTG TTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCG CGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCTGA
ÍL-15(L52C) (secuencia de ADN n° 6; SEC ID n° 15):
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGC T CTC GGT GC AACT GGGTGAAT GTA ATT AGT GATTT GA AA AAAATT G AAG ATC TTATT
CAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCGAGTTGC AAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCATGTGAGTCC GGCGAT GC AAGT ATTC AT GAT AC AGTAGAAAATCTGAT C ATCTTAGC AAAC AACAG TTTGTCTTCT AATGGGAATGT AACAGAAT CTGGATGC AAAGAATGTGAGGAACTGG AGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCA TCAACACTTCTTGA
IL-15Ra-ECD (S40C)-Fc (secuencia de ADN n° 7, SEC ID n° 16):
ATGGACATGCGGGTQCCAGCCCAOCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGC TCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTC AAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGT AAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGC CCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCGCGACCCTGCCCTGGTTCACCAACG CCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAGGCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCC TCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCATCTCCAAGCTCAAACAACACAGCG GCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCAGCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCC ACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGTCCTCCCACGGCACCCCATCTCAGAC AACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCCGCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGT ATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTGGCGGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGAAG CGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCT CTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGAT CAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTG AAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAG CCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTC CATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACT GCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCAC AGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTT ACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAA CGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTT
c c t t t t t c t t g t a c a g c a a a c t c a c c g t t g a c a a g a g t c g g t g g c a g c a a g g a a a t GTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCT CTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA
Fc-IL-15Ra-ECD (S40C) (secuencia de ADN n° 8, SE C ID n° 17)
ATGGACATGCGGGTGCCAGCCCAGCTGCTGGGCCTGTTGCTGCTGTGGTTCCCCGGC TCTCGGTGCGAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCT CCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACC CTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAA GATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAA GACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGA CTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAAC AAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACG GGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAG TGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCA GATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAA GGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAA AAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGTGGTGGCAG TGg t g g c g g a g g g i c a g g a g g t g g t g g a a g c a t c a c c t g c c c t c c a c c t a t g t c c g T GGAAC ACGC AGAC ATCT GGGTC AAGAGCT AC AGCTTGT ACT CCCGCGAGCGCT AC ATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTG TTGAACAAGGCCACCAATGTCGCCCACTGGACAACCCCAAGTCTCAAATGCATTCG CGACCCTGCCCTGGTTCACCAACGCCCAGCGCCACCATCCACAGTAACCACTGCAG GCGTGACCCCACAGCCAGAGAGCCTCTCCCCTTCTGGCAAAGAGCCAGCAGCTTCA TCTCCAAGCTCAAACAACACAGCGGCCACAACAGCAGCTATTGTCCCGGGCTCCCA GCTGATGCCTTCAAAATCACCTTCCACAGGCACCACAGAGATCAGCAGTCATGAGT CCTCCCACGGCACCCCATCTCAGACAACAGCCAAGAACTGGGAACTCACAGCATCC GCCTCCCACCAGCCGCCAGGTGTGTATCCACAGGGCCACAGCGACACCACTTGA
IL-15Ra-shushi+ (73) (S40C)-Fc (secuencia de ADN n° 9, SEC ID n° 18):
AT GG ACAT GCGGGT GCC AGCCCAGCT GCTGGGCCT GTT GCT GCT GT GGTTCCCCGGC TCTCGGTGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTC AAGAGCTAC AGCTT GTACT CCCGC G AGC GCT AC ATTT GTAACTCTGGTTT CAAGCGT AAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACCAATGTCGC CC ACT GGAC A ACCCC AAGT CT CAAATGC ATTCGCG ACCCT GC CCTGGTT C ACC A AC G CGGC GGAGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGA AGCGAAC CT AAGT C CTCT G AT AAGACC CACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTG TTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTG
CGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAAGATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGG ATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCT ACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAG GAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCAT TTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTC GGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTAC CCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGACAACCAGAAAACAACTACA AGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCA CCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCAC GAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTCTCAGCCTTTCTCCCGGCAAGTGA C
Fc-IL-15Rct-shushi+ (73)(S40C) (secuencia de ADN n° 10, SEC ID n° 19):
ATGG AC ATGCG GGT GC CAGCC C AGCTGCTG GGCCTGTT GCTGCT GTGGTT CC CCGGC TGTCGGTGCGAACCT AAGTCC TCT GAT A AGACCC AC AC AT GTCCCCCCTGC CC AGCT CCTGAGCTCTTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACC CTTATGATCAGCAGAACACCCGAAGTTACTTGCGTGGTCGTGGACGTTTCTCACGAA GATCCTGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAA GACTAAGCCCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGA CTGTTCTCCATCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAAC AAGGCACTGCCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACG GGAGCCACAGGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAG TGTCACTTACATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGC AAC GGAC AACC AG AAAAC AACT AC AAG ACC ACACCT CCT GT GCTCGATTC A GATGGTTCCTTTTTCTTGTACAGCAAACTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAA GG AAATGT G TT CAGCT GTTCT GTGAT GC ACG AGGC CCT GC ACAACCATT ATACCC A A
a a a t c t c t c a g c c t t t c t c c c g g c a a g g g c g g a g g a g g c t c t g g .c g g t g g t g g c a g TGGTGGCGGAGGGTCAGGAGGTGGTGGAAGCATCACCTGCCCTCCACCTATGTCCG TGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCCGCGAGCGCTAC ATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACCTGCAGCCTGACCGAGTGCGTG
t t g a a c a a g g c c a c c a a t g t c g c c c a c t g g a c a a c c c c a a g t c t c a a a t g c a t t c g CGACCCTGCCCTGGTT C ACC A ACGCTGA
Fragmento Fe: ADN de lgG1-Fc (secuencia de ADN n° 11, SEC ID n° 20):
GAACCTAAGTCCTCTGATAAGACCCACACATGTCCCCCCTGCCCAGCTCCTGAGCTC
TTGGGCGGACCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATACCCTTATGATC
AGC AGAAC ACCCGAAGTT ACTTGCGTGGT CGT GGACGTTT CT C ACGAAGATCCTGA
AGTGAAATTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACTAAGC
CCCGTGAAGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTCGTTTCAGTGCTGACTGTTCTCC
AT C AGGACT GGCT C AACGGGAAGGAGT AT AAGT GC AAGGT GTCTAACAAGGC ACT G
CCCGCACCCATCGAGAAGACCATTTCTAAGGCCAAGGGTCAACCACGGGAGCCACA
GGTTTACACATTGCCTCCCAGTCGGGAGGAGATGACAAAGAATCAAGTGTCACTTA
CATGTCTTGTGAAGGGCTTCTACCCCTCAGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAC
GGACAACCAGAAAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTCGATTCAGATGGTTC
CTTTTTCTTGTACAGCAAA CTCACCGTTGACAAGAGTCGGTGGCAGCAAGGAAATG
TGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTATACCCAAAAATCTC
TCAGCCTTTCTCCCGGCAAG
Ejemplo 3. Características del complejo de proteínas IL-15
El complejo de proteína IL-15 proporcionado en la presente invención consiste en una proteína de fusión soluble (I) y una proteína de fusión soluble (II), en el que la proteína de fusión soluble (I) comprende un polipéptido IL-15 unido covalentemente a un polipéptido biológicamente activo o un fragmento funcional del mismo; la proteína de fusión soluble (II) comprende un polipéptido IL-15R alfa unido covalentemente a un polipéptido biológicamente activo o un fragmento funcional del mismo, en el que la proteína de fusión soluble (I) o la proteína de fusión soluble (II) posee Cys resultante de uno o más sitios de mutación de aminoácido según se define en la reivindicación 1, se forma un enlace disulfuro mediante el apareamiento de la Cys correspondiente presente en la proteína de fusión soluble (II) y la proteína de fusión soluble (I).
En la presente invención, se construyó un complejo de proteínas estable con evidente actividad antitumoral y semivida in vivo prolongada mediante un método de ingeniería genética, y la molécula del complejo comprendía una molécula de proteína de fusión de Fc de IL-15 o un derivado de la misma e IL-15Ra o un derivado de la misma.
La molécula de la proteína de fusión presenta las características siguientes:
1) La proteína de fusión comprende dos fracciones moleculares principales, una de las cuales es una molécula con actividad biológica de IL-15 y la otra es una molécula de fusión de Fc con IL-15Ra o un fragmento funcional de la misma.
2) La fracción molecular con bioactividad de IL-15 presenta mutaciones de cisteína en uno o más sitios de aminoácido respecto a IL-15 de tipo salvaje o mutantes funcionales de IL-15, y estos sitios de mutación de cisteína pueden aparearse con los sitios de mutación de cisteína correspondientes en IL-15Ra o su fragmento funcional para formar un enlace disulfuro.
3) La fracción de la molécula de fusión de Fc que presenta IL-15Ra o fragmento funcional presenta mutaciones de cisteína en uno o más sitios de aminoácido respecto al dominio enteramente extracelular; el fragmento de IL-15Ra o un fragmento funcional de IL-15Ra contiene una forma acortada del dominio Sushi. Dichas cisteínas pueden aparearse con los sitios de mutación de cisteína correspondientes en IL-15 o un mutante funcional de la misma para formar un enlace disulfuro.
4) La proteína de fusión puede expresarse establemente mediante cotransfección o construcción de una única línea celular con dos plásmidos, y puede obtenerse una sola molécula mediante un método convencional de separación.
IL-15 utilizada en los ejemplos de la presente invención se refiere a moléculas maduras de interleuquina-15 humana (SEC ID n° 1) o variantes de las mismas. La IL-15Ra ECD utilizada en los ejemplos de la presente invención se refiere a un fragmento de dominio extracelular de interleuquina-15 receptor alfa humana (SEC ID n° 3). La variante de la misma es preferentemente una versión acorta de la misma, tal como IL-15Ra-sushi+ (SEC ID n° 4). La parte de fragmento Fc utilizada en los ejemplos de la presente invención puede ser un fragmento Fc del anticuerpo humano IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o una variante del mismo, preferentemente un fragmento Fc de IgG1 humana, más preferentemente SEC ID n° 9.
En la presente invención, IL-15Ra o un derivado de la misma se fusiona con un fragmento Fc o variante de Fc mediante un conector peptídico para formar una proteína de fusión soluble (II), en la que el orden de unión de cada componente proteína no se encuentra limitado. El conector peptídico puede ser un conector blando comúnmente utilizado en la técnica. Preferentemente es (GGGGS)n , en donde ‘n’ puede ser un valor entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 5, y lo más preferentemente 2. Además de unir IL-15 a IL-15R-alfa, la proteína de fusión soluble (II) y la proteína de fusión
soluble (I) también pueden combinarse mediante un enlace disulfuro formado mediante apareamiento de los sitios de mutación de cisteína. La estabilidad de la molécula puede incrementarse mediante estos últimos.
Son secuencias de proteína relacionadas las siguientes:
IL-15 (SEC ID n° 1): (secuencia de aminoácido de interleuquina-15 humana y también la secuencia de IL-15 de referencia)
NWYNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIH DTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-15(L52C) (SEC ID n° 2): (secuencia de aminoácidos de la interleuquina-15 humana con una mutación L52C en la posición 52)
NWYNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISCESGDASIH DTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-15Ra-ECD (SEC ID n° 3): (La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la interleuquina 15 receptor alfa humana)
IT CPPPMS VEHADIW VKS Y SLY SRERYICNSGFKRKAGTS SLTEC VLNKATN V AHWTTP SLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGS QLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT
IL-15Ra-sushi+ (SEC ID n° 4): (La forma truncada del fragmento de receptor de la interleuquina 15 humana, que contiene 73 aminoácidos)
IT CPPPMS VEHADIW YKSYSLY SRERYICN S GFKRKAGTS SLTEC VLNKATNY AHWTTP SLKCIRDPALYHQR
IL-15Ra-ECD (S40C)-Fc (SEC ID n° 5): (polipéptido de fusión de dominio extracelular de IL-15Ra fusionado con Fc, que contiene el sitio de mutación S40C)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNV AHWTTP SLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGS QLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTGGGGS GGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK
Fc-IL-15Ra-ECD (S40C) (SEC ID n° 6): (polipéptido de fusión de Fc fusionado con la región extracelular de IL-15Ra, que contiene la mutación S40C)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKA TNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTA ATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQG HSDTT
IL-15Ra-Sushi+(S40C)-Fc (SEC ID n° 7): (una forma truncada de la interleuquina 15 receptor a humana que contiene el dominio Sushi fusionado a Fc mediante un conector, en el que Sushi+ contiene una mutación S40C y Sushi+ está situado en el extremo N-terminal) ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKATNVAHWTTP SLKCIRDPALVHQRGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQD WLN GKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKN QV SLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc-IL-15Ra-sushi+(S40C)(SEC ID n° 8): (una forma truncada de receptor de interleuquina 15 que contiene el dominio Sushi fusionado con Fc mediante un conector, en el que Sushi+ contiene una mutación S40C y Sushi+ está situado en el extremo C-terminal) EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKG GGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTCSLTECVLNKA TNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQR
Fragmento Fc, lgG1-Fc (Proteína) (SEC ID n° 9) EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKF NW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDÍAVEW ESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
En el experimento, las moléculas que debían someterse a ensayo se numeraron de la manera siguiente: complejos de proteínas 1, 2, 3 y 4, en los que el complejo de proteínas n° 1 se obtuvo mediante coexpresión de SEC ID n° 2 y SEC ID n° 5. El complejo de proteínas n° 2 se obtuvo mediante coexpresión de SEC ID n° 2 y SEC ID n° 6. El complejo de proteínas n° 3 se obtuvo mediante coexpresión de SEC ID n° 2 y SEC ID n° 7. El complejo de proteínas n° 4 se obtuvo mediante coexpresión de SEC ID n° 2 y SEC ID n° 8. Se muestra el diagrama esquemático en la figura 7. Se incrementó la estabilidad de la molécula de complejo mediante el incremento de la formación de enlaces disulfuro mediante apareamiento de los sitios de mutación de cisteína.
La lista de complejos de proteínas es la siguiente:
Ejemplo 4. Obtención del complejo de proteína IL-15
1. Expresión de la proteína
La proteína IL-15/IL-15Ra se transfectó transitoriamente y se expresó mediante la utilización de células 293 FreeStyle (GIBCO, n° de cat. R79007). Las células 293 FreeStyle se cultivaron en suspensión en medio de expresión de 293 Freestyle (GIBCO, n° de cat. 12338018), complementado con suero fetal bovino ultrabajo en IgG (f Bs ultrabajo en inmunoglobulinas, GIBCO, n° de cat. 16250078) a una concentración final de 1%. Se prepararon los plásmidos de expresión de IL-15/IL-15Ra y el reactivo de transfección PEI (Polysciences, n° de cat. 239662); los dos plásmidos de IL-15 e IL-15Ra se cotransfectaron en una proporción comprendida entre 1:1 y 9:1; la cantidad total de plásmidos era de 100 gg/100 ml de células; la proporción de plásmido a PEI era de 1:2 en masa. La densidad celular el día de la transfección era de 1*106/ml. Se preparó 1 l de células 293 FreeStyle para su transfección. Se mezclaron 50 ml de
Opti-MEM (GIBCO, n° de cat. 11058021) con el plásmido, se mantuvieron en reposo y se filtraron. Se mezclaron 50 ml adicionales de Opti-MEM con PEI, se mantuvieron en reposo durante 5 min y se filtraron. El plásmido se mezcló con PEI y se mantuvo en reposo durante 15 min. La mezcla de plásmido y PEI se añadió lentamente a las células y se cultivó en un incubador de agitación a 130 rpm a 37°C, 8% de CO2. Cinco días después, se recogió el sobrenadante mediante centrifugación para la purificación de las proteínas.
2. Purificación de proteínas
Cromatografía de afinidad para la proteína de fusión de IL-15:
Se recogió el sobrenadante a partir del cultivo celular mediante centrifugación a alta velocidad y se sometió a cromatografía de afinidad mediante la utilización de una columna de proteína A de GE. El tampón de equilibrado utilizado en la cromatografía era 1xPBS (pH 7,4); después, se cargó el sobrenadante celular y se ligó, lavando con PBS hasta que la UV volvió a la línea base, y seguidamente se eluyó la proteína diana con tampón de elución, acidez: pH 2,5 a 5). Se ajustó el pH a neutro con Tris y se almacenó la proteína diana.
Cromatografía de intercambio iónico para la proteína de fusión de IL-15:
se ajustó el pH del producto obtenido durante la cromatografía de afinidad a 1 a 2 unidades de pH más bajas o más altas que el pI. A continuación, la muestra se diluyó apropiadamente para controlar la conductividad de la muestra a menos de 5 ms/cm. Se llevó a cabo una elución en gradiente de NaCl correspondiente a la condición del pH mediante la utilización de un tampón adecuado correspondiente al pH, tal como tampón de fosfato, tampón de acetato, y otros, mediante la utilización de métodos convencionales de la técnica de cromatografía de columna de intercambio iónico, tales como el intercambio catiónico o el intercambio aniónico. Las proteínas diana correspondientes a los diferentes picos de absorción se recogieron mediante la utilización de SDS-PAGE y se almacenaron.
Cromatografía de exclusión por tamaño para la proteína de fusión de IL-15:
El producto obtenido durante la cromatografía de intercambio iónico se concentró mediante ultrafiltración y se cargó para la cromatografía de exclusión por tamaño, mediante la utilización de gel GE Superdex200 para eliminar posibles polímeros y otros componentes, a fin de obtener el producto deseado a alta pureza. La pureza de la proteína obtenida puede detectarse mediante SDS-PAGE y SEC-HPLC. Se determinó la concentración de las proteínas mediante espectrofotometría de UV.
Ejemplos de ensayo
Ejemplo de ensayo 1. Ensayo de proliferación de PBMC in vitro
Se cultivaron PBMC frescas (células mononucleares de sangre periférica humana, Shanghai Blood Center) en medio RPMI1640 (Thermo Fisher Chemical Products Co., Ltd (Beijing), n° de cat. SH30809.01B) que contenía f Bs al 10%, se centrifugaron y se resuspendieron a una densidad celular de 5x105 células/ml. Se añadieron 90 pl a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Se diluyeron las muestras a una multiplicidad de diferentes concentraciones determinadas con PBS. Se añadieron 10 pl a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se cultivaron en un incubador a 37°C, 5% de CO2 durante 48 horas. Después, se extrajeron 50 pl para la detección de la proliferación celular con el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo®.
Tabla 5. Resultados de detección de la actividad de los complejos de proteínas 1 y 3 de la presente invención en ensayo de proliferación de PBMC in vitro
La Tabla 5 muestra los resultados de detección de la actividad de los complejos de proteína 1 y 3 de la presente invención frente a IL-15 de control en ensayo de proliferación de PBMC in vitro, indicando que los complejos de proteína 1 y 3 de la presente solicitud mejoraron significativamente la actividad de proliferación de las PBMC en comparación con IL-15 de control. En el presente experimento, la actividad estimulada por el complejo de proteína 1 se incrementó en aproximadamente 5 veces, mientras que la actividad estimulada por el complejo de proteína 3 mejoró en aproximadamente 66 veces.
Ejemplo de ensayo 2. Ensayo in vitro de proliferación de células Mo7e
1. Materiales principales
Se obtuvieron Mo7e (línea celular de leucemia megacariocítica humana) de Peking Union Medical College; IL-15 se
adquirió de NOVOProtein, n° de cat. C016; se obtuvo análogo de IL-15 a partir de una preparación del propio laboratorio; se adquirió el kit de recuento celular Cell Counting Kit-8 (CCK-8) de WST, n° de cat. EX660;
se adquirió GM-c S f de NOVOProtein, n° de cat. CC79.
2. Procedimientos
1) Se cultivaron Mo7e en medio RPMI-1640 modificado (que contenía L-glutamina 2,05 Mm, FBS al 10% y GM-CSF 15 ng/ml) en el incubador a 37°C (5% de CO2);
2) Se centrifugaron células Mo7e en buenas condiciones a temperatura ambiente, 150xg durante 5 min. Se descartó el sobrenadante;
3) El pellet celular se lavó con medio libre de GM-CSF dos veces y después se realizó el recuento;
4) Se ajustó la concentración celular y se sembraron en una placa de 96 pocillos en un número celular de 2x104/pocillo y un volumen de 90 pl (libre de GM-CSF); se mantuvieron en el incubador celular para el cultivo;
5) Se diluyó IL-15 y su análogo 4 veces con PBS; se añadieron 10 pl/pocillo al sistema de cultivo celular tras 2 horas de incubación de las células en placas de 96 pocillos. Se repitió cada concentración por triplicado; se utilizaron pocillos de blanco (con sólo adición de PBS) como control;
6) Las placas celulares se cultivaron en el incubador durante 3 días;
7) A todos los pocillos de ensayo se añadieron 10 pl de CCK-8 y se incubaron en el incubador durante 3 horas; 8) Se detectó la absorbancia a 450 nm (DO450).
Tabla 6. Resultados de los complejos de proteína 1 a 4 en ensayo in vitro de proliferación de células Mo7e.
La Tabla 6 muestra la comparación de los complejos de proteína 1 a 4 con IL-15 de control en el ensayo in vitro de proliferación de células Mo7e, indicando que los complejos de proteína 1 a 4 mejoraron significativamente la actividad de proliferación en comparación con IL-15 de control, y la actividad de proliferación estimulada por los complejos 3 y 4 era significativamente más elevada que la estimulada por los complejos de proteína 1 y 2.
Ejemplo de ensayo 3. Modelo de metástasis pulmonar de ratón
1. Procedimientos de ensayo animal
Se dividieron 32 ratones C57BL/6 (SPF, Shanghai Super B&K Laboratory Animal Corp., Ltd.) en 4 grupos, cada grupo de 8 ratones. Se inyectaron por vía intravenosa 1,5x105 células B16F10 en los ratones por la vena de la cola (Cell Resource Center, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, TCM36). Se inyectó por vía intraperitoneal PBS, 2 pg de IL-15 y 5 pg o 15 pg de complejo de proteína 3 en los ratones el día 1. Se pesaron una vez cada 2-3 días; se sacrificó un ratón de cada grupo el día 14 y se observó la metástasis pulmonar. Todos los ratones fueron sacrificados el día 16. Se extrajeron los pulmones de todos los ratones y se pesaron; se observaron las m asas pulmonares negras y se fotografiaron y después se fijaron los pulmones en formaldehído y se contó el número de m asas negras.
2. Resultados
Los pulmones de los ratones en el grupo de PBS mostraron un número elevado de melanomas metastásicos en crecimiento (73±43). Los pulmones del grupo de IL-15 mostraron un número elevado de m asas de melanoma (65±29), aproximadamente 90% del número observado en el grupo de PBS. Los pulmones de complejo de proteína 3-5 pg mostraron una metástasis parcial de las m asas de melanoma (30±16), aproximadamente 41% del número observado en el grupo de PBS. Los pulmones de complejo de proteína 3-15 pg mostraron una metástasis parcial de las m asas de melanoma (24±13), aproximadamente 33% del número observado en el grupo de PBS.
En el modelo de ratón B16F10, la eficacia del complejo de proteína 3 fue significativamente superior a la de IL-15, tal como se muestra en la figura 8.
El peso pulmonar relativo en el grupo de PBS fue significativamente superior al observado en el grupo de complejo de proteína 3, tal como se muestra en la figura 9.
No se observó una reducción significativa de peso corporal en cada grupo durante la administración, sugiriendo que la dosis administrada no presenta toxicidad significativa, tal como se muestra en la figura 10.
En otro experimento de modelo de ratón B16F10 con otro grupo de administración, los presentes inventores observaron actividad antitumoral significativa al reducir la dosis del complejo de proteína 3 a 0,5 pg/ratón, mientras que no se observaron síntomas anormales evidentes en el caso de una dosis máxima tolerada de 3o pg/ratón. En resumen, el complejo de proteína 3 puede inhibir la metástasis de las células B16F10 en pulmones de ratón y presenta un efecto dependiente de la dosis y presenta una buena ventana de seguridad.
Ejemplo de ensayo 4. Modelo de tumor subcutáneo de ratón
1. Procedimientos de ensayo animal
1.1 Se dejó que los ratones se adaptasen al medio de laboratorio durante 5 días.
1.2 Trasplante de células tumorales
En ratones C57BL/6 (SPF, Shanghai Xi Puer Bei Kai Experimental Animal Co., Ltd.) se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho células B16F10 (5x106 /ratón). Los tumores crecieron durante 7 días. Una vez el volumen tumoral había crecido a 160±40 mm3, los animales se dividieron aleatoriamente (dO) en 4 grupos, cada uno de 7 ratones. 1.3 Dosis y método de administración
En cada grupo se inyectó por vía intraperitoneal el fármaco de ensayo una vez el día 1 y el día 5, en total dos veces, con PBS o lL-15 (2 pg) o complejo de proteína 3 (5 pg) o complejo de proteína 3 (15 pg). Se midieron los volúmenes tumorales y el peso corporal de los ratones cada 2 días y se registraron los datos.
1.4 Estadísticas
Software estadístico Excel: se calculó el valor medio como 'avg'; SD se calculó como 'STDEV'; SEM se calculó como 'STDEV/SQRT'; el valor de P entre los diferentes grupos se calculó como 'TTEST'.
Volumen tumoral (V) calculado como: V=1/2 x Longitud x Lcorto2
Volumen relativo (VRT) = Vt/Vo
Tasa de inhibición tumoral (%) = (Cvrt-Tvrt)/Cvrt (%)
Vo y Vt representan el volumen tumoral al inicio del experimento y al final del experimento, respectivamente. Cvrt y Tvrt representan el grupo de control de blanco (PBS) y el volumen tumoral relativo en el grupo de ensayo al final del experimento, respectivamente.
2. Resultados
Debido a que los tumores de células B16F10 trasplantadas crecieron muy rápidamente, el experimento se detuvo el día 9. El efecto de inhibición del crecimiento de la proteína IL-15 sobre el tumor de B16F10 se muestra en la Tabla 1. Tras la administración de una dosis los días 1 y 5, respectivamente, IL-15 no inhibió el crecimiento de los tumores de células B16F10 trasplantados el día 9. Sin embargo, la tasa de inhibición en el grupo de complejo de proteína 3 - 5 pg y en el grupo de complejo de proteína 3 - 15 pg era de 30% y 73%, respectivamente, en el que el grupo de complejo de proteína 3 - 15 pg pudo inhibir significativamente el crecimiento tumoral.
En conclusión, el complejo de proteína 3 presenta el efecto de inhibir el crecimiento de los xenoinjertos de B16F10 en el presente estudio y presenta un evidente efecto dependiente de la dosis; ver la Tabla 7.
Claims (18)
- REIVINDICACIONESi. Complejo de proteína IL-15 que consiste en una proteína de fusión soluble I y una proteína de fusión soluble II, en el que la proteína de fusión soluble I es un polipéptido IL-15 o un fragmento funcional del mismo y la proteína de fusión soluble II es un polipéptido IL-15Ra o un fragmento funcional del mismo,en el que la proteína de fusión soluble I y/o la proteína de fusión soluble II posee Cys resultante de una o más mutaciones de aminoácidos y se forma un enlace disulfuro mediante apareamiento de la Cys correspondiente presente en la proteína de fusión soluble II y la proteína de fusión soluble I,en el que la mutación del aminoácido Cys se produce en L45, Q48, V49, L52, E53, C88 o E89 en el polipéptido IL-15 o un fragmento funcional del mismo, y/o en el que la mutación del aminoácido Cys se produce en K34, L42, A37, G38 o S40 en el polipéptido IL-15Ra o fragmento funcional del mismo.
- 2. Complejo de proteína IL-15 según la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión soluble I y/o proteína de fusión soluble II se une covalentemente a fragmento Fc o a un mutante del mismo.
- 3. Complejo de proteína IL-15 según la reivindicación 1, en el que la mutación del aminoácido Cys se produce en l52 en el polipéptido IL-15 o fragmento funcional del mismo, y/o en el que la mutación del aminoácido Cys se produce en S40 en el polipéptido IL-15Ra o fragmento funcional del mismo.
- 4. Complejo de proteína IL-15 según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la proteína de fusión soluble I es SEC ID n° 2.
- 5. Complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína de fusión soluble II se constituye mediante recombinación de un polipéptido IL-15Ra o fragmento funcional del mismo y un fragmento Fc.
- 6. Complejo de proteína IL-15 según la reivindicación 5, en el que el polipéptido IL-15Ra o fragmento funcional del mismo se une al extremo N-terminal del fragmento Fc.
- 7. Complejo de proteína IL-15 según la reivindicación 5, en el que el fragmento Fc se muestra en SEC ID n° 9.
- 8. Complejo de proteína IL-15 según la reivindicación 6, en el que el fragmento Fc se muestra en SEC ID n° 9.
- 9. Complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de la proteína de fusión soluble II se selecciona del grupo que consiste en SEC ID n° 5, SEC ID n° 6, SEC ID n° 7 y SEC ID n° 8.
- 10. Complejo de proteína IL-15 según la reivindicación 1, en el que la secuencia de la proteína de fusión soluble I se muestra en SEC ID n° 2 y la proteína de fusión soluble II se muestra en SEC ID n° 5, 6, 7 o 8,
- 11. Ácido nucleico codificante del complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
- 12. Vector de ADN, que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 11.
- 13. Célula huésped, que comprende el vector de ADN según la reivindicación 12.
- 14. Método para la preparación del complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el método comprende:cultivar la célula huésped según la reivindicación 13 bajo condiciones suficientes para expresar el complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,expresar y purificar el complejo de proteína IL-15.
- 15. Composición farmacéutica, que comprende el complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
- 16. Complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica según la reivindicación 15, para la utilización en el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por IL-15,en el que la enfermedad o el trastorno se selecciona del grupo que consiste en enfermedad infecciosa, cáncer, enfermedad sanguínea, enfermedad inflamatoria y enfermedad autoinmunitaria,el cáncer es preferentemente se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de piel, linfoma, carcinoma de células renales, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer de estómago y cáncer de mama,la enfermedad infecciosa se selecciona preferentemente del grupo que consiste en infección por el virus de la viruela, infección por VIH,infección bacteriana, infección fúngica e infección por VHB,la enfermedad sanguínea se selecciona del grupo que consiste en anemia, leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásico y leucemia linfocítica granular de células T grandes,la enfermedad autoinmunitaria se selecciona preferentemente del grupo que consiste en esclerosis múltiple, soriasis, artritis reumatoide, gastritis y mucositis.
- 17. Complejo de proteína IL-15 o composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento según la reivindicación 16, en el que la utilización es en combinación con un inhibidor de molécula pequeña o un fármaco de anticuerpos; el inhibidor de molécula pequeña se selecciona preferentemente de los agentes quimioterapéuticos o radioterapéuticos dirigidos; el fármaco de anticuerpos se selecciona preferentemente de anticuerpo monoclonal, más preferentemente se selecciona de anticuerpo anti-CD20, anti-PD1, anti-PDL1, anti-Her2, anti-EGFR y anti-c-MET.
- 18. Complejo de proteína IL-15 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la composición farmacéutica según la reivindicación 15, para la utilización en la inmunoterapia celular; la inmunoterapia celular es particularmente inmunoterapia tumoral de DC, CIK, DC-CIK, ECIK, NK, CAS-T, BiAb-T, TCR-T y CAR-T.
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