RU2776529C2 - Соединения mic-1 и их применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к соединению ингибирующего макрофаги цитокина-1 (MIC-1), состоящего из полипептида MIC-1 и N-концевого удлинения аминокислотной последовательности, и может быть использовано в медицине. Полученное соединение, содержащее аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 89-117, 164, 165, 182, 200-221, может быть использовано для эффективного предупреждения или лечения ожирения. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 15 табл., 9 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к соединениям MIC-1 и их фармацевтическому применению.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Перечень последовательностей, озаглавленный как "ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ", с размером 142554 байта, был создан 24 мая 2017 г. и включен в данное описание посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ингибирующий макрофаги цитокин-1 (MIC-1) впервые был описан в 1997 г. (Bootcov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Oct. 1997) благодаря экспериментам, показавшим его усиленную экспрессию в активированных макрофагах. Впоследствии MIC-1 был идентифицирован другими и получил несколько дополнительных названий, таких как плацентарный трансформирующий ростовой фактор-бета (PTGF-P), плацентарный костный морфогенетический белок, фактор 15 роста и дифференцировки (GDF15), выделенный из предстательной железы фактор (PDF), продукт гена, активируемого нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (NAG-1) и PL74.

MIC-1 является дальним членом суперсемейства TGF-бета, семейства пептидных гормонов, вовлеченных в рост и дифференцировку клеток. MIC-1 циркулирует в виде богатого цистеином гомодимера с молекулярной массой (ММ) 24,5 кДа. Первоначально сообщалось, что MIC-1 активируется в макрофагах стимулирующими веществами, включая интерлейкин 1b (IL-1b), альфа-фактор некроза опухоли (TNF-альфа), IL-2 и TGF-b. Также было показано, что MIC-1 может ослаблять липополисахарид-индуцированное продуцирование TNF-альфа, и на основании этих данных было высказано предположение, что MIC-1 является противовоспалительным цитокином.

В последнее время (Johnen et al., Nat. Med., Nov., 2007) с использованием данных, полученных от пациентов с прогрессирующей формой рака, было показано, что уменьшение массы коррелировало с уровнями циркулирующего MIC-1. Эти данные указывают на то, что MIC-1 регулирует массу тела. Эту гипотезу тестировали на мышах с ксенотрансплантированными опухолевыми клетками предстательной железы, у которых повышенные уровни MIC-1 ассоциировались с уменьшением массы тела и снижением потребления пищи, эффектом, который можно было изменить на обратный посредством введения нейтрализующих антител к MIC-1. Поскольку введение рекомбинантного MIC-1 мышам регулировало уровень гипоталамического нейропептида Y и проопиомеланокортина, было высказано предположение, что MIC-1 регулирует потребление пищи при участии центрального механизма. Кроме того, трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие MIC-1, хуже набирают вес и жировую массу тела как при обычной диете с низким содержанием жиров, так и при диете с высоким содержанием жиров (Macia et al., PLoS One, Apr., 2012). Кроме того, трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие MIC-1, получающие корм согласно диете как с низким, так и с высоким содержанием жиров, соответственно, демонстрировали улучшенную толерантность к глюкозе по сравнению с животными дикого типа в случае использования сопоставимой диеты.

Ожирение чаще всего вызывается чрезмерным потреблением калорийной пищи как таковым или в сочетании с уменьшением затрат энергии и/или отсутствием физической нагрузки. Ожирение является общепризнанным фактором риска для метаболических заболеваний, таких как диабет, сердечно-сосудистые заболевания, апноэ во сне и рак.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке описаны соединения MIC-1, содержащие полипептиды MIC-1 с N-концевыми удлинениями аминокислотной последовательности.

Согласно одному из аспектов соединения MIC-1 по изобретению обладают хорошими биофизическими свойствами. Эти свойства включают, но не ограничиваются этим, растворимость и стабильность. Согласно одному из аспектов соединения MIC-1 по изобретению обладают улучшенной растворимостью. Согласно одному из аспектов соединения MIC-1 по изобретению обладают улучшенной химической стабильностью.

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению обладают улучшенной биофизической стабильностью, на что указывает пониженная склонность к образованию кристаллов.

Согласно одному из аспектов соединения MIC-1 по изобретению сохраняют активность в отношении рецептора MIC-1 и эффективность in vivo в отношении снижения потребления пищи и уменьшения массы тела. Ввиду этого, данные соединения MIC-1 могут быть использованы для лечения метаболических расстройств, таких как ожирение, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, подобные дислипидемии и артериосклерозу, и других расстройств, таких как стеатогепатит и диабетическая нефропатия.

Согласно одному из аспектов, соединения MIC-1 по изобретению содержат полипептид MIC-1 и N-концевое удлинение аминокислотной последовательности, при этом указанное удлинение состоит из 3-36 аминокислотных остатков, и при этом соединение имеет рассчитанное значение изоэлектрической точки (pI) ниже 6,5.

В некоторых воплощениях изобретения соединение MIC-1 имеет рассчитанное значение pI ниже 6,1.

В некоторых воплощениях изобретения соединение MIC-1 имеет рассчитанное значение pI выше 4,7.

В некоторых воплощениях изобретения соединение MIC-1 имеет рассчитанное значение pI выше 4,7 и ниже 6,1.

В некоторых воплощениях изобретения соединение MIC-1 имеет рассчитанное значение pI, которое находится в диапазоне 5,8-5,2.

В некоторых воплощениях соединения MIC-1 по изобретению, представленные в виде гомодимеров, имеют 218-296, 224-296 или 230-296 аминокислотных остатков.

В некоторых воплощениях соединения MIC-1 по изобретению содержат N-концевое удлинение размером в диапазоне 3-35, 3-30, 3-25, 3-24, 4-36, 4-35, 4-30, 4-25, 4-24, 5-36, 5-35, 5-30, 5-25, 5-24, 6-36, 6-35, 6-30, 6-25, 6-24, 7-36, 7-35, 7-30, 7-25, 7-24, 8-36, 8-35, 8-30, 8-25, 8-24, 8-12, 30-36, 32-36, 30-34 или 30-32 аминокислотных остатков.

В некоторых воплощениях соединения MIC-1 по изобретению содержат N-концевое удлинение размером в диапазоне 30-32 аминокислотных остатков.

В некоторых воплощениях соединения MIC-1 по изобретению содержат N-концевое удлинение, которое имеет избыток остатков кислых аминокислот (аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты), составляющий по меньшей мере 3, 4, 5 или 6 остатков по сравнению с числом остатков основных аминокислот (лизина, аргинина и гистидина).

В некоторых воплощениях изобретения соединения MIC-1 содержат N-концевые удлинения, составленные из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из А, Е, G, Р, S, Т, Q и D, при этом указанное удлинение содержит по меньшей мере три аминокислотных остатка Е и/или D.

В некоторых воплощениях соединения MIC-1 по изобретению содержат полипептид MIC-1, который демонстрирует по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 98% идентичности последовательности с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

В некоторых воплощениях соединения MIC-1 по изобретению содержат полипептид MIC-1, который содержит одну или более чем одну из следующих замен: N3E, Р11Е, Н18Е, R21E, А30Е, А47Е, R53E, А54Е, М57Е, M57L, R67E, L68E, K69E, А75Е, А81Е, Р85Е, M86L, L105E и К107Е по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1, и/или делецию первых трех остатков (MIC-1-Δ1-3) или делецию остатка N3 (дез-N3) по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

В конкретном воплощении изобретения соединение MIC-1 содержит полипептид MIC-1 и N-концевое удлинение аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 87, 90, 92, 93, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 108, 109 или 164.

Согласно одному из аспектов изобретения предложены соединения MIC-1, имеющие растворимость, составляющую примерно 0,5, 1,0, 5,0, 10, 30 или 50 мг/мл при рН 8,0 в буферной системе на основе трис(гидроксиметил)аминометана (трис).

Согласно одному из аспектов изобретения предложена молекула полинуклеотида, кодирующего соединение MIC-1 по изобретению.

Согласно одному из аспектов изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение MIC-1 по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Согласно одному из аспектов изобретения предложено соединение MIC-1 по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Согласно одному из аспектов изобретения предложено соединение MIC-1 по изобретению для применения в предупреждении и/или лечении метаболического расстройства, при этом метаболическое расстройство представляет собой ожирение, диабет 2 типа, дислипидемию или диабетическую нефропатию.

Согласно одному из аспектов изобретения предложено соединение MIC-1 по изобретению для применения в предупреждении и/или лечении расстройств приема пищи, таких как ожирение, например, посредством уменьшения потребления пищи, снижения массы тела, подавления аппетита и индуцирования насыщения.

Согласно одному из аспектов изобретения предложено соединение MIC-1 по изобретению для применения в предупреждении и/или лечении ожирения.

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению представляют собой агонисты рецептора MIC-1. Согласно одному из аспектов соединения по изобретению подавляют потребление пищи. Согласно одному из аспектов соединения по изобретению снижают массу тела.

Согласно одному из аспектов изобретения предложено соединение MIC-1 по изобретению для применения в предупреждении и/или лечении сердечнососудистого заболевания.

Согласно одному из аспектов изобретения предложено соединение MIC-1 по изобретению для применения в предупреждении и/или лечении дислипидемии, артериосклероза, стеатогепатита или диабетической нефропатии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Экспрессия соединений MIC-1, содержащих одиночные 12-мерные структурные блоки. Все клетки выращивали в ТВ при 37°С и экспрессию белков индуцировали, добавляя 0,5 мМ изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG) после того, как значение оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) достигало 1,0. Клетки собирали по прошествии ночи и уровень экспрессии проверяли, нанося суммарный лизат на гель для проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). MIC-1 дикого типа (wtMIC-1) наносили в качестве положительного контроля.

Фиг. 2. Экспрессия соединений MIC-1, содержащих двойные 12-мерные структурные блоки. Все клетки выращивали в ТВ при 37°С и экспрессию белков индуцировали, добавляя 0,5 мМ IPTG после того, как значение OD₆₀₀ достигало 1,0. Клетки собирали по прошествии ночи и уровень экспрессии проверяли, нанося суммарный лизат на гель для SDS-PAGE. wtMIC-1 наносили в качестве положительного контроля.

Фиг. 3. а) Сравнение уровней экспрессии среди соединений MIC-1, начинающихся с 12-мер-(4+2+_), -(4+4+_) и -(4+3+_). Следует отметить, что группа, несущая 12-мер-(4+3+_), и конструкция, отмеченная точкой, содержат M57L в остове MIC-1. b) Влияние удлиненных 12-меров на уровень экспрессии. В дополнение к этому, самая низкая точка на графике в группе 3.6 относится к соединению MIC-1, содержащему M57L. На этой фигуре "1.6 последние" относится к TSTEEG, "2.6" относится к TSESAT, "3.6" относится к TSTEPS, а "4.6" относится к SEPATS.

Фиг. 4. Результаты SDS-PAGE репрезентативных вариантов, несущих 12-мер-(4+2+_), 12-мер-(4+3+_)+M57L, 12-мер-(три повтора) и 12-мер-(четыре повтора). Т: общий белок, S: растворимая фракция, Р: клеточный осадок (тельца включения).

Фиг. 5. Растворимость соединений MIC-1, содержащих мутации в последовательности. На этой фигуре остовом является MIC-1-del(1-3).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Изобретение относится к соединению MIC-1, содержащему полипептид MIC-1. Согласно одному из аспектов изобретение относится к соединению MIC-1, содержащему полипептид MIC-1 и N-концевое удлинение аминокислотной последовательности, при этом указанное удлинение состоит из 3-200 аминокислотных остатков, и при этом соединение имеет рассчитанное значение pI ниже 6,5.

MIC-1

Термин "MIC-1", использованный в данном описании, означает ингибирующий макрофаги цитокин-1 (MIC-1), также известный как фактор 15 роста и дифференцировки (GDF15), плацентарный костный морфогенетический белок (PLAB) и продукт гена, активируемого нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (NAG-1). MIC-1 синтезируется в виде внутриклеточного гомодимерного белка-предшественника с ММ 62 кДа, который впоследствии расщепляется под действием фуриноподобной протеазы с образованием гомодимера с ММ 24,5 кДа. Последовательность полноразмерного человеческого MIC-1 дикого типа с № доступа Q99988 может быть получена из базы данных UNIPROT. Содержащая 308 аминокислот последовательность предшественника включает в себя сигнальный пептид (аминокислоты 1-29), пропептид (аминокислоты 30-196) и последовательность мономера MIC-1 (аминокислоты 197-308). Последовательность мономера MIC-1 из 112 аминокислот включена в данное описание как SEQ ID NO: 1. Мономер MIC-1 содержит девять остатков цистеина, которые образуют 4 внутрицепочечные дисульфидные связи и одну межцепочечную дисульфидную связь, создавая ковалентно связанный гомодимер с ММ 24,5 кДа. Описана природная мутация, соответствующая H6D в последовательности мономера MIC-1 (SEQ ID NO: 1).

Термин "соединение MIC-1", использованный в данном описании, относится к соединению, содержащему полипептид MIC-1 и N-концевое удлинение аминокислотной последовательности. Обычно соединение MIC-1 представлено в форме гомодимера.

Термин "полипептид MIC-1", использованный в данном описании, относится к последовательности мономера MIC-1 человека с SEQ ID NO: 1 или его аналога. Численные обозначения у конкретных остатков MIC-1, если не указано иное, относятся к последовательности мономера из 112 аминокислот (т.е. остаток 1 представляет собой аланин (А1), а остаток 112 представляет собой изолейцин (I112).

Термин "MIC-1-аналог" или "аналог MIC-1", использованный в данном описании, относится к полипептиду MIC-1, который представляет собой аминокислотный вариант последовательности мономера MIC-1 с SEQ ID NO: 1. Другими словами, аналог MIC-1 представляет собой полипептид MIC-1, число аминокислотных остатков в котором изменено по сравнению с MIC-1 человека (SEQ ID NO: 1). Эти изменения могут представлять собой, независимо, одну или более аминокислотных замен, вставок и/или делеций.

Аналоги MIC-1 могут быть описаны с учетом измененного аминокислотного остатка, номера аминокислотного остатка (т.е. соответствующего положения в последовательности мономера MIC-1 (SEQ ID NO: 1)) и изменения (например, изменения аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток).

Согласно одному из аспектов аналог MIC-1 представляет собой функциональный вариант MIC-1 с SEQ ID NO: 1. Согласно одному из аспектов изобретения аналоги MIC-1 демонстрируют по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 98% идентичности последовательности с MIC-1 с SEQ ID NO: 1. В качестве примера способа определения идентичности последовательностей между двумя аналогами проведено выравнивание двух пептидов H6D MIC-1 и MIC-1 с SEQ ID NO: 1. Идентичность последовательности аналога H6D MIC-1 относительно MIC-1 с SEQ ID NO: 1 определяется числом получающихся после выравнивания идентичных остатков за вычетом числа других остатков, деленным на общее число остатков в MIC-1 с SEQ ID NO: 1. Соответственно, в указанном примере идентичность последовательности в процентном отношении составляет [(112-1)/112]×100. При определении идентичности последовательностей аналога MIC-1 N-концевое удлинение аминокислотной последовательности не включают.

Согласно другому аспекту изобретения аналоги MIC-1 содержат меньшее число, например, меньше 15, 10 или 5, модификаций аминокислотных остатков (замен, делеций, добавлений (включая вставки) и любой их комбинации) относительно MIC-1 человека с SEQ ID NO: 1. Термин "модификация аминокислотных остатков", использованный по всей этой заявке, применяется для обозначения модификации аминокислоты по сравнению с мономером MIC-1 (SEQ ID NO: 1). Эта модификация может быть результатом делеции аминокислоты, добавления аминокислоты, замены одной аминокислоты на другую или результатом ковалентного присоединения заместителя к аминокислоте в данном пептиде.

Замены. Согласно одному из аспектов аминокислоты могут быть заменены путем выполнения консервативной замены. Термин "консервативная замена", использованный в данном описании, указывает на то, что один или более чем один аминокислотный остаток заменяют на другой, схожий в биологическом плане остаток. Примеры включают замены аминокислотных остатков на остатки со схожими характеристиками, например, небольших аминокислот, кислых аминокислот, полярных аминокислот, основных аминокислот, гидрофобных аминокислот и ароматических аминокислот.

Согласно одному из аспектов аминокислоты могут быть заменены путем выполнения неконсервативной замены. Термин "неконсервативная замена", использованный в данном описании, указывает на то, что одну или более чем одну аминокислоту заменяют на другую аминокислоту, имеющую отличающиеся характеристики. Примеры включают замену остатка основной аминокислоты на остаток кислой аминокислоты, замену остатка полярной аминокислоты на остаток ароматической аминокислоты и т.д. Согласно одному из аспектов неконсервативная замена представляет собой замену кодируемой аминокислоты на другую кодируемую аминокислоту, имеющую отличающиеся характеристики. Согласно одному из аспектов аналоги MIC-1 могут содержать замены на одну или несколько неприродных аминокислот и/или одно или несколько не являющихся аминокислотами соединений, например, на миметики аминокислот, в последовательности MIC-1.

Остаток аспарагина в положении 3 (N3) последовательности мономера MIC-1 человека (SEQ ID NO: 1) является химически лабильным. Согласно одному из аспектов изобретения аспарагин в положении, соответствующем положению 3 последовательности мономера MIC-1 (SEQ ID NO: 1), может быть заменен на серии (N3S), глутаминовую кислоту (N3E), аланин (N3A) или глутамин (N3Q). Согласно одному из аспектов изобретения аспарагин в положении, соответствующем положению 3 последовательности мономера MIC-1 (SEQ ID NO: 1), может быть заменен на глутаминовую кислоту (N3E).

Согласно одному из аспектов изобретения аргинин в положении, соответствующем положению 2 последовательности мономера MIC-1 (SEQ ID NO: 1), заменен на аланин (R2A), а аспарагин в положении, соответствующем положению 3 последовательности мономера MIC-1 (SEQ ID NO: 1), заменен на глутаминовую кислоту (N3E).

Делеции и укорочения. Согласно одному из аспектов в аналогах MIC-1 по изобретению из аминокислотной последовательности MIC-1 (SEQ ID NO: 1) могут быть делетированы один или более аминокислотных остатков, отдельно или в комбинации с одной или более вставками или заменами.

Для описания аналогов MIC-1 с аминокислотными делециями можно использовать приставку "дез" с указанием аминокислотного остатка, который делетирован, и затем номера делетированной аминокислоты (т.е. номера соответствующего положения в мономере MIC-1 (SEQ ID NO: 1)). В некоторых воплощениях изобретения аспарагин в положении, соответствующем положению 3 мономера MIC-1 человека (SEQ ID NO: 1), делетирован (MIC-1-дез-N3, SEQ ID NO: 2).

Для описания аналогов MIC-1 с укорочением на один или несколько аминокислотных остатков на N- или С-конце можно использовать обозначение "MIC-1-A" с указанием числа делетированных аминокислотных остатков (т.е. соответствующих положений в мономере MIC-1 (SEQ ID NO: 1)). В некоторых воплощениях изобретения первые три остатка (А1, R2, N3) на N-конце делетированы (MIC-1-Δ1-3, SEQ ID NO: 3).

Вставки. Согласно одному из аспектов в аналогах MIC-1 по изобретению в аминокислотную последовательность MIC-1 человека могут быть встроены один или более аминокислотных остатков, отдельно или в комбинации с одной или более делециями или заменами.

Согласно одному из аспектов аналоги MIC-1 по изобретению могут включать вставки в последовательность MIC-1 одной или нескольких неприродных аминокислот и/или одного или нескольких не являющихся аминокислотами соединений.

Термин "белок" или "полипептид", как он, например, используется в данном описании, относится к соединению, которое содержит ряд аминокислот, соединенных между собой амидными (или пептидными) связями.

Аминокислоты представляют собой молекулы, содержащие аминогруппу и группу карбоновой кислоты и, возможно, одну или несколько дополнительных групп, часто обозначаемых как боковая цепь.

Термин "аминокислота" включает в себя кодируемые (или протеиногенные, или природные) аминокислоты (среди которых 20 стандартных аминокислот), а также некодируемые (или непротеиногенные, или неприродные) аминокислоты. Кодируемыми аминокислотами являются такие аминокислоты, которые естественным путем включены в белки. Стандартными аминокислотами являются такие аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом. Некодируемые аминокислоты либо не встречаются в белках, либо не продуцируются стандартным клеточным аппаратом (например, они могут подвергаться посттрансляционной модификации). В дальнейшем следует понимать, что все аминокислоты в белках MIC-1, для которых не указан оптический изомер, относятся к L-изомеру (если не указано иное).

Как очевидно из приведенного выше, аминокислотные остатки могут быть идентифицированы по их полному названию, их однобуквенному коду и/или их трехбуквенному коду. Эти три способа полностью эквивалентны. Для удобства читателя одно- и трехбуквенные коды аминокислот приведены ниже:

глицин: G и Gly; пролин: Р и Pro; аланин: А и Ala; валин: V и Val; лейцин: L и Leu; изолейцин: I и Не; метионин: М и Met; цистеин: С и Cys; фенилаланин: F и Phe; тирозин: Y и Tyr; триптофан: W и Trp; гистидин: Н и His; лизин: K и Lys; аргинин: R и Arg; глутамин: Q и Gin; аспарагин: N и Asn; глутаминовая кислота: Е и Glu; аспарагиновая кислота: D и Asp; серин: S и Ser; и треонин: Т и Thr.

N-концевое удлинение аминокислотной последовательности

В некоторых воплощениях изобретения соединение MIC-1 содержит N-концевое удлинение аминокислотной последовательности.

Термин "N-концевое удлинение аминокислотной последовательности", использованный в данном описании, означает, что N-конец полипептида MIC-1 присоединен к С-концу N-концевого удлинения аминокислотной последовательности через амидную связь, предпочтительно пептидную связь. В данном описании термины "N-концевое удлинение аминокислотной последовательности", "N-концевое удлинение" и "N-удлинение" означают одно и то же и используются взаимозаменяемо. В одном из воплощений соединение по изобретению содержит последовательность мономера MIC-1 человека (SEQ ID NO:1) с удлинением аминокислотной последовательности, присоединенным к N-концу, т.е. к аланину в положении 1 (А1), через пептидную связь.

В некоторых воплощениях изобретения размер N-концевого удлинения аминокислотной последовательности составляет до 200 аминокислотных остатков включительно. В конкретном воплощении изобретения N-концевое удлинение аминокислотной последовательности имеет от 3 до 36 аминокислотных остатков.

Согласно одному из аспектов изобретения N-концевое удлинение аминокислотной последовательности имеет избыток остатков кислых аминокислот (аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты), составляющий по меньшей мере 3, 4, 5 или 6 остатков по сравнению с числом остатков основных аминокислот (лизина, аргинина и гистидина). "Избыток" остатков кислых аминокислот означает, что число остатков кислых аминокислот превышает число остатков основных аминокислот. Определяемое значение избытка остатков кислых аминокислот рассчитывают, как число остатков кислых аминокислот за вычетом числа остатков основных аминокислот.

Метионин представляет собой начальную аминокислоту при экспрессии белков в прокариотических клетках (например, бактериях, например, Е. coli). В некоторых воплощениях изобретения этот начальный остаток метионина удаляется из белка в процессе экспрессии белка. Поэтому, этот начальный остаток метионина не входит в состав последовательности N-удлинения соединения MIC-1. Однако, специалисту в данной области техники известно, что стартовый кодон, кодирующий этот начальный остаток метионина, необходим для инициации трансляции белка и должен быть введен, без всяких исключений, прямо перед нуклеотидной последовательностью для экспрессии белка.

Вместе с тем понятно, что те соединения MIC-1 с N-удлинениями, имеющими этот начальный остаток метионина, также попадают в объем данного изобретения.

Изоэлектрическая точка (pI)

Рассчитанное значение pI для соединения MIC-1 по определению представляет собой рН, при котором общий рассчитанный заряд этого соединения равен нулю. Рассчитанный заряд соединения MIC-1 как функцию от рН получают с использованием значений pKa для аминокислотных остатков, описанных в Таблице 1, и способа, описанного В. Skoog и A. Wichman (Trends in Analytical Chemistry, 1986, vol. 5, pp. 82-83). Значение pKa для боковой цепи цистеина (Cys) включено в расчет заряда только для остатков цистеина со свободной сульфгидрильной группой. В качестве примера рассчитанное значение pI для wtMIC-1 человека в виде гомодимера составляет 8,8.

Как описано в данной заявке, расчеты pI для соединений MIC-1 выполняют для случая соединений MIC-1 в виде гомодимеров.

Таблица 1. Значения pKa для аминокислотных остатков, использованные для вычисления pI. Приведены те значения pKa, которые описаны в статье Rickard ЕС, Strohl MM, Nielsen RG "Correlation of Electrophoretic Mobilities from Capillary Electrophoresis with Physicochemical Properties of Proteins and Peptides", Analytical Biochemistry, 1991, vol. 197, pp. 197-207.

Согласно одному из аспектов, соединения MIC-1 по изобретению обладают хорошими биофизическими свойствами. Эти свойства включают, но не ограничиваются этим, растворимость и/или стабильность.

Растворимость

Человеческий MIC-1 дикого типа представляет собой гидрофобный белок с рассчитанным для случая гомодимера значением pI, составляющим 8,8. В связи с этим, MIC-1 дикого типа можно растворять только до концентрации примерно 0,5 мг/мл в водных буферных системах с нейтральным значением рН. Низкая растворимость MIC-1 в значительной степени препятствует возможности его использования для приготовления на его основе препаратов и терапевтическому применению, поэтому разработка соединения MIC-1 с измененной генно-инженерным путем растворимостью важна для молекулярного конструирования MIC-1.

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению обладают улучшенной растворимостью (т.е. являются более растворимыми) по сравнению с MIC-1 человека с SEQ ID NO: 1.

Согласно описанному в данной заявке растворимость измеряют так, как описано в Примере 4.

В некоторых воплощениях соединения MIC-1 по изобретению обладают растворимостью, составляющей по меньшей мере 1 мг/мл в трис-буфере при рН 8,0. В других воплощениях соединения по изобретению обладают растворимостью, составляющей по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 30 мг/мл или по меньшей мере 40 мг/мл в трис-буфере при рН 8,0.

Согласно описанному в данной заявке растворимость измеряют для случая соединений MIC-1 в виде гомодимеров.

Стабильность

Последовательность человеческого MIC-1 дикого типа химически нестабильна, и некоторые остатки аминокислотной последовательности могут изменяться в процессе хранения, включая дезамидирование аспарагина в положении 3 (N3) и окисление метионинов М43, М57 и М86. Химическая нестабильность некоторых остатков может оказывать влияние на фармацевтические свойства, поэтому разработка химически стабильных соединений MIC-1 будет составлять другую важную часть получения терапевтического соединения MIC-1.

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению обладают улучшенной химической стабильностью по сравнению с MIC-1 человека с SEQ ID NO: 1.

Термин "химическая стабильность" относится к химическим изменениям в структуре полипептида, приводящим к образованию продуктов химической деградации, возможно имеющим более низкую биологическую активность, меньшую растворимость и/или вызывающим повышенный иммуногенный эффект по сравнению с интактным полипептидом. Химическую стабильность можно оценить посредством измерения количества продуктов химической деградации в различные моменты времени после воздействия разных условий окружающей среды, например, с использованием гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC) и/или обращенно-фазовой HPLC (RP-HPLC).

MIC-1 может быть химически нестабильным; и некоторые остатки аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1) могут изменяться в процессе хранения, включая дезамидирование N3 и окисление метионинов М43, М57 и М86. Химическая нестабильность некоторых остатков может оказывать влияние на фармацевтические свойства, как например, низкая химическая стабильность для использования MIC-1 в качестве терапевтического соединения.

В некоторых воплощениях изобретения определенные остатки в последовательности мономера MIC-1 (SEQ ID NO: 1) модифицированы, например, путем замены с целью повышения химической стабильности соединения MIC-1. Чтобы избежать дезамидирования, остаток N3 может быть делетирован или заменен на другую аминокислоту, например, Е или Q. Чтобы уменьшить окисление, метионин может быть заменен на другую аминокислоту, например, Е или L.

Кристаллизация

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению демонстрируют сниженную тенденцию к образованию кристаллов при рН 8,0 по сравнению с MIC-1 c SEQ ID NO: 1.

Иммуногенность

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению обладают низким риском в отношении иммуногенности. Активность in vitro

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению сохраняют специфическую активность в отношении рецептора MIC-1 человека (SEQ ID NO:1). Специфическая активность и эффективность в отношении рецептора могут быть измерены в клетках млекопитающих, трансфицированных рецептором MIC-1 человека (hGFRAL, подобным альфа-рецептору семейства GDNF (глиального нейротрофического фактора) человека) и его участвующим в передаче сигнала корецептором hRET51 (человеческим протоонкогенным тирозин-протеинкиназным рецептором Ret, изоформой 51). Активацию рецепторного комплекса соединениями MIC-1 измеряют по фосфорилированию киназ, регулируемых внеклеточным сигналом (ERK), как описано в примере 6.

Как описано в данной заявке, специфическую активность и эффективность в отношении рецептора измеряют для случая соединений MIC-1 в виде гомодимеров.

Биологическая активность in vivo

Согласно одному из аспектов соединения по изобретению являются эффективными in vivo, что может быть определено так, как известно в данной области техники, на любой подходящей животной модели.

Не страдающая ожирением крыса Sprague Dawley (SD) представляет собой один из примеров подходящей животной модели, и на таких крысах можно определять изменения в потреблении пищи in vivo, например так, как описано в примере 7. Согласно одному из аспектов соединения по изобретению подавляют потребление пищи in vivo у не страдающих ожирением крыс Sprague Dawley. Крысы Sprague Dawley с индуцированным диетой ожирением (DIO) представляют собой другой пример подходящей животной модели, и на таких крысах можно определять изменения в потреблении пищи in vivo. Согласно одному из аспектов соединения по изобретению подавляют потребление пищи in vivo и снижают массу тела у крыс Sprague Dawley с DIO.

Способы получения

Соединения MIC-1 по настоящему изобретению могут быть приготовлены средствами рекомбинантной технологии получения белков, известными специалистам в данной области техники. В общем случае, нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие представляющие интерес белки или их функциональные варианты, модифицируют с целью кодирования желаемого соединения MIC-1. Затем эту модифицированную последовательность встраивают в экспрессирующий вектор, которым, в свою очередь, трансформируют или трансфицируют экспрессирующие клетки хозяина.

Нуклеиновокислотная конструкция, кодирующая соединение MIC-1, может соответственно иметь геномное, кДНК или синтетическое происхождение. Изменения аминокислотной последовательности осуществляют посредством модификации генетического кода хорошо известными методами.

Последовательность ДНК, кодирующую соединение MIC-1, обычно встраивают в рекомбинантный вектор, которым может быть любой вектор, подходящий для осуществления методик рекомбинантной ДНК, и выбор вектора часто будет зависеть от клетки хозяина, в которую он должен быть введен. Так, вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого происходит независимо от репликации хромосомы, например, может представлять собой плазмиду. Альтернативно, вектор может быть таким, который, будучи введен в клетку хозяина, интегрируется в геном клетки хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он был интегрирован.

Вектор предпочтительно представляет собой экспрессирующий вектор, в котором последовательность ДНК, кодирующая соединение MIC-1, функционально связана с дополнительными сегментами, необходимыми для транскрипции данной ДНК. Термин "функционально связанный" указывает на то, что данные сегменты организованы таким образом, что они функционируют согласованно для достижения своих намеченных целей, например, транскрипция инициируется на промоторе и распространяется на всю последовательность ДНК, кодирующую полипептид, пока она не завершится на терминаторе.

Таким образом, экспрессирующие векторы, применяемые для экспрессии соединения MIC-1, будут содержать промотор, способный инициировать и направлять транскрипцию клонированного гена или кДНК. Промотор может представлять собой любую последовательность ДНК, демонстрирующую транскрипционную активность в выбранной клетке хозяина, и может происходить из генов, кодирующих белки, которые являются либо гомологичными, либо гетерологичными белкам клетки хозяина.

Кроме того, экспрессирующие векторы, используемые для экспрессии соединения MIC-1, также будут содержать терминирующую последовательность, а именно, последовательность, распознаваемую клеткой хозяина, для остановки транскрипции. Терминирующая последовательность функционально связана с 3'-концом нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей полипептид. В настоящем изобретении можно использовать любой терминатор, который является функциональным в выбранной клетке хозяина.

Экспрессия соединения MIC-1 может быть ориентирована либо на внутриклеточную экспрессию в цитозоль клетки хозяина, либо в направлении секреторного пути для внеклеточной экспрессии в ростовую среду.

Внутриклеточная экспрессия представляет собой путь по умолчанию и требует наличия экспрессирующего вектора с последовательностью ДНК, содержащей промотор, за которым следует последовательность ДНК, кодирующая соединение MIC-1, и далее терминатор.

Чтобы направить последовательность соединения MIC-1 по секреторному пути клетки хозяина, необходима секреторная сигнальная последовательность (также известная как последовательность сигнального пептида или пре-последовательность) в виде удлинения последовательности MIC-1. Последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, присоединяют к 5'-концу последовательности ДНК, кодирующей соединение MIC-1, в корректной рамке считывания. Сигнальным пептидом может быть пептид, в норме ассоциированный с белком, или который может быть закодирован в гене другого секретируемого белка.

Методики, используемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих соединение MIC-1, промотор, терминатор и/или секреторную сигнальную последовательность, соответственно, и для введения их в подходящие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в данной области техники (ср., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Клетка-хозяин, в которую вводят последовательность ДНК, кодирующую соединение MIC-1, может представлять собой любую клетку, способную экспрессировать соединение MIC-1 либо внутриклеточно, либо внеклеточно. Соединение MIC-1 может быть получено путем культивирования клетки хозяина, содержащей последовательность ДНК, кодирующую соединение MIC-1, и способной экспрессировать соединение MIC-1 в подходящую питательную среду в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию соединения MIC-1. Неограничивающими примерами клеток хозяина, подходящих для экспрессии соединений MIC-1, являются: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, а также линии клеток почки эмбриона человека (HEK), почки новорожденного хомячка (BHK) или яичника китайского хомячка (СНО). Если необходимы посттрансляционные модификации, то подходящие клетки хозяина включают клетки дрожжей, грибов, насекомых и высших эукариот, как например, клетки млекопитающих.

После прохождения экспрессии соединения MIC-1 в микроорганизме хозяина его можно выделить и очистить до необходимого качества традиционными методами. Неограничивающими примерами таких традиционных методов выделения и очистки являются центрифугирование, солюбилизация, фильтрация, осаждение, ионообменная хроматография, аффинная хроматография с иммобилизованным металлом (IMAC), обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (RP-HPLC), гель-фильтрация и сублимационная сушка.

Примеры экспрессии и очистки рекомбинантных белков MIC-1 можно найти, например, в Cordingley et al., J. Virol., 1989, 63, pp. 5037-5045; Birch et al., Protein Expr. Purif., 1995, 6, pp. 609-618 и в WO 2008/043847.

Примеры экспрессии и очистки белков MIC-1 из микроорганизмов можно найти, например, в Chich et al., Anal. Biochem., 1995, 224, pp.245-249 и Xin et al., Protein Expr. Purif., 2002, 24, pp. 530-538.

Конкретные примеры способов получения ряда соединений по изобретению включены в экспериментальную часть.

Тельца включения и экспрессия белка

Соединения MIC-1 могут быть экспрессированы в бактериях, таких как Е. coli. В контексте настоящего изобретения крупномасштабное получение белкового продукта - указанных полипептидов MIC-1, содержащих N-удлинение, может осуществляться с использованием телец включения (IB), поскольку предоставляет удобный подход для регулирования метода выделения, контроля чистоты белка, деградации протеазами и общей стабильности белка. Это становится особенно важным в случае крупномасштабного получения белка. Критически важным для качества IB является баланс между наличием полипептидов MIC-1 с зависящей от N-удлинения растворимостью, частично регулируемой рассчитанным значением pI, и образованием IB.

СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ

Подразумевается, что термин "лечение" включает в себя как предупреждение, так и сведение к минимуму упоминаемого заболевания, расстройства или состояния (т.е. "лечение" относится к введению как с профилактической, так и терапевтической целью соединения по изобретению или композиции, содержащей соединение по изобретению, если не указано иное или явно не противоречит контексту.

Введение может быть осуществлено любым путем, при котором соединение по данному изобретению эффективно переносится к желаемому или соответствующему месту в организме, в частности, парентерально, например подкожно, внутримышечно или внутривенно. Альтернативно, соединение по данному изобретению можно вводить перорально, ингаляционно, ректально, трансдермально, трансбуккально, сублингвально или назально.

Количество соединения по данному изобретению, подлежащее введению, определение частоты введения соединения по данному изобретению и выбор соединения или соединений по данному изобретению, которое(ые) необходимо вводить, возможно вместе с другим фармацевтически активным агентом, все это решается на консультации с практикующим врачом, знакомым с методами лечения ожирения и родственных расстройств.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

Фармацевтические композиции, содержащие соединение по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир и фармацевтически приемлемый эксципиент, могут быть приготовлены так, как известно в данной области техники.

Термин "эксципиент" в своем широком смысле относится к любому компоненту, отличающемуся от активного(ых) терапевтического(их) ингредиента(ов). Эксципиент может представлять собой инертное вещество, неактивное вещество и/или вещество, не являющееся активным с медицинской точки зрения.

Эксципиент может применяться для разных целей, например, в качестве носителя, наполнителя, разбавителя, вспомогательного вещества для таблеток, и/или для улучшения введения и/или всасывания активного вещества.

Технология изготовления композиций на основе фармацевтически активных ингредиентов вместе с различными эксципиентами известна в данной области техники, см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (например, 19^oe издание (1995) и любые более поздние издания).

Комбинированное лечение

Лечение соединением по настоящему изобретению также можно комбинировать с лечением одним или несколькими фармакологически активными веществами, например, выбранными из средств против ожирения, регулирующих аппетит агентов и агентов для лечения и/или предупреждения осложнений и расстройств, являющихся результатом ожирения или ассоциированных с ним.

Фармацевтические показания

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение относится к соединению по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

В конкретных воплощениях соединение по изобретению может быть использовано для приведенных далее видов терапевтического лечения:

(1) предупреждение и/или лечение расстройств приема пищи, таких как ожирение, например, посредством уменьшения потребления пищи, снижения массы тела, подавления аппетита и индуцирования насыщения;

(2) предупреждение и/или лечение гипергликемии, инсулинорезистентности и/или нарушенной толерантности к глюкозе;

(3) предупреждение и/или лечение дислипидемии.

В некоторых воплощениях изобретение относится к способу коррекции веса. В некоторых воплощениях изобретение относится к способу снижения аппетита. В некоторых воплощениях изобретение относится к способу уменьшения потребления пищи.

Как правило, все субъекты, страдающие ожирением, также считаются страдающими от избыточного веса. В некоторых воплощениях изобретение относится к способу лечения или предупреждения ожирения. В некоторых воплощениях изобретение относится к применению соединений MIC-1 по изобретению для лечения или предупреждения ожирения. В некоторых воплощениях субъектом, страдающим ожирением, является человек, например, взрослый человек или ребенок (включая младенцев, детей и подростков). Индекс массы тела (BMI) представляет собой показатель содержания жира в организме, вычисляемый с учетом роста и веса. Формула для вычисления: BMI = масса в килограммах/(рост в метрах)². Человек, страдающий ожирением, может иметь BMI ≥30; этот субъект также может называться тучным. В некоторых воплощениях человек, страдающий ожирением, может иметь BMI ≥35 или BMI в диапазоне от ≥30 до <40. В некоторых воплощениях ожирением является сильно выраженное ожирение или патологическое ожирение, при этом человек может иметь BMI ≥40.

В некоторых воплощениях изобретение относится к способу лечения или предупреждения избыточного веса, возможно в присутствии по меньшей мере одного связанного с избыточным весом сопутствующего заболевания. В некоторых воплощениях изобретение относится к применению соединений MIC-1 по изобретению для лечения или предупреждения избыточного веса, возможно в присутствии по меньшей мере одного связанного с избыточным весом сопутствующего заболевания.

В некоторых воплощениях субъектом, страдающими от избыточного веса, является человек, например, взрослый человек или ребенок (включая младенцев, детей и подростков). В некоторых воплощениях человек, страдающий от избыточного веса, может иметь BMI ≥25, например, BMI ≥27. В некоторых воплощениях человек, страдающий от избыточного веса, имеет BMI в диапазоне от 25 до <30 или в диапазоне от 27 до <30. В некоторых воплощениях связанное с избыточным весом сопутствующее заболевание выбрано из группы, состоящей из гипертензии, диабета (такого как диабет 2 типа), дислипидемии, повышенного уровня холестерина в крови и синдрома обструктивного апноэ во время сна.

В некоторых воплощениях изобретение относится к способу снижения массы тела. В некоторых воплощениях изобретение относится к применению соединений MIC-1 по изобретению для снижения массы тела. Человек, подлежащий снижению массы тела по настоящему изобретению может иметь BMI ≥25, например, BMI ≥27 или BMI ≥30. В некоторых воплощениях человек, подлежащий снижению массы тела по настоящему изобретению может иметь BMI ≥35 или BMI ≥40. Термин "снижение массы тела" может включать в себя лечение или предупреждение ожирения и/или избыточного веса.

В некоторых воплощениях изобретение относится к способу лечения или предупреждения сердечно-сосудистого заболевания, подобного артериосклерозу, и других расстройств, таких как стеатогепатит и диабетическая нефропатия.

Используемые в английском варианте данного описания артикли "а" и "an" относятся к одному или к более чем одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту данного документа. В качестве примера, "полипептид MIC-1" означает один полипептид MIC-1 или более чем один полипептид MIC-1.

Конкретные воплощения

Далее изобретение описывается следующими неограничивающими воплощениями изобретения.

1. Соединение MIC-1, содержащее полипептид MIC-1 и N-концевое удлинение аминокислотной последовательности, при этом указанное удлинение состоит из 3-200 аминокислотных остатков, и при этом соединение имеет рассчитанное значение pI ниже 6,5.

2. Соединение по воплощению 1, где полипептид MIC-1 и аминокислотное удлинение состоит из 109-312, 112-312, 115-312, 112-148 или 115-148 аминокислотных остатков.

3. Соединение по воплощению 1, где соединение представляет собой гомодимер.

4. Соединение по воплощению 1, где соединение в виде гомодимера состоит из 218-296, 224-296, 230-296, 218-310, 224-310, 230-310, 218-360, 224-360, 230-360, 218-624, 224-624, 230-296 или 230-296 аминокислотных остатков.

5. Соединение, состоящее из полипептида MIC-1 с N-концевым удлинением аминокислотной последовательности, при этом указанное удлинение состоит из 3-200 аминокислотных остатков, и при этом соединение имеет рассчитанное значение pI ниже 6,5.

6. Соединение по воплощениям 1-5, где рассчитанное значение pI ниже 6,1.

7. Соединение по воплощениям 1-5, где рассчитанное значение pI ниже 6,0.

8. Соединение по любому из воплощений 1-5, где рассчитанное значение pI ниже 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3 или 5,2, 5,1 или 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1 или 4,0.

9. Соединение по воплощениям 1-7, где рассчитанное значение pI выше 4,7.

10. Соединение по воплощениям 1-7, где рассчитанное значение pI выше 4,8.

11. Соединение по воплощениям 1-7, где рассчитанное значение pI выше 4,9.

12. Соединение по воплощениям 1-7, где рассчитанное значение pI выше 5,0.

13. Соединение по воплощениям 1-7, где рассчитанное значение pI выше 5,1.

14. Соединение по любому из воплощений 1-5, где рассчитанное значение pi находится в диапазоне 6,5-3,0, 6,5-3,5, 6,5-4,0, 6,1-3,0, 6,1-3,5, 6,1-4,0, 6,1-4,7, 6,1-4,9, 6,1-5,0, 6,1-5,1, 6,0-3,0, 6,0-3,5, 6,0-4,0, 5,9-3,0, 5,9-3,5, 5,9-4,0, 5,9-5,0, 5,9-5,1, 5,8-3,0, 5,8-3,5, 5,8-4,0, 5,8-5,1, 5,8-5,2, 5,5-3,0, 5,5-3,5, 5,5-4,0 или 5,0-4,0.

15. Соединение по любому из воплощений 1-14, где рассчитанное значение pI находится в диапазоне 5,8-5,2.

16. Соединение по любому из воплощений 1-15, где размер указанного удлинения находится в диапазоне 3-100, 3-50, 3-40, 3-30, 5-100, 5-50, 5-40, 5-30, 10-100, 10-50, 10-40, 10-30, 3-36, 3-30, 3-25, 3-24, 3-12, 4-36, 4-30, 4-24, 4-12, 5-36, 5-30, 5-24, 5-12, 6-36, 6-30, 6-24, 6-12, 7-36, 7-30, 7-24, 7-12, 8-36, 8-30, 8-24, 8-12, 30-36, 32-36, 30-34 или 30-32 аминокислотных остатков.

17. Соединение по любому из воплощений 1-16, где размер указанного удлинения составляет 3-36 аминокислот.

18. Соединение по любому из воплощений 1-17, где размер указанного удлинения составляет 30-32 аминокислотных остатка.

19. Соединение по любому из воплощений 1-18, где удлинение имеет избыток остатков кислых аминокислот (аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты), составляющий по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков по сравнению с числом остатков основных аминокислот (лизина, аргинина и гистидина).

20. Соединение по любому из воплощений 1-18, где удлинение содержит по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 75% избытка остатков кислых аминокислот (аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты) по сравнению с числом остатков основных аминокислот (лизина, аргинина и гистидина).

21. Соединение по любому из воплощений 1-20, где удлинение содержит по меньшей мере 15% остатков кислых аминокислот.

22. Соединение по воплощению 21, где удлинение содержит по меньшей мере 25% остатков кислых аминокислот.

23. Соединение по любому из воплощений 1-22, где удлинение составлено из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из А, Е, G, Р, S, Т, D, N и Q, при этом указанное удлинение содержит по меньшей мере три аминокислотных остатка Е и/или D.

24. Соединение по любому из воплощений 1-23, где удлинение составлено из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из А, Е, G, Р, S, Т, Q и D, при этом указанное удлинение содержит по меньшей мере три аминокислотных остатка Е и/или D.

25. Соединение по воплощению 23 или 24, где удлинение содержит по меньшей мере три остатка Е и по меньшей мере один остаток Р.

26. Соединение по воплощению 25, где удлинение дополнительно содержит S, G, Т и А.

27. Соединение по воплощению 26, где удлинение содержит 6 остатков Ser, 4 остатка Pro, 4 остатка Gly, 4 остатка Thr, 4 остатка Glu и 2 остатка Ala.

28. Соединение по воплощению 27, где удлинение содержит две последовательности, выбранные из группы, состоящей из SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG и SEPATSGSETPG.

29. Соединение по воплощению 28, где удлинение дополнительно содержит 6-8 следующих одна за другой аминокислот из последовательностей SPAGSPTSTEEG, TSESATPESGPG, TSTEPSEGSAPG или SEPATSGSETPG, например, первые 6-8 аминокислотных остатков, последние 6-8 остатков или расположенные внутри 6-8 остатков.

30. Соединение по любому из воплощений 23-29, где удлинение начинается c S.

31. Соединение по любому из воплощений 30, где удлинение начинается с SE.

32. Соединение по любому из воплощений 31, где удлинение начинается с SEP.

33. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей: SPAGSP (SEQ ID NO: 4),

34. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей: SPAGSP, TSESAT, TSTEPE,

35. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит любую комбинацию любых 2-6 из следующих последовательностей SPAGSP, TSESAT, TSTEPE, SEPATS, TSTEEG, PESGPG, SGSAPG, GSETPG, GEPQ, GEPS, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

36. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

37. Соединение по воплощению 36, где удлинение содержит любую комбинацию 2-9 из следующих последовательностей GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

38. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

39. Соединение по воплощению 38, где удлинение содержит любую комбинацию 2-9 из следующих последовательностей GEPS, GPSE, GPES, GSPE, GSEP, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

40. Соединение по воплощению 39, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS (SEQ ID N0: 140), GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE (SEQ ID NO: 141), GPESGPESGPESGPESGPES (SEQ ID NO: 142), GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE (SEQ ID NO: 143) и GSEPGSEPGSEPGSEPGSEP (SEQ ID NO: 144).

41. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

42. Соединение по воплощению 41, где удлинение содержит любую комбинацию 2-9 из следующих последовательностей GEPQ, GEQP, GPEQ, GPQE, GQEP, GQPE, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

43. Соединение по воплощению 42, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ (SEQ ID NO: 145), GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP (SEQ ID NO: 146), GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ (SEQ ID NO: 147), GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE (SEQ ID NO: 148), GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP (SEQ ID NO: 149) и GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE (SEQ ID NO: 150).

44. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей PEDEETPEQE, PDEGTEEETE, PAAEEEDDPD, AEPDEDPQSED, AEPDEDPQSE, AEPEEQEED и AEPEEQEE, GGGS, GSGS, GGSS и SSSG.

45. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит любую комбинацию двух-трех из следующих последовательностей PEDEETPEQE, PDEGTEEETE, PAAEEEDDPD, AEPDEDPQSED, AEPDEDPQSE, AEPEEQEED, AEPEEQEE и AEEAEEAEEAEEAEE.

46. Соединение по любому из воплощений 1-24, где удлинение содержит одну или более из следующих последовательностей SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ 10 NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194 и SEQ ID NO: 195.

47. Соединение по любому из воплощений 1-46, где удлинение содержит 1-3 остатка аминокислоты аланин на N-конце.

48. Соединение по любому из воплощений 1-47, где удлинение содержит 1-4 остатка аминокислот глицин и серин на С-конце.

49. Соединение по любому из воплощений 1-48, где удлинение содержит последовательность (Gly-Ser)n или (Ser-Gly)n на С-конце, при этом n представляет собой целое число в диапазоне 1-8.

50. Соединение по любому из воплощений 1-49, где удлинение содержит GGGS, GSGS, GGSS или SSSG на С-конце.

51. Соединение по любому из воплощений 1-50, где полипептид MIC-1 демонстрирует по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с MIC-1 дикого типа (SEQ ID NO: 1).

52. Соединение по воплощению 51, где полипептид MIC-1 демонстрирует по меньшей мере 95% идентичности последовательности с MIC-1 дикого типа (SEQ ID NO: 1).

53. Соединение по любому из воплощений 1-51, где полипептид MIC-1 имеет модификацию максимально по 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 аминокислотам или 1 аминокислоте по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

54. Соединение по любому из воплощений 1-53, где полипептид MIC-1 имеет модификации максимально по 7, 6, 5, 4, 3 или 2 аминокислотам по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

55. Соединение, содержащее полипептид MIC-1, при этом указанное соединение имеет рассчитанное значение pI ниже 6,5.

56. Соединение по любому из воплощений 1-55, где полипептид MIC-1 содержит одну или несколько следующих замен: Р11Е, Н18Е, R21E, А30Е, M43L, М43Е, А47Е, R53E, А54Е, М57Е, M57L, Н66Е, R67E, L68E, K69E, А75Е, А81Е, Р85Е, M86F, M86L, Q90E, Т92Е, L105E, K107E по сравнению с MIC-1 дикого типа (SEQ ID NO: 1).

57. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 содержит одну или несколько следующих замен: R2S, R2A, N3S N3E, N3A, N3T, N3P, N3G, N3V, N3H, N3Y или N3Q по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

58. Соединение по любому из воплощений 1-57, где полипептид MIC-1 содержит делецию остатка N3 (дез-N3) по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO:1.

59. Соединение по любому из воплощений 1-58, где полипептид MIC-1 содержит замену М57Е или M57L по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

60. Соединение по любому из воплощений 1-59, где полипептид MIC-1 содержит замену M86L или M86F по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

61. Соединение по воплощению 60, где полипептид MIC-1 дополнительно содержит замену Q90E или Т92Е по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

62. Соединение по любому из воплощений 1-61, где полипептид MIC-1 содержит замену Н66Е по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

63. Соединение по любому из воплощений 1-62, где полипептид MIC-1 содержит замену R67E по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

64. Соединение по любому из воплощений 1-63, где полипептид MIC-1 содержит делецию первых 3, 4, 5 или 6 остатков по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

65. Соединение по любому из воплощений 1-64, где полипептид MIC-1 содержит делецию первых 3 остатков по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

66. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 154 (M43L/дез-N3).

67. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 155 (M43L/Δ1-3).

68. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 156 (М57Е/Н66Е/дез-N3).

69. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 157 (M57L/Δ1-3).

70. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 158 (M57L/дез-N3).

71. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 159 (M86L/Δ1-3).

72. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 160 (M86L/дез-N3).

73. Соединение по любому из воплощений 1-56, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 222 (M57L, M86L/дез-N3).

74. Соединение по любому из воплощений 1-55, где полипептид MIC-1 имеет последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1.

75. Соединение MIC-1, содержащее полипептид MIC-1 и N-концевое удлинение аминокислотной последовательности, при этом соединение содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 или 164.

76. Соединение MIC-1, содержащее полипептид MIC-1 и N-концевое удлинение аминокислотной последовательности, при этом соединение содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 100, 104, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 или 164.

77. Соединение по любому из воплощений 1-76, демонстрирующее улучшенную растворимость по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

78. Соединение по любому из воплощений 1-77, демонстрирующее улучшенную растворимость по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1 при рН 8,0 в буферной системе на основе триса.

79. Соединение по любому из воплощений 1-78, где соединение демонстрирует улучшение в растворимости более чем в 2 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз и до 100 раз включительно по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1 при рН 8,0 в буферной системе на основе триса.

80. Соединение по любому из воплощений 1-79, где соединение имеет растворимость, составляющую 0,5, 1,0, 5,0, 10, 30 или 50 мг/мл при рН 8,0 в буферной системе на основе триса.

81. Соединение по воплощению 80, где соединение имеет растворимость, составляющую 30 мг/мл при рН 8,0 в буферной системе на основе триса.

82. Соединение по любому из воплощений 1-81, где соединение MIC-1 демонстрирует пониженную склонность к образованию кристаллов при рН 8,0 по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

83. Соединение по воплощению 82, где склонность к образованию кристаллов измеряют при рН 8,0 в буферной системе на основе триса.

84. Соединение по любому из воплощений 1-83, где соединение обладает низким риском в отношении иммуногенности.

85. Соединение по любому из воплощений 1-84, где соединение обладает улучшенной эффективностью in vivo в отношении уменьшения потребления пищи и/или снижения массы тела по сравнению с MIC-1 с SEQ ID NO: 1.

86. Соединение по любому из воплощений 1-85 для применения в качестве лекарственного средства.

87. Соединение по любому из воплощений 1-85 для применения в предупреждении и/или лечении метаболического расстройства.

88. Соединение по воплощению 87 для применения в предупреждении и/или лечении метаболического расстройства, при этом метаболическое расстройство представляет собой ожирение, диабет 2 типа, дислипидемию или диабетическую нефропатию.

89. Соединение по любому из воплощений 1-85 для применения в предупреждении и/или лечении расстройств приема пищи, таких как ожирение.

90. Соединение по воплощению 89 для применения в предупреждении и/или лечении ожирения посредством уменьшения потребления пищи, снижения массы тела, подавления аппетита и индуцирования насыщения.

91. Соединение по любому из воплощений 1-85 для применения в предупреждении и/или лечении сердечно-сосудистого заболевания.

92. Соединение по воплощению 91 для применения в предупреждении и/или лечении дислипидемии, артериосклероза, стеатогепатита или диабетической нефропатии.

93. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из воплощений 1-85 или его фармацевтически приемлемую соль, амид или сложный эфир и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

94. Применение соединения по любому из воплощений 1-85 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения метаболического расстройства, при этом метаболическое расстройство представляет собой ожирение, диабет 2 типа, дислипидемию или диабетическую нефропатию.

95. Применение соединения по любому из воплощений 1-85 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения расстройств приема пищи.

96. Применение соединения по любому из воплощений 1-85 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения ожирения.

97. Применение соединения по любому из воплощений 1-85 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения ожирения посредством уменьшения потребления пищи, снижения массы тела, подавления аппетита и индуцирования насыщения.

98. Применение соединения по любому из воплощений 1-85 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения сердечно-сосудистого заболевания.

99. Применение соединения по любому из воплощений 1-85 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения дислипидемии, артериосклероза, стеатогепатита или диабетической нефропатии.

100. Способ лечения и/или предупреждения метаболического расстройства путем введения фармацевтически активного количества соединения по любому из воплощений 1-85, при этом метаболическое расстройство представляет собой ожирение, диабет 2 типа, дислипидемию или диабетическую нефропатию.

101. Способ лечения и/или предупреждения расстройств приема пищи путем введения фармацевтически активного количества соединения по любому из воплощений 1-85.

102. Способ лечения и/или предупреждения ожирения путем введения фармацевтически активного количества соединения по любому из воплощений 1-85.

103. Способ лечения и/или предупреждения ожирения посредством уменьшения потребления пищи, снижения массы тела, подавления аппетита и индуцирования насыщения путем введения фармацевтически активного количества соединения по любому из воплощений 1-85.

104. Способ лечения и/или предупреждения сердечно-сосудистого заболевания путем введения фармацевтически активного количества соединения по любому из воплощений 1-85.

105. Способ лечения и/или предупреждения дислипидемии, артериосклероза, стеатогепатита или диабетической нефропатии путем введения фармацевтически активного количества соединения по любому из воплощений 1-85.

106. Молекула полинуклеотида, кодирующего соединение по любому из воплощений 1-85.

ПРИМЕРЫ

Список сокращений

"Основной пик" относится к пику на хроматограмме для проверки очистки, который имеет наибольшую интенсивность в ультрафиолетовой области (УФ) в миллиединицах поглощения и который содержит слитый белок.

HPLC обозначает высокоэффективную жидкостную хроматографию.

SDS-PAGE обозначает электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

IMAC обозначает аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом.

SEC обозначает гель-проникающую хроматографию.

MS обозначает масс-спектрометрию.

В этом описании буквы греческого алфавита могут быть представлены их символом или соответствующим словесным названием, например: α = альфа; β = бета; ε = эпсилон; γ = гамма; ω = омега; Δ = дельта; и так далее. Кроме того, греческая буква μ может быть представлена как "мк", например, в случае μл = мкл или в случае μМ = мкМ.

Конструирование соединений MIC-1

Согласно одному из аспектов изобретения конструировали соединения MIC-1, обладающие повышенной растворимостью. Согласно одному из аспектов изобретения этого достигали путем добавления N-концевого "кислого" удлинения к полипептиду MIC-1. Согласно одному из аспектов изобретения повышение растворимости и улучшение стабильности происходило в результате модификации аминокислотной последовательности полипептида MIC-1. Например, к N-концу полипептида MIC-1 добавляли удлинения и/или осуществляли модификацию в пределах аминокислотной последовательности полипептида MIC-1 (мутацию внутри последовательности).

Конструирование N-удлинений

При конструировании N-концевого удлинения аминокислотной последовательности удаляли остатки F, I, L, М, V, W и Y, поскольку они могли способствовать агрегации белка. Остатки Н, K и R также удаляли, поскольку они могли вызывать нежелательное связывание с клеточной мембраной. Предпочтительными для последовательности N-удлинения являются остатки А, Е, G, Р, S, Т, D, N и Q. В частности, предпочтительны остатки Е и D, поскольку они повышают растворимость, уменьшая значение pI соединения. В частности, для некоторых N-удлинений добавляли один или два дополнительных остатка аланина на самом N-конце, чтобы повысить эффективность удаления начального остатка метионина, когда соединения MIC-1 экспрессировали в E.coli.

Различные N-концевые удлинения аминокислотной последовательности конструировали с учетом приведенных выше принципов. Некоторые N-удлинения содержат последовательности, происходящие из белков человека (гуманизированные последовательности); некоторые содержат искусственно сконструированную(ые) последовательность(и) (например, GS, SG, АЕЕ, AES, GEPQ (SEQ ID NO: 123), GEPS (SEQ ID NO: 118)); некоторые содержат несколько повторов гуманизированных последовательностей или искусственных последовательностей; некоторые содержат комбинацию упомянутого выше. Было сконструировано несколько состоящих из 6 остатков последовательностей (6-меров). N-удлинения могут содержать один или более 6-меров, часть 6-меров (например, 1-5 остатков 6-меров) или комбинацию упомянутого выше. Аминокислотные остатки искусственных последовательностей (в том числе 6-меров) и гуманизированных последовательностей могут быть расположены в любом порядке.

Некоторые репрезентативные 6-меры и комбинации 6-меров приведены в Таблице 2.

Мутации внутри последовательности

Некоторые расположенные внутри остатки MIC-1 (SEQ ID NO: 1) модифицировали, например, посредством замены. Например, чтобы повысить растворимость соединений MIC-1, гидрофобный остаток MIC-1 можно заменить на гидрофильный остаток, предпочтительно на "кислый" остаток; положительно заряженный остаток можно заменить на "кислый" остаток и т.д. Для уменьшения окисления остаток метионина может быть заменен на остатки других аминокислот, например, Е, F или L.

Мутации внутри последовательности для повышения растворимости включают, но не ограничиваются этим: Р11Е, Н18Е, R21E, А30Е, А47Е, R53E, А54Е, М57Е, R67E, L68E, K69E, А75Е, А81Е, Р85Е, L105E и K107E.

Мутации внутри последовательности для уменьшения окисления включают, но не ограничиваются этим: M43L, М57Е, M57L, M86F и M86L.

Мутации внутри последовательности для повышения химической стабильности включают, но не ограничиваются этим: R2S, R2A, N3S N3E, N3A, N3T, N3P, N3G, N3V, N3H, N3Y и N3Q.

Расчет значений pI для соединений MIC-1

Рассчитанное значение pI для соединения MIC-1 по определению представляет собой рН, при котором общий рассчитанный заряд этого соединения равен нулю. Рассчитанный заряд соединения MIC-1 как функцию от рН получают с использованием значений pKa для аминокислотных остатков, описанных в Таблице 1, и способа, описанного В. Skoog и A. Wichman (Trends in Analytical Chemistry, 1986, vol. 5, pp. 82-83). Значение pKa для боковой цепи цистеина (Cys) включено в расчет заряда только для остатков цистеина со свободной сульфгидрильной группой. В качестве примера рассчитанное значение pI для wtMIC-1 человека в виде гомодимера составляет 8,8.

Как описано здесь и по всему этому документу, расчеты pI для соединений MIC-1, если не указано иное, выполняют для случая соединений MIC-1 в виде гомодимеров.

* Аминокислотные остатки в "GEPQ" или "GEPS" могут быть расположены в любом порядке.

Материалы и методы

Общие методы получения

Пример 1. Ферментация и экспрессия соединений MIC-1 кДНК для соединения MIC-1 субклонировали в приготовленный на основе pET11b вектор. Сверхэкспрессию соединений MIC-1 в виде телец включения индуцировали в Е. coli, используя 0,5 мМ изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG), когда плотность клеток достигала значения OD₆₀₀, равного 1,0. После непрерывного роста в ТВ в течение 20 ч при 37°С клетки собирали и готовили образцы как для жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (LC/MS), так и для сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC), чтобы подтвердить молекулярную массу.

Ферментацию осуществляли способом стационарного культивирования с подпиткой в среде определенного химического состава в качестве среды с добавками. Выход ферментации в значительной мере зависел от свойств соединений и варьировал от соединения к соединению в диапазоне от 1 г/л до 8 г/л.

Пример 2. Очистка и рефолдинг

Далее соединения MIC-1 очищали так, как приведено ниже.

Суспензию (20%-ную масс/об.) Е. coli в 10 мМ трис-буфере, рН 8,0, обрабатывали ультразвуком (в течение 5 минут на льду с интервалами включения/выключения по 3 секунды) и соединения MIC-1 собирали центрифугированием (10000 × д; в течение 30 минут). Тельца включения повторно солюбилизировали, используя 8 М мочевину в 20 мМ трисе, рН 8,0, и дебрис удаляли центрифугированием (10000 × д; в течение 30 минут). Соединения MIC-1 в полученном супернатанте собирали и разбавляли в буфере для рефолдинга (50 мМ трис, рН 8,5, и 10% DMF (диметилформамид) или 10% DMSO (диметилсульфоксид)) до конечной концентрации 0,1 мг/мл. Процесс рефолдинга продолжался в течение 48 часов в холодной комнате. Полученный раствор фильтровали через фильтр (0,4 мкм) и загружали на колонку для гидрофобных взаимодействий или применяли анионообменную хроматографию (50 мМ трис, рН 8,0, 0-500 мМ NaCl), используя смолу Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), как описано в общих чертах в Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes, Robert K. 3-е изд., 1994 (глава 6 и глава 8). В некоторых случаях выполняли дальнейшую очистку посредством гель-проникающей хроматографии с использованием колонки HiLoad 26/60 Superdex pg 75 (GE Healthcare), осуществляя процесс в 50 мМ трисе, рН 8,0, и 200 мМ NaCl. Для хранения соединения MIC-1 переносили в DPBS (забуференный фосфатом физиологический раствор по Дульбекко) и хранили в замороженном состоянии.

*N.D.: не определяли.

Пример 3. рН-зависимая растворимость соединений MIC-1 по изобретению

Цель этого эксперимента состояла в скрининге соединений MIC-1 с улучшенной растворимостью и в определении оптимального диапазона рН для композиции.

Соединения MIC-1 растворяли в смеси воды и этанола (60% воды и 40% этанола) в диапазоне концентраций от 3 мг/мл до 10 мг/мл. Растворитель выпаривали с использованием SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf) в течение 6 часов, получая указанное соединение MIC-1 в виде таблетки (пеллета).

Для анализа кривой зависимости растворимости от рН использовали приведенные ниже буферы: ацетатный буфер (от рН 3 до рН 6); трис-буфер (от рН 7 до рН 9); буфер на основе N-циклогексил-3-аминопропансульфоновой кислоты (CAPS) (от рН 10 до рН 11).

Буферы добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета вместе с соединениями MIC-1. Используемое количество может быть не точно одинаковым, но во всех случаях подразумевалось получение расчетной концентрации в пределах 12-18 мг/мл. Концентрацию соединений MIC-1 в супернатанте определяли посредством UPLC (Таблица 6). Не основании этих результатов установлено, что растворимость соединений MIC-1 по изобретению в диапазоне рН 6-9 была значительно выше по сравнению с таковой у wtMIC-1. Оптимальный диапазон рН для соединений MIC-1 приходился на тот диапазон рН, который является предпочтительным для композиции, например, рН 6,5-8,5.

Пример 4. Максимальная растворимость соединений MIC-1 при рН 8

Чтобы провести тестирование максимальной растворимости, соединения MIC-1 растворяли в смеси воды и этанола (60% воды и 40% этанола) в диапазоне концентраций от 3 мг/мл до 10 мг/мл. Затем аликвоты раствора (по 150 мкл на каждую лунку) переносили в 96-луночный планшет (Corning). Растворитель выпаривали с использованием SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf) в течение 6 часов, получая соединение MIC-1 в виде таблетки (пеллета). В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли трис-буфер (рН 8,0; без эксципиентов). Количество буфера, добавленного в лунку, было меньше количества, необходимого для растворения целиком этой таблетки в лунке, в результате чего достигали максимальной концентрации. Планшет встряхивали на планшетном шейкере при 800 об./мин (MixMate, Eppendorf) в течение 2 часов. Остаток таблетки удаляли центрифугированием при 3600 g в течение 5 мин. Супернатанты переносили в 96-луночный планшет с глубокими лунками и разбавляли в 20 раз 40%-ным этанолом. Затем все образцы анализировали с использованием UPLC (Acquity, Waters), планшетного ридера (Infinite М200 pro, Tecan) и УФ-спектрометра (NanoDrop 8000, Thermo Scientific) на предмет определения концентрации (Таблица 7).

На основании этих результатов установлено, что растворимость соединений MIC-1 по изобретению значительно улучшалась при рН 8,0. В частности, растворимость соединений MIC-1 с N-удлинениями достигала значений выше 30 мг/мл при рН 8,0.

Общие методы скрининга активности in vitro

Пример 5. Создание клеточной линии BHK21-hGFRAL-IRES-hRET

Цель этого примера состояла в разработке основанного на использовании клеток анализа in vitro для тестирования активности MIC-1. Клетки млекопитающих трансфицировали, и они стабильно экспрессировали полноразмерный рецептор MIC-1 (hGFRAL) и его полноразмерный участвующий в передаче сигнала корецептор hRET51.

Плазмиды, экспрессирующие полноразмерный hGFRAL и полноразмерный hRET51, конструировали путем вставки синтезированных ДНК-нуклеотидов, кодирующих полноразмерный hGFRAL и полноразмерный hRET51, в экспрессирующий вектор pEL для млекопитающих. IRES (участок внутренней посадки рибосомы) представляет собой обычно используемый линкер между двумя последовательностями ДНК, благодаря чему эти две последовательности ДНК могут совместно транслироваться в матричную РНК (мРНК). Остов вектора pEL был предоставлен компанией Taihegene CRO.

Два миллиона клеток ВНК21 рассевали в чашку Петри диаметром 10 см и культивировали в течение ночи в культуральной среде (DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) + 10% FBS (фетальная телячья сыворотка) + 1% PS (пенициллин/стрептомицин)). Клетки трансфицировали плазмидами pEL-hGFRAL-IRES-hRET. Трансфицированные клетки распределяли по новым чашкам (10 см) с разными плотностями и выращивали на селективной среде (DMEM+10% FBS+1% PS+G418 в концентрации 1 мг/мл) в течение более 2 недель для получения отдельных клонов. Отдельные клоны переносили в 6-луночные планшеты и культивировали до конфлюэнтности 100%. Экспрессию мРНК для hGFRAL и hRET измеряли с использованием количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Успешно трансфицированные клоны отбирали и тестировали на предмет связывания с MIC-1 (Фиг. 15 и Таблица 13).

Пример 6. Основанный на использовании клеток анализ активности MIC-1 in vitro

И wtMIC-1, и соединения MIC-1 индуцировали фосфорилирование ERK1/2 (pERK) в стабильных клетках линии BHK21-hGFRAL-IRES-hRET (Таблица 8). На основании этих результатов можно сделать вывод, что тройной комплекс MIC-1, GFRAL и RET фосфорилирует протеинтирозинкиназу RET, чтобы индуцировать активности MIC-1 in vivo через сигнальные пути, содержащие путь ERK/MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа), посредством фосфорилирования ERK1/2.

Результаты скрининга соединений MIC-1 с использованием ВНК21-hGFRAL-IRES-hRET показаны в Таблице 8. Соединения MIC-1, содержащие только N-удлинения, или аналоги MIC-1, содержащие только мутации внутри последовательности, достигали активности in vitro, равной или даже превышающей активность wtMIC-1. Кроме того, комбинация N-удлинения и мутаций внутри последовательности также могла приводить к аналогичной активности.

Повышение растворимости MIC-1 также может быть достигнуто в результате осуществления N-концевого слияния полипептидов MIC-1 с сывороточным альбумином человека (HSA). Известно, что в результате слияния с HSA растворимость MIC-1 может повышаться. На предмет активности in vitro тестировали два таких слитых белка HSA-MIC-1 (Таблица 9).

Наблюдали значительную потерю активности, демонстрирующую, что эти слитые с MIC-1 белки, обладающие высокой растворимостью, не сохраняли рецепторной активности.

Эффективность in vivo

Пример 7. Влияние соединений MIC-1 на потребление пищи тощими крысами Sprague Dawley

Эффективность соединений MIC-1 по изобретению in vivo измеряли на тощих самцах крыс Sprague Dawley в возрасте 9-11 недель. Животным делали инъекции один раз в сутки в дозе 8 нмоль/кг массы тела (4 нмоль/кг для двух слитых белков HSA-MIC-1) за 1-2 ч до наступления темнового периода. Соединения вводили подкожно (1-4 мл/кг) в соответствующем забуференном растворе. Изменения в потреблении пищи измеряли, используя автоматические системы мониторинга потребления пищи (систему BioDAQ и систему НМ2 для крыс). При использовании системы BioDAQ животных размещали поодиночке; при использовании системы НМ2 животных размещали группами до 3 животных включительно на одну клетку. Каждое соединение тестировали на n=4-8 животных. Животные проходили акклиматизацию в течение по меньшей мере 7 суток перед экспериментом. Собранные данные выражают в виде ежесуточного потребления пищи (потребления пищи за 24 часа), измеренного за период от наступления каждой ежесуточной 12-часовой темновой фазы до наступления темновой фазы следующих суток. Ежесуточные изменения в потреблении пищи в ответ на введенное соединение рассчитывали, вычитая значение для среднего ежесуточного потребления пищи в группе, получавшей разбавитель, из значения для среднего ежесуточного потребления в группе, подвергаемой лечению. Изменения считались значимыми, если при использовании двустороннего t-критерия Стьюдента получали р<0,1. Результаты выражают в виде "максимального уменьшения" в потреблении пищи по сравнению со случаем получения разбавителя (в процентах), зафиксированного в течение периода исследования. Кроме того, данные выражают в виде "суммарного уменьшения" в потреблении пищи, которое представляет собой сумму случаев значимых (р<0,1) ежесуточных уменьшений в потреблении пищи (в процентах) во время периода исследования.

Примечание: * означает, что введенная доза составляет 4 нмоль/кг массы тела.

Авторы изобретения неожиданным образом обнаружили, что эти соединения MIC-1 не только обладали повышенной растворимостью, но также и эффективностью, равной или даже превышающей таковую у wtMIC-1 (Таблица 10). Например, соединения, соответствующие SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106, имели максимальную и суммарную эффективность in vivo, которая на 40-50% превышала таковую у wtMIC-1 при подкожном введении. Кроме того, возрастание эффективности ассоциировали с повышением растворимости, поскольку соединения, соответствующие SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106, все обладали повышенной растворимостью и значительно более высокой эффективностью in vivo по сравнению с wtMIC-1. Эта корреляция, по-видимому, не объясняется изменениями E_max in vitro, поскольку все соединения в Таблице 10, за исключением соединения, соответствующего SEQ ID NO: 105, имели значение E_max, сравнимое с таковым для wtMIC-1. Фактически, соединение с SEQ ID NO: 105 имело более низкое значение E_max, чем wtMIC-1, и по-прежнему оставалось более эффективным, чем wtMIC-1, in vivo. Кроме того, эффективности in vitro были сопоставимы среди соединений, так как ни одно из соединений не имело значения ЕС₅₀, отличающегося от такового для wtMIC-1. Таким образом, связь между повышенной эффективностью in vivo и повышенной растворимостью является неожиданной и не может быть просто объяснена изменениями в повышенной активации рецепторов in vitro.

Пример 8. Экспрессия MIC-1 и эффективность удаления начального Met в случае разных 12-мерных блоков

В организме человека N-формилметионин распознается иммунной системой как чужеродное соединение или как сигнал тревоги, высвобождаемый поврежденными клетками, и стимулирует организм бороться с возможной инфекцией (James F. Zachary, М. Donald McGavin. Pathologic Basis of Veterinary Disease 5: Pathologic Basis of Veterinary Disease). В дополнение к этому, метионин является нестабильным остатком, который может легко окисляться. Поэтому эффективность отщепления N-Met очень важна для экспрессии MIC-1.

Имеются 4 разных типа 12-меров, и все они состоят из 3 остатков Ser, 2 остатков Pro, 2 остатков Gly, 2 остатков Thr, 2 остатков Glu и 1 остатка Ala. Однако, эти 12 остатков в каждом повторе располагаются по-разному.

Мало что известно о влиянии разных 12-меров на уровень экспрессии и эффективность отщепления N-Met. Таким образом, системное исследование соединений MIC-1, начинающихся с единичного и двойного 12-мера, соответственно, является крайне необходимым.

кДНК для соединения MIC-1 субклонировали в приготовленный на основе pET11b вектор. Сверхэкспрессию соединений MIC-1 в виде телец включения индуцировали в Е. coli, используя 0,5 мМ изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG), когда плотность клеток достигала значения OD₆₀₀, равного 1,0. После непрерывного роста в ТВ в течение 20 ч при 37°С клетки собирали и обрабатывали ультразвуком в буфере А (20 мМ трис, рН 8,0). Полученную смесь центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин и анализировали посредством LC/MS и SDS-PAGE, чтобы подтвердить молекулярную массу.

Ферментацию осуществляли способом стационарного культивирования с подпиткой в среде определенного химического состава в качестве среды с добавками. Выход ферментации в значительной мере зависел от свойств соединений и варьировал от соединения к соединению в диапазоне от 1 г/л до 8 г/л.

Соединения, сконструированные для тестирования единичных 12-меров, и результаты показаны в Таблице 11 и на Фиг. 1.

N/A: означает, что MIC-1 с N-удлинением не экспрессировался в Е. coli. АК означает аминокислоту.

Соединения, несущие двойные 12-меры, а также результаты приведены в Таблице 12 (см. Таблицу 12 и Фиг. 2).

N/A: означает, что соединение MIC-1 с N-удлинением не экспрессировалось в Е. coli.

В заключение отметим, что в случае N-удлинений, начиная с блока 12-мера-1, экспрессия в Е. coli отсутствовала. В случае других 12-мерных блоков экспрессии белка достигали, но только для 12-мера-4 в качестве начальной последовательности наблюдали полное отщепление метионина. Помимо этого, отщепление N-Met в случае серии 12-мера-2 осуществляется с большей эффективностью, чем в случае серии 12-мера-3.

Пример 9. Уровень экспрессии и содержание в тельцах включения пептидного соединения MIC-1 с 2* или 2,5*12-мерным N-удлинением

(1) Экспрессия соединения MIC-1 с 2,5*12-мерным N-удлинением

Способ получения белка см. в примере 8. Результаты показаны в Таблице 13, на Фиг. 3 и Фиг. 4.

Примечания: ".6" означает первые 6 АК 12-меров, "последние" означает последние 6 АК 12-меров, "внутри" означает 6 АК внутри 12-меров.

Несмотря на то, что протяженный 12-мер (6 АК) располагается на расстоянии 24 АК от N-конца, уровни экспрессии соединения MIC-1 значительно варьируют среди разных групп. Очевидно, что фрагмент, состоящий из 12-мера-1, не подходит для экспрессии, что согласуется с полученными ранее результатами. Средние уровни экспрессии конструкций 12-мер-(4+_+3.6) и -(4+_+4.6) относительно выше, чем в других случаях.

(2) Содержание в тельцах включения соединения MIC-1 с 2* или 2,5*12-мерным N-удлинением

Для крупномасштабного получения белка обычно хорошим выбором считаются тельца включения, главным образом благодаря их улучшенным свойствам в плане масштабирования, которые в основном включают: высокий уровень экспрессии, простоту стадии выделения и высокую степень чистоты, устойчивость к протеазам и хорошую воспроизводимость процесса.

Соединения MIC-1 могут быть экспрессированы либо в виде телец включения, либо в растворимой форме, что главным образом зависит от pI соединений и размера удлинения. Результаты показаны в Таблице 14 и на Фиг. 4.

Примечание: * приведенное здесь число представляет собой оценку с использованием SDS-PAGE.

Растворимость соединений MIC-1 с мутациями внутри последовательности показана в Таблице 15 и на Фиг. 5 (остовом является MIC-1-del(1-3)).

Исследовали способность соединений MIC-1, начинающихся с 12-мер-(4+2+_), -(4+4+_) и -(4+3+_), секретироваться в виде телец включения. Было показано, что содержание в тельцах включения составляет >90%, когда pI >5,1. Помимо этого, соединения MIC-1 с мутациями М57Е/Н66Е внутри последовательности экспрессировались главным образом в растворимых фракциях.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Novo Nordisk A/S

Zhang, Xujia

<120> СОЕДИНЕНИЯ MIC-1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 160031WO03

<160> 222

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Homo Sapiens

<400> 1

Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 2

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> MIC-1-дез-N3

<400> 2

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

1 5 10 15

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

20 25 30

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

35 40 45

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

50 55 60

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 3

<211> 109

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> MIC-1-Del(1-3)

<400> 3

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

1 5 10 15

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

20 25 30

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

35 40 45

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

50 55 60

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

85 90 95

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105

<210> 4

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 4

Ser Pro Ala Gly Ser Pro

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 5

Thr Ser Glu Ser Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 6

Thr Ser Thr Glu Pro Glu

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 7

Ser Glu Pro Ala Thr Ser

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 8

Thr Ser Thr Glu Glu Gly

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 9

Pro Glu Ser Gly Pro Gly

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 10

Ser Gly Ser Ala Pro Gly

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 11

Gly Ser Glu Thr Pro Gly

1 5

<210> 12

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 12

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20

<210> 13

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 13

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20

<210> 14

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 14

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly

20

<210> 15

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 15

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro

20 25 30

<210> 16

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 16

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro

20 25 30

<210> 17

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 17

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro

20 25 30

<210> 18

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 18

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr

20 25 30

<210> 19

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 19

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr

20 25 30

<210> 20

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 20

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr

20 25 30

<210> 21

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 21

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu

20 25 30

<210> 22

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 22

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu

20 25 30

<210> 23

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 23

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu

20 25 30

<210> 24

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 24

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser

20 25 30

<210> 25

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 25

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser

20 25 30

<210> 26

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 26

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser

20 25 30

<210> 27

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 27

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20 25 30

<210> 28

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 28

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20 25 30

<210> 29

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 29

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20 25 30

<210> 30

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 30

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20 25 30

<210> 31

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 31

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20 25 30

<210> 32

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 32

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20 25 30

<210> 33

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 33

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly

20 25 30

<210> 34

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 34

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly

20 25 30

<210> 35

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 35

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly

20 25 30

<210> 36

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 36

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20 25 30

<210> 37

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 37

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20 25 30

<210> 38

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 38

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20 25 30

<210> 39

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 39

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu

20 25 30

Ser Gly Pro Gly

35

<210> 40

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 40

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser

20 25 30

Thr Glu Glu Gly

35

<210> 41

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 41

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly

35

<210> 42

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 42

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser

20 25 30

Thr Glu Glu Gly

35

<210> 43

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 43

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu

20 25 30

Ser Gly Pro Gly

35

<210> 44

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 44

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly

35

<210> 45

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 45

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser

20 25 30

Glu Thr Pro Gly

35

<210> 46

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 46

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser

20 25 30

Thr Glu Glu Gly

35

<210> 47

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 47

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu

20 25 30

Ser Gly Pro Gly

35

<210> 48

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 48

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly

35

<210> 49

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 49

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser

20 25 30

Glu Thr Pro Gly

35

<210> 50

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 50

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser

20 25 30

Thr Glu Glu Gly

35

<210> 51

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 51

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu

20 25 30

Ser Gly Pro Gly

35

<210> 52

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 52

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly

35

<210> 53

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 53

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser

20 25 30

Glu Thr Pro Gly

35

<210> 54

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 54

Ala Glu Glu Ala Glu Ser

1 5

<210> 55

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 55

Ala Glu Ser Met

1

<210> 56

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 56

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser

1 5

<210> 57

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 57

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ser

20

<210> 58

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 58

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20

<210> 59

<211> 21

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 59

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Glu Glu Ala Glu Ser

20

<210> 60

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 60

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Glu Ser

<210> 61

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 61

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser

1 5 10

<210> 62

<211> 26

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 62

Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20 25

<210> 63

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 63

Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20

<210> 64

<211> 26

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 64

Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20 25

<210> 65

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 65

Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20

<210> 66

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 66

Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu

1 5 10

<210> 67

<211> 22

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 67

Ala Ala Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20

<210> 68

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 68

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20

<210> 69

<211> 25

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 69

Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu

1 5 10 15

Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro

20 25

<210> 70

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 70

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser

20 25 30

<210> 71

<211> 32

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 71

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

<210> 72

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 72

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

20

<210> 73

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 73

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 74

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 74

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Glu Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 75

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 75

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Glu Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 76

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 76

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu Glu Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 77

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 77

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Glu Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 78

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 78

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Glu Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 79

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 79

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Glu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 80

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 80

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Glu Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 81

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 81

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 82

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 82

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 83

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 83

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Glu Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 84

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 84

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Glu Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 85

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 85

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Glu Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 86

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 86

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Glu Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 87

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 87

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 88

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 88

Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Glu Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 89

<211> 115

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 89

Ala Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp

20 25 30

Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile

35 40 45

Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile

50 55 60

Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys

65 70 75 80

Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp

85 90 95

Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys

100 105 110

His Cys Ile

115

<210> 90

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 90

Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 91

<211> 118

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 91

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly

1 5 10 15

Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr

35 40 45

Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His

50 55 60

Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro

65 70 75 80

Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln

85 90 95

Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala

100 105 110

Lys Asp Cys His Cys Ile

115

<210> 92

<211> 132

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 92

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly

20 25 30

Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly

35 40 45

Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys

50 55 60

Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln

65 70 75 80

Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro

85 90 95

Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr

100 105 110

Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp

115 120 125

Cys His Cys Ile

130

<210> 93

<211> 136

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 93

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro

20 25 30

Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu

35 40 45

Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln

50 55 60

Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn

65 70 75 80

Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr

85 90 95

Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu

100 105 110

Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu

115 120 125

Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 94

<211> 130

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 94

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys

20 25 30

Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala

35 40 45

Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly

50 55 60

Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys

65 70 75 80

Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys

85 90 95

Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr

100 105 110

Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His

115 120 125

Cys Ile

130

<210> 95

<211> 127

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 95

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Glu Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

20 25 30

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

35 40 45

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

50 55 60

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

65 70 75 80

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

85 90 95

Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

100 105 110

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

115 120 125

<210> 96

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 96

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Ser Gly Asp His Cys

1 5 10 15

Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser

20 25 30

Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val

35 40 45

Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala

50 55 60

Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp

65 70 75 80

Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val

85 90 95

Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp

100 105 110

Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

115 120

<210> 97

<211> 138

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 97

Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ala Arg Asn Gly Asp His

20 25 30

Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala

35 40 45

Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu

50 55 60

Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala

65 70 75 80

Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro

85 90 95

Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met

100 105 110

Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp

115 120 125

Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 98

<211> 136

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 98

Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ala Ala Glu Gly Asp His Cys Pro

20 25 30

Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu

35 40 45

Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln

50 55 60

Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn

65 70 75 80

Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr

85 90 95

Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu

100 105 110

Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu

115 120 125

Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 99

<211> 135

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 99

Ala Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser

1 5 10 15

Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu

20 25 30

Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu

35 40 45

Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val

50 55 60

Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met

65 70 75 80

His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val

85 90 95

Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile

100 105 110

Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu

115 120 125

Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 100

<211> 131

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 100

Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg

20 25 30

Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp

35 40 45

Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile

50 55 60

Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile

65 70 75 80

Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys

85 90 95

Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp

100 105 110

Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys

115 120 125

His Cys Ile

130

<210> 101

<211> 121

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 101

Ala Ala Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu Gly Asp His Cys

1 5 10 15

Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser

20 25 30

Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val

35 40 45

Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala

50 55 60

Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp

65 70 75 80

Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val

85 90 95

Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp

100 105 110

Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

115 120

<210> 102

<211> 131

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 102

Ala Ala Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg

20 25 30

Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp

35 40 45

Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile

50 55 60

Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile

65 70 75 80

Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys

85 90 95

Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp

100 105 110

Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys

115 120 125

His Cys Ile

130

<210> 103

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 103

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 104

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 104

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 105

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 105

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 106

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 106

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 107

<211> 134

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 107

Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu

1 5 10 15

Pro Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Asp His Cys Pro Leu Gly

20 25 30

Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp

35 40 45

Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr

50 55 60

Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His

65 70 75 80

Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro

85 90 95

Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln

100 105 110

Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala

115 120 125

Lys Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 108

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 108

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 109

<211> 141

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 109

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

35 40 45

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

65 70 75 80

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

85 90 95

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

100 105 110

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

115 120 125

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135 140

<210> 110

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 110

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 111

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 111

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 112

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 112

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu Glu Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 113

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 113

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 114

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 114

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 115

<211> 140

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 115

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Gly

20 25 30

Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val

35 40 45

Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro

50 55 60

Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe

65 70 75 80

Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu

85 90 95

Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn

100 105 110

Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr

115 120 125

Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135 140

<210> 116

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 116

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 117

<211> 135

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 117

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu

20 25 30

Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu

35 40 45

Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val

50 55 60

Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met

65 70 75 80

His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val

85 90 95

Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile

100 105 110

Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu

115 120 125

Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 118

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 118

Gly Glu Pro Ser

1

<210> 119

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 119

Gly Pro Ser Glu

1

<210> 120

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 120

Gly Pro Glu Ser

1

<210> 121

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 121

Gly Ser Pro Glu

1

<210> 122

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 122

Gly Ser Glu Pro

1

<210> 123

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 123

Gly Glu Pro Gln

1

<210> 124

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 124

Gly Glu Gln Pro

1

<210> 125

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 125

Gly Pro Glu Gln

1

<210> 126

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 126

Gly Pro Gln Glu

1

<210> 127

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 127

Gly Gln Glu Pro

1

<210> 128

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 128

Gly Gln Pro Glu

1

<210> 129

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 129

Pro Glu Asp Glu Glu Thr Pro Glu Gln Glu

1 5 10

<210> 130

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 130

Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu

1 5 10

<210> 131

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 131

Pro Ala Ala Glu Glu Glu Asp Asp Pro Asp

1 5 10

<210> 132

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 132

Ala Glu Pro Asp Glu Asp Pro Gln Ser Glu Asp

1 5 10

<210> 133

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 133

Ala Glu Pro Asp Glu Asp Pro Gln Ser Glu

1 5 10

<210> 134

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 134

Ala Glu Pro Glu Glu Gln Glu Glu Asp

1 5

<210> 135

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 135

Ala Glu Pro Glu Glu Gln Glu Glu

1 5

<210> 136

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 136

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 137

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 137

Gly Ser Gly Ser

1

<210> 138

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 138

Gly Gly Ser Ser

1

<210> 139

<211> 4

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 139

Ser Ser Ser Gly

1

<210> 140

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 140

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ser

20

<210> 141

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 141

Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu Gly Pro Ser Glu

1 5 10 15

Gly Pro Ser Glu

20

<210> 142

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 142

Gly Pro Glu Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Glu Ser

1 5 10 15

Gly Pro Glu Ser

20

<210> 143

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 143

Gly Ser Pro Glu Gly Ser Pro Glu Gly Ser Pro Glu Gly Ser Pro Glu

1 5 10 15

Gly Ser Pro Glu

20

<210> 144

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 144

Gly Ser Glu Pro Gly Ser Glu Pro Gly Ser Glu Pro Gly Ser Glu Pro

1 5 10 15

Gly Ser Glu Pro

20

<210> 145

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 145

Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln

1 5 10 15

Gly Glu Pro Gln

20

<210> 146

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 146

Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro Gly Glu Gln Pro

1 5 10 15

Gly Glu Gln Pro

20

<210> 147

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 147

Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln

1 5 10 15

Gly Pro Glu Gln

20

<210> 148

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 148

Gly Pro Gln Glu Gly Pro Gln Glu Gly Pro Gln Glu Gly Pro Gln Glu

1 5 10 15

Gly Pro Gln Glu

20

<210> 149

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 149

Gly Gln Glu Pro Gly Gln Glu Pro Gly Gln Glu Pro Gly Gln Glu Pro

1 5 10 15

Gly Gln Glu Pro

20

<210> 150

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 150

Gly Gln Pro Glu Gly Gln Pro Glu Gly Gln Pro Glu Gly Gln Pro Glu

1 5 10 15

Gly Gln Pro Glu

20

<210> 151

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 151

Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu

1 5 10 15

<210> 152

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 152

Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser

1 5

<210> 153

<211> 31

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 153

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr

1 5 10 15

Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro

20 25 30

<210> 154

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 154

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

1 5 10 15

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

20 25 30

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Leu Cys Ile Gly Ala Cys Pro

35 40 45

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

50 55 60

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 155

<211> 109

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 155

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

1 5 10 15

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

20 25 30

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Leu Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

35 40 45

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

50 55 60

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

85 90 95

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105

<210> 156

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 156

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

1 5 10 15

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

20 25 30

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

35 40 45

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

50 55 60

Glu Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 157

<211> 109

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 157

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

1 5 10 15

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

20 25 30

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

35 40 45

Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

50 55 60

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

85 90 95

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105

<210> 158

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 158

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

1 5 10 15

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

20 25 30

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

35 40 45

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

50 55 60

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 159

<211> 109

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 159

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

1 5 10 15

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

20 25 30

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

35 40 45

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

50 55 60

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

85 90 95

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105

<210> 160

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 160

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

1 5 10 15

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

20 25 30

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

35 40 45

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

50 55 60

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 161

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 161

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

20 25 30

Gly Glu Pro Ser

35

<210> 162

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 162

Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln

1 5 10 15

Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln Gly Glu Pro Gln

20 25 30

Gly Glu Pro Gln

35

<210> 163

<211> 25

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 163

Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Glu Pro Gln Gly Gln Glu

1 5 10 15

Pro Gln Pro Gly Glu Pro Glu Gly Gln

20 25

<210> 164

<211> 143

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 164

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

35 40 45

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

50 55 60

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

65 70 75 80

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

85 90 95

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

100 105 110

Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

115 120 125

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135 140

<210> 165

<211> 134

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 165

Ala Gly Pro Glu Gln Gly Gln Glu Pro Gly Glu Pro Gln Gly Gln Glu

1 5 10 15

Pro Gln Pro Gly Glu Pro Glu Gly Gln Gly Asp His Cys Pro Leu Gly

20 25 30

Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp

35 40 45

Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr

50 55 60

Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His

65 70 75 80

Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro

85 90 95

Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln

100 105 110

Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala

115 120 125

Lys Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 166

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 166

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly

1 5 10

<210> 167

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 167

Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

1 5 10

<210> 168

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 168

Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly

1 5 10

<210> 169

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 169

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly

1 5 10

<210> 170

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 170

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20

<210> 171

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 171

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly

20

<210> 172

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 172

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20

<210> 173

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 173

Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20

<210> 174

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 174

Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20

<210> 175

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 175

Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly

20

<210> 176

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 176

Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20

<210> 177

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 177

Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly

1 5 10 15

Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20

<210> 178

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 178

Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly

20

<210> 179

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 179

Thr Ser Thr Glu Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Glu Ser Gly Ser Ala Pro Gly

20

<210> 180

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 180

Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20

<210> 181

<211> 24

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 181

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly

20

<210> 182

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 182

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 183

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 183

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu

20 25 30

<210> 184

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 184

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu

20 25 30

<210> 185

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 185

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20 25 30

<210> 186

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 186

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr

20 25 30

<210> 187

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 187

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser

20 25 30

<210> 188

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 188

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser

20 25 30

<210> 189

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 189

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly

20 25 30

<210> 190

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 190

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr

20 25 30

<210> 191

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 191

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu

20 25 30

<210> 192

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 192

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser

20 25 30

<210> 193

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 193

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu

20 25 30

<210> 194

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 194

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser

20 25 30

<210> 195

<211> 32

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 195

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln

20 25 30

<210> 196

<211> 32

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 196

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

20 25 30

<210> 197

<211> 36

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 197

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly

35

<210> 198

<211> 48

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 198

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly

35 40 45

<210> 199

<211> 60

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> N-концевое удлинение

<400> 199

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly

35 40 45

Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly

50 55 60

<210> 200

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 200

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 201

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 201

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 202

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 202

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 203

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 203

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 204

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 204

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 205

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 205

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 206

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 206

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 207

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 207

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 208

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 208

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 209

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 209

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Glu Gly Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 210

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 210

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 211

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-termnal extension

<400> 211

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Glu Ser Ala Thr Pro Glu Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 212

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 212

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 213

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 213

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 214

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 214

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 215

<211> 141

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 215

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Pro Glu Gln Gly Pro Glu Gln

20 25 30

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

35 40 45

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

65 70 75 80

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

85 90 95

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

100 105 110

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

115 120 125

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135 140

<210> 216

<211> 141

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 216

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Gly Glu Pro Ser Gly Glu Pro Ser

20 25 30

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

35 40 45

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

50 55 60

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

65 70 75 80

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

85 90 95

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

100 105 110

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

115 120 125

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135 140

<210> 217

<211> 147

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 217

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg

35 40 45

Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp

50 55 60

Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile

65 70 75 80

Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile

85 90 95

Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys

100 105 110

Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp

115 120 125

Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys

130 135 140

His Cys Ile

145

<210> 218

<211> 159

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 218

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly

35 40 45

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

50 55 60

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

65 70 75 80

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

85 90 95

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

100 105 110

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

115 120 125

Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

130 135 140

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

145 150 155

<210> 219

<211> 172

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 219

Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly

35 40 45

Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala Arg Asn Gly

50 55 60

Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val

65 70 75 80

Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro

85 90 95

Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe

100 105 110

Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu

115 120 125

Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn

130 135 140

Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr

145 150 155 160

Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

165 170

<210> 220

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 220

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro

20 25 30

Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu

35 40 45

Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met

50 55 60

Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Glu His Ala

65 70 75 80

Gln Ile Lys Thr Ser Leu Glu Glu Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala

85 90 95

Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys

100 105 110

Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys

115 120 125

Asp Cys His Cys Ile

130

<210> 221

<211> 139

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1 плюс N-концевое удлинение

<400> 221

Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Gly Asp

20 25 30

His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg

35 40 45

Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Asn Glu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Glu Leu Lys

85 90 95

Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro

100 105 110

Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr

115 120 125

Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

130 135

<210> 222

<211> 111

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Полипептид MIC-1

<400> 222

Ala Arg Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu

1 5 10 15

His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val

20 25 30

Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro

35 40 45

Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Leu His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu

50 55 60

His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Asn Pro Leu Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser

85 90 95

Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<---

Claims (2)

1. Соединение ингибирующего макрофаги цитокина-1 (MIC-1), состоящее из полипептида MIC-1 и N-концевого удлинения аминокислотной последовательности, имеющее аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 89-117, 164, 165, 182, 200-221.

2. Применение соединения по п. 1 для предупреждения или лечения ожирения.

Images