JP6696915B2 - Ｍｉｃ−１融合タンパク質及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、MIC-1融合タンパク質及びその医薬使用に関する。
配列表の参照による組込み
配列表は「配列表」と表題を付けており、28154バイトで、2015年6月11日に作成したもので、参照により本明細書に組み込まれる。
マクロファージ阻害性サイトカイン(MIC-1)は、GDF-15及び胎盤骨形態形成タンパク質(PLAB)としても知られ、細胞増殖及び分化に関与しているペプチドホルモンのファミリーである、TGF-ベータスーパーファミリーの遠いメンバーである。MIC-1は、分子量24.5kDaのシステインリッチホモ二量体として循環している。MIC-1は最初、IL-1b、TNF-アルファ、IL-2、及びTGF-bを含む刺激によりマクロファージにおいて上方調節されていると報告された。MIC-1がリポ多糖誘導TNF-アルファ産生を減少させることができることも明らかにされ、MIC-1が抗炎症性サイトカインであることは提唱されたこれらのデータに基づいていた。つい最近、進行がんのヒト患者がどうして体重が減少するのかをある研究が調べ、患者たちは体重減がMIC-1の循環レベルと相関していることを示した。これらのデータは、MIC-1が体重を調節していることを示している。この仮説は、前立腺腫瘍細胞を異種移植されたマウスにおいて試され、データは、上昇したMIC-1レベルが体重減及び食物摂取量の減少と関連があり、この効果はMIC-1の抗体の投与により逆転されることを明らかにした。組換えMIC-1をマウスに投与すると視床下部神経ペプチドY及びプロオピオメラノコルチンが調節されたので、MIC-1は中枢機構により食物摂取量を調節することが提唱された。更に、MIC-1を過剰発現しているトランスジェニックマウスは、正常な低脂肪食でも高脂肪食でも増える体重及び体脂肪は少ない。その上、それぞれ低脂肪食と高脂肪食の両方で飼育されているMIC-1を過剰発現しているトランスジェニックマウスは、同等食の野生型動物と比べると耐糖能が改善されていた。
天然のMIC-1は半減期が短く、天然のMIC-1を用いた処置では効力を維持するためには毎日投与が必要であることになる。
WO2001079443は、医薬的関心のあるペプチドへの融合のためのヒト血清アルブミン又はその変異体の使用に関する。
WO2005099746は、MIC-1調節剤を投与することにより食欲及び/又は体重を調節する方法に関する。
WO2001079443 WO2005099746 WO2008/043847
Mccurdy, Tら、Journal of Laboratory and Clinical Medicine、143巻、2号、2004年、115〜124頁 Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989年 Cordingley ら、J. Virol. 1989年、63、5037〜5045頁 Birchら、Protein Expr Purif.、1995年、6、609〜618頁 Chichら、Anal. Biochem、1995年、224、245〜249頁 Xinら、Protein Expr. Purif. 2002年、24、530〜538頁 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (例えば19th edition (1995)、and any later editions) DurocherらNucleic Acid Research、2002年 Bizanek, R.; Manes, J. D.; Fujinari, E. M. Chemiluminescent nitrogen detection as a new technique for purity assessment of synthetic peptides separated by reversed-phase HPLC. Pept. Res. 1996年、9 (1)、40〜44頁 Kleinova Aら、Rapid Commun. Mass Spectrom、2005年; 19: 2965〜2973頁
本発明はMIC-1融合タンパク質に関する。
一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを介して接続された、融合タンパク質のC末端のMIC-1タンパク質又はその類似体と、融合タンパク質のN末端のヒト血清アルブミン(HSA)の機能的変異体とを含む融合タンパク質を含む化合物を提供する。ペプチドリンカーは10から50アミノ酸の長さがあり、アミノ酸配列[X-Ym]nを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2である。
本発明の一態様では、Yは、Pro及びGlyを除くコードされたアミノ酸の群から選択される。別の態様では、Yは、Pro及びGlyを除くコードされた非極性アミノ酸の群から選択される。
一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを介して接続された、融合タンパク質のC末端のMIC-1タンパク質又はその類似体と、融合タンパク質のN末端のヒト血清アルブミンの機能的変異体とを含む融合タンパク質を含む化合物をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステル及び1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明の化合物を提供する。
一態様では、本発明は、例えば、食物摂取量を減らし、体重を減少させ、食欲を抑制し、満腹を誘導することによる、肥満等の摂食障害の処置において使用するための本発明の化合物を提供する。
一態様では、本発明は、肥満の処置において使用するための本発明の化合物を提供する。
一態様では、本発明の化合物はMIC-1アゴニストである。一態様では、本発明の化合物は食物摂取を阻害する。一態様では、本発明の化合物は体重を下げる。
一態様では、本発明の化合物は、天然のMIC-1の半減期よりも長い半減期を有する。
は、HSA-MIC-1二量体融合タンパク質の略図である。A、B及びCは、それぞれヒト血清アルブミンドメイン、リンカー領域及びMIC-1の相対的な位置を描いている。-SS-は、2つのHSA-MIC-1単量体を互いに連結して機能的な二量体融合タンパク質を形成する鎖間ジスルフィド架橋を示している。
本発明はMIC-1融合タンパク質を含む化合物に関する。一態様では、本発明はMIC-1融合タンパク質に関する。
一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを介して接続された、融合タンパク質のC末端のMIC-1又はその類似体と、融合タンパク質のN末端のヒト血清アルブミン(HSA)又はその機能的変異体とを含む融合タンパク質を含む化合物を提供する。ペプチドリンカーは10から50アミノ酸の長さがあり、アミノ酸配列[X-Ym]nを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2である。
本発明の一態様では、Yは、Pro及びGlyを除くコードされたアミノ酸の群から選択される。別の態様では、Yは、Pro及びGlyを除くコードされた非極性アミノ酸の群から選択される。
本発明の融合タンパク質戦略は、可溶性で安定な血漿タンパク質ヒト血清アルブミンと天然のMIC-1又はMIC-1類似体を組み合わせる。ヒト血清アルブミンは、発現収量を改善しMIC-1に安定性を授けるための融合パートナーとして使用することを有利にする高可溶性及び安定性等の固有の特性を有する。融合パートナーとしてのヒト血清アルブミンは、腎クリアランスを阻害する著しいサイズ増加により並びに/又はエンドソームからの再利用及び分子が循環中もっと長く存在できるようにするリソソーム分解の防止を可能にするFc新生児型受容体に結合することにより、MIC-1の血漿半減期を増加させることもできる。他のもっと小さな治療タンパク質の場合と同様に、天然のMIC-1は短い血漿半減期のせいで血流から急速に消失し、天然のMIC-1を用いた処置では有効性を維持するためには毎日投与が必要であることになる。本発明は、血漿半減期が増加したMIC-1融合タンパク質を含む化合物を提供する。
以下では、ギリシャ文字は、その記号又は対応する名称、例えば、α=アルファ、β=ベータ、ε=イプシロン、γ=ガンマ、ω=オメガ等により表すことがある。ギリシャ文字のμは、「u」により、例えば、μl=ulで、又はμM=uMで表すことがある。
MIC-1タンパク質及び類似体
本明細書で使用される用語「MIC-1」とは、増殖分化因子15(GDF-15)及び胎盤骨形態形成タンパク質(PLAB)としても知られるマクロファージ阻害性サイトカイン-1(MIC-1)を意味する。完全長野生型ヒトMIC-1タンパク質の配列はUNIPROTデータベース、受託番号Q99988から入手可能である。308アミノ酸前駆タンパク質は、シグナルペプチド(アミノ酸1〜29)、プロペプチド(アミノ酸30〜196)及び成熟タンパク質(アミノ酸197〜308)を含む。112アミノ酸成熟MIC-1タンパク質は配列番号1として本明細書に含まれている。成熟MIC-1は、4つの鎖内ジスルフィド結合と1つの鎖間ジスルフィド結合の形成を生じて共有結合した24.5kDaホモ二量体を生み出す9システイン残基を含有する。成熟タンパク質(配列番号1)中のHis6Aspに対応する天然に存在する突然変異は既に記載されている。
したがって、野生型ヒトMIC-1の特定の例は配列番号1の成熟MIC-1タンパク質であり、配列番号1はアミノ酸改変His6Asp、並びに上で言及したプロペプチド及び/又はシグナルペプチドが先行するこれらの配列のいずれでも有する。
本明細書で使用される用語「MIC-1タンパク質」は、配列番号1のヒトMIC-1タンパク質、又はその類似体を指す。配列番号1の配列を有するタンパク質は、「hMIC-1」、「天然」MIC-1又は「野生型」MIC-1とも称する。
本明細書で使用される用語「MIC-1類似体」又は「MIC-1タンパク質の類似体」は、成熟MIC-1タンパク質(配列番号1)の変異体であるタンパク質、又は化合物を指す。一態様では、MIC-1類似体は、成熟MIC-1タンパク質(配列番号1)の機能的変異体である。本発明の一態様では、MIC-1類似体は、天然MIC-1(配列番号1)に少なくとも85%、90%又は95%の配列同一性を示す。
本発明の別の態様では、MIC-1類似体は、ヒト天然MIC-1(配列番号1)と比べて17未満のアミノ酸改変(置換、欠失、付加(挿入を含む)及びその任意の組合せ)を含む。2つの類似体間の配列同一性を決定するための方法の例として、2つのペプチドHis6Asp MIC-1と天然MIC-1を整列させる。天然MIC-1と比べたHis6Asp MIC-1類似体の配列同一性は、整列された同一残基の数引く異なる残基の数割る天然MIC-1中の残基の総数により与えられる。したがって、前記例では、百分率での配列同一性は(112-1)/112×100である。
本出願全体を通じて使用される用語「アミノ酸改変」は、天然MIC-1(配列番号1)と比べた場合のアミノ酸への改変という意味において使用される。この改変は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、1つのアミノ酸の別のアミノ酸又はペプチドのアミノ酸に共有結合された置換基での置換の結果であることが可能である。
置換
一態様では、アミノ酸は保存的置換により置換することができる。本明細書で使用される用語「保存的置換」とは、1つ又は複数のアミノ酸が別の生物学的に類似する残基で置き換えられることを意味する。例には、特徴が類似するアミノ酸残基の、例えば、小アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸及び芳香族アミノ酸の置換が含まれる。
一態様では、アミノ酸は非保存的置換により置換することができる。本明細書で使用される用語「非保存的置換」とは、1つ又は複数のアミノ酸が異なる特徴を有する別のアミノ酸により置き換えられることを意味する。例には、塩基性アミノ酸残基の酸性アミノ酸残基での置換、極性アミノ酸残基の芳香族アミノ酸残基での置換、等が含まれる。一態様では、非保存的置換は、コードされたアミノ酸の異なる特徴を有する別のコードされたアミノ酸への置換である。一態様では、MIC-1類似体は、1つ又は複数の非天然及び/又は非アミノ酸、例えば、アミノ酸模倣物のMIC-1配列内への置換を含むことができる。
ヒト成熟MIC-1(配列番号1)の3位のアスパラギン残基は化学的に不安定である。本発明の一態様では、ヒト成熟MIC-1(配列番号1)の3位に対応する位置のアスパラギンはSer、Asp、Glu、Ala、Pro、Thr、Gly、又はGlnに置換することができる。本発明の一態様では、ヒト成熟MIC-1(配列番号1)の3位に対応する位置のアスパラギンはSerに置換されている。本発明の別の態様では、ヒト成熟MIC-1(配列番号1)の3位に対応する位置のアスパラギンはGluに置換されている。
本発明の一態様では、ヒト成熟MIC-1(配列番号1)の2位に対応する位置のアルギニンはアラニンに置換されている。
本発明の一態様では、ヒト成熟MIC-1(配列番号1)の2位に対応する位置のアルギニンはアラニンに置換されており、ヒト成熟MIC-1(配列番号1)の3位に対応する位置のアスパラギンはGluに置換されている。
欠失及びトランケーション
一態様では、本発明のMIC-1類似体は、単独で又は1つ若しくは複数の挿入若しくは置換と組み合わせて、1つ又は複数のアミノ酸残基がヒトMIC-1のアミノ酸配列から欠失していてもよい。
一態様では、ヒト成熟MIC-1の3つのN末端アミノ酸(Ala1、Arg2、Asn3)が欠失していてもよい。
挿入
一態様では、本発明のMIC-1類似体は、単独で又は1つ若しくは複数の欠失及び/若しくは置換と組み合わせて、1つ又は複数のアミノ酸残基がヒトMIC-1のアミノ酸配列に挿入されていてもよい。
一態様では、本発明のMIC-1類似体は、MIC-1の配列中への1つ又は複数の非天然アミノ酸及び/又は非アミノ酸の挿入を含むことができる。
MIC-1類似体は、i)変更されているアミノ酸残基に対応する成熟MIC-1タンパク質中のアミノ酸残基の数(すなわち、天然のMIC-1中の対応する位置)に、及びii)実際の変更に言及することにより記載することができる。言い換えると、MIC-1類似体は、天然のMIC-1(配列番号1)と比べた場合、いくつかのアミノ酸残基に変更されているMIC-1タンパク質である。これらの変更は、独立的に、1つ又は複数のアミノ酸置換、付加及び/又は欠失を表すことができる。
上の例から明らかなように、アミノ酸残基は、そのフルネーム、その1文字コード、及び/又はその3文字コードにより特定することができる。これら3つのやり方は完全に等価である。
例えば、MIC-1タンパク質という文脈において使用される用語「タンパク質」は、アミド(又はペプチド)結合により相互接続されている一連のアミノ酸を含む化合物を指す。
アミノ酸はアミン基及びカルボン酸基、並びに場合によって、側鎖と呼ばれることが多い1つ又は複数の追加の基を含有する分子である。
用語「アミノ酸」にはコードされる(又はタンパク新生若しくは天然の)アミノ酸(その中でも20の標準アミノ酸)、並びに非コード(又は非タンパク新生若しくは非天然の)アミノ酸が含まれる。コードされたアミノ酸は、タンパク質に天然に組み込まれているアミノ酸である。標準アミノ酸は遺伝コードによりコードされているアミノ酸である。非コードアミノ酸はタンパク質中には含まれない、又は標準細胞機構によって産生されない(例えば、非コードアミノ酸は翻訳後修飾を受けている可能性がある)。以下では、光学異性体について述べられていないMIC-1タンパク質の全てのアミノ酸はL-異性体を意味すると理解されるべきである(他の方法で明記されない限り)。
ヒト血清アルブミン
ヒト血清アルブミン(HSA)は球状タンパク質のファミリーに属し、585アミノ酸で構成されており、おおよその分子量は67kDaである。アルブミンは、会合すると心臓形の分子を形成する3つの相同ドメインを含む。アルブミンは水溶性であり濃縮された塩溶液に溶け、一般には血漿中に含まれる。アルブミンはヒト血漿のうち最も豊富にあるタンパク質であり、その主な機能は、血液の浸透圧を調節し、ホルモン又は脂肪酸を輸送し、pHを緩衝することである。成人でのヒト血清アルブミンの正常範囲は35から50g/Lであり、ヒト血清アルブミンは全血漿タンパク質の80〜90%を占める。ヒト血清アルブミンは外来性リガンドに対する天然の担体であるので、毒性及び免疫原性を誘導するリスクは低く、ヒト血液から抽出されるヒト血清アルブミンは臨床目的に使用することが可能である。ヒト血清アルブミンの血漿半減期はおおよそ20日である。ヒト血清アルブミンの長い半減期は、一部には新生児型Fc受容体(FcRn)により媒介されるpH依存性再利用により引き起こされる。FcRnは、細胞中及び血管内皮細胞等の循環している血液と相互作用する細胞の表面に存在している。
対象の治療タンパク質を含む組換えヒト血清アルブミン融合タンパク質は、ヒト血清アルブミン又はその断片をコードするDNAが治療タンパク質をコードするDNAに結合されるように遺伝子操作により達成することができる。次に、適切な発現宿主は、融合タンパク質を発現するのに適したプラスミドにコードされた融合ヌクレオチド配列で形質転換される又はトランスフェクトされる。融合パートナーとしてのヒト血清アルブミンは2つの生物学的機構を通じて治療タンパク質の血漿半減期を増加させると考えられている。サイズの著しい増加により腎クリアランスが阻害され、Fc新生児型受容体に結合するヒト血清アルブミンの固有の能力によりエンドソームからの再利用及びリソソーム分解の防止が可能になり、合わせて分子は循環中で更に長く存在できるようになる。
アルブミン融合タンパク質は、発現系において商業規模で及び血漿半減期の長い治療タンパク質を作製する他の方法よりも低いコストで産生することが可能である。
野生型と同じ血漿半減期延長効果を有するヒト血清アルブミンの機能的変異体(切断型及び/又はアミノ酸置換された機能的変異体)を設計することが可能であることは当業者には公知である。例えば、ヒト血清アルブミンのドメインIIIはFcNに高度に結合することが明らかにされており、このドメインのみを又は、長い半減期若しくは改変されている半減期を有する他のドメインとの組合せを含む変異体を作製することが可能である(例えば、Albufuse Flex Technology、Novozymes社)。
野生型成熟ヒト血清アルブミンの配列は配列番号2として本明細書に含まれており、その配列はUniprotデータベースに受託番号P02768で注釈が付けられている。本発明は、生物学的に活性なMIC-1タンパク質又はその変異体並びにヒト血清アルブミンの生物学的に活性な及び/又は治療的に活性な断片又は変異体を含む、又は代わりにからなるヒト血清アルブミン融合タンパク質を提供する。一態様では、本発明は、成熟天然MIC-1及び成熟天然ヒト血清アルブミンを含む、又は代わりにからなるヒト血清アルブミン融合タンパク質を提供する。本発明の一態様では、ヒト血清アルブミンの一次配列は改変されている。非限定的例には、ヒト血清アルブミンの半減期延長効果を妨げない、トランケーション又はアミノ酸置換若しくは欠失をヒト血清アルブミン中に含むヒト血清アルブミンの機能的変異体が含まれる。ヒト血清アルブミンは、ドメインIの34位に不対システイン残基からの単一チオール基を含有する。ヒト血清アルブミンのCys34は酸化防止活性を提供し、血液中では遊離のチオール基の最大部分を構成する。2つのヒト血清アルブミン分子のCys34-Cys34ジスルフィド連鎖には、調製中の他の残基との副反応、低い安定性又はタンパク質凝集を促進する構造変化を含むいくつかの不利な点がある。Ala又はSer等の他のアミノ酸でのCys34の置換については既に記載されている(Mccurdy, Tら、Journal of Laboratory and Clinical Medicine、143巻、2号、2004年、115〜124頁)。用語「HSA C34A」は、野生型ヒト血清アルブミンアミノ酸配列の34位のシステイン残基がアラニンで置き換えられているヒト血清アルブミン(HSA)変異体を指す。34位での遊離のCysの好ましくない相互作用を通じた二量体化及び不安定性を防ぐ他の方法には、ヒト血清アルブミンドメインIのN末端のトランケーション又は配列からのCys残基の除去が含まれる。
本明細書で使用される「機能的変異体」とは、元のタンパク質と同じ機能を実質的に保持しているある種のタンパク質の化学的変異体を意味する。
融合タンパク質
本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質を意味することが意図されている。本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、少なくとも2つのタンパク質及び/又はペプチドの共有結合を意味することも意図されている。一態様では、本発明の融合タンパク質は、医薬的関心のある活性を有する天然のMIC-1と融合されている融合パートナーとしてのヒト血清アルブミンを含む。融合タンパク質は、治療タンパク質の組換え発現又は安定性を改善するために並びにそのようなタンパク質の細胞培養物及び同類のものからの回収及び精製の改善のために多くの場合使用される。融合タンパク質は人工的配列、例えば、リンカー配列を含むことができる。
本明細書で使用される「融合パートナー」とは、融合タンパク質の一部であるタンパク質、すなわち、融合タンパク質により包含される少なくとも2つのタンパク質の1つを意味することが意図されている。
本発明の一実施形態では、融合パートナーは、おおよその分子量が67kDaであるヒト血清アルブミン(配列番号2)又はその機能的変異体を含み、これは異なる長さ、電荷及び/又は構造モチーフのアミノ酸配列からなるドメイン間リンカー領域を介して分子量がおおよそ12kDaのMIC-1(配列番号1)又はその機能的変異体のN末端に作動可能に連結されている。
本明細書で使用される「融合タグ」とは、融合タンパク質の一部であり、すなわち、融合タンパク質により包含される少なくとも2つのタンパク質の1つであり、融合タンパク質の発現、可溶化又は精製を改善する配列、例えば、6×ヒスチジンタグ(His6等の)又は可溶化ドメイン(チオール:ジスルフィドインターチェンジタンパク質DsbC(DsbC)、マルトース結合タンパク質(MBP)、又はチオレドキシン(Trx)等の)を含むタンパク質配列を意味することが意図されている。
本発明の一態様では、おおよそ80kDaのサイズを有する単量体NH2-HSA-リンカー-MIC-1-COOHは、2つのMIC-1分子間の鎖間ジスルフィド架橋を介して天然の分子としてホモ二量体化して、おおよそ160〜165kDaの分子量を有する活性なHSA-MIC-1融合タンパク質を形成する(図1に略図として描かれている)。
ペプチドリンカー
本明細書で使用される用語「ペプチドリンカー」とは、典型的には融合タンパク質の機能、折り畳み又は発現を促進するために使用されるアミノ酸配列を意味することが意図されている。
融合タンパク質に含まれるMIC-1タンパク質のその推定受容体への異なる曝露、血漿半減期又は全体の融合タンパク質安定性は、生物学的有効性、血漿半減期又は融合タンパク質安定性に変化を引き起こすことが可能な融合タンパク質のリンカー配列/構造の違いにより影響を受けることがある。
長さの変動(リンカー長の変動)を含む異なる予想される生物物理学的又は構造的特性並びにアルファヘリックス構造、剛構造若しくは柔軟なランダムコイル構造又は電荷等の予想される二次構造を有する本発明由来のリンカーが設計された。本発明では、リンカーの長さは7から35アミノ酸まで変化した。リンカー長は、生物活性のあるMIC-1ドメインに結合されている融合パートナーにより提供される立体障害の可能性を変化させることによりヒト血清アルブミンとMIC-1ドメインの間の潜在的相互作用に影響を与えることができる。立体障害は融合タンパク質単量体の2つのドメインの正しい折り畳み、二量体の形成、MIC-1部分と推定受容体の相互作用に影響を与えることができ、又はリンカーそれ自体はヒト血清アルブミン若しくはMIC-1のどちらかと相互作用することができ、リンカーの組成と長さの両方が一部そのような相互作用の性質及び程度に影響することができる。
機能的特性
生物活性 - in vivo薬理学
一態様では、本発明の化合物はin vivoで強力であり、それは任意の適切な動物モデルにおいて、並びに臨床試験において当技術分野で公知の通りに決定することができる。
非肥満スプラーグドーリーラットは適切な動物モデルの一例であり、食物摂取量の変化は、例えば、実施例2に記載されるように、そのようなラットにおいてin vivoで決定することができる。
一態様では、本発明の化合物は非肥満スプラーグドーリーラットにおいてin vivo食物摂取を阻害する。
例として、本発明の特定の態様では、4nmol/kgの用量で6〜7日間にわたり記録された24時間食物摂取量の最大の有意な(p<0.10)減少である最大有効性は、20%を超える、好ましくは30%を超えるはずである。本発明の別の特定の態様では、4nmol/kgの用量で6〜7日間にわたり記録された24時間食物摂取量の最大の有意な(p<0.10)減少である最大有効性は、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%であるはずである。
例として、本発明の特定の態様では、4nmol/kgの用量でビヒクルと比べた24時間食物摂取量の有意な(p<0.10)減少の合計である蓄積された有効性は、50%を超える、より好ましくは70%を超える、更に好ましくは80%を超える、又は最も好ましくは100%を超えるはずである。
例として、本発明の特定の態様では、4nmol/kgの用量でビヒクルと比べた24時間食物摂取量の有意な(p<0.10)減少の合計である蓄積された有効性は、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも70%、更に好ましくは少なくとも80%、又は最も好ましくは少なくとも100%であるはずである。
食餌誘発性肥満(DIO)スプラーグドーリーラットは適切な動物モデルの別の例であり、食物摂取量の変化は、例えば、実施例3に記載されるように、そのようなラットにおいてin vivoで決定することができる。
一態様では、本発明の化合物はDIOスプラーグドーリーラットにおいてin vivo食物摂取を阻害する。
本発明の一態様では、4nmol/kgの用量で6〜7日間にわたり記録された24時間食物摂取量の最大の有意な(p<0.10)減少である最大有効性は、少なくとも50%、又は好ましくは少なくとも60%である。
本発明の一態様では、4nmol/kgの用量でビヒクルと比べた24時間食物摂取量の有意な(p<0.10)減少の合計である蓄積された有効性は、少なくとも300%、より好ましくは少なくとも340%、又は更に好ましくは少なくとも380%である。
生物物理学的特性
一態様では、本発明の化合物はすぐれた生物物理学的特性を有する。これらの特性には、物理的安定性及び/又は可溶性が含まれるがこれらに限定されない。これらの及び他の生物物理学的特性は、当技術分野で公知の標準法を使用して測定することができる。特定の実施形態では、これらの特性は天然のMIC-1(配列番号1)と比べると改善されている。天然のMIC-1と比べて融合タンパク質の生物物理学的安定性が増大しているのは、少なくとも一部には融合パートナーの安定化効果又はヒト血清アルブミンとMIC-1配列の間に挿入された介在アミノ酸リンカーの長さ若しくは組成のせいである可能性がある。
製造方法
本発明の融合タンパク質等の融合タンパク質は、当業者には公知の組換えタンパク質技術によって製造することができる。一般に、対象のタンパク質又はその機能的変異体をコードする核酸配列は所望の融合タンパク質をコードするように改変されている。この改変には、融合タンパク質として発現される2つ又はそれよりも多いタンパク質をコードする核酸配列のインフレーム融合が含まれる。そのような融合タンパク質は、リンカーペプチド並びに融合タグ、例えば、ヒスチジンタグ(His6等の)又は可溶化ドメイン(DsbC、MBP又はTrx等の)に融合された融合タンパク質があってもなくても可能である。次に、この改変された配列は発現ベクター内に挿入され、このベクターは今度は発現宿主細胞内に形質転換又はトランスフェクトされる。
融合タンパク質をコードする核酸構築物は適切には、ゲノム、cDNA又は合成起源でもよい。アミノ酸配列変更は、周知の技法により遺伝コードの改変により達成される。
融合タンパク質をコードするDNA配列は、通常、組換えDNA手順に都合よくかけることができるいかなるベクターでも可能である組換えベクター内に挿入され、ベクターの選択は、それが導入されることになる宿主細胞に依拠する場合が多い。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製は染色体の複製とは独立しているベクター、例えば、プラスミドであってよい。代わりに、ベクターは、宿主細胞内に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであってもよい。
ベクターは、好ましくは、融合タンパク質をコードするDNA配列がDNAの転写に必要な追加のセグメントに作動可能に連結されている発現ベクターである。用語「作動可能に連結された」とは、セグメントがその意図された目的のために提携して機能する、例えば、転写がプロモーターにおいて開始され、ポリペプチドをコードするDNA配列中を進行し、ターミネーターで終止するように、セグメントが配置されていることを示している。
したがって、融合タンパク質の発現において使用するための発現ベクターは、クローン化された遺伝子又はcDNAの転写を開始し指示することができるプロモーターを含むことになる。プロモーターは選択した宿主細胞において転写活性を示すいかなるDNA配列でもよく、宿主細胞にとって同属の又は異種のタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。
更に、融合タンパク質の発現のための発現ベクターは、宿主細胞により認識されて転写を終結させる配列である終結配列も含むことになる。終結配列はポリペプチドをコードする核酸配列の3'末端に作動可能に連結されている。選択された宿主細胞において機能的であるいかなるターミネーターも本発明において使用することができる。
融合タンパク質の発現は、宿主細胞の細胞質ゾルにおける細胞内発現を目指しても、又は増殖培地への細胞外発現のための分泌経路に向けられてもよい。
細胞内発現はデフォルト経路であり、プロモーターとそれに続く融合タンパク質をコードするDNA配列それに続くターミネーターを含むDNA配列を有する発現ベクターが必要である。
融合タンパク質を宿主細胞の分泌経路に導くためには、融合タンパク質のN末端伸長として分泌シグナル配列(シグナルペプチド又はプレ配列としても知られている)が必要である。シグナルペプチドをコードするDNA配列は正確なリーディングフレームにおいて融合タンパク質をコードするDNA配列の5'末端に結合されている。シグナルペプチドは通常、タンパク質と関連しているペプチドでもよく、又は別の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子由来でもよい。
それぞれ、融合タンパク質、プロモーター、ターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をコードするDNA配列をライゲートし、複製に必要な情報を含有する適切なベクター内に挿入するのに使用される手順は当業者には周知である(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989年参照)。
融合タンパク質をコードするDNA配列を導入する宿主細胞は、細胞内でも細胞外でも融合タンパク質を発現することができるいかなる細胞でもよい。融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするDNA配列を含有し、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地において融合タンパク質を発現することができる宿主細胞を培養することにより産生することができる。融合タンパク質の発現に適した宿主細胞の非限定的例は、大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、並びにヒト胎児由来腎臓(HEK)、ベビーハムスター腎臓(BHK)又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系である。翻訳後修飾が必要な場合は、適切な宿主細胞には、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞等の高等真核細胞が含まれる。
融合タンパク質が宿主生物において発現された後は、従来の技法により回収し必要な質まで精製することができる。そのような従来の回収及び精製技法の非限定的例は、遠心分離、可溶化、濾過、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)、ゲル濾過及び凍結乾燥である。
融合タンパク質の組換え発現及び精製の例は、例えば、Cordingleyら、J. Virol. 1989年、63、5037〜5045頁、Birchら、Protein Expr Purif.、1995年、6、609〜618頁及びWO2008/043847に見ることができる。
融合タンパク質の微生物発現及び精製の例は、例えば、Chichら、Anal. Biochem、1995年、224、245〜249頁及びXinら、Protein Expr. Purif. 2002年、24、530〜538頁に見ることができる。
本発明のいくつかの化合物を調製する方法の特定の例は、実験の部に含まれる。
投与様式
用語「処置」は、言及されている疾患、障害、又は状態の予防と最小化の両方を含むことを意味する(すなわち、「処置」は、他の方法で示されていない又は文脈によりはっきり矛盾していなければ、本発明の化合物又は本発明の化合物を含む組成物の予防的投与と治療的投与の両方を指す)。
投与経路は、非経口的に、例えば、皮下に、筋肉内に又は静脈内に等の、本発明の化合物を身体の所望の又は適切な場所に効果的に輸送するいかなる経路でもよい。代わりに、本発明の化合物は、経口的に、肺に、直腸に、経皮的に、頬に、舌下に、又は経鼻的に投与することが可能である。
投与される本発明の化合物の量、本発明の化合物を投与する頻度の決定、及び場合によって別の薬学的活性剤と一緒に、本発明のどの化合物を投与するかの選出は、肥満及び関連する障害の処置に詳しい専門家に相談して決められる。
医薬組成物
本発明の化合物又は薬学的に許容されるその塩、アミド、若しくはエステル及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物は、当技術分野で公知の通りに調製することができる。
用語「賦形剤」は広く、活性治療成分以外の任意の構成成分を指す。賦形剤は非活性物質、不活性物質、及び/又は医薬的に活性ではない物質でもよい。
賦形剤は、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、錠剤補助剤として種々の目的にかなう、並びに/又は活性物質の投与及び/若しくは吸収を改善するのに役立つことができる。
種々の賦形剤と一緒の医薬活性成分の製剤は当技術分野では公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (例えば、19th edition (1995)、and any later editions)を参照されたい。
用語「物理的安定性」は、熱機械的応力への曝露並びに/又は不安定化する界面及び表面(例えば、疎水性表面)との相互作用の結果として、生物学的に不活性な及び/又は不溶性の凝集体を形成するポリペプチドの傾向を指す。水性ポリペプチド製剤の物理的安定性は、目視検査により及び/又は様々な期間、異なる温度での機械的/物理的応力(例えば、撹拌)への曝露後の濁り度計測により評価することができる。代わりに、物理的安定性は、例えば、チオフラビンT又は「疎水性パッチ」プローブ等のポリペプチドの立体構造状態の分光学剤又はプローブを使用して評価することができる。
用語「化学的安定性」は、未変化のポリペプチドと比べて潜在的に生物学的能力が低下し及び/又は免疫原性効果が増加している化学的分解産物の形成をもたらすポリペプチド構造の化学的(特に共有結合の)変化を指す。化学的安定性は、例えば、SEC-HPLC及び/又はRP-HPLCによる、異なる環境条件への曝露後の種々の時点での化学的分解産物の量を測定することにより評価することができる。
併用処置
本発明に従った化合物を用いた処置は、例えば、抗肥満薬、食欲抑制薬、並びに肥満から生じる又は肥満に関連する合併症及び障害の処置及び/又は予防のための薬剤から選択される1つ又は複数の医薬活性物質と組み合わせることもできる。
医薬品適応症
一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明の化合物に関する。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、以下の医学的処置:
(i)例えば、食物摂取量を減らし、体重を減少させ、食欲を抑制し、満腹を誘導することによる、肥満等の摂食障害の予防及び/又は処置、
(ii)高血糖及び/又は耐糖能障害の予防及び/又は処置
のために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は体重管理のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は食欲低下のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は食物摂取量の減少のための方法に関する。
一般に、肥満に罹っている対象全てが体重過多にも罹っていると考えられている。いくつかの実施形態では、本発明は肥満の処置又は予防のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は肥満の処置又は予防のための本発明のMIC-1融合タンパク質の使用に関する。いくつかの実施形態では、肥満に罹っている対象は、成人又は小児(幼児、子供、及び青年を含む)等のヒトである。肥満度指数(BMI)は身長と体重に基づく体脂肪の尺度である。計算式はBMI=キログラム体重/メートル身長2である。肥満に罹っているヒト対象は≧30のBMIを有することがあり、この対象は肥満と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、肥満に罹っているヒト対象は、≧35のBMI又は≧30から<40の範囲のBMIを有することがある。いくつかの実施形態では、肥満は超肥満体又は病的肥満であり、ヒト対象は≧40のBMIを有することがある。
いくつかの実施形態では、本発明は、場合によって少なくとも1つの体重関連併存症の存在下での、体重過多の処置又は予防のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、場合によって少なくとも1つの体重関連併存症の存在下での、体重過多の処置又は予防のための本発明のMIC-1融合タンパク質の使用に関する。
いくつかの実施形態では、体重過多に罹っている対象は、成人又は小児(幼児、子供、及び青年を含む)等のヒトである。いくつかの実施形態では、体重過多に罹っているヒト対象は、≧27のBMI等の≧25のBMIを有することがある。いくつかの実施形態では、体重過多に罹っているヒト対象は、25から<30の範囲の又は27から<30の範囲のBMIを有する。いくつかの実施形態では、体重関連併存症は、高血圧、糖尿病(例えば、2型糖尿病)、脂質代謝異常、高コレステロール、及び閉塞性睡眠時無呼吸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は体重減少のための方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明は体重減少のための本発明のMIC-1融合タンパク質の使用に関する。本発明に従って体重の減少に供されるヒトは、≧27のBMI又は≧30のBMI等の≧25のBMIを有することがある。いくつかの実施形態では、本発明に従って体重の減少に供されるヒトは、≧35のBMI又は≧40のBMIを有することがある。用語「体重の減少」は、肥満及び/又は体重過多の処置又は予防を含むことができる。
特定の実施形態
本発明は、本発明の以下の非限定的実施形態により更に説明される。
1.式(I):
A-B-C(I)
(式中、
Aは、ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体であり、
Bは、アミノ酸配列[X-Ym]nを含むペプチドリンカーであり、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2であり、
Cは、MIC-1タンパク質又はその類似体であり、
ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体のC末端がペプチドリンカーのN末端に融合されており、ペプチドリンカーのC末端がMIC-1タンパク質又はその類似体のN末端に融合されている)
の融合タンパク質を含む化合物。
2.式(I):
A-B-C(I)
(式中、
Aは、ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体であり、
Bは、アミノ酸配列[X-Ym]nを含むペプチドリンカーであり、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2であり、
Cは、MIC-1タンパク質又はその類似体であり、
ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体のC末端がペプチドリンカーのN末端に融合されており、ペプチドリンカーのC末端がMIC-1タンパク質又はその類似体のN末端に融合されている)
の融合タンパク質からなる化合物。
3.式(I):
A-B-C(I)
(式中、
Aは、ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体であり、
Bは、ペプチドリンカーであり、ペプチドリンカーは、10から50アミノ酸長であり、アミノ酸配列[X-Ym]nを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2であり、
Cは、MIC-1タンパク質又はその類似体であり、
ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体のC末端がペプチドリンカーのN末端に融合されており、ペプチドリンカーのC末端がMIC-1タンパク質又はその類似体のN末端に融合されている)
の融合タンパク質を含む化合物。
4.式(I):
A-B-C(I)
(式中、
Aは、ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体であり、
Bは、ペプチドリンカーであり、ペプチドリンカーは、10から50アミノ酸長であり、アミノ酸配列[X-Ym]nを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nが少なくとも2であり、
Cは、MIC-1タンパク質又はその類似体であり、
ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体のC末端がペプチドリンカーのN末端に融合されており、ペプチドリンカーのC末端がMIC-1タンパク質又はその類似体のN末端に融合されている)
の融合タンパク質からなる化合物。
5.2つのMIC-1タンパク質又はその類似体の間の鎖間ジスルフィド架橋により形成される、式(I):
A-B-C(I)
の2つの融合タンパク質のホモ二量体である、実施形態1から4のいずれか1つに記載の化合物。
6.ペプチドリンカーが10から35アミノ酸長である、実施形態1から5のいずれか1つに記載の化合物。
7.ペプチドリンカーが15から25アミノ酸長である、実施形態1から5のいずれか1つに記載の化合物。
8.ペプチドリンカーが20から25アミノ酸長である、実施形態1から5のいずれか1つに記載の化合物。
8a.ペプチドリンカーが20から30アミノ酸長である、実施形態1から5のいずれか1つに記載の化合物。
9.ペプチドリンカーが最大35アミノ酸からなる、実施形態1から5のいずれか1つに記載の化合物。
10.ペプチドリンカーが最大30アミノ酸からなる、実施形態1から5のいずれか1つに記載の化合物。
11.ペプチドリンカーが最大25アミノ酸からなる、実施形態1から15のいずれか1つに記載の化合物。
12.ペプチドリンカーがアミノ酸配列[X-Ym]nXを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
13.ペプチドリンカーがアミノ酸配列[X-Ym]nXを有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
14.ペプチドリンカーがアミノ酸配列[X-Ym]nXを有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも5である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
15.ペプチドリンカーがアミノ酸配列[X-Ym]nXを有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から3であり、nは少なくとも5である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
16.ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGSS[X-Ym]nXを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
17.ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGSS[X-Ym]nXを有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
18.ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGSS[X-Ym]nXを有を有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも5である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
19.ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGSS[X-Ym]nXを有を有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から3であり、nは少なくとも5である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
20.ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGSS[X-Ym]nXを有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2であり、nは5又は6である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
21.ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGSS[X-Ym]nXを有し、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2であり、nは6である、実施形態1から11のいずれか1つに記載の化合物。
22.XがAspである、実施形態1から21のいずれか1つに記載の化合物。
23.XがGluである、実施形態1から21のいずれか1つに記載の化合物。
24.mが2であり、nが2、4又は6である、実施形態1から23のいずれか1つに記載の化合物。
25.nが2、4又は6である、実施形態1から24のいずれか1つに記載の化合物。
26.nが6である、実施形態1から24のいずれか1つに記載の化合物。
27.mが2である、実施形態1から24のいずれか1つに記載の化合物。
27a.mが3である、実施形態1から24のいずれか1つに記載の化合物。
28.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala)6を含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
29.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala)6である、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
30.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala)6-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
31.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala)6-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
32.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala)6-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
33.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala)6-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
34.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala)10-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
35.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala)10-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
36.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala)10-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
37.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala)10-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
38.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala-Ala)5-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
39.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala-Ala)5-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
40.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala-Ala)5-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
41.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala-Ala)5-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
42.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala-Ala)6-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
43.ペプチドリンカーが(Glu-Ala-Ala-Ala)6-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
44.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala-Ala)6-Gluを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
45.ペプチドリンカーがGly-Gly-Ser-Ser-(Glu-Ala-Ala-Ala)6-Gluである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
46.ペプチドリンカーが(Asp-Ala-Ala)6-Aspを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
47.ペプチドリンカーが(Asp-Ala-Ala)6-Aspである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
48.ペプチドリンカーが(Asp-Ala-Ala-Ala)5-Aspを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
49.ペプチドリンカーが(Asp-Ala-Ala-Ala)5-Aspである、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
50.ペプチドリンカーが(Asp-Ala-Ala-Ala)6-Aspを含む、実施形態1から27のいずれか1つに記載の化合物。
51.Cが天然のMIC-1(配列番号1)に少なくとも85%配列同一性を示すMIC-1の類似体である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
52.Cが、天然のMIC-1(配列番号1)に少なくとも90%配列同一性を示すMIC-1の類似体である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
53.Cが、天然のMIC-1(配列番号1)に少なくとも95%配列同一性を示すMIC-1の類似体である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
54.Cが、天然のMIC-1(配列番号1)と比べて最大17アミノ酸改変を有するMIC-1の類似体である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
55.Cが、天然のMIC-1(配列番号1)と比べて最大11アミノ酸改変を有するMIC-1の類似体である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
56.Cが天然のMIC-1(配列番号1)と比べて最大5アミノ酸改変を有するMIC-1の類似体である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
57.Cが成熟ヒトMIC-1(配列番号1)である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
58.Cが配列番号14のN3S hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
59.Cが配列番号15のR2A,N3E hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
60.Cが配列番号16のN3E hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
61.Cが配列番号17のN3A hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
62.Cが配列番号18のN3P hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
63.Cが配列番号19のN3T hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
64.Cが配列番号20のN3G hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
65.Cが配列番号21のN3Q hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
66.Cが配列番号22のN3D hMIC-1である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
67.Cが配列番号14である、先行する実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
68.Cが配列番号15である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
69.Cが配列番号16である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
70.Cが配列番号17である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
71.Cが配列番号18である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
72.Cが配列番号19である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
73.Cが配列番号20である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
74.Cが配列番号21である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
75.Cが配列番号22である、実施形態1から50のいずれか1つに記載の化合物。
76.Aが配列番号2の野生型ヒト血清アルブミンである、実施形態1から75のいずれか1つに記載の化合物。
77.Aが配列番号2の野生型ヒト血清アルブミンに少なくとも85%配列同一性を示すヒト血清アルブミンの類似体である、実施形態1から75のいずれか1つに記載の化合物。
78.Aが、配列番号2の野生型ヒト血清アルブミンに少なくとも90%配列同一性を示すヒト血清アルブミンの類似体である、実施形態1から75のいずれか1つに記載の化合物。
79.Aが、配列番号2の野生型ヒト血清アルブミンに少なくとも95%配列同一性を示すヒト血清アルブミンの類似体である、実施形態1から75のいずれか1つに記載の化合物。
80.Aが配列番号23のC34Aヒト血清アルブミンである、実施形態1から75のいずれか1つに記載の化合物。
81.Aが配列番号23である、実施形態1から75のいずれか1つに記載の化合物。
82.融合パートナーを更に含む、実施形態1から81のいずれか1つに記載の化合物。
83.N末端融合パートナーを更に含む、実施形態1から81のいずれか1つに記載の化合物。
84.MIC-1アゴニストである、実施形態1から83のいずれか1つに記載の化合物。
85.食物摂取量を減らすことができる、実施形態1から84のいずれか1つに記載の化合物。
86.非肥満スプラーグドーリーラットにおいて単一用量研究で決定された食物摂取量を減らすin vivo効果を有する、実施形態1から85のいずれか1つに記載の化合物。
87.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号10のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号11のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号33のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号34のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号35のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号36のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号37のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号38のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号12のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号13のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号14のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号15のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号16のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号17のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号18のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号19のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号20のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号21のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号22のMIC-1変異体である、
から選択される、式(I):
A-B-C(I)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
88.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号14のMIC-1変異体である、
Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号15のMIC-1変異体である、
から選択される、式(I):
A-B-C(I)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
89.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号10のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
90.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号11のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
91.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号33のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
92.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号34のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
93.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
94.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号35のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
95.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号36のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
96.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号37のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
97.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号38のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
98.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号12のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
99.Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号13のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
100.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
101.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号14のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
102.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号15のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
103.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号16のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
104.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号17のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
105.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号18のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
106.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号19のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
107.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号20のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
108.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号21のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
109.Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号22のMIC-1変異体である、実施形態1に記載の化合物。
110.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号10のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
111.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号11のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
112.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号33のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
113.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号34のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
114.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
115.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号35のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
116.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号36のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
117.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号37のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
118.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号38のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
119.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号12のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
120.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号13のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
121.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
122.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号14のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
123.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号15のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
124.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号16のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
125.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号17のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
126.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号18のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
127.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号19のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
128.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号20のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
129.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号21のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
130.式(I):
A-B-C(I)
(式中、Aは配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号22のMIC-1変異体である)
の融合タンパク質からなる、実施形態1に記載の化合物。
131.化合物23、化合物24、及び化合物26から選択される、実施形態1に記載の化合物。
132.化合物23である、実施形態1に記載の化合物。
133.化合物24である、実施形態1に記載の化合物。
134.化合物25である、実施形態1に記載の化合物。
135.化合物26である、実施形態1に記載の化合物。
136.式(I)のHis-タグ付の融合タンパク質からなり、His-タグは配列番号3のHis-タグであり、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号9のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
137.式(I)のHis-タグ付の融合タンパク質からなり、His-タグは配列番号3のHis-タグであり、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号10のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
138.式(I)のHis-タグ付の融合タンパク質からなり、His-タグは配列番号3のHis-タグであり、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号11のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
139.式(I)のHis-タグ付の融合タンパク質からなり、His-タグは配列番号3のHis-タグであり、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号12のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
140.式(I)のHis-タグ付の融合タンパク質からなり、His-タグは配列番号3のHis-タグであり、Aは配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bは配列番号13のペプチドリンカーであり、Cは配列番号1の天然ヒトMIC-1である、実施形態1に記載の化合物。
141.実施形態1〜140のいずれか1つに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステル及び1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
142.医薬として使用するための、実施形態1〜140のいずれか1つに記載の化合物。
143.例えば、食物摂取量を減らし、体重を減少させ、食欲を抑制し、満腹を誘導することによる、肥満等の摂食障害の予防及び/又は処置において使用するための実施形態1〜140のいずれか1つに記載の化合物。
144.肥満の予防及び/又は処置において使用するための実施形態1〜140のいずれか1つに記載の化合物。
145.例えば、食物摂取量を減らし、体重を減少させ、食欲を抑制し、満腹を誘導することによる、肥満等の摂食障害の処置のための医薬の製造における実施形態1〜140のいずれか1つに記載の化合物の使用。
146.肥満の処置のための医薬の製造における実施形態1〜140のいずれか1つに記載の化合物の使用。
147.実施形態1〜140のいずれか1つに記載の医薬活性量の化合物を投与することによって、例えば、食物摂取量を減らし、体重を減少させ、食欲を抑制し、満腹を誘導することにより、肥満等の摂食障害を処置する又は予防する方法。
148.実施形態1〜140のいずれか1つに記載の医薬活性量の化合物を投与することによって肥満を処置する又は予防する方法。
149.実施形態1〜140のいずれか1つに記載の化合物をコードするポリヌクレオチド分子。
この実験の部は略字の一覧から始まり、本発明の化合物の調製、精製及び特徴付けの一般的方法を含むセクションが続く。次に、これらの融合タンパク質の活性及び特性に関係する実施例(薬理学的方法と見出しが付いたセクション)が続く。実施例は本発明を説明する役目を果たす。
略字の一覧
「主ピーク」は、ミリ吸光度単位で最も高いUV強度を有し融合タンパク質を含有する精製クロマトグラムにおけるピークを指す。
HPLCは高速液体クロマトグラフィーである。
SDS-PAGEはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動である。
IMACは固定化金属アフィニティークロマトグラフィーである。
SECはサイズ排除クロマトグラフィーである。
MSは質量分析である。
材料及び方法
調製の一般的方法
一般的発現方法1:融合構築物の小規模スクリーニング及び発現
構築物ごとの発現レベルは、Expi293(商標)発現培地(Life Technologies(商標)、#A1435101)において増殖させた2mlの懸濁培養物でのヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(Expi293F(商標)、Life Technologies(商標)、#A14527)へのプラスミドの一過性トランスフェクションによって決定した。expi293細胞は、37℃、8%CO2及び80%湿度で使い捨て24ウェルマルチウェルブロック(Axygen社、#P-DW-10ml-24-C-S)において増殖させた。振盪速度は50mmオービタルスロー付のInfors Multitron Cellインキュベーターにおいて200rpmであった。トランスフェクションごとに、100μlのトランスフェクション培地(Opti-MEM(登録商標)I(1x)+GlutaMAX(商標)-I減少血清培地、Life technologies(商標)#51985-026)中2μgのDNA及びトランスフェクション培地中5.4μlのExpiFectamine(商標)293試薬(ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット、Life technologies(商標)#A14525)を、製造業者の使用説明書に従って使用した。トランスフェクション18時間後、培養物に10μlのエンハンサー1及び100μlのエンハンサー2(ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット、Life technologies(商標)#A14525)を与えた。トランスフェクションのおおよそ90時間後、細胞培養物は10分間、4000gの遠心分離により収穫し、浄化した培養培地はタンパク質発現の更なる分析のために使用した。
構築物の相対的発現レベルは、縮分なしで、浄化した細胞上澄みをSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲル(Novex(登録商標)NuPAGE(登録商標)4-12%Bis-Tris midi protein gels、26ウェル、Life Technologies(商標)#WG1403BOX)に直接充填することにより決定し、得られたタンパク質バンドはクーマシー染色(InstantBlue(商標)、Expedeon社#ISBL1L)により可視化した。それぞれの融合タンパク質の製造実行可能性は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)工程を使用して小規模精製スクリーンにより評価した。精製されたタンパク質溶液は上記の通りにSDS-PAGE及びクーマシー染色により可視化し、その結果を使用して有効性のin vivo評価に十分なタンパク質を提供するのに必要とされるそれぞれの構築物の細胞培養量を決定した。
一般的発現方法2:Hisタグ付きHSA-MIC-1融合タンパク質のスケールアップ発現
MIC-1融合タンパク質をコードしているプラスミドはOneShot(登録商標)Top10F'化学的コンピテント大腸菌細胞(Life Technologies(商標)#C303003)に形質転換し、コロニーはAmp/Carb選択寒天プレート上で増殖させ、形質転換体はTerrific Broth(TB)培養物に播種するのに使用した。一晩増殖後、ペレット状の大腸菌細胞は大規模プラスミド調製物(EndoFree(登録商標)Plasmid Mega Kit、Qiagen(登録商標)社#12381)のために使用した。
一過性発現は、OptiMEM(登録商標)トランスフェクション培地(50ml/リットル細胞培養物)中のプラスミドDNA(1mg/リットル細胞培養物)をOptiMEM(登録商標)トランスフェクション培地(50ml/リットル細胞培養物)中のExpiFectamine(商標)293試薬(2.7ml/リットル細胞培養物)に添加し、20分間インキュベートし、次にトランスフェクション混合物を細胞培養物(3×106細胞/mlのexpi293F細胞)に添加しすることによって実施した。トランスフェクション18時間後、培養物にエンハンサー1(5ml/リットル細胞培養物)及びエンハンサー2(50ml/リットル細胞培養物)を与えた。expi293細胞は、37℃、8%CO2及び80%湿度で1リットルの使い捨て振盪フラスコ(Corning社#CLS431147)において増殖させた。振盪速度は50mmオービタルスロー付のInfors Multitron Cellインキュベーターにおいて110rpmであった。
トランスフェクションのおおよそ90時間後、培養物は10分間、4000gの遠心分離により収穫した。浄化した培地は精製する前に0.22μmフィルターを通して無菌濾過した。
精製
遠心分離及び0.22μm PESボトルトップフィルター(Techno Plastic Products AG社、Switzerland)を通じた濾過に続いて、浄化した上澄みは、リットル上澄みあたり200mLのHis結合バッファー(300mMリン酸ナトリウム(NaP)、1.8M NaCl、60mMイミダゾール、pH7.5)の添加によりIMAC精製のための条件付けをした。
AKTAxpressクロマトグラフィーシステムを使用して、条件付けした上澄みはバッファーA(50mM NaP、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH7.5)で平衡化した5mlのHisTrap Excelカラム(GE-Healthcare社、Sweden)に低流速で注ぎ、その後低親和性結合不純物は洗浄バッファー(50mM NaP、300mM NaCl、30mMイミダゾール、pH7.5)で溶出させた。結合している融合タンパク質は100%バッファーB(50mM NaP、300mM NaCl、500mMイミダゾール、pH7.5)でステップ溶出し、主ピークはUnicorn(商標)ソフトウェアのピーク検出オプションを使用して収集し、HiLoad Superdex 200 16/600 PGカラム(GE-Healthcare社、Sweden)上で1×PBS pH7.4(Ampliqon社)中、調製用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を更に使用して自動的に精製した。1.5mlの画分を収集し、precast4〜12%NuPAGE(登録商標)ゲル(Life technologies(商標)社)を使用する還元性及び非還元性SDS-PAGEにより分析した。要するに、試料を還元が必要な場合は10×還元剤を補充した4×LDS(ドデシル硫酸リチウム)試料バッファーと混合した。混合物は、SDS-PAGEに充填する前に95℃で5分間加熱した。Novex SeeBlue(登録商標)plus2 pre-stained Protein standard(Life technologies(商標))はサイズ評価のためにSDS-PAGE上で画分に沿って流した。タンパク質はInstantBlueTM染色(Expedeon社、Cambridgeshire、UK)を製造業者の使用説明書に従って使用して可視化した。
一般的発現方法3:HSA-リンカー-MIC-1融合タンパク質の組換え発現
HSA-リンカー-MIC-1融合タンパク質の組換え発現のためのベクターの作製:
一連のCMVプロモーターベースの発現ベクター(pTTベクター)を、EXPI293F細胞(Life technologies社)におけるHAS-リンカー-MIC-1融合タンパク質の一過性発現のために作製した。pTTベクターはYves Durocher(DurocherらNucleic Acid Research、2002年)により開発されたHEK293-6E EBNAベースの発現系における一過性タンパク質発現のために作製し、Expi293発現系における一過性発現のために使用することが可能である。
最初、それぞれのアルブミン-リンカー-MIC-1融合タンパク質変異体の遺伝子構築物は、ヒトCD33シグナルペプチド配列を有するpTTベクターでGenscript社に注文した。プラスミドは引き続き選択のために大腸菌に形質転換し、構築物の配列はDNA塩基配列決定により確認した。
融合タンパク質の組換え発現
HSA-リンカー-MIC-1融合タンパク質は、EXPI293F細胞(Life 30 technologies社)において製造業者の使用説明書に従って、pTTベースの発現ベクターのトランスフェクションにより一過性に発現された。以下の手順は一般的なEXPI293F発現プロトコールを説明している。
細胞維持:
EXPI293F細胞はExpi293(商標)発現培地(Life technologies社)において懸濁液で増殖させた。細胞は、36.5℃、8%CO2及び85〜125rpmで、オービタル振盪器インキュベーター内のエルレンマイヤー振盪フラスコにおいて培養し、0.4〜4×10E6細胞/mL間の細胞密度で維持した。
DNAトランスフェクション:
典型的には、30〜1000mLの培養量をトランスフェクトした。DNA及びトランスフェクション試薬の別々の希釈液を最初に調製した。以下の成分を細胞培養物1mLあたりで混合した:
1.総量で1μgのベクターDNAを50μLのOpti-MEN培地(Gibco社)に希釈し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートした。
2.総量で2.7μLのExpifectamin(商標)293(Life technologies社)を50μLのOpti-MEN培地(Gibco社)に希釈し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートした。
2つの別々の希釈液を混合し、室温(23〜25℃)で10分間インキュベートした。DNA-Expifectamin(商標)293混合物を1mLのEXPI293F細胞培養物に直接添加した。トランスフェクション時、EXPI293F培養物の細胞密度は2.8〜3.2×10E6細胞/mLであるはずである。トランスフェクトされた細胞培養物は36.5℃、8%CO2及び85〜125rpmで、オービタル振盪器インキュベーター内でインキュベートした。トランスフェクション18時間後、5μLのExpifectamin(商標)293トランスフェクションエンハンサー1及び50μLのExpifectamin(商標)293トランスフェクションエンハンサー2を培養物1mLあたりで添加した。トランスフェクションの5日後、細胞培養上澄みを遠心分離により収穫し、続いて0.22μm PESフィルターユニット(Corning社)を通して濾過した。
精製
融合タンパク質はpH8(中性pH)でGigacapカラム(イオン交換)上で捕捉され、段階的勾配を使用する塩(硫酸ナトリウム)濃度の増加を用いて溶出させた。溶出されたタンパク質は、捕捉プール中の濃度に応じて、10kDaのMWCOを用いてAmicon Ultra遠心濾過器上で濃縮する又はしなかった。類似体は最終的には、PBSバッファーを使用してHiLoad Superdex×200 16/60又は26/60prepグレードカラム上で精製した。
一般的検出方法及び特徴付け
MS分析
精製された組合せ融合タンパク質の無傷の塊をMaxis Impact(商標)ESI-Q-OTOF質量分析計(Bruker Daltonics社)に連結されたThermo-Dionex Ultimate3000TM HPLC (Thermo Fisher Scientific社)を使用して分析した。溶媒はA:0.1%ギ酸(v/v)を含む水及びB:0.08%ギ酸(v/v)を含むアセトニトリルであった。試料は、10%Bにおいて0.2ml/分で2分間、Waters Acquity(商標)BEH300 C4 1.7μm 1.0×100mmカラム(Waters社)上でオンラインで脱塩し、0.2ml/分で10%Bから90%B溶媒の8分線形勾配により溶出した。
215nmでの吸光度(Abs215)及びm/z300から3000の範囲でのm/zスペクトルを記録した。得られたデータはDataAnalysis 4.1ソフトウェア(Bruker Daltonics社)を使用して解析した。平均m/zスペクトルは最大エントロピー逆重畳積分を使用して逆重畳積分(deconvolute)した。
ペプチド質量マッピングは正しいリンカー配列を確認するために実施し、当業者に公知の方法を使用して行った。要するに、精製されたタンパク質は、「溶液中トリプシン消化及びグアニジン化キット」、Pierce社製品番号89895から採り入れた方法を使用してトリプシン消化にかけた。融合タンパク質における正しいリンカー配列の同定及び確認を可能にするペプチド質量マッピングは、ペプチドの実験的に決定された質量を抽出するData Analysisソフトウェア(Bruker Daltonics社)及び予想される融合タンパク質配列から導き出される計算された質量に対して実験的質量をマッチさせるためのBiotoolsソフトウェア(Biotools社)を製造業者の使用説明書に従って使用して行った。一般に、可変修飾(variable modification)は「酸化(M)」及び「カルバミドメチル(Carbamidomethyl)(C)」に設定され、質量許容差は20ppmに設定され、MS/MS許容差は50mmμに設定された。
標準HPLCに連結された化学発光窒素検出(CLND)を使用して、基本的には他所に記載されている通りに(例えば、Bizanek, R.; Manes, J. D.; Fujinari, E. M. Chemiluminescent nitrogen detection as a new technique for purity assessment of synthetic peptides separated by reversed-phase HPLC. Pept. Res. 1996年、9 (1)、40〜44頁)タンパク質濃度を決定した。
(実施例1)
本発明の化合物の発現及び精製
表1に描かれている融合タンパク質変異体をコードする異なるプラスミドは、ヒト血清アルブミン部分とMIC-1部分の間のリンカー配列の違いを用いて設計された。
一部の融合タンパク質は野生型ヒトMIC-1(配列番号1)を含み、他の融合タンパク質はMIC-1変異体(配列番号14〜配列番号23)を含む。一部の融合タンパク質はヒト野生型ヒト血清アルブミン(配列番号2)を含み、他の融合タンパク質は、野生型ヒト血清アルブミンアミノ酸配列の34位のシステイン残基がアラニンで置き換えられているヒト血清アルブミン変異体であるHSA C34A(配列番号23)を含む。プラスミドは周知の組換えDNA技法により作製した(GenScript社より入手)。N末端Hisタグ配列(配列番号3)のある又はなしの構築物を設計した。Hisタグのある構築物は固定化アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用する精製を可能にし、Hisタグが付いていない構築物の精製には他の精製手段を使用した。Hisタグはヒト血清アルブミンのまさにN末端に置かれているので、MIC-1融合タンパク質の有効性にも、融合パートナーとして使用される場合、Fc新生児型受容体へのヒト血清アルブミンの結合及びヒト血清アルブミンの半減期延長効果にも影響しない。リンカー配列は表2に与えられている。
代表的な例として、材料及び方法のセクションで記載した通りにExpi293F細胞において一過性発現により化合物番号7の大規模生産を実施した。手短に言えば、200μgのプラスミドDNAを10mlのOpti-MEM(登録商標)トランスフェクション培地に添加し、540μlのExpiFectamine(商標)293試薬を10mlのOpti-MEM(登録商標)トランスフェクション培地に添加した。2つの溶液を組み合わせてトランスフェクション混合物を形成した。20分間のインキュベーション後、トランスフェクション混合物は細胞密度3×106細胞/mlの200mlのexpi293F細胞培養物に添加した。トランスフェクションの18時間後、培養物に1mlのエンハンサー1及び10mのエンハンサー2を与えた。トランスフェクションのおおよそ90時間後、培養物は10分間4000gの遠心分離により収穫した。浄化した培養液は精製する前に0.22μMフィルターを通して無菌濾過した。
ヒト血清アルブミン分子をMIC-1タンパク質のN末端に様々なリンカーによって融合するin vivo効果を調べるために、発現された分子は上記の方法を使用して精製した。化合物番号7は、サイズ排除に連結された自動固定化金属イオンクロマトグラフィーを使用して首尾よく精製した。SECカラムの全容積内の2つの主ピークは分画し分析した。第1のピークはカラムの空隙で溶出し、非還元SDS-PAGEにより溶出したタンパク質の凝集状態が確かめられた。主ピークは凝集ピークと部分的に重複していた。したがって、全主ピークを表す画分全てがプール中に含まれていたわけではなかった。プールされた画分の非還元SDS-PAGEにより、約120kDaタンパク質として移動した単一バンドが生じた。分子の二量体構造を確認するために、無傷の質量分析(MS)を実施した。平均質量スペクトルの逆重畳積分により、平均質量164140 Daが得られた。化合物番号7の計算による分子量は163820 Daである。したがって、無傷のMS分析により、精製された分子がその二量体形態であるが、潜在的にはいくつかの翻訳後修飾(例えば、酸化、脱アミド、等)を抱えていることが明らかになっている。構築物を更に特徴付けるため、ペプチド質量マッピング戦略を特徴付けに展開した。哺乳動物宿主細胞において発現されたHSA-MIC-1融合タンパク質は、以前記載された通りに様々な程度のCys34システイン化(cysteinylation)を生じた(Kleinova Aら、Rapid Commun. Mass Spectrom、2005年; 19: 2965〜2973頁)。更に、不均一性の他の原因は、非常に不安定であることが分かっているMIC-1配列の3位のAsnに関連付けられることが分かった。なぜならば、AsnはAsp又はイソAspに容易に脱アミドするからである。
薬理学的方法
(実施例2)
痩せたスプラーグドーリーラットの食物摂取量に対する本発明の融合タンパク質の効果
本実施例の目的は、in vivoでの化合物の有効性を試験することである。本発明の化合物のin vivo有効性は、250g〜300gの雄非肥満スプラーグドーリーラットにおいて測定した。動物には、4nmol/kg体重の用量を1回注射した。化合物は、生理等張リン酸緩衝食塩(PBS)水(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4)中で皮下に投与した(1ml/kg)。一部の場合、緩衝生理食塩水は500ppmのポリソルベート80も含有していた。野生型ヒトMIC-1は基準化合物として含まれ、研究中8nmol/kg体重の用量を毎日1回注射した。野生型hMIC-1は酸性等張緩衝液(pH4.0、5mM酢酸、2.25%グリセロール、70ppmポリソルベート20)中で皮下に投与した(1ml/kg)。
食物摂取量の変化は、自動食物モニターシステム(BioDAQ又はHM-2)により又は24時間期間にわたり手作業でケージ給餌トレーにおける食物ペレットの減少を測定することにより測定した。動物は、BioDAQシステムでは単独で入れ、HM-2システムではケージあたり3匹を入れた。動物は後者のシステムでは、HM-2システムが食物摂取量の個々の尺度を収集するために研究開始に先立ってチップマーク(chip-marked)された。それぞれの化合物は1つ又は複数の実験において4〜8匹の動物で試験した。動物は研究開始に先立って実験設定において少なくとも7日間気候順応させた。収集したデータは、それぞれ1日12時間暗期の開始から次の暗期まで測定した1日の食物摂取量(24時間食物摂取量)として表す。投与された化合物への応答での食物摂取量の1日の変化はほとんどの研究では、ビヒクル群の平均1日食物摂取量から処置群の平均1日食物摂取量を引くことにより計算した。2,3の研究では、投与された化合物への応答での食物摂取量の1日の変化は、研究開始に先立つ日の平均1日食物摂取量から介入治療中の1日平均食物摂取量を引くことにより計算した。変化はスチューデントt-検定(両側)を使用してp<0.1の場合は有意であると見なした。
ヒト血清アルブミン部分とMIC-1部分の間の数アミノ酸リンカーを調査した。リンカーは、異なる長さ、電荷又は構造モチーフ(例えば、Proリッチリンカー、Glu/Asp及びAlaを含む予想されるアルファヘリックス傾向を有するリンカー又はリンカーに柔軟性を与える典型的なGly/Ser含有リンカー)を有することにより特徴付けた。リンカー変異体は、上記の通りに最大有効性、生物学的効果の持続時間及び蓄積された有効性に基づいて評価し比較した。
驚いたことに、発明者らは、ヒト血清アルブミンとMIC-1の間にリンカーが存在しない又はペプチドリンカーのサイズが10アミノ酸未満では生物学的有効性が限定されている又は有意の生物学的有効性がない化合物が生じる(化合物1、2、12、13及び14(表5))ことを見出した。
これとは対照的に、サイズが10アミノ酸以上のリンカーは融合タンパク質の生物学的有効性にプラスの影響を及ぼした。本発明では、リンカーアミノ酸組成及び配列の変動もHSA MIC-1融合タンパク質の生物学的有効性に有意な影響を及ぼすことも見出された。驚いたことに、発明者らは、酸性残基(Glu又はAsp)の繰り返し続いてAla等の少なくとも2つの非極性残基を含む約20アミノ酸の中程度サイズのリンカーの特定の組合せにより、通常は融合タンパク質の分離ドメインのためのリンカーとして使用されるGly及びSer残基を含む同一サイズの柔軟なリンカーと比べると、HSA-MIC-1融合タンパク質の生物学的有効性が増加することを見出した(表3、化合物番号4と比べた化合物番号7又は9)。
更に詳細には、驚いたことに、発明者らは、酸性残基(Glu又はAsp)の繰り返し続いてAla等の少なくとも2つの非極性残基を含む約10〜35アミノ酸の中程度サイズのリンカーは、Gly及びSer残基を含む同一サイズの柔軟なリンカー又は硬直なPro含有リンカーと比べると、HSA-MIC-1融合タンパク質の有利な生物学的有効性を示すことを見出した(化合物4及び17(表5)と比べた化合物7(表6))。30アミノ酸を超える更に長いリンカーについて類似の観察を行った(化合物16又は18(表5)と比べた化合物10(表6))。
それぞれの繰り返しにおいてAlaを酸性残基で置換すると最大有効性及び/又は蓄積された有効性にマイナスの影響を及ぼした(例えば、化合物8(表5)と比べた化合物5(表6))。驚いたことに、Glu-Ala-Ala又はAsp-Ala-Alaの繰り返しを含有するリンカーの酸性残基を塩基性のLys残基で置換すると、生物学的有効性及び蓄積された食物摂取量が明らかに減少することが見出され、有効性の違いがリンカー配列の小さな変化から生じる可能性があることを示した(化合物6(表5)と比べた化合物番号5及び9(表6))。
したがって、本発明は、ある種のリンカーを有するHSA-MIC-1融合タンパク質がより高い最大有効性及び蓄積された有効性並びに融合タンパク質のより長い持続期間をもたらすことを実証している。
全てが配列番号9のリンカーを有しそれぞれ表3及び4のMIC-1変異体及び/又はヒト血清アルブミン変異体を含むHSA MIC-1融合タンパク質を調製し試験して、MIC-1部分及び/又はヒト血清アルブミン部分のこれらの変化が融合タンパク質の有効性に対して効果があるかどうかを調べた。表7で見ることができるように、全ての融合タンパク質が、4nmol/kgの単回注射に応答して3〜5日の間食物摂取量を有意に減少させることが分かった。
(実施例3)
DIOスプラーグドーリーラットの食物摂取量に対する本発明の融合タンパク質の効果
DIOラットを使用して痩せたラットにおいて試験した化合物を更に研究した。エネルギー含量の45%が脂肪に由来する特別な研究用食餌(Research Diets、D12451)に生後8週間の動物を委ねることにより肥満を誘導した。動物は典型的には、研究開始前に500〜600gの体重に達した。動物には4nmol/kg体重の用量を1回注射した。化合物は、生理等張リン酸緩衝食塩(PBS)水(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4)中で皮下に投与した(1ml/kg)。一部の場合、緩衝生理食塩水は500ppmのポリソルベート80も含有していた。
食物摂取量の変化は、自動食物モニターシステム(BioDAQ又はHM-2)により測定した。動物は、BioDAQシステムでは単独で入れ、HM-2システムではケージあたり3匹を入れた。動物は後者のシステムでは、HM-2システムが食物摂取量の個々の尺度を収集するために研究開始に先立ってチップマークされた。それぞれの化合物は1つ又は複数の実験において4〜8匹の動物で試験した。動物は研究開始に先立って実験設定において少なくとも7日間気候順応させた。収集した食物摂取量データは、それぞれ1日12時間暗期の開始から次の暗期まで測定した1日の食物摂取量(24時間食物摂取量)として表す。投与された化合物への応答での食物摂取量の1日の変化は、ビヒクル群の平均1日食物摂取量から処置群の平均1日食物摂取量を引くことにより計算した。変化はスチューデントt-検定(両側)を使用してp<0.1の場合は有意であると見なした。
試験したHSA MIC-1融合タンパク質は全てDIOラットにおいて良好な有効性を示した。化合物7と23を比較した場合、Hisタグ(配列番号3)は融合タンパク質の有効性又は効果の持続期間に影響を及ぼさないことは明らかである。
(実施例4)
痩せたスプラーグドーリーラットにおけるMIC-化合物の薬理動態学的評価
本研究の目的は、痩せたスプラーグドーリーラットへの静脈内投与後のHSA MIC-1融合タンパク質のin vivoでの半減期、すなわち、血液循環中のその時間の延長及びそれによるその作用時間を決定することである。これは薬理動態学(PK)研究において行い、問題の融合タンパク質の終末相半減期を決定する。終末相半減期とは、一般的には、初期分布相後に測定されるある種の血漿濃度を半減させるのにかかる時間を意味する。in vivo半減期は、尾静脈への化合物の注射とそれに続く曝露分析のための種々の時点での血液血漿試料の収集により300g〜500gの痩せたSDラットにおいて測定した。化合物(0.5nmol/kg体重)は、生理等張リン酸緩衝食塩(PBS)水(140mM NaCl、2.7mM KCl、8.05mM Na2HPO4、1.96mM KH2PO4、500ppmのポリソルベート80)中で静脈内に投与した(1ml/kg)。血液試料は、-30、30、60、240及び420分並びに24、30、48、72、96、120、168、216、264及び360/384時間に舌から収集した。200μlの血液はEDTAチューブに収集し氷上で最大20分間保存した。血漿試料は4℃、10000Gで5分間血液試料を遠心分離することにより作製した。試料は続いて乾燥氷上でミクロン(Micronic)チューブにピペットで移し(pipet)、LOCI又はELISA等の類似の抗体ベースのアッセイを使用してそれぞれのMIC-1化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保管した。個々の血漿濃度-時間プロファイルは、Phoenix v. 6.2又は6.3ソフトウェア(Pharsight社、Mountain View、CA、USA)の非コンパートメントモデルにより解析し、こうして終末相半減期を決定した。
リンカーの長さ(すなわち、リンカー内のアミノ酸の数)と痩せたラットにおけるT1/2の間の相関はピアソン相関分析を使用して解析した。スピアマン相関係数は-0.0365であり、リンカー長とT1/2の間には有意な直線関係はないことが示唆された。この解析の意味は、融合タンパク質の生物学的有効性は、融合タンパク質のin vivo半減期の関数ではないということである。
本発明のある種の特長を本明細書において説明し記載してきたが、多くの改変、置換、変更、及び等価物が当業者であればこの時点で浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神内に納まるような全ての改変及び変更を網羅していると意図されていることを理解するべきである。

Claims (13)

  1. 式(I):
    A-B-C(I)
    (式中、
    Aは、ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体であり、
    Bは、ペプチドリンカーであり、ペプチドリンカーは、10から35アミノ酸長であり、アミノ酸配列[X-Ym]nを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2であり、
    Cは、MIC-1タンパク質又はその機能的変異体であり、
    ヒト血清アルブミン又はその機能的変異体のC末端がペプチドリンカーのN末端に融合されており、ペプチドリンカーのC末端がMIC-1タンパク質又はその機能的変異体のN末端に融合されており、
    MIC-1の機能的変異体が、天然のMIC-1(配列番号1)に少なくとも85%配列同一性を示し、
    ヒト血清アルブミンの機能的変異体が、配列番号2の野生型ヒト血清アルブミンに少なくとも85%配列同一性を示す)
    の融合タンパク質を含む化合物。
  2. 2つのMIC-1タンパク質又はその機能的変異体の間の鎖間ジスルフィド架橋により形成される、式(I):
    A-B-C(I)
    の2つの融合タンパク質のホモ二量体である、請求項1に記載の化合物。
  3. ペプチドリンカーがアミノ酸配列[X-Ym]nXを含み、式中、XはAsp又はGluであり、YはAlaであり、mは2から4であり、nは少なくとも2である、請求項1又は2に記載の化合物。
  4. XがAspである、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. XがGluである、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  6. mが2であり、nが2、4又は6である、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 融合パートナーを更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 前記化合物がMIC-1アゴニストである、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
  9. Aが配列番号2のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
    Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号1の天然ヒトMIC-1である、
    Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号14のMIC-1変異体である、
    Aが配列番号23のヒト血清アルブミンタンパク質であり、Bが配列番号9のペプチドリンカーであり、Cが配列番号15のMIC-1変異体である、
    から選択される、式(I):
    A-B-C(I)
    の融合タンパク質からなる、請求項1に記載の化合物。
  10. 請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステル及び1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  11. 医薬として使用するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
  12. 食物摂取量を減らし、体重を減少させ、食欲を抑制し、満腹を誘導することによる、摂食障害の予防及び/又は処置において使用するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
  13. 摂食障害が肥満である、請求項12に記載の組成物。
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