KR101947342B1 - Gm-csf 반감기를 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GM-CSF의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기를 치환 하는 것을 포함하여 GM-CSF의 반감기를 증가시키는 방법 또는 반감기가 증가 된 GM-CSF에 관한 것으로서, 본 발명의 라이신 잔기가 치환된 GM-CSF은 인체 내에서 오랜 시간 동안 잔류하며 치료효과가 우수하다.

Description

GM-CSF 반감기를 증가시키는 방법 {A method for extending half-life of GMCSF}

본 발명은 단백질 또는 (폴리)펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함에 의해 단백질 또는 (폴리)펩타이드의 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 방법에 의해 제작된 반감기가 증가된 단백질 또는 (폴리)펩타이드에 관한 것이다.

세포 내 단백질 분해는 리소좀 (lysosome)과 프로테아좀 (proteasome)에 의한 두 가지 경로를 통해 이루어진다. 단백질의 10 ~ 20%를 분해하는 리소좀 경로는 기질 특이성 및 정교한 시간적 조절성이 없다. 즉 내포운동 (endocytosis)에 의해 세포 내로 함입되어 들어간 세포 표면단백질이 리소좀에서 분해되는 것처럼 대부분 세포외 또는 막단백질을 분해하는 과정이다. 그러나, 진핵세포에서 단백질들이 선택적으로 분해되기 위해서는 유비퀴틴 (ubiquitin) 결합효소에 의해 목표단백질에 유비퀴틴이 결합한 후 폴리유비퀴틴 사슬이 형성되고, 이것이 프로테아좀에 의해 인지되고 분해되는 과정, 즉 유비퀴틴-프로테아좀 경로 (ubiquitin-proteasome pathway: UPP)를 거쳐야 한다. 진핵세포 단백질 중 80 ~ 90% 이상은 이 과정을 거쳐서 분해되며, 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 진핵세포 내에 존재하는 대부분의 단백질 분해를 조절함으로써, 단백질의 전환과 항상성을 담당한다.

유비퀴틴은 매우 잘 보존된 76개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 거의 모든 진핵세포에 존재하며, 그 중 6, 11, 27, 29, 33, 48, 63번째 아미노산 잔기는 라이신 (Lysine, Lys, K)이며, 48과 63번이 폴리유비퀴틴 사슬을 형성하는 데 주요한 역할을 한다. 유비퀴틴이 단백질에 표지되는 과정 (ubiquitination)에는 일련의 효소계 (E1, E2, E3)가 관여하며, 표지된 단백질은 ATP-의존성 단백질 분해효소 복합체인 26S 프로테아좀에 의해 분해된다. 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 별개의 두 개의 연속된 과정을 포함하는데, 이 중 첫 번째는 기질에 여러 개의 유비퀴틴 분자를 공유결합으로 표지하는 과정이며, 두 번째는 유비퀴틴에 의해 표지된 단백질이 26S 프로테아좀 복합체에 의해 분해되는 과정이다. 유비퀴틴과 기질의 결합은 기질분자의 라이신 잔기와 유비퀴틴의 C-말단의 글리신 사이의 이소펩티드 결합 (isopeptide bond)을 통해 일어나며, 유비퀴틴-활성화 효소 E1, 유비퀴틴-결합 효소 E2, 유비퀴틴 리가아제 E3에 의해 유비퀴틴과 효소 간에 티올에스테르가 형성됨으로써 이루어진다. 그 중 E1 (ubiquitin-activating enzyme)은 ATP-의존적인 반응으로 유비퀴틴을 활성화시킨다. E2 (ubiquitin-conjugating enzyme)은 유비퀴틴-컨쥬게이션화 도메인 내의 시스테인 (cysteine) 잔기에 E1으로부터 활성화된 유비퀴틴을 받아서 이를 E3 리가아제 (ligase)에 전달하거나 또는 기질 단백질에 직접 전달한다. E3 효소 역시 기질 단백질의 라이신 잔기와 유비퀴틴의 글리신 잔기 간의 안정된 이소펩티드 결합을 촉매한다. 기질 단백질에 결합된 유비퀴틴의 C-말단 라이신 잔기에 또 다른 유비퀴틴이 연결될 수 있는데, 이러한 과정을 반복하여 기질 단백질에 여러 개의 유비퀴틴 분자가 가지를 친 모양으로 연결되어 폴리유비퀴틴 사슬을 형성하면 그 단백질은 26S 프로테아좀에 의해 인식되어 선택적으로 분해된다.

한편, 생체 내에서 치료적 효과를 갖는 다양한 종류의 단백질 및 (폴리)펩타이드가 알려져 있다. 이와 같이 생체 내에서 치료적 효과를 갖는 단백질 또는 (폴리)펩타이드는, 예를 들어, 성장호르몬분비호르몬 (growth hormone releasing hormone, GHRH), 성장호르몬 분비펩타이드 (growth hormone releasing peptide), 인터페론 (interferons, interferon-α or interferon-β), 인터페론수용체 (interferon receptors), 콜로니자극인자 (colony stimulating factors, CSFs), 글루카곤-유사 펩타이드 (glucagon-like peptides), 인터류킨 (interleukins), 인터류킨수용체 (interleukin receptors), 엔자임 (enzymes), 인터류킨결합단백질 (interleukin binding proteins), 사이토카인 결합단백질 (cytokine binding proteins), G-단백질-결합수용체 ( G-protein-coupled receptor), 인간성장호르몬 (human growth hormone, hGH), 대식세포 활성화인자 (macrophage activating factor), 대식세포 펩타이드 (macrophage peptide), B 세포인자 (B cell factor), T 세포인자 (T cell factor), 단백질 A (protein A), 알러지저해제 (allergy inhibitor), 세포괴사 글리코단백질 (cell necrosis glycoproteins), G-단백질-결합수용체 (G-protein-coupled receptor), 면역독소 (immunotoxin), 림프독소 (lymphotoxin), 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 종양억제자 (tumor suppressors), 전이성장인자 (metastasis growth factor), 알파-1 안티트립신 (alpha-1 antitrypsin), 알부민 (albumin), 알파-락트알부민 (alpha-lactalbumin), 아포지질단백질-E (apolipoprotein-E), 에리트로포이에틴 (erythropoietin), 고도로 글리코실화된 에리트로포이에틴 (highly glycosylated erythropoietin), 안지오포이에틴 (angiopoietins), 헤모글로빈 (hemoglobin), 트롬빈 (thrombin), 트롬빈수용체 활성화 펩타이드 (thrombin receptor activating peptide), 트롬보모둘린 (thrombomodulin), 제 VII인자 (factor VII), 제 VIIa인자 (factor VIIa), 제 VIII인자 (factor VIII), 제 IX인자 (factor IX), 제 XIII인자 (factor XIII), 플라스미노겐 활성화인자 (plasminogen activating factor), 유로키나아제 (urokinase), 스트렙토키나아제 (streptokinase), 히루딘 (hirudin), 단백질 C (protein C), C-반응성단백질 (C-reactive protein), 레닌저해제 (renin inhibitor), 콜라게네이즈 저해제 (collagenase inhibitor), 수퍼옥시드 디스무타아제 (superoxide dismutase), 렙틴 (leptin), 혈소판 유래 성장인자 (platelet-derived growth factor), 상피세포성장인자 (epithelial growth factor), 내피세포성장인자 (epidermal growth factor), 안지오스타틴 (angiostatin), 안지오텐신 (angiotensin), 골성장인자 (bone growth factor), 골자극단백질 (bone stimulating protein), 칼시토닌 (calcitonin), 인슐린 (insulin), 아트리오펩틴 (atriopeptin), 연골유도인자 (cartilage inducing factor), 피브린결합펩타이드 (fibrin-binding peptide), 엘카토닌 (elcatonin), 결합조직 활성인자 (connective tissue activating factor), 조직인자계 응고억제제 (tissue factor pathway inhibitor), 여포자극호르몬 (follicle stimulating hormone), 황체형성호르몬 (luteinizing hormone), 황체형성호르몬분비호르몬 (luteinizing hormone releasing hormone), 신경성장인자 (nerve growth factors), 부갑상선호르몬 (parathyroid hormone), 릴랙신 (relaxin), 세크레틴 (secretin), 소마토메딘 (somatomedin), 인슐린 유사 성장인자 (insulin-like growth factor), 부신피질호르몬 (adrenocortical hormone), 글루카곤 (glucagon), 콜레시토키닌 (cholecystokinin), 췌장폴리펩타이드 (pancreatic polypeptide), 가스트린분비펩타이드 (gastrin releasing peptide), 부신피질자극호르몬 방출인자 (corticotropin releasing factor), 갑상선자극호르몬 (thyroid stimulating hormone), 오토택신 (autotaxin), 락토페린 (lactoferrin), 미오스타틴 (myostatin), 수용체 (receptors), 수용체길항제 (receptor antagonists), 세포표면항원 (cell surface antigens), 바이러스 유래 백신항원 (virus derived vaccine antigens), 모노클로널 항체 (monoclonal antibodies), 폴리클로널 항체 (polyclonal antibodies), 및 항체단편을 포함한다.

과립구대식세포 콜로니자극인자 (GM-CSF; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)는 대식세포, T 세포, 비만 세포, 자연 살해 세포, 내피세포 및 섬유아 세포에 의해 분비되는 단백질로서, 백혈구의 성장인자로 기능하는 사이토가인이다. 또한 줄기세포가 과립구(호중구, 호염기구, 호산구)와 단핵구를 생산하도록 자극하며, 대식세포의 수를 급격히 늘려 감염반응과 대항할 수 있도록 하므로 면역/감염반응에 작용한다 (Med Oncol., 31(1):774, 2014; Blood, 77(6):1131-1145, 1991). 재조합 GM-CSF는 HIV-감염 환자들에게 백신 보조제로써 사용될 수 있다고 보고되었다 (Hum Vaccin Immunother., 8(11):16541658, 2012; Vaccines (Basel)., 2(1):160178, 2014). 또한 비호킨스 림프종, 림프종 백혈병이나 호킨스 환자들이 골수 이식 치료를 받을 때 백혈구 수치 증가에 효과가 있으나, 류마티스 관절염 환자의 관절에서는 높게 발현되기 때문에 GM-CSF이 줄어들게 되면 염증이나 손상을 줄일 수 있다고 보고된다 (Expert Rev Neurother., 13(3):313-335, 2013).

본 발명은 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기가 치환된 단백질로서, 증가된 반감기를 갖는 단백질을 제공하는 하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 증가된 반감기를 갖는 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기를 치환하는 것을 포함하는, 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 단백질의 라이신 잔기는 보존적 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명에서, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한, 예를 들어, 전하 또는 소수성을 갖는 화학적 특성을 갖는 측쇄를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것을 의미한다. 일반적으로 보존적 아미노산 치환에 의해 단백질의 기능적 특성은 실질적으로 변화하지 않는다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르 테이트 및 글루타메이트 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다.

본 발명에서 단백질의 라이신 잔기는 염기성 측쇄를 포함하는 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있으며, 바람직하게는 아르기닌 잔기로 치환된다.

본 발명에 따르면 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 단백질은 반감기가 증가되어 체내에서 오랜 시간 잔류할 수 있다.

도 1은 GM-CSF 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 2는 GM-CSF 유전자 크기와 PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 HEK-293T 세포에서 GM-CSF의 플라스미드를 통한 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 유비퀴틴화 분석을 통한 GM-CSF의 분해경로를 제시한다.
도 5는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 GM-CSF 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 6은 단백질합성 저해제 시클로헥시미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 GM-CSF의 반감기 변화를 나타낸다.
도 7은 JAK-STAT, PI3K-AKT 및 MAPK/ERK 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.

본 발명의 일 구체예에서, 단백질은 GM-CSF이다. 서열번호 1로 표시되는 GM-CSF의 아미노산 서열에서 N-말단에서부터 89, 91, 및 102번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 GM-CSF 및 이를 포함하는 호중구감소증 예방 및/또는 면역 질환 및/또는 고형암 및 혈액암을 포함하는 암 및/또는 류마티스 관절염 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 라이신 잔기를 아르기닌 (arginine, R) 잔기로 치환시키기 위하여 부위특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하였다. 이 방법은 특정 돌연변이를 유도할 DNA서열을 이용하여 프라이머를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작한다.

본 발명에서, 표적단백질을 면역침강분석법에 의해 세포주 내로 형질감염시키고 침강시켜 유비퀴틴화 정도를 확인하였으며, MG132 (프로테아좀 저해제) 시약을 처리한 결과, 유비퀴틴화 정도가 증가한 것을 통해 표적단백질이 유비퀴틴-프로테아좀에 의한 분해 경로를 거친다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 약학조성물은 경구 (oral), 경피 (transcutaneous), 피하 (subcutaneous), 정맥내 (intravenous) 또는 근육내 투여를 포함하는 다양한 경로로 체내 전달될 수 있으며, 주사형 제제로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 방법에 따라 투여된 후에 신속한 방출, 지연된 방출 또는 천천히 방출 되도록 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 상기 제형은 정제 (tablet), 알약 (pill), 분말 (powder), 사셰 (sachet), 엘렉시르제 (elixir), 현탁 (suspension), 에멀션 (emulsion), 용액 (solution), 시럽 (syrup), 에어로졸 (aerosol), 소프트 또는 단단한 젤라틴 캡슐 (soft and hard gelatin capsule), 멸균주사용액 (sterile injectable solution), 멸균 팩키지된 분말 등을 포함한다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토오스 (lactose), 덱스트로오스 (dextrose), 수크로오스 (sucrose), 만니톨 (mannitol), 자일리톨 (xylitol), 에리스리톨 (erythritol), 말티톨 (maltitol), 탄수화물 (starches), 검 아카시아 (gum acacia), 알지네이트 (alginates), 젤라틴 (gelatin), 인산칼슘 (calcium phosphate), 규산칼슘 (calcium silicate), 셀룰로오스 (cellulose), 메틸셀룰로오스 (methyl cellulose), 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 물, 메틸히드록시벤조에이트 (methylhydroxybenzoates), 프로필히드록시벤조에이트 (propylhydroxybenzoates), 활석 (talc), 스테아린산마그네슘 (magnesium stearate) 및 미네랄 오일을 포함한다. 또한, 제형은 충진제, 항교착제 (anti-agglutinating agents), 윤활제 (lubricating agents), 습윤제 (wetting agents), 향미료 (flavoring agents), 유화제 (emulsifiers), 보존제 (preservative) 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 단수형태는 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수형태를 포함한다. 또한, 본 발명에서 구성된, 갖는 이루어진 과 같은 용어는 “포함하는”과 유사한 의미를 갖는 것으로 해석된다. 본 발명에서, “생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질”은 인간을 포함하는 포유동물에 투여되었을 때 유용한 생물학적 활성을 나타내는 (폴리)펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 더 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것을 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시 예 1: GM- CSF 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 GM-CSF DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 BamHI과 XhoI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였으며 (도 1, GM-CSF 아미노산 서열: SEQ No.1), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 2). 또한 도 1의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝 된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머 세트의 일부이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 2). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 60℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 30초를 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 15의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 발현을 확인하였으며, 이를 통해 myc에 결합된 GM-CSF 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였고 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것을 확인히였다 (도 3).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (GM-CSF K89R FP 5'-GGCAGCCTCACCAGGCTCAAGGGCC-3' (SEQ No.2), RP 5'-GGCCCTTGAGCCTGGTGAGGCTGCC-3' (SEQ No.3); GM-CSF K91R FP 5'-CTC ACCAAGCTCAGGGGCCCCTTGACC-3' (SEQ No.4), RP 5'-GGTCAAGGGGCCCCTGAGCTTGGTGAG-3' (SEQ No.5); GM-CSF K102R FP 5'-GCTAGCCACTACAGACAGCACTGCCCT-3' (SEQ No.6), RP 5'-AGGGCAGTGCTGTCTGTAGTGGCTAGC-3' (SEQ No.7)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-GM-CSF를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 3개의 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 1).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 GM-CSF 작제물
89	pcDNA3-myc-GM-CSF (K89R)
91	pcDNA3-myc-GM-CSF (K91R)
102	pcDNA3-myc-GM-CSF (K102R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-GM-CSF WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 과정을 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-GM-CSF WT 3 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 (co-transfection)시키고 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖, Sigma-Aldrich)을 6시간 동안 처리한 후, 면역 침강 분석을 실시하였다 (도 4). 또한 WT과 치환체 사이의 유비퀴틴화 정도를 비교하기 위하여 pcDNA3-myc-GM-CSF WT, pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K89R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R) 및 pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R) 각 3㎍을 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍과 함께 HEK 293T 세포 (ATCC, CRL-3216)를 공동형질감염 (co-transfection)시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 5).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-GM-CSF WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 4, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 4, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K89R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R) 의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-GM-CSF WT, pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K89R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 5). 이상의 결과는 GM-CSF이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화 되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성저해제 cycloheximide ( CHX )에 의한 GM- CSF의 반감기 확인

pcDNA3-myc-GM-CSF WT, pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K89R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R)를 각각 3 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질 생성 저해제 시클로헥시미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 30분, 60분, 90분에 걸쳐서 반감기를 측정해본 결과, 인간 GM-CSF의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 6). 인간 GM-CSF의 반감기는 30분 이내인 반면, 인간 pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R)의 반감기는 60분 및 90분 이상으로 WT보다 길어졌으며, 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 6).

4. 세포 내에서의 GM- CSF 와 GM- CSF 치환체들에 의한 신호전달 확인

GM-CSF에 의한 세포 내 역할은 JAK/STAT, MAPK 및 PI3K/AKT 신호전달에 의해 작용한다는 것이 보고되었다 (Blood, 119(15):3383-3393, 2012).

본 실시예에서는 세포 내에서 GM-CSF와 GM-CSF 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K89R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 HeLa 세포를 감염시킨 2일 경과 후, 감염된 세포에서 단백질을 추출하여 각 정량 후, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K89R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R)으로 감염된 HeLa 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S), 항-AKT (H-136, Santa Cruz Biotechnology, sc-8312), 항-phospho-AKT (S473, cell signaling 9271S), 항-Erk1/2 (9B3, Abfrontier LF-MA0134), 항-phospho-Erk1/2 (Thr202/Tyr204, Abfrontier LF-PA0090) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000~1:3000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K89R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K91R), pcDNA3-myc-GM-CSF 치환체 (K102R)은 HeLa 세포 내에서 pcDNA3-myc-GM-CSF WT과 동일하거나 증가된 phospho-STAT3와 phospho-AKT 신호전달을 보였다 (도 7).

본 발명에 따르면, 반감기가 증가된 GM-CSF가 제공된다. 따라서 본 발명은 치료제로서 이용될 수 있는 GM-CSF에 관한 것으로서, 제약 산업서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

<110> UbiProtein. Corp <120> A method for extending half-life of GMCSF <130> UBPRN17P-0005 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor <400> 1 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ggcagcctca ccaggctcaa gggcc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ggcccttgag cctggtgagg ctgcc 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ctcaccaagc tcaggggccc cttgacc 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ggtcaagggg cccctgagct tggtgag 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gctagccact acagacagca ctgccct 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 agggcagtgc tgtctgtagt ggctagc 27

Claims (4)

1. 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 과립구대식세포 콜로니자극인자 (GM-CSF; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)의 N-말단으로부터 91 및 102번째 위치의 라이신 잔기 중 어느 하나가 아르기닌으로 치환된 것인, 증가된 반감기를 갖는 GM-CSF.
2. 삭제
3. (a) 프로모터; 및 (b) 제 1항의 GM-CSF를 엔코딩 하는 염기서열을 포함하는 발현벡터로서, 상기 프로모터와 염기서열이 작동적으로 연결된 것인, 발현벡터.
4. 제 3항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
   
   
   
   
   
   
   

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