KR102085605B1

KR102085605B1 - 대사 장애를 치료하기 위한 융합 단백질

Info

Publication number: KR102085605B1
Application number: KR1020147010946A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 알. 보에처; 샤리 엘. 카프란; 더글라스 에스. 다니엘스; 노리오 하마마츠; 스튜어트 리히트; 스티븐 크레이그 웰던
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2020-03-06
Also published as: KR20140069250A; SG11201400538QA; JP2014534172A; LT3321276T; AR123908A2; DK2760475T3; WO2013049247A1; JP2020007314A; EP3321276A3; EA201490695A1; SG10201602339XA; PE20181159A1; UY34346A; US9266935B2; SI3321276T1; US9006400B2; CO6920257A2; US11129874B2; JP6186361B2; EA039633B1

Abstract

본 발명은 개선된 제약 특성을 갖는 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)의 폴리펩티드 및 단백질 변이체를 포함하는 융합 단백질의 확인에 관한 것이다. 대사 상태를 비롯한 FGF21-연관 장애의 치료 방법을 또한 개시한다.

Description

대사 장애를 치료하기 위한 융합 단백질{FUSION PROTEINS FOR TREATING METABOLIC DISORDERS}

본 발명은 투여받는 대상체에서의 대사 프로파일을 개선시키는 것으로 공지된 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)을 포함하는 신규한 융합 단백질에 관한 것이다.

섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리는 22개의 유전적으로 구별되는 상동 리간드를 특징으로 하고, 이들은 7개의 서브패밀리로 나누어진다. FGF-21은 FGF-19 및 FGF-23과 가장 밀접하게 관련되고, 이들과 함께 서브패밀리를 형성한다. 이 FGF 서브패밀리는 전형적 FGF에 대해 통상적이지 않은 다양한 생리학적 과정, 즉 에너지 및 담즙산 항상성, 글루코스 및 지질 대사, 및 포스페이트 뿐만 아니라 비타민 D 항상성을 조절한다. 또한, 다른 FGF와 달리, 이 서브패밀리는 내분비 방식으로 작용한다 (문헌 [(Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8)(Beenken et al. (2009) Nature Reviews Drug Discovery 8, 235)]).

FGF21은 28개 아미노산 리더 서열 (서열 5)을 함유하는 209개 아미노산 폴리펩티드이다. 인간 FGF21은 마우스 FGF21에 대해 약 79% 아미노산 동일성을, 래트 FGF21에 대해 약 80% 아미노산 동일성을 갖는다. 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)은 허혈성 혈관 질환, 상처 치유, 및 폐, 기관지 또는 폐포 세포 기능의 손실과 연관된 질환을 위한 치료로서 기재된 바 있다 (문헌 [Nishimura et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206]; 특허 공개공보 WO01/36640; 및 특허 공개공보 WO01/18172). FGF-21은 FGF 수용체, 및 FRS2a 및 ERK를 비롯한 하류 신호전달 분자를 활성화시키지만, FGFR과 FGF-21의 직접 상호작용은 검출되지 않았다. 연구는 FGF-21에 대한 세포 반응의 결정자 및 FGFR을 통한 FGF-21 신호전달을 매개하는 보조인자로서, 간, 지방세포 및 췌장에서 고도로 발현되는 β-클로토(β-klotho)를 확인한 바 있다 (문헌 [Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 26687-95]). FGF21은 FGFR1(IIIc), FGFR2(IIIc) 및 FGFR3(IIIc) β-클로토 신호전달 복합체의 강력한 효능제이다.

FGF-21은 인슐린-비의존성 글루코스 흡수를 유도하는 것으로 나타났다. FGF-21은 또한 다양한 당뇨병 설치류 모델에서 고혈당증을 개선하는 것으로 나타났다. 또한, FGF-21을 과다발현하는 트랜스제닉 마우스는 식이-유발 대사 이상에 저항성인 것으로 밝혀졌고, 감소된 체중 및 지방량, 인슐린 감수성의 증진이 입증되었다 (문헌 [Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37]). 당뇨병 비-인간 영장류에 대한 FGF-21의 투여는 공복 혈장 글루코스, 트리글리세리드, 인슐린 및 글루카곤 수준의 감소를 야기하였고, 거의 80%의 HDL 콜레스테롤 증가를 비롯하여 지단백질 프로파일의 유의한 개선을 유도하였다 (문헌 [Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81]). FGF21 작용의 분자 메카니즘을 조사한 최근 연구는 공복 상태에 대한 적응의 조절을 돕는 중요한 내분비 호르몬으로서의 FGF21을 확인한 바 있다 (문헌 [(Badman et al. (2009) Endocrinology 150, 4931)(Inagaki et al. (2007) Cell Metabolism 5, 415)]). 이것은, 에너지 항상성의 생물학을 조절하는데 있어 간이 신체의 나머지 부분과 소통하게 하는, PPARα 하류의 이전에 상실된 연결 고리를 제공한다 (문헌 [(Galman et al. (2008) Cell Metabolism 8, 169)(Lundasen et al. (2007) Biochemical and Biophysical Research Communications 360, 437)]).

FGF21은 PPARγ 발현을 억제하고 미토콘드리아 기능을 증가시키는 AMPK/SIRT1/PGC1α 경로의 활성화를 통해 지방세포 항상성을 조절한다 (문헌 [Chau et al. (2010) PNAS 107, 12553]). FGF21은 또한 배양된 인간 근관 및 단리된 마우스 조직에서 측정된 바와 같이 골격근에 의한 글루코스 흡수를 증가시킨다. 설치류 도세포의 FGF21 처리는 ERK1/2 및 Akt 경로의 활성화를 통해 개선된 기능 및 생존을 유도한다 (문헌 [Wente et al. (2006) Diabetes 55, 2470]). FGF21 처리는 또한, 아마도 HNF4α 및 Foxa2 신호전달을 통해, 설치류 간에서의 지질생성 및 지방산 산화 효소에 대한 변경된 유전자 발현을 유발한다.

FGF-21을 생물치료제로서 직접 사용하는 것과 연관된 문제점은 그의 반감기가 매우 짧다는 것이다 (문헌 [Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635]). 마우스에서, 인간 FGF21의 반감기는 0.5 내지 1시간이고, 시노몰구스 원숭이에서, 반감기는 2 내지 3시간이다. FGF21은 다용도 멸균 제약 제제로서 이용될 수도 있다. 그러나, 보존제, 즉 m-크레졸은 이들 조건 하에서 그의 안정성에 대해 유해한 영향을 갖는 것으로 결정된 바 있다.

제1형 및 제2형 당뇨병 및 다른 대사 상태의 치료에서 치료제로서 사용하기 위한 FGF21 단백질의 개발 시에는, 반감기 및 안정성의 증가가 바람직할 것이다. 증진된 반감기 및 안정성을 갖는 FGF21 단백질은 환자에게 보다 적은 빈도의 단백질 투여를 허용할 것이다. 명백하게, 치료 단백질 FGF21을 위한 안정한 수성 단백질 제제를 개발할 필요성이 존재한다.

또한, 단백질 제약으로서의 FGF21의 개발에서의 유의한 문제는 그의 물리적 및 화학적 불안정성을 극복하는 것이다. 단백질의 조성 다양성 및 특징은 구체적 거동, 예컨대 폴딩, 입체형태적 안정성, 및 언폴딩/변성을 규정한다. 이러한 특징은 수성 단백질 용액을 이용하는 제약 제제 개발의 과정에서 단백질 안정화를 목표로 하는 경우에 다루어져야 한다 (문헌 [Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)]). 관심있는 치료 단백질, 예를 들어 본 발명의 단백질을 안정화시키는 것의 바람직한 효과는, 단백질분해 및 효소적 분해에 대한 저항성을 증가시킴으로써 단백질 안정성을 개선하고 단백질 응집을 감소시키는 것이다.

발명의 개요

본 발명은 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)을 포함하고, 제약 제제 조건 하에 야생형 FGF21 및 그의 변이체보다 개선된 제약 특성을 갖는, 예를 들어 더 안정하고, 투여받는 대상체에 대한 대사 파라미터를 개선시키는 능력을 보유하고, 단백질분해 및 효소적 분해에 덜 민감하고, 응집하여 복합체를 형성할 가능성이 적은 신규한 융합 단백질의 확인에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 FGF21의 말단절단, 돌연변이 및 변이를 포함한다.

FGF21-연관 장애, 뿐만 아니라 다른 대사, 내분비 및 심혈관 장애, 예컨대 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 및 다른 대사 장애를 치료하는 방법, 및 중환자의 사망률 및 이환율을 감소시키는 방법이 또한 개시된다.

본 발명의 융합 단백질은 단독으로 또는 경구 항당뇨병제와 조합하여 매주 1회 주사가능한 형태로 사용될 수 있으며, 이는 제1형 및 제2형 당뇨병 환자의 혈당 조절, 체중 및 지질 프로파일을 개선시킬 것이다. 단백질은 또한 비만 또는 다른 FGF21-연관 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 제약 제제 조건 하에서 야생형 FGF21보다 더 안정하고, 단백질분해 및 효소적 분해에 덜 민감하고, 응집하여 복합체를 형성할 가능성이 적은 단백질의 제시에 의해, 예를 들어 야생형 FGF21의 투여를 포함하는 단백질 치료제와 연관된 물리적 불안정성의 유의한 난관을 극복한다.

제1 측면에서, 본 발명은 표 1에 열거되고 본원에 추가로 기재된 서열 중 하나 이상을 포함하는 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 융합 단백질을 제공한다. 표 1에 열거된 FGF21 서열은 야생형 FGF21 서열, 예를 들어 NCBI 참조 번호 NP_061986.1을 갖고, 예를 들어 키론 코퍼레이션(Chiron Corporation)에 양도된 US 6,716,626B1과 같은 허여된 특허에서 찾을 수 있는 야생형 FGF21 서열의 변이체일 수 있다.

상기 융합체는, 예를 들어 변이체 FGF21 서열, 예를 들어 표 1의 서열 및 다른 분자 (비-FGF21 부분), 예를 들어 IgG 불변 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어 Fc 영역), 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 알부민-결합 폴리펩티드 사이의 융합체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 분자의 비-FGF21 부분은 Fc 영역이다.

다른 실시양태는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 벡터를 보유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 융합 단백질을 생성하는데 사용되는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 이러한 방법은, 예를 들어 야생형 FGF21 단백질 내 관심 위치에서의 아미노산의 부위-특이적 혼입을 통한 야생형 FGF21 단백질의 변형, 뿐만 아니라 다른 분자, 예를 들어 lgG 불변 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어 Fc 영역), 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 알부민-결합 폴리펩티드와 분자의 FGF21 부분 사이에서의 융합을 포함한다. 상기 변형 및 융합은 단백질의 야생형 버전에 비해 본 발명의 융합 단백질의 생물학적 특성을 증진시키고, 뿐만 아니라 일부 경우에는, 예를 들어 표지 및 단백질 반감기 연장제를 위한 부착지점으로서 작용하고, 고체 지지체의 표면에 상기 변이체를 부착하기 위해 작용한다. 본 발명의 관련 실시양태는 상기 본 발명의 단백질의 생산, 및 상기 변이체 및 융합체를 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터의 생산이 가능한 세포의 생산 방법이다.

다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 본 발명의 융합 단백질은 길이가 8-12개 아미노산 잔기만큼 작은 단편을 비롯한 FGF21 야생형 서열의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩티드는 포유동물에서 혈액 글루코스를 저하시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 본 발명의 융합 단백질은, 예를 들어 그의 야생형 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입, 부가 또는 치환을 갖는, FGF21 야생형 서열의 하나 이상의 변이체를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 본 발명의 융합 단백질은 야생형 FGF21에 비해 부위-특이적 아미노산 변형이 이루어진 위치에서든지 또는 이들 단백질의 야생형 버전과 공유하는 아미노산의 위치에서든지 하나 이상의 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리시알산에 공유적으로 연결될 수 있다. PEG 기는 본 발명의 융합 단백질, 예를 들어 FGF21 단백질 변이체의 구성성분 부분의 생물학적 기능을 증진시키고/거나 저해하지 않는 방식으로 부착된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 임의로 링커, 예컨대 GS, GGGGSGGGGSGGGGS (서열 6)를 통해 이종 아미노산 서열에 융합될 수 있다. 이종 아미노산 서열은 IgG 불변 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어 Fc 영역), 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 알부민-결합 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 개시된 이러한 융합 단백질은 또한 다량체를 형성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 이종 아미노산 서열 (예를 들어 HSA, Fc 등)은 본 발명의 융합 단백질의 아미노-말단에 융합된다. 다른 실시양태에서, 융합 이종 아미노산 서열 (예를 들어 HSA, Fc 등)은 본 발명의 융합 단백질의 카르복실-말단에 융합된다.

또 다른 실시양태는 하나 이상의 FGF21-연관 장애, 예컨대 비만, 제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 및 다른 대사 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 하나 이상의 본 발명의 단백질 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애를 나타내는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 본 발명의 융합 단백질 및 제약상 허용되는 제제화 작용제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 대사 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있고, 방법은 그를 필요로 하는 인간 환자에게 본 발명의 제약 조성물의 투여하는 것을 포함한다. 치료할 수 있는 대사 장애의 비제한적 예는 제1형 및 제2형 당뇨병 및 비만을 포함한다.

본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 발명의 상세한 설명에서 설명될 것이다.

도 1a-1d는 V188이 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 V76보다 개선된 효능을 갖는 것을 나타낸다. V188은 킬로그램당 1 밀리그램 (mpk)으로 투여될 때, V76이 킬로그램당 5 밀리그램으로 투여되었을 때에 비해 우수한 결과를 나타낸다. 도 1a는 식후 혈장 글루코스를 판독값으로서 나타낸다 (원형은 비히클 (PBS - 포스페이트 완충 염수)을 나타내고, 사각형은 5 mpk의 V76을 나타내고, 삼각형은 1 mpk의 V188을 나타냄). 도 1b는 식후 혈장 인슐린을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V188). 도 1c는 체중을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V188). 도 1d는 간 지질 함량을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V188).
도 2a-2d는 V101이 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 V76보다 개선된 효능을 갖는 것을 나타낸다. V101은 킬로그램당 1 밀리그램 (mpk)으로 투여될 때, V76이 킬로그램당 5 밀리그램으로 투여되었을 때에 비해 우수한 결과를 나타낸다. 도 2a는 식후 혈장 글루코스를 판독값으로서 나타낸다 (원형은 비히클 (PBS - 포스페이트 완충 염수)을 나타내고, 사각형은 5 mpk의 V76을 나타내고, 삼각형은 1 mpk의 V101을 나타냄). 도 2b는 식후 혈장 인슐린을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V101). 도 2c는 체중을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V101). 도 2d는 간 지질 함량을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V101).
도 3a-3d는 V103이 ob/ob 당뇨병 마우스 모델에서 V76보다 개선된 효능을 갖는 것을 나타낸다. V103은 킬로그램당 1 밀리그램 (mpk)으로 투여될 때, V76이 킬로그램당 5 밀리그램으로 투여되었을 때에 비해 우수한 결과를 나타낸다. 도 3a는 식후 혈장 글루코스를 판독값으로서 나타낸다 (원형은 비히클 (PBS - 포스페이트 완충 염수)을 나타내고, 사각형은 5 mpk의 V76을 나타내고, 삼각형은 1 mpk의 V103을 나타냄). 도 3b는 식후 혈장 인슐린을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V103). 도 3c는 체중을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V103). 도 3d는 간 지질 함량을 판독값으로서 나타낸다 (왼쪽에서부터 오른쪽으로: 비히클, 5 mpk의 V76 및 1 mpk의 V103).
도 4a-4d는 본 발명의 융합 단백질이 보유하는 당업계의 FGF21 융합 단백질보다 우수한 약동학적 및 열역학적 특성을 입증한다. 도 4a는 마우스에서의 상기 융합체의 IV 주사 후, Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G) 및 Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E)으로 기재된 바와 같은 PCT 공개공보 WO10/129600에서의 본 발명의 융합 단백질의 혈장 농도를 나타낸다. 도 4b는 항-Fc-ELISA에 의해 검정된 바와 같은 마우스에서의 단일 IV 투여 후 본 발명의 융합 단백질 (V101, V103 & V188)의 약동학적 특성을, 항 FGF21 항체 ELISA를 이용한 이전의 연구에서의 V76에 대한 마우스에서 생성된 약동학적 데이터와 비교하여 나타낸다. 도 4c는 120시간 및 15일에서의 Fc-ELISA 데이터와 일치하는, 항-FGF21 웨스턴 블롯에서의 본 발명의 융합 단백질의 무작위 추출 검사를 나타낸다. 블롯에서의 샘플은 하기와 같다: A는 V101을 나타내고, B는 V103을 나타내고, C는 V188을 나타낸다. 대조군은 V101 및 혈청이다. 도 4d는 V76에 비해 유의하게 증가된 본 발명의 융합 단백질의 열역학적 안정성을 입증한다. 위에서부터 아래로, 도면은 V101, V103 및 V188을 나타내며, 이들 모두는 V76 (T_m < 50℃ (나타내지 않음)) 및 야생형 FGF21 (T_m =46.5℃±0.3 (나타내지 않음))에 비해 개선된 용융 온도 (T_m)를 갖는다.

본 발명의 융합 단백질은 당업계에 공지된 바와 같은 전장 야생형 FGF21 폴리펩티드의 변형된 버전을 나타낸다. FGF21 야생형 서열은, 예를 들어 FGF21 야생형 서열과 단백질 변이체 간의 비교가 필요한 경우, 참조 서열 (서열 1)로서 작용할 것이다. FGF21 야생형 서열은 NCBI 참조 서열 번호 NP_061986.1을 갖고, 예를 들어 키론 코퍼레이션에 양도된 US 6,716,626B1과 같은 허여된 특허에서 찾을 수 있다 (서열 1).

전장 FGF21 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 mRNA 서열 (NCBI 참조 서열 번호 NM_019113.2)은 하기에 나타낸다 (서열 2).

성숙 FGF21 서열은 리더 서열이 결여되고, 또한 폴리펩티드의 다른 변형, 예컨대 (리더 서열이 있거나 없는) 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단의 단백질분해 프로세싱, 보다 큰 전구체로부터의 보다 작은 폴리펩티드 절단, N-연결된 및/또는 O-연결된 글리코실화, 및 당업자에게 이해되는 다른 번역후 변형을 포함할 수 있다. 성숙 FGF21 서열의 대표적인 예는 하기 서열 (서열 3, 전장 FGF21 단백질 서열 (NCBI 참조 서열 번호 NP_061986.1)의 아미노산 위치 29-209를 나타냄)을 갖는다.

성숙 FGF21 폴리펩티드 (서열 3)를 코딩하는 상응하는 cDNA 서열은 하기에 나타낸다 (서열 4).

본 발명의 융합 단백질은 본원에 열거된 야생형 단백질의 단백질 변이체 또는 돌연변이체, 예를 들어 FGF21 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질 변이체", "인간 변이체", "폴리펩티드 또는 단백질 변이체", "변이체", "돌연변이체", 뿐만 아니라 그의 임의의 유사 용어 또는 특정 버전 (예를 들어 "FGF21 단백질 변이체", "변이체", "FGF21 돌연변이체" 등)은 자연 발생 (즉, 야생형) 단백질 또는 폴리펩티드 대응부 또는 상응하는 천연 서열의 변형, 말단절단, 다른 변이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 정의한다. "변이체 FGF21" 또는 "FGF21 돌연변이체"는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 야생형 (즉, 자연 발생) FGF21 단백질에 상대하여 기재된다.

본 발명의 대표적인 융합 단백질 서열은 표 1에 열거된다. 상기 융합체의 기재는 FGF21 변이체, 및 적용가능한 경우 링커를 포함한다. FGF21 변이체에 의해 사용된 변화 또는 치환은 야생형 FGF21에 대해 번호가 매겨지고 기재된다. 예로서, "변이체 101 (V101)" (서열 10)은 2개의 아미노산 링커 및 야생형 FGF21에 대해 이루어진 하기 치환을 갖는 Fc-FGF21 융합체이다: Q55C, A109T, G148C, K150R, P158S, P174L, S195A, P199G, G202A.

표 1. FGF21 변이체 Fc 융합 단백질

^*- 달리 명시되지 않는 한, 상기 표의 FGF21 야생형 서열은 NCBI 참조 서열 번호 NP_061986.1 (서열 1)을 지칭함에 주의한다. FGF21 모이어티 내의 모든 돌연변이 및 상기 돌연변이의 상응하는 아미노산 넘버링은 Fc 및 링커 영역을 또한 포함할 수 있는 전장 서열이 아니라 다시 상기 표에서의 (서열 1)을 지칭한다.

본 발명의 융합 단백질에서 사용되는 변이체 또는 돌연변이체, 예를 들어 야생형 FGF21의 변이체는 야생형 단백질에 비해 하나 이상의 치환된, 부가된 및/또는 제거된 아미노산을 특징으로 한다. 추가로, 변이체는 야생형 단백질에 비해 N- 및/또는 C-말단의 말단절단을 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 변이체는 야생형 단백질의 일부 변형된 구조적 또는 기능적 특성을 보유한다. 예를 들어 변이체는 농축 용액에서의 증진되거나 또는 개선된 물리적 안정성 (예를 들어 보다 적은 소수성 매개 응집), 혈장과 함께 인큐베이션하는 경우의 증진되거나 또는 개선된 혈장 안정성, 또는 유리한 생물활성 프로파일을 유지하면서 증진되거나 또는 개선된 생물활성을 가질 수 있다.

본 발명의 융합 단백질의 부분과 그의 야생형 비교 단백질 사이의 차이를 구성하는 허용되는 아미노산 치환 및 변형은 비-자연 발생 아미노산 유사체에 의한 치환을 비롯한 하나 이상의 아미노산 치환, 및 말단절단을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질 (예를 들어 본 발명의 융합 단백질)은, 본원에 기재된 바와 같은 부위-지정 돌연변이체, 말단절단된 폴리펩티드, 단백질분해-저항성 돌연변이체, 응집-감소 돌연변이체, 조합 돌연변이체, 및 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

단백질 발현 분야의 당업자는 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현을 위해, 메티오닌 또는 메티오닌-아르기닌 서열이 임의의 본 발명의 융합 단백질의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 고려될 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명의 융합 단백질은 제약 보존제 (예를 들어 m-크레졸, 페놀, 벤질 알콜)와의 증가된 상용성을 보유할 수 있고, 따라서 저장 동안 단백질의 생리화학적 특성 및 생물학적 활성을 유지하는 보존된 제약 제제의 제조를 가능하게 한다. 따라서, 야생형에 비해 증진된 제약 안정성을 갖는 변이체는 생물학적 효력을 유지하면서, 생리학적 및 보존된 제약 제제 조건 둘 다 하에서 농축 용액에서의 개선된 물리적 안정성을 갖는다. 비제한적 예로서, 본 발명의 융합 단백질은 그의 야생형 대응부 또는 상응하는 천연 서열보다 단백질분해 및 효소적 분해에 대해 저항성일 수 있고; 개선된 안정성을 가질 수 있고; 응집 가능성이 적을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 이들 용어는 상호 배타적이거나 제한적이지 않으며, 주어진 변이체가 야생형 단백질의 하나 이상의 변형된 특성을 갖는 것이 전적으로 가능하다.

본 발명은 또한, 예를 들어 서열 3의 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 FGF21 아미노산 서열을 포함하지만, FGF21 단백질 변이체에 바람직한 특성, 예를 들어 FGF21-수용체에 대한 개선된 효력, 단백질분해-저항성, 증가된 반감기 또는 응집-감소 특성 및 그의 조합을 부여하는 특정 잔기는 추가로 변형되지 않은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 즉, 단백질분해-저항성, 응집-감소, 또는 다른 특성을 부여하기 위해 변형된 FGF21 돌연변이체 서열 내의 잔기를 제외하고, FGF21 돌연변이체 서열 내의 약 5% (대안적으로 4%, 대안적으로 3%, 대안적으로 2%, 대안적으로 1%)의 다른 모든 아미노산 잔기는 변형될 수 있다. 이러한 FGF21 돌연변이체는 하나 이상의 야생형 FGF21 폴리펩티드의 활성을 보유한다.

본 발명은 또한, 서열 2 또는 서열 4의 뉴클레오티드 서열과 약 85% 이상 동일하고, 더 바람직하게는 약 90 내지 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하지만, 코딩된 단백질의 단백질분해-저항성, 응집-감소 또는 다른 특성을 부여하는 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드는 추가로 변형되지 않는다. 즉, 단백질 분해-저항성, 응집-감소 또는 다른 특성을 부여하기 위해 변형된 FGF21 돌연변이체 서열 내의 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드를 제외하고, 돌연변이체 서열 내의 약 15%, 더 바람직하게는 약 10 내지 5％의 다른 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 하나 이상의 그의 야생형 대응부의 활성을 보유하는 단백질을 코딩한다.

본 발명의 융합 단백질을 생성하는데 사용되는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 이러한 방법은 야생형 버전의 단백질 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 FGF21 야생형 단백질)의 부위-특이적 변형 및 비-부위-특이적 변형, 예를 들어 야생형 단백질의 말단절단, 및 야생형 단백질 내 관심 위치에서의 아미노산의 부위-특이적 혼입을 포함한다. 상기 변형은 야생형 단백질에 비해 본 발명의 융합 단백질의 생물학적 특성을 증진시키고, 뿐만 아니라 일부 경우에는, 예를 들어 표지 및 단백질 반감기 연장제를 위한 부착 지점으로서 작용하고, 고체 지지체의 표면에 상기 변이체를 부착하기 위해 작용한다. 본 발명의 관련 실시양태는 상기 본 발명의 융합 단백질의 생산, 및 상기 변이체를 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터의 생산이 가능한 세포의 생산 방법이다.

특정 실시양태에서, 이러한 변형, 예를 들어 부위-특이적 변형은, 예를 들어 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 반감기를 연장하거나 또는 달리 생물학적 특성을 개선시키기 위해, 접합체, 예를 들어 PEG 기를 상기 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 부착하는데 사용된다. 상기 기술은 본원에 추가로 기재되어 있다.

다른 실시양태에서, 이러한 변형, 예를 들어 부위-특이적 변형은 본 발명의 단백질의 반감기를 연장하는 다른 중합체, 소분자 및 재조합 단백질 서열을 부착하는데 사용된다. 한 이러한 실시양태는 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대한 지방산 또는 특정 알부민 결합 화합물의 부착을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변형은 특정한 아미노산 유형에서 이루어지고, 단백질 상 하나 이상의 부위에 부착될 수 있다.

다른 실시양태에서, 이러한 변형, 예를 들어 부위-특이적 변형은 야생형 및/또는 변이 다량체, 예를 들어 이량체 (동종이량체 또는 이종이량체) 또는 삼량체 또는 사량체의 생성을 위한 부착 수단으로서 사용된다. 이들 다량체 단백질 분자는 아미노-말단에서 또는 카르복시-말단에서 다른 단백질, 예컨대 Fc, 인간 혈청 알부민 (HSA) 등에 부착되거나 융합된 PEG, 당 및/또는 PEG-콜레스테롤 접합체와 같은 기를 추가로 가질 수 있다.

다른 실시양태에서, 이러한 부위-특이적 변형은 부위-특이적으로 혼입된 피롤리신, 또는 피롤리신 유사체 또는 비-자연 발생 아미노산 (파라-아세틸-Phe, 파라-아지도-Phe)의 위치가 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 고체 지지체 표면 상에 대한 제어된 배향 및 부착을 허용하는 것인 상기 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 생산하는데 사용되거나 또는 PEG, 당 및/또는 PEG-콜레스테롤 접합체와 같은 기가 부착되도록 하는데 사용된다.

다른 실시양태에서, 이러한 부위-특이적 변형은 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 부위-특이적으로 가교결합시켜 이종이량체 및 이종삼량체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 헤테로-올리고머를 형성하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 이러한 부위-특이적 변형은 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 부위-특이적으로 가교결합시켜 단백질-단백질 접합체, 단백질-폴리펩티드 접합체, 단백질-펩티드 접합체, 폴리펩티드-폴리펩티드 접합체, 폴리펩티드-펩티드 접합체 또는 펩티드-펩티드 접합체를 형성하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 부위 특이적 변형은 하나 초과의 분자의 유형이 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 단일 부위에 부착되는 것을 허용하는 분지화 지점을 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 열거된 변형은 비-부위-특이적 방식으로 이루어져, 본 발명의 단백질-단백질 접합체, 단백질-폴리펩티드 접합체, 단백질-펩티드 접합체, 폴리펩티드-폴리펩티드 접합체, 폴리펩티드-펩티드 접합체 또는 펩티드-펩티드 접합체를 형성할 수 있다.

정의

다양한 정의가 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 대부분의 단어는 당업자에 의해 그 단어에 부여된 의미를 갖는다. 하기 또는 본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의된 단어는 전체로서 본 발명의 문맥에서 제공되고 당업자에 의해 전형적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "FGF21"은 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 단백질 패밀리의 구성원을 의미한다. FGF21의 아미노산 서열 (진뱅크 등록 번호 NP_061986.1)은 서열 1로서 제시되고, 이의 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 2 (NCBI 참조 서열 번호 NM_019113.2)로서 제시된다. "FGF21 변이체", "FGF21 돌연변이체" 및 유사한 용어는, 예를 들어 결실되거나, 부가되거나, 변형되거나, 또는 치환된 구성성분 아미노산 잔기를 갖는, FGF21 단백질의 변형된 버전을 설명한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "FGF21 수용체"는 FGF21에 대한 수용체를 의미한다 (문헌 [Kharitonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,Het al. (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Yet al. (2007) PNAS 104:7432-7437]).

용어 "FGF21 폴리펩티드"는 인간에서 발현되는 자연 발생 폴리펩티드를 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "FGF21 폴리펩티드"는 임의의 전장 FGF21 폴리펩티드, 예를 들어 209개의 아미노산 잔기로 이루어지고 서열 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 1; 181개의 아미노산 잔기로 이루어지고 전장 FGF21 폴리펩티드의 아미노-말단 단부의 28개 아미노산 (즉, 신호 펩티드를 구성하는 것)은 제거된 임의의 성숙 형태의 폴리펩티드를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "변이체 76"은, Cys154를 통해 연결된 40 kDa 분지형 PEG 및 177개 아미노산 야생형 단백질에 대한 8개 점 돌연변이를 특징으로 하는 FGF21 단백질 변이체이다. 변이체의 합성은 본원에 더 상세하게 기재되어 있고, 단백질 서열은 표 1 및 서열 9에 나타나 있다.

용어 "단리된 핵산 분자"는 (1) 전체 핵산이 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 약 50% 이상으로부터 분리되었거나, (2) "단리된 핵산 분자"가 자연에서는 연결되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 연결되지 않거나, (3) 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (4) 보다 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 단리된 핵산 분자에는 임의의 다른 오염 핵산 분자, 또는 폴리펩티드 생산 또는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그의 사용을 저해하는 그의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 실질적으로 존재하지 않는다.

용어 "벡터"는 코딩 정보를 숙주 세포에 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 (예를 들어 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 의미하기 위해 사용된다.

용어 "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시하고/거나 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 발현은 전사, 번역, 및 인트론이 존재할 경우의 RNA 스플라이싱과 같은 과정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 플랭킹 서열이 그의 통상적인 기능을 수행하도록 설정되거나 또는 조립된 것인 플랭킹 서열의 배열을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 융합 단백질의 요소들은 융합 단백질이 자연 발생의 내인성 단백질인 것처럼 기능하도록 하기 위해 및/또는 상승작용적 방식으로 상기 융합 단백질의 이질적인 요소들을 결합시키기 위해 서로 작동가능하게 연결될 수 있다.

뉴클레오티드 수준에서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 플링킹 서열은 코딩 서열의 복제, 전사 및/또는 번역에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 코딩 서열은 프로모터가 그 코딩 서열의 전사를 지시할 수 있을 때 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이다. 플랭킹 서열은 정확하게 기능하는 한, 코딩 서열에 인접할 필요가 없다. 따라서, 예를 들어 비번역되지만 전사되는 개재 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되었거나 형질전환될 수 있고 이어서 선택된 관심 유전자를 발현할 수 있는 세포를 의미하기 위해 사용된다. 상기 용어는 선택된 유전자가 존재하는 한, 자손의 형태 또는 유전적 구성이 본래의 모세포와 동일한지의 여부와는 상관없이 모 세포의 자손을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 자연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체 (이들 모두는 그 구조가 D 및 L 입체이성질체 형태를 허용하는 경우 이러한 입체이성질체 형태임)를 의미한다. 아미노산은 본원에서 그의 명칭, 그의 통상적으로 공지된 3문자 기호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고된 1문자 기호에 의해 지칭된다.

용어 "자연 발생"은 생물학적 물질, 예컨대 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등과 관련하여 사용되는 경우, 자연에서 발견되고 인간에 의해 조작되지 않은 물질의 의미한다. 이와 유사하게, 본원에 사용된 바와 같은 "비-자연 발생"은 자연에서 발견되지 않거나 인간에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 의미한다. 뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "자연 발생"은 염기 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T) 및 우라실 (U)을 의미한다. 아미노산과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "자연 발생"은 20개의 통상적인 아미노산 (즉, 알라닌 (A), 시스테인 (C), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 페닐알라닌 (F), 글리신 (G), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 리신 (K), 류신 (L), 메티오닌 (M), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V), 트립토판 (W), 및 티로신 (Y)), 뿐만 아니라 셀레노시스테인, 피롤리신 (Pyl 또는 O), 및 피롤린-카르복시-리신 (Pcl 또는 Z)을 의미한다.

피롤리신 (Pyl)은 메타노사르시나(Methanosarcina) 과의 메탄생성 고세균의 메틸아민 메틸트랜스퍼라제 내에서 자연적으로 발견되는 아미노산이다. 피롤리신은 각각의 mRNA 내의 인-프레임 UAG 코돈에서 번역과 동시에 혼입되는 리신 유사체이고, 이는 22번째 천연 아미노산으로 간주된다.

적어도 PCT 특허 공개공보 WO2010/48582 (출원인 아이알엠, 엘엘씨(IRM, LLC))에 기재된 바와 같이, 이. 콜라이에서 피롤리신 (Pyl)을 생합성하기 위한 시도는 본원에서 피롤린-카르복시-리신 또는 Pcl로 지칭되는 "탈메틸화 피롤리신"의 형성을 유발하였다. 본원에 사용된 바와 같은 "Pcl"은 Pcl-A 또는 Pcl-B를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-천연 아미노산" 및 "비천연 아미노산"은 동일하든 상이하든 임의의 유기체로부터의 비변형된 또는 변형된 유전자를 사용하여 임의의 유기체에서 생합성적으로 생성될 수 없는 아미노산 구조를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 (야생형) FGF21 단백질 서열 또는 본 발명의 서열에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 의미한다. 이들은 20개의 자연 발생 아미노산, 셀레노시스테인, 피롤리신 (Pyl), 또는 피롤린-카르복시-리신 (Pcl, 예를 들어 PCT 특허 공개공보 WO2010/48582에 기재된 바와 같은 것) 중 하나가 아닌 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 비-천연 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산의 치환에 의해, 및/또는 비-천연 아미노산의 자연 발생 (야생형) FGF21 단백질 서열 또는 본 발명의 서열 내로의 삽입에 의해 도입될 수 있다. 또한, 비-천연 아미노산 잔기는 목적 관능기, 예를 들어 관능성 모이어티 (예를 들어 PEG)를 연결하는 능력을 FGF21 분자에 부여하도록 혼입될 수 있다. 아미노산과 관련하여 사용되는 경우, 기호 "U"는 본원에 사용된 바와 같은 "비-천연 아미노산" 및 "비천연 아미노산"을 의미할 것이다.

또한, 이러한 "비천연 아미노산"은 단백질로의 혼입을 위해 변형된 tRNA 및 변형된 tRNA 신테타제 (RS)를 요구하는 것으로 이해된다. 이들 "선택된" 직교 tRNA/RS 쌍은 슐츠(Schultz) 등에 의해 개발된 선택 방법 또는 무작위 또는 표적화 돌연변이에 의해 생성된다. 예로서, 피롤린-카르복시-리신은 한 유기체로부터 숙주 세포로 이동된 유전자에 의해 생합성적으로 생성된다는 점, 및 천연 tRNA 및 tRNA 신테타제 유전자를 사용하여 단백질에 혼입된다는 점에서 "천연 아미노산"인 반면, p-아미노페닐알라닌 (문헌 [Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9] 참조)은 생합성적으로 생성될지라도, "선택된" 직교 tRNA/tRNA 신테타제 쌍에 의해 단백질에 혼입되기 때문에 "비천연 아미노산"이다.

변형된 코딩된 아미노산은 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, O-포스포세린, 아제티딘카르복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노부티르산, 3-아미노부티르산, 2-아미노피멜산, tert-부틸글리신, 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로프리온산, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 히드록시리신, 알로-히드록시리신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프트알라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 펜틸글리신, 피페콜산 및 티오프롤린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "아미노산"은 또한 특정 유기체 내에서의 대사물이지만 단백질 내로의 혼입을 위한 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 자연 발생 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산은 오르니틴, D-오르니틴 및 D-아르기닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 유사체"는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 일례로서 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물을 의미한다. 아미노산 유사체는, 가역적으로 또는 비가역적으로 화학적으로 차단되거나, 또는 그의 C-말단 카르복시기, 그의 N-말단 아미노기 및/또는 그의 측쇄 관능기가 화학적으로 변형된 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다. 이러한 유사체는 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 술폰, S-(카르복시메틸)-시스테인, S-(카르복시메틸)-시스테인 술폭시드, S-(카르복시메틸)-시스테인 술폰, 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르), N-에틸글리신, 알라닌 카르복스아미드, 호모세린, 노르류신, 및 메티오닌 메틸 술포늄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 의미한다.

용어 "생물학적 활성 변이체"는 폴리펩티드 변이체에 도입된 변형의 유형이나 수에 상관없이, 그의 야생형 (예를 들어 자연 발생) 단백질 또는 폴리펩티드 대응부의 활성, 예컨대 혈액 글루코스, HbA1c, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 조절하고; 췌장 기능을 증가시키고; 간 내 지질 수준을 감소시키고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비량 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 보유하는, 본 발명의 융합 단백질에서 예를 들어 융합체의 구성성분 단백질로서 사용되는 임의의 폴리펩티드 변이체를 의미한다. 그의 야생형 버전에 비해 다소 감소된 수준의 활성을 보유하는 폴리펩티드 변이체도 생물학적 활성 폴리펩티드 변이체로 간주될 수 있다. 본 발명의 생물학적 활성 폴리펩티드 변이체의 대표적인 비제한적 예는, 변형 후에 야생형 FGF21에 비해 유사하거나 증진된 생물학적 특성을 보유하는 FGF21 변이체이다.

용어 "유효량" 및 "치료 유효량"은 각각 야생형 폴리펩티드 또는 단백질 대응부의 하나 이상의 생물학적 활성, 예컨대 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키거나; 간 트리글리세리드 또는 지질 수준을 감소시키거나; 체중을 감소시키거나; 또는 글루코스 내성, 에너지 소비량 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력의 관찰가능한 수준을 지지하기 위해 사용되는 본 발명의 융합 단백질의 양을 의미한다. 예를 들어 FGF21-연관 장애 (예컨대 제1형 또는 제2형 당뇨병, 비만 또는 대사 증후군)를 나타내거나, 이를 앓고 있거나, 또는 앓기 쉬운 환자에게 투여되는 "치료 유효량"은 상기 언급된 장애와 연관된 병리학적 증상, 질환 진행, 생리학적 상태, 또는 상기 장애에 굴복하는 것에 대한 저항성에서의 개선을 유도하거나 향상시키거나 또는 달리 유발하는 양이다. 본 발명의 목적을 위해, "대상체" 또는 "환자"는 바람직하게는 인간이지만, 동물, 보다 구체적으로 반려 동물 (예를 들어 개, 고양이 등), 가축 (예를 들어 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험 동물 (예를 들어 래트, 마우스, 기니 피그 등)일 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 담체" 또는 "생리학상 허용되는 담체"는 본 발명의 융합 단백질의 전달을 달성하거나 증진시키기에 적합한 하나 이상의 제제화 물질을 의미한다.

용어 "항원"은 항체에 의해 결합될 수 있고, 추가로 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.

용어 "천연 Fc"는 단량체 또는 다량체 형태에 상관없이 전체 항체의 소화로부터 또는 다른 수단에 의해 생성된 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 의미하고, 힌지 영역을 함유할 수 있다. 천연 Fc의 본래의 이뮤노글로불린 공급원은 바람직하게는 인간 기원의 것이고, 임의의 이뮤노글로불린일 수 있지만, IgG1 및 IgG2가 바람직하다. 천연 Fc 분자는 공유 (즉, 디술피드 결합) 및 비-공유 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 이루어진다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디술피드 결합의 수는 부류 (예를 들어 IgG, IgA 및 IgE) 또는 하위부류 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 및 IgGA2)에 따라 1 내지 4 범위이다. 천연 Fc의 하나의 예는 IgG의 파파인 소화로부터 생성되는 디술피드-결합 이량체이다 (문헌 [Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9] 참조). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭이다.

용어 "Fc 변이체"는 천연 Fc로부터 변형되지만 여전히 샐비지(salvage) 수용체인 FcRn (신생아 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 포함하는 분자 또는 서열을 의미한다. 국제 공개 번호 WO 97/34631 및 WO 96/32478에 예시적인 Fc 변이체, 뿐만 아니라 샐비지 수용체와의 상호작용이 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 천연 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 천연 Fc는 본 발명의 융합 단백질의 융합 분자에 필요하지 않은 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 (1) 디술피드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 비상용성, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현 시의 N-말단 불균일성, (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 샐비지 수용체 이외의 Fc 수용체에 대한 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 주거나, 또는 관련된 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결여되거나, 또는 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함한다. Fc 변이체는 하기에 더 상세하게 기재되어 있다.

용어 "Fc 도메인"은 상기 정의된 바와 같은 천연 Fc 및 Fc 변이체 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc 분자에서와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 전체 항체로부터 소화된 것이든 다른 수단에 의해 생성된 것이든 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, Fc 도메인은, 예를 들어 Fc 도메인과 FGF21 서열 사이의 공유 결합을 통해 FGF21 또는 FGF21 돌연변이체 (FGF21 또는 FGF21 돌연변이체의 말단절단된 형태 포함)에 융합될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 Fc 도메인의 회합을 통해 다량체를 형성할 수 있고, 이들 융합 단백질 및 그의 다량체 둘 다 본 발명의 측면이다.

본원에 사용된 바와 같은 "변형된 Fc 단편"은 변형된 서열을 포함하는 항체의 Fc 단편을 의미할 것이다. Fc 단편은 CH2, CH3 및 힌지 영역의 일부를 포함하는 항체의 일부이다. 변형된 Fc 단편은, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. FcLALA는 LALA 돌연변이 (L234A, L235A)를 갖는 변형된 Fc 단편이고, 이는 저하된 효율을 갖는 ADCC를 유발하고 인간 보체에 결합하여 이를 약하게 활성화시킨다. 문헌 [Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104]. Fc 단편에 대한 추가의 변형은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,217,798에 기재되어 있다.

용어 "이종"은 이들 도메인이 항체의 불변 영역과 연관되어 자연적으로 발견되지 않음을 의미한다. 특히, 이러한 이종 결합 도메인은 4개의 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 및 이들 사이의 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어진 항체 가변 도메인의 전형적인 구조를 갖지 않는다. 따라서 퓨조바디의 각 아암은 항체의 불변 C_H1 중쇄 영역의 N-말단 부분에서 공유적으로 연결된 제1 결합 도메인을 포함하는 제1 단일 쇄 폴리펩티드, 및 항체의 불변 C_L 경쇄의 N-말단 부분에서 공유적으로 연결된 제2 결합 도메인을 포함하는 제2 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다. 공유 연결은, 예를 들어 펩티드성 결합을 통해 직접적일 수 있거나, 또는 링커, 예를 들어 펩티드성 링커를 통해 간접적일 수 있다. 퓨조바디의 2개의 이종이량체는, 항체 구조와 유사하게, 예를 들어 그의 힌지 영역에서의 1개 이상의 디술피드 가교에 의해 공유적으로 연결된다. 퓨조바디 구조를 갖는 분자의 예, 특히 이종이량체 수용체의 리간드 결합 영역을 포함하는 퓨조바디는 당업계에 기재된 바 있다 (예를 들어 국제 특허 공개공보 WO01/46261 및 WO11/076781 참조).

용어 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제 또는 커플링 또는 활성화 모이어티를 사용한 유도체화가 존재하거나 존재하지 않는 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 의미한다.

용어 "FGF21-연관 장애" 및 본원에서 유사하게 사용된 용어는 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 및 다른 대사 장애를 포함한다.

용어 "인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애" 및 본원에서 유사하게 사용된 용어는 중증 인슐린 저항성을 유도하지만 종종 (그러나 항상은 아님) 제2형 당뇨병에서 흔한 비만을 보이지 않는 인슐린 수용체 (또는 그로부터 직접 하류인 가능한 단백질)에서의 돌연변이로 인해 고통받는 대상체에서의 상태를 설명한다. 여러 면에서, 이들 상태로 인해 고통받는 대상체는 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 하이브리드 증상을 나타낸다. 이로 인해 고통받는 대상체는 유형 A 인슐린 저항성, 유형 C 인슐린 저항성 (AKA HAIR-AN 증후군), 랩손 멘덴홀(Rabson-Mendenhall) 증후군 및 최종적으로 도노휴(Donohue) 증후군 또는 요정증을 포함하는 대략적인 중증도 증가의 몇몇 카테고리로 나뉜다. 이들 장애는 매우 높은 내인성 인슐린 수준과 연관되고, 매우 종종 고혈당증과 연관된다. 이로 인해 고통받는 대상체는 또한 피부의 접힌 부분에서 고안드로겐증, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 다모증 및 흑색 극세포증 (과도한 성장 및 색소침착)을 비롯한 "인슐린 독성"과 연관된 다양한 임상적 특징을 나타낸다.

"제2형 당뇨병"은 인슐린의 이용가능성에도 불구하고 과량의 글루코스 생성을 특징으로 하는 상태이고, 부적절한 글루코스 클리어런스의 결과로서 순환 글루코스 수준이 과도하게 높게 유지된다.

"제1형 당뇨병"은 인슐린의 완전한 결여에 의해 야기되는 높은 혈액 글루코스 수준을 특징으로 하는 상태이다. 이것은 신체의 면역계가 췌장 내의 인슐린-생산 베타 세포를 공격하여 이를 파괴할 때 발생한다. 이에 따라, 췌장은 인슐린을 거의 또는 전혀 생산하지 않게 된다.

"글루코스 불내성" 또는 글루코스 내성 장애 (IGT)는 심혈관 병리상태의 증가된 위험과 연관된 이상혈당증의 당뇨병 전증 상태이다. 당뇨병 전증 상태는 대상체에서 글루코스의 세포 내로의 효율적인 이동 및 효율적인 연료 공급원으로서의 이용을 막아, 혈액 내 글루코스 수준의 상승 및 어느 정도의 인슐린 저항성을 야기한다.

"고혈당증"은 혈액 내 과량의 당 (글루코스)으로서 정의된다.

저혈당으로도 불리는 "저혈당증"은 혈액 글루코스 수준이 신체의 활성에 충분한 에너지를 제공하기에는 너무 낮게 떨어졌을 때 발생한다.

"고인슐린혈증"은 정상보다 높은 수준의 혈액 내 인슐린으로서 정의된다.

"인슐린 저항성"은 정상적인 양의 인슐린이 정상 미만의 생물학적 반응을 생성하는 상태로서 정의된다.

"비만"은 인간 대상체에 대해, 주어진 집단의 이상적인 체중보다 20% 초과로 더 높은 체중으로서 정의될 수 있다 (문헌 [R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916]).

"당뇨병성 합병증"은 높은 혈액 글루코스 수준에 의해 야기되는, 다른 신체 기능, 예컨대 신장, 신경 (신경병증), 발 (족부 궤양 및 불량한 순환) 및 눈 (예를 들어 망막병증)의 문제이다. 또한, 당뇨병은 심장 질환 및 골 및 관절 장애의 위험을 증가시킨다. 당뇨병의 다른 장기간 합병증은 피부 문제, 소화 문제, 성 기능장애 및 치아 및 잇몸 문제를 포함한다.

"대사 증후군"은 하기 징후 중 3개 이상의 집합으로서 정의될 수 있다: 복부 지방 - 대부분의 남성에서 40-인치 이상의 허리; 고혈당 - 공복 후 110 밀리그램/데시리터 (mg/dl) 이상; 높은 트리글리세리드 - 혈류에서 150 mg/dL 이상; 낮은 HDL - 40 mg/dl 미만; 및 130/85 mmHg 이상의 혈압.

"췌장염"은 췌장의 염증이다.

"이상지혈증"은 지단백질 과다생산 또는 결핍을 포함하는 지단백질 대사의 장애이다. 이상지혈증은 혈액 내의 총 콜레스테롤, 저-밀도 지단백질 (LDL) 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도의 상승, 및 고-밀도 지단백질 (HDL) 콜레스테롤 농도의 감소에 의해 나타낼 수 있다.

"비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)"은 간세포의 지방 변화를 특징으로 하는, 알콜 소비와 연관되지 않은 간 질환이다.

"비알콜성 지방간염 (NASH)"은 간소엽내 염증 및 섬유증이 동반되는 간세포의 지방 변화를 특징으로 하는, 알콜 소비와 연관되지 않은 간 질환이다.

"고혈압" 또는 높은 혈압은 심혈관 손상 또는 다른 유해한 결과를 유도할 가능성이 있는 수준으로의 전신 동맥 혈압의 일시적인 또는 지속적인 상승이다. 고혈압은 140 mmHg 초과의 수축기 혈압 또는 90 mmHg 초과의 확장기 혈압으로서 임의로 정의된 바 있다.

"심혈관 질환"은 심장 또는 혈관에 관한 질환이다.

"급성 심근경색"은 심장의 일부에 대한 혈액 공급의 중단이 있을 때 발생한다. 생성된 허혈 및 산소 부족은, 충분한 기간 동안 치료하지 않고 방치할 경우 심근 조직 (심근)의 손상 또는 사망 (경색증)을 야기할 수 있다.

"말초 동맥 질환"은 플라크가 혈액을 두부, 기관 및 사지로 운반하는 동맥에 축적될 때 발생한다. 시간이 경과함에 따라, 플라크는 경화되어 동맥을 좁게 만들 수 있고, 이는 기관 및 신체의 다른 부분으로의 산소-풍부 혈액의 흐름을 제한한다.

"아테롬성동맥경화증"은 동맥 내강의 협소화를 야기하고 종국적으로 섬유증 및 석회화로 진행되는, 대동맥 및 중간 크기 동맥의 내막에 불규칙적으로 분포하는 지질 침착물을 특징으로 하는 혈관 질환이다. 병변은 통상적으로 국소적이고, 서서히 및 간헐적으로 진행된다. 혈류 제한은 병변의 분포 및 중증도에 따라 상이한 대부분의 임상 징후를 설명한다.

"졸중"은 24시간보다 오래 지속되는 뇌 순환의 장애에 관한 임의의 급성 임상 사건이다. 졸중은 비가역적인 뇌 손상, 순환이 손상된 뇌 조직의 위치 및 범위에 따른 증상의 유형 및 중증도를 포함한다.

울혈성 심부전으로도 불리는 "심부전"은 심장이 충분한 혈액을 더 이상 신체의 나머지 부분으로 펌프질할 수 없는 상태이다.

관상동맥 질환으로도 불리는 "관상동맥 심장 질환"은 심장에 혈액 및 산소를 공급하는 소혈관의 협소화이다.

"신장 질환" 또는 신병증은 임의의 신장 질환이다. 당뇨병성 신병증은 제1형 또는 제2형 당뇨병을 앓는 사람의 이환 및 사망의 주요 원인이다.

"신경병증"은 뇌신경 또는 말초 또는 자율 신경계를 포함하는 임의의 질환이다.

"위마비"는 장의 지연 배출을 야기하는 위 연동운동의 약화이다.

본 발명에 의해 포함되는 중환자는 일반적으로 불안정한 대사항진 상태를 경험한다. 이 불안정한 대사 상태는 일부 영양소의 상대적인 결핍을 야기할 수 있는 기질 대사의 변화에 기인한다. 일반적으로 지방 및 근육 둘 다의 증가된 산화가 존재한다.

또한, 중환자는 바람직하게는 전신 염증 반응 증후군 또는 호흡 곤란을 경험하는 환자이다. 이환율의 감소는 중환자에서 추가의 질병, 상태, 또는 증상이 발병할 가능성의 감소 또는 추가의 질병, 상태, 또는 증상의 중증도의 감소를 의미한다. 예를 들어 이환율의 감소는 균혈증 또는 패혈증 또는 다발성 기관 부전과 연관된 합병증의 발생률의 감소에 상응할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 내용상 명백하게 달리 표시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "항체"는 2개 이상의 이러한 항체의 혼합물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 값의 +/- 20%, 보다 바람직하게는 +/- 10%, 보다 더 바람직하게는 +/- 5%를 의미한다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 의미하고, 이는 코딩 및 비-코딩 아미노산, 자연 및 비-자연 발생 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 융합 단백질, 예컨대 비제한적으로 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, 이종 및 상동 리더 서열을 갖고 N-말단 메티오닌 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 융합체; 면역학적으로 태그부착된 단백질 등을 포함한다.

용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되고, 진단, 치료 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체, 특히 인간을 의미한다. 다른 대상체는 소, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말 등을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 환자로부터의 생물학적 물질을 의미한다. 본 발명에 의해 검정되는 샘플은 임의의 특정한 유형으로 제한되지 않는다. 샘플은 비제한적 예로서 단세포, 다세포, 조직, 종양, 생물학적 유체, 생물학적 분자, 또는 임의의 상기의 것의 상청액 또는 추출물을 포함한다. 예는 생검을 위해 제거된 조직, 절제 동안 제거된 조직, 혈액, 소변, 림프 조직, 림프액, 뇌척수액, 점액 및 대변 샘플을 포함한다. 사용되는 샘플은 검정 형식, 검출 방법 및 검정되는 종양, 조직, 세포 또는 추출물의 특성에 따라 상이할 것이다. 샘플의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이용되는 방법에 적합한 샘플을 얻기 위해 용이하게 변형될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 분자"는 폴리펩티드, 핵산 및 사카라이드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절하는"은 유전자, 단백질, 또는 세포의 내부, 외부 또는 표면 상 임의의 분자의 질 또는 양의 변화를 나타낸다. 변화는 분자의 발현 또는 수준의 증가 또는 감소일 수 있다. 용어 "조절하다"는 또한 제한 없이 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키고; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준을 감소시키고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 포함하는 생물학적 기능/활성의 질 또는 양의 변화를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절제"는 FGF21-연관 장애, 예컨대 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 비만과 같은 대사 상태와 연관된 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 사건을 조절하는 조성물을 의미한다. 상기 사건은 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키고; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준을 감소시키고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"유전자 산물"은 유전자에 의해 발현되거나 생산된 생체중합체 생성물이다. 유전자 산물은, 예를 들어 비스플라이싱된 RNA, mRNA, 스플라이스 변이체 mRNA, 폴리펩티드, 번역후 변형된 폴리펩티드, 스플라이스 변이체 폴리펩티드 등일 수 있다. 또한, 상기 용어에는 RNA 유전자 산물을 주형으로서 사용하여 제조된 생체중합체 생성물 (즉, RNA의 cDNA)이 포함된다. 유전자 산물은 효소적으로, 재조합적으로, 화학적으로, 또는 유전자가 천연인 세포 내에서 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물이 단백질성이면, 이것은 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물이 핵산이면, 이것은 생물학적 활성을 나타내는 단백질성 유전자 산물로 번역될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "FGF21 활성의 조절"은, 예를 들어 작용제의 FGF21 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와의 상호작용, FGF21 전사 및/또는 번역의 억제 (예를 들어 FGF21 유전자 또는 FGF21 전사체와의 안티센스 또는 siRNA 상호작용, FGF21 발현을 용이하게 하는 전사 인자의 조절을 통함) 등의 결과일 수 있는 FGF21 활성 각각의 증가 또는 감소를 의미한다. 예를 들어 생물학적 활성의 조절은 생물학적 활성의 증가 또는 감소를 의미한다. FGF21 활성은 제한 없이 대상체에서의 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준의 검정, FGF21 폴리펩티드 수준의 평가, 또는 FGF21 전사 수준의 평가를 포함하는 수단에 의해 평가될 수 있다. FGF21 활성의 비교는, 예를 들어 FGF21 하류 바이오마커의 수준 측정, 및 FGF21 신호전달의 증가 측정에 의해서도 달성될 수 있다. FGF21 활성은 세포 신호전달; 키나제 활성; 지방세포 내로의 글루코스 흡수; 혈액 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준 변동; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준 변화; FGF21과 FGF21 수용체 사이의 상호작용; 또는 FGF21 수용체의 인산화 측정에 의해서도 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21 수용체의 인산화는 티로신 인산화일 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21 활성의 조절은 FGF21-관련 표현형의 조절을 야기할 수 있다.

FGF21 활성의 비교는, 예를 들어 FGF21 하류 바이오마커의 수준 측정, 및 FGF21 신호전달의 증가 측정에 의해서도 달성될 수 있다. FGF21 활성은 세포 신호전달; 키나제 활성; 지방세포 내로의 글루코스 흡수; 혈액 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준 변동; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준 변화; FGF21과 수용체 (FGFR-1c, FGFR-2c, 또는 FGFR-3c) 사이의 상호작용; 또는 FGF21 수용체의 인산화 측정에 의해서도 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21 수용체의 인산화는 티로신 인산화일 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF21 활성의 조절은 FGF21-관련 표현형의 조절을 야기할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "FGF21 하류 바이오마커"는 유전자 또는 유전자 산물, 또는 유전자 또는 유전자 산물의 측정가능한 표시이다. 일부 실시양태에서, FGF21의 하류 마커인 유전자 또는 활성은 변경된 발현 수준을 나타내거나, 또는 혈관 조직 내에서 나타난다. 일부 실시양태에서, 하류 마커의 활성은 FGF21 조절제의 존재 하에 변경된다. 일부 실시양태에서, 하류 마커는 FGF21이 본 발명의 FGF21 조절제에 의해 교란되는 경우 변경된 발현 수준을 나타낸다. FGF21 하류 마커는 제한 없이 글루코스 또는 2-데옥시-글루코스 흡수, pERK 및 다른 인산화 또는 아세틸화 단백질 또는 NAD 수준을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상향-조절하다"는 활성 또는 양의 증가, 활성화 또는 자극을 의미한다. 예를 들어 본 발명의 맥락에서, FGF21 조절제는 FGF21 수용체의 활성을 증가시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 FGFR-1c, FGFR-2c 또는 FGFR-3c는 FGF21 조절제에 반응하여 상향-조절될 수 있다. 상향-조절은 또한, 예를 들어 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤 수준을 저하시키거나; 간 지질 또는 간 트리글리세리드 수준을 감소시키거나; 체중을 감소시키거나; 글루코스 내성, 에너지 소비량, 또는 인슐린 감수성을 개선시키거나; 또는 FGF21 수용체의 인산화를 야기하거나; 또는 FGF21 하류 마커를 증가시키는 능력과 같은 FGF21-관련 활성을 의미한다. FGFR21 수용체는 FGFR-1c, FGFR-2c 또는 FGFR-3c 중 하나 이상일 수 있다. 상향-조절은 대조군에 비해 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 250%, 적어도 400% 또는 적어도 500%일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "N-말단"은 단백질의 적어도 첫 20개 아미노산을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "N-말단 도메인" 및 "N-말단 영역"은 상호교환적으로 사용되고, 단백질의 첫 아미노산에서 시작하여 단백질의 N-말단 절반 내의 임의의 아미노산에서 끝나는 단백질의 단편을 의미한다. 예를 들어, FGF21의 N-말단 도메인은 서열 1의 아미노산 1로부터 대략 서열 1의 아미노산 10과 105 사이의 임의의 아미노산까지이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "C-말단"은 단백질의 적어도 마지막 20개 아미노산을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "C-말단 도메인" 및 "C-말단 영역"은 상호교환적으로 사용되고, 단백질의 C-말단 절반 내의 임의의 아미노산에서 시작하여 단백질의 마지막 아미노산에서 끝나는 단백질의 단편을 의미한다. 예를 들어, FGF21의 C-말단 도메인은 서열 1의 아미노산 105로부터 대략 아미노산 200까지의 임의의 아미노산에서 시작하여 서열 1의 아미노산 209에서 끝난다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "도메인"은 생체분자의 공지된 또는 추정되는 기능에 기여하는 생체분자의 구조적 부분을 의미한다. 도메인은 영역 또는 그의 일부와 동시에 연장될 수 있고, 그 영역의 전부 또는 일부 이외에도 특정한 영역과 구별되는 생체분자의 일부를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 도메인" ("신호 서열" 또는 "신호 펩티드"로도 불림)은 전구체 단백질 (종종 막 결합 또는 분비 단백질)의 N-말단 영역에서 아미노산 서열의 연속 스트레치에 존재하는 펩티드 도메인을 의미하고, 번역후 단백질 수송에 관여한다. 다수의 경우에서, 신호 도메인은 분류 과정이 완료된 후, 특수 신호 펩티다제에 의해 전장 단백질로부터 제거된다. 각각의 신호 도메인은 전구체 단백질에 대해 세포 내의 특정 목적지를 지정한다. FGF21의 신호 도메인은 서열 1의 아미노산 1-28이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "수용체 결합 도메인"은 막 결합 수용체 단백질과 접촉하여 세포 반응, 예컨대 신호전달 사건을 유발하는 단백질의 임의의 부분 또는 영역을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드 결합 도메인"은 상응하는 천연 서열의 하나 이상의 정성적 결합 활성을 보유하는 본 발명의 융합 단백질의 임의의 부분 또는 영역을 의미한다.

용어 "영역"은 생체분자의 1차 구조의 물리적으로 인접하는 부분을 의미한다. 단백질의 경우에, 영역은 그 단백질의 아미노산 서열의 인접하는 부분에 의해 정의된다. 일부 실시양태에서, "영역"은 생체분자의 기능과 연관된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단편"은 생체분자의 1차 구조의 물리적으로 인접하는 부분을 의미한다. 단백질의 경우에, 상기 부분은 그 단백질의 아미노산 서열의 인접하는 부분에 의해 정의되고, 적어도 3-5개의 아미노산, 적어도 8-10개의 아미노산, 적어도 11-15개의 아미노산, 적어도 17-24개의 아미노산, 적어도 25-30의 아미노산, 및 적어도 30-45개의 아미노산을 의미한다. 올리고뉴클레오티드의 경우에, 상기 부분은 그 올리고뉴클레오티드의 핵산 서열의 인접하는 부분에 의해 정의되고, 적어도 9-15개의 뉴클레오티드, 적어도 18-30개의 뉴클레오티드, 적어도 33-45개의 뉴클레오티드, 적어도 48-72개의 뉴클레오티드, 적어도 75-90개의 뉴클레오티드, 및 적어도 90-130개의 뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시양태에서, 생체분자의 부분은 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 문맥에서, FGF21 폴리펩티드 단편은 서열 1에 제시된 전체 FGF21 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 자연으로부터 유래되는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 포유동물 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 어구 "상동 뉴클레오티드 서열", 또는 "상동 아미노산 서열", 또는 그의 변형은 뉴클레오티드 수준 또는 아미노산 수준에서 적어도 명시된 백분율의 상동성을 특징으로 하는 서열을 의미하고, "서열 동일성"과 상호교환적으로 사용된다. 상동 뉴클레오티드 서열은 단백질의 이소형을 코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 이소형은, 예를 들어 RNA의 선택적 스플라이싱의 결과로서 동일한 유기체의 상이한 조직에서 발현될 수 있다. 대안적으로, 이소형은 상이한 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상동 뉴클레오티드 서열은 포유동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 이외의 종의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상동 뉴클레오티드 서열은 또한 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열의 자연 발생 대립유전자 변이 및 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상동 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환을 함유하고 폴리펩티드가 동일한 결합 및/또는 활성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 비교 서열과 적어도 60% 또는 그 초과, 99%까지의 동일성을 갖는 경우 상동이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 비교 서열과 1개 이상, 60개까지의 뉴클레오티드/아미노산 치환, 부가 또는 결실을 공유하는 경우 상동이다. 일부 실시양태에서, 상동 아미노산 서열은 5개 이하 또는 3개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.

퍼센트 상동성 또는 동일성은, 예를 들어 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman) 알고리즘 (문헌 [Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489])을 이용하는, 디폴트 설정을 사용한 갭(Gap) 프로그램 (유닉스(UNIX)용 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 유니버시티 리서치 파크)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브와 표적 사이의 상동성은 약 75% 내지 약 85%이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 2 또는 그의 일부에 적어도 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 및 약 100% 상동인 뉴클레오티드를 갖는다.

상동성은 또한 폴리펩티드 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 구성성분 폴리펩티드는 그의 전장 야생형 대응부 또는 상응하는 천연 서열, 또는 그의 일부에 적어도 95% 상동일 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 또는 그의 일부와, 상이한 아미노산 서열의 동일성 정도 또는 백분율은 "본 발명 서열" 또는 "외래 서열" 중 어느 것이든 가장 짧은 것의 길이에 의해 나눠진 2개의 서열의 정렬에서 정확한 일치의 수로 계산된다. 그 결과는 동일성 퍼센트로서 표현된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼합"은 하나 이상의 화합물, 세포, 분자 등을 함께 동일한 영역 내에서 배합하는 과정을 의미한다. 이것은, 예를 들어 시험 튜브, 페트리 디쉬, 또는 하나 이상의 화합물, 세포, 또는 분자의 혼합을 허용하는 임의의 용기에서 수행될 수 있다

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 정제된"은 그의 자연 환경으로부터 제거되고 자연적으로 그와 함께 회합되는 다른 성분이 60% 이상, 75% 이상, 및 90% 이상 존재하지 않는 화합물 (예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 항체)을 의미한다.

용어 "제약상 허용되는 담체"는 치료제, 예컨대 항체 또는 폴리펩티드, 유전자, 및 다른 치료제의 투여를 위한 담체를 의미한다. 상기 용어는 그 자체가 조성물을 투여받은 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 제약 담체를 의미한다. 적합한 담체는 크고 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다. 이러한 담체는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 치료 조성물 내의 제약상 허용되는 담체는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함할 수 있다. 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 또한 이러한 비히클에 존재할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질의 물리적 안정성의 증진

시스테인 잔기에 의해 제공되는 바와 같은 자연 발생 디술피드 결합은 일반적으로 단백질의 열역학적 안정성을 증가시킨다. 용융 온도의 증가에서 측정된 바와 같은 증가된 열역학적 안정성의 성공적인 예는 효소 T4 리소자임 (문헌 [Matsumuraet al., PNAS 86:6562-6566 (1989)]) 및 바르나제 (문헌 [Johnson et al., J. Mol. Biol. 268:198-208 (1997)])의 다중 디술피드-결합 돌연변이체이다. 본 발명의 측면은 야생형 FGF21의 가요성을 제한하여 단백질의 소수성 코어에 대한 보존제의 접근을 제한하는 변이체 내의 디술피드 결합의 존재에 의해 달성되는, 보존제 존재 하의 FGF21의 물리적 안정성의 증진이다.

본 발명의 제2 측면은 따라서, 예를 들어 시스테인 잔기의 야생형 FGF21 단백질 또는 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질 변이체 내로의 혼입 또는 치환을 통한 추가의 디술피드 결합의 혼입에 의해 유도된 개선된 제약 안정성을 갖는 인간 FGF21의 변이체, 또는 그의 생물학적 활성 펩티드를 제공한다. 당업자는 천연 시스테인, 시스테인 103 및 시스테인 121이, 본원에 기재된 제안된 실시양태 이외의 개선된 특성을 부여할 수 있는 신규한 디술피드 결합을 도입하기 위한 유전자좌로서 이용될 수 있음을 인식할 것이다.

이들은 하기의 것들 중 2개 이상에 대한 시스테인의 치환을 야생형 FGF-21에 혼입한 융합 단백질을 포함한다: 글루타민 46, 아르기닌 47, 티로신 48, 류신 49, 티로신 50, 트레오닌 51, 아스파르테이트 52, 아스파르테이트 53, 알라닌 54, 글루타민 55, 글루타민 56, 트레오닌 57, 글루타메이트 58, 알라닌 59, 히스티딘 60, 류신 61, 글루타메이트 62, 이소류신 63, 발린 69, 글리신 70, 글리신 71, 알라닌 72, 알라닌 73, 류신 144, 히스티딘 145, 류신 146, 프롤린 147, 글리신 148, 아스파라긴 149, 리신 150, 세린 151, 프롤린 152, 히스티딘 153, 아르기닌 154, 아스파르테이트 155, 프롤린 156, 알라닌 157, 프롤린 158, 아르기닌 159, 글리신 160, 프롤린 161, 알라닌 162, 아르기닌 163, 페닐알라닌 164, 여기서 아미노산의 넘버링은 전장 209개 아미노산 hFGF21 서열 (서열 1)을 기준으로 한다.

또한, 본 발명의 융합 단백질은 하기와 같은 Cys103-Cys121에서 자연 발생한 것 이외의 조작된 디술피드 결합에 의해 증진된 야생형 인간 FGF21의 변이체, 또는 그의 생물학적 활성 펩티드를 포함할 수 있다:

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 제2 실시양태에 나타낸 2개 이상의 아미노산 위치에서의 시스테인의 치환과 조합한 본 발명의 제1 실시양태에 나타낸 임의의 아미노산 위치에서의 임의의 하전되고/거나 극성이지만 비하전된 아미노산의 치환을 포함하는 야생형 인간 FGF21의 변이체, 또는 그의 생물학적 활성 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

야생형 단백질 비교체 및 그의 변이체에 대한 본 발명의 융합 단백질의 개선

단백질 제약의 개발에서 유의한 문제는 단백질의 물리적 및 화학적 불안정성을 다루는 것임은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이것은 단백질 제약 제제가 유리한 생물활성 프로파일을 유지하면서 안정한 농축 및 보존 용액을 필요로 하는 다중 사용의 주사가능한 제제로 의도되는 경우 훨씬 더 분명해진다. 문헌에서 야생형 FGF21의 생물물리학적 특성화는 농축 단백질 용액 (5 mg/ml 초과)이 스트레스 조건, 예컨대 고온 또는 낮은 pH에 노출될 때 가속화된 회합 및 응집 (즉, 불량한 물리적 안정성 및 생물제약 특성)을 유도함을 확립하였다. FGF21의 농축 단백질 용액의 제약 보존제 (예를 들어 m-크레졸)에 대한 노출도 물리적 안정성에 대해 부정적인 영향을 가졌다.

따라서, 본 발명의 실시양태는 생리학적 및 보존된 제제 조건 둘 다 하에서 화학적 안정성 및 생물학적 효력을 유지하면서 농축 용액의 물리적 안정성을 증진시키는 것이다. 주어진 단백질 농도에서는 온도 및 이온 강도가 물리적 안정성에 대해 상당한 영향을 갖기 때문에, 회합 및 응집은 소수성 상호작용에 의한 결과일 수 있다고 생각된다. 대부분의 경우에, 비-보존된, 추정된 표면 노출 아미노산 잔기가 표적화되었다. 이들 잔기의 국부 환경을 분석하고, 구조적으로 중요한 것으로 생각되지 않는 잔기를 돌연변이유발을 위해 선택하였다. 특정 변화를 개시하기 위한 한 방법은 글루탐산 잔기를 도입함으로써 단백질의 pI를 추가로 감소시키는 것이었다 ("글루탐산 스캔"). 하전된 치환기의 도입은 전하-전하 반발을 통해 소수성-매개 응집을 억제하여, 잠재적으로 보존제 상용성을 개선시킬 것이라는 가설이 세워진다. 또한, 당업자는 충분한 정도의 돌연변이유발로, 음전하의 동시 감소를 수반하거나 수반하지 않는 양전하의 도입에 의해 전하-전하 반발을 허용함으로써 pI가 염기성 pH 범위로 이동할 수 있음을 또한 인식할 것이다.

생물치료제로서의 야생형 FGF21의 치료 용도와 연관된 추가의 문제점은, 예를 들어 그의 반감기가 생체내에서 매우 짧다는 것이다 (마우스 및 영장류에서 각각 약 0.5 및 2시간). 따라서 더 높은 효력 또는 더 긴 반감기를 통해 보다 효과적인 후속 화합물을 개발할 필요성이 존재한다. 본 발명의 융합 단백질은 보다 높은 효력 및 반감기-연장된 제제로 FGF21 치료의 바람직한 효과를 달성하기 위한 방식으로 개발되었다.

추가로 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질은 야생형 FGF21의 훨씬 더 짧은 반감기 및 PCT 공개공보 WO10/129600에서의 융합 단백질 Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E)의 17시간 반감기에 비해, 마우스에서 2주보다 긴 반감기를 갖는다. 본 발명의 융합 단백질은 또한 본원 및 2010년 11월 19일에 출원된 미국 특허 출원 61/415,476에 기재된 바와 같은 PEG화 V76에 비해 개선된 반감기 및 약동학적 특성을 입증한다.

또한, 1 mpk의 본 발명의 Fc-FGF21 융합 단백질은 글루코스, 인슐린, 체중 및 간 지질의 감소에 대해 5 mpk의 V76보다 효과적이다. ob/ob 마우스의 12일 치료 연구에서, 융합 단백질은 하기 비히클로부터의 % 변화를 나타낸다 (모든 융합체는 1.0 mg/kg으로 투여되고, V76은 5.0 mg/kg으로 투여됨):

비히클로부터의 총 글루코스 (AUC) % 변화: V76은 -42%이고; V101은 -53%이고, V103은 -46%이고, V188은 -42%임;

비히클로부터의 총 혈장 인슐린 % 변화: V76은 -46%이고; V101은 -82%이고, V103은 -69%이고, V188은 -59%임;

비히클로부터의 총 체중 % 변화: V76은 -7%이고; V101은 -12%이고, V103은 -12%이고, V188은 -11%임;

비히클로부터의 전체 간 지질 % 변화: V76은 -30%이고; V101은 -44%이고, V103은 -50%이고, V188은 -51%임.

이와 유사하게, 시험관내 검정은 V76에 대한 본 발명의 융합 단백질의 동일한 5배 또는 더 높은 효력을 나타낸다:

인간 지방세포 검정에서의 pERK에서 (평균 EC50 ± SEM), V76은 21 ± 2 nM (n=3)이고; V101은 1.0 ± 0.1 nM (n=3)이고, V103은 1.3 ± 0.2 nM (n=3)이고, V188은 1.4 ± 0.4 nM (n=3)이고;

인간 β클로토 검정에 의한 HEK293에서의 pERK에서 (평균 EC50 ± SEM), V76은 13 ± 4 nM (n=5)이고, V101은 0.60 ± 0.06 nM (n=5)이고, V103은 0.9 ± 0.3 nM (n=5)이고, V188은 0.4 ± 0.1 nM (n=3)이고;

마우스 지방세포 검정에서의 글루코스 흡수에서 (평균 EC50 ± SEM), V76은 5 ± 1 nM (n=3)이고, V101은 0.60 ± 0.06 nM (n=3)이고, V103은 0.60 ± 0.07 nM (n=3)이고, V188은 0.48 ± 0.14 nM (n=3)이다.

본 발명의 실시양태는 생리학적 및 보존된 제약 제제 조건 둘 다 하에서의 물리적 및 화학적 안정성에 관한 것이지만, 예를 들어 야생형 FGF21과 비교할 때 본 발명의 융합 단백질의 생물학적 효력을 유지하는 것 또한 중요한 고려 인자이다. 따라서, 본 발명의 단백질의 생물학적 효력은 본원의 실시예에 나타낸 바와 같은 글루코스 흡수 및/또는 혈장 글루코스 수준의 저하에 영향을 미치는 단백질의 능력에 의해 규정된다.

본 발명에 따라 투여되는 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성되고/거나 단리될 수 있다. 변이체를 생성하기 위한 가장 바람직한 방법은 재조합 DNA 방법론을 통한 것이고, 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 방법은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.)]에 기재되어 있다.

추가로, 바람직한 실시양태는 본원에 기재된 변이체로부터 유도된 생물학적 활성 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 기재된 하나 이상의 치환을 함유할 것이고, 변이체는 생물학적 활성을 보유할 것이다. 펩티드는 당업자에게 공지된 임의의 모든 수단에 의해 생산될 수 있고, 그 예는 효소적 소화, 화학적 합성 또는 재조합 DNA 방법론을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특정 섬유모세포 성장 인자의 펩티드 단편이 생물학적 활성을 갖는 것은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어 문헌 [Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988), 및 J. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106 (1987)]을 참조한다. 따라서, 변이체의 단편 또는 펩티드의 선택은 당업계에 공지된 기준을 기초로 한다. 예를 들어 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV 또는 DPP-4)는 뉴로펩티드, 내분비 펩티드 및 시토카인의 불활성화와 관련된 세린형 프로테아제로 공지되어 있다 (문헌 [Damme et al. Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)]). FGF21의 N-말단 (HisProIlePro)은, 잠재적으로 DPP-IV의 기질이고, 이에 따라 4개 아미노산이 N-말단에서 말단절단된 FGF21의 단편을 생성할 수 있는 2개의 디펩티드를 함유한다. 예상외로, 야생형 FGF21의 이 단편은 생물학적 활성을 보유하는 것으로 입증되었고, 따라서 4개 이하의 아미노산이 N-말단에서 말단절단된 본 발명의 단백질은 본 발명의 실시양태이다.

본 발명은 또한 RNA 형태 또는 DNA의 형태일 수 있는 상기 기재된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 코딩 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축중성의 결과로 달라질 수 있다.

본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함할 수 있다: 변이체에 대한 코딩 서열 단독; 변이체에 대한 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예컨대 기능성 폴리펩티드, 또는 리더 또는 분비 서열 또는 프로-단백질 서열; 변이체에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 변이체에 대한 코딩 서열의 5' 및/또는 3'의 인트론 또는 비-코딩 서열. 따라서, 용어 "변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 변이체에 대한 코딩 서열 뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 추가로, 제시된 치환을 함유하는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 인간 FGF21 서열의 자연 발생 대립유전자 변이체, 비-자연 발생 변이체, 또는 상기 기재된 말단절단된 변이체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 변이체가 개시된 변이체의 단편, 유도체 또는 유사체를 코딩하는 것인 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체는 제1 또는 제2 실시양태의 제시된 아미노산 치환이 하나 이상 존재하는 한, 결실 변이체, 치환 변이체, 말단절단된 변이체, 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 (즉, 기능을 보장하도록 위치한) 후에 숙주에서 발현될 것이다. 이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적 DNA 서열로 형질전환된 이들 세포의 검출을 허용하기 위해 선택 마커, 예를 들어 테트라시클린, 네오마이신 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다. FGF21 변이체는 적절한 프로모터의 제어 하에 포유동물 세포, 곤충, 효모, 박테리아 또는 다른 세포에서 발현될 수 있다. 무세포 번역 시스템이 본 발명의 DNA 구축물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 생산하는데 사용될 수도 있다.

이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하기에 특히 유용한 원핵 숙주이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스 섭틸루스(Bacillus subtilus), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 및 다양한 종의 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)를 포함하지만, 다른 것도 선택에 따라 사용될 수 있다. 이들 원핵 숙주 내에, 전형적으로 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어 복제 기점)을 함유할 발현 벡터를 제조할 수도 있다. 또한, 임의의 많은 익히 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (Trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다 또는 T7로부터의 프로모터 시스템이 존재할 수 있다. 프로모터는 전형적으로, 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.

단백질 발현 분야의 당업자는 이. 콜라이에서의 발현을 위해, 메티오닌 또는 메티오닌-아르기닌 서열이 성숙 서열 (서열 3)의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 문맥 내에서 고려됨을 인식할 것이다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 이. 콜라이에서 발현된 본 발명의 단백질은 N-말단에 도입된 메티오닌 서열을 갖는다.

다른 미생물, 예컨대 효모 또는 진균도 발현에 사용될 수 있다. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 피키아 안구스타(Pichia angusta)는 바람직한 효모 숙주의 예이고, 목적한 바와 같은 발현 제어 서열, 예컨대 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소를 포함하는 프로모터, 및 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 함유한다. 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei); 및 쉬조필룸 코뮨(Schizophyllum commune)이 진균 숙주의 예이지만, 다른 것도 선택에 따라 사용될 수 있다.

포유동물 조직 세포 배양 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생산하는데 사용될 수 있다. 진핵 세포가 실제로 바람직한데, 이는 무손상 변이체를 분비할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있기 때문이고, 여기에는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, NSO 세포, 시리안 햄스터(Syrian Hamster) 난소 세포주, HeLa 세포, 또는 인간 배아 신장 세포주 (즉, HEK293, HEK293EBNA)가 포함된다.

이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 라우스(Raus) 육종 바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. 바람직한 폴리아데닐화 부위는 SV40 및 소 성장 호르몬으로부터 유래된 서열을 포함한다.

관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어 본 발명의 융합 단백질 및 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 상이한 익히 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 이용되고, 반면에 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다

다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)] 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)는, 예를 들어 본 발명의 융합 단백질에 이용되는 생산 방법의 특성에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드, 예를 들어 본 발명의 이중 활성 융합 단백질은 환자의 임상 상태, 단백질 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 의사에게 공지된 다른 인자를 고려하여 우수한 의료 행위에 일치하는 방식으로 제제화되고 투여되어야 한다. 따라서, 본원의 목적을 위한 본 발명의 융합 단백질의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 결정된다.

본 발명의 단백질의 제약 조성물은 제1형 및 제2형 당뇨병, 비만, 대사 증후군 또는 중환자를 치료하기 위한 일반적으로 의도된 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 투여의 비제한적 허용 수단은, 예를 들어 흡입 또는 좌약에 의해 또는 점막 조직에, 예컨대 질, 직장, 요도, 협측 및 설하 조직에 대한 세척에 의해, 경구로, 비강으로, 국소로, 비강내로, 복강내로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 흉골내로, 관절내 주사에 의해, 림프내로, 간질로, 동맥내로, 피하로, 활막내, 경상피, 및 경피로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 세척에 의해, 경구로, 또는 동맥내로 투여된다. 다른 적합한 도입 방법에는 재충전성 또는 생분해성 장치 및 저속 또는 지속 방출 중합체성 장치가 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 다른 공지된 대사 작용제와의 조합 요법의 일부로서 투여될 수 있다.

투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재할 경우 동시 치료의 종류, 치료 빈도, 및 목적하는 효과의 특성에 좌우될 것이다. 본 발명의 범위 내의 조성물은 FGF21 변이체가 제1형 또는 제2형 당뇨병, 비만 또는 대사 증후군의 치료를 위해 목적하는 의학적 효과를 달성하는데 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물을 포함한다. 환자별로 개별 필요량은 달라질 수 있지만, 모든 성분의 유효량에 대해 최적인 범위를 결정하는 것은 통상의 기술을 가진 임상의의 능력 내에 있다.

본 발명의 단백질은 공지된 제약상 유용한 조성물의 제조 방법에 따라 제제화될 수 있다. 목적 제제는 적절한 희석제로 재구성되는 안정한 동결건조 생성물 또는 임의적인 제약상 허용되는 담체, 보존제, 부형제 또는 안정화제를 함유하는 고순도의 수용액인 제제일 것이다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)]). 본 발명의 단백질은 제약상 허용되는 완충제, 및 허용되는 안정성을 제공하기 위해 조정된 pH, 및 투여에 허용되는 pH와 조합될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 일반적으로 목적 순도의 하나 이상의 단백질을 제약상 허용되는 담체, 즉 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이고 제제의 다른 성분과 상용성인 것과 주사가능한 단위 투여 형태 (용액, 현탁액 또는 에멀젼)로 혼합함으로써 제제화된다. 바람직하게는, 하나 이상의 제약상 허용되는 항-미생물제가 첨가될 수 있다. 페놀, m-크레졸 및 벤질 알콜이 바람직한 제약상 허용되는 항-미생물제이다.

임의로, 하나 이상의 제약상 허용되는 염이 이온 강도 또는 장성을 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 하나 이상의 부형제가 제제의 등장성을 추가로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 글리세린, 염화나트륨 및 만니톨이 등장성 조정 부형제의 예이다.

당업자는 우수한 의료 행위 및 개별 환자의 임상 상태에 의해 결정된 바와 같이, 본 발명의 단백질을 포함하는 치료 조성물에 대한 제약상 유효 투여량 및 투여 요법을 용이하게 최적화할 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 전형적 용량 범위는 성인의 경우 약 0.01 mg/일 내지 약 1000 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 0.05 mg/주 내지 약 5000 mg/주)일 것이다. 바람직하게는, 투여량 범위는 약 0.1 mg/일 내지 약 100 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 0.5 mg/주 내지 약 500 mg/주), 보다 바람직하게는 약 1.0 mg/일 내지 약 10 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 5 mg/주 내지 약 50 mg/주)이다. 가장 바람직하게는, 투여량은 약 1-5 mg/일 (또는 주당 1회 투여되는 약 5 mg/주 내지 약 25 mg/주)이다. 투여되는 FGF21 변이체의 적절한 용량은 보다 빠르고 보다 효율적인 글루코스 이용에 의해 혈액 글루코스 수준의 저하 및 에너지 소비량의 증가를 유발할 것이고, 따라서 제1형 및 제2형 당뇨병, 비만 및 대사 증후군을 치료하는데 유용하다.

또한, 고혈당증 및 인슐린 저항성은 영양 지원이 주어진 중환자에서 통상적이기 때문에, 일부 ICU에서는 식후 중환자의 과도한 고혈당증을 치료하기 위해 인슐린을 투여한다. 실제로, 최근의 연구는 혈액 글루코스를 110 mg/dl 이하의 수준으로 유지하기 위한 외인성 인슐린의 사용이 당뇨병 병력의 존재 여부와 무관하게 외과 중환자실의 중환자의 이환율 및 사망률을 감소시켰음을 기록하고 있다 (문헌 [Van den Berghe, et al. N Engl J Med., 345(19):1359, (2001)]). 따라서, 본 발명의 단백질은 대사 불안정 중환자에서 대사 안정성의 회복을 돕는데 특유하게 적합하다. FGF21의 변이체를 함유하는 것과 같은 본 발명의 단백질은 그것이 글루코스 흡수를 자극하고, 인슐린 감수성을 증진시키지만, 저혈당증은 유도하지 않다는 점에서 특유하다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 상태, 및 다른 대사 장애의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 단백질이 고려된다.

부위-특이적 FGF21 돌연변이체

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 추가의 FGF21 돌연변이체 또는 비천연 아미노산을 갖는 FGF21 유사체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 야생형 FGF21의 하기 추가의 변형 중 하나 이상을 갖는 FGF21 효능제를 포함한다:

(i) 이량체화, 예컨대 R154C에서의 디술피드의 형성 또는 또 다른 부위에서의 시스테인의 도입, 또는 융합된 Fc 도메인을 통한 이량체화, 또는 이과능성 PEG와 같은 가교제를 통한 이량체 형성을 촉진하기 위한 추가의 디술피드, 비천연 아미노산, 또는 변형;

(ii) FGF21의 단편;

(iii) FGF21 활성 (베타-클로토에 결합 및 FGFR의 결합 및 활성화)을 갖도록 선택된 단백질; 및

(iv) FGF21 모방 항체 (다양한 형식, 예컨대 Fab, 유니바디, svFc 등).

일부 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 하기 링커 중 하나 이상을 포함한다: 단순 아미드 결합, 짧은 펩티드 (특히 Ser/Gly 반복부), FGF21 번역된 서열로부터의 추가 잔기, 또는 전체 단백질에 이르는 보다 큰 링커 (예컨대 Fc 도메인, HSA-결합 나선 다발, HSA 등). 2개의 모이어티는 또한 다른 화학적 수단에 의해, 예컨대 비천연 아미노산 또는 표준 화학 링커 (말레이미드-Cys, NHS-Lys, 클릭 등)를 통해 연결될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 반감기 연장을 위한 하기 부착을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 융합체의 단량체 또는 이량체 버전에 대한 HSA-결합 지질 또는 소분자 또는 미셀.

본 발명의 특정 실시양태에서, 반감기 연장 및 다른 개선된 생물학적 특성을 달성하기 위해 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대해 다른 부착이 이루어질 수 있다. 이들은 PEG-콜레스테롤 접합체 (미셀 및 리포솜 포함)를 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 부착하고/거나, 당 (글리코실레이트)을 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 부착하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 스타치 (HES), 알부민-결합 리간드, 또는 탄수화물 차폐의 접합체를 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 펩티드에 부가하기 위해 유사한 기술이 사용된다.

HES화 기술은, 예를 들어 환원성 알킬화를 통해 분지형 히드록시에틸스타치 (HES) 쇄 (60 kDa 또는 100 kDa, 옥수수 전분으로부터의 고분지형 아밀로펙틴 단편)를 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 커플링시킨다. 폴리시알화는 PEG화와 유사한 방식으로 관심 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 폴리시알산 (PSA) 중합체와 접합시킨다. PSA 중합체는 신체에서 자연적으로 발생하는 음으로 하전된 비-면역원성 중합체이고, 10-50kD의 분자량으로 이용가능하다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 반감기 연장 및 다른 개선된 생물학적 특성을 달성하기 위해 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대해 다른 부착 또는 변형이 이루어질 수 있다. 이들은 재조합 PEG (rPEG) 기의 생성, 및 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드에 대한 그의 부착을 포함한다. 회사 아뮤닉스 인크.(Amunix, Inc.)에 의해 개발된 바와 같은 rPEG 기술은 생물제약에 유전적으로 융합된 PEG-유사 특성을 갖는 단백질 서열을 기반으로 하여, 추가의 화학적 접합 단계를 회피한다. rPEG는 친수성 아미노산의 긴 비구조화 꼬리를 함유하는 연장된 반감기 엑세나티드 구축물이고, 이는 단백질 또는 펩티드의 혈청 반감기 증가 및 그의 흡수 속도 저하 둘 다를 가능하게 하여 최고효과-최저효과 비를 유의하게 감소시킬 수 있다. rPEG는 증가된 유체역학 반경을 갖고, 그의 실제 분자량의 약 15배인 겉보기 분자량을 나타내며, PEG화 방식을 모방하여 긴 혈청 반감기를 달성한다.

말단절단된 FGF21 폴리펩티드

본 발명의 한 실시양태는 성숙 FGF21 폴리펩티드 (서열 3)의 말단절단된 형태에 관한 것이다. 본 발명의 상기 실시양태는 성숙 FGF21 폴리펩티드의 비말단절단된 형태와 유사한, 일부 경우에는 이보다 우수한 활성을 제공할 수 있는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드를 확인하기 위한 노력에 의해 달성되었다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "말단절단된 FGF21 폴리펩티드"는 아미노산 잔기가 FGF21 폴리펩티드의 아미노-말단 (또는 N-말단) 단부로부터 제거되었거나, 아미노산 잔기가 FGF21 폴리펩티드의 카르복실-말단 (또는 C-말단) 단부로부터 제거되었거나, 또는 아미노산 잔기가 FGF21 폴리펩티드의 아미노-말단 및 카르복실-말단 단부 둘 다로부터 제거된 FGF21 폴리펩티드를 의미한다. 본원에 개시된 다양한 말단절단체를 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다.

N-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩티드 및 C-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩티드의 활성은 시험관내 포스포-ERK 검정을 사용하여 검정할 수 있다. 말단절단된 FGF21 폴리펩티드의 활성을 조사하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 검정의 구체적인 상세내용은 실시예에서 확인할 수 있다.

본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩티드의 활성은 또한 생체내 검정, 예컨대 ob/ob 마우스에서 평가될 수 있다. 일반적으로, 말단절단된 FGF21 폴리펩티드를 시험 동물에 복강 내로 투여하여 말단절단된 FGF21 폴리펩티드의 생체내 활성을 평가할 수 있다. 목적 인큐베이션 기간 (예를 들어 1시간 이상) 후에, 혈액 샘플을 채취하고, 혈액 글루코스 수준을 측정할 수 있다.

a. N-말단에서의 말단절단

본 발명의 일부 실시양태에서, N-말단에서의 말단절단은 성숙 FGF21 폴리펩티드의 N-말단 단부로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 잔기를 포함한다. 9개 미만의 아미노산 잔기의 N-말단에서의 말단절단을 갖는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 개체에서 혈액 글루코스를 저하시키는 성숙 FGF21 폴리펩티드의 능력을 보유한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 잔기의 N-말단에서의 말단절단을 갖는 성숙 FGF21 폴리펩티드 또는 FGF21 단백질 변이체의 말단절단된 형태를 포함한다.

b. C-말단에서의 말단절단

본 발명의 일부 실시양태에서, C-말단에서의 말단절단은 성숙 FGF21 폴리펩티드의 C-말단 단부로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 아미노산 잔기를 포함한다. 13개 미만의 아미노산 잔기의 C-말단에서의 말단절단을 갖는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 시험관내 ELK-루시페라제 검정에서 야생형 FGF21의 효능의 50% 이상의 효능을 나타냈고 (문헌 [Yie J. et al. FEBS Letts 583:19-24 (2009)]), 이는 이들 FGF21 돌연변이체가 개체에서 혈액 글루코스를 저하시키는 성숙 FGF21 폴리펩티드의 능력을 보유함을 나타낸다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 아미노산 잔기의 C-말단에서의 말단절단을 갖는 성숙 FGF21 폴리펩티드 또는 FGF21 단백질 변이체의 말단절단된 형태를 포함한다.

c. N-말단 및 C-말단에서의 말단절단

본 발명의 일부 실시양태에서, 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 N-말단 및 C-말단에서의 말단절단의 조합을 가질 수 있다. N-말단 및 C-말단에서의 말단절단의 조합을 갖는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서의 말단절단만을 갖는 상응하는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드의 활성을 공유한다. 즉, 9개 미만의 아미노산 잔기의 N-말단에서의 말단절단 및 13개 미만의 아미노산 잔기의 C-말단에서의 말단절단 둘 다를 갖는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 9개 미만의 아미노산 잔기의 N-말단에서의 말단절단을 갖는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드 또는 13개 미만의 아미노산 잔기의 C-말단에서의 말단절단을 갖는 말단절단된 FGF21 폴리펩티드와 유사하거나 보다 높은 혈액 글루코스-저하 활성을 보유한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 잔기의 N-말단에서의 말단절단 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 아미노산 잔기의 C-말단에서의 말단절단을 갖는, 성숙 FGF21 폴리펩티드 또는 FGF21 단백질 변이체의 말단절단된 형태를 포함한다.

본 발명의 모든 FGF21 변이체와 마찬가지로, 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 지정된 돌연변이에 의해 또는 박테리아 발현 과정의 결과로서 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌 잔기를 임의로 포함할 수 있다.

본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 본원에 기재된 실시예에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 잘 알고 있는 당업자는 본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩티드를 제조하고 사용하기 위해 본원의 개시내용과 함께 그 지식을 이용할 수 있다. 표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 형질전환 (예를 들어 전기천공, 리포펙션)을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 상기 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual]을 참고한다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 상세설명에 따라, 당업계에서 통상적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 연관되어 이용되는 명명법 및 그의 실험 절차 및 기술은 당업계에 익히 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기술이 화학적 합성; 화학적 분석; 제약 제조, 제제화, 및 전달; 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 또한 말단절단된 FGF21 폴리펩티드에 추가의 특성을 부여할 수 있는 또 다른 물질에 융합될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 말단절단된 FGF21 폴리펩티드는 IgG 불변 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어 Fc 영역), 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 알부민-결합 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이러한 융합은 공지의 분자 생물학적 방법 및/또는 본원에 제공된 지침을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 융합 폴리펩티드의 이익, 뿐만 아니라 이러한 융합 폴리펩티드의 제조 방법은 본원에서 보다 상세하게 설명된다.

FGF21 융합 단백질

본원에 사용된 바와 같은 용어 "FGF21 융합 폴리펩티드" 또는 "FGF21 융합 단백질"은 본원에 기재된 임의의 FGF21 단백질 변이체의 N-말단 또는 C-말단에서의 1개 이상의 아미노산 잔기 (예컨대 이종 단백질 또는 펩티드)의 융합체를 의미한다.

FGF21 융합 단백질은 이종 서열을, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 FGF21 단백질 변이체의 N-말단 또는 C-말단에서 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 이종 서열은 아미노산 서열 또는 비-아미노산-함유 중합체일 수 있다. 이종 서열은 FGF21 단백질 변이체에 직접 또는 링커 또는 어댑터 분자를 통해 융합될 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 1개 이상의 아미노산 잔기 (또는 -량체), 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 잔기 (또는 -량체), 바람직하게는 10 내지 50개 아미노산 잔기 (또는 -량체), 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 잔기 (또는 -량체), 보다 바람직하게는 15 내지 35개 아미노산 잔기 (또는 -량체)일 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 또한 DNA 제한 엔도뉴클레아제에 대한 또는 융합된 모이어티의 분리를 허용하는 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖도록 설계될 수 있다.

이종 펩티드 및 폴리펩티드는 FGF21 단백질 변이체의 검출 및/또는 단리를 허용하는 에피토프; 막횡단 수용체 단백질 또는 그의 일부, 예컨대 세포외 도메인 또는 막횡단 및 세포내 도메인; 막횡단 수용체 단백질에 결합하는 리간드 또는 그의 일부; 촉매 활성을 갖는 효소 또는 그의 일부; 올리고머화를 촉진하는 폴리펩티드 또는 펩티드, 예컨대 류신 지퍼 도메인; 안정성을 증가시키는 폴리펩티드 또는 펩티드, 예컨대 이뮤노글로불린 불변 영역; 기능적 또는 비-기능적 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄; 및 본 발명의 FGF21 단백질 변이체와 상이한 활성, 예컨대 치료 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한 인간 혈청 알부민 (HSA)에 융합된 FGF21 돌연변이체도 본 발명에 포함된다.

a. Fc 융합

본 발명의 한 실시양태에서, FGF21 단백질 변이체는 인간 IgG의 Fc 영역의 하나 이상의 도메인에 융합된다. 항체는 2개의 기능적으로 독립적인 부분, 즉 항원에 결합하는 "Fab"로 공지된 가변 도메인 및 이펙터 기능, 예컨대 보체 활성화 및 식세포에 의한 공격과 관련된 "Fc"로 공지된 불변 도메인을 포함한다. Fc는 긴 혈청 반감기를 갖는 반면, Fab는 수명이 짧다 (문헌 [Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31]). 치료 단백질과 함께 연결되는 경우, Fc 도메인은 보다 긴 반감기를 제공하거나 또는 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 고정, 및 아마도 심지어 태반 전달과 같은 기능을 혼입할 수 있다 (문헌 [Capon et al., 1989]).

개시내용 전반에 걸쳐, Fc-FGF21은 Fc 서열이 FGF21의 N-말단에 융합된 융합 단백질을 의미한다. 이와 유사하게, 개시내용 전반에 걸쳐, FGF21-Fc는 Fc 서열이 FGF21의 C-말단에 융합된 융합 단백질을 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 본원에 정의된 바와 같은 FGF21 변이체를 포함하는 Fc-FGF21 융합 단백질이다. 특히 바람직한 실시양태는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 Fc 단편 (예를 들어 FcLALA) 및 FGF21 변이체를 포함하는 Fc-FGF21 융합 단백질이다.

융합 단백질은, 예를 들어 단백질 A 친화도 칼럼의 사용에 의해 정제될 수 있다. Fc 영역에 융합된 펩티드 및 단백질은 생체내에서 비융합된 대응부보다 실질적으로 긴 반감기를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, Fc 영역에 대한 융합은 융합 폴리펩티드의 이량체화/다량체화를 허용한다. Fc 영역은 자연 발생 Fc 영역일 수 있거나, 또는 특정 품질, 예컨대 치료 품질, 순환 시간, 또는 감소된 응집을 개선하기 위해 변경될 수 있다.

항체의 "Fc" 도메인과의 융합에 의한 단백질 치료제의 유용한 변형은 PCT 공개 번호 WO 00/024782에 상세하게 논의되어 있다. 이 문헌에는 "비히클", 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란 또는 Fc 영역에 대한 연결이 논의되어 있다.

b. 융합 단백질 링커

본 발명의 융합 단백질을 형성할 때, 필요하지는 않지만, 링커가 사용될 수 있다. 존재할 경우, 링커는 주로 스페이서로서 작용하기 때문에 그의 화학 구조는 중요하지 않을 수 있다. 링커는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어지고, 여기서 아미노산은 20개의 자연 발생 아미노산으로부터 선택된다. 다양한 실시양태에서, 1 내지 20개의 아미노산은 아미노산 글리신, 세린, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커는 입체적으로 비방해된 대부분의 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리글리신, 폴리알라닌, 글리신과 알라닌의 조합 (예컨대 폴리(Gly-Ala)), 또는 글리신과 세린의 조합 (예컨대 폴리(Gly-Ser))이다. 15개 아미노산 잔기의 링커가 FGF21 융합 단백질에 대해 특히 잘 기능하는 것으로 밝혀졌지만, 본 발명은 임의의 길이 또는 조성의 링커를 고려한다.

본원에 기재된 링커는 예시적인 것이고, 훨씬 더 길고 다른 잔기를 포함하는 링커가 본 발명에 의해 고려된다. 비-펩티드 링커도 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들어, 알킬 링커와 같은 것이 사용될 수 있다. 이들 알킬 링커는 저급 알킬 (예를 들어 C1-C6), 저급 아실, 할로겐 (예를 들어 Cl, Br), CN, NH2 또는 페닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 비-입체 방해 기에 의해 추가로 치환될 수 있다. 예시적인 비-펩티드 링커는 폴리에틸렌 글리콜 링커이고, 여기서 링커는 100 내지 5000 kD, 예를 들어 100 내지 500 kD의 분자량을 갖는다.

화학적으로 변형된 융합 단백질

예를 들어 본원에 기재된 FGF21 융합체의 말단절단 및 변이체 형태를 비롯하여 본원에 기재된 융합 단백질의 화학적으로 변형된 형태는 본원에 기재된 개시내용을 고려하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. 이러한 화학적으로 변형된 융합 단백질은, 화학적으로 변형된 돌연변이체가 돌연변이체에 자연적으로 부착된 분자의 유형 또는 위치에 있어서 비변형된 돌연변이체와 상이하도록 변경된다. 화학적으로 변형된 돌연변이체는 하나 이상의 자연적으로 부착된 화학적 기의 결실에 의해 형성된 분자를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 하나 이상의 중합체의 공유 부착에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 선택된 중합체는 전형적으로, 그것이 부착되는 단백질이 수용성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 침전되지 않도록 수용성이다. 적합한 중합체의 범위 내에는 중합체의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료 용도를 위해, 중합체는 제약상 허용되는 것일 것이다. 본 발명의 단백질에 접합된 비-수용성 중합체 또한 본 발명의 측면을 형성한다.

예시적인 중합체는 각각 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 중합체는 각각 전형적으로 약 2 kDa 내지 약 100 kDa의 평균 분자량을 갖는다 (용어 "약"은 수용성 중합체의 제제 내에서, 일부의 분자는 언급된 분자량보다 크고 일부는 작을 것임을 나타냄). 각각의 중합체의 평균 분자량은 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 보다 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 40 kDa, 가장 바람직하게는 약 20 kDa 내지 약 35 kDa이다.

적합한 수용성 중합체 또는 그의 혼합물은 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물, 당, 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (모노-(C1-C10), 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리 에틸렌 글리콜을 비롯하여 단백질의 유도체화에 사용된 PEG 형태 포함), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 (예컨대 저분자량, 예를 들어 약 6 kD의 덱스트란), 셀룰로스, 또는 다른 탄수화물 기재 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 및 폴리비닐 알콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 공유적으로 부착된 FGF21 단백질 변이체 다량체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 이관능성 가교결합 분자가 본 발명에 포함된다. 또한, 폴리시알산에 공유적으로 부착된 FGF21 돌연변이체가 본 발명에 포함된다.

폴리사카라이드 중합체는 단백질 변형을 위해 사용할 수 있는 또 다른 유형의 수용성 중합체이다. 따라서, 폴리사카라이드 중합체에 융합된 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 실시양태를 형성한다. 덱스트란은 우세하게 알파 1-6 연결에 의해 연결된 글루코스의 개별 서브유닛으로 구성된 폴리사카라이드 중합체이다. 덱스트란 자체는 넓은 분자량 범위에서 이용가능하고, 약 1 kD 내지 약 70 kD의 분자량에서 용이하게 이용가능하다. 덱스트란은 단독으로 또는 또 다른 비히클 (예를 들어 Fc)과 조합하여 비히클로서 사용하기에 적합한 수용성 중합체이다. 예를 들어 국제 공개 번호 WO 96/11953을 참조한다. 치료 또는 진단 이뮤노글로불린에 접합된 덱스트란의 사용이 보고된 바 있다. 예를 들어 본원에 참조로 포함된 유럽 특허 공보 번호 0 315 456을 참조한다. 본 발명은 또한 약 1 kD 내지 약 20 kD의 덱스트란의 사용을 포함한다.

일반적으로, 화학적 변형은 단백질을 활성화된 중합체 분자와 반응시키기 위해 사용되는 임의의 적합한 조건 하에 수행할 수 있다. 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) FGF21 단백질 변이체가 하나 이상의 중합체 분자에 부착되는 조건 하에 폴리펩티드를 활성화된 중합체 분자 (예컨대 중합체 분자의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 최적의 반응 조건은 공지의 파라미터 및 목적하는 결과를 기준으로 결정될 것이다. 예를 들어 중합체 분자 대 단백질의 비가 클수록, 부착된 중합체 분자의 백분율이 커진다. 본 발명의 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체는 아미노-말단에 단일 중합체 분자 모이어티를 가질 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,234,784 참조).

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 단백질을 비오틴에 화학적으로 커플링시킬 수 있다. 이어서, 비오틴/본 발명의 단백질을 아비딘에 결합시켜, 4가의 아비딘/비오틴/본 발명의 단백질을 생성한다. 또한 본 발명의 단백질을 디니트로페놀 (DNP) 또는 트리니트로페놀 (TNP)에 공유적으로 커플링시키고, 생성된 접합체를 항-DNP 또는 항-TNP-IgM으로 침전시켜 10가의 십량체 접합체를 형성할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체의 투여에 의해 완화되거나 조정될 수 있는 상태는 본 발명의 단백질에 대해 본원에 기재된 것을 포함한다. 그러나, 본원에 개시된 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체는 비변형된 FGF21 돌연변이체에 비해 추가의 활성, 증진 또는 감소된 생물학적 활성, 또는 다른 특징, 예컨대 증가 또는 감소된 반감기를 가질 수 있다.

융합 단백질의 치료 조성물 및 그의 투여

본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 융합 단백질 중 하나 이상을 투여 방식에 적합하도록 선택된 제약상 또는 생리학상 허용되는 제제화 작용제 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합하여 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 조합물은, 예를 들어 증진된 특성을 나타내는 단백질의 확인의 관점에서 구체적으로 고려된다.

일부 실시양태에서, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조되고; 주사 전 액체 비히클 내의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다. 리포솜은 제약상 허용되는 담체의 정의 내에 포함된다. 제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 또한 제약 조성물 내에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제에 대한 자세한 논의는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkins]에서 이용가능하다.

허용되는 제제화 물질은 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.

제약 조성물은, 예를 들어 조성물의 pH, 오스몰농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착, 또는 투과를 변형하거나, 유지하거나 또는 보존하기 위한 제제화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제제화 물질은 아미노산 (예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항미생물제, 항산화제 (예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨), 완충제 (예컨대 보레이트, 비카르보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산), 벌킹제 (예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이트화제 (예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)), 착화제 (예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물 (예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린), 단백질 (예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체 (예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염-형성 반대이온 (예컨대 나트륨), 보존제 (예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소), 용매 (예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜 (예컨대 만니톨 또는 소르비톨), 현탁화제, 계면활성제 또는 습윤제 (예컨대 플루로닉스; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 증진제 (예컨대 수크로스 또는 소르비톨), 장성 증진제 (예컨대 알칼리 금속 할라이드; 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨; 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 제약 아주반트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)], 및 그의 후속판 참조).

최적 제약 조성물은, 예를 들어 의도된 투여 경로, 전달 형식, 및 목적 투여량에 따라 당업자가 결정할 것이다 (예를 들어 상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조). 이러한 조성물은 본 발명의 융합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 생체 내 클리어런스 속도에 영향을 줄 수 있다.

제약 조성물 내의 1차 비히클 또는 담체는 특성상 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어 주사에 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여를 위한 조성물에 통상적인 다른 물질로 보충된 물, 생리 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수는 추가의 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 제약 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 트리스 완충제, 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 완충제를 포함하고, 이는 소르비톨 또는 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이중 기능 제약 조성물은 목적 순도를 갖는 선택된 조성물을 임의의 제제화 작용제 (상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences])와 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다. 추가로, 이중 기능 단백질 생성물은 적절한 부형제, 예컨대 수크로스를 사용하여 동결건조물로서 제제화될 수 있다.

본 발명의 융합 단백질을 함유하는 제약 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관, 예컨대 경구를 통한 전달을 위해 선택될 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 조성물의 제조는 당업계의 기술 내에 있다.

제제 성분은 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 예를 들어 완충제를 사용하여 조성물을 생리학적 pH로 또는 약간 더 낮은 pH로, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 유지한다.

비경구 투여가 고려될 때, 본 발명에서 사용하기 위한 치료 조성물은 제약상 허용되는 비히클 내에 목적하는 이중 기능 단백질을 포함하는, 발열원 무함유의 비경구로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은, 그 안에 이중 기능 단백질이 적절하게 보존된 멸균 등장성 용액으로서 제제화된 멸균 증류수이다. 또 다른 제제는 추후 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 제어 또는 지속 방출을 제공하는 작용제, 예컨대 주사가능한 마이크로구체, 생분해성 입자, 중합체 화합물 (예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포솜에 의한 목적 분자의 제제화를 포함할 수 있다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있고, 이는 순환에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 목적 분자를 도입하기에 적합한 다른 수단은 이식가능한 약물 전달 장치를 포함한다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 흡입용으로 제제화될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 이중 기능 단백질은 흡입을 위한 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 이중 기능 단백질 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위한 추진제에 의해 제제화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 기재하는 국제 공개 번호 WO 94/20069에 추가로 기재되어 있다.

특정 제제는 경구로 투여될 수 있음이 또한 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이 방식으로 투여되는 본 발명의 융합 단백질은 고체 투여 형태, 예컨대 정제 및 캡슐의 조제에 통상적으로 사용되는 담체를 사용하거나 사용하지 않고 제제화될 수 있다. 예를 들어 캡슐은 생체이용률이 최대이고 사전-전신 분해가 최소일 때 위장관 내의 지점에서 제제의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 흡수를 촉진하기 위한 추가의 작용제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.

또 다른 제약 조성물은 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와 혼합하여 포함할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 또 다른 적절한 비히클 내에 용해시킴으로써, 용액을 단위-투여 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 융합 단백질을 포함하는 추가의 제약 조성물, 예컨대 지속- 또는 제어-전달 제제 내에 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 제제는 당업자에게 자명할 것이다. 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단, 예컨대 리포솜 담체, 생분해성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사제를 제제화하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 제약 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 마이크로입자의 제어 방출을 기재하는 국제 공개 번호 WO 93/15722, 및 마이크로구체/마이크로입자 제조 및 용도를 논의하고 있는 문헌 [Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327 및 Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18] 참조).

지속-방출 제제의 추가의 예는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐을 포함한다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919 및 유럽 특허 번호 0 058 481), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌 [Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56]), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (문헌 [Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105]), 에틸렌 비닐 아세테이트 (상기 문헌 [Langer et al.]) 또는 폴리-D-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 번호 0 133 988)을 포함할 수 있다. 지속-방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조할 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92]; 및 유럽 특허 번호 0 036 676, 0 088 046 및 0 143 949를 참조한다.

생체내 투여를 위해 사용될 수 있는 본 발명의 제약 조성물은 전형적으로 멸균상태여야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 조성물이 동결건조될 경우, 이 방법을 이용한 멸균은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액으로 저장할 수 있다. 또한, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 구비된 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 넣는다.

일단 제약 조성물을 제제화하였으면, 이를 멸균 바이알 내에 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 저장할 수 있다. 이러한 제제는 즉시 사용 가능 형태 또는 투여 전에 재구성을 필요로 하는 형태 (예를 들어 동결건조된 형태)로 저장할 수 있다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 건조된 단백질이 담긴 제1 용기 및 수성 제제가 담긴 제2 용기 둘 다를 각각 포함할 수 있다. 단일 및 다중-챔버의 사전-충전된 시린지 (예컨대 액체 시린지 및 리오시린지)를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

융합 단백질의 투여량 및 그의 투여

치료적으로 사용되는 본 발명의 제약 조성물의 유효량은, 예를 들어 치료 상황 및 목표에 따라 달라질 것이다. 따라서, 당업자라면 치료에 적절한 투여량 수준이 전달되는 분자, 융합 단백질 변이체가 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 체구 (체중, 체표면 또는 기관 크기) 및 상태 (연령 및 전반적 건강)에 따라 부분적으로 달라질 것임을 인식할 것이다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 전형적인 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 수 있다.

투여 빈도는 사용되는 제제 내의 이중 기능 단백질의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 시간 간격을 둔 2회 이상의 용량 (동일한 양의 목적 분자를 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무 영역 내에 해당한다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인할 수 있다.

제약 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따른, 예를 들어 경구; 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통한; 지속 방출 시스템 (이는 또한 주사될 수 있음)에 의한; 또는 이식 장치에 의한 투여이다. 원하는 경우, 조성물은 볼루스 주사, 또는 주입에 의해 연속적으로, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 조성물은 목적 분자가 그 위에 흡수되거나 캡슐화된 막, 스폰지, 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관 내로 이식될 수 있고, 목적 분자의 전달은 확산, 지연-방출형 볼루스, 또는 연속 투여를 통해 이루어질 수 있다.

융합 단백질의 치료 용도

본 발명의 단백질은 대사 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 질환, 장애 또는 상태의 치료, 진단, 개선 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 치료되는 대사 장애는 당뇨병, 예를 들어 제2형 당뇨병이다. 또 다른 실시양태에서, 대사 장애는 비만이다. 다른 실시양태는 제1형 당뇨병, 췌장염, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 급성 심근경색, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 위마비 및 다른 대사 장애와 같은 대사 상태 또는 장애를 포함한다.

적용 시, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 비만과 같은 장애 또는 상태는 본원에 기재된 바와 같은 FGF21 단백질 변이체를 그를 필요로 하는 환자에게 치료 유효 용량의 양으로 투여함으로써 치료될 수 있다. 투여는 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 IV 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 또는 정제 또는 액체 형성 형태로 경구로 수행할 수 있다. 대부분의 상황에서, 목적 투여량은 본원에 기재된 바와 같이 임상의가 결정할 수 있고, FGF21 돌연변이체 폴리펩티드의 치료 유효 용량을 나타낼 수 있다. FGF21 돌연변이체 폴리펩티드의 치료 유효 용량이 특히 투여 계획, 투여되는 항원의 단위 용량, 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 다른 치료제와 조합되어 투여되는지의 여부, 수용자의 면역 상태 및 건강에 따라 달라질 것임은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효 용량"은 연구원, 의사, 또는 다른 임상의가 조사하는 조직계, 동물 또는 인간에서 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 포함하는 생물학적 또는 의약 반응을 유도하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩티드의 양을 의미한다.

지금까지 본 발명을 상세하게 기재하였고, 이는 설명의 목적으로만 본원에 포함되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조로 더욱 명확하게 이해될 것이다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내의 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); 및 Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]을 참조한다.

실시예

실시예 1: FGF21 변이체 단백질의 제조

FGF21 V76에 대한 발현 구축물: FGF21 변이체를 문헌 [Achmuller et al. (2007) (Nature Methods 4:1037-1043)]에 기재된 바와 같은 변형된 이. 콜라이 발현 벡터 pET30a 내로 클로닝하여, FGF21의 N-말단 (aa 33-209)에서 헥사-히스티딘 태그에 이어 N^pro-EDDIE 태그에 대한 인-프레임 융합체를 생성하였다.

FGF21 V76의 발현 및 정제: pET30a-His-N^pro-EDDIE-FGF21 발현 플라스미드를 이. 콜라이 BL21 Star (DE3) 적격 세포 (인비트로젠(Invitrogen)) 내로 형질전환시켰다. 37℃의 50 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 50 mL의 테리픽 브로쓰(Terrific Broth) (TB) 내에서 새로이 형질전환된 세포의 단일 콜로니로부터 밤새 성장을 수행하였다. 예비-배양물을 카나마이신을 함유하는 1 L의 TB 배지 내로 옮기고, 250 rpm에서 진탕하면서 37℃의 배플 플라스크 내에서 배양하였다. 6시간의 배양 후에, 최종 농도 1 mM의 IPTG의 첨가에 의해 FGF21의 발현을 유도하고, 배양물을 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이어서 세포를 수확하고, 50 mL의 빙냉 용해 완충제; 50 mM 트리스-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 내에 재현탁시킨 후, 마이크로플루이다이저(microfluidizer)™를 사용하여 용해시켰다.

봉입체 (IB)를 4℃에서 1시간 동안 30,000 x g에서 원심분리에 의해 침전시켰다. IB를 50 mM 트리스-HCl, pH 8, 150 mM NaCl로 세척한 다음, 30mL의 용해 완충제; 10 mM 트리스-HCl, pH 8, 100 mM NaH₂PO₄, 6M GnHCl 내에 용해시켰다. 용해된 IB를 25℃에서 1시간 동안 30,000 x g에서 원심분리에 의해 정화하였다. IB 용액을 용해 완충제로 평형화시킨 Ni-NTA 고성능 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare))의 5 mL 칼럼 상에 로딩하였다. pH를 4.5로 감소시킴으로써 수지에 결합된 단백질을 용리시켰다. 용출액을 pH를 조정하고 20 mM의 농도의 디티오트레이톨 (DTT)을 첨가함으로써 조건화시켰다. 조건화된 용출액을 1L의 재폴딩 완충제; 50 mM 트리스-HCl, pH 8, 0.5 M 아르기닌, 20 mM DTT 내로 서서히 희석한 후, 4℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 희석한 샘플을 농축하고, 한외여과 방법을 이용하여 20 mM 트리스-HCl, pH 9 내로 완충제-교환하였다. 농축된 샘플을 20 mM 트리-HCl (pH 9)로 평형화시킨 Q 세파로스 패스트 플로우(Q sepharose fast flow) 수지 (지이 헬쓰케어)의 10 mL 칼럼 상에 로딩하였다.

수지를 평형 완충제로 세척한 후에, 수지에 결합된 단백질을 20 mM 트리스-HCl, pH 9, 500 mM NaCl로 용리시켰다. 용출액을 20 mM 트리스, pH 8.0, 50 mM 이미다졸로 평형화시킨 Ni-NTA 고성능 수지의 5 mL 칼럼 상에 로딩하고, FGF21을 함유하는 관통액 분획을 수집하여, 재폴딩된 FGF21 단백질로부터 절단된 His-N^pro 융합 단편 및 임의의 비절단된 융합 단백질을 제거하였다. FGF21 분획을 10 mM 트리스, pH 8, 50 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂로 평형화시킨 엔도트랩(EndoTrap) HD 수지 (하이글로스(Hyglos))로 처리하여 내독소 수준을 감소시켰다. 저-내독소 샘플을 PBS에 대해 투석한 후, 0.22 μm 필터로 멸균하였다. 정제된 FGF21 단백질을 액체 질소 내에서 급속-동결시키고, -80℃에서 저장하였다. 단백질 농도를 FGF21에 대한 몰 흡광 계수로서 9362 M-1 cm-1을 이용한 280nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다. 단백질 순도 및 통합성을 HPLC, SDS-PAGE 및 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법에 의해 결정하였다.

FGF21 변이체의 시스테인 PEG화: FGF21 변이체 V76 (R154C)은 조작된 시스테인을 통해 이량체화하는 경향을 갖기 때문에; 이에 따라, PEG화 전에 단백질 용액 (전형적으로 트리스 완충제 내 5 mg/ml)을 얼음 상에서 30분 동안 5 mM 메르캅토에틸아민으로 온화하게 환원시키고, 20 mM 트리스, pH 7 내에서 즉시 탈염시켰다. 이어서 새로이 환원시킨 단백질 (전형적으로 3 mg/ml)을 얼음 상에서 3시간 동안 1.5 당량의 40 kDa 분지형 말레이미도-PEG 시약 (NOF, 선브라이트(Sunbright) 시리즈로부터 카탈로그 # GL2-400MA)을 사용하여 즉시 PEG화하였다. PEG화된 단백질을 약 25%의 총 수율로 음이온 교환 크로마토그래피 (모노큐(MonoQ))에 의해 최종적으로 정제하였다.

Fc-FGF21 융합 변이체에 대한 발현 구축물: 인간 FGF21 변이체 코딩 아미노산 33-209에 대한 cDNA를, 단백질의 분비를 지시하는 리더 펩티드 (이뮤노글로불린 카파-쇄)에 이어서 Fc 도메인 및 더 짧은 링커를 포함하는 N-말단 서열과 함께 인-프레임으로 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 포유동물 발현 벡터 하류에 클로닝하였다.

Fc-FGF21 변이체의 발현 및 정제: Fc-FGF21 변이체 단백질을 HEK293T 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)) 내에 발현시켰다. 세포를 형질감염시키는 날까지 프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지 (인비트로젠, 카탈로그 #12338-018) 내 37℃, 8% CO₂에서 현탁 배양으로 성장시켰다. 세포를 요동치는 버킷 로터 내에서 7분 동안 1000xg에서 원심분리하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 계수하였다. 세포를 900 mL의 프리스타일 293 배지 내에서 최종 농도 1.4x10⁶개 세포/mL의 농도로 희석하고, 3 L 비-배플 플라스크 (코닝(Corning), 카탈로그 #431252) 내에 넣었다. 세포를 하기와 같은 폴리에틸렌이민 (PEI) 및 플라스미드의 혼합물을 사용하여 형질감염시켰다. 멸균 1 mg/ml 스톡의 선형, M.W.25,000, PEI (알파 에이사(Alfa Aesar), 카탈로그 #43896) 3 mL를 50 mL의 프리스타일 293 배지에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 5분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 이와 동시에, 1 mg의 내독소-무함유 플라스미드를 50 mL 프리스타일 293 배지에 첨가하고, 0.22 uM 필터를 사용하여 멸균 여과하였다. 이어서 PEI 혼합물을 멸균 여과된 DNA에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 10분 동안 25℃에서 인큐베이션되도록 하였다. 이어서 PEI-플라스미드 혼합물을 희석된 HEK 293T 세포를 함유하는 3 L 플라스크에 첨가하고, 125 RPM, 37℃, 8% CO₂의 진탕 인큐베이터에 넣었다.

형질감염 후 제6일에, 세포를 10분 동안 2000xg에서 원심분리하여 상청액을 수확하였다. 상청액을 0.8/0.2 uM 필터 (팰 코포레이션(Pall Corporation), 카탈로그 #4628)을 통한 여과에 의해 추가로 정제하였다.

FGF21 단백질의 배치 정제를, 정제될 것으로 예상되는 단백질 20 mg당 1mL의 재조합 단백질 A 세파로스 패스트 플로우 (GE, 카탈로그 #17-5138-03)를 정화된 상청액에 직접 첨가하고, 부드럽게 회전시키면서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 행하였다. 이어서 상청액 혼합물을 일회용 폴리-정제용 크로마토그래피 칼럼 (바이오-래드(Bio-Rad), 카탈로그 #731-1550) 상에 붓고, 관통액을 폐기하였다. 잔류 비드를 5 칼럼 부피의 DPBS, pH 7.4 (인비트로젠, 카탈로그 #14190-144)로 세척하였다. 단백질 A 비드로부터의 단백질의 용리를 20 칼럼 부피의 50 mM 시트르산나트륨 완충제, pH 3.0을 첨가함으로써 행하였다. 용리 완충제를 20% 트리스-HCL 완충제, pH 9.0의 첨가에 의해 중화하였다. 하이 로드 26/600 슈퍼덱스(High Load 26/600 Superdex) 200pg 칼럼 (GE, 카탈로그 #28-9893-36) 상에 단백질 A 배치 정제 물질을 유동시킴으로써 크기 배제 크로마토그래피를 2차 폴리싱 단계로서 수행하였다. 정제된 단백질 수율을 A280에 의해 정량화하였다. SDS-Page를 실행하여 순도 및 분자량을 검증하였다. 내독소 수준을 엔도세이프 PTS 시스템 (찰스 리버 랩스)(Endosafe PTS system (Charles River Labs))을 사용하여 정량화하였다.

실시예 2: FGF21 의존성 2-데옥시글루코스 (2-DOG) 흡수의 측정

FGF21은 인슐린의 존재 및 부재 하에 마우스 3T3-L1 지방세포에서 글루코스-흡수를 자극하고, 용량-의존성 방식으로 ob/ob 및 db/db 마우스 및 8주령 ZDF 래트에서 식후 및 공복 혈액 글루코스, 트리글리세리드, 및 글루카곤 수준을 감소시키는 것으로 나타나 있고, 따라서, 당뇨 및 비만을 치료하기 위한 요법으로서의 FGF21의 용도에 대한 기초를 제공한다 (예를 들어 특허 공개공보 WO03/011213 및 문헌 [Kharitonenkov et al., (2005) Jour. of Clinical Invest. 115:1627-1635] 참조). 또한, FGF21은 3T3-L1 지방세포에서 FGFR-1 및 FGFR-2의 티로신 인산화를 자극하는 것으로 관찰되었다.

3T3-L1 섬유모세포를 ATCC (카탈로그 # CL173)로부터 구입하였다. 세포를 150 cm 페트리-디쉬에서 전면생장률까지 성장시켰고, 추가의 4일 동안 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 고 글루코스를 갖는 DMEM (인비트로젠, 카탈로그 # 11995065) 내에서 유지하였다. 이어서 세포를 3일 동안 4 μg/mL 인슐린 (시그마(Sigma), 카탈로그 # I-5500), 115 μg/mL IBMX (시그마, 카탈로그 # I5879) 및 0.0975 μg/mL 덱사메타손 (시그마, 카탈로그 #D1756)으로 보충된 상기 배지 내에서 분화시킨 후에, 분화 배지를 완전 DMEM으로 교체하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포의 플레이트 하나를 배지 교체 다음날 4개의 96-웰 플레이트 내에 시딩하였다.

이어서 지방세포를 완전 배지 내에서 FGF21-WT 및 FGF21 변이체 단백질 (변이체 목록은 표 2를 참조하고; 30 pM 내지 100 nM의 전형적 농도 범위를 사용함)로 밤새 처리하였다. FGF21 샘플로 처리한 지방세포를 2시간 동안 50 μL/웰의 KRH 완충제 (0.75% NaCl; 0.038% KCl; 0.0196% CaCl₂; 0.032% MgSO₄; 0.025M HEPES, pH 7.5; 0.5% BSA; 2 mM 피루브산나트륨) 내에서 혈청을 고갈시켰다. 블랭크를 위한 웰에 15분 동안 1 μL (최종 농도 5 μg/ml) 시토칼라신 B를 첨가하였다. [3H]-2-DOG (20.6 mCi/mmol, 1 mCi/ml)를 5.1 mM의 차가운 2-DOG 내에 1:20 희석하고, 1 μL의 희석된 2-DOG를 웰마다 첨가하고, 세포를 5분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 100 μL/웰의 KRH 완충제로 3회 세척하였다. 40 μL/웰의 1% SDS를 세포에 첨가하고, 세포를 10분 이상 동안 진탕하였다. 200 μL/웰 섬광 유체를 첨가하고, 플레이트를 밤새 진탕하고, 베타-마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다. 시토칼라신 B로 처리한 전체 행/열로부터 얻은 값을 평균을 내고, 다른 모든 값으로부터 뺐다. 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어에 의해 분석하였고, 그 결과는 표 2에 요약하였다. Fc-FGF21 융합 변이체 V101, V103 및 V188은 마우스 3T3L1 지방세포에 의한 2-데옥시글루코스 흡수의 유도에 대해 PEG화 FGF21 변이체 V76보다 우수하였다.

실시예 3: pERK 인 셀 웨스턴(In Cell Western) (ICW) 검정.

인간 β-클로토로 안정하게 형질감염된 HEK293 세포를 DMEM 고 글루코스, 10% FBS, 1% PS 및 600 ng/ml G418 내에서 배양하고, 폴리-D-리신 코팅된 96-웰 플레이트 (비디 바이오사이언스(BD bioscience), 카탈로그 #356640) 내에 30,000개 세포/웰로 밤새 시딩하였다. 세포를 4시간 동안 DMEM 고 글루코스, 0.5% BSA 및 10 mM HEPES 내에서 혈청을 고갈시켰다. WT FGF21 및 FGF21 변이체 (변이체 목록은 표 3을 참조)를 고갈 배지 내에서 다양한 농도 (100 pM 내지 300 nM의 전형적 농도 범위를 사용함)로 희석하였다. 세포를 FGF21로 10분 동안 자극하였다. FGF21 또는 FGF21 변이체 단백질 자극 후에, 배지를 웰로부터 흡인시키고, 세포를 100 μL의 차가운 PBS로 1회 세척한 다음, 100 μl의 4% 포름알데히드로 15분 동안 실온에서 고정시킨 후, 100 μL 빙냉 메탄올과 함께 추가로 10분 인큐베이션하였다.

고정 후에, 세포를 각각 5 분씩 PBS 내의 0.3% 트리톤 X-100으로 4회 세척하였다. 150 μL 오디세이(Odyssey) 차단 완충제를 1.5시간 동안 실온에서 투과된 세포에 첨가하였다. 포스포-ERK (pERK) 항체를 0.17 μg/ml의 농도 (1:200 희석 또는 제시된 희석)로 희석하고, 총-ERK (tERK) 항체를 오디세이 차단 완충제 내에서 2.2 μg/ml의 농도 (1:200 희석 또는 제시된 희석)로 희석하였다. 50 μL를 배경에 대해 표준화하기 위해 2차 항체로만 처리한 하나의 칼럼을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 젖은 종이 타월 및 뚜껑으로 덮고, 증발을 막은 다음, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

이후에, 1차 항체를 흡인시키고, 세포를 각각 5분 동안 PBS 내의 0.3% 트윈(Tween) 20으로 4회 세척하였다. 세척하는 동안, 2차 항체 반응 혼합물을 1:1000-희석 (또는 제시된 희석) 염소 항-마우스 알렉사(Alexa) 680 및 1:1000-희석 (또는 제시된 희석) 아이알다이(IRDye)800 염소 항-토끼 항체를 함유하는 오디세이 차단 완충제 내에서 제조하였다. 세척이 완료되면, 40 μL의 반응 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 2차 항체를 차광하기 위해 플레이트를 흑색 뚜껑으로 덮고, 플레이트를 진탕기 상에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 최종적으로, 세포를 다시 각각 5분 동안 PBS 내의 0.3% 트윈 20으로 4회 세척한 후, 리-코르 바이오사이언스(LI-COR Bioscience) 오디세이 적외선 영상화 시스템 (미국 네브라스카주 링컨 소재의 리-코르 바이오사이언시스) 상에서 700 nm (적색) 및 800 nm (녹색) 채널로 스캐닝하였다. 알렉사 680은 tERK를 근적외선 형광 (방출 파장 668nm)으로 염색시키는 반면, 아이알다이800은 pERK를 녹색 형광 (방출 파장 800nm)으로 염색시켰다. 형광 배경을 제거하기 위해 2차 항체로만 처리한 전체 행/열로부터 얻어진 값을 평균을 내고, 플레이트로부터 얻어진 다른 모든 값으로부터 뺐다. 각각의 웰 내의 pERK에 대한 값을 tERK의 값으로 나누어 각각의 샘플 내에 존재하는 pERK의 양을 표준화하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어에 의해 분석하였고, 그 결과는 표 2에 요약하였다. 이 ERK 인산화 검정에서 Fc-FGF21 융합 변이체 V101, V103 및 V188은 PEG화 FGF21 변이체 V76보다 우수하였다.

표 2: ERK 인 셀 웨스턴 및 마우스 3T3L1 지방세포 글루코스 흡수 검정 결과의 개요

실시예 4: FGF21 변이체의 생체내 시험

ob/ob 마우스는 제2형 당뇨병에 대한 마우스 모델이다. 마우스는 기능성 렙틴이 결핍되고, 고혈당증, 인슐린 저항성, 과식증, 간 지방증 및 비만을 특징으로 한다. 수컷 ob/ob 마우스 (10-13주령)를 하기 PEG화 FGF21 변이체 V76 및 Fc-FGF21 융합 변이체 V101, V103 및 V188의 혈액 글루코스에 대한 효과를 측정하는데 사용하였다.

FGF21 변이체 또는 PBS 비히클을 주당 2회 12일 (총 4회 용량) 1 mg/kg (V101, V103 및 V188)으로 피하 또는 5 mg/kg V76으로 피하 투여하였다. 연구의 제1일에, 꼬리 혈액 글루코스 및 체중을 측정하고, 마우스를 군 사이에 평균 글루코스 및 체중이 일치하는 상이한 군 (군당 n=8)으로 배분하였다. 혈액 글루코스는 혈당측정기 (원터치(OneTouch))를 사용하여 측정하였다. 혈장 인슐린은 투여 전 제1일, 및 제12일, 마지막 투여 24시간 후에 측정하였다. 이들 연구의 결과는 표 5에 요약하였다.

이들 연구의 결과는 표 3 및 도 1-3에 요약하였다. Fc-FGF21 융합 변이체 V101, V103 및 V188은 이들 연구에서 측정한 모든 종점 및 5배 더 낮은 용량에서 PEG화 FGF21 변이체 V76보다 우수하였다.

표 3. ob/ob 마우스에서의 12일 연구 동안의 FGF21 변이체에 의한 혈장 글루코스, 인슐린, 체중 (BW) 증가, 간 TG/지질에서의 비히클에 대한 변화%.

실시예 5: 마우스에서의 FGF21 융합 변이체의 약동학

C57BL/6J 마우스에 1 mg/kg 시험 물질을 IV 주사하고, 16일 (384시간)에 걸친 다양한 시점에 채혈하여 Fc-FGF21 융합 변이체 V101, V103 및 V188의 약동학적 프로파일을 결정하였다. 혈액 샘플은 악하 및 안와정맥총으로부터 EDTA-코팅 마이크로테이너 튜브 내에 수집하였다. 각 시점에 대략 50 μL의 혈액을 수집하여 ~25 μL의 혈장을 얻었다.

384-웰 플레이트를 2 μg/mL의 항-인간 Fc-감마 염소 폴리클로날 항체 (30 μL/웰)로 실온에서 밤새 코팅하고, 이어서 2시간 동안 실온에서 카세인-기재 희석제 (100 μL/웰)에 의해 차단하여, ELISA에 의해 시험 물질의 혈장 농도를 측정하였다. 희석된 샘플, 표준물 및 대조군을 플레이트에 첨가하고 (30 μL/웰), 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 제거한 후, 웰을 포스페이트-기재 세척액 (100 μL/웰)으로 3회 세척하였다. 포획 항체의 HRP-표지 버전인 검출 항체를 플레이트에 첨가하고 (30 μL/웰), 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 포스페이트-기재 세척 용액 (100 μL/웰)으로 다시 3회 세척한 후, 화학발광 기질을 첨가하고 (30 μL/웰), 플레이트 발광을 적절한 플레이트 판독기를 사용하여 5분 내에 판독하였다. 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, Fc-FGF21 융합 변이체는 당업계에 공지된 Fc-FGF21 융합체 (도 4a) 및 PEG화 FGF21 변이체 V76 (도 4b)에 비해 훨씬 연장된 혈장 반감기를 가졌다.

Fc-FGF21 시험 물질의 혈청 수준을 ELISA에 의해 측정한 수준과 비교를 위해 웨스턴 블롯에 의해 입증하여 Fc 단독이 아닌 전장 Fc-FGF21 변이체가 ELISA에서 검출되었음을 확실히 하였다. 2 uL의 마우스 혈청을 2.5 uL의 4X 로딩 완충제, 1 uL의 10X 변성제 및 4 uL의 dH₂O와 배합하고, 5분 동안 95℃로 가열하고, 4-12% 구배 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 100 볼트 (일정한 전압)에서 1시간 동안 전기영동하였다. 샘플을 아이블롯 시스템 (인비트로젠 카탈로그 # IB1001, 7분의 실행 시간)을 사용한 웨스턴 블롯에 의해 니트로셀룰로스 여과지로 옮겼다. 니트로셀룰로스 필터를 30 mL의 록크랜드(Rockland) 차단 용액 (카탈로그 #MB-070)으로 차단하고, 1:2000 희석한 염소 항-FGF21 1차 항체 (알앤디 시스템즈(R&D systems), 카탈로그 # BAF2539) 및 1:10000 희석한 2차로서의 형광 표지 스트렙타비딘 (리코르(Licor), 카탈로그 # 926-68031)으로 스냅 아이블롯 시스템 프로토콜에 따라 프로브 조사하였다. 단백질 수준을 리코르 오디세이 시스템 상 700 nm에서 영상화하고, 동일한 겔 상에서 실행된 2 nM 대조군 V101과 비교하였다. 도 4c에 나타낸 바와 같이, 전장 Fc-FGF21 변이체 V101, V103 및 V188은 약동학 연구에서 마우스 혈청으로부터의 15일에 걸친 항-FGF21 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 이용하여 검출가능하였다.

실시예 6: Fc-FGF21 융합 변이체 V101, V103 및 V188은 열역학적으로 매우 안정하다

단백질은 특정 온도 범위에서 언폴딩될 수 있다. 단백질 언폴딩의 온도는 단백질의 열 안정성을 설명하기 위한 고유 파라미터이다. 시차 주사 열량측정법 (DSC)이 단백질의 비폴딩 온도를 검출하는데 사용된다. 이 특징적 온도는 용융 온도 (Tm)로 기재되며, 이는 단백질 언폴딩 동안의 피크 온도이다.

원래의 단백질 샘플을 0.5 ml의 전체 부피를 위해 ~1 mg/ml (0.5 mg/ml 내지 1.2 mg/ml)의 농도로 PBS 내에서 희석하였다. 희석된 단백질 샘플의 0.4 ml/웰 분취액, 표준물, PBS 및 탈이온수를 DSC 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 밀봉에 의해 덮었다. 샘플을 마이크로칼.(MicroCal.)로부터의 96 웰 시차 주사 열량계 내에서 분석하였다. 온도를 1도/분의 속도로 10 내지 110℃에서 스캔하였다.

도 4d에 나타낸 바와 같이 FGF21 변이체 V101, V103 및 V188의 용융 온도는 매우 높았다. 이는 FGF21 변이체 V76 및 야생형 FGF21의 더 낮은 용융 온도 (나타내지 않음)와 대조적이다. 본 발명자들은 V101, V103 및 V188의 개선된 안정성을 신규한 Q55C 및 G148C 돌연변이로부터의 제2 디술피드 결합의 특이적 부가의 결과로 보았다. 이 유형의 열역학적 안정성은 단백질분해로부터 단백질을 보호하는 것으로 공지되어 있고, 또한 도 4b 및 4c의 데이터에 의해 예시된 유의하게 연장된 생체내 안정성 및 개선된 약동학적 프로파일로 해석될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Boettcher, Brian Daniels, Doug Caplan, Shari Hamamatsu, Norio Weldon, Stephen Licht, Stuart <120> FUSION PROTEINS FOR TREATING METABOLIC DISORDERS <130> PAT054783 <150> 61/539280 <151> 2011-09-26 <160> 13 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 2 <211> 940 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgtcagctg aggatccagc cgaaagagga gccaggcact caggccacct gagtctactc 60 acctggacaa ctggaatctg gcaccaattc taaaccactc agcttctccg agctcacacc 120 ccggagatca cctgaggacc cgagccattg atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac 180 tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc 240 atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 300 acagatgatg cccagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg 360 ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt 420 attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 480 tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 540 ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag 600 tccccacacc gggaccctgc accccgagga ccagctcgct tcctgccact accaggcctg 660 ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc 720 tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga 780 agccagaggc tgtttactat gacatctcct ctttatttat taggttattt atcttattta 840 tttttttatt tttcttactt gagataataa agagttccag aggagaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 940 <210> 3 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 4 <211> 546 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 60 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 120 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 180 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 240 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 300 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 360 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 420 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 480 ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 540 tcctga 546 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala 20 25 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggggsggggs ggggs 15 <210> 7 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 225 230 235 240 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 245 250 255 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 260 265 270 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 275 280 285 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 290 295 300 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 305 310 315 320 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 325 330 335 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 340 345 350 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 370 375 380 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 385 390 395 400 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 405 <210> 8 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 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His Gly Leu 340 345 350 Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro 355 360 365 Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu 370 375 380 Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser 385 390 395 400 Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser 405 410 415 Tyr Ala Ser <210> 9 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 1 5 10 15 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 20 25 30 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gln Ser Pro Glu Ser Leu 35 40 45 Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 50 55 60 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 85 90 95 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 100 105 110 His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Pro Gln Gly 115 120 125 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 130 135 140 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 145 150 155 160 Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 165 170 175 Ser <210> 10 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 225 230 235 240 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gln Thr Glu Ala 245 250 255 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 260 265 270 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 275 280 285 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 290 295 300 Gly Thr Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 305 310 315 320 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 325 330 335 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp 340 345 350 Pro Ala Ser Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 370 375 380 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ala Met Val Gly Gly Ser Gln Ala Arg 385 390 395 400 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 405 <210> 11 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 225 230 235 240 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gln Thr Glu Ala 245 250 255 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 260 265 270 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 275 280 285 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Lys Pro Asp 290 295 300 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 305 310 315 320 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 325 330 335 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp 340 345 350 Pro Ala Ser Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 370 375 380 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ala Met Val Gly Gly Ser Gln Ala Arg 385 390 395 400 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 405 <210> 12 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln 245 250 255 Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gln Thr Glu Ala His Leu Glu 260 265 270 Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu 275 280 285 Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu 290 295 300 Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Lys Pro Asp Gly Ala Leu 305 310 315 320 Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu 325 330 335 Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu 340 345 350 Pro Leu His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser 355 360 365 Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu 370 375 380 Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser 385 390 395 400 Ser Asp Pro Leu Ala Met Val Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ser Pro Ser 405 410 415 Tyr Ala Ser <210> 13 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val 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Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser 355 360 365 Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu 370 375 380 Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser 385 390 395 400 Ser Asp Pro Leu Ala Met Val Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ser Pro Ser 405 410 415 Tyr Ala Ser

Claims

FGF21 변이체 및 Fc 영역을 포함하고, 여기서 FGF21 변이체는 전장 hFGF21 서열인 서열 1에 대해 Q55C, R105K, G148C, K150R, P158S, S195A, P199G 및 G202A의 돌연변이를 포함하는 것인 융합 단백질.
FGF21 변이체 및 Fc 영역을 포함하고, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
제1항에 있어서, FGF21 변이체가 GS 링커에 의해 상기 Fc 영역에 융합되는 것인 융합 단백질.
제1항에 있어서, Fc 영역이 LALA 돌연변이를 갖는 변형된 Fc 단편인 융합 단백질.
제1항에 있어서, 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
제1항에 있어서, Fc 영역이 링커를 통해 FGF21 변이체에 연결되는 것인 융합 단백질.
제6항에 있어서, 링커가 1 내지 20개의 아미노산 길이인 융합 단백질.
제6항 또는 제7항에 있어서, 링커가 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 것인 융합 단백질.
제1항, 제3항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질의 Fc 영역이 변형된 Fc 단편인 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 환자에서 혈액 글루코스 저하, 인슐린 수준 저하, 트리글리세리드 수준 저하, 콜레스테롤 수준 저하, 간 지질 수준 감소, 간 트리글리세리드 수준 감소, 체중 감소, 글루코스 내성 개선 및 인슐린 감수성 개선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물학적 활성을 달성하는데 사용하기 위한 제약 조성물.
제10항에 있어서, 상기 환자가 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 당뇨병 합병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH) 및 다른 대사 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장애를 앓고 있는 것인 제약 조성물.
제11항에 있어서, 상기 장애가 비만, 제2형 당뇨병, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH) 또는 고혈당증인 제약 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는
제13항의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 숙주 세포.
제15항의 숙주 세포를 사용하여 융합 단백질을 발현시키는 것을 포함하는, 융합 단백질을 생산하는 방법.
제16항에 있어서, 융합 단백질을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한에 따른 융합 단백질을 포함하는, 환자에서 대사 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 제약 조성물.
제18항에 있어서, 대사 장애가 비만, 당뇨병, 이상지혈증, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 비알콜성 지방간염 (NASH) 또는 고혈당증인 제약 조성물.
제19항에 있어서, 대사 장애가 제2형 당뇨병인 제약 조성물.
제19항에 있어서, 대사 장애가 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD)인 제약 조성물.
제19항에 있어서, 대사 장애가 비알콜성 지방간염 (NASH)인 제약 조성물.
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