JP2022169771A - タンパク質の半減期を増加させる方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】タンパク質の半減期を増加させる方法または半減期の増加したタンパク質を提供する。【解決手段】タンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法であって、タンパク質または（ポリ）ペプチドにおいてユビキチンのＣ末端のグリシンと結合するリジンの少なくとも１つをアルギニンで置換することを含み、前記タンパク質は、特定のアミノ酸配列を有するＡＮＧＰＴ－１であり、そのＮ末端から１７５番目、２１６番目および４１４番目のリジン残基の少なくとも１つをアルギニンで置換する、前記方法である。本発明のリジン残基が置換されたタンパク質は、人体内で長期に亘って残留し、治療効果に優れる。【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質または（ポリ）ペプチドの一つ以上のアミノ酸残基を置換することにより、タンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法に関する。また、このような方法により作製された半減期の増加したタンパク質または（ポリ）ペプチドに関する。
細胞内タンパク質分解は、リソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）とプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）による二つの経路を通じてなされる。タンパク質の１０～２０％を分解するリソソーム経路は、基質特異性および精巧な時間的調節性がない。すなわち、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞内に取り込まれた細胞表面タンパク質がリソソームにおいて分解されることのように、細胞外または膜タンパク質の大部分を分解する過程である。しかし、真核細胞においてタンパク質が選択的に分解されるためには、ユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）結合酵素によって標的タンパク質にユビキチンが結合した後にポリユビキチン鎖が形成され、それがプロテアソームにより認識および分解される過程、すなわち、ユビキチン－プロテアソーム経路（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ：ＵＰＰ）を経なければならない。真核細胞タンパク質中の８０～９０％以上はこの過程を経て分解され、ユビキチン－プロテアソーム経路は真核細胞内に存在する大部分のタンパク質分解を調節することによって、タンパク質の転換と恒常性を司ると考えられる。
ユビキチンは、高度に保存された７６個のアミノ酸からなるタンパク質であり、あらゆる真核細胞に存在し、その中でも６、１１、２７、２９、３３、４８、６３番目のアミノ酸残基はリジン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ、Ｋ）であり、４８番および６３番がポリユビキチン鎖を形成するのに主な役割をする。ユビキチンがタンパク質に標識される過程（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）には一連の酵素系（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）が関与し、標識されたタンパク質はＡＴＰ－依存性タンパク質分解酵素複合体である２６Ｓプロテアソームによって分解される。ユビキチン－プロテアソーム経路は個別の二つの連続した過程を含み、一方が、基質に多数のユビキチン分子を共有結合で標識する過程であり、他方が、ユビキチンにより標識されたタンパク質が２６Ｓプロテアソーム複合体によって分解される過程である。ユビキチンと基質の結合は、基質分子のリジン残基とユビキチンのＣ末端のグリシンとの間のイソペプチド結合（ｉｓｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）を通じて起こり、ユビキチン－活性酵素Ｅ１、ユビキチン－結合酵素Ｅ２、ユビキチンリガーゼＥ３によってユビキチンと酵素との間にチオールエステルが形成されることによってなされる。その中で、Ｅ１（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）は、ＡＴＰ－依存的な反応でユビキチンを活性化させる。Ｅ２（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）は、ユビキチン－共役ドメイン内のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）残基にＥ１から活性化されたユビキチンを受け、それをＥ３リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）に伝達するかまたは基質タンパク質に直接伝達する。Ｅ３酵素もまた基質タンパク質のリジン残基とユビキチンのグリシン残基との間の安定的なイソペプチド結合を触媒する。基質タンパク質に結合されたユビキチンのＣ末端リジン残基にまた他のユビキチンが連結されることができ、このような過程を繰り返して基質タンパク質に多数のユビキチン分子が枝を下ろした形で連結されてポリユビキチン鎖を形成すれば、そのタンパク質は、２６Ｓプロテアソームにより認識されて選択的に分解される。
一方、インビボにおける治療効果を有する種々のタンパク質および（ポリ）ペプチドが知られている。このようにインビボにおける治療効果を有するタンパク質または（ポリ）ペプチドは、例えば、成長ホルモン放出ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α ｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－β）、インターフェロン受容体（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ、ＣＳＦｓ）、グルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ）、インターロイキン受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、酵素（ｅｎｚｙｍｅｓ）、インターロイキン結合タンパク質（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、サイトカイン結合タンパク質（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）、マクロファージ活性因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、マクロファージペプチド（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｂ細胞因子（Ｂ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、Ｔ細胞因子（Ｔ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、アレルギー阻害剤（ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、細胞壊死糖タンパク質（ｃｅｌｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）、リンフォトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、腫瘍抑制因子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）、転移成長因子（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、α－１抗トリプシン（ａｌｐｈａ－１ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、α－ラクトアルブミン（ａｌｐｈａ－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、アポリポタンパク質－Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ－Ｅ）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、高度グリコシル化エリスロポエチン（ｈｉｇｈｌｙ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ）、ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、トロンビン受容体活性ペプチド（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、トロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）、第ＶＩＩ因子（ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ）、第ＶＩＩＩ因子（ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ｆａｃｔｏｒ ＩＸ）、第ＸＩＩＩ因子（ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩ）、プラスミノゲン活性因子（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、タンパク質Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）、Ｃ－反応性タンパク質（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、レニン阻害剤（ｒｅｎｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、コラゲナーゼ阻害剤（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、上皮成長因子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、アンギオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）、骨成長因子（ｂｏｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、骨刺激タンパク質（ｂｏｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、アトリオペプチン（ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｎ）、軟骨誘導因子（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、フィブリン結合ペプチド（ｆｉｂｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、結合組織活性因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、組織因子経路阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、レラキシン（ｒｅｌａｘｉｎ）、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、ソマトメジン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、副腎皮質ホルモン（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ）、グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎ）、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）、膵臓ポリペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ガストリン放出ペプチド（ｇａｓｔｒｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、オートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、受容体拮抗薬（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）、細胞表面抗原（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ウイルス由来ワクチン抗原（ｖｉｒｕｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および抗体フラグメントを含む。
上皮成長因子（ＥＧＦ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は受容体ＥＧＦＲに結合して細胞成長、増殖、分化を促進し、ヒトＥＧＦは５３個のアミノ酸からなる（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２８４（１）：２－１３、２００３）。また、このようなＥＧＦは、皮膚およびヘアの再生に重要な役割をすることが報告されている（Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ．、７２（２）：８１－８６、２０１３）。
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、成長因子のうちの一つであり、細胞成長と分裂を調節し、血管新生に関与し、血小板由来成長因子サブユニットＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ）（ＰＤＧＦＡ）と血小板由来成長因子サブユニットＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ）（ＰＤＧＦＢ）が機能を持つヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏ－ｄｉｍｅｒｓ）をなす（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、９８９（１）：１１０、１９８９；ＥＭＢＯ Ｊ．、１１（１２）：４２５１４２５９、１９９２）。ＰＤＧＦは合成され、血小板のα顆粒（ａｌｐｈａ ｇｒａｎｕｌｅｓ）に貯蔵されており血小板が活性を持つようになれば分泌され、筋肉細胞、活性マクロファージと上皮細胞などの細胞からも産生される（Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．、１９（１９）：３３８４－３３９０、２０１３）。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ；Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞および線維芽細胞によって分泌されるタンパク質であり、白血球の成長因子として機能するサイトカインである。また、幹細胞が顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）と単核球を生産するように刺激し、マクロファージ数を急激に増やして感染反応と対抗することができるようにするので免疫／感染反応に作用する（Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．、３１（１）：７７４、２０１４；Ｂｌｏｏｄ、７７（６）：１１３１－１１４５、１９９１）。組み換えＧＭ－ＣＳＦは、ＨＩＶ－感染患者にワクチン補助剤として使用することができると報告されている（Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、８（１１）：１６５４１６５８、２０１２；Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．、２（１）：１６０１７８、２０１４）。また、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫白血病やホジキン患者が骨髄移植治療を受ける時には白血球の数値増加に効果があるが、リウマチ関節炎患者の関節では高く発現するため、ＧＭ－ＣＳＦが減ると、炎症や損傷を減らすことができると報告されている（Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．、１３（３）：３１３－３３５、２０１３）。
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ；Ｆｏｌｌｉｃｌｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）は、３５．５ｋＤａの糖タンパク質ポリペプチドの形態で二つのポリペプチドであるアルファとベータがヘテロ二量体をなす性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ）のうちの一つであり、女性の卵胞成長と男性の精子発生を促進し維持する役割をし、脳下垂体前葉の 性腺細胞において合成されて分泌され、身体の生殖過程、発生、成長、思春期の成熟を調節する（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５０：４６５－４９５、１９８１；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１０９（３１）：１２４９１－１２４９６、２０１２）。一般に、卵胞刺激ホルモンは、不妊治療である体外受精（ＩＶＦ）の時に過排卵を誘導するために用いられる。また、固形癌の場合、ＦＳＨの受容体が腫瘍血管内皮において高く発現して新生血管の再生に関与することが報告されており、ＦＳＨと受容体のアンタゴニストを開発する場合に坑癌治療にも使用できる（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、３６３（１７）：１６２１－１６３０、２０１０）。
アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）は、血管成長因子として血管新生に直接的に関与し、血管を囲む筋肉細胞のシグナル伝達によって微小血管透過性（ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）、血管拡張（ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ）および血管収縮（ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）を調節する（ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．、１０：１４３、２０１０；Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．、３２８（１）：１８－２６、２０１３）。現在４種のａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓであるＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴ３およびＡＮＧＰＴ４が知られている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、９６（５）：１９０４－１９０９、１９９９）。その中でもアンジオポエチン－１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）は、血管成長と血管形成に重要な役割をするタンパク質であり、ＡＮＧＰＴ１遺伝子によって暗号化されている。全てのアンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）は内皮細胞特異的チロシン－タンパク質キナーゼ受容体（ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合し、これは内皮と周囲基質および中間葉の間の相互作用を仲裁するのに重要な役割をする。また、血管の成熟と安定性に寄与し、心臓の初期発達に関与する（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１３（５）：３０９－３１７、２００３）。
本発明は、タンパク質の半減期を増加させる方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、アミノ酸配列に存在する一つ以上のリジン残基が置換されたタンパク質であって、増加した半減期を有するタンパク質を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、増加した半減期を有するタンパク質を含む薬学組成物を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明は、タンパク質のアミノ酸配列に存在する一つ以上のリジン残基を置換することを含む、タンパク質の半減期を増加させる方法を提供する。
本発明において、タンパク質のリジン残基は、保存アミノ酸で置換可能である。本発明において、「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似した、例えば、電荷または疎水性を有する化学的特性を有する側鎖を有する他のアミノ酸残基によって置換されることを意味する。一般に、保存アミノ酸置換によってタンパク質の機能的特性は実質的に変化しない。類似した化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸グループの例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド－含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニンおよびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩；および７）硫黄－含有側鎖：システインおよびメチオニンを含む。
本発明において、タンパク質のリジン残基は、塩基性側鎖を含むアルギニンまたはヒスチジンで置換可能であり、アルギニン残基で置換されることが好ましい。
本発明によると、タンパク質のアミノ酸配列に存在する一つ以上のリジン残基がアルギニンで置換されたタンパク質は、半減期が増加して体内で長期に亘って残留可能である。
本発明の一実施形態において、タンパク質はＥＧＦである。配列番号１で表されるＥＧＦのアミノ酸配列において、Ｎ末端から２８および４８番目のリジン残基のうち一つ以上がアルギニン残基で置換される。その結果として、前記半減期が増加したＥＧＦおよびそれを含む細胞成長、皮膚およびヘアの再生および／または治療のための薬学および／または美容組成物が提供される（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２８４（１）：２－１３、２００３；Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ．、７２（２）：８１－８６、２０１３）。
本発明の他の一実施形態において、タンパク質はＰＤＧＦＡである。配列番号６で表されるＰＤＧＦＡのアミノ酸配列において、Ｎ末端から１６０、１６５および２０６番目のリジン残基のうち一つ以上がアルギニン残基で置換される。また、本発明のまた他の一実施形態において、タンパク質はＰＤＧＦＢである。配列番号７で表されるＰＤＧＦＢのアミノ酸配列において、Ｎ末端から１６２、１６７および１７９番目のリジン残基のうち一つ以上がアルギニン残基で置換される。その結果として、前記半減期が増加した血小板由来成長因子およびそれを含む細胞成長、血管生成および慢性潰瘍と骨損失の回復のための薬学および／または美容組成物が提供される。
本発明のさらに他の一実施形態において、タンパク質はＧＭ－ＣＳＦである。配列番号２０で表されるＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列において、Ｎ末端から８９、９１および１０２番目のリジン残基のうち一つ以上がアルギニン残基で置換される。その結果として、半減期が増加したＧＭ－ＣＳＦおよびそれを含む好中球減少症の予防および／または免疫疾患および／または固形癌および血液癌を含む癌および／またはリウマチ関節炎の予防および／または治療用の薬学組成物が提供される。
本発明のさらに他の一実施形態において、タンパク質はＦＳＨである。配列番号２７で表されるＦＳＨ－αのアミノ酸配列において、Ｎ末端から７５、９９および１１５番目のリジン残基のうち一つ以上がアルギニン残基で置換される。また、本発明のさらに他の一実施形態において、タンパク質はＦＳＨ－βである。配列番号２８で表されるＦＳＨ－βのアミノ酸配列において、Ｎ末端から６７、１０４および１２８番目のリジン残基のうち一つ以上がアルギニン残基で置換される。その結果として、半減期が増加したＦＳＨおよびそれを含む過排卵誘導のための不妊治療剤および／または固形癌治療用の薬学組成物が提供される。
本発明のさらに他の一実施形態において、タンパク質はＡＮＧＰＴ－１である。配列番号４１で表されるＡＮＧＰＴ－１アミノ酸配列において、Ｎ末端から１７５、２１６および４１４番目のリジン残基のうち一つ以上がアルギニン残基で置換される。その結果として、半減期が増加したＡＮＧＰＴ－１およびそれを含む糖尿病、心臓疾患および／または敗血症治療用の薬学組成物が提供される。
本発明において、タンパク質のアミノ酸配列に存在するリジン残基をアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｒ）残基で置換するために部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用した。この方法は、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマーを作製した後、特定の条件でＰＣＲを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製する。
本発明において、標的タンパク質を免疫沈降分析法によって細胞株内にトランスフェクションし沈降させてユビキチン化レベルを確認し、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）試薬を処理した結果、ユビキチン化レベルが増加したことを通じて、標的タンパク質がユビキチン－プロテアソームによる分解経路を経ることを確認した。
本発明において、薬学組成物は、経口（ｏｒａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）または筋肉内投与を含む様々な経路を通じて体内伝達され、注射型製剤として投与できる。また、本発明の薬学組成物は、前記方法により投与された後に迅速な放出、遅延的放出または徐放されるように当業者に周知の方法により剤形化できる。前記剤形は、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）、ピル（ｐｉｌｌ）、粉体（ｐｏｗｄｅｒ）、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）、懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、乳液（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、シロップ（ｓｙｒｕｐ）、エアロゾル（ａｅｒｏｓｏｌ）、ソフトタイプまたはハードタイプのゼラチンカプセル（ｓｏｆｔ ａｎｄ ｈａｒｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｃａｐｓｕｌｅ）、無菌注射可能な溶液（ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、無菌包装粉体などを含む。好適な担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）、エリスリトール（ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）、マルチトール（ｍａｌｔｉｔｏｌ）、スターチ（ｓｔａｒｃｈｅｓ）、アカシア・ゴム（ｇｕｍ ａｃａｃｉａ）、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅｓ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ケイ酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、微結晶性セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、水、メチルヒドロキシベンゾエート（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅｓ）、プロピルヒドロキシベンゾエート（ｐｒｏｐｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅｓ）、タルク（ｔａｌｃ）、ステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）およびミネラルオイルを含む。また、剤形は、充填剤、抗凝集剤（ａｎｔｉ－ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、着香料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ）、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）などをさらに含んでもよい。
本発明において、単数の形態は、特に明確に記述しない限り、複数の形態を含む。また、本発明において、「構成される」、「有する」、「からなる」などのような用語は、「含む」と類似の意味を持つものとして解釈される。本発明において、「生理活性（ポリ）ペプチドまたはタンパク質」とは、ヒトを含む哺乳動物への投与時、有用な生物学的活性を表す（ポリ）ペプチドまたはタンパク質を意味する。
以下では、実施例に基づいて本発明をより詳しく説明する。下記の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
実施例１：ＥＧＦタンパク質のユビキチン化分析および半減期の増加の確認と細胞内シグナル伝達の確認
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
ＥＧＦをクローニングするためにＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＭ－ＣＣＬ－２ＴＭ）からＴｒｉｚｏｌとクロロホルムを用いて精製されたＲＮＡを抽出した。次にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて重合酵素連鎖反応を通じてＥＧＦを増幅した。ＥＧＦ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図１、ＥＧＦのアミノ酸配列：配列番号１）、制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２）。また、図１のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットであり、その結果もまたアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応のために５２℃で３０秒間、延長（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）反応のために７２℃で３０秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図１のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてその発現を確認した。それにより、ｍｙｃに結合されたＥＧＦタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチン（ａｃｔｉｎ）で確認したブロット（ｂｌｏｔ）を通じて適正量がロード（ｌｏａｄｉｎｇ）されたことを確認した（図３）。
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
ＥＧＦをクローニングするためにＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＭ－ＣＣＬ－２ＴＭ）からＴｒｉｚｏｌとクロロホルムを用いて精製されたＲＮＡを抽出した。次にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて重合酵素連鎖反応を通じてＥＧＦを増幅した。ＥＧＦ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図１、ＥＧＦのアミノ酸配列：配列番号１）、制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２）。また、図１のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットであり、その結果もまたアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応のために５２℃で３０秒間、延長（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）反応のために７２℃で３０秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図１のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を通じてその発現を確認した。それにより、ｍｙｃに結合されたＥＧＦタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチン（ａｃｔｉｎ）で確認したブロット（ｂｌｏｔ）を通じて適正量がロード（ｌｏａｄｉｎｇ）されたことを確認した（図３）。
（２）リジン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）残基の置換
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｒ）で置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＥＧＦ Ｋ２８Ｒ ＦＰ ５’－ＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＡＡＣ－３’（配列番号２）、ＲＰ ５’－ＧＴＴＧＣＡＴＧＣＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣ－３’（配列番号３）；ＥＧＦ Ｋ４８Ｒ ＦＰ ５’－ＴＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧ－３’（配列番号４）、ＲＰ ５’－ＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＧＧＴＡ－３’（配列番号５）を作製した後、ＰＣＲを実行して特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）されたプラスミドＤＮＡを作製した（表１）。
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｒ）で置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＥＧＦ Ｋ２８Ｒ ＦＰ ５’－ＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＡＡＣ－３’（配列番号２）、ＲＰ ５’－ＧＴＴＧＣＡＴＧＣＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣ－３’（配列番号３）；ＥＧＦ Ｋ４８Ｒ ＦＰ ５’－ＴＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧ－３’（配列番号４）、ＲＰ ５’－ＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＧＧＴＡ－３’（配列番号５）を作製した後、ＰＣＲを実行して特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）されたプラスミドＤＮＡを作製した（表１）。
２．インビボにおけるユビキチン化分析
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチン（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７９（４）、２３６８－２３７６、２００４；Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、８７３８８５、２０１２；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２、１２７３１２８０、２００３；Ｃｅｌｌ、７８、７８７－７９８、１９９４）をコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図４）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図５）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチン（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７９（４）、２３６８－２３７６、２００４；Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、８７３８８５、２０１２；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２、１２７３１２８０、２００３；Ｃｅｌｌ、７８、７８７－７９８、１９９４）をコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図４）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図５）。
免疫沈降のために得られたタンパク質サンプルは、溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８および１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶解した後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０）一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）と混合して４℃で一晩培養した。免疫沈降体は、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて４℃で２時間反応させて分離した。次に、溶解緩衝液で２回洗浄した。タンパク質サンプルを２Ｘ ＳＤＳ緩衝液と混合した後、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施して分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７３９２）および抗－β－ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１，０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ－４０）で免疫沈降を実施した場合、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴにはユビキチンが結合してポリユビキチン化が形成されることによって、スメア（ｓｍｅａｒ）ユビキチンが探知されてバンドが濃く現れた（図４、レーン３および４）。また、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した場合、ポリユビキチン化の形成が増加してユビキチンが探知されるバンドがさらに濃く現れた（図４、レーン４）。このような結果は、ＥＧＦがユビキチンと結合し、ユビキチン－プロテアソームシステムを通じてポリユビキチン化されることを提示する。また、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）の場合、ＷＴよりバンドが薄く現れた。これは、この置換体にユビキチンが結合できずユビキチンが少なく検出されたことを示す（図５、レーン３）。
３．タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）（ＣＨＸ）によるＥＧＦの半減期の確認
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ＋Ｋ４８Ｒ）を各々３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、１時間、２時間、４時間にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＥＧＦの分解が抑制されることを確認した（図６）。ヒトＥＧＦの半減期は２時間以内であるのに対し、ヒトＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）、ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）、ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ＋Ｋ４８Ｒ）の半減期は４時間以上とＷＴより長く、その結果をグラフで示した（図６）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ＋Ｋ４８Ｒ）を各々３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、１時間、２時間、４時間にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＥＧＦの分解が抑制されることを確認した（図６）。ヒトＥＧＦの半減期は２時間以内であるのに対し、ヒトＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）、ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）、ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ＋Ｋ４８Ｒ）の半減期は４時間以上とＷＴより長く、その結果をグラフで示した（図６）。
４．細胞内におけるＥＧＦとＥＧＦ置換体によるシグナル伝達の確認
ＥＧＦは、成長因子としてＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ１／２－Ｅｒｋシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によってＥｒｋ１／２を活性化させることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７、４６１９－４６２８、２００４）。
ＥＧＦは、成長因子としてＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ１／２－Ｅｒｋシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によってＥｒｋ１／２を活性化させることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７、４６１９－４６２８、２００４）。
本実施例では、細胞内におけるＥＧＦとＥＧＦ置換体によるシグナル伝達過程を確認した。先ず、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）を各々３μｇずつ用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクションした。感染して２日経過後、細胞からタンパク質を抽出して各々定量化し、細胞内シグナル伝達過程を確認するためにウェスタンブロットを実行した。このために、各々、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）で感染したＨｅＬａ細胞から分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２１８７６）、抗－リン酸化－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１３１Ｓ）、抗－ＡＫＴ（Ｈ－１３６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－８３１２）、抗－リン酸化－ＡＫＴ（Ｓ４７３、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２７１Ｓ）、抗－Ｅｒｋ１／２（９Ｂ３、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＭＡ０１３４）、抗－リン酸化－Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＰＡ００９０）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００～１：３０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２００４）と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ２８Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ置換体（Ｋ４８Ｒ）は、ＨｅＬａ細胞内でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＥＧＦ ＷＴと同一であるかまたは増加したリン酸化－ＳＴＡＴ３、リン酸化－ＡＫＴとリン酸化－Ｅｒｋ１／２のシグナル伝達を示した（図７）。
実施例２：ＰＤＧＦタンパク質のユビキチン化分析および半減期増加の確認と細胞内シグナル伝達の確認
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングした（図８、ＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢのアミノ酸配列：配列番号６と配列番号７）。その結果は、制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図９）。また、図８のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図９）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために６０℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で４５秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図８のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。ｍｙｃに結合されたＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図１０）。
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングした（図８、ＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢのアミノ酸配列：配列番号６と配列番号７）。その結果は、制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図９）。また、図８のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図９）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために６０℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で４５秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図８のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。ｍｙｃに結合されたＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図１０）。
（２）リジン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）残基の置換
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｒ）で置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＰＤＧＦＡ Ｋ１６０Ｒ ＦＰ ５’－ＧＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡ－３’（配列番号８）、ＲＰ ５’－ＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＴＡＴＴＣ－３’（配列番号９）；ＰＤＧＦＡ Ｋ１６５Ｒ ＦＰ ５’－ＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１０）、ＲＰ ５’－ＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴ－３’（配列番号１１）；ＰＤＧＦＡ Ｋ２０６Ｒ ＦＰ ５’－ＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＡＡＡＡＣＣＣ－３’（配列番号１２）、ＲＰ ５’－ＧＧＧＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＧＴＴＴ－３’（配列番号１３）、（ＰＤＧＦＢ Ｋ１６２Ｒ ＦＰ ５’－ＡＴＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴ－３’（配列番号１４）、ＲＰ ５’－ＡＡＡＧＡＴＴＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＡＡＴ－３’（配列番号１５）；ＰＤＧＦＢ Ｋ１６７Ｒ ＦＰ ５’－ＣＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧ－３’（配列番号１６）、ＲＰ ５’－ＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＴＧＧ－３’（配列番号１７）；ＰＤＧＦＢ Ｋ１７９Ｒ ＦＰ ５’－ＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＡＣＡ－３’（配列番号１８）、ＲＰ ５’－ＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９）を作製した後、ＰＣＲを実行して特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表２）。
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｒ）で置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＰＤＧＦＡ Ｋ１６０Ｒ ＦＰ ５’－ＧＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡ－３’（配列番号８）、ＲＰ ５’－ＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＴＡＴＴＣ－３’（配列番号９）；ＰＤＧＦＡ Ｋ１６５Ｒ ＦＰ ５’－ＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１０）、ＲＰ ５’－ＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴ－３’（配列番号１１）；ＰＤＧＦＡ Ｋ２０６Ｒ ＦＰ ５’－ＡＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＡＡＡＡＣＣＣ－３’（配列番号１２）、ＲＰ ５’－ＧＧＧＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＧＴＴＴ－３’（配列番号１３）、（ＰＤＧＦＢ Ｋ１６２Ｒ ＦＰ ５’－ＡＴＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴ－３’（配列番号１４）、ＲＰ ５’－ＡＡＡＧＡＴＴＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＡＡＴ－３’（配列番号１５）；ＰＤＧＦＢ Ｋ１６７Ｒ ＦＰ ５’－ＣＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧ－３’（配列番号１６）、ＲＰ ５’－ＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＴＧＧ－３’（配列番号１７）；ＰＤＧＦＢ Ｋ１７９Ｒ ＦＰ ５’－ＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＡＣＡ－３’（配列番号１８）、ＲＰ ５’－ＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１９）を作製した後、ＰＣＲを実行して特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表２）。
２．インビボにおけるユビキチン化分析
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチン（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７９（４）、２３６８－２３７６、２００４；Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、８７３８８５、２０１２；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２、１２７３１２８０、２００３；Ｃｅｌｌ、７８、７８７－７９８、１９９４）をコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図４）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図１１）。
免疫沈降のために得られたタンパク質サンプルは、溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８および１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶解した後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０）一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）と混合して４℃で一晩培養した。免疫沈降体は、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて４℃で２時間反応させて分離した。次に、溶解緩衝液で２回洗浄した。タンパク質サンプルを２Ｘ ＳＤＳ緩衝液と混合した後、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施して分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７３９２）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１，０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ－４０）で免疫沈降を実施した場合、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴとｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴにはユビキチンが結合してポリユビキチン化が形成されることによって、スメア（ｓｍｅａｒ）ユビキチンが探知されてバンドが濃く現れた（図４、レーン３、４、７および８）。また、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した場合、ポリユビキチン化の形成が増加してユビキチンが探知されるバンドがさらに濃く現れた（図４、レーン４および８）。このような結果は、ＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢがユビキチンと結合し、ユビキチン－プロテアソームシステムを通じてポリユビキチン化されることを提示する。また、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）の場合、ＷＴよりバンドが薄く現れた。これは、これらの置換体にユビキチンが結合できずユビキチンが少なく検出されたことを示す（図１２、レーン３～５および８～１０）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチン（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７９（４）、２３６８－２３７６、２００４；Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、８７３８８５、２０１２；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２、１２７３１２８０、２００３；Ｃｅｌｌ、７８、７８７－７９８、１９９４）をコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図４）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図１１）。
免疫沈降のために得られたタンパク質サンプルは、溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８および１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶解した後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０）一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）と混合して４℃で一晩培養した。免疫沈降体は、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて４℃で２時間反応させて分離した。次に、溶解緩衝液で２回洗浄した。タンパク質サンプルを２Ｘ ＳＤＳ緩衝液と混合した後、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施して分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７３９２）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１，０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ－４０）で免疫沈降を実施した場合、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴとｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴにはユビキチンが結合してポリユビキチン化が形成されることによって、スメア（ｓｍｅａｒ）ユビキチンが探知されてバンドが濃く現れた（図４、レーン３、４、７および８）。また、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した場合、ポリユビキチン化の形成が増加してユビキチンが探知されるバンドがさらに濃く現れた（図４、レーン４および８）。このような結果は、ＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢがユビキチンと結合し、ユビキチン－プロテアソームシステムを通じてポリユビキチン化されることを提示する。また、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）の場合、ＷＴよりバンドが薄く現れた。これは、これらの置換体にユビキチンが結合できずユビキチンが少なく検出されたことを示す（図１２、レーン３～５および８～１０）。
３．タンパク質生成阻害剤ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）によるＰＤＧＦの半減期の確認
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）を各々３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、３０分、６０分および９０分と、１５分、３０分および６０分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢの分解が抑制されることを確認した（図６）。ヒトＰＤＧＦＡは６０分後に分解されるのに対し、ヒトＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）は９０分以上でも分解されないことが分かり、ヒトＰＤＧＦＢは３０分で分解されるのに対し、ヒトＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）は６０分以上でも分解されないことが分かり、その結果をグラフで示した（図１３、１４および１５）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）を各々３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、３０分、６０分および９０分と、１５分、３０分および６０分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＰＤＧＦＡとＰＤＧＦＢの分解が抑制されることを確認した（図６）。ヒトＰＤＧＦＡは６０分後に分解されるのに対し、ヒトＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）は９０分以上でも分解されないことが分かり、ヒトＰＤＧＦＢは３０分で分解されるのに対し、ヒトＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）は６０分以上でも分解されないことが分かり、その結果をグラフで示した（図１３、１４および１５）。
４．細胞内におけるＰＤＧＦとＰＤＧＦ置換体によるシグナル伝達の確認
ＰＤＧＦは、成長因子としてＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ１／２－Ｅｒｋシグナル伝達によってＥｒｋ１／２を活性化させることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７、４６１９－４６２８、２００４）。
ＰＤＧＦは、成長因子としてＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ１／２－Ｅｒｋシグナル伝達によってＥｒｋ１／２を活性化させることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１７、４６１９－４６２８、２００４）。
本実施例では、細胞内におけるＰＤＧＦとＰＤＧＦ置換体によるシグナル伝達過程を確認した。先ず、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）を各々３μｇずつ用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクションした。感染して２日経過後、細胞からタンパク質を抽出して各々定量化し、細胞内シグナル伝達過程を確認するためにウェスタンブロットを実行した。このために、各々、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）で感染したＨｅＬａ細胞から分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２１８７６）、抗－リン酸化－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１３１Ｓ）、抗－ＡＫＴ（Ｈ－１３６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－８３１２）、抗－リン酸化－ＡＫＴ（Ｓ４７３、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２７１Ｓ）、抗－Ｅｒｋ１／２（９Ｂ３、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＭＡ０１３４）、抗－リン酸化－Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＰＡ００９０）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００～１：３０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２００４）と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ１６５Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ置換体（Ｋ２０６Ｒ）は、ＨｅＬａ細胞内でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＡ ＷＴと同一であるかまたは増加したリン酸化－ＳＴＡＴ３シグナル伝達を示し、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１６７Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＰＤＧＦＢ置換体（Ｋ１７９Ｒ）は、ＨｅＬａ細胞内でリン酸化－ＡＫＴとリン酸化－Ｅｒｋ１／２シグナル伝達を示した（図１６）。
実施例３：ＧＭ－ＣＳＦタンパク質のユビキチン化分析および半減期増加の確認と細胞内シグナル伝達の確認
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図１７、ＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列：配列番号２０）、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図１８）。また、図１７のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図１８）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために６０℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で３０秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図１７のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認し、それにより、ｍｙｃに結合されたＧＭ－ＣＳＦタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図１９）。
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図１７、ＧＭ－ＣＳＦのアミノ酸配列：配列番号２０）、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図１８）。また、図１７のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図１８）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために６０℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で３０秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図１７のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認し、それにより、ｍｙｃに結合されたＧＭ－ＣＳＦタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図１９）。
（２）リジン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）残基の置換
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＧＭ－ＣＳＦ Ｋ８９Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＣ－３’（配列番号２１）、ＲＰ ５’－ＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＣ－３’（配列番号２２）；ＧＭ－ＣＳＦ Ｋ９１Ｒ ＦＰ ５’－ＣＴＣ ＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣ－３’（配列番号２３）、ＲＰ ５’－ＧＧＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧ－３’（配列番号２４）；ＧＭ－ＣＳＦ Ｋ１０２Ｒ ＦＰ ５’－ＧＣＴＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴ－３’（配列番号２５）、ＲＰ ５’－ＡＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＡＧＣ－３’（配列番号２６）を作製した後、特定の条件でＰＣＲを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表３）。
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＧＭ－ＣＳＦ Ｋ８９Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＣ－３’（配列番号２１）、ＲＰ ５’－ＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＣ－３’（配列番号２２）；ＧＭ－ＣＳＦ Ｋ９１Ｒ ＦＰ ５’－ＣＴＣ ＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＣＣ－３’（配列番号２３）、ＲＰ ５’－ＧＧＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧ－３’（配列番号２４）；ＧＭ－ＣＳＦ Ｋ１０２Ｒ ＦＰ ５’－ＧＣＴＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＣＴ－３’（配列番号２５）、ＲＰ ５’－ＡＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＡＧＣ－３’（配列番号２６）を作製した後、特定の条件でＰＣＲを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表３）。
２．インビボにおけるユビキチン化分析
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡをコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図２０）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図２１）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡをコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図２０）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図２１）。
免疫沈降のために得られたサンプルは、溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８および１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶解した後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０）一次抗体と混合して４℃で一晩培養した。免疫沈降体は、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて４℃で２時間反応させて分離した。次に、溶解緩衝液で２回洗浄した。免疫ブロット法は、タンパク質サンプルを２Ｘ ＳＤＳ緩衝液と混合した後、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施して分離した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７３９２）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。
その結果、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ－４０）で免疫沈降を実施した場合、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴにはユビキチンが結合してポリユビキチン化が形成されることによって、スメアユビキチンが探知されてバンドが濃く現れた（図２０、レーン３および４）。また、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した場合、ポリユビキチン化の形成が増加してユビキチンが探知されるバンドがさらに濃く現れた（図２０、レーン４）。また、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）の場合、ＷＴよりバンドが薄く、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）がユビキチンと結合できずユビキチンが少なく検出された（図２１、レーン３、４および５）。以上の結果は、ＧＭ－ＣＳＦがユビキチンと結合し、ユビキチン－プロテアソームシステムを通じてポリユビキチン化されて分解されることを示す。
３．タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）によるＧＭ－ＣＳＦの半減期の確認
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）を各々３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、３０分、６０分、９０分にかけて半減期を測定してみた結果、ヒトＧＭ－ＣＳＦの分解が抑制されることを確認した（図２２および２３）。ヒトＧＭ－ＣＳＦの半減期は３０分以内であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）の半減期は６０分および９０分以上としてＷＴより長く、その結果をグラフで示した（図２２および２３）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）を各々３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、３０分、６０分、９０分にかけて半減期を測定してみた結果、ヒトＧＭ－ＣＳＦの分解が抑制されることを確認した（図２２および２３）。ヒトＧＭ－ＣＳＦの半減期は３０分以内であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）の半減期は６０分および９０分以上としてＷＴより長く、その結果をグラフで示した（図２２および２３）。
４．細胞内におけるＧＭ－ＣＳＦとＧＭ－ＣＳＦ置換体によるシグナル伝達の確認
ＧＭ－ＣＳＦによる細胞内役割は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達によって作用することが報告されている（Ｂｌｏｏｄ、１１９（１５）：３３８３－３３９３、２０１２）。
ＧＭ－ＣＳＦによる細胞内役割は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達によって作用することが報告されている（Ｂｌｏｏｄ、１１９（１５）：３３８３－３３９３、２０１２）。
本実施例では、細胞内におけるＧＭ－ＣＳＦとＧＭ－ＣＳＦ置換体によるシグナル伝達過程を確認した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）を各々３μｇずつ用いてＨｅＬａ細胞を感染して２日経過後、感染した細胞からタンパク質を抽出して各々定量化し、細胞内シグナル伝達過程を確認するためにウェスタンブロットを実施した。この過程でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）で感染したＨｅＬａ細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２１８７６）、抗－リン酸化－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１３１Ｓ）、抗－ＡＫＴ（Ｈ－１３６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－８３１２）、抗－リン酸化－ＡＫＴ（Ｓ４７３、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２７１Ｓ）、抗－Ｅｒｋ１／２（９Ｂ３、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＭＡ０１３４）、抗－リン酸化－Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＰＡ００９０）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００～１：３０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２００４）と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ８９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ９１Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ置換体（Ｋ１０２Ｒ）は、ＨｅＬａ細胞内でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＧＭ－ＣＳＦ ＷＴと同一であるかまたは増加したリン酸化－ＳＴＡＴ３とリン酸化－ＡＫＴシグナル伝達を示した（図２４）。
実施例４：ＦＳＨタンパク質のユビキチン化分析および半減期増加の確認と細胞内シグナル伝達の確認
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＦＳＨ－αとＦＳＨ－βのＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図２５、ＦＳＨ－αのアミノ酸配列：配列番号２７およびＦＳＨ－βのアミノ酸配列：配列番号２８）、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２６）。また、図２５のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２６）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために５６℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で１分間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図２９のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。ｍｙｃに結合されたＦＳＨ－αとＦＳＨ－βタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図２７）。
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＦＳＨ－αとＦＳＨ－βのＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図２５、ＦＳＨ－αのアミノ酸配列：配列番号２７およびＦＳＨ－βのアミノ酸配列：配列番号２８）、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２６）。また、図２５のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図２６）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために５６℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で１分間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図２９のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。ｍｙｃに結合されたＦＳＨ－αとＦＳＨ－βタンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図２７）。
（２）リジン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）残基の置換
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＦＳＨ－αＫ７５Ｒ ＦＰ ５’－ＡＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣ－３’（配列番号２９）、ＲＰ ５’－ＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＣＣＡＡＣＡＴ－３’（配列番号３０）、ＦＳＨ－αＫ９９Ｒ ＦＰ ５’－ＡＴＧＧＧＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＣ－３’（配列番号３１）、ＲＰ ５’－ＧＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＣＣＣＣＡＴ－３’（配列番号３２）、ＦＳＨ－αＫ１１５Ｒ ＦＰ ５’－ＴＧＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧ－３’（配列番号３３）、ＲＰ ５’－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡ－３’（配列番号３４）、ＦＳＨ－βＫ６７Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＴＡＣＣＴＴ－３’（配列番号３５）、ＲＰ ５’－ＡＡＧＧＴＡＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＣ－３’（配列番号３６）、ＦＳＨ－βＫ１０４Ｒ ＦＰ ５’－ＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＣＧＡ－３’（配列番号３７）、ＲＰ ５’－ＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣ－３’（配列番号３８）、ＦＳＨ－βＫ１２８Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧ－３’（配列番号３９）、ＲＰ ５’－ＣＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣ－３’（配列番号４０）を作製した後、特定の条件でＰＣＲを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αとｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された各々３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表４）。
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＦＳＨ－αＫ７５Ｒ ＦＰ ５’－ＡＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣ－３’（配列番号２９）、ＲＰ ５’－ＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＣＣＡＡＣＡＴ－３’（配列番号３０）、ＦＳＨ－αＫ９９Ｒ ＦＰ ５’－ＡＴＧＧＧＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＣ－３’（配列番号３１）、ＲＰ ５’－ＧＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＣＣＣＣＡＴ－３’（配列番号３２）、ＦＳＨ－αＫ１１５Ｒ ＦＰ ５’－ＴＧＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧ－３’（配列番号３３）、ＲＰ ５’－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡ－３’（配列番号３４）、ＦＳＨ－βＫ６７Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＴＡＣＣＴＴ－３’（配列番号３５）、ＲＰ ５’－ＡＡＧＧＴＡＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＣ－３’（配列番号３６）、ＦＳＨ－βＫ１０４Ｒ ＦＰ ５’－ＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＣＧＡ－３’（配列番号３７）、ＲＰ ５’－ＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣ－３’（配列番号３８）、ＦＳＨ－βＫ１２８Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＴＧＡＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＧ－３’（配列番号３９）、ＲＰ ５’－ＣＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣ－３’（配列番号４０）を作製した後、特定の条件でＰＣＲを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αとｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βをテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された各々３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表４）。
２．インビボにおけるユビキチン化分析
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡをコードするプラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴおよびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βＷＴの各々３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図２８）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ１１５Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図２８）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡをコードするプラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴおよびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βＷＴの各々３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図２８）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ１１５Ｒ）と、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図２８）。
免疫沈降のために得られたサンプルは、溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８および１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶解した後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０）一次抗体と混合して４℃で一晩培養した。免疫沈降体は、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて４℃で２時間反応させて分離した。次に、溶解緩衝液で２回洗浄した。免疫ブロット法は、タンパク質サンプルを２Ｘ ＳＤＳ緩衝液と混合した後、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施して分離した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７３９２）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。
その結果、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）で免疫沈降を実施した場合、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴおよびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βＷＴにはユビキチンが結合してポリユビキチン化が形成されることによって、スメアユビキチンが探知されてバンドが濃く現れた（図２８、レーン３、４およびレーン７、８）。また、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した場合、ポリユビキチン化の形成が増加してユビキチンが探知されるバンドがさらに濃く現れた（図２８、レーン４および８）。また、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）の場合、ＷＴよりバンドが薄く、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）がユビキチンと結合できずユビキチンが少なく検出された（図２９、レーン４および８～１０）。以上の結果は、ＦＳＨがユビキチンと結合し、ユビキチン－プロテアソームシステムを通じてポリユビキチン化されて分解されることを示す。
３．タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）によるＦＳＨ－αおよびＦＳＨ－βの半減期の確認
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ１１５Ｒ）、およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）を３μｇずつＨｅＬａ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、３０分、６０分、９０分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＦＳＨの分解が抑制されることを確認した（図２７）。ヒトＦＳＨ－αの半減期は４５分であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）の半減期は９０分以上とＷＴより長く、ヒトＦＳＨ－βの半減期は３０分以内であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）の半減期は６０分以上、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）の半減期は９０分以上とＷＴより長く、その結果をグラフで示した（図３０、３１および３２）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ１１５Ｒ）、およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）を３μｇずつＨｅＬａ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、３０分、６０分、９０分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＦＳＨの分解が抑制されることを確認した（図２７）。ヒトＦＳＨ－αの半減期は４５分であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）の半減期は９０分以上とＷＴより長く、ヒトＦＳＨ－βの半減期は３０分以内であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）の半減期は６０分以上、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）の半減期は９０分以上とＷＴより長く、その結果をグラフで示した（図３０、３１および３２）。
４．細胞内におけるＦＳＨとＦＳＨ置換体によるシグナル伝達の確認
ＦＳＨシグナル伝達は、細胞内ｃＡＭＰを増加させ、それによってＰＫＡが活性になると、ＣＲＥＢＰのような転写因子などのリン酸化を調節し、また、Ｅｒｋ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達と関連することが報告されている（Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）、６：１４２、２０１５；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、４７３（１１）：１４８３－１５０１、２０１６）。
ＦＳＨシグナル伝達は、細胞内ｃＡＭＰを増加させ、それによってＰＫＡが活性になると、ＣＲＥＢＰのような転写因子などのリン酸化を調節し、また、Ｅｒｋ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達と関連することが報告されている（Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）、６：１４２、２０１５；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、４７３（１１）：１４８３－１５０１、２０１６）。
本実施例では、細胞内におけるＦＳＨ－αとＦＳＨ－α置換体およびＦＳＨ－βとＦＳＨ－β置換体によるシグナル伝達過程を確認した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ１１５Ｒ）、およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）を各々３μｇずつ用いてＨｅＬａ細胞を感染させた。感染して２日経過後、細胞からタンパク質を抽出して各々定量化し、細胞内シグナル伝達過程を確認するためにウェスタンブロットを実施した。この過程でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ１１５Ｒ）で感染したＨｅＬａ細胞から分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２１８７６）、抗－リン酸化－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１３１Ｓ）、抗－ＡＫＴ（Ｈ－１３６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－８３１２）、抗－リン酸化－ＡＫＴ（Ｓ４７３、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２７１Ｓ）、抗－Ｅｒｋ１／２（９Ｂ３、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＭＡ０１３４）、抗－リン酸化－Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＰＡ００９０）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００～１：３０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２００４）と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ９９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－α置換体（Ｋ１１５Ｒ）は、ＨｅＬａ細胞内でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－αＷＴと同一であるかまたは増加したリン酸化－ＡＫＴシグナル伝達を示し、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１０４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－β置換体（Ｋ１２８Ｒ）は、ＨｅＬａ細胞内でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＦＳＨ－βＷＴと同一であるかまたは増加したリン酸化－ＳＴＡＴ３、リン酸化－ＡＫＴおよびリン酸化－Ｅｒｋ１／２シグナル伝達を示した（図３３）。
実施例５：ＡＮＧＰＴ－１タンパク質のユビキチン化分析および半減期増加の確認と細胞内シグナル伝達の確認
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＡＮＧＰＴ－１ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図３４、ＡＮＧＰＴ－１のアミノ酸配列：配列番号４１）、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図３５）。また、図３４のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図３５）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために６０℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で１分３０秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図３４のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。ｍｙｃに結合されたＡＮＧＰＴ－１タンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図３６）。
１．発現ベクターへのクローニングおよびタンパク質発現の確認
（１）発現ベクタークローニング
重合酵素連鎖反応によるＡＮＧＰＴ－１ ＤＮＡ増幅産物とｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ（５．６ｋｂ）を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより切片を作った後に接合してクローニングし（図３４、ＡＮＧＰＴ－１のアミノ酸配列：配列番号４１）、その結果は制限酵素により切断後にアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図３５）。また、図３４のヌクレオチド配列上に下線と太字で表示された部分はクローニング部位を再度確認するために重合酵素連鎖反応を通じて確認する時に用いられたプライマーセットの一部であり、その結果はアガロースゲル電気泳動を通じて確認した（図３５）。重合酵素連鎖反応の条件は以下のとおりである；初期変性を９４℃で３分間反応させた後、変性反応のために９４℃で３０秒間、アニーリング反応のために６０℃で３０秒間、延長反応のために７２℃で１分３０秒間を２５サイクルで繰り返して実行し、その後、７２℃で１０分間反応させた。このように作製されたＤＮＡがタンパク質としてろくに発現するかを確認するために、図３４のマップに表示されたｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃベクターに存在するｍｙｃを抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）抗体を用いてウェスタンブロットを通じてその発現を確認した。ｍｙｃに結合されたＡＮＧＰＴ－１タンパク質がよく発現したことを確認し、アクチンで確認したブロットを通じて適正量がロードされたことを確認した（図３６）。
（２）リジン（Ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）残基の置換
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＡＮＧＰＴ－１ Ｋ１７５Ｒ ＦＰ ５’－ＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡ－３’（配列番号４２）、ＲＰ ５’－ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴ－３’（配列番号４３）、ＡＮＧＰＴ－１ Ｋ２１６Ｒ ＦＰ ５’－ＡＣＣＴＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＡ－３’（配列番号４４）、ＲＰ ５’－ＴＴＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＧＴ－３’（配列番号４５）、ＡＮＧＰＴ－１ Ｋ４１４Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣ－３’（配列番号４６）、ＲＰ ５’－ＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣ－３’（配列番号４７）を作製した後、特定の条件でＰＣＲを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１をテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表５）。
部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてリジン残基をアルギニンで置換し、特定の突然変異を誘発するＤＮＡ配列を用いてプライマー（ＡＮＧＰＴ－１ Ｋ１７５Ｒ ＦＰ ５’－ＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡ－３’（配列番号４２）、ＲＰ ５’－ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴ－３’（配列番号４３）、ＡＮＧＰＴ－１ Ｋ２１６Ｒ ＦＰ ５’－ＡＣＣＴＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＡ－３’（配列番号４４）、ＲＰ ５’－ＴＴＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＧＴ－３’（配列番号４５）、ＡＮＧＰＴ－１ Ｋ４１４Ｒ ＦＰ ５’－ＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣ－３’（配列番号４６）、ＲＰ ５’－ＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣ－３’（配列番号４７）を作製した後、特定の条件でＰＣＲを実行することによって特定のアミノ酸残基を置換させたプラスミドＤＮＡを作製した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１をテンプレートとして用い、リジン残基がアルギニンで置換（Ｋ→Ｒ）された３個のプラスミドＤＮＡを作製した（表５）。
２．インビボにおけるユビキチン化分析
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡをコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図３７）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図３８）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡをコードするプラスミドを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を感染させた。ユビキチン化過程を確認するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴ ３μｇとｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇを細胞に共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後にＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図３７）。また、ＷＴと置換体の間のユビキチン化レベルを比較するために、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）およびｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）の各々３μｇをｐＭＴ１２３－ＨＡ－ユビキチンＤＮＡ １μｇと共にＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を共トランスフェクション（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後に免疫沈降分析を実施した（図３８）。
免疫沈降のために得られたサンプルは、溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８および１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）で溶解した後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０）一次抗体と混合して４℃で一晩培養した。免疫沈降体は、タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて４℃で２時間反応させて分離した。次に、溶解緩衝液で２回洗浄した。免疫ブロット法は、タンパク質サンプルを２Ｘ ＳＤＳ緩衝液と混合した後、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施して分離した。分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－７３９２）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。
その結果、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）で免疫沈降を実施した場合、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴにはユビキチンが結合してポリユビキチン化が形成されることによって、スメアユビキチンが探知されてバンドが濃く現れた（図３７、レーン３および４）。また、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）を６時間処理した場合、ポリユビキチン化の形成が増加してユビキチンが探知されるバンドがさらに濃く現れた（図３７、レーン４）。また、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）の場合、ＷＴよりバンドが薄く、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）がユビキチンと結合できずユビキチンが少なく検出された（図３８、レーン３～５）。以上の結果は、ＡＮＧＰＴ－１がユビキチンと結合し、ユビキチン－プロテアソームシステムを通じてポリユビキチン化されて分解されることを示す。
３．タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）によるＡＮＧＰＴ－１の半減期の確認
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）を３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、３０分、６０分および９０分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＡＮＧＰＴ－１の分解が抑制されることを確認した（図３９および４０）。ヒトＡＮＧＰＴ－１の半減期は２０分以内であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）の半減期は３０分以上としてＷＴより長く、その結果はグラフで示した（図３９および４０）。
ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）を３μｇずつＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。トランスフェクションして４８時間後、タンパク質生成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）を処理し、３０分、６０分および９０分にかけて半減期を測定した。その結果、ヒトＡＮＧＰＴ－１の分解が抑制されることを確認した（図３９および４０）。ヒトＡＮＧＰＴ－１の半減期は２０分以内であるのに対し、ヒトｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）の半減期は３０分以上としてＷＴより長く、その結果はグラフで示した（図３９および４０）。
４．細胞内におけるＡＮＧＰＴ－１とＡＮＧＰＴ－１置換体によるシグナル伝達の確認
ＡＮＧＰＴ－１は、細胞内ＡＮＧＰＴＴＩＥシグナル伝達経路によってＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を活性化し、その後、内皮細胞間の相互作用および細胞成長に関与することが報告されている（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１０（８）：５７５－５８５、２０１０）。
ＡＮＧＰＴ－１は、細胞内ＡＮＧＰＴＴＩＥシグナル伝達経路によってＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を活性化し、その後、内皮細胞間の相互作用および細胞成長に関与することが報告されている（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１０（８）：５７５－５８５、２０１０）。
本実施例では、細胞内におけるＡＮＧＰＴ－１とＡＮＧＰＴ－１置換体によるシグナル伝達過程を確認した。ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）を各々５μｇずつ用いてＨｅＬａ細胞を感染させた。感染して２日経過後、細胞からタンパク質を抽出して各々定量化し、細胞内シグナル伝達過程を確認するためにウェスタンブロットを実施した。この過程でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）で感染したＨｅＬａ細胞から分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗－ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４０）、抗－ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２１８７６）、抗－リン酸化－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１３１Ｓ）、抗－ＡＫＴ（Ｈ－１３６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－８３１２）、抗－リン酸化－ＡＫＴ（Ｓ４７３、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２７１Ｓ）、抗－Ｅｒｋ１／２（９Ｂ３、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＭＡ０１３４）、抗－リン酸化－Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ ＬＦ－ＰＡ００９０）および抗－β－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－４７７７８）を１：１０００～１：３０００の重量比で含むブロッキング溶液と抗－ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２００４）と抗－マウス（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＫＰＬ、０７４－１８０６）二次抗体を用いてＥＣＬシステム（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で現像した。その結果、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ１７５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ２１６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１置換体（Ｋ４１４Ｒ）は、ＨｅＬａ細胞内でｐｃＤＮＡ３－ｍｙｃ－ＡＮＧＰＴ－１ ＷＴと同一であるかまたは増加したリン酸化－ＡＫＴおよびリン酸化－Ｅｒｋ１／２シグナル伝達を示した（図４１）。
本発明によると、半減期が増加したタンパク質または（ポリ）ペプチドが提供される。したがって、本発明は、治療剤として利用できるタンパク質または（ポリ）ペプチドに関し、製薬産業および美容産業に有用に利用できるものである。
Claims (31)
- タンパク質または（ポリ）ペプチドにおいてユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）のＣ末端のグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）と結合するリジン（ｌｙｓｉｎｅ）のうち一つ以上をアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）で置換することを含む、タンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期（ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）を増加させる方法。
- 前記タンパク質がＥＧＦであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ＥＧＦが配列番号１のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端から２８および４８番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がＰＤＧＦＡであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ＰＤＧＦＡが配列番号６のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端から１６０、１６５および２０６番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がＰＤＧＦＢであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ＰＤＧＦＢが配列番号７のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端から１６２、１６７および１７９番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項６に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がＧＭ－ＣＳＦであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ＧＭ－ＣＳＦが配列番号２０のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端から８９、９１および１０２番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項８に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がＦＳＨ－αであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ＦＳＨ－αが配列番号２７のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端から７５、９９および１１５番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項１０に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がＦＳＨ－βであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ＦＳＨ－βが配列番号２８のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端から６７、１０４および１２８番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項１２に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記タンパク質がＡＮＧＰＴ－１であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 前記ＡＮＧＰＴ－１が配列番号４１のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端から１７５、２１６および４１４番目の位置のリジン残基のうち一つ以上をアルギニンで置換することを特徴とする、請求項１４に記載のタンパク質または（ポリ）ペプチドの半減期を増加させる方法。
- 増加した半減期を有するタンパク質であって、前記タンパク質のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換され、前記置換されたリジン残基はユビキチンのＣ末端グリシンと結合することを特徴とする、増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記増加した半減期を有するタンパク質は、成長ホルモン放出ホルモン（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α ｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－β）、インターフェロン受容体（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ、ＣＳＦｓ）、グルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ）、インターロイキン受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、酵素（ｅｎｚｙｍｅｓ）、インターロイキン結合タンパク質（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、サイトカイン結合タンパク質（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）、マクロファージ活性因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、マクロファージペプチド（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｂ細胞因子（Ｂ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、Ｔ細胞因子（Ｔ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、アレルギー阻害剤（ａｌｌｅｒｇｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、細胞壊死糖タンパク質（ｃｅｌｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）、リンフォトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、腫瘍抑制因子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）、転移成長因子（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、α－１抗トリプシン（ａｌｐｈａ－１ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、α－ラクトアルブミン（ａｌｐｈａ－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、アポリポタンパク質－Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ－Ｅ）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、高度グリコシル化エリスロポエチン（ｈｉｇｈｌｙ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ）、ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、トロンビン受容体活性ペプチド（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、トロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）、第ＶＩＩ因子（ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ）、第ＶＩＩＩ因子（ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ｆａｃｔｏｒ ＩＸ）、第ＸＩＩＩ因子（ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩ）、プラスミノゲン活性因子（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、タンパク質Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）、Ｃ－反応性タンパク質（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、レニン阻害剤（ｒｅｎｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、コラゲナーゼ阻害剤（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、上皮成長因子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、アンギオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）、骨成長因子（ｂｏｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、骨刺激タンパク質（ｂｏｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、アトリオペプチン（ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｎ）、軟骨誘導因子（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、フィブリン結合ペプチド（ｆｉｂｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、結合組織活性因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、組織因子経路阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、レラキシン（ｒｅｌａｘｉｎ）、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、ソマトメジン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、副腎皮質ホルモン（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ）、グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎ）、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）、膵臓ポリペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ガストリン放出ペプチド（ｇａｓｔｒｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、オートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、受容体拮抗薬（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）、細胞表面抗原（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ウイルス由来ワクチン抗原（ｖｉｒｕｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）または抗体フラグメントであることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号１を有するＥＧＦであり、そのＮ末端から２８および４８番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号６を有するＰＤＧＦＡであり、そのＮ末端から１６０、１６５および２０６番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号７を有するＰＤＧＦＢであり、そのＮ末端から１６２、１６７および１７９番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号２０を有するＧＭ－ＣＳＦであり、そのＮ末端から８９、９１および１０２番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号２７を有するＦＳＨ－αであり、そのＮ末端から７５、９９および１１５番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号２８を有するＦＳＨ－βであり、そのＮ末端から６７、１０４および１２８番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号４１を有するＡＮＧＰＴ－１であり、そのＮ末端から１７５、２１６および４１４番目の位置のリジン残基のうち一つ以上がアルギニンで置換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の増加した半減期を有するタンパク質。
- 請求項１８に記載のＥＧＦおよび賦形剤を含む、細胞成長、皮膚およびヘアの再生および／または治療のための薬学および／または美容組成物。
- 請求項１９に記載のＰＤＧＦＡまたは請求項２０に記載のＰＤＧＦＢおよび賦形剤を含む、細胞成長、血管生成および慢性潰瘍と骨損失の回復のための薬学および／または美容組成物。
- 請求項２１に記載のＧＭ－ＣＳＦおよび薬剤学的に許容される賦形剤を含む、好中球減少症の予防および／または免疫疾患および／または固形癌および血液癌を含む癌および／またはリウマチ関節炎の予防および／または治療用の薬学組成物。
- 請求項２２に記載のＦＳＨ－αまたは請求項２３に記載のＦＳＨ－βおよび薬剤学的に許容される賦形剤を含む、過排卵誘導のための不妊治療剤および／または固形癌治療用の薬学組成物。
- 請求項２４に記載のＡＮＧＰＴ－１および薬剤学的に許容される賦形剤を含む、糖尿病、心臓疾患および／または敗血症治療用の薬学組成物。
- （ａ）プロモータ、（ｂ）請求項１６～２４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および任意のリンカーを含む発現ベクターであって、前記プロモータとヌクレオチド配列が作動的に連結されたものである、発現ベクター。
- 請求項３０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
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