KR101923896B1

KR101923896B1 - 단백질 반감기를 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR101923896B1
Application number: KR1020170033797A
Authority: KR
Inventors: 백광현; 김경곤; 배성렬; 김명선; 김현미
Original assignee: 주식회사 유비프로틴
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2018-11-29
Also published as: KR20180055651A

Abstract

본 발명은 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기를 치환 하는 것을 포함하여 단백질의 반감기를 증가시키는 방법 또는 반감기가 증가 된 단백질에 관한 것으로서, 본 발명의 라이신 잔기가 치환된 단백질은 인체 내에 서 오랜 시간 동안 잔류하며 치료효과가 우수하다.

Description

단백질 반감기를 증가시키는 방법 {A method for extending half-life of a protein}

본 발명은 단백질 또는 (폴리)펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함에 의해 단백질 또는 (폴리)펩타이드의 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한 이러한 방법에 의해 제작된 반감기가 증가된 단백질 또는 (폴리)펩타이드에 관한 것이다.

세포 내 단백질 분해는 리소좀 (lysosome)과 프로테아좀 (proteasome)에 의한 두 가지 경로를 통해 이루어진다. 단백질의 10 ~ 20%를 분해하는 리소좀 경로는 기질 특이성 및 정교한 시간적 조절성이 없다. 즉 내포운동 (endocytosis)에 의해 세포 내로 함입되어 들어간 세포 표면단백질이 리소좀에서 분해되는 것처럼 대부분 세포외 또는 막단백질을 분해하는 과정이다. 그러나, 진핵세포에서 단백질들이 선택적으로 분해되기 위해서는 유비퀴틴 (ubiquitin) 결합효소에 의해 목표단백질에 유비퀴틴이 결합한 후 폴리유비퀴틴 사슬이 형성되고, 이것이 프로테아좀에 의해 인지되고 분해되는 과정, 즉 유비퀴틴-프로테아좀 경로 (ubiquitin-proteasome pathway: UPP)를 거쳐야 한다. 진핵세포 단백질 중 80 ~ 90% 이상은 이 과정을 거쳐서 분해되며, 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 진핵세포 내에 존재하는 대부분의 단백질 분해를 조절함으로써, 단백질의 전환과 항상성을 담당한다.

유비퀴틴은 매우 잘 보존된 76개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 거의 모든 진핵세포에 존재하며, 그 중 6, 11, 27, 29, 33, 48, 63번째 아미노산 잔기는 라이신 (Lysine, Lys, K)이며, 48과 63번이 폴리유비퀴틴 사슬을 형성하는 데 주요한 역할을 한다. 유비퀴틴이 단백질에 표지되는 과정 (ubiquitination)에는 일련의 효소계 (E1, E2, E3)가 관여하며, 표지된 단백질은 ATP-의존성 단백질 분해효소 복합체인 26S 프로테아좀에 의해 분해된다. 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 별개의 두 개의 연속된 과정을 포함하는데, 이 중 첫 번째는 기질에 여러 개의 유비퀴틴 분자를 공유결합으로 표지하는 과정이며, 두 번째는 유비퀴틴에 의해 표지된 단백질이 26S 프로테아좀 복합체에 의해 분해되는 과정이다. 유비퀴틴과 기질의 결합은 기질분자의 라이신 잔기와 유비퀴틴의 C-말단의 글리신 사이의 이소펩티드 결합 (isopeptide bond)을 통해 일어나며, 유비퀴틴-활성화 효소 E1, 유비퀴틴-결합 효소 E2, 유비퀴틴 리가아제 E3에 의해 유비퀴틴과 효소 간에 티올에스테르가 형성됨으로써 이루어진다. 그 중 E1 (ubiquitin-activating enzyme)은 ATP-의존적인 반응으로 유비퀴틴을 활성화시킨다. E2 (ubiquitin-conjugating enzyme)은 유비퀴틴-컨쥬게이션화 도메인 내의 시스테인 (cysteine) 잔기에 E1으로부터 활성화된 유비퀴틴을 받아서 이를 E3 리가아제 (ligase)에 전달하거나 또는 기질 단백질에 직접 전달한다. E3 효소 역시 기질 단백질의 라이신 잔기와 유비퀴틴의 글리신 잔기 간의 안정된 이소펩티드 결합을 촉매한다. 기질 단백질에 결합된 유비퀴틴의 C-말단 라이신 잔기에 또 다른 유비퀴틴이 연결될 수 있는데, 이러한 과정을 반복하여 기질 단백질에 여러 개의 유비퀴틴 분자가 가지를 친 모양으로 연결되어 폴리유비퀴틴 사슬을 형성하면 그 단백질은 26S 프로테아좀에 의해 인식되어 선택적으로 분해된다.

한편, 생체 내에서 치료적 효과를 갖는 다양한 종류의 단백질 및 (폴리)펩타이드가 알려져 있다. 이와 같이 생체 내에서 치료적 효과를 갖는 단백질 또는 (폴리)펩타이드는, 예를 들어, 성장호르몬분비호르몬 (growth hormone releasing hormone, GHRH), 성장호르몬 분비펩타이드 (growth hormone releasing peptide), 인터페론 (interferons, interferon-α or interferon-β), 인터페론수용체 (interferon receptors), 콜로니자극인자 (colony stimulating factors, CSFs), 글루카곤-유사 펩타이드 (glucagon-like peptides), 인터류킨 (interleukins), 인터류킨수용체 (interleukin receptors), 엔자임 (enzymes), 인터류킨결합단백질 (interleukin binding proteins), 사이토카인 결합단백질 (cytokine binding proteins), G-단백질-결합수용체 ( G-protein-coupled receptor), 인간성장호르몬 (human growth hormone, hGH), 대식세포 활성화인자 (macrophage activating factor), 대식세포 펩타이드 (macrophage peptide), B 세포인자 (B cell factor), T 세포인자 (T cell factor), 단백질 A (protein A), 알러지저해제 (allergy inhibitor), 세포괴사 글리코단백질 (cell necrosis glycoproteins), G-단백질-결합수용체 (G-protein-coupled receptor), 면역독소 (immunotoxin), 림프독소 (lymphotoxin), 종양괴사인자 (tumor necrosis factor), 종양억제자 (tumor suppressors), 전이성장인자 (metastasis growth factor), 알파-1 안티트립신 (alpha-1 antitrypsin), 알부민 (albumin), 알파-락트알부민 (alpha-lactalbumin), 아포지질단백질-E (apolipoprotein-E), 에리트로포이에틴 (erythropoietin), 고도로 글리코실화된 에리트로포이에틴 (highly glycosylated erythropoietin), 안지오포이에틴 (angiopoietins), 헤모글로빈 (hemoglobin), 트롬빈 (thrombin), 트롬빈수용체 활성화 펩타이드 (thrombin receptor activating peptide), 트롬보모둘린 (thrombomodulin), 제 VII인자 (factor VII), 제 VIIa인자 (factor VIIa), 제 VIII인자 (factor VIII), 제 IX인자 (factor IX), 제 XIII인자 (factor XIII), 플라스미노겐 활성화인자 (plasminogen activating factor), 유로키나아제 (urokinase), 스트렙토키나아제 (streptokinase), 히루딘 (hirudin), 단백질 C (protein C), C-반응성단백질 (C-reactive protein), 레닌저해제 (renin inhibitor), 콜라게네이즈 저해제 (collagenase inhibitor), 수퍼옥시드 디스무타아제 (superoxide dismutase), 렙틴 (leptin), 혈소판 유래 성장인자 (platelet-derived growth factor), 상피세포성장인자 (epithelial growth factor), 내피세포성장인자 (epidermal growth factor), 안지오스타틴 (angiostatin), 안지오텐신 (angiotensin), 골성장인자 (bone growth factor), 골자극단백질 (bone stimulating protein), 칼시토닌 (calcitonin), 인슐린 (insulin), 아트리오펩틴 (atriopeptin), 연골유도인자 (cartilage inducing factor), 피브린결합펩타이드 (fibrin-binding peptide), 엘카토닌 (elcatonin), 결합조직 활성인자 (connective tissue activating factor), 조직인자계 응고억제제 (tissue factor pathway inhibitor), 여포자극호르몬 (follicle stimulating hormone), 황체형성호르몬 (luteinizing hormone), 황체형성호르몬분비호르몬 (luteinizing hormone releasing hormone), 신경성장인자 (nerve growth factors), 부갑상선호르몬 (parathyroid hormone), 릴랙신 (relaxin), 세크레틴 (secretin), 소마토메딘 (somatomedin), 인슐린 유사 성장인자 (insulin-like growth factor), 부신피질호르몬 (adrenocortical hormone), 글루카곤 (glucagon), 콜레시토키닌 (cholecystokinin), 췌장폴리펩타이드 (pancreatic polypeptide), 가스트린분비펩타이드 (gastrin releasing peptide), 부신피질자극호르몬 방출인자 (corticotropin releasing factor), 갑상선자극호르몬 (thyroid stimulating hormone), 오토택신 (autotaxin), 락토페린 (lactoferrin), 미오스타틴 (myostatin), 수용체 (receptors), 수용체길항제 (receptor antagonists), 세포표면항원 (cell surface antigens), 바이러스 유래 백신항원 (virus derived vaccine antigens), 모노클로널 항체 (monoclonal antibodies), 폴리클로널 항체 (polyclonal antibodies), 및 항체단편을 포함한다.

β-트로핀 (β-trophin)은 인슐린을 분비하는 췌장의 β-세포를 빠르게 성장시킨다. β-트로핀은 제 2형 당뇨병 환자들에게 한 달 또는 일 년에 1회 투여함에 의해, 혈중 당 수치를 일정하게 조절하는 췌장 β-세포의 활동을 충분히 유지할 수 있다. 또한, 인슐린을 투여 받는 것이 아니라, β-트로핀의 투여에 의해 인체가 자신의 인슐린을 생성하므로 부작용이 거의 없다. β-트로핀이 마우스 간에서 일시적으로 발현이 되면 췌장-베타 세포의 증식이 촉진된다는 것이 보고된 바 있다 (Cell 153, 747-758, 2013).

성장호르몬 (Growth hormone: GH)은 펩티드 호르몬의 일종으로 뇌하수체 전엽에서 합성 및 분비가 이루어지고, 체내에서 뼈, 연골 등의 성장뿐만 아니라 지방의 분해 및 단백질 합성을 촉진시키는 대사에도 관여한다. 성장호르몬은 왜소증에 대한 치료를 목적으로 사용될 수 있고, 왜소증은 선천성심장병, 만성폐질환, 만성신장질환, 만성소모성질환 등으로 인한 왜소증, 성장호르몬 결핍증이나 갑상선 기능 저하증, 당뇨병 등 호르몬 분비이상으로 인한 왜소증, 또는 선천적 염색체 질환인 터너 증후군을 포함할 수 있다. 성장호르몬은 STAT (signal transducers and activators of transcription) 단백질의 유전자 수준에서의 전사를 조절한다는 것이 보고되었다 (Oncogene, 19, 2585-2597, 2000).

인슐린 (Insulin)은 체내 혈당을 조절한다. 인슐린은 췌장의 섬세포가 파괴되어 인슐린이 부족해져 혈당의 농도가 증가하는 제 1형 당뇨병 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 체세포의 인슐린 수용체에 저항성이 생겨서 인슐린이 분비 됨에도 혈당의 농도가 조절되지 않는 제 2형 당뇨병 환자에게도 투여될 수 있다. 인슐린은 간에서 STAT3의 인산화를 자극하여 결과적으로 간에서의 글루코오스 (glucose) 항상성을 조절한다는 것이 보고되었다 (Cell Metabolism 3, 267-275, 2006).

인터페론 (Interferons)은 면역시스템의 세포들인 백혈구, 자연살해세포 (natural killer cell), 섬유아세포, 상피세포 등에 의해서 분비되고 만들어지며, 자연적으로 발생하는 단백질 군의 일종이다. 인터페론은 타입Ⅰ, 타입Ⅱ, 및 타입Ⅲ의 3가지로 분류되고 각 단백질들이 전달하는 수용체의 종류에 따라 결정된다. 인터페론의 작용 기전은 복잡하여 완전하게 이해되고 있지는 못하나, 바이러스, 세균, 암 그리고 다른 외부의 물질들에 대한 면역체계의 반응을 조절한다고 알려져 있다. 한편, 인터페론은 바이러스의 세포들 또는 암세포들을 직접적으로 사멸시키지 않는 대신에 면역시스템의 반응을 촉진하고, 수많은 세포의 단백질 분비를 조절하는 유전자 작용을 조절함으로써 암세포의 성장을 억제시킨다. 인터페론 타입Ⅰ에 포함된 IFN-α는 B형 간염과 C형 간염의 치료에 사용될 수 있음이 알려져 있으며, IFN-β는 다발성경화증을 치료하는데 이용될 수 있다. 인터페론-α는 STAT-1, -2와 -3를 증가시킨다는 것이 보고되었고 (J Immunol, 187, 2578-2585, 2011), 멜라노마 (melanoma) 세포에서는 인터페론-α에 의해 성장을 촉진하는 STAT3 단백질을 활성화한다는 것이 보고되었다 (Euro J Cancer, 45, 1315-1323, 2009). 세포 내에 인터페론-β을 처리하게 되면 AKT를 포함하는 신호전달 과정들의 활성이 유도된다는 것이 보고되었다 (Pharmaceuticals (Basel), 3, 994-1015, 2010).

과립구집락자극인자 (G-CSF: Granulocyte-colony stimulating factor)는 과립구들과 줄기세포를 생성하고 혈류로 이 세포들을 방출시키도록 골수를 자극시키는 당단백질이다. 기능적으로 사이토카인과 호르몬의 역할을 하며 집락자극인자 (colony stimulating factor)의 한 유형이다. G-CSF는 조혈체계에 영향을 주는 것에 더하여 신경세포에 신경영양 인자로서 작용할 수 있다. 이것의 수용체는 실제로 뇌와 척수에 있는 뉴런에서 발현되며 중추신경계에서 G-CSF의 작용은 신경세포의 발생을 유도하고, 신경가소성을 증가시키며 세포예정사에 대응한다. 이러한 특성들로 인해 G-CSF는 뇌경색과 같은 신경성 질환의 치료의 발전을 위해 연구 중에 있다. G-CSF는 백혈구의 일종인 과립구들의 생성을 자극시킨다. 또한, 종양학과 혈액학에서 G-CSF의 재조합 형태는 화학치료 후의 호중구 감소증으로부터의 회복을 촉진하기 위해 주로 암 환자들에 사용된다. 과립구집락자극인자 (G-CSF)는 신경교종 (glioma) 세포에서 STAT3를 활성화시키고 이를 통해서 신경교종 증식에 관여한다는 것이 보고되었으며 (Cancer Biol Ther., 13(6), 389-400, 2012), 난소 상피암세포 (ovarian epithelial cancer cells)에서 발현된다는 것과 JAK2/STAT3 경로를 조절함에 따라 여성 자궁암의 병리학적 관련성이 있다는 것이 보고되었다 (Br J Cancer, 110, 133-145, 2014).

에리트로포이에틴 (Erythropoietin, EPO)은 당단백질 호르몬으로, 인터루킨 3 (IL-3), 인터루킨 6 (IL-6), 글루코코르티코이드 및 줄기세포인자와 같은 다양한 성장인자와 작용한다. 에리트로포이에틴은 사이토카인으로서 적혈구의 전구체 형태로 골수에 존재하면서 적혈구 생성에 관여한다. 또한, 에리트로포이에틴은 혈관수축에 의존적인 고혈압과도 연관이 있는데, 간에서 생성되는 체내 철분 조절호르몬 (iron-regulatory hormone)인 헵시딘 호르몬의 흡수를 억제시켜 철 이온의 흡수를 증가시킴으로써 조절한다. 또한, 에리트로포이에틴은 심근경색이나 뇌졸중과 같은 신경손상에 대한 뇌의 반응에 신경을 보호하는 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라 기억증진, 상처회복, 우울증치료에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 에리트로포이에틴은 폐암이나 혈액 암에서 증가되며 에리트로포이에틴을 투여하게 될 경우 Erk1/2의 인산화에 의해 세포 주기 진행을 조절하여 저산소증에서 효과가 증가된다는 것이 보고되었다 (J Hematol Oncol., 6, 65, 2013).

재조합 섬유아세포성장인자-1 (Fibroblast growth factor-1: FGF-1)은 섬유아세포성장인자 중의 하나로써 산성 FGF이며 배아발달, 세포성장, 조직재생, 암 성장과 전이 등에 역할을 한다. 또한 임상 연구에서 FGF-1은 심장에서 혈관신생 (angiogenesis)을 유도한다는 것이 보고되었다 (BioDrugs., 11(5), 301308, 1999). FGF는 진피의 섬유아세포의 성장을 촉진시키는 물질이기 때문에 진피세포를 건강하게 유지시키고 피부탄력을 강화시켜 피부를 촉촉하게 만들어주며 피부세포의 활성화로 피부 전체의 인상이 밝아지면서 뽀얀 피부를 유지할 수 있게 한다. 또한, 상처가 나거나 손상된 피부를 신속하게 회복시키도록 도와주며 피부장벽을 강화시켜서 방어기능을 강화하기도 한다. HEK293 세포에 처리하게 되면 Erk 1/2 인산화가 증가한다는 것이 보고되었다 (Nature, 513(7518), 436-439, 2014).

혈관내피생성인자 A (Vascular endothelial growth factor A: VEGFA)는 혈관형성 (vasculogenesis) 및 혈관신생 (angiogenesis)을 자극하는 세포에서 생산되는 신호전달 단백질로써 저산소 환경의 조직에 산소를 저장하는 과정에 역할을 한다 (Mol Cell Endocrinol., 397, 5157, 2014). 기관지 천식과 당뇨병의 경우, VEGF의 혈장 농도가 높아져 있으며 (Diabetes, 48(11), 22292239, 2013), VEGF의 정상적인 기능은 배아 발달, 손상 후 새 혈관의 생성, 운동 후 근육과 막힌 혈관을 관통하는 새로운 혈관의 생성 등의 기능을 한다. VEGF가 과발현이 되면 질환이 생기게 된다. 고형암의 경우 계속적으로 혈액이 주입되지 않을 경우 더 이상 커질 수 없는데 VEGF가 발현되면 보다 더 성장하고 전이가 일어나게 된다. 내피세포의 성장 및 증식과 관련해서 중요한 인자로써 암세포에서 신생혈관생성에 작용을 하게 되는데, 이 때 PI3K/Akt/HIF-1α 신호전달과정이 관여한다는 것이 보고되었다 (Carcinogenesis, 34, 426-435, 2013). 또한 VEGF는 AKT 인산화를 유도한다는 것이 보고되었다 (Kidney Int., 68, 1648-1659, 2005).

지방조직에서 분비되는 식욕억제단백질 (Leptin)과 식욕촉진호르몬 (Ghrelin) 중 식욕억제단백질 (Leptin)은 면역, 생식 및 조혈 작용에 중요한 역할을 하는 16-kDa의 체내 순환 호르몬이며 (Cell Res., 10, 81-92, 2000), 식욕촉진호르몬 (Ghrelin)은 성장호르몬 분비수용체 (the growth hormone secretagogue receptor; GHS-R)를 통해서 지방조직에서 분비되어 식욕을 느끼게 하는 28 아미노산으로 구성된 위 펩티드 (stomach-peptide)이며 (J Endocrinol., 192, 313323, 2007; Nature, 442, 656-660, 1999), preproghrelin으로부터 프로세싱 과정을 통해 형성된다 (Pediatr Res., 65, 3944, 2009; J Biol Chem., 281(50), 3886738870, 2006). 식욕억제단백질 (Leptin)은 지방조직에서 분비되어 포만감을 느끼게 하여 더 이상 음식을 섭취하지 않도록 느끼게 하는 호르몬으로, 이 호르몬 분비에 문제가 발생하면 음식을 먹고 싶은 욕구가 발생된다. 과당이 인슐린의 분비를 방해하고 렙틴 분비를 낮추고 그렐린의 분비를 촉진시켜 식욕을 증가시키는 것이 보고된 바 있다 (J Biol Chem., 277(7), 5667-5674, 2002; I.J.S.N., 7(1), 06-15, 2016). 또한 식욕억제단백질 (Leptin)은 유방암 세포에서 AKT의 인산화를 증가시킨다는 것이 보고되었으며 (Cancer Biol Ther., 16(8), 1220-1230, 2015), 자궁암에서는 PI3K/AKT 신호전달 과정에 의해 암 세포 성장을 자극시킨다는 것이 보고되었다 (Int J Oncol., 49(2), 847, 2016). 반면에 식욕촉진호르몬 (Ghrelin)은 성장호르몬 분비수용체 (the growth hormone secretagogue receptor; GHS-R)를 통해서 세포 성장을 조절하며, 체내 칼슘 조절을 통해서 STAT3를 증가시킨다는 것이 보고되었다 (Mol Cell Endocrinol., 285, 19-25, 2008).

글루카곤유사펩티드 (GLP-1)는 회장과 대장의 L세포에서 분비되는 인크레틴(incretin) 호르몬으로서 인슐린 분비를 증가시킨다. 특히, 포도당 농도에 따라 인슐린 분비를 증가시키는 특징이 있어 저혈당이 발생하지 않으며, 이러한 특징으로 인해 2형 당뇨병 치료에 이용될 수 있다고 보고되었다 (Pharmaceuticals (Basel), 3(8), 2554-2567, 2010; Diabetologia, 36(8), 741-744, 1993). 또한 GLP-1은 상부 소화기관의 운동저하, 식욕억제 등의 작용이 있고 기존에 존재하는 췌장의 β세포를 증식시킬 수도 있다 (Endocr Rev., 16(3), 390-410, 1995; Endocrinology, 141(12), 4600-4605, 2000; Dig Dis Sci., 38(4), 665-673, 1993; Am J Physiol., 273(5 Pt 1), E981- 988, 1997). 그러나 GLP-1의 혈중 반감기는 약 2분 정도로 매우 짧기 때문에 약제로 개발하기에는 큰 단점을 갖고 있다. 또한 glucose 항상성을 조절하며 인슐린 저항성에 중요한 역할을 하기 때문에 현재 당뇨 치료제로 사용되며 STAT3 활성을 유도한다는 것이 보고되었다 (Biochem Biophys Res Commun., 425(2), 304-308, 2012).

골형성단백질 (BMP2)은 TGF-β의 수퍼패밀리 (superfamily) 중 하나로서, 연골과 뼈 형성에 중요한 역할을 하는 단백질이며, 세포성장, 세포사멸 및 분화에 있어 중추적인 역할을 한다 (Genes Dev., 10, 1580-1594, 1996; Development, 122, 3725-3734, 1996; J Biol Chem., 274, 26503-26510, 1999; J Exp Med., 189, 1139-1147, 1999). 골수종 환자에서 나타나는 골 장애에 의해서 세포사멸을 유도하는 항암효과를 보이게 되어 다발성 골수종의 치료제로도 사용될 수 있다고 보고되었다 (Blood, 96(6), 2005-2011, 2000; Leuk Lymphoma., 43(3), 635-639, 2002).

면역글로불린 G (IgG)는 항체의 일종으로서 혈액 및 세포외액에서 발견되는 주요한 항체의 하나이며 세포 조직의 감염을 조절한다. IgG는 작은 크기의 단량체이며, 이는 IgG가 조직으로 쉽게 관류할 수 있도록 한다 (Basic Histology, McGraw-Hill, ISBN 0-8385-0590-2, 2003). IgG는 면역결핍, 자가면역질환, 및 감염을 치료하는데 사용된다 (Proc Natl Acad Sci U S A., 107(46), 19985-19990, 2010). 추가 부탁드립니다.

체내 항상성의 조절과 관련된 단백질 관련 치료제는 암의 유발 위험을 증가시키는 등의 부작용을 갖고 있다. 예를 들어, 인슐린분비호르몬분해효소 (DPP-4) 저해제 계열의 치료제는 갑상선암 유발 가능성이 제기되었고, 인슐린 글라진은 유방암 위험도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 성장호르몬분비 이상 질환을 가진 환자가 성장호르몬을 지속적으로 투여하거나 과다 투여할 경우 당뇨병, 미세혈관장애, 조기 사망과 관계가 있는 것으로 보고되고 있다. 이와 같이, 기존 단백질 관련 치료제의 부작용으로 인해 새로운 치료제 개발의 필요성이 높아짐에 따라, 본 발명자들은 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기를 치환시킴으로써 단백질이 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해되는 것을 방지하여 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 완성하였다.

본 발명은 단백질 또는(폴리)펩타이드의 반감기를 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기가 치환된 단백질로서, 증가된 반감기를 갖는 단백질을 제공하는 하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 증가된 반감기를 갖는 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기를 치환하는 것을 포함하는, 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 단백질의 라이신 잔기는 보존적 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명에서, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한, 예를 들어, 전하 또는 소수성을 갖는 화학적 특성을 갖는 측쇄를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것을 의미한다. 일반적으로 보존적 아미노산 치환에 의해 단백질의 기능적 특성은 실질적으로 변화하지 않는다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르 테이트 및 글루타메이트 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다.

본 발명에서 단백질의 라이신 잔기는 염기성 측쇄를 포함하는 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환될 수 있으며, 바람직하게는 아르기닌 잔기로 치환된다.

본 발명에 따르면 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 하나 이상의 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 단백질은 반감기가 증가되어 체내에서 오랜 시간 잔류할 수 있다.

도 1은 β-트로핀 발현벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 β-트로핀 유전자에 대한 PCR 결과물을 나타낸 것이다.
도 3은 HEK-293T 세포에서 β-트로핀 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 유비퀴틴화 분석을 통한 β-트로핀의 분해경로를 제시한다.
도 5는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 β-트로핀 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 6은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 β-트로핀의 반감기 변화를 나타낸다.
도 7은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 8은 성장호르몬 발현 벡터의 구조를 나타낸다.
도 9는 성장호르몬에 대한 PCR 결과물을 나타낸다.
도 10은 HEK-293T 세포에서 성장호르몬 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 11은 유비퀴틴화 분석을 통한 성장호르몬의 분해경로를 제시한다.
도 12는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 성장호르몬 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 13은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 성장호르몬의 반감기 변화를 나타낸다.
도 14는 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 15는 인슐린 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 16은 인슐린에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 17은 HEK-293T 세포에서 인슐린 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 18은 유비퀴틴화 분석을 통한 인슐린의 분해경로를 제시한다.
도 19는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 인슐린 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 20은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 인슐린의 반감기 변화를 나타낸다.
도 21은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 22는 인터페론-α 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 23은 인터페론-α 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 24는 HEK-293T 세포에서 인터페론-α 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 25는 유비퀴틴화 분석을 통한 인터페론-α의 분해경로를 제시한다.
도 26은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 인터페론-α 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 27은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 인터페론-α의 반감기 변화를 나타낸다.
도 28은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 29는 G-CSF 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 30은 G-CSF 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 31은 HEK-293T 세포에서 G-CSF 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 32는 유비퀴틴화 분석을 통한 G-CSF의 분해경로를 제시한다.
도 33은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 G-CSF 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 34는 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 G-CSF의 반감기 변화를 나타낸다.
도 35은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 36은 인터페론-β 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 37은 인터페론-β 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 38은 HEK-293T 세포에서 인터페론-β 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 39는 유비퀴틴화 분석을 통한 인터페론-β의 분해경로를 제시한다.
도 40은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 인터페론-β 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 41은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 인터페론-β 의 반감기 변화를 나타낸다.
도 42는 JAK-STAT 및 PI3K/AKT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 43은 에리트로포이에틴 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 44는 에리트로포이에틴 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 45는 HEK-293T 세포에서 에리트로포이에틴 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 46은 유비퀴틴화 분석을 통한 에리트로포이에틴의 분해경로를 제시한다.
도 47은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 에리트로포이에틴 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 48은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 에리트로포이에틴의 반감기 변화를 나타낸다.
도 49는 MAPK/ERK 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 50은 BMP2 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 51은 BMP2 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 52는 HEK-293T 세포에서 BMP2 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 53은 유비퀴틴화 분석을 통한 BMP2의 분해경로를 제시한다.
도 54는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 BMP2 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 55는 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 BMP2의 반감기 변화를 나타낸다.
도 56은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 57은 섬유아세포성장인자-1 (FGF-1) 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 58은 섬유아세포성장인자-1 (FGF-1) 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 59는 HEK-293T 세포에서 섬유아세포성장인자-1 (FGF-1) 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 60은 유비퀴틴화 분석을 통한 섬유아세포성장인자-1 (FGF-1)의 분해경로를 제시한다.
도 61은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 섬유아세포성장인자-1 (FGF-1) 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 62는 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 섬유아세포성장인자-1 (FGF-1)의 반감기 변화를 나타낸다.
도 63은 MAPK/ERK 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 64는 렙틴 (Leptin) 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 65는 렙틴 (Leptin) 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 66은 HEK-293T 세포에서 렙틴 (Leptin) 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 67은 유비퀴틴화 분석을 통한 렙틴 (Leptin)의 분해경로를 제시한다.
도 68은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 렙틴 (Leptin) 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 69는 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 렙틴 (Leptin)의 반감기 변화를 나타낸다.
도 70은 PI3K/AKT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 71은 혈관내피성장인자 (VEGFA) 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 72는 혈관내피성장인자 (VEGFA) 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 73은 HEK-293T 세포에서 혈관내피성장인자 (VEGFA) 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 74는 유비퀴틴화 분석을 통한 혈관내피성장인자 (VEGFA)의 분해경로를 제시한다.
도 75는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 혈관내피성장인자 (VEGFA) 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 76은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 혈관내피성장인자 (VEGFA)의 반감기 변화를 나타낸다.
도 77은 JAK-STAT 및 PI3K/AKT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 78은 그렐린/오베스타틴 프리프로펩타이드 (Ghrelin/obestatin prepropeptide) (Prepro-GHRL) 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 79는 그렐린/오베스타틴 프리프로펩타이드 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 80은 HEK-293T 세포에서 Prepro-GHRL 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 81는 유비퀴틴화 분석을 통한 Prepro-GHRL의 분해경로를 제시한다.
도 82는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 Prepro-GHRL 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 83은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 Prepro-GHRL의 반감기 변화를 나타낸다.
도 84은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 85는 GHRL 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 86은 GHRL 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 87은 HEK-293T 세포에서 GHRL 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 88는 유비퀴틴화 분석을 통한 GHRL의 분해경로를 제시한다.
도 89는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 GHRL 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 90은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 GHRL의 반감기 변화를 나타낸다.
도 91은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 92는 글루카곤유사펩타이드-1 (GLP-1) 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 93은 글루카곤유사펩타이드-1 (GLP-1) 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 94는 HEK-293T 세포에서 글루카곤유사펩타이드-1 (GLP-1) 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 95는 유비퀴틴화 분석을 통한 글루카곤유사펩타이드-1 (GLP-1)의 분해경로를 제시한다.
도 96은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 글루카곤유사펩타이드-1 (GLP-1) 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 97은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 글루카곤유사펩타이드-1 (GLP-1)의 반감기 변화를 나타낸다.
도 98은 JAK-STAT 시그널 유도와 같은 효과에 대한 결과를 나타낸다.
도 99는 IgG 중쇄 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 100은 IgG 중쇄 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 101은 HEK-293T 세포에서 IgG 중쇄 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 102는 유비퀴틴화 분석을 통한 IgG 중쇄의 분해경로를 제시한다.
도 103은 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 IgG 중쇄 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 104는 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 IgG 중쇄의 반감기 변화를 나타낸다.
도 105는 IgG 경쇄 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 106은 IgG 경쇄 유전자에 대한 PCR 결과를 나타낸다.
도 107은 HEK-293T 세포에서 IgG 경쇄 플라스미드 유전자의 발현을 나타낸다.
도 108은 유비퀴틴화 분석을 통한 IgG 경쇄의 분해경로를 제시한다.
도 109는 야생형과 비교하여 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 IgG 경쇄 치환체의 유비퀴틴화 정도를 나타낸다.
도 110은 단백질합성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide, CHX)으로 처리한 후 IgG 중쇄의 반감기 변화를 나타낸다.

본 발명의 일 구체예에서, 단백질은 β-트로핀이다. 서열번호 1로 표시되는 β-트로핀의 아미노산 서열에서 N-말단에서부터 62, 124, 153 및 158째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 그 결과로서, 상기 반감기가 증가된 β-트로핀 및 이를 포함하는 당뇨병 및 비만 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물이 제공된다 (Cell, 153(4), 747758, 2013; Cell Metab., 18(1), 5-6, 2013; Front Endocrinol (Lausanne), 4, 146, 2013).

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 성장호르몬이다. 서열번호 10으로 표시되는 성장호르몬의 아미노산 서열에서 N-말단에서부터 64, 67, 96, 141, 166, 171, 184, 194 및 198번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 상기 반감기가 증가된 성장호르몬 및 이를 포함하는 왜소증 및 기타 성장호르몬 결핍 질환 (Kabuki syndrome과 Kearns-Sayre syndrome (KSS)) 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다 (J Endocrinol Invest., 39(6), 667-677, 2016; J Pediatr Endocrinol Metab., 2016, [Epub ahead of print]; Horm Res Paediatr. 2016, [Epub ahead of print]).

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 인슐린이다. 서열번호 17로 표시되는 인슐린의 아미노산 서열에서 N-말단에서부터 53 및 88번째 라이신 잔기 중 하나 이상을 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 상기 반감기가 증가된 인슐린 및 이를 포함하는 당뇨병 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 인터페론-α이다. 서열번호 22로 표시되는 인터페론-α의 아미노산 서열에서 N-말단에서부터 17, 54, 72, 93, 106, 135, 144, 154, 156, 157 및 187번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 인터페론-α 및 이를 포함하는 자가면역을 포함하는 면역 질환 및/또는 고형암 및 혈액암을 포함하는 암 및/또는 감염 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다 (Ann Rheum Dis., 42(6), 672-676, 1983; Memo., 9, 63-65, 2016).

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 과립구집락자극인자이다. 서열번호 31으로 표시되는 과립구집락 자극인자 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 11, 46, 53, 64 및 73번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 과립구집락자극인자 및 이를 포함하는 호중구감소증 예방 및/또는 치료용 약학조성물이 제공된다 (EMBO Mol Med. 2016, [Epub ahead of print]).

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 인터페론-β이다. 서열번호 36으로 표시되는 과립구집락 자극인자 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 4, 40, 54, 66, 73, 120, 126, 129, 136, 144, 155 및 157번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 인터페론-β 및 이를 포함하는 다발성 경화증, 자가면역질환, 바이러스 감염， HIV와 관련된 질병，C형 간염, 류마티스성 관절염 등의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한, 자가면역을 포함하는 면역 질환 및/또는 고형암 및 혈액암을 포함하는 암 및/또는 감염 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다 (Ann Rheum Dis., 42(6), 672-676, 1983; Memo., 9, 63-65, 2016).

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 에리트로포이에틴 (EPO)이다. 서열번호 43으로 표시되는 에리트로포이에틴 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 47, 72, 79, 124, 143, 167, 179 및 181번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 에리트로포이에틴 및 이를 포함하는 만성신부전에 의한 빈혈, 수술에 따른 빈혈, 암 또는 항암치료에 따른 빈혈 등, 빈혈 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 골형성단백질 (BMP2)이다. 서열번호 52으로 표시되는 골형성단백질 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 32, 64, 127, 178, 185, 236, 241, 272, 278, 281, 285, 287, 290, 293, 297, 355, 358, 379 및 383 번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 골형성단백질 및 이를 포함하는 빈혈 및 골질환 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다 (Cell J., 17(2), 193-200, 2015; Clin Orthop Relat Res., 318, 222-230, 1995).

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 섬유아세포성장인자-1 (FGF-1)이다. 서열번호 61로 표시되는 섬유아세포성장인자-1 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 15, 24, 25, 27, 72, 115, 116, 120, 127, 128, 133 및 143번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 섬유아세포성장인자-1 및 이를 포함하는 신경질환 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 식욕억제호르몬 (Leptin)이다. 서열번호 66로 표시되는 식욕억제호르몬 (Leptin) 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 26, 32, 36, 54, 56, 74 및 115번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 식욕억제호르몬 (Leptin) 및 이를 포함하는 뇌질환 및/또는 심장질환 및/또는 비만 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. (Ann N Y Acad Sci., 1243, 1529, 2011; J Neurochem., 128(1), 162-172, 2014; Clin Exp Pharmacol Physiol., 38(12), 905-913, 2011)

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 혈관내피세포성장인자 A (VEGFA)이다. 서열번호 75로 표시되는 VEGFA 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 22, 42, 74, 110, 127, 133, 134, 141, 142, 147, 149, 152, 154, 156, 157, 169, 180, 184, 191 및 206번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 VEGFA 및 이를 포함하는 항-노화, 모발 성장, 상처 치유 및 angiogenesis 관련된 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 식욕촉진호르몬 전구체이다. 서열번호 80으로 표시되는 식욕촉진호르몬 전구체 아미노산서열에서 N-말단으로부터 39, 42, 43, 47, 85, 100, 111 및 117번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 식욕촉진호르몬 전구체 및 이를 포함하는 비만, 영양 실조 및 거식증을 포함하는 식욕 조절 기능 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 식욕촉진호르몬 (Ghrelin)이다. 서열번호 83로 표시되는 식욕촉진호르몬 (Ghrelin) 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 39, 42, 43, 및 47번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 식욕촉진호르몬 (Ghrelin) 및 이를 포함하는 비만, 영양 실조 및 거식증을 포함하는 식욕 조절 기능 질환의 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 단백질은 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 이다. 서열번호 92로 표시되는 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 아미노산서열에서 N-말단으로부터 117 및 125번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 및 이를 포함하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 구체예에서, 단백질은 면역글로불린 (IgG)의 중쇄 (HC) 이다. 서열번호 97으로 표시되는 면역글로불린 (IgG)의 중쇄(HC) 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 49, 62, 84, 95, 143, 155, 169, 227, 232, 235, 236, 240, 244, 268, 270, 296, 310, 312, 339, 342, 344, 348, 356, 360, 362, 382, 392, 414, 431, 436 및 461 번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 면역글로불린 (IgG) 및 이를 포함하는 다양한 암종의 치료를 위한 IgG 기반의 항체 치료제의 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 구체예에서, 단백질은 면역글로불린 (IgG)의 경쇄 (LC) 이다. 서열번호 104로 표시되는 면역글로불린 (IgG) 경쇄 (LC)의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 61, 64, 67, 125, 129, 148, 167, 171, 191, 205, 210, 212 및 229번째 라이신 잔기 중 하나 이상이 아르기닌 잔기로 치환된다. 따라서, 반감기가 증가된 면역글로불린 (IgG) 및 이를 포함하는 다양한 암종의 치료를 위한 IgG 기반의 항체 치료제의 약학 조성물이 제공된다.

본 발명에서, 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 라이신 잔기를 아르기닌 (arginine, R) 잔기로 치환시키기 위하여 부위특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하였다. 이 방법은 특정 돌연변이를 유도할 DNA서열을 이용하여 프라이머를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작한다.

본 발명에서, 표적단백질을 면역침강분석법에 의해 세포주 내로 형질감염시키고 침강시켜 유비퀴틴화 정도를 확인하였으며, MG132 (프로테아좀 저해제) 시약을 처리한 결과, 유비퀴틴화 정도가 증가한 것을 통해 표적단백질이 유비퀴틴-프로테아좀에 의한 분해 경로를 거친다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 약학조성물은 경구 (oral), 경피 (transcutaneous), 피하 (subcutaneous), 정맥내 (intravenous) 또는 근육내 투여를 포함하는 다양한 경로로 체내 전달될 수 있으며, 주사형 제제로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 방법에 따라 투여된 후에 신속한 방출, 지연된 방출 또는 천천히 방출 되도록 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 상기 제형은 정제 (tablet), 알약 (pill), 분말 (powder), 사셰 (sachet), 엘렉시르제 (elixir), 현탁 (suspension), 에멀션 (emulsion), 용액 (solution), 시럽 (syrup), 에어로졸 (aerosol), 소프트 또는 단단한 젤라틴 캡슐 (soft and hard gelatin capsule), 멸균주사용액 (sterile injectable solution), 멸균 팩키지된 분말 등을 포함한다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토오스 (lactose), 덱스트로오스 (dextrose), 수크로오스 (sucrose), 만니톨 (mannitol), 자일리톨 (xylitol), 에리스리톨 (erythritol), 말티톨 (maltitol), 탄수화물 (starches), 검 아카시아 (gum acacia), 알지네이트 (alginates), 젤라틴 (gelatin), 인산칼슘 (calcium phosphate), 규산칼슘 (calcium silicate), 셀룰로오스 (cellulose), 메틸셀룰로오스 (methyl cellulose), 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 물, 메틸히드록시벤조에이트 (methylhydroxybenzoates), 프로필히드록시벤조에이트 (propylhydroxybenzoates), 활석 (talc), 스테아린산마그네슘 (magnesium stearate) 및 미네랄 오일을 포함한다. 또한, 제형은 충진제, 항교착제 (anti-agglutinating agents), 윤활제 (lubricating agents), 습윤제 (wetting agents), 향미료 (flavoring agents), 유화제 (emulsifiers), 보존제 (preservative) 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 단수형태는 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수형태를 포함한다. 또한, 본 발명에서 구성된, 갖는 이루어진 과 같은 용어는 “포함하는”과 유사한 의미를 갖는 것으로 해석된다. 본 발명에서, “생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질”은 인간을 포함하는 포유동물에 투여되었을 때 유용한 생물학적 활성을 나타내는 (폴리)펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 더 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것을 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시 예 1: β-트로핀 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호 전달 확인

1. 발현 벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현 벡터 클로닝

β-트로핀을 클로닝하기 위해 HepG2 세포 (ATCC, HB-8065)에서 Trizol과 클로로포름을 이용하여 정제된 RNA를 추출하였다. 다음 SuperScript™ First-Strand cDNA Synthesis System (Invitrogen, Grand Island, NY)을 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 템플릿 (template)으로 중합효소연쇄 반응을 통해 β-트로핀을 증폭하였다. β-트로핀 DNA 증폭 산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 BamHI과 EcoRI로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하고 (도 1, β-트로핀 아미노산 서열: SEQ No. 1) 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 2). 또한 도 1의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인 시 사용된 프라이머세트이며, 그 결과 또한 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 2). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같았다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 (denature) 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 (annealing) 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 (extention) 반응을 위한 72℃에서 1분을 25 사이클 반복하여 수행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 1의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블로팅 (Western blot)을 통해 그 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 β-트로핀 단백질이 잘 발현 된 것을 확인하였으며 액틴 (actin)으로 확인한 블롯 (blot)을 통해 정량이 로딩 (loading)된 것을 확인하였다 (도 3).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌 (Arginine, R)으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (β-트로핀 K62R FP 5'-AGGGACGGCTGACAAGGGCCAGGAA- 3' (SEQ No. 2), RP 5'-CCAGGCTGTTCCTGGCCCTTGTCAGC-3' (SEQ No. 3); β-트로핀 K124R FP 5'-GGCACAGAGGGTGCTACGGGACAGC-3' (SEQ No. 4), RP 5'-C GTAGCACCCTCTGTGCCTGGGCCA-3' (SEQ No. 5); β-트로핀 K153R FP 5'-GAATTTG AGGTCTTAAGGGCTCACGC-3' (SEQ No. 6), RP 5'-CTTGTCAGCGTGAGCCCTTAAGAC CTC-3' (SEQ No. 7); β-트로핀 K158R FP 5'-GCTCACGCTGACAGGCAGAGCCACAT-3' (SEQ No. 8), RP 5'-CCATAGGATGTGGCTCTGCCTGTCAGC-3' (SEQ No. 9)를 제작한 후, PCR을 수행하여 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-β-트로핀을 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 4개의 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 1).

Lysine(K) residue site	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 β-trophin 작제물
62	pcDNA3-myc-β-trophin (K62R)
124	pcDNA3-myc-β-trophin (K124R)
153	pcDNA3-myc-β-trophin (K153R)
158	pcDNA3-myc-β-trophin (K158R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-β-트로핀 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 (J Biol Chem., 279(4), 2368-2376, 2004; Cell Research, 22, 873885, 2012; Oncogene, 22, 12731280, 2003; Cell, 78, 787-798, 1994)을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포 (ATCC, CRL-3216)를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-β-트로핀 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 (co-transfection)시키고 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역 침강 분석을 실시하였다 (도 4). 또한 각각 pcDNA3-myc-β-트로핀 WT, pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K62R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K153R) 및 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K158R)를 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 형질감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-β-트로핀 WT, pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K62R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K153R) 및 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K158R)를 각 2㎍을 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍과 함게 세포에 공동형질감염 (co-transfection)시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 5).

면역침강을 위해 얻은 단백질 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체 (Santa Cruz Biotechnology, sc-40)와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 다음, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 가열한 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인 (Millipore)으로 옮긴 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1,000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-β-트로핀 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 (smear) 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 4, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 억제제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우, 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 4, 레인 4). 이러한 결과는 β-트로핀이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화 되는 것을 제시한다. 또한 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K62R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K153R), 및 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K158R)의 경우, WT보다 밴드가 연하게 나타났다. 이는 이들 치환체에 유비퀴틴이 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출된 것을 나타낸다 (도 5, 레인 3, 5 및 6).

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 β-트로핀의 반감기 확인

pcDNA3-myc-β-트로핀 WT, pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K62R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K153R), 및 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K158R)을 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 (transfection)시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (cycloheximide) (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 20분, 40분 및 60분에 걸쳐서 반감기를 측정하였다. 그 결과, 인간 β-트로핀의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 6). 인간 β-트로핀의 반감기는 1시간 이내인 반면 인간 β-트로핀 치환(변이)체 (K62R)과 β-트로핀 치환체 (K158R)의 반감기는 1시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 6).

4. 세포 내에서의 β-트로핀과 β-트로핀 치환체들에 의한 신호전달 확인

β-트로핀이 마우스 간에서 일시적으로 발현이 되면 췌장-베타 세포의 증식이 촉진된다는 것이 보고되었다 (Cell, 153, 747-758, 2013). 본 실시예는, 세포 내에서 β-트로핀과 β-트로핀 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저 PANC-1 세포 (ATCC, CRL-1469)를 PBS로 7차례 씻어낸 후, pcDNA3-myc-β-트로핀 WT, pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K62R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K153R) 및 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K158R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여, PANC-1 세포를 형질감염시켰다. 감염 2일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 수행하였다. 이를 위해, 각각 pcDNA3-myc-β-트로핀 WT, pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K62R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K153R) 및 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K158R)으로 감염된 PANC-1 세포에서 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 옮긴 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K62R), pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K124R) 및 pcDNA3-myc-β-트로핀 치환체 (K153R)은 PANC-1 세포 내에서 pcDNA3-myc-β-트로핀 WT과 동일하거나 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 7).

실시 예 2: 성장호르몬 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현 벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현 벡터 클로닝

중합효소연쇄 반응을 통해 증폭된 성장호르몬 (GH)과 pCS4-flag (4.3 kb, Oncotarget., 7(12), 14441-14457, 2016)를 제한효소인 EcoRI로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였으며 (도 8, GH 아미노산 서열: SEQ No.10), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 9). 또한 도 8의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인 시 사용된 프라이머세트이며, 그 결과 또한 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 9). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 60℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 30초를 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 8의 맵에 표시된 pCS4-flag 벡터에 존재하는 flag을 항-flag (Sigma-aldrich, F3165) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행하였다. 그 결과 flag에 결합된 성장호르몬 단백질이 잘 발현되는 것이 확인되었고, 액틴으로 확인한 블롯팅은 정량 로딩된 것을 나타냈다 (도 10).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (GH K67R FP 5'-CCAAAGGAACAGAGGTATTCATTC-3' (SEQ No. 11), RP 5'-CAGGAATGAATACCTCTGTTCCTT-3' (SEQ No. 12); GH K141R FP 5'-GA CCTCCTAAGGGACCTAGAG-3' (SEQ No. 13), RP 5'-CTCTAGGTCCCTTAGGAGGTC-3' (SEQ No. 14); GH K166R FP 5'-CAGATCTTCAGGCAGACCTAC-3' (SEQ No. 15), RP 5'- GTAGGTCTGCCTGAAGATCTG-3' (SEQ No. 16)를 제작한 후, 특정 조건에서 PCR을 수행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-성장호르몬을 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 2).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 GH 작제물
67	pCS4-flag-GH (K67R)
141	pCS4-flag-GH (K141R)
166	pCS4-flag-GH (K166R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pCS4-flag-성장호르몬 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pCS4-flag-성장호르몬 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 (co-transfection) 시켰다. 형질감염 24시간 후, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 다음, 면역침강분석을 수행하였다 (도 11). 또한 pCS4-flag-성장호르몬 WT, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K166R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA를 각각 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 되는 정도를 확인하기 위하여 pCS4-flag-성장호르몬 WT, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R) 및 pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K166R) 각 2 ㎍와 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 12).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-flag (Sigma-aldrich, F3165) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 가열한 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 옮긴 다음, 항-flag (Sigma-aldrich, F3165), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-flag (Sigma-aldrich, F3165)으로 면역침강을 실시한 경우, pCS4-flag-성장호르몬 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 11, 레인 2과 3). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 11, 레인 3). 또한 pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K166R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R), 및pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K166R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 12, 레인 3-5). 이러한 결과는 성장호르몬이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 성장호르몬의 반감기 확인

pCS4-flag-성장호르몬 WT, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K166R)를 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 (transfection) 시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질생성 저해제 cycloheximide(CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 1시간, 2시간, 4시간, 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정하였다. 그 결과, 인간 성장호르몬의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 13). 인간 성장호르몬의 반감기는 2시간 이내인 반면 인간 pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R)의 반감기는 8시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 13).

4. 세포 내에서의 성장호르몬과 성장호르몬 치환체들에 의한 신호전달 확인

성장호르몬은 STAT (signal transducers and activators of transcription) 단백질의 유전자 수준에서의 전사를 조절한다는 것이 보고되었다 (Oncogene, 19, 2585-2597, 2000). 이에 본 실시예에서는, 세포 내에서 성장호르몬과 성장호르몬 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. pCS4-flag-성장호르몬 WT, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R) 및 pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K166R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 HEK293 세포를 감염시켰다. 감염 1일 경과한 후, 세포에서 소니케이터 (sonicator)를 이용하여 용해시킨 후, 수득한 단백질을 PBS로 7차례 세척한 PANC-1 세포에 처리하여 감염시키고, 2일 경과 후 PANC-1 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하였다. 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 각각의 pCS4-flag-성장호르몬 WT, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R), pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R) 및 pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K166R)으로 감염된 PANC-1 세포에서 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, Cell Signaling Technology, 9131S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K141R)는 PANC-1 세포 내에서 pCS4-flag-성장호르몬 WT과 동일하거나 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였고, pCS4-flag-성장호르몬 치환체 (K67R)는 대조군보다 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 14).

실시 예 3: 인슐린 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호 전달 확인

1. 발현 벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 인슐린 DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 BamHI과 EcoRI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였다 (도 15, 인슐린 아미노산 서열: SEQ No. 17). 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 16). 또한 도 15의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 16). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링반응을 위한 60℃에서 30초, 연장반응을 위한 72℃에서 30초를 25 주기로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응하였다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 15의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. myc에 결합된 인슐린 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였고, 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것을 나타냈다 (도 17).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (insulin K53R FP 5'-GGCTTCTTCTACACACCCAGGACCC-3' (SEQ No. 18), RP 5'-CTCCCGGCGGGTCCTGGGTGTGTA-3' (SEQ No. 19); insulin K88R FP 5'-TCCCTGCAGAGGCGTGGCATTGT-3' (SEQ No. 20), RP 5'-TTGTTCCACAATGCCA CGCCTCTGCAG-3' (SEQ No. 21)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-인슐린을 템플릿으로 사용하고, 2개의 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 3).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 insulin 작제물
53	pcDNA3-myc-insulin (K53R)
88	pcDNA3-myc-insulin (K88R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-인슐린 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-인슐린 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 (co-transfection) 시켰다. 형질감염 24시간 후, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강분석을 수행하였다 (도 18). 또한 각각 pcDNA3-myc-인슐린 WT, pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R), pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K88R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA를 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위해, pcDNA3-myc-인슐린 WT, pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R) 및 pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K88R)각 2 ㎍와 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍로 세포를 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 19).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 가열한 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 멤브레인으로 옮긴 다음, 항-myc (9E10, sc-40), 항-HA (sc-7392) 및 항-β-actin (sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806)를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-인슐린 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 18, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 18, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 19, 레인 3). 이상의 결과는 인슐린이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 인슐린의 반감기 확인

pcDNA3-myc-인슐린 WT, pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R) 및 pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K88R)를 각각 2 ㎍씩 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 2시간, 4시간, 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정해본 결과, 인간 인슐린의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 20). 결과적으로, 인간 인슐린의 반감기는 30분 이내인 반면, 인간 pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R)의 반감기는 1시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과를 그래프로 나타내었다 (도 20).

4. 세포 내에서의 인슐린과 인슐린 치환체들에 의한 신호전달 확인

인슐린은 간에서 STAT3의 인산화를 자극하여 결과적으로 간에서의 glucose 항상성을 조절한다는 것이 보고되었다 (Cell Metab., 3, 267275, 2006). 본 실시예에서는, 세포 내에서 인슐린과 인슐린 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저, pcDNA3-myc-인슐린 WT, pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R), 및 pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K88R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 PBS로 7차례씩 씻어낸 PANC-1과 HepG2 (ATCC, AB-8065)를 감염시켰다. 2일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량 한 다음, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 각각 pcDNA3-myc-인슐린 WT, pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R) 및 pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K88R)로 감염시킨 PANC-1과 HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포에서 분리한 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, Cell Signaling 9131S) 및 항-β-액틴 (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-인슐린 치환체 (K53R)은 PANC-1과 HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포 내에서 pcDNA3-myc-인슐린 WT과 비슷하거나 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 21).

실시예 4: 인터페론-α 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 인터페론-α DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 EcoRI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였으며 (도 22, 인터페론-α 아미노산 서열: SEQ No. 22), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 23). 또한 도 22의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝 된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 23). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 1분을 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 22의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였으며, 이를 통해 myc에 결합된 인터페론-α 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였고 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것을 확인히였다 (도 24).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (IFN-α K93R FP 5'-CTTCAGCACAAGGGACTCATC-3' (SEQ No. 23), RP 5'-CAGATGAGTCCCTTGTGCTGA-3' (SEQ No. 24); IFN-α K106R FP 5'-CTCCTAGAC AGATTCTACACT-3' (SEQ No. 25), RP 5'-AGTGTAGAATCTGTCTAGGAG-3' (SEQ No. 26); IFN-α K144R FP 5'-GCTGTGAGGAGATACTTCCAA-3' (SEQ No. 27), RP 5'-TT GGAAGTATCTCCTCACAGC-3' (SEQ No. 28); IFN-α K154R FP 5'-CTCTATCTGAGAGAG AAGAAA-3' (SEQ No. 29), RP 5'-TTTCTTCTCTCTCAGATAGAG-3' (SEQ No. 30)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-인터페론-α를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 4개의 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 4).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R )로 치환된 IFN-α 작제물
93	pcDNA3-myc-IFN-α (K93R)
106	pcDNA3-myc-IFN-α (K106R)
144	pcDNA3-myc-IFN-α (K144R)
154	pcDNA3-myc-IFN-α (K154R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-인터페론-α WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-인터페론-α WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 다음, 면역침강 분석을 실시하였다 (도 25). 또한 각각 pcDNA3-myc-인터페론-α WT, pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R), 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-인터페론-α WT, pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R) 및 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R) 각각 2 ㎍와 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 26).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-인터페론-α WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 25, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 25, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R) 및 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R) 및 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 26, 레인 3 및 6). 이상의 결과는 인터페론-α이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화 되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 인터페론-α의 반감기 확인

pcDNA3-myc-인터페론-α WT, pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R) 및 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R)를 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질 생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 1일, 2일에 걸쳐서 반감기를 측정해본 결과, 인간 인터페론-α의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 27). 인간 인터페론-α의 반감기는 1일 이내인 반면, 인간 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R) 및 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R)의 반감기는 2일 이상으로 WT보다 길어졌으며, 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 27).

4. 세포 내에서의 인터페론-α와 인터페론-α 치환체들에 의한 신호전달 확인

인터페론-α는 STAT-1, -2와 -3를 증가시킨다는 것이 보고되었고 (J Immunol., 187, 2578-2585, 2011), melanoma 세포에서는 인터페론-α에 의해 성장을 촉진하는 STAT3 단백질을 활성화한다는 것이 보고되었다 (Eur J Cancer, 45, 1315-1323, 2009). 본 실시예에서는 세포 내에서 인터페론-α와 인터페론-α 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. THP-1 세포 (ATCC, TIB-202)를 PBS로 7차례 씻어낸 후, pcDNA3-myc-인터페론-α WT, pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R), 및 pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 THP-1 세포 를 감염시킨 다음 1일과 2일 경과 후 순차적으로 세포에서 단백질을 추출하여 각 정량 후, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 Western blot을 실시하였다. 이 과정에서 pcDNA3-myc-인터페론-α WT, pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R)으로 감염된 THP-1 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K93R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K106R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K144R), pcDNA3-myc-인터페론-α 치환체 (K154R)은 THP-1 세포 (ATCC, TIB-202) 내에서 pcDNA3-myc-인터페론-α WT과 동일하거나 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 28).

실시 예 5: 과립구집락 자극인자 (G- CSF ) 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 과립구집락 자극인자 (G-CSF) DNA 증폭 산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 EcoRI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였으며 (도 29, G-CSF 아미노산 서열: SEQ No.31), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기 영동을 통해 확인하였다 (도 30). 또한 도 29의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머센트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 30). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장반응을 위한 72℃에서 1분을 25 주기로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 29의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. myc에 결합된 과립구집락 자극인자(G-CSF) 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량이 로딩된 것으로 나타났다 (도 31).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (G-CSF K46R FP 5'-AGCTTCCTGCTCAGGTGCTTAGAG-3' (SEQ No. 32), RP 5'-TTGCTCTAAGCACCTGAGCAGGAA-3' (SEQ No. 33), G-CSF K73R FP 5'- TGTGCCACCTACAGGCTGTGCCAC-3' (SEQ No. 34), RP 5'-GGGGTGGCACAGCCTGTA GGTGGC-3' (SEQ No. 35)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자(G-CSF)를 템플릿으로 사용하고, Lysine 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 2개의 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 5).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 G-CSF 작제물
46	pcDNA3-myc-G-CSF (K46R)
73	pcDNA3-myc-G-CSF (K73R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 감염 24시간 경과 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강분석을 실시하였다 (도 32). 또한 각각 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체 (K46R), pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) (K73R)과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자(G-CSF) WT, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자(G-CSF) 치환체 (K46R), pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) (K73R)를 각각 2 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 수행하였다 (도 33).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 가열 한 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 32, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 32, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자(G-CSF) (K73R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) (K73R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 33, 레인 4). 이상의 결과는 과립구집락 자극인자(G-CSF)이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성 저해제 cycloheximide (CHX)에 의한 과립구집락 자극인자 (G-CSF)의 반감기 확인

pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체 (K46R), pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) (K73R)를 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 (transfection)시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질 생성 저해제 cycloheximide (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 4시간, 8시간 및 16시간에 걸쳐서 반감기를 측정하였다. 그 결과, 인간 과립구집락 자극인자 (G-CSF)의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 34). 인간 과립구집락 자극인자 (G-CSF)의 반감기는 4시간인데 반면 인간 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) (K73R)의 반감기는 16시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 34).

4. 세포 내에서의 과립구집락 자극인자 (G- CSF )와 과립구집락 자극인자 (G- CSF ) 치환체들에 의한 신호전달 확인

과립구집락 자극인자 (G-CSF)는 신경교종 (glioma) 세포에서 STAT3를 활성화시키고 이를 통해서 신경교종 증식에 관여한다는 것이 보고되었으며 (Cancer Biol Ther., 13(6), 389-400, 2012), 난소 상피 암세포에서 발현된다는 것과 JAK2/STAT3 경로를 조절함에 따라 여성 자궁암의 병리학적 관련성이 있다는 것이 보고되었다 (Br J Cancer, 110, 133-145, 2014). 본 실시예에서는, 세포 내에서 과립구집락 자극인자 (G-CSF)와 과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저 THP-1 세포 (ATCC, TIB-202)를 PBS로 7차례 씻어낸 후, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체 (K46R) 및 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체 (K73R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 THP-1 세포 (ATCC, TIB-202) 를 감염시켰다. 감염 1일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자(G-CSF) 치환체 (K46R), pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체 (K73R)으로 감염된 THP-1 세포 (ATCC, TIB-202)에서 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1,000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체 (K46R), pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) 치환체 (K73R)은 THP-1 세포 (ATCC, TIB-202) 내에서 pcDNA3-myc-과립구집락 자극인자 (G-CSF) WT과 동일하거나 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 35).

실시 예 6: 인터페론-β 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 인터페론-β DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 EcoRI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였으며 (도 36, 인터페론-β 아미노산 서열: SEQ No. 36), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 37). 또한 도 36의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 37). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 50초를 25 사이클 반복하여 진행하였고, 이후 72℃도에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 36의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였으며, 이를 통해 myc에 결합된 인터페론-β 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량이 로딩된 것으로 나타났다 (도 38). 또한 인터페론-β의 경우 세포 내에서 글라이코실레이션 (glycosylation)에 의해 두 종류의 발현 밴드가 나타났으며 이 과정을 차단하는 PNGase F (New England Biolabs Inc., P0704S) 500 unit을 37℃에서 한 시간 동안 처리한 후, 한 종류의 발현 밴드만 보이는 것을 확인하였다 (도 38).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌 (Arginine, R)으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (IFN-β K40R FP 5'-CAGTGTCAGAGGCTCCTGTGG-3' (SEQ No. 37), RP 5'- CCACAGGAGCCTCTGACACTG-3' (SEQ No. 38); IFN-β K126R FP 5'-CT GGAAGAAAGACTGGAGAAA-3' (SEQ No. 39), RP 5'-TTTCTCCAGTCTTTCTTCCAG-3' (SEQ No. 40); IFN-β K155R FP 5'-CATTACCTGAGGGCCAAGGAG-3' (SEQ No. 41), RP 5'-CTCCTTGGCCCTCAGGTAATG-3' (SEQ No. 42)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-인터페론-β를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 6).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 IFN-β 작제물
40	pcDNA3-myc-IFN-β (K40R)
126	pcDNA3-myc-IFN-β (K126R)
155	pcDNA3-myc-IFN-β (K155R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-인터페론-β WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-인터페론-β WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역 침강 분석을 실시하였다 (도 39). 또한 pcDNA3-myc-인터페론-β WT, pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA를 각각 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-인터페론-β WT, pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)를 각각 2 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 40).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후, 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-인터페론-β WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 39, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 39, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 40, 레인 3 및 5). 이상의 결과는 인터페론-β이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 인터페론-β의 반감기 확인

pcDNA3-myc-인터페론-β WT, pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)를 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질 생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 4시간, 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정하였다. 그 결과, 인간 인터페론-β의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 41). 인간 인터페론-β의 반감기는 4시간인 반면 인간 pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R) 및 pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)의 반감기는 8시간으로 WT보다 길어졌으며, 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 41).

4. 세포내에서의 인터페론-β와 인터페론-β 치환체들에 의한 신호전달 확인

세포 내에 인터페론을 처리하게 되면 AKT를 포함하는 신호전달 과정들의 활성이 유도된다는 것이 보고되었다 (Pharmaceuticals (Basel), 3, 994-1015, 2010). 본 실시예에서는, 세포 내에서 인터페론-β와 인터페론-β 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. pcDNA3-myc-인터페론-β WT, pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 HEK293 세포를 감염시켰다. 감염 1일 경과한 후, 세포에서 소니케이터를 이용하여 용해시킨 후, 수득한 단백질을 PBS로 7차례 씻어낸 HepG2 세포 (ATCC, AB-8065)에 처리하여 감염시키고, 2일이 지난 후 HepG2 세포 에서 단백질을 추출하여 각각 정량 하였다. 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 Western blot을 실시하였다. 이 과정에서 각각 pcDNA3-myc-인터페론-β WT, pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R) 및 pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S), 항-AKT (H-136, Santa Cruz Biotechnology, sc-8312), 항-phospho-AKT (S473, cell signaling 9271S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K40R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K126R), pcDNA3-myc-인터페론-β 치환체 (K155R)은 HepG2 세포 내에서 pcDNA3-myc-인터페론-β WT과 동일하거나 증가된 phospho-AKT 신호전달을 보였다 (도 42).

실시 예 7: 에리트로포이에틴 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 에리트로포이에틴 DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc 발현 벡터 (5.6kb)를 제한효소인 EcoRI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝 하였으며 (도 43, 에리트로포이에틴 아미노산 서열: SEQ No. 43), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 44). 또한 도 43의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 44). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃도에서 1분을 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 43의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행하였다. 그 결과 myc에 결합된 에리트로포이에틴 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량이 로딩된 것으로 나타났다 (도 45).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (EPO K124R FP 5'-GCATGTGGATAGAGCCGTCAGTGC-3' (SEQ No. 44), RP 5'-GCACTGACGGCTCTATCCACATGC-3' (SEQ No. 45); EPO K167R FP 5'-T GACACTTTCCGCAGACTCTTCCGAGTCTAC-3' (SEQ No. 46), RP 5'-GTAGACTCGGAAG AGTCTGCGGAAAGTGTCA-3' (SEQ No. 47); EPO K179R FP 5'-CTCCGGGGAAGGCTG AAGCTG-3' (SEQ No. 48), RP 5'-CAGCTTCAGCCTTCCCCGGAG-3' (SEQ No. 49); EPO K181R FP 5'-GGAAAGCTGAGGCTGTACACAGG-3' (SEQ No. 50), RP 5'-CCTGTGTACAG CCTCAGCTTTCC-3' (SEQ No. 51)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-에리트로포이에틴을 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 7).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 EPO 작제물
124	pcDNA3-myc-EPO (K124R)
167	pcDNA3-myc-EPO (K167R)
179	pcDNA3-myc-EPO (K179R)
181	pcDNA3-myc-EPO (K181R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 되는 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 (co-transfection)시키고 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강분석을 실시하였다 (도 46). 또한 각각 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K167R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K179R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K181R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K167R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K179R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K181R) 각각 2 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강 분석을 실시하였다 (도 47).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해 완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질 샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 46, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 46, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K181R)은 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 47, 레인 6). 이상의 결과는 에리트로포이에틴이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 에리트로포이에틴의 반감기확인

pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K167R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K179R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K181R)를 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시켰다. 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드(CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 2시간, 4시간, 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 에리트로포이에틴의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 48). 결과적으로 인간 에리트로포이에틴의 반감기는 4시간 이내인 반면 인간 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K124R)의 반감기는 8시간으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 48).

4. 세포 내에서의 에리트로포이에틴과 에리트로포이에틴 치환체들에 의한 신호전달 확인

에리트로포이에틴은 폐암이나 혈액암에서 증가되며 에리트로포이에틴을 투여하게 될 경우 Erk1/2의 인산화에 의해 세포 주기 진행을 조절하여 저산소증에서 효과가 증가된다는 것이 보고되었다 (J Hematol Oncol., 6, 65, 2013). 본 실시예에서는, 세포 내에서 에리트로포이에틴과 에리트로포이에틴 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저, HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 굶긴 후, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K167R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K179R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K181R)을 각각 3 ㎍씩 이용하여 HepG2세포를 감염시켰다. 감염 2일이 지난 후 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 각각 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K167R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K179R), 및 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K181R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-Erk1/2 (9B3, Abfrontier LF-MA0134), 항-phospho-Erk1/2 (Thr202/Tyr204, Abfrontier LF-PA0090) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K124R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K167R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K179R), pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 치환체 (K181R)은 HepG2 세포 내에서 pcDNA3-myc-에리트로포이에틴 WT과 동일하거나 증가된 phospho-Erk1/2 신호전달을 보였다 (도 49).

실시 예 8: 골형성단백질 ( BMP2 )의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호 전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 골형성단백질 (BMP2) DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 EcoRI과 XhoI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝하였으며 (도 50, BMP2 아미노산 서열: SEQ No.52), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 51). 또한, 도 50의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 51). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 1분 30초를 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 50의 맵에 표시된 pcDNA3-myc vector에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 골형성 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로팅된 것으로 나타났다 (도 52).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (BMP2 K293R FP 5'-GAAACGCCTTAGGTCCAGCTGTAAGAGAC-3' (SEQ No. 53), RP 5'-GTCTCTTACAGCTGGACCTAAGGCGTTTC-3' (SEQ No. 54); BMP2 K297R FP 5'-TTAAGTCCAGCTGTAGGAGACACCCTTTGT-3' (SEQ No. 55), RP 5'-ACAAAGGGTGTCTCCTACAGCTGGACTTAA-3' (SEQ No. 56); BMP2 K355R FP 5'-GTTAACTCTAGGATTCCTAAGGC-3' (SEQ No. 57), RP 5'-GC CTTAGGAATCCTAGAGTTAAC-3' (SEQ No. 58); BMP2 K383R FP 5'- GGTTGTATTAAGGAACTATCAGGAC-3' (SEQ No. 59), RP 5'-GTCCTGATAGTTCCTTAAT ACAACC-3' (SEQ No. 60)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-골형성단백질(BMP2)을 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 8).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 BMP2 작제물
293	pcDNA3-myc-BMP2 (K293R)
297	pcDNA3-myc-BMP2 (K297R)
355	pcDNA3-myc-BMP2 (K355R)
383	pcDNA3-myc-BMP2 (K383R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-골형성단백질 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-골형성단백질 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강 분석을 실시하였다 (도 53). 또한 각각의 pcDNA3-myc-골형성단백질 WT, pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K383R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 를 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-골형성단백질 WT, pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K383R) 각각 2 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역 침강 분석을 실시하였다 (도 54). 면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역 침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 가열 한 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-골형성단백질 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 53, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 53, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 54, 레인 3 및 5). 이상의 결과는 골형성단백질이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 골형성단백질의 반감기 확인

pcDNA3-myc-골형성단백질 WT, pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K383R)를 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질 감염 (transfection) 시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 2시간, 4시간 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정하였다. 그 결과, 인간 골형성단백질의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 55). 인간 골형성단백질의 반감기는 2시간 이내인 반면 인간 pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R)의 반감기는 4시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 55).

4. 세포 내에서의 골형성단백질과 골형성단백질 치환체들에 의한 신호전달 확인

골형성단백질은 다양한 골수종 세포에서 STAT3의 비활성을 초래하여 세포사멸을 초래한다는 것이 보고되었다 (Blood, 96, 2005-2011, 2000). 본 실시예에서는, 세포 내에서 골형성단백질과 골형성단백질 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저, HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 굶긴 후, pcDNA3-myc-골형성단백질 WT, pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K383R)을 각각 3 ㎍씩 이용하여 HepG2 세포를 감염시켰다. 감염 2일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 수행하였다. 이 과정에서 각각 pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R) 및 pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K383R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗과 항-마우스 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K293R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K297R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K355R), pcDNA3-myc-골형성단백질 치환체 (K383R)은 HepG2 세포 내에서 pcDNA3-myc-골형성단백질 WT과 동일하게 대조군에 비해 감소된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 56).

실시 예 9: 섬유아세포성장인자-1( FGF -1) 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 섬유아세포성장인자-1 DNA 증폭 산물과 pCMV3-C-myc (6.1kb)를 제한효소인 KpnI과 XbaI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝 하였으며 (도 57, 섬유아세포성장인자-1 아미노산 서열: SEQ No.61), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 58). 또한 도 57의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 58). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 30초를 25 주기로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 57의 맵에 표시된 pCMV3-C-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. myc에 결합된 섬유아세포성장인자-1 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯팅을 통해 정량이 로딩된 것으로 나타났다 (도 59).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (FGF-1 K27R FP 5'-AAGAAGCCCAGACTCCTCTAC-3' (SEQ No. 62), RP 5'-GTAGAGGAGTCTGGGCTTCT T-3' (SEQ No. 63); FGF-1 K120R FP 5'-CAT GCAGAGAGGAATTGGTTT-3' (SEQ No. 64), RP 5'-AAACCAATTCCTCTCTGCATG-3' (SEQ No. 65)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pCMV3-C-myc-FGF-1 DNA를 템플릿으로 사용하고, Lysine 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 9).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 FGF-1 작제물
27	pCMV3-C-myc-FGF-1 (K27R)
120	pCMV3-C-myc-FGF-1 (K120R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강 분석을 실시하였다 (도 60). 또한 각각 pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R), pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 (K120R) 각각 2 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 61).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 60, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 60, 레인 4). 또한 pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 61, 레인 3, 4). 이상의 결과는 섬유아세포성장인자-1이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 섬유아세포성장인자-1의 반감기 확인

pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R)를 각각 2㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시키고 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 24시간 및 36시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 섬유아세포성장인자-1의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 62). 인간 섬유아세포성장인자-1의 반감기는 1일 이내인 반면 인간 pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R)의 반감기는 1일 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 62).

4. 세포 내에서의 섬유아세포성장인자-1과 섬유아세포성장인자-1 치환체들에 의한 신호전달 확인

재조합 섬유아세포성장인자-1을 HEK293 세포에 처리하게 되면 Erk 1/2 인산화가 증가한다는 것이 보고되었다 (Nature, 513(7518), 436-439, 2014). 본 실시예에서는, 세포 내에서 섬유아세포성장인자-1과 섬유아세포성장인자-1 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저, HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 ?E긴 한 후, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 HepG2 세포를 감염시켜 2일이 지난 후 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨[스턴블롯팅을 수행하였다. 이 과정에서 pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-Erk1/2 (9B3, Abfrontier LF-MA0134), 항-phospho-Erk1/2 (Thr202/Tyr204, Abfrontier LF-PA0090) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K27R), pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 치환체 (K120R)은 HepG2 세포 내에서 pCMV3-C-myc-섬유아세포성장인자-1 WT과 동일하거나 증가된 phospho-ERK1/2 신호전달을 보였다 (도 63).

실시 예 10: 식욕억제호르몬 ( Leptin ) 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 식욕억제호르몬 (Leptin) DNA 증폭산물과 pCMV3-C-myc (6.1kb)를 제한효소인 KpnI과 XbaI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝 하였으며 (도 64, 렙틴 아미노산 서열: SEQ No. 66), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 65). 또한 도 64의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 65). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 45초를 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 64의 맵에 표시된 pCMV3-C-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. myc에 결합된 식욕억제호르몬 (Leptin) 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것으로 나타났다 (도 66).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (Leptin K26R FP 5'-CCCATCCAAAAGGTCCAAGAT-3' (SEQ No. 67), RP 5'- ATCTTGGACCTTTTGGATGGG-3' (SEQ No. 68); Leptin K32R FP 5'-GA TGACACCAAGACCCTCATC-3' (SEQ No. 69), RP 5'-GATGAGGGTCTTGGTGTCATC-3' (SEQ No. 70); Leptin K36R FP 5'-ACCCTCATCAGGACAATTGTC-3' (SEQ No. 71), RP 5'-GACAATTGTCCTGATGAGGGT-3' (SEQ No. 72); Leptin K74R FP 5'-ACCTTATCCAG GATGGACCAG-3' (SEQ No. 73), RP 5'-CTGGTCCATCCTGGATAAGGT-3' (SEQ No. 74)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pCMV3-C-myc-식욕억제호르몬(Leptin) DNA를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 10).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 Leptin 작제물
26	pCMV3-C-myc-Leptin (K26R)
32	pCMV3-C-myc-Leptin (K32R)
36	pCMV3-C-myc-Leptin (K36R)
74	pCMV3-C-myc-Leptin (K74R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 되는 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT 6 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 다음, 면역침강분석을 실시하였다 (도 67). 또한 각각 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K32R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R)과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 되는 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K32R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R) 각각 6 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 68).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 67, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 67, 레인 4). 또한 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 68, 레인 3, 5 및 6). 이상의 결과는 식욕억제단백질이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 식욕억제단백질 (Leptin)의 반감기 확인

pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K32R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R)를 각각 6 ㎍씩 HEK 293T세포에 형질감염 시키고 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리한 다음, 2시간, 4시간 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 식욕억제단백질의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 69). 결과적으로 인간 식욕억제단백질의 반감기는 4시간인데 반면 인간 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R)의 반감기는 8시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 69).

4. 세포 내에서의 식욕억제단백질와 식욕억제단백질 치환체들에 의한 신호전달 확인

식욕억제단백질은 유방암 세포에서 AKT의 인산화를 증가시킨다는 것이 보고되었으며 (Cancer Biol Ther., 16(8), 1220-1230, 2015), 자궁암에서는 PI3K/AKT 신호전달 과정에 의해 암 세포 성장을 자극시킨다는 것이 보고되었다 (Int J Oncol., 49(2), 847, 2016). 본 실시예에서는, 세포 내에서 식욕억제단백질과 식욕억제단백질 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저, HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 굶긴 후, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K32R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R)를 각각 6 ㎍씩 이용하여 HepG2 세포를 감염시켰다. 감염 2일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 Western blot을 실시하였다. 이 과정에서 각각 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K32R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R) 및 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, sc-40), 항-AKT (H-136, Santa Cruz Biotechnology, sc-8312), 항-phospho-AKT (S473, Cell Signaling 9271S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗과 항-마우스 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K26R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K32R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K36R), pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 치환체 (K74R)은 HepG2 세포내에서 pCMV3-C-myc-식욕억제단백질 WT과 동일하게 대조군에 비해서 현저하게 증가된 phospho-AKT 신호전달을 보였다 (도 70).

실시 예 11: 혈관내피생성인자 A ( VEGFA ) 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현 벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 혈관내피생성인자 A DNA 증폭산물과 pCMV3-C-myc (6.1 kb)를 제한효소인 KpnI과 XbaI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝 하였으며 (도 71, 혈관내피생성인자 A 아미노산 서열: SEQ No. 75), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 72). 또한 도 71의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 72). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 1분을 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 71의 맵에 표시된 pCMV3-C-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 VEGFA 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것으로 나타났다 (도 73).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (VEGFA K127R FP 5'-TACAGCACAACAGATGTGAATGCAGACC-3' (SEQ No. 76), RP 5'-GGTCTGCATTCA CATCTGTTGTGCTGTA-3' (SEQ No. 77); VEGFA K180R FP 5'-ATCCGCAGACGTGTAG ATGTTCCTGCA-3' (SEQ No. 78), RP 5'-TG CAGGAACATCTACACGTCTGCGGAT-3' (SEQ No. 79)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pCMV3-C-myc-VEGFA DNA를 템플릿으로 사용하고, Lysine 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 11).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 VEGFA 작제물
127	pCMV3-C-myc-VEGFA (K127R)
180	pCMV3-C-myc-VEGFA (K180R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pCMV3-C-myc-VEGFA WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-VEGFA WT 6 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강 분석을 실시하였다 (도 74). 또한 각각 pCMV3-C-myc-VEGFA WT, pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R), pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-VEGFA WT, pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R) 및 pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R) 각각 6 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 75).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 가열 한 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pCMV3-C-myc-VEGFA WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 74, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 74, 레인 4). 또한 pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R), pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R), pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 75, 레인 3, 4). 이상의 결과는 VEGFA이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 VEGFA의 반감기 확인

pCMV3-C-myc-VEGFA WT, pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R), pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)를 각각 6 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 (transfection)시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 2시간, 4시간, 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 VEGFA의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 76). 인간 VEGFA의 반감기는 2시간 이내인 반면, 인간 pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R), pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)의 반감기는 4시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 76).

4. 세포 내에서의 VEGFA와 VEGFA 치환체들에 의한 신호전달 확인

VEGFA는 내피세포의 성장, 증식과 관련해서 중요한 인자로써 암세포에서 신생 혈관 생성에 작용을 하게 되는데 이 때 PI3K/Akt/HIF-1α 신호전달 과정이 관여한다는 것이 보고되었다 (Carcinogenesis, 34, 426-435, 2013). 또한 VEGF는 AKT 인산화를 유도한다는 것이 보고되었다 (Kidney Int., 68, 1648-1659, 2005). 본 실시예에서는, 세포 내에서 VEGFA와 VEGFA 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저, HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 굶긴 후, pCMV3-C-myc-VEGFA WT, pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R) 및 pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)를 각각 6 ㎍씩 이용하여 HepG2 세포를 감염시켰다. 감염 2일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 수행하였다. 이 과정에서 각각 pCMV3-C-myc-VEGFA WT, pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R), 및 pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S), 항-AKT (H-136, Santa Cruz Biotechnology, sc-8312), 항-phospho-AKT (S473, cell signaling 9271S) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K127R) 및 pCMV3-C-myc-VEGFA 치환체 (K180R)은 HepG2 세포 내에서 pCMV3-C-myc-VEGFA WT과 동일하거나 증가된 phospho-STAT3와 phospho-AKT 신호전달을 보였다 (도 77).

실시 예 12: 식욕촉진호르몬 전구체 ( Ghrelin / Obestatin Preprohormone ; prepro - GHRL )에서의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현 벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 식욕촉진호르몬 전구체 (Ghrelin/Obestatin Preprohormone; prepro-GHRL) DNA 증폭산물과 pCMV3-C-myc (6.1kb)를 제한효소인 KpnI과 XbaI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝 하였으며 (도 78, prepro-GHRL 아미노산 서열: SEQ No. 80), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 79). 또한 도 78의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트로 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 79). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 30초를 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 78의 맵에 표시된 pCMV3-C-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 항체를 이용하여 Western blot을 통해 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 식욕촉진호르몬 전구체 (Ghrelin/Obestatin Preprohormone; prepro-GHRL) 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것으로 나타났다 (도 80).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (prepro-GHRL K100R FP 5'-GCCCTGGGGAGGTTTCTTCAG-3' (SEQ No. 81), RP 5'-CTGAAGAAACCTCCCCAGGGC-3' (SEQ No. 82)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환 시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pCMV3-C-myc-식욕촉진호르몬 precursor (Ghrelin/Obestatin Preprohormone; prepro-GHRL) DNA를 템플릿으로 사용하고, Lysine 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 12).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 Ghrelin 작제물
100	pCMV3-C-myc-prepro-GHRL (K100R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT 6 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강분석을 실시하였다 (도 81). 각각 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT, 및 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R) 각각 6 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 82).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해 완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역 블롯팅은 단백질 샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 (smear) 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 81, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 81, 레인 4). 또한 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 82, 레인 3). 이상의 결과는 식욕촉진단백질이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 식욕촉진단백질(Ghrelin)의 반감기 확인

pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R)를 각각 6 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 2시간, 4시간 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정해본 결과, 인간 식욕촉진단백질의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 83). 결과적으로 인간 식욕촉진호르몬 전구체 (Ghrelin/Obestatin Preprohormone; prepro-GHRL)의 반감기는 2시간 이내인데 반면 인간 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R)의 반감기는 2시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 83).

4. 세포 내에서의 식욕촉진호르몬 전구체 ( Ghrelin / Obestatin Preprohormone ; prepro - GHRL )과 식욕촉진호르몬 전구체 (Ghrelin/Obestatin Preprohormone; prepro-GHRL) 치환체들에 의한 신호전달 확인

식욕촉진호르몬은 성장호르몬분비수용체 (the growth hormone secretagogue receptor; GHS-R)를 통해서 세포 성장을 조절하며, 체내 칼슘 조절을 통해서 STAT3를 증가시킨다는 것이 보고되었다 (Mol Cell Endocrinol., 285, 19-25, 2008). 본 실시예에서는 세포 내에서 식욕촉진호르몬 precursor (Ghrelin/Obestatin Preprohormone; prepro-GHRL)과 식욕촉진호르몬 precursor (Ghrelin/Obestatin Preprohormone; prepro-GHRL) 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저, HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 굶긴 후, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R)을 각각 6 ㎍씩 이용하여 HepG2 세포를 감염시켰다. 감염 2일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량한 다음, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R)로 감염된 HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포에서 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S), 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pCMV3-C-myc-prepro-GHRL 치환체 (K100R)은 HepG2 세포 내에서 pCMV3-C-myc-prepro-GHRL WT과 동일하거나 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 84).

실시 예 13: 식욕촉진호르몬 ( Ghrelin )에서의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 식욕촉진호르몬 (Ghrelin) DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 BamHI과 XhoI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝 하였으며 (도 85, Ghrelin 아미노산 서열: SEQ No. 83), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 86). 또한 도 85의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 한 번 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 86). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 20초를 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 85의 맵에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 식욕촉진호르몬 (Ghrelin) 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것으로 나타났다 (도 87).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (Ghrelin K39R FP 5'-AGTCCAGCAGAGAAGGGAGTCGAAGAAGCCA-3' (SEQ No. 84), RP 5'-TGGCTTCTTCGACTCCCTTCTCTGCTGGACT-3' (SEQ No. 85); Ghrelin K42R FP 5'-AGAAAGGAGTCGAGGAAGCCACCAGCCAAGC-3' (SEQ No. 86), RP 5'-GCTTGGCTGGTGGCTTCCTCGACTCCTTTCT-3' (SEQ No. 87); Ghrelin K43R FP 5'-AGAAAGGAGTCGAAGAGGCCACCAGCCAAGC-3' (SEQ No. 88), RP 5'-GC TTGGCTGGTGGCCTCTTCGACTCCTTTCT-3' (SEQ No. 89) ; Ghrelin K47R FP 5'-AAGA AGCCACCAGCCAGGCTGCAGCCCCGA-3' (SEQ No. 90), RP 5'-TCGGGGCTGCAGCCT GGCTGGTGGCTTCTT-3' (SEQ No. 91)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 (Ghrelin) DNA를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 13).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 Ghrelin 작제물
39	pcDNA3-myc-Ghrelin (K39R)
42	pcDNA3-myc-Ghrelin (K42R)
43	pcDNA3-myc-Ghrelin (K43R)
47	pcDNA3-myc-Ghrelin (K47R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 다음, 면역침강 분석을 실시하였다 (도 88). 또한 각각 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K42R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 (K43R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K47R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K42R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K43R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K47R) 각각 2 ㎍, 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강 분석을 실시하였다 (도 89).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해 완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해 완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질 샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-식욕촉진단백질 WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 (smear) 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 88, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 88, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K42R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K43R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K47R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K42R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K43R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K47R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 89, 레인 3 및 6). 이상의 결과는 식욕촉진호르몬이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 식욕촉진호르몬 (Ghrelin)의 반감기 확인

pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K42R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K43R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K47R)를 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시키고 48시간 후, 단백질 생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ug/㎖)을 처리하고 12시간, 24시간, 36시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 식욕촉진호르몬의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 90). 결과적으로 인간 식욕촉진호르몬 (Ghrelin) 반감기는 15시간 이내인데 반면 인간 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 (K47R)의 반감기는 36시간 이상으로 WT보다 길어졌으며 이 결과는 그래프로 나타내었다 (도 90).

4. 세포 내에서의 식욕촉진호르몬 ( Ghrelin )과 식욕촉진호르몬 ( Ghrelin ) 치환체들에 의한 신호전달 확인

식욕촉진호르몬은 성장호르몬 분비 수용체 (the growth hormone secretagogue receptor; GHS-R)를 통해서 세포 성장을 조절하며, 체내 칼슘 조절을 통해서 STAT3를 증가시킨다는 것이 보고되었다 (Mol Cell Endocrinol., 285, 19-25, 2008). 본 실시예에서는 세포 내에서 식욕촉진호르몬 (Ghrelin)과 식욕촉진호르몬 (Ghrelin) 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저 HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 굶긴 후, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K42R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K43R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K47R)를 각각 3 ㎍씩 이용하여 HepG2 세포를 감염시켰다. 감염 2일 경과 후, 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 각각 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K42R), pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K43R), 및 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K47R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S), 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 치환체 (K39R)는 HepG2 세포 내에서 pcDNA3-myc-식욕촉진호르몬 WT보다 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 91).

실시 예 14: 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 단백질의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인과 세포 내 신호전달 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

중합효소 연쇄반응에 의한 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) DNA 증폭산물과 pcDNA3-myc (5.6kb)를 제한효소인 BamHI과 XhoI으로 절편을 만든 후 접합하여 클로닝 하였으며 (도 92, GLP-1 아미노산 서열: SEQ No. 92), 그 결과는 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 93). 또한 도 92의 염기서열 상에 밑줄과 굵은 글씨체로 표시된 부분은 클로닝된 부위를 다시 확인하고자 중합효소연쇄 반응을 통해 확인할 때 사용된 프라이머세트이며, 그 결과는 아가로즈젤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 93). 중합효소연쇄 반응 조건은 다음과 같다; 초기 변성을 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 변성 반응을 위한 94℃에서 30초, 어닐링 반응을 위한 58℃에서 30초, 연장 반응을 위한 72℃에서 20초를 25 사이클로 반복하여 진행하였고, 이후 72℃도에서 10분간 반응시켰다. 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 92의 맵에 표시된 pcDNA3-myc vector에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것으로 나타났다 (도 94).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (GLP-1 K117R FP 5'-AAGCTGCCAGGGAATTCA-3' (SEQ No. 93), RP 5'-TGAATTCCCTGGCAGCTT-3' (SEQ No. 94); GLP-1 K125R FP 5'-TTGGC TGGTGAGAGGCC-3' (SEQ No. 95), RP 5'-GGCCTCTCACCAGCCAA-3' (SEQ No. 96)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환 시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) DNA를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 14).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 GLP-1 작제물
117	pcDNA3-myc-GLP-1 (K117R)
125	pcDNA3-myc-GLP-1 (K125R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 (co-transfection) 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 다음, 면역침강 분석을 실시하였다 (도 95). 또한 각각 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R), pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R), pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R), pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R) 각각 2 ㎍와 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍를 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강분석을 실시하였다 (도 96).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역블롯팅은 단백질 샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 95, 레인 3과 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 95, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R), pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R), pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 96, 레인 3, 4). 이상의 결과는 글루카곤유사펩티드 (GLP-1)이 유비퀴틴과 결합하고 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 글루카곤유사펩티드 (GLP-1)의 반감기 확인

pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R), pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R)를 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 (transfection) 시켰다. 형질감염 48시간 후, 단백질 생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 2시간, 4시간 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 글루카곤유사펩티드 (GLP-1)의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 97). 결과적으로 인간 글루카곤유사펩티드 (GLP-1)의 반감기는 2시간인데 반면 인간 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R), pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R)의 반감기는 4시간 이상으로 WT보다 길었고 이와 같은 결과를 그래프로 비교하였다 (도 97).

4. 세포 내에서의 글루카곤유사펩티드 (GLP- 1)와 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체들에 의한 신호전달 확인

글루카곤유사펩티드 (GLP-1)는 글루코오스 항상성을 조절하며 인슐린 저항성에 중요한 역할을 하기 때문에 현재 당뇨 치료제로 사용되며 STAT3 활성을 유도한다는 것이 보고되었다 (Biochem Biophys Res Commun., 425(2), 304-308, 2012). 본 실시예에서는 세포 내에서 글루카곤유사펩티드 (GLP-1)과 글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체들에 의한 신호전달 과정을 확인하였다. 먼저 HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포를 8시간 동안 굶긴 후, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R), pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R)를 각각 6 ㎍씩 이용하여 HepG2 세포를 감염시켰다. 감염 2일이 지난 후 세포에서 단백질을 추출하여 각각 정량하고, 세포 내 신호전달 과정을 확인하고자 웨스턴블롯팅을 실시하였다. 이 과정에서 각각 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R) 및 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K125R)으로 감염된 HepG2 세포에서 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21876), 항-phospho-STAT3 (Y705, cell signaling 9131S), 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-레빗 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2004)과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다. 그 결과, pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) 치환체 (K117R)는 HepG2 (ATCC, AB-8065) 세포 내에서 pcDNA3-myc-글루카곤유사펩티드 (GLP-1) WT과 동일하게 대조군보다 증가된 phospho-STAT3 신호전달을 보였다 (도 98).

실시 예 15: 면역글로불린 (IgG) 중쇄 (HC)의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

면역글로불린 (IgG) 중쇄 (HC)은 Roche에서 보유했던 특허 중 권리 만료된 Herceptin이라는 유방암치료제에 대한 특허 명세서 (특허번호 EP1308455 B9, 특허 명칭: A composition comprising anti-HER2 antibodies, p. 24)를 참조하여 포유동물세포에서 단백질 발현이 잘 되도록 코돈 최적화 (codon optimization)을 수행하여 본 연구에 사용된 고유의 DNA 서열을 합성하였고 이후 제한효소인 EcoRI과 XhoI을 이용하여 절편을 만들어 pcDNA3-myc (5.6kb)의 EcoRI과 XhoI를 이용한 절편과 접합하여 클로닝하였으며 (도 99, 면역글로불린 (IgG) 중쇄 아미노산 서열: SEQ No. 97), 이 과정을 통한 산물은 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 재확인하였다 (도 100). 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 99의 map에 표시된 pcDNA3-myc 벡터에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 면역글로불린 (IgG)의 중쇄 (HC) 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였고, 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것으로 나타났다 (도 101).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (IgG HC K235R FP 5'-ACAAAGGTGGACAGGAAGGTGGAGCCCAAG-3' (SEQ No. 98), RP 5'-CTTGGGCTCC ACCTTCCTGTCCACCTTTGT-3' (SEQ No. 99); IgG HC K344R FP 5'-GAGTATAAGTGC AGGGTGTCCAATAAGGCCCTGC-3' (SEQ No. 100), RP 5'-GCAGGGCCTTATTGGACAC CCTGCACTTATACTC-3' (SEQ No. 101); IgG HC K431R FP 5'-CTTTCTGTATAGCAGG CTGACCGTGGATAAGTCC-3' (SEQ No. 102), RP 5'-GGACTTATCCACGGTCAGCCTGC TATACAGAAAG-3' (SEQ No. 103)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-IgG HC DNA를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 15).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 IgG HC 작제물
235	pcDNA3-myc-IgG HC (K235R)
344	pcDNA3-myc-IgG HC (K344R)
431	pcDNA3-myc-IgG HC (K431R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-면역글로불린 (IgG)-HC WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC의 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역침강분석을 실시하였다 (도 102). 또한 각각 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC WT, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K235R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K344R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K431R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC WT, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K235R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K344R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K431R) 각각 2 ㎍와 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역침강 분석을 실시하였다 (도 103).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해 완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역 블롯팅은 단백질 샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 가열 한 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, sc-40)으로 면역침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 (smear) 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 102, 레인 3, 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 102, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K431R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K431R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 103, 레인 5). 이상의 결과는 면역글로불린(IgG)-HC이 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 면역글로불린(IgG)-HC의 반감기 확인

pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC WT, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K235R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K344R), 및 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K431R)를 각각 2 ㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시키고 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리한 다음, 2시간, 4시간 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 면역글로불린(IgG)-HC의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 104). 결과적으로 인간 면역글로불린(IgG)-HC의 반감기는 2시간 이내인 반면 인간 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-HC 치환체 (K431R)의 반감기는 4시간 정도로 WT보다 길었고 이와 같은 결과는 그래프로 나타냈다 (도 104).

실시 예 16: 면역글로불린 (IgG) 경쇄 (LC)의 유비퀴틴화 분석 및 반감기 증가 확인

1. 발현벡터로의 클로닝 및 단백질 발현 확인

(1) 발현벡터 클로닝

면역글로불린 (IgG)의 경쇄 (LC)은 Roche에서 보유했던 특허 중 권리 만료된 Herceptin이라는 유방암치료제에 대한 특허명세서 (특허번호 EP1308455 B9, 특허 명칭: A composition comprising anti-HER2 antibodies, p. 23)를 참조하여 포유동물 세포에서 단백질 발현이 잘 되도록 코돈 최적화를 수행하여 본 연구에 사용된 고유의 DNA 서열을 합성하였고 이후 제한효소인 EcoRI과 XhoI을 이용하여 절편을 만들어 pcDNA3-myc (5.6kb)의 EcoRI과 XhoI를 이용한 절편과 접합하여 클로닝하였으며 (도 105, 면역글로불린 (IgG)의 경쇄 (LC) 아미노산 서열: SEQ No. 104), 이 과정을 통한 산물은 제한효소 절단 후, 아가로즈젤 전기영동을 통해 재확인하였다 (도 106). 이와 같이 제작된 DNA가 단백질로 제대로 발현하는지를 확인하기 위하여 도 105의 맵에 표시된 pcDNA3-myc vector에 존재하는 myc을 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40) 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅을 통해 발현을 확인하였다. 이를 통해 myc에 결합된 면역글로불린 (IgG)의 경쇄 (LC) 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며 액틴으로 확인한 블롯을 통해 정량 로딩된 것으로 나타났다 (도 107).

(2) 라이신 (Lysine, K) 잔기의 치환

부위 특이적 돌연변이유도를 이용하여 라이신 잔기를 아르기닌으로 치환하였으며, 특정 돌연변이를 유도할 DNA 서열을 이용하여 프라이머 (IgG LC K67R FP 5'-CCTGGCAAGGCCCCAAGGCTGCTGATCTAC-3' (SEQ No. 105), RP 5'-GTAGATCAG CAGCCTTGGGGCCTTGCCAGG-3' (SEQ No. 106); IgG LC K129R FP 5'-ACAAAGGT GGAGATCAGGAGGACCGTGGCC-3' (SEQ No. 107), RP 5'-GGCCACGGTCCTCCTGAT CTCCACCTTTGT-3' (SEQ No. 108); IgG LC K171R FP 5'-GCCAAGGTGCAGTGGAGG GTGGATAACGCC-3' (SEQ No. 109), RP 5'-GGCGTTATCCACCCTCCACTGCACCTTGG C-3' (SEQ No. 110)를 제작한 후, 특정조건에서 PCR을 진행함으로써 특정 아미노산 잔기를 치환 시킨 플라스미드 DNA를 제작하였다. pcDNA3-myc-IgG LC DNA를 템플릿으로 사용하고, 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환 (K→R)된 플라스미드 DNA를 제작하였다 (표 16).

Lysine (K) 잔기 위치	Lysine (K)이 Arginine (R)로 치환된 IgG LC 작제물
67	pcDNA3-myc-IgG LC (K67R)
129	pcDNA3-myc-IgG LC (K129R)
171	pcDNA3-myc-IgG LC (K171R)

2. 생체 내 유비퀴틴화 분석

pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC WT과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC의 WT 2 ㎍과 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후에 MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 후, 면역 침강 분석을 실시하였다 (도 108). 또한 각각 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC WT, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K67R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K129R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K171R) 및 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포를 감염시켰다. 유비퀴틴화 되는 정도를 확인하기 위하여 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC WT, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K67R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K129R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K171R) 각각 2 ㎍와 pMT123-HA-유비퀴틴 DNA 1 ㎍을 세포에 공동형질감염 시키고 24시간 후에 면역 침강 분석을 실시하였다 (도 109).

면역침강을 위해 얻은 샘플은 용해 완충액 (1% Triton X, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8 및 1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)으로 용해한 후, 항-myc (9E10, sc-40) 1차 항체와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 면역 침강체는 단백질 A/G 비드 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켜 분리하였다. 이후, 용해완충액으로 2회 세척하였다. 면역 블롯팅은 단백질 샘플을 2X SDS 완충액과 혼합한 후 100℃에서 7분간 끓이고 난 후, SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40), 항-HA (Santa Cruz Biotechnology, sc-7392) 및 항-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778)을 1:1000의 중량비로 포함하는 블로킹 용액과 항-마우스 (Peroxidase-labeled antibody to mouse IgG (H+L), KPL, 074-1806) 2차 항체를 사용하여 ECL 시스템 (Western blot detection kit, ABfrontier, Seoul, Korea)으로 현상하였다.

그 결과, 항-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology, sc-40)으로 면역 침강을 실시한 경우, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC WT에는 유비퀴틴이 결합하여 폴리유비퀴틴화가 형성됨에 따라 번진 모양의 유비퀴틴이 탐지되어 밴드가 진하게 나타났다 (도 108, 레인 3, 4). 또한, MG132 (프로테아좀 저해제, 5 ㎍/㎖)을 6시간 동안 처리한 경우에서는 폴리유비퀴틴화 형성이 증가되어 유비퀴틴이 탐지되는 밴드가 더욱 진하게 나타났다 (도 108, 레인 4). 또한 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K171R)의 경우, WT보다 밴드가 연하였으며, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K171R)이 유비퀴틴과 결합하지 못하여 유비퀴틴이 적게 검출되었다 (도 109, 레인 5). 이상의 결과는 면역글로불린(IgG)-LC가 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 폴리유비퀴틴화되어 분해됨을 보여준다.

3. 단백질 생성 저해제 cycloheximide(CHX)에 의한 면역글로불린(IgG)-LC의 반감기 확인

pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC WT, pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K67R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K129R), pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K171R)를 각각 2㎍씩 HEK 293T 세포에 형질감염 시키고 48시간 후, 단백질생성 저해제 시클로헥사미드 (CHX) (Sigma-Aldrich) (100 ㎍/㎖)을 처리하고 2시간, 4시간 및 8시간에 걸쳐서 반감기를 측정한 결과, 인간 면역글로불린(IgG)-LC의 분해가 억제되는 것을 확인하였다 (도 110). 결과적으로 인간 면역글로불린(IgG)-LC의 반감기는 1시간 이내인 반면 인간 pcDNA3-myc-면역글로불린(IgG)-LC 치환체 (K171R)의 반감기는 2시간 이상으로 WT보다 길었고, 이와 같은 결과를 그래프로 나타냈다 (도 110).

본 발명에 따르면, 반감기가 증가된 단백질 또는 (폴리)펩타이드가 제공된다. 따라서 본 발명은 치료제로서 이용될 수 있는 단백질 또는 (폴리)펩타이드에 관한 것으로서, 제약 산업에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

<110> UbiProtein. 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Leu Trp Ala Leu Thr Gly His Val Gln Arg Gln Arg Arg Glu 165 170 175 Met Val Ala Gln Gln His Arg Leu Arg Gln Ile Gln Glu Arg Leu His 180 185 190 Thr Ala Ala Leu Pro Ala 195 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta trophin <400> 2 agggacggct gacaagggcc aggaa 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta trophin <400> 3 ccaggctgtt cctggccctt gtcagc 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta trophin <400> 4 ggcacagagg gtgctacggg acagc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta trophin <400> 5 cgtagcaccc tctgtgcctg ggcca 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta trophin <400> 6 gaatttgagg tcttaagggc tcacgc 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta trophin <400> 7 cttgtcagcg tgagccctta agacctc 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta trophin 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Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His 325 330 335 Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val 340 345 350 Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala 355 360 365 Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn 370 375 380 Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 385 390 395 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 53 gaaacgcctt aggtccagct gtaagagac 29 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 54 gtctcttaca gctggaccta aggcgtttc 29 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 55 ttaagtccag ctgtaggaga caccctttgt 30 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 56 acaaagggtg tctcctacag ctggacttaa 30 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 57 gttaactcta ggattcctaa ggc 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 58 gccttaggaa tcctagagtt aac 23 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 59 ggttgtatta aggaactatc aggac 25 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human bone morphogenetic protein-2 <400> 60 gtcctgatag ttccttaata caacc 25 <210> 61 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human fibroblast growth factor-1 <400> 61 Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe 1 5 10 15 Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser 20 25 30 Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly 35 40 45 Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu 50 55 60 Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu 85 90 95 Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr 100 105 110 Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys 115 120 125 Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 145 150 155 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human fibroblast growth factor-1 <400> 62 aagaagccca gactcctcta c 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human fibroblast growth factor-1 <400> 63 gtagaggagt ctgggcttct t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human fibroblast growth factor-1 <400> 64 catgcagaga ggaattggtt t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human fibroblast growth factor-1 <400> 65 aaaccaattc ctctctgcat g 21 <210> 66 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 66 Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 85 90 95 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 67 cccatccaaa aggtccaaga t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 68 atcttggacc ttttggatgg g 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 69 gatgacacca agaccctcat c 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 70 gatgagggtc ttggtgtcat c 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 71 accctcatca ggacaattgt c 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 72 gacaattgtc ctgatgaggg t 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 73 accttatcca ggatggacca g 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Leptin <400> 74 ctggtccatc ctggataagg t 21 <210> 75 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human vascular endothelial growth factor A <400> 75 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 130 135 140 Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Pro 145 150 155 160 Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro 165 170 175 Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala 180 185 190 Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg 195 200 205 Arg <210> 76 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human vascular endothelial growth factor A <400> 76 tacagcacaa cagatgtgaa tgcagacc 28 <210> 77 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human vascular endothelial growth factor A <400> 77 ggtctgcatt cacatctgtt gtgctgta 28 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human vascular endothelial growth factor A <400> 78 atccgcagac gtgtagatgt tcctgca 27 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human vascular endothelial growth factor A <400> 79 tgcaggaaca tctacacgtc tgcggat 27 <210> 80 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human prepro-GHRL <400> 80 Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu 1 5 10 15 Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His 20 25 30 Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu 35 40 45 Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln 50 55 60 Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Met Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe 65 70 75 80 Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln 85 90 95 Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu 100 105 110 Ala Pro Ala Asp Lys 115 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human prepro-GHRL <400> 81 gccctgggga ggtttcttca g 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human prepro-GHRL <400> 82 ctgaagaaac ctccccaggg c 21 <210> 83 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human appetite stimulating hormone (Ghrelin) <400> 83 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 84 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human appetite stimulating hormone (Ghrelin) <400> 84 agtccagcag agaagggagt cgaagaagcc a 31 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human appetite stimulating hormone (Ghrelin) <400> 85 tggcttcttc gactcccttc tctgctggac t 31 <210> 86 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human appetite stimulating hormone (Ghrelin) <400> 86 agaaaggagt cgaggaagcc accagccaag c 31 <210> 87 <211> 31 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Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Leu Glu 465 470 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG heavy chain <400> 98 acaaaggtgg acaggaaggt ggagcccaag 30 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG heavy chain <400> 99 cttgggctcc accttcctgt ccacctttgt 30 <210> 100 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG heavy chain <400> 100 gagtataagt gcagggtgtc caataaggcc ctgc 34 <210> 101 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG heavy chain <400> 101 gcagggcctt attggacacc ctgcacttat actc 34 <210> 102 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG heavy chain <400> 102 ctttctgtat agcaggctga ccgtggataa gtcc 34 <210> 103 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG heavy chain <400> 103 ggacttatcc acggtcagcc tgctatacag aaag 34 <210> 104 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG light chain <400> 104 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Leu Glu 225 230 235 <210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG light chain <400> 105 cctggcaagg ccccaaggct gctgatctac 30 <210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG light chain <400> 106 gtagatcagc agccttgggg ccttgccagg 30 <210> 107 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG light chain <400> 107 acaaaggtgg agatcaggag gaccgtggcc 30 <210> 108 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG light chain <400> 108 ggccacggtc ctcctgatct ccacctttgt 30 <210> 109 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG light chain <400> 109 gccaaggtgc agtggagggt ggataacgcc 30 <210> 110 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG light chain <400> 110 ggcgttatcc accctccact gcaccttggc 30

Claims

서열번호: 66를 갖는 렙틴 (Leptin)의 N-말단으로부터 26 또는 36째 위치의 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 것인, 증가된 반감기를 갖는 렙틴.
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(a) 프로모터; (b) 제 1항의 렙틴을 엔코딩 하는 염기서열; 및 임의의 링커를 포함하는 발현벡터로서, 상기 프로모터와 염기서열이 작동적으로 연결된 것인, 발현벡터.
제 4항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.