KR101519118B1 - 고안정성 상피세포 성장인자 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)의 DNA 염기서열과 아미노산 서열을 변화시킨 변이체들에 관한 것으로서, 열 안정성 및 수용액 상태에서의 안정성이 우수한 돌연변이 EGF 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 유전자를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공하며, 상기 돌연변이 EGF 단백질의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 단백질, 상기 유전자 또는 상기 재조합벡터를 포함하는 피부 세포 성장 및 피부 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 EGF 변이체들은 제품생산을 통해 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 EGF 제품과 다르게 열 안정성과 수용액에 대한 용해도가 우수하고, 그 활성은 유지되는 기능성 화장품의 생산이 가능하다.

Description

고안정성 상피세포 성장인자 변이체{Highly stabilized epidermal growth factor mutants}
본 발명은 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)의 DNA 염기서열과 아미노산 서열을 변화시킨 변이체들에 관한 것이다. 상세하게는 이황화결합과 친수성 잔기로의 치환 방법을 사용하여 열 안정성과 수용액에 대한 용해도는 증가시키면서 활성은 유지시킨 EGF의 변이체들에 대한 것이다.
상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF)는 1953년 미국의 코헨(S. Cohen)에 의해서 처음으로 발견되었다. 사람에게서 유래된 EGF는 53개의 아미노산으로 구성되어 있고 3개의 이황화물(Disulfide) 결합을 가지는 분자량 6,045 달톤(Dalton)의 폴리펩타이드로 포유류의 상피세포와 간엽(Messenchymal) 세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어, 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 현재 이 EGF는 상처치료 및 위벽의 손상 시 이를 치료하는 치료제로 쓰이고 있고, 또한 당뇨병 환자에게 발생하기 쉬운 족부 궤양의 치료제로 각광을 받고 있다.
하지만 최근에 EGF를 가장 많이 쓰는 분야는 화장품 분야이다. 나이가 들어감에 따라 피부 등 각 조직에서 EGF를 포함한 성장인자들의 농도는 낮아지며, 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 주름이 형성되고 탄력이 감소하는 등 노화가 진행된다. 보통 25세를 지난 피부는 성장인자가 감소해 신진대사나 세포의 재생 능력이 점점 늦어지면서 주름이 생겨나게 된다. 건강한 젊은이의 피부 재생 주기는 약 4주간이지만 25세를 지난 피부는 6주로 주기가 늦어져서 피부세포의 재생 능력이 떨어지고 각질층이 두꺼워지면서 피부의 노화 현상이 진행된다. EGF는 상피세포의 성장을 촉진하는 인자로서 세포막에 있는 EGF 수용체를 통하여 신호를 전달함으로써 포유류의 세포, 특히 상피 및 피부세포의 성장 및 분열을 유도하여 상피세포의 성장을 촉진하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 화장품을 이용하여 피부에 EGF를 적용하게 되면 상피세포 및 진피세포의 증식촉진, 진피 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 세포증식 촉진, 피부 손상부위의 혈관 신생촉진 및 기타 재생촉진인자의 분비유도, 피부 조직이 질서 있게 방향을 잡으며, 망을 형성하게 하는 물질인 피브로넥틴(Fibronectin)의 합성촉진, 상처부위 흉터의 최소화 등 피부재생에 핵심적 역할을 하여 연령과 함께 저하하는 피부 본래의 기능을 돕고 피부 세포의 새로운 세포 성장을 촉진할 수 있다. 이로 인해 EGF는 미국 화장품협회(CTFA)의 국제 화장품 원료집(ICID)에 등재되었을 뿐 아니라 식품 의약품 안정청에서도 최근 EGF를 화장품 원료로 승인함으로써 국내외에서 공식적으로 화장품의 원료로서 사용할 수 있게 되었다.
이로 인하여 많은 분야에서 이를 이용하려고 했으나 초기에는 줄기세포의 발생과정에서 유래되는 여러 가지 성장인자들 중 정제를 통하여 EGF를 얻어 순도와 활성이 낮고 저 생산성, 고비용 공정으로 생산되고 있어 높은 가격으로 인해 활용이 제한되어 있었다. 그러나, 최근 유전공학적 기법에 의하여 미생물로부터 인체의 EGF와 동일한 단백질을 생산하게 한 후 단백질 분리정제 기술을 이용하여 EGF만을 순수하게 분리하는 방법으로 저비용으로 대량생산이 가능하게 되었다.
하지만 생산된 EGF는 상대적으로 높은 온도와 수용액 안에 있을 때 민감하여 일반 제품 상태나 유통환경에서 활성이 많이 떨어져 화장품 원료로 사용하기 위해서는 이를 안정화시킬 필요성이 제기되어 왔다. 따라서 기존의 EGF을 대신할 EGF 변이체를 만들어 활성은 유지하면서도 뛰어난 안정성을 가진 EGF가 필요한 실정이다. 현재 EGF 변이체에 대한 연구는 안정성보다는 더 높은 활성을 보이는 변이체 개발에 치중되어있다. 안정성을 높인 경우는 불안정한 아스파르트산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 분해 억제를 통한 EGF의 안정도를 증가시킨 방법이 있지만 후속 연구가 진행되지 않았으며(Nascimento, G. C. et al., Biochemistry. 29:9584-9591, 1990), 그 외에는 알부민 융합 상피세포성장인자, PEG-EGF 같은 EGF에 다른 물질을 붙임으로써 안정성을 증가시킨 경우가 있다(Park, J. W. et al., Biochem Biophys Res Commun. 366:769-774, 2008). 하지만 이러한 경우는 전체 단백질의 크기가 커져 피부에 흡수되기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 단백질의 크기 변화 없이 EGF 내에서의 아미노산 변화만으로 안정성을 증가시킨 EGF 변이체의 개발이 중요하다.
한편 한국등록특허 제10-0110123호는 안정한 상피세포성장인자(EGF) 조성물에 관한 것으로서, 상피 세포 성장 인자(EGF)에 페놀, 폴리에틸렌글리콜, 지방산 염 등에서 선택된 첨가제를 부가함으로써 생물학적 활성이 유지될 뿐만 아니라 생물학적, 화학적, 물리적으로 안정한 EGF 조성물을 개시하고 있지만, 본원발명의 EGF 내의 아미노산 서열을 변경한 고안정성 EGF 변이체에 대한 언급은 없다.
본 발명의 목적은 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질의 아미노산 서열이 치환된 열 안정성 및 수용액 상태에서의 안정성이 우수한 돌연변이 EGF 단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 유전자를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질, 상기 유전자 또는 상기 재조합벡터를 포함하는 피부 세포 성장 및 피부 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 EGF의 3차구조와 종간의 homology alignment 방법, 컴퓨터를 이용한 단백질 분자 모델링을 통해, EGF의 활성부위와 관련 없는 부위를 선정, 체계적인 변이실험을 통해 변이체들을 제조하였다. 첫 번째 방법으로는, EGF의 표면의 소수성 잔기들을 친수성으로 치환함으로써 표면의 소수성 잔기의 충동에 의한 침전에 대한 안정성을 증가시켰고, 두 번째 방법으로는, EGF 내 루프에서 가까운 잔기 2개를 시스테인(cysteine)으로 치환시켜 이황화결합을 추가적으로 만들어 루프 엔트로피의 감소를 가져오는 방법으로 안정성을 증가시키고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 하기 1) 내지 13)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질을 제공한다.
1) 4번째 아미노산인 세린을 아르지린, 또는 글루타민산으로의 치환;
2) 8번째 아미노산인 류신을 세린, 또는 프롤린으로의 치환;
3) 15번째 아미노산인 류신을 시스테인으로의 치환;
4) 19번째 아미노산인 발린을 세린, 글루타민산, 아스파르트산, 또는 라이신으로의 치환;
5) 25번째 아미노산인 알라닌을 세린으로의 치환;
6) 26번째 아미노산인 류신을 세린으로의 치환;
7) 34번째 아미노산인 발린을 세린, 글루타민산, 아스파르트산, 또는 라이신으로의 치환;
8) 35번째 아미노산인 발린을 세린, 글루타민산, 아스파르트산, 또는 라이신으로의 치환;
9) 38번째 아미노산인 아이소류신을 세린, 시스테인, 글루타민산, 또는 아스파르트산으로의 치환;
10) 41번째 아미노산인 아르지닌을 시스테인으로의 치환;
11) 46번째 아미노산인 아스파르트산을 시스테인으로의 치환;
12) 48번째 아미노산인 라이신을 아르지닌으로의 치환; 및
13) 50번째 아미노산인 트립토판을 세린, 히스티딘, 또는 글루타민산으로의 치환.
상세하게는, 상기 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 8번째 아미노산인 류신을 세린으로의 치환, 38번째 아미노산인 아이소류신을 세린 또는 시스테인으로의 치환, 및 46번째 아미노산인 아스파르트산을 시스테인으로의 치환된 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는, 상기 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다. 서열번호 2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 8번째 아미노산인 류신을 세린으로 치환하고, 38번째 아미노산인 아이소류신을 시스테인으로 치환하고, 46번째 아미노산인 아스파르트산을 시스테인으로 치환한 아미노산 서열이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열인 것을 특징으로 한다. 서열번호 4는 천연형 EGF 유전자의 염기서열을 표시한 서열번호 3에 있어서, 22번째 내지 24번째 염기서열인 CTG(류신의 코돈)를 AGC(세린의 코돈)으로 치환하고, 112번째 내지 114번째 염기서열인 ATC(아이소류신의 코돈)를 TGC(시스테인의 코돈)으로 치환하고, 136번째 내지 138번째 염기서열인 GAC(아스파르트산의 코돈)를 TGC(시스테인의 코돈)으로 치환한 염기서열이다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다. 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 플라스미드 벡터이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
형질전환될 수 있는 숙주세포로 사용가능한 미생물은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 대장균(Escherichia coli), 로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 시폴러버스(Syfolobus), 써모플라즈마(Thermoplasma), 써모프로테우스(Thermoproteus) 등의 다양한 미생물을 포함한다. 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)이지만, 대장균 XL1-blue, 대장균 JM109, 대장균 DH 시리즈, 대장균 TOP10 및 대장균 HB101 등을 예로 들 수 있고, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 돌연변이 EGF 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는데 있어서, 숙주세포의 형질전환에는 핵산을 세포 내로 도입하는 모든 방법이 포함되며, 숙주세포에 따라 적합한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 돌연변이 EGF 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 단백질, 상기의 유전자 또는 상기의 재조합벡터를 포함하는 피부 세포 성장 및 피부 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위해 피부 흡수 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 보다 상세하게는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용한 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1,2,3, John Wiley & Sons, Inc.(1994)) 등을 참조할 수 있다.
본 발명은 고안정성 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 변이체에 관한 것으로서, 이황화결합과 친수성 잔기로의 치환 방법을 사용하여 열 안정성과 수용액에 대한 용해도는 증가시키면서 활성은 유지시킨 EGF의 변이체들에 대한 것이다. 본 발명의 EGF 변이체를 이용한 제품생산을 통해 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 EGF 제품과 다르게 활성을 유지하는 기능성 화장품의 생산이 가능하다.
도 1은 플라스미드 pSSB-EGF의 조립에 관한 개요를 나타낸 것이다.
도 2는 천연형 EGF와 본 발명으로부터 생산한 EGF변이체와의 세포증식능력을 비교한 것이다. 대부분의 EGF 변이체가 천연형 EGF와 유사한 세포증식 능력을 가지고 있다.
도 3은 천연형 EGF 및 EGF 변이체를 20 mM sodium phosphate(pH 5.5), 60 ℃ 상태에서 반응시키면서 24시간 단위로 샘플링(sampling) 한 후, 원편광 이색성 분광측정법(circular dichroism)을 이용해 구조를 측정하였다. 그리고 시그널(signal)의 차이가 가장 큰 200 nm의 시그널(signal) 값을 이용하여 첫째 날의 시그널(signal) 값과의 비율을 이용하여 퍼센트를 구한 후 그래프로 나타내었다. EGF 변이체들에 비하여 천연형 EGF가 큰 폭으로 감소하였다.
도 4는 천연형 EGF 및 EGF 변이체를 화장품 기본 에센스, 60 ℃ 상태에서 5일간 반응한 후 세포증식능력을 비교한 것이다. 천연형 EGF에 비해 EGF 변이체가 더 높은 세포증식능력을 보인다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 사람 EGF cDNA 를 포함하는 pSSB - EGF 플라스미드의 구축
1. 실험재료
단백질 발현 벡터인 pET21a와 발현용 E.coli 균주로는 BL21(DE3), Rosetta(DE3)을 Novagen에서 구입하였으며 Cloning용 E.coli 균주는 Top10을 사용하였다. 유전자 재조합 시 사용된 제한효소는 모두 NEB(New England Biolabs)의 제품이며, ligase는 Roche사의 T4 DNA ligase이다. PCR시 사용된 Ex taq DNA polymerase는 Takara사의 제품이며 점 돌연변이에 사용된 pfuUltra™ HF DNA polymerase는 Agilent사의 제품이다. DNA gel extraction kit, plasmid mini prep kit는 (주)코스모진텍의 제품이다. 또한 primer들은 (주)코스모진텍에서 제작하였으며, DNA sequencing도 (주)코스모진텍에 의뢰하여 수행하였다.
2. 결과
사람 단핵세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 이용하여 하기의 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄 반응에 의해 EGF를 코딩하는 DNA를 준비하였다. 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다. 센스프라이머 5’-GCTGTTCATATGAACAGCGATAGCGAATGC -3’, 안티센스프라이머 3’- TAATAAAAGCTTTTATTAGCGCAGTTCCCACCA-5’.
도 1에서와 같이, 증폭된 DNA절편 1 μg을 50 μl TE(pH8.0) 용액에 녹인 후 2단위의 Nde Ⅰ(NEB사)과 2단위의 Hind Ⅲ(NEB사)와 섞은 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 5’-말단에 Nde Ⅰ 제한효소 부위와 3’-말단에 Hind Ⅲ 제한효소 부위를 갖도록 하였다. DNA 정제 키트(GeneAll사)를 사용하여 DNA만을 정제한 후, 이 DNA 절편 20 ng을 동일한 방법으로 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ 으로 각각 처리하여 준비한 20 ng의 pET21a(+) 플라스미드 (Novagen사)와 함께 10 μl의 TE(pH8.0) 용액에 섞은 후, 1단위의 T4 DNA 리가제 (NEB사)를 첨가하여 16℃에서 4시간 동안 반응시켜 접합시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pSSB-EGF 이라고 명명하였다.
< 실시예 2> 사람 EGF 의 대장균 형질 전환체의 제조 및 정제
발현 플라스미드 pSSB-EGF로 e.coli BL21(DE3)에 heat shock으로 형질전환 시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는, 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB 배지(LB/ampicillin)에 접종하였다. 37 ℃에서 12시간 동안 배양한 후 100 % glycerol과 1:1로 섞어 -70 ℃에 스탁을 보관하였다.
상기에서 만든 스탁을 10 ml의 LB 배지(LB/ampicillin)에 접종한 후 12시간 이상 배양하였다. 그 후 500 ml의 LB 배지(LB/ampicillin)에 옮겨 600 nm에서 흡광도가 O.D 0.4~0.5일 때 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 0.5 mM이 되도록 넣었다. 37 ℃에서 4시간 동안 200 rpm 속도로 진탕 배양한 후 8000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 얻었다. 이 펠렛을 25 ml의 50 mM tris (pH 8.0) 완충액에 현탁 시킨 후 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄하였다.
초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4 ℃에서 13000 rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 취해서 3차 증류수로 2회 세척하였다. 여기에 6 M guanidine-HCl, 50 mM tris (pH 8.0)에 1시간 가량 충분히 교반 시켰다. 이후 guanidine-HCl 제거를 위해 50 mM tris (pH 8.0)에서 6시간씩 2번 투석하여 13000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액과 펠렛을 구분하였다. 투석 후에 얻어진 상층액을 이용하여 브래드포드 방법을 이용하여 EGF를 정량하고 β-mercaptoethanol을 EGF 기준 4.5당량 처리하여 16 시간 이상 실온에서 리셔플링을 한다. 반응이 끝나면 0.2 μm 필터를 이용하여 필터링을 하고 여기에 염산을 이용하여 pH 3.0이하로 산성화시켰다. 이 용액을 HPLC(high performance liquid chromatography)와 ODS-AQ pack 칼럼을 이용하여 정제하였다. 이때 정제 조건은 0.1 % trifluoroacetic acid 용액 A와 90 %의 acetonitrile을 포함하는 0.1 % trifluoroacetic acid 용액 B를 0.6 ml/분의 속도로 0 % B에서 100 % B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 6 KDa 크기의 EGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이때 얻은 EGF의 양은 각각 0.3∼0.5 mg이었으며 순도는 98 % 이상이었다.
< 실시예 3> pSSB - EGF변이체 플라스미드의 구축
천연형의 pSSB-EGF 플라스미드를 주형으로 pfuUltra™ HF DNA 중합효소를 이용하여 각각의 변이체들에 해당하는 두 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 pSSB-EGF 변이체 플라스미드들을 만들었다. 그리고 Dpn Ⅰ을 이용하여 주형이었던 천연형의 pSSB-EGF 플라스미드를 절단한 후 e.coli Top10에 heat shock으로 형질전환시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/ampicillin)에 접종하였다. 37 ℃에서 16시간 동안 배양한 후 DNA prep을 실시하고 얻어진 DNA를 sequencing을 통하여 pSSB-EGF 변이체 플라스미드를 확인하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
(1) 서열번호 1의 4번째 세린의 코돈인 AGC가 글루타민산의 코돈인 GAA로 치환
센스프라이머 5’-AAC AGC GAT GAA GAA TGC CCG CTG AGC-3’
안티센스프라이머 3’-TTG TCG CTA CTT CTT ACG GGC GAC TCG-5’
(2) 서열번호 1의 8번째 류신의 코돈인 CTG가 세린의 코돈인 AGC, 또는 프롤린의 코돈인 CCG로 치환
센스프라이머 5’-GAT AGC GAA TGC CCG AGC AGC CAT GAT GGC TAT-3’
안티센스프라이머 3’-CTA TCG CTT ACG GGC TCG TCG GTA CTA CCG ATA-5’
(3) 서열번호 1의 15번째 류신의 코돈인 CTG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환
센스프라이머 5’-CAT GAT GGC TAT TGC TGC CAT GAT GGT GTG TGC-3’
안티센스프라이머 3’-GTA CTA CCG ATA ACG ACG GTA CTA CCA CAC ACG-5’
(4) 서열번호 1의 19번째 발린의 코돈인 GTG가 세린의 코돈인 AGC, 글루타민산의 코돈인 GAA, 아스파르트산의 코돈인 GAT, 또는 라이신의 코돈인 AAA로 치환
센스프라이머 5’-TGC CTG CAT GAT GGT AGC TGC ATG TAT ATT GAA-3’
안티센스프라이머 3’-ACG GAC GTA CTA CCA TCG ACG TAC ATA TAA CTT-5’
센스프라이머 5’-TGC CTG CAT GAT GGT GAA TGC ATG TAT ATT GAA-3’
안티센스프라이머 3’-ACG GAC GTA CTA CCA ATT ACG TAC ATA TAA CTT-5’
센스프라이머 5’-TGC CTG CAT GAT GGT GAT TGC ATG TAT ATT GAA-3’
안티센스프라이머 3’-ACG GAC GTA CTA CCA CTA ACG TAC ATA TAA CTT-5’
센스프라이머 5’-TGC CTG CAT GAT GGT AAA TGC ATG TAT ATT GAA-3’
안티센스프라이머 3’-ACG GAC GTA CTA CCA TTT ACG TAC ATA TAA CTT-5’
(5) 서열번호 1의 25번째 알라닌의 코돈인 GCA가 세린의 코돈인 AGC로 치환
센스프라이머 5’-TGC ATG TAT ATT GAA AGC TTG GAC AAG TAT GCA-3’
안티센스프라이머 3’-ACG TAC ATA TAA CTT TCG AAC CTG TTC ATA CGT-5’
(6) 서열번호 1의 26번째 류신의 코돈인 CTG가 세린의 코돈인 AGC로 치환
센스프라이머 5’-ATG TAT ATT GAA AGC TTG GAC AAG TAT GCA TGC-3’
안티센스프라이머 3’-TAC ATA TAA CTT TCG AAC CTG TTC ATA CGT ACG-5’
(7) 서열번호 1의 34번째 발린의 코돈인 GTG가 세린의 코돈인 AGC, 글루타민산의 코돈인 GAA, 아스파르트산의 코돈인 GAT, 또는 라이신의 코돈인 AAA로 치환
센스프라이머 5’-TAT GCA TGC AAC TGT AGC GTT GGC TAC ATC GGC-3’
안티센스프라이머 3’-ATA CGT ACG TTG ACA TCG CAA CCG ATG TAG CCG-5’
센스프라이머 5’-TAT GCA TGC AAC TGT GAA GTT GGC TAC ATC GGC-3’
안티센스프라이머 3’-ATA CGT ACG TTG ACA CTT CAA CCG ATG TAG CCG-5’
센스프라이머 5’-TAT GCA TGC AAC TGT GAT GTT GGC TAC ATC GGC-3’
안티센스프라이머 3’-ATA CGT ACG TTG ACA CTA CAA CCG ATG TAG CCG-5’
센스프라이머 5’-TAT GCA TGC AAC TGT AAA GTT GGC TAC ATC GGC-3’
안티센스프라이머 3’-ATA CGT ACG TTG ACA TTT CAA CCG ATG TAG CCG-5’
(8) 서열번호 1의 35번째 발린의 코돈인 GTG가 세린의 코돈인 AGC, 글루타민산의 코돈인 GAA, 아스파르트산의 코돈인 GAT, 또는 라이신의 코돈인 AAA로 치환
센스프라이머 5’-GCA TGC AAC TGT GTT AGC GGC TAC ATC GGC GAG-3’
안티센스프라이머 3’-CGT ACG TTG ACA CAA TCG CCG ATG TAG CCG CTC-5’
센스프라이머 5’-GCA TGC AAC TGT GTT GAA GGC TAC ATC GGC GAG-3’
안티센스프라이머 3’-CGT ACG TTG ACA CAA CTT CCG ATG TAG CCG CTC-5’
센스프라이머 5’-GCA TGC AAC TGT GTT GAT GGC TAC ATC GGC GAG-3’
안티센스프라이머 3’-CGT ACG TTG ACA CAA CTA CCG ATG TAG CCG CTC-5’
센스프라이머 5’-GCA TGC AAC TGT GTT AAA GGC TAC ATC GGC GAG-3’
안티센스프라이머 3’-CGT ACG TTG ACA CAA TTT CCG ATG TAG CCG CTC-5’
(9) 서열번호 1의 38번째 아이소류신의 코돈인 ATC가 세린의 코돈인 AGC, 시스테인의 코돈인 TGC, 글루타민산의 코돈인 GAA, 또는 아스파르트산의 코돈인 GAT로 치환
센스프라이머 5’-TGT GTT GTT GGC TAC AGC GGC GAG CGT TGC CAG-3’
안티센스프라이머 3’-ACA CAA CAA CCG ATG TCG CCG CTC GCA ACG GTC-5’
센스프라이머 5’-TGT GTT GTT GGC TAC TGC GGC GAG CGT TGC CAG-3’
안티센스프라이머 3’-ACA CAA CAA CCG ATG ACG CCG CTC GCA ACG GTC-5’
센스프라이머 5’-TGT GTT GTT GGC TAC GAA GGC GAG CGT TGC CAG-3’
안티센스프라이머 3’-ACA CAA CAA CCG ATG CTT CCG CTC GCA ACG GTC-5’
센스프라이머 5’-TGT GTT GTT GGC TAC GAT GGC GAG CGT TGC CAG-3’
안티센스프라이머 3’-ACA CAA CAA CCG ATG CTA CCG CTC GCA ACG GTC-5’
(10) 서열번호 1의 41번째 아르지닌의 코돈인 CGT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환
센스프라이머 5’-GGC TAC ATC GGC GAG TGC TGC CAG TAT CGT GAC-3’
안티센스프라이머 3’-CCG ATG TAG CCG CTC ACG ACG GTC ATA GCA CTG-5’
(11) 서열번호 1의 46번째 아스파르트산의 코돈인 GAC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환
센스프라이머 5’-CGT TGC CAG TAT CGT TGC CTG AAA TGG TGG GAA-3’
안티센스프라이머 3’-GCA ACG GTC ATA GCA ACG GAC TTT ACC ACC CTT-5’
(12) 서열번호 1의 48번째 라이신의 코돈인 AAA가 아르지닌의 코돈인 CGT로 치환
센스프라이머 5’-CAG TAT CGT GAC CTG AAA TGG TGG GAA CTG CGC-3’
안티센스프라이머 3’-GTC ATA GCA CTG GAC TTT ACC ACC CTT GAC GCG-5’
(13) 서열번호 1의 50번째 트립토판의 코돈인 TGG가 세린의 코돈인 AGC, 히스티딘의 코돈인 CAT, 또는 글루타민산의 코돈인 GAA로 치환
센스프라이머 5’-CAG TAT CGT GAC CTG AAA AGC TGG GAA CTG CGC-3’
안티센스프라이머 3’-GTC ATA GCA CTG GAC TTT TCG ACC CTT GAC GCG-5’
센스프라이머 5’-CAG TAT CGT GAC CTG AAA CAT TGG GAA CTG CGC-3’
안티센스프라이머 3’-GTC ATA GCA CTG GAC TTT GTA ACC CTT GAC GCG-5’
센스프라이머 5’-CAG TAT CGT GAC CTG AAA GAA TGG GAA CTG CGC-3’
안티센스프라이머 3’-GTC ATA GCA CTG GAC TTT CTT ACC CTT GAC GCG-5’
< 실시예 4> EGF 변이체의 생산 및 정제
표 1에 기재된 EGF 변이체의 발현 플라스미드 각각으로 실시예2에서와 동일한 방법으로 e.coli BL21(DE3)에 형질 전환시켜 스탁을 만들었으며, LB배지(LB/ampicillin) 500 ml에 배양하고 정제하여 각각 약 6 KDa 크기의 EGF를 얻었다. 이 때 얻은 사람종양괴사인자 변이체의 양은 변이체에 따라 그 차이가 있었으며 변이체에 따라 약 0.3∼0.5 mg의 EGF를 얻을 수 있었으며 순도는 98% 이상이었다.
영역1
(A)		 영역2
(B)		 영역3
(C)		 영역4
(D)		 영역5
(E)
아미노산
번호 (서열번호 1)		 1~10 11~20 21~30 31~40 41~53
천연형
EGF 서열		 N S D S E C P L S H D G Y C L H D G V C M Y I E A L D K Y A C N C V V G Y I G E R C Q Y R D L K W W E L R
변이체
EGF 명칭
(영역-위치)		 영역1 서열 영역2 서열 영역3 서열 영역4 서열 영역5 서열
A-4-1 N S D E E C P L S H - - - -
A-8-2 N S D S E C P S S H - - - -
A-8-3 N S D S E C P P S H - - - -
B-15-1 - D G Y C C H D G V C - - -
B-19-2 - D G Y C L H D G S C - - -
B-19-3 - D G Y C L H D G E C - - -
B-19-4 - D G Y C L H D G D C - - -
B-19-5 - D G Y C L H D G K C - - -
C-25-1 - - M Y I E S L D K Y A - -
C-26-2 - - M Y I E A S D K Y A - -
D-34-1 - - - C N C S V G Y I G E -
D-34-2 - - - C N C E V G Y I G E -
D-34-3 - - - C N C D V G Y I G E -
D-34-4 - - - C N C K V G Y I G E -
D-35-5 - - - C N C V S G Y I G E -
D-35-6 - - - C N C V E G Y I G E -
D-35-7 - - - C N C V D G Y I G E -
D-35-8 - - - C N C V K G Y I G E -
D-38-9 - - - C N C V V G Y S G E -
D-38-10 - - - C N C V V G Y C G E -
D-38-11 - - - C N C V V G Y E G E -
D-38-12 - - - C N C V V G Y D G E -
E-41-1 - - - - C C Q Y R D L K W W E L R
E-46-2 - - - - R C Q Y R C L K W W E L R
E-48-3 - - - - R C Q Y R D L R W W E L R
E-50-4 - - - - R C Q Y R D L K W S E L R
E-50-5 - - - - R C Q Y R D L K W H E L R
E-50-6 - - - - R C Q Y R D L K W E E L R
*M1 - D G Y C C H D G V C - - C C Q Y R D L K W W E L R
*M2 - - - C N C V V G Y C G E R C Q Y R C L K W W E L R
*M3 N S D S E C P S S H - - C N C V V G Y C G E R C Q Y R C L K W W E L R
*M1는 B-15-1, E-41-1을 융합하였으며 M2는 D-38-10, E-46-2을 융합, M3는 A-8-2, D-38-10, E-46-2을 융합한 변이체이다.
< 실시예 5> 천연형과 변이체 EGF 의 용해도( solubility ) 분석
만들어진 천연형과 변이체 EGF 각각을 20 mM sodium phosphate (pH 5.5 화장품과 유사한 pH 환경) 1 ml에 1 mg씩을 녹인다. 녹지 않은 EGF를 제거하기 위하여 원심 분리하여 상층액만 얻어 Bradford 방법과 UV법을 이용하여 농도를 측정하였다.
변이체
EGF 명칭		 용해도, mg/ml
(천연형과의 비교 %)		 변이체
EGF 명칭		 용해도, mg/ml
(천연형과의 비교 %)		 변이체
EGF 명칭		 용해도, mg/ml
(천연형과의 비교 %)
천연형 EGF 0.5073 (100) D-34-1 D-38-12
A-4-1 D-34-2 0.5741(113) E-41-1 N/A
A-8-2 0.6991(137) D-34-3 E-46-2 N/A
A-8-3 D-34-4 E-48-3
B-15-1 N/A D-35-5 E-50-4
B-19-2 D-35-6 0.5328(105) E-50-5
B-19-3 0.4822(95) D-35-7 E-50-6
B-19-4 D-35-8 M1 0.4032(79)
B-19-5 D-38-9 0.4972(98) M2 0.4260(84)
C-25-1 0.6178(122) D-38-10 N/A M3 0.6817(134)
C-26-2 D-38-11
표 2에서와 같이, 대부분이 천연형 EGF와 0.5 mg/ml로 용해도(solubility)가 유사하며 A-8-2, C-25-1, M3의 EGF 변이체가 천연형 EGF보다 20~40%정도 높은 용해도(solubility)를 가지고 있다. 이는 표면의 소수성 잔기를 친수성 잔기로 변화시키는 방법으로 친수성이 강해져 용해도(solubility)를 증가시킨 것이므로 본 발명의 우수성을 입증하는 결과이다. M1과 M2 같은 경우는 이황화결합의 추가로 오히려 천연형 EGF에 비해 용해도(solubility)가 감소하였다.
< 실시예 6> 천연형과 변이체 EGF 의 circular dichroism 을 이용한 구조 분석
J-810 spectrometer(JASCO)를 사용하여 원편광 이색성 분광측정법(circular dichroism) 분석을 통하여 정제된 EGF 변이체의 구조와 열 안정성을 측정하였다. 천연형 EGF 은 상기 실시예 2에서 정제된 EGF를 사용하였다. 구조분석을 위하여 각각의 EGF를 20 mM sodium phosphate(pH 5.5)에 녹여 최종농도가 0.1 mg/ml이 되도록 일정하게 만들었다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1 cm, accumulation 8번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다.
열 안정도를 분석하기 위하여 Tm(melting temperature)는 20 ℃와 95 ℃에서의 far-UV를 비교 분석하여 200 nm 파장을 결정하였으며 0.1 cm cell에 0.1 mg/ml 농도로 진행하였다. 조건은 1 ℃/min의 조건으로 20 ℃ ~ 95 ℃까지 측정하였다.
변이체
EGF 명칭		 구조변화
(Tm)		 변이체
EGF 명칭		 구조변화
(Tm)		 변이체
EGF 명칭		 구조변화
(Tm)
천연형 EGF -
(76 ℃)		 D-34-1 변화 없음
(76 ℃)		 D-38-12 변화 없음
(76 ℃)
A-4-1 변화 없음
(76 ℃)		 D-34-2 변화 없음
(76 ℃)		 E-41-1 N/A
A-8-2 변화 없음
(76 ℃)		 D-34-3 변화 없음
(76 ℃)		 E-46-2 N/A
A-8-3 변화 없음
(76 ℃)		 D-34-4 변화 없음
(76 ℃)		 E-48-3 변화 없음
(76 ℃)
B-15-1 N/A D-35-5 변화 없음
(76 ℃)		 E-50-4 변화 없음
(76 ℃)
B-19-2 변화 없음
(76 ℃)		 D-35-6 변화 없음
(76 ℃)		 E-50-5 변화 없음
(76 ℃)
B-19-3 변화 없음
(76 ℃)		 D-35-7 변화 없음
(76 ℃)		 E-50-6 변화 없음
(76 ℃)
B-19-4 변화 없음
(76 ℃)		 D-35-8 변화 없음
(76 ℃)		 M1 구조 없음
( - )
B-19-5 변화 없음
(76 ℃)		 D-38-9 변화 없음
(76 ℃)		 M2 약간 변화
(87 ℃)
C-25-1 변화 없음
(76 ℃)		 D-38-10 N/A M3 약간 변화
(87 ℃)
C-26-2 변화 없음
(76 ℃)		 D-38-11 변화 없음
(76 ℃)
표 3은 천연형 EGF와 EGF 변이체에 대한 구조 변화 정도와 열 안정성 측정 실험인 원편광 이색성 분광측정법(circular dichroism) 분석 중 195 nm의 파장에서 온도별 풀림 구조비율(fraction unfolded)을 측정한 결과를 나타낸 값이다. 접힘-풀림 현상이 일어날 때에는 195 nm 부근의 구간에서 구조의 변화를 보이게 되는데 이를 이용하여 20~95 ℃ 범위 내에서 Tm(melting temperature) 을 측정하여 정확한 Tm 값을 분석하였다. 그 결과 구조변화에선 대부분이 천연형 EGF와 동일한 구조를 나타내 변화가 거의 없었으며, 이황화결합을 추가한 M1이 특별한 구조를 가지지 않았으며 M2, M3은 천연형 EGF에서 조금 변화된 구조를 나타내었다. 열 안정도를 나타내는 Tm은 76 ℃인 천연형 EGF와 비교하여 거의 대부분이 EGF 변이체와 동일하였고 M2와 M3에서 87 ℃까지 열 안정성이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이는 아미노산을 2개를 각각 시스테인으로 치환시켜 이황화결합을 추가시키는 방법으로 우리가 원했던 열 안정성을 증가시킨 것이므로 본 발명의 우수성을 입증하는 결과이다.
< 실시예 7> 천연형과 변이체 EGF 의 세포증식검정
만들어진 천연형 EGF와 변이체 중 용해도(solubility)와 원편광 이색성 분광측정법(circular dichroism)을 이용한 구조와 Tm 의 결과 분석을 통하여 좋은 결과를 나타내는 몇몇을 선정하여 세포증식검정을 실시하였다. 세포증식검정은 (주)이노파마스크린에 의뢰하여 EGF에 민감한 피부세포인 NIH3T3 세포주를 가지고 수행하였다. 실험 방법으로는 NIH-3T3 cell을 10 % heat-inactivation 된 fetal bovine serum, 100 units/ml의 penicillin, 100 mg/ml의 streptomycin이 포함된 DMEM complete 배지를 이용하여 유지하였다. 96 well culture plate에 2 × 103 cells/well의 NIH-3T3 cell을 seeding 하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 starvation 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 sample solution을 각각의 농도별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 μl의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 이용하여 100 μl의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. Absorbance는 spectrophotometer를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군, control)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 대부분의 EGF 변이체가 천연형 EGF와 유사한 세포증식능력을 보이고 있으며 구조를 가지지 않았던 M1은 세포증식능력을 가지지 않았다.
< 실시예 8> 천연형과 변이체 EGF 의 incubation 에 따른 circular dichroism 분석
실온에서 장기간 보관을 통하여 천연형 EGF와 변이체들의 안정성을 확인해야 하지만 기간이 너무 길다는 단점이 있어서 극한 환경에서 단기간 incubation test를 진행하였다. 20 mM sodium phosphate(pH 5.5)에서 각각의 천연형 EGF와 변이체들을 0.3 mg/ml로 녹인 후 60 ℃인 water bath에서 incubation을 하였다. 24시간 단위로 sampling 하여 13000 rpm으로 15분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 20 mM sodium phosphate (pH 5.5)로 희석하여 원편광 이색성 분광측정법(circular dichroism)을 이용하여 구조를 측정하였다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1 cm, accumulation 8번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다. 시간이 지날수록 천연형 EGF 변이체들의 구조 signal이 줄어들었으며 천연형 EGF가 변이체에 비하여 더 심한 감소를 보였다. 이를 더 쉽게 보기 위하여 signal의 차이가 가장 큰 200 nm의 signal 값을 이용하여 첫째 날의 signal 값과의 비율을 이용하여 도 3과 같이 그래프로 나타냈다. 표 4는 incubation 5일째의 천연형 EGF signal 값을 변이체와의 signal 값과 비교하였을 때의 퍼센트를 나타내었다. A-8-2, D-38-9, M2, M3변이체는 천연형 EGF와 비교하여 약 125 %의 signal값을 나타내고 있다. 이는 본 발명에서 만들어진 EGF 변이체의 열 안정성과 용해도(solubility)의 우수성을 입증하는 결과이다.
변이체 EGF명칭 천연형 EGF 대비
백분율 (%)		 변이체 EGF 명칭 천연형 EGF 대비
백분율(%)
천연형 EGF 100 D-34-2 111.10
M2 129.13 C-25-1 106.38
M3 127.48 D-35-6 100.14
A-8-2 126.68 B-19-3 84.22
D-38-9 125.93
< 실시예 9> 천연형 EGF 와 M3 변이체의 incubation 에 따른 세포증식검정
앞의 모든 실험의 결과를 토대로 열 안정성과 용해도(solubility)가 가장 좋은 M3 변이체를 이용하여 20 mM sodium phosphate(pH 5.5) 상태가 아닌 실제 화장품 상태에서도 천연형 EGF와 비교하여 M3 변이체가 열 안정성을 가지는지를 확인하기 위하여 화장품 기본 에센스 상태에 천연형 EGF와 M3 변이체를 같은 농도로 녹인 후 5일간 60 ℃에서 incubation하였다. 그리고 원심 분리하여 상층액만을 가지고 (주)이노파마스크린에 의뢰하여 EGF에 민감한 피부세포인 NIH3T3 세포주를 가지고 세포증식검정을 수행하였다. 도 4에서 보는 바와 같이 M3 변이체가 천연형 EGF에 비하여 세포증식에서 더 높은 활성을 나타내었다. 이는 incubation 중 M3 변이체가 천연형 EGF에 비하여 열 안정도와 용해도(solubility)가 더 높게 나타내므로, 이와 같은 결과는 본 발명의 우수성을 입증하는 결과이다.
<110> SOONGSIL UNIVERSITY RESEARCH CONSORTIUM TECHNO-PARK <120> Highly stabilized epidermal growth factor mutants <130> ADP-2013-0260 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 20 25 30 Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epidermal growth factor(EGF) protein mutant <400> 2 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Ser Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 20 25 30 Cys Val Val Gly Tyr Cys Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Cys Leu Lys 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 3 <211> 159 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aacagcgata gcgaatgccc gctgagccat gatggctatt gcctgcatga tggtgtgtgc 60 atgtatattg aagcattgga caagtatgca tgcaactgtg ttgttggcta catcggcgag 120 cgttgccagt atcgtgacct gaaatggtgg gaactgcgc 159 <210> 4 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epidermal growth factor(EGF) gene mutant <400> 4 aacagcgata gcgaatgccc gagcagccat gatggctatt gcctgcatga tggtgtgtgc 60 atgtatattg aagcattgga caagtatgca tgcaactgtg ttgttggcta ctgcggcgag 120 cgttgccagt atcgttgcct gaaatggtgg gaactgcgc 159

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 38번째 아미노산인 아이소류신이 시스테인으로 치환되고, 46번째 아미노산인 아스파르트산이 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 8번째 아미노산인 류신이 세린으로 치환되고, 38번째 아미노산인 아이소류신이 시스테인으로 치환되며, 46번째 아미노산인 아스파르트산이 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항의 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질을 코딩하는 유전자.
  5. 삭제
  6. 제 4 항의 유전자를 포함하는 재조합벡터.
  7. 제 6 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 대장균은 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제 6 항에 따른 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계;
    상기 형질전환된 대장균을 배양하여 돌연변이 EGF 단백질을 발현시키는 단계; 및
    상기 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 돌연변이 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 단백질 제조방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 세포 성장 및 피부 재생 촉진용 화장료 조성물.
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