BR112014007069B1

BR112014007069B1 - Proteínas de fusão para o tratamento de distúrbios metabólicos

Info

Publication number: BR112014007069B1
Application number: BR112014007069-5A
Authority: BR
Inventors: Brian R. Boettcher; Shari L. Caplan; Douglas S. Daniels; Norio Hamamatsu; Stuart Licht; Stephen Craig Weldon
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2020-12-15
Also published as: JO3476B1; WO2013049247A1; EP3321276A2; CN107266579B; JP2018023370A; EP2760475A1; PL2760475T3; TN2014000109A1; AR088044A1; ES2895080T3; RS62341B1; MA35437B1; BR112014007069A2; PE20181159A1; IL231533B; MX350273B; CU24314B1; JP2022058546A; HK1251238A1; CN103945871B

Abstract

proteínas de fusão para o tratamento de distúrbios metabólicos. a invenção refere-se à identificação de proteínas de fusão que compreendem variantes polipeptídicas e proteicas do fator de crescimento de fibroblastos 21 (fgf21) com propriedades farmacêuticas melhoradas. adicionalmente, são descritos métodos para tratar distúrbios associados ao fgf21, inclusive condições metabólicas.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se a novas proteínas de fusão que compreendem o fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21), conhecidas por melhorar os perfis metabólicos em pacientes a quem são administradas.

Antecedentes da invenção

[0002] A família do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) é caracterizada por 22 ligantes homólogos geneticamente distintos que são agrupados em sete subfamílias. FGF-21 está mais estreitamente relacionado e forma uma subfamília com FGF-19 e FGF-23. Esta sub- família de FGF regula diversos processos fisiológicos incomuns aos FGFs clássicos, a saber, homeostase energética e dos ácidos biliares, metabolismo da glicose e de lipídios e homeostase do fosfato, bem como da vitamina D. Além do mais, diferentemente de outros FGFs, esta subfamília atua de modo endócrino (Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8; Beenken et al. (2009) Nature Reviews Drug Discovery 8, 235).

[0003] O FGF21 é um polipeptídeo de 209 aminoácidos contend uma sequência líder formada por 28 aminoácidos (SEQ ID NO:5). O FGF21 humano possui aproximadamente 79% de identidade de ami- noácidos com o FGF21 do camundongo e aproximadamente 80% de identidade de aminoácidos com o FGF21 do rato. O fator de crescimento dos fibroblastos 21 (FGF21) foi descrito como um tratamento para doença vascular isquêmica, cicatrização de feridas e doenças associadas com perda da função pulmonar, de brônquios ou de células alveolares (Nishimura et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206; Publicação de Patente WO01/36640; e Publicação de Patente WO01/18172). Embora o FGF-21 ative receptores de FGF e moléculas de sinalização downstream (a jusante), incluindo FRS2a e ERK, a interação direta de FGFRs e FGF-21 não foi detectada. Estudos identificaram β-klotho, com alta expressão no fígado, em adipóci- tos e no pâncreas, como um determinante da resposta celular ao FGF- 21 e como um cofator na mediação da sinalização de FGF-21 por intermédio de FGFRs (Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 2668795). FGF21 é um agonista potente dos complexos de sinalização FGFR1 (IlIc), FGFR2(lllc) e FGFR3(lllc)-β-klotho.

[0004] O FGF-21 mostrou induzir a captação de glucose indepen dente da insulina. Além disso, mostrou também atenuar a hiperglice- mia em uma variedade de modelos de roedores diabéticos. Adicionalmente, camundongos transgênicos com superexpressão do FGF-21 demonstraram que são resistentes a anormalidades metabólicas induzidas por dieta, além de demonstrarem redução do peso corporal e da massa de gordura e melhoria da sensibilidade à insulina (Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37). A administração de FGF-21 a primatas não humanos diabéticos provocou um declínio na glicose plasmática em jejum, em níveis de triglicerídeos, de insulina e de glucagon e levou à melhoria dos perfis de lipoproteínas, inclusive um au-mento de quase 80% no colesterol-HDL (Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774- 81). Estudos recentes investigando os mecanismos de ação em nível molecular do FGF21 identificaram o FGF21 como um importante hormônio endócrino que ajudar a controlar a adaptação para o estado de jejum (Badman et al. (2009) Endocrinology 150, 4931; lnagaki et al. (2007) Cell Metabolism 5, 415). Isso fornece um vínculo downstream previamente despercebido de PPARa, pelo qual o fígado comunica-se com o resto do corpo para regular a biologia da homeostase energética (Galman et al. (2008) Cell Metabolism 8, 169; Lundasen et al. (2007) Biochemical and Biophysical Rese- arch Communications 360, 437).

[0005] O FGF21 regula a homeostase dos adipócitos através da ativação de uma via AMPK/SIRT1/PGC1α que inibe a expressão de PPARy e aumenta a função mitocondriana (Chau et al. (2010) PNAS 107, 12553). O FGF21 também aumenta a captação de glicose pelo músculo esquelético, conforme medida em miotubos humanos cultivados e tecido isolado de camundongo. O tratamento com FGF21 de células das ilhotas de roedores leva à função melhorada e sobrevida pela ativação das vias ERK1/2 e Akt (Wente et al. (2006) Diabetes 55, 2470). O tratamento com FGF21 também resulta em expressão gênica alterada para lipogênese e de enzimas responsáveis pela oxidação de ácidos graxos em fígados de roedores, provavelmente através da sinalização de HNF4α e Foxa2.

[0006] Uma dificuldade associada ao uso do FGF-21 diretamente como agente bioterapêutico é que sua meia-vida é muito curta (Khari- tonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:16271635) Em camundongos, a meia-vida do FGF21 humano é de 0,5 até 1 hora e, em macacos Cynomolgus, a meia-vida é de 2 a 3 horas. O FGF21 pode ser utilizado em uma formulação farmacêutica estéril de multiuso. Contudo, um efeito adverso de conservantes, ou seja, m- cresol sobre a sua estabilidade foi determinado nessas condições.

[0007] No desenvolvimento de uma proteína FGF21 para o uso como agente terapêutico no tratamento de diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2 e de outras condições metabólicas, um aumento na meia-vida e na estabilidade seria desejável. Proteínas FGF21 com meia-vida e estabilidadereforçadas permitiriam a administração menos frequente a pacientes a quem a proteína é administrada. Evidentemente, há necessidade de que fosse desenvolvida uma formulação aquosa estável de proteína para a proteína terapêutica FGF21.

[0008] Além do mais, um desafio considerável no desenvolvimento de FGF21, como proteína farmacêutica, é lidar com suas instabilidadesfísica e química. A variedade da composição e as características de proteínas definem comportamentos específicos como dobramento, estabilidade conformacional e desdobramento/desnaturação. Tais características devem ser abordadas quando se visa estabilizar proteínas ao longo do desenvolvimento de condições para formulações farmacêuticas que utilizam soluções aquosas de proteínas (Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)). Um efeito desejado na estabilização de proteínas terapêuticas de interesse, por exemplo, as proteínas da presente invenção, é aumentar a resistência à proteólise e à degradação enzimática e, dessa forma, melhorar a estabilidade da proteína e reduzir a agregação de proteínas.

Sumário da invenção

[0009] A invenção refere-se à identificação de novas proteínas de fusão que compreendem o fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21) e que apresentam propriedades farmacêuticas melhoradas acima do FGF21 do tipo selvagem e suas variantes em condições de formulação farmacêutica, por exemplo, são mais estáveis, possuem a capacidade para melhorar parâmetros metabólicos de indivíduos aos quais são administradas, são menos suscetíveis à proteólise e à degradação enzimática e são menos propensas a se agregarem e formarem complexos. As proteínas de fusão da invenção compreendem truncamentos, mutações e variantes do FGF21.

[00010] Adicionalmente, são descritos métodos para tratar distúrbios associados ao FGF21, bem como outros distúrbios metabólicos, endócrinos e cardiovasculares, tais como obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteatohepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, infarto agudo do miocárdio, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, doença renal, complicações diabéticas, neuropatia, gastroparesia, distúrbios associados com mutações inativadoras graves no receptor da in-sulina e outros distúrbios metabólicos, e para reduzir a mortalidade e a morbidade de pacientes criticamente enfermos.

[00011] As proteínas de fusão da presente invenção podem ser utilizadas na forma injetável uma vez por semana isoladamente ou combinadas com agentes antidiabéticos orais que melhorarão o controle glicêmico, o peso corporal e o perfil lipídico de pacientes com diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2. As proteínas podem também ser utilizadas para o tratamento de obesidade ou de outras condições associadas ao FGF21.

[00012] As proteínas de fusão da invenção superam os obstáculos significantes de instabilidades físicas associados com proteínas terapêuticas, inclusive, por exemplo, com a administração do FGF21 do tipo selvagem, por apresentar proteínas que são mais estáveis, menos suscetíveis à proteólise e à degradação enzimática e menos propensas a se agregarem e formarem complexos do que o FGF21 do tipo selvagem em condições de formulação farmacêutica.

[00013] Em um primeiro aspecto, a invenção provê proteínas de fusão do Fator de Crescimento de Fibroblastos 21 (FGF21) que compreendem uma ou mais das sequências listadas na Tabela 1 e descritas mais detalhadamente abaixo. As sequências de FGF21 listadas na Tabela 1 podem ser variantes da sequência do FGF21 do tipo selvagem, por exemplo, a sequência do FGF21 do tipo selvagem com número de referência NCBI NP_061986.1, e encontradas em patentes emitidas tais como, por exemplo, US 6 716 626B1, concedida à Chiron Corporation.

[00014] As referidas fusões podem ser, por exemplo, entre as se- quências variantes do FGF21, por exemplo, as sequências da Tabela 1, e outras moléculas (uma parte não FGF21), por exemplo, um domínio constante de IgG ou seu fragmento (por exemplo, a região Fc), albuminasérica humana (HSA) ou polipeptídeos que se ligam à albumina. Em uma concretização preferida, a parte não FGF21 da molécula é uma região Fc.

[00015] Outras concretizações são levadas a polinucleotídeos que codificam as proteínas de fusão da invenção, a um vetor que contém os referidos polinucleotídeos e a uma célula hospedeira que carrega o referido vetor.

[00016] Adicionalmente, a presente invenção provê métodos utilizados para gerar as proteínas de fusão da invenção, em que tais métodos envolvem a modificação da proteína FGF21 do tipo selvagem, por intermédio de, por exemplo, a incorporação sítio-específica de amino- ácidos em posições de interesse dentro da proteína FGF21 do tipo selvagem, bem como a fusão entre a parte de FGF21 da molécula e outras moléculas, por exemplo, um domínio constante de IgG ou seu fragmento (por exemplo, a região Fc), albumina sérica humana (HSA) ou polipeptídeos que se ligam à albumina. As referidas modificações e fusões reforçam as propriedades biológicas das proteínas de fusão da invenção em relação às versões proteicas do tipo selvagem, assim como, em alguns casos, servem como pontos de ligação para, por exemplo, marcações e agentes que ampliam a meia-vida de proteínas e para fins de fixar as referidas variantes à superfície de um suporte sólido. Concretizações relacionadas da invenção são métodos para produzir células capazes de produzir as referidas proteínas da invenção e de produzir vetores contendo o DNA que codifica as referidas variantes e fusões.

[00017] Em várias concretizações, as proteínas de fusão da invenção aqui descritas podem compreender um ou mais fragmentos das sequências do tipo selvagem de FGF21, inclusive fragmentos tão pequenos que contêm apenas 8-12 resíduos de aminoácidos de comprimento, e em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicose sanguínea em um mamífero. Em várias concretizações, as proteínas de fusão da invenção aqui descritas podem compreender uma ou mais variantes das sequências do tipo selvagem de FGF21, por exemplo, com uma ou mais deleções, inserções, adições ou substituições em relação às suas sequências do tipo selvagem.

[00018] Em algumas concretizações, as proteínas de fusão da invenção aqui descritas podem ser ligadas covalentemente a um ou mais polímeros, tais como polietilenoglicol (PEG) ou ácido polisiálico, seja na posição de modificações sítio-específicas de aminoácidos efetuadas em relação ao FGF21 do tipo selvagem, ou na posição de ami- noácidos comumente compartilhados com as versões do tipo selvagem destas proteínas. O grupo PEG é ligado de tal maneira a reforçar e/ou não interferir com a função biológica das partes constituintes das proteínas de fusão da invenção, por exemplo, as variantes da proteína FGF21. Em outras concretizações, os polipeptídeos da invenção po-dem ser fundidos a uma sequência heteróloga de aminoácidos, opcio-nalmenteatravés de um ligante, tal como GS, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:6). A sequência heteróloga de aminoácidos pode ser um domínio constante de IgG ou seu fragmento (por exemplo, a região Fc), albumina sérica humana (HSA) ou polipep- tídeos que se ligam à albumina. Tais proteínas de fusão aqui descritas podem também formar multímeros.

[00019] Em algumas concretizações, uma sequência heteróloga de aminoácidos (por exemplo, HSA, Fc, etc.) é fundida ao amino terminal das proteínas de fusão da invenção. Em outras concretizações, a sequência heteróloga de aminoácidos da fusão (por exemplo, HSA, Fc, etc.) é fundida à carboxila terminal das proteínas de fusão da inven- ção.

[00020] Ainda outra concretização leva a métodos para tratar um paciente que exibe um ou mais distúrbios associados ao FGF21, como obesidade, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus tipo 1, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteatohepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsu- linemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, in- farto agudo do miocárdio, hipertensão, doença cardiovascular, ateros- clerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, doença renal, complicações diabéticas, neuropatia, gastroparesia, distúrbios associados com mutações inativadoras no receptor da insulina e outros distúrbios metabólicos,que compreendem administrar ao referido paciente com necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais proteínas da invenção ou de uma de suas composições farmacêuticas.

[00021] A invenção também provê composições farmacêuticas que compreendem as proteínas de fusão da invenção aqui descritas e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas podem ser utilizadas em um método para tratar um distúrbio metabólico, e o método compreende administrar a um paciente humano com necessidade desse tratamento uma composição farmacêutica da invenção. Exemplos não limitantes de distúrbios metabólicos que podem ser tratados incluem diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2 e obesidade.

[00022] Estes e outros aspectos da invenção serão elucidados na descrição detalhada a seguir da invenção.

Descrição resumida dos desenhos

[00023] As Figuras 1A-1D mostram que V188 possui eficácia melhorada no modelo de camundongo ob/ob diabético acima de V76. V188 mostra resultados superiores quando administrada a 1 miligrama por quilograma (mpk), quando comparado aos 5 miligramas por quilograma aos quais V76 foi administrada. A Figura 1A mostra leituras do nível de glicose plasmática no estado alimentado (círculos representam veículo (PBS - solução salina com tampão fosfato), quadrados representam V76 a 5 mpk e triângulos representam V188 a 1 mpk). A Figura 1B mostra leituras do nível de insulina plasmática no estado alimentado (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V188 a 1 mpk). A Figura 1C mostra leituras do peso corporal (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V188 a 1 mpk). A Figura 1D mostra leituras do teor de lipídios no fígado (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V188 a 1 mpk).

[00024] As Figuras 2A-2D mostram que V101 possui eficácia melhorada no modelo de camundongo ob/ob diabético acima de V76. V101 mostra resultados superiores quando administrada a 1 miligrama por quilograma (mpk), quando comparado aos 5 miligramas por quilograma aos quais V76 foi administrada. A Figura 2A mostra leituras do nível de glicose plasmática no estado alimentado (círculos representam veículo (PBS - solução salina com tampão fosfato), quadrados representam V76 a 5 mpk e triângulos representam V101 a 1 mpk). A Figura 2B mostra leituras do nível de insulina plasmática no estado alimentado (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V101 a 1 mpk). A Figura 2C mostra leituras do peso corporal (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V101 a 1 mpk). A Figura 2D mostra leituras do teor de lipídios no fígado (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V101 a 1 mpk).

[00025] As Figuras 3A-3D mostram que V103 possui eficácia melhorada no modelo de camundongo ob/ob diabético acima de V76. V103 mostra resultados superiores quando administrada a 1 miligrama por quilograma (mpk), quando comparado aos 5 miligramas por quilo- grama aos quais V76 foi administrada. A Figura 3A mostra leituras do nível de glicose plasmática no estado alimentado (círculos representamveículo (PBS - solução salina com tampão fosfato), quadrados representam V76 a 5 mpk e triângulos representam V103 a 1 mpk). A Figura 3B mostra leituras do nível de insulina plasmática no estado alimentado (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V103 a 1 mpk). A Figura 3C mostra leituras do peso corporal (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V103 a 1 mpk). A Figura 3D mostra leituras do teor de lipídios no fígado (da esquerda para a direita: veículo, V76 a 5 mpk e V103 a 1 mpk).

[00026] As Figuras 4A-4D demonstram as propriedades farmacoci- néticas e termodinâmicas superiores possuídas pelas proteínas de fusão da invenção acima das proteínas de fusão de FGF21 existentes na técnica. A Figura 4A mostra as concentrações plasmáticas de proteínas de fusão da invenção na Publicação PCT WO10/129600, descritas como Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G) e Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E), após a injeção IV da referida fusão em camundongos. A Figura 4B mostra propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão da invenção (V101, V103 e V188) depois de uma única dose IV no camundongo, conforme analisado por ensaio ELISA com anti-Fc, em comparação com dados farmacocinéticos gerados no camundongo por V76 em um estudo prévio com ensaio ELISA utilizando um anticorpo anti-FGF21. A Figura 4C mostra uma verificação in loco das proteínas de fusão da invenção pela técnica de Western Blotting com um anticorpo anti-FGF21, que é compatível com dados por ELISA de antiFc em 120 horas e 15 dias. As amostras no Blottingsão como segue: A representa V101, B representa V103 e C representa V188. O controleé V101 e soro. A Figura 4D demonstra a estabilidade termodinâmica significativamente aumentada das proteínas de fusão da invenção quando comparadas à V76. De cima para baixo, a figura representa V101, V103 e V188, todas as quais com temperaturas de fusão (Tm) melhoradas quando comparadas à V76 (Tm < 50 °C (não mostrado)) e FGF21 do tipo selvagem (Tm = 46,5 °C±0.3 (não mostrado)).

Descrição detalhada da invenção

[00027] As proteínas de fusão da presente invenção representam versões modificadas do comprimento completo do polipeptídeo FGF21 do tipo selvagem, conforme conhecido na técnica. A sequência do tipo selvagem do FGF21 servirá como sequência de referência (SEQ ID NO:1), por exemplo, quando comparações entre a sequência do tipo selvagem do FGF21 e as variantes proteicas forem necessárias. A sequência do tipo selvagem do FGF21 possui o número NCBI de sequência de referência NP_061986.1e pode ser encontrada em patentes emitidas, tais como, por exemplo, US 6 716 626B1, concedida à Chiron Corporation (SEQ ID NO:1). Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Vai Ser 15 10 15 Vai Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro lie Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai Arg Gin Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai lie Gin He Leu Gly Vai 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 HO Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser 209

[00028] A sequência codificadora correspondente do mRNA para o polipeptídeo completo FGF21 (número NCBI de sequência de referência NM_019113.2) é mostrada abaixo (SEQ ID NO:2): 1 ctgtcagctg aggatccagc cgaaagagga gccaggcact caggccacct gagtctactc 61 acctggacaa ctggaatctg gcaccaattc taaaccactc agcttctccg agctcacacc 121 ccggagatca cctgaggacc cgagccattg atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac 181 tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc 241 atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 301 acagatgatg cccagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg 361 ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt 421 attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 481 tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 541 ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag 601 tccccacacc gggaccctgc accccgagga ccagctcgct tcctgccact accaggcctg 661 ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc 721 tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga 781 agccagaggc tgtttactat gacatctcct ctttatttat taggttattt atcttattta 841 tttttttatt tttcttactt gagataataa agagttccag aggagaaaaa aaaaaaaaaa 901 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

[00029] A sequência do FGF21 maduro é desprovida de uma se- quência líder e pode também incluir outras modificações de um poli- peptídeo, tais como processamento proteolítico da terminação amino (com ou sem uma sequência líder) e/ou da terminação carboxila, clivagem de um polipeptídeo menor a partir de um precursor maior, gli- cosilação N-ligada e/ou O-ligada e outras modificações pós- traducionais entendidas pelos técnicos no assunto. Um exemplo representativo de uma sequência do FGF21 maduro possui a sequência seguinte (SEQ 25 ID NO:3, que representa as posições 29-209 de aminoácidos da sequência proteica completa do FGF21 (número NCBI de sequência de referência NP_061986.1)): His Pro 11$ Pro Asp Ser Ser Pro Lea Leu Gin Phe Gly Gly Gin Vai 5 10 15 Arg Gin Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Tbr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu 11$ Arg Glu Asp Gly Thr Vai Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser 35 ‘40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Vai He Gin 50 55 ’ ’ 60 He Leu Gly Vai Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pre Asp Gly 65 7(1 75 30 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asπ Vai Tyr Gin Ser Glu Ala His IOC 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 " 125 Ala Pro Arg Gly Pre Ala Arg Phu Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 ’ 135 140 Ala Leu Pre Glu Pro Fro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Vai 145 150 155 160 Gly Ger Ser Asp Pro Leu Ser Met Vai Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser ISC

[00030] A sequência codificadora correspondente do cDNA para o polipeptídeo FGF21 maduro (SEQ ID NO:3) é mostrada abaixo (SEQ ID NO:4): 1 caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 61 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 121 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agetgaaage ettgaageeg 181 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 240 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggeetgea gcttccggga getgettett 301 gaggaeggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 360 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 421 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 481 ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 541 teetga

[00031] As proteínas de fusão da invenção podem compreender variantes ou mutantes proteicos das proteínas do tipo selvagem listadas neste relatório descritivo, por exemplo, variantes de FGF21. Neste relatório descritivo, os termos "variante proteica", "variante humana", "variante polipeptídica ou proteica", "variante", "mutante", bem como quaisquer termos semelhantes ou suas versões específicas (por exemplo, "variante proteica do FGF21", "variante", "FGF21 mutante", etc.) definem sequências proteicas ou polipeptídicas que compreendemmodificações, truncamentos, outras variantes de homólogos de proteínas ou polipeptídeos naturais (ou seja, do tipo selvagem) ou sequências nativas correspondentes. "FGF21 variante" ou "FGF21 mutante", por exemplo, é descrito em relação à proteína FGF21 do tipo selvagem (ou seja, natural) conforme aqui descrita.

[00032] Sequências representativas das proteínas de fusão da invenção estão listadas na Tabela 1. As descrições das referidas fusões incluem a variante do FGF21 e, quando aplicável, de um ligante. As alterações ou substituições, empregadas pela variante do FGF21, estão numeradas e são descritas em relação ao FGF21 do tipo selvagem. A título de exemplo, a "Variante 101 (V101)" (SEQ ID N0:10) é uma fusão de Fc-FGF21 com um ligante de dois aminoácidos e as seguintessubstituições efetuadas em relação ao FGF21 do tipo selvagem FGF21: Q55C, A109T, G148C, K150R, P158S, P174L, S195A, P199G, G202A. Tabela 1: Proteínas variantes da fusão de Fc com FGF21

*- Notar que a sequência de FGF21 do tipo selvagem nesta tabela re- fere-se ao número NCBI de sequência de referência NP_061986.1 (SEQ ID NO:1) a menos que especificado de outra forma. Todas as mutações no grupo FGF21 e a numeração correspondente de aminoá- cidos das referidas mutações remetem à (SEQ ID NO:1) não às sequências completas nesta tabela, as quais podem também incluir regiões Fc e de ligantees.

[00033] As variantes ou os mutantes utilizados nas proteínas de fusão da invenção, por exemplo, variantes de FGF21 do tipo selvagem, apresentam ao menos um aminoácido substituído, adicionado e/ou removido em relação à proteína do tipo selvagem as variantes podem incluir truncamentos no N e/ou C-terminal em relação às proteínas do tipo selvagem. Em termos gerais, uma variante possui alguma propriedade modificada, estrutural ou funcional, da proteína do tipo selvagem. Por exemplo, a variante pode apresentar estabilidade física reforçada ou melhorada em soluções concentradas (por exemplo, menos agregação por mediação hidrofóbica), estabilidade plasmática reforçada ou melhorada quando incubada com plasma sanguíneo ou bioatividade reforçada ou melhorada enquanto mantendo um perfil favorável de bi- oatividade.

[00034] Substituições e modificações aceitáveis de aminoácidos que constituem diferenças entre as porções das proteínas de fusão da invenção e suas proteínas comparadoras do tipo selvagem incluem, entre outras, uma ou mais substituições de aminoácidos, inclusive substituições por análogos de aminoácidos não naturais, e truncamentos. Dessa forma, as proteínas de fusão da invenção (por exemplo, as proteínas de fusão da invenção) incluem, entre outros, mutantes sítio- dirigidos, polipeptídeos truncados, mutantes resistentes à proteólise, mutantes que reduzem a agregação, mutantes de combinações e proteínas de fusão, conforme aqui descritos.

[00035] O técnico na área da expressão de proteínas reconhecerá que a sequência de metionina ou de metionina-arginina pode ser introduzida no N-terminal de qualquer uma das proteínas de fusão da invenção, para expressão em E. coli, e estas são contempladas dentro do contexto desta invenção.

[00036] As proteínas de fusão da invenção podem possuir compatibilidade aumentada com conservantes farmacêuticos (por exemplo, m- cresol, fenol, álcool benzílico), pelo qual possibilitando o preparo de uma formulação farmacêutica com conservantes que mantenha as propriedades físico-químicas e a atividade biológica da proteína durante o armazenamento. Sendo assim, variantes com estabilidade farmacêutica reforçada, em relação ao tipo selvagem, apresentam estabili- dade física melhorada em soluções concentradas tanto em condições fisiológicas como nas de formulação farmacêutica com conservante, ao mesmo tempo em que mantêm a potência biológica. A título de exemplo não limitante, as proteínas de fusão da invenção podem ser mais resistentes à proteólise e à degradação enzimática; podem apresentar estabilidade melhorada; e podem ser menos propensas a se agregarem do que suas homólogas do tipo selvagem ou sequências nativas correspondentes. Neste relatório descritivo, estes termos não são mutuamente exclusivos ou limitantes, em que é inteiramente possível que uma determinada variante possua uma ou mais propriedades modificadas da proteína do tipo selvagem.

[00037] A invenção também abrange moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas de fusão da invenção e que compreendem, por exemplo, uma sequência de aminoácidos do FGF21 que seja idêntica ao menos em aproximadamente 95% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, mas em que resíduos específicos que conferem uma propriedade desejável à variante proteica do FGF21, por exemplo, potência melhorada frente a receptores do FGF21, resistência à proteóli- se, meia-vida aumentada ou propriedades de redução da agregação e suas combinações, não foram adicionalmente modificados. Em outras palavras, com a exceção de resíduos na sequência mutante do FGF21 que foram modificados a fim de conferir resistência à proteólise, redução da agregação ou outras propriedades, podem ter-se modificado aproximadamente 5% (alternadamente 4%, alternadamente 3%, alternadamente 2%, alternadamente 1%) de todos os outros resíduos de aminoácidos na sequência mutante do FGF21. Tais FGF21 mutantes possuem ao menos uma atividade do polipeptídeo FGF21 do tipo selvagem.

[00038] A invenção também abrange uma molécula de ácido nu- cleico que compreende uma sequência nucleotídica que é idêntica ao menos em aproximadamente 85%, e mais preferivelmente, idêntica ao menos em aproximadamente 90 a 95% à sequência nucleotídica da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, mas em que os nucleotídeos que codificamresíduos de aminoácidos que conferem resistência à proteólise, redução da agregação ou outras propriedades às proteínas codificadasnão foram adicionalmente modificados. Em outras palavras, com a exceção de nucleotídeos que codificam resíduos nas sequências mu- tantes do FGF21 que foram modificados a fim de conferir resistência à proteólise, redução da agregação ou outras propriedades, pode ter-se modificado aproximadamente 15%, e mais preferivelmente próximo de 10 a 5% de todos os outros nucleotídeos na sequência mutante. Tais moléculas de ácido nucleico codificam proteínas que possuem ao menos uma atividade de suas homólogas do tipo selvagem.

[00039] A presente invenção provê métodos utilizados para gerar as proteínas de fusão da invenção, em que tais métodos envolvem modificação sítio-específica e modificação não sítio-específica das versões do tipo selvagem das proteínas (por exemplo, a proteína FGF21 do tipo selvagem conforme aqui descrita), por exemplo, truncamentos das proteínas do tipo selvagem e a incorporação sítio-específica de ami- noácidos em posições de interesse dentro das proteínas do tipo selvagem. As referidas modificações reforçam as propriedades biológicas das proteínas de fusão da invenção em relação às proteínas do tipo selvagem, bem como, em alguns casos, servem como pontos de ligação para, por exemplo, marcações e agentes de extensão da meia- vida das proteínas, e para fins de fixar as referidas variantes à superfície de um suporte sólido. Concretizações relacionadas da invenção são métodos de produção de células capazes de produzir as referidas proteínas de fusão da invenção e de produzir vetores contendo DNA que codifica as referidas variantes.

[00040] Em certas concretizações, tais modificações, por exemplo, modificações sítio-específicas, são utilizadas para anexar conjugados, por exemplo, grupos PEG a proteínas, polipeptídeos e/ou a peptídeos da invenção, para fins de, por exemplo, ampliar a meia-vida ou de outra forma melhorar as propriedades biológicas das referidas proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos. As referidas técnicas estão descritas mais detalhadamente abaixo.

[00041] Em outras concretizações, tais modificações, por exemplo, modificações sítio-específicas são utilizadas para anexar outros polímeros, pequenas moléculas e sequências proteicas recombinantes que ampliam a meia-vida da proteína da invenção. Uma de tais concretizações inclui a ligação de ácidos graxos ou de compostos específicos que se ligam à albumina a proteínas, polipeptídeos e/ou peptí- deos. Em outras concretizações, as modificações são efetuadas em um determinado tipo de aminoácido e podem ser anexadas a um ou mais sítios na proteína.

[00042] Em outras concretizações, tais modificações, por exemplo, modificações sítio-específicas, são utilizadas como meio de ligação para produção de multímeros do tipo selvagem e/ou variantes, por exemplo, dímeros (homodímeros ou heterodímeros), trímeros ou te- trâmeros. Essas moléculas proteicas multiméricas podem adicionalmente conter grupos tais como PEG, açúcares e/ou conjugados PEG- colesterol anexados ou serem fundidas na terminação amino ou car- boxila a outras proteínas tais como Fc, albumina sérica humana (HSA), etc.

[00043] Em outras concretizações, tais modificações sítio- específicas são utilizadas para produzir proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos, em que a posição da pirrolisina ou de seu análogo ou de aminoácidos não naturais (para-acetil-Phe, para-azido-Phe), incorporados de modo sítio-específico, permite controlar a orientação e fixar tais proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos à superfície de um suporte sólido ou para que tenham grupos como PEG, açúcares e/ou conjugados PEG-colesterol anexados.

[00044] Em outras concretizações, tais modificações sítio- específicas são utilizadas para promover a reticulação de proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos de modo sítio-específico, pelo qual formando oligômeros incluindo, entre outros, heterodímeros e heterotrí- meros. Em outras concretizações, tais modificações sítio-específicas são utilizadas para promover a reticulação de proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos de modo sítio-específico, pelo qual formando conjuga-dos do tipo proteína-proteína, conjugados proteína-polipeptídeo, con-jugadosproteína-peptídeo, conjugados polipeptídeo-polipeptídeo, con-jugadospolipeptídeo-peptídeo ou conjugados peptídeo-peptídeo. Em outras concretizações, uma modificação sítio-específica pode incluir um ponto de ramificação para permitir que mais de um tipo de molécula seja anexada em um sítio único de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo.

[00045] Em outras concretizações, as modificações aqui listadas podem ser efetuadas de maneira não sítio-específica e resultarem em conjugados do tipo proteína-proteína, conjugados proteína- polipeptídeo, conjugados proteína-peptídeo, conjugados polipeptídeo- polipeptídeo, conjugados polipeptídeo-peptídeo ou conjugados peptí- deo-peptídeo da invenção.

Definições

[00046] Várias definições são utilizadas por todo este documento. A maioria das palavras possui o significado que seria atribuído àquelas palavras pelo técnico no assunto. Palavras especificamente definidas, seja abaixo ou em outro lugar neste documento, possuem o significado fornecido no contexto da presente invenção como todo e como são tipicamente entendidas pelos técnicos no assunto.

[00047] Neste relatório descritivo, o termo "FGF21" refere-se a um membro da família proteica do fator de crescimento de fibroblastos (FGF). Uma sequência de aminoácidos de FGF21 (No de acesso no GenBank NP_061986.1) é apresentada como SEQ ID NO:1, cuja sequência polinucleotídica correspondente é apresentada como SEQ ID NO:2 (número NCBI de sequência de referência NM_019113.2). "Vari-ante de FGF21", "mutante de FGF21" e termos semelhantes descrevem a versão modificada da proteína FGF21, por exemplo, com resíduos deletados, adicionados, modificados ou substituídos dos aminoá- cidos constituintes.

[00048] Neste relatório descritivo, o termo "receptor do FGF21"refere-se a um receptor para FGF21 (Kharitonenkov, A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu, H. et al. (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Y. et al. (2007) PNAS 104:7432-7437).

[00049] O termo "polipeptídeo do FGF21" refere-se a um polipeptí- deo de ocorrência natural que é expresso em humanos. Para fins desterelatório descritivo, o termo "polipeptídeo do FGF21" pode ser utilizado alternadamente para se referir a qualquer polipeptídeo completo do FGF21, por exemplo, SEQ ID NO:1, que consiste em 209 resíduos de aminoácidos e que é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:2; qualquer forma madura do polipeptídeo, que consiste em 181 resíduos de aminoácidos e na qual os 28 resíduos de aminoá- cidos no amino-terminal do polipeptídeo completo do FGF21 (ou seja, que constitui o peptídeo de sinalização) foram removidos.

[00050] "Variante 76," neste relatório descritivo, é uma variante proteica do FGF21, apresentando um PEG ramificado de 40 kDa ligado através de Cys154 e oito mutações pontuações em relação à proteína do tipo selvagem de 177 aminoácidos. A síntese da variante está descrita mais detalhadamente neste relatório, e a sequência proteica está representada na Tabela 1 e SEQ ID NO:9.

[00051] O termo "molécula isolada de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico da presente invenção que (1) foi separada ao menos de aproximadamente 50 por cento de proteínas, lipídios, carboidratos ou outros materiais com os quais é naturalmente encontrada quando o ácido nucleico total é isolado das células de origem, (2) não está ligada à totalidade ou a uma parte de um polipeptí- deo ao qual a "molécula isolada de ácido nucleico"está ligada na natureza; (3) está operacionalmente ligada a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza ou (4) não ocorre na natureza como parte de uma sequência polipeptídica maior. De preferência, a molécula isolada de ácido nucleico da presente invenção está substancialmente livre de quaisquer outras moléculas contaminantes de ácido nucleico ou de outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interfeririam com seu uso na produção do polipeptídeo ou seu uso terapêutico, diagnóstico, profilático ou em pesquisa.

[00052] O termo "vetor"é usado para se referir a qualquer molécula (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo ou vírus) utilizada para transferirinformação sobre codificação a uma célula hospedeira.

[00053] O termo "vetor de expressão"refere-se a um vetor adequado para transformação de uma célula hospedeira e que contém sequências de ácidos nucleicos que direcionam e/ou controlam a expressão de sequências heterólogas inseridas de ácidos nucleicos. Expressão inclui, entre outros, processos como transcrição, tradução e splicing(remoção de fragmentos) de RNA, se introns estiverem presentes.

[00054] O termo "operacionalmente ligado", neste relatório descritivo, refere-se a um arranjo de sequências flanqueadoras, em que as sequências flanqueadoras assim descritas são configuradas ou estão montadas para que executem a sua função habitual. Elementos de proteínas de fusão podem ser operacionalmente ligados uns aos conforme seria com uma proteína endógena natural e/ou para combinar elementos diferentes das referidas proteínas de fusão de modo sinér- gico.

[00055] Em nível de nucleotídeo, uma sequência flanqueadora operacionalmente ligada a uma sequência codificadora pode ter a capacidade de efetuar a replicação, a transcrição e/ou a tradução da sequência codificadora. Por exemplo, uma sequência codificadora está operacionalmente ligada a um promotor quando o promotor é capaz de direcionar a transcrição daquela sequência codificadora. Uma sequência flanqueadora não precisa ser contígua à sequência codificadora, desde que atue corretamente. Portanto, por exemplo, sequências intervenientesnão traduzidas, todavia transcritas podem estar presentes entre a sequência de um promotor e a sequência de codificação, e ainda assim sequência do promotor pode ser considerada “operacionalmente ligada” à sequência de codificadora.

[00056] O termo "célula hospedeira"é usado para se referir a uma célula que foi transformada ou que é capaz de ser transformada com uma sequência de ácido nucleico e depois de expressar um gene selecionado de interesse. O termo inclui a progênie da célula precursora, seja a progênie idêntica ou não em morfologia ou em constituição genética à precursora original, desde que o gene selecionado esteja pre-sente.

[00057] O termo "aminoácido", neste relatório descritivo, refere-se a aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, análogos de aminoá- cidos e mimétidos de aminoácidos que atuam de maneira semelhante aos aminoácidos naturais, todos os seus estereoisômeros D e L se a sua estrutura permite tais formas estereoisoméricas. Neste relatório descritivo, os aminoácidos são designados por seus nomes, seus símbolos comumente conhecidos formados por 3 letras ou pelos símbolos em uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB.

[00058] O termo "de ocorrência natural" quando usado em conexão com materiais biológicos como moléculas de ácido nucleico, polipeptí- deos, células hospedeiras e os semelhantes, refere-se a materiais que são encontrados na natureza e não manipulados pelo homem. Do mesmo modo, "de ocorrência não natural", neste relatório descritivo, refere-se a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem. Quando usado em conexão com nucleotídeos, o termo "de ocorrência natural" refere- se às bases adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracila (U). Quando usado em conexão com aminoácidos, o termo "de ocorrência natural" refere-se aos 20 aminoácidos convencionais (ou seja, alanina (A), cisteína (C), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), feni- lalanina (F), glicina (G), histidina (H), isoleucina (I), lisina (K), leucina (L), metionina (M), asparagina (N), prolina (P), glutamina (Q), arginina (R), serina (S), treonina (T), valina (V), triptofano (W) e tirosina (Y)), bem como selenocisteína, pirrolisina (Pyl ou O) e pirrolina-carboxi- lisina (Pel ou Z).

[00059] Pirrolisina (Pyl) é um aminoácido de ocorrência natural encontrado dentro de metilamina metiltransferases de arquéias metano- gênicas da família Methanosarcina. A pirrolisina é um análogo da lisina incorporado por tradução concomitante em códons UAG in frame no respectivo mRNA e é considerado o 22oaminoácido natural.

[00060] Tal como descrito pelo menos na Publicação da Patente PCT WO2010/48582 (Requerente IRM, LLC), tentativas para biossin- tetizar pirrolisina (Pyl) em E. coli resultaram na formação de "pirrolisina desmetilada", designada neste relatório descritivo como pirrolina- carboxi-lisina ou Pel. "Pel" neste relatório descritivo refere-se à Pcl-A ou à Pcl-B.

[00061] Os termos "aminoácido não natural" e "aminoácido não natural", neste relatório descritivo, destinam-se alternadamente a repre- sentar estruturas de aminoácidos que não podem ser geradas por bi- ossíntese em organismo algum usando genes não modificados ou modificados de qualquer organismo, sejam estes iguais ou diferentes. Os termos referem-se a um resíduo de aminoácido que não está presente na sequência proteica de ocorrência natural (do tipo selvagem) do FGF21 ou nas sequências da presente invenção. Estes incluem, entre outros, aminoácidos modificados e/ou análogos de aminoácidos que não sejam um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, seleno- cisteína, pirrolisina (Pyl) ou pirrolina-carbóxi-lisina (Pel, por exemplo, como descrita na Publicação da Patente PCT WO2010/48582). Tais resíduos de aminoácidos não naturais podem ser introduzidos por substituição de aminoácidos de ocorrência natural e/ou por inserção de aminoácidos não naturais na sequência proteica de ocorrência natural (do tipo selvagem) do FGF21 ou nas sequências da invenção. O resíduo de aminoácido não natural também pode ser incorporado de tal modo que uma funcionalidade desejada seja transmitida à molécula de FGF21, por exemplo, a capacidade para ligar um grupo funcional (por exemplo, PEG). Quando usado em conexão com aminoácidos, o símbolo "U"significará "aminoácido não natural" neste relatório descritivo.

[00062] Adicionalmente, entende-se que tais "aminoácidos não naturais" necessitam de um tRNA modificado e um tRNA sintetase (RS) modificada para incorporação em uma proteína.

[00063] Estes pares de tRNA/RS ortogonais “selecionados” são gerados por um processo de seleção como desenvolvido por Schultz et al. ou por mutação aleatória ou direcionada. A título de exemplo, pirro- lina-carboxi-lisina é um "aminoácido natural" gerado de modo biossin- tético por genes transferidos de um organismo para as células hospedeiras e incorporado em proteínas utilizando genes naturais de tRNA e tRNA sintetase, enquanto p-aminofenilalanina (Ver, Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9) é um "aminoácido não natural" porque, embora gerado por biossíntese, é incorporado em proteínas por um par de tRNA/tRNA ortogonal “selecionado”.

[00064] Aminoácidos modificados codificados incluem, entre outros, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, O-fosfoserina, ácido azetidinacar- boxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2- aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, bu- tilglicina terciária, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'- diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropriônico, N-etilglicina, N- metilglicina, N-etil-asparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo- isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metil-isoleucina, N- metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, orni- tina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. O termo "aminoácido" também inclui aminoácidos de ocorrência natural que são metabólitos de certos organismos, mas que não codificados pelo código genético para incorporação em proteínas. Tais aminoácidos incluem, entre outros, ornitina, D-ornitina e D-arginina.

[00065] O termo "análogo de aminoácido", neste relatório descritivo, refere-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, a título de exemplo apenas, um α-carbono que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxi- la, um grupo amino e um grupo R. Análogos de aminoácidos incluem os aminoácidos naturais e não naturais que são quimicamente bloqueados,reversível ou irreversivelmente, ou que seu grupo carbóxi no C- terminal, seu grupo amino no N-terminal e/ou seus grupos funcionais na cadeia lateral são modificados quimicamente. Tais análogos incluem, entre outros, metionina sulfóxido, metionina sulfona, S- (carboximetil)-cisteína, S-(carboximetil)-cisteína sulfóxido, S- (carboximetil)-cisteína sulfona, (beta-metil éster) do ácido aspártico, N- etilglicina, alanina carboxamida, homoserina, norleucina e metionina metil sulfônio.

[00066] O termo "mimético de aminoácidos", neste relatório descritivo, refere-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de maneira semelhante a um aminoácido de ocorrência natural.

[00067] O termo "variante biologicamente ativa" refere-se a qualquer variante polipeptídica utilizada nas proteínas de fusão da invenção, por exemplo, como proteína constituinte das fusões, que possui uma atividade de seu homólogo proteico ou polipeptídico do tipo selvagem (por exemplo, de ocorrência natural), tal como a capacidade para modular os níveis de glicose sanguínea, HbA1c, insulina, triglice- rídeos ou de colesterol; aumentar a função pancreática; reduzir os níveis de lipídios no fígado; reduzir o peso corporal; e melhorar a tolerância à glicose, o gasto energético ou a sensibilidade à insulina, independentemente do tipo ou do número de modificações que foram introduzidas na variante polipeptídica. Variantes polipeptídicas que possuem um nível ligeiramente menor de atividade em relação a suas versões do tipo selvagem podem, não obstante, ser consideradas va-riantespolipeptídicas biologicamente ativas. Um exemplo representativonão limitante de uma variante polipeptídica biologicamente ativa da invenção é uma variante do FGF21, que é modificada depois e possui propriedades biológicas semelhantes ou reforçadas em relação ao FGF do tipo selvagem.

[00068] Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeutica- mente eficaz" referem-se cada um à quantidade de uma proteína de fusão da invenção usada para apoiar um nível observável de uma ou mais atividades biológicas dos homólogos polipeptídicos ou proteicos do tipo selvagem, tais como a capacidade para diminuir os níveis de glicose sanguínea, insulina, triglicerídeos ou de colesterol; reduzir os níveis de triglicerídeos ou lipídios no fígado; reduzir o peso corporal; ou melhorar a tolerância à glicose, o gasto energético ou a sensibilidadeà insulina. Por exemplo, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" administrada a um paciente que exibe, sofre ou é propenso a sofrer de distúrbios associados ao FGF21 (tais como diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2, obesidade ou síndrome metabólica), é tal quantidade que induz, atenua ou de outra provoca uma melhora nos sintomas patológicos, na progressão da doença, nas condições físicas associadas ou na resistência para sucumbir aos distúrbios acima mencionados. Para fins da presente invenção, um "indivíduo"ou "paciente"é preferivelmente um humano, mas pode também ser um animal, mais especificamente, um animal de companhia (por exemplo, cães, gatos e os semelhantes), animais de criação (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos e os semelhantes) e animais de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, cobaias e os semelhantes).

[00069] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável"ou "veículo fisiologicamente aceitável"neste relatório descritivo refere-se a um ou mais materiais de formulação adequados para alcançar ou reforçar a liberação de uma proteína de fusão da invenção.

[00070] O termo "antígeno"refere-se a uma molécula ou uma parte de uma molécula que é capaz de ser ligada por um anticorpo e que, adicionalmente, é capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos que são capazes de se ligar a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos.

[00071] O termo "Fc nativo" refere-se à molécula ou à sequência que compreende a sequência de um fragmento não de ligação ao an- tígeno, resultante da digestão do anticorpo inteiro ou produzido por outros meios, sejam em forma monomérica ou multimérica, e pode conter a região hinge (de articulação). A fonte original de imunoglobu- lina do Fc nativo é de preferência de origem humana e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas, embora lgG1 e lgG2 sejam preferidas. Moléculas de Fc nativo são constituídas por polipeptídeos monoméri- cos que podem ligar-se em formas diméricas ou multiméricas por associação covalente (ou seja, ligações dissulfeto) e não covalente. O número de ligações dissulfeto intermoleculares entre subunidades mo- noméricas de moléculas de Fc nativo varia de 1 a 4 dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA e IgE) ou subclasse (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgA1 e lgGA2). Um exemplo de um Fc nativo é um dímero ligado por dissulfeto resultante da digestão por papaína de uma IgG (ver Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). O termo "Fc nativo" neste relatório descritivo é genérico para formas monoméricas, diméricas e multiméricas.

[00072] O termo "variante de Fc" refere-se a uma molécula ou sequência que é modificada a partir de um Fc nativo, mas que ainda compreende um sítio de ligação para o receptor de resgate, FcRn (receptor Fc neonatal). As Publicações Internacionais Nos WO 97/34631 e WO 96/32478 descrevem variantes exemplares de Fc, bem como a interação com o receptor de resgate, e são aqui incorporadas por referência neste pedido de patente. Por conseguinte, o termo "variante de Fc" pode compreender uma molécula ou sequência que é humanizada a partir de um Fc nativo não humano. Além do mais, um Fc nativo compreende regiões que podem ser removidas porque estas conferem aspectos estruturais ou atividade biológica que não são necessários para as moléculas de fusão das proteínas de fusão da invenção. Portanto, o termo "variante de Fc" compreende uma molécula ou sequência que é desprovida de um ou mais sítios ou resíduos do Fc nativo, ou na qual um ou mais sítios do Fc foram modificados, afetam ou estão envolvidos em: (1) formação de ligações dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeira selecionada, (3) heterogeneidade no N-terminal quando da expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com complemento, (6) ligação a um receptor Fc diferente do receptor selvagem ou (7) citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). As variantes de Fc estão descritas mais detalhadamente abaixo.

[00073] O termo "domínio Fc" abrange Fc nativo e Fc variantes e sequências conforme definidos acima. Tal como com variantes de Fc e moléculas do Fc nativo, o termo "domínio Fc" inclui moléculas em forma monomérica ou multimérica, sejam digeridas a partir do anticorpo inteiro ou produzidas por outros meios. Em algumas concretizações da presente invenção, um domínio Fc pode ser fundido ao FGF21 ou a um FGF21 mutante (inclusive uma forma truncada do FGF21 ou de um FGF21 mutante) por meio de, por exemplo, uma ligação covalente entre o domínio Fc e a sequência do FGF21. Tais proteínas de fusão podem formar multímeros através da associação dos domínios Fc e tanto estas proteínas de fusão como seus multímeros representam um aspecto da presente invenção.

[00074] O termo "fragmento Fc modificado", neste relatório descritivo,significará um fragmento Fc de um anticorpo compreendendo uma sequência modificada. O fragmento Fc é uma parte de um anticorpo que compreende o domínio CH2, CH3 e parte da região hinge. O fragmento Fc modificado pode ser derivado de, por exemplo, IgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. FcLALA é um fragmento Fc modificado uma mutação LALA (L234A, L235A), que desencadeia ADCC com eficiência mais baixa e que se liga e ativa o complemento humano de modo fraco. Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104. Modificações adicionais ao fragmento Fc estão descritas em, por exemplo, a Patente U.S. No 7 217 798.

[00075] O termo "heterólogo"significa que estes domínios não são naturalmente encontrados associados com regiões constantes de um anticorpo. Especificamente, tais domínios heterólogos de ligação não possuem a estrutura típica de um domínio variável de anticorpos que consiste em 4 regiões (arcabouço), FR1, FR2, FR3 e FR4, e as 3 regiões determinantes de complementaridade (CDRs) intercaladas. Cada braço do anticorpo fundido (fusobody), portanto, compreende uma primeira cadeia polipeptídica única incluindo um primeiro domínio de ligação ligado covalentemente à parte N-terminal de uma região constante de cadeia pesada CH1 de um anticorpo e uma segunda cadeia polipeptídica única incluindo um segundo domínio de ligação ligado covalentemente à parte N-terminal de uma região constante de cadeia leve CL de um anticorpo. A ligação covalente pode ser direta, por exemplo, através de uma ligação peptídica, ou indireta através de um ligante, por exemplo, um ligante peptídico. Os dois heterodímeros do fusobodyestão ligados covalentemente, por exemplo, por ao menos uma ponte dissulfeto em sua região hinge, semelhantemente à estrutura de um anticorpo. Exemplos de moléculas com estrutura de fusobody foram descritos na técnica, especialmente, fusobodies que compreendem a região de ligação a ligantes do receptor heterodimérico (ver, por exemplo, as Publicações das Patentes Internacionais WO01/46261 e WO11/076781).

[00076] O termo "polietilenoglicol" ou "PEG" refere-se a um composto de polialquilenoglicol ou seu derivado, com ou sem agentes de acoplamento ou a derivatização com grupos acopladores ou ativado- res.

[00077] O termo "distúrbios associados ao FGF21", e termos semelhantemente utilizados neste relatório descritivo, inclui obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteatohepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, infarto agudo do miocárdio, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, doença renal, complicações diabéticas, neuropatia, gastro- paresia, distúrbios associados com mutações inativadoras graves no receptor da insulina e outros distúrbios metabólicos.

[00078] O termo "distúrbios associados com mutações inativadoras graves no receptor da insulina", e termos semelhantemente utilizados neste relatório descritivo, descrevem condições em indivíduos afetados por mutações no receptor da insulina (ou em possíveis proteínas diretamente a jusante deste) que causam grave resistência à insulina, mas que são frequentemente (embora nem sempre) vistas sem a obesidade comum no diabetes mellitus tipo 2. Em muitas maneiras, indivíduos afetados por estas condições manifestam sintomas híbridos do diabetes mellitus tipo 1 e do diabetes mellitus tipo 2. Os indivíduos afetados se enquadram em diversas categorias de gravidade mais ou menos crescente, incluindo: Resistência insulínica tipo A, resistência insulínica tipo C (síndrome de HAIR-AN), síndrome de Rabson- Mendenhall e finalmente síndrome de Donohue ou leprechaunismo. Estes distúrbios estão associados com níveis endógenos de insulina muito altos e, bem frequentemente, com hiperglicemia. Assim, os indivíduos afetados também apresentam várias características clínicas associadas com “toxicidade da insulina", incluindo hiperandrogenismo, síndrome do ovário policístico (PCOS), hirsutismo e acantose nigricans (crescimento e pigmentação excessivos) nas dobras da pele.

[00079] "Diabetes mellitus tipo 2"é uma condição caracterizada pelaprodução excessiva de glucose apesar da disponibilidade de insulina, e os níveis circulantes de glicose permanecem excessivamente altos como resultado da depuração inadequada de glicose.

[00080] "Diabetes mellitus tipo 1"é uma condição caracterizada por altos níveis de glicose sanguínea causados pela ausência total de insulina. Esta condição ocorre quando o sistema imune do corpo ataca as células beta produtoras de insulina no pâncreas e as destrói. O pâncreas então produz pouca ou nenhuma insulina.

[00081] "Intolerância à glicose" ou comprometimento da tolerância à glicose (IGT) é um estado pré-diabético de disglicemia que está associado com risco aumentado de patologia cardiovascular. A condição pré-diabética impede que um indivíduo movimente a glicose para o interior das células de modo eficiente e que a utilize como fonte energética eficiente, levando à elevação dos níveis de glicose no sangue e a algum grau de resistência à insulina.

[00082] "Hiperglicemia"é definida como excesso de açúcar (glicose) no sangue.

[00083] "Hipoglicemia", também chamada de baixo nível de açúcar no sangue, ocorre quando o nível de glicose sanguínea decresce tanto que não é suficiente para fornecer energia para as atividades do corpo.

[00084] "Hiperinsulinemia"é definida como nível superior ao normal de insulina no sangue.

[00085] "Resistência à insulina"é definida como um estado no qual uma quantidade normal de insulina produz uma resposta biológica abaixo da normal

[00086] "Obesidade", em termos do indivíduo humano, pode ser definida como aquele peso corporal superior a 20 por cento acima do peso corporal ideal para uma dada população (R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, pp. 904-916).

[00087] "Complicações diabéticas" são problemas, causados pelos altos níveis da glicose sanguínea, com outras funções do corpo tais como nos rins, nervos (neuropatias), pés (úlceras nos pés e má circulação) e olhos (por exemplo, retinopatias). O diabetes também aumenta o risco de doença cardíaca e distúrbios ósseos e articulares. Outras complicações tardias do diabetes incluem problemas cutâneos, problemas digestivos, disfunção sexual e problemas com os dentes e as gengivas.

[00088] "Síndrome metabólica"pode ser definida como um agrupamento de ao menos três dos seguintes sinais: acúmulo de gordura abdominal principalmente em homens, largura da cintura de 40 polegadas (101,6 centímetros) ou mais; alto nível de açúcar no sangue - pelo menos 110 miligramas por decilitro (mg/dL) após jejum; alto nível de triglicerídeos - pelo menos 150 mg/dL na corrente sanguínea; baixo nível de HDL - inferior a 40 mg/dl; e pressão arterial de 130/85 mmHg ou mais alta.

[00089] "Pancreatite"é a inflamação do pâncreas.

[00090] "Dislipidemia"é um distúrbio do metabolismo de lipoproteí- nas, inclusive a superprodução ou a deficiência de lipoproteínas. As dislipidemias podem se manifestar por elevação das concentrações de colesterol total, colesterol-lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e de triglicerídeos e diminuição na concentração de colesterol-lipoproteínas de alta densidade (HDL) no sangue.

[00091] "Doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)"é uma doença hepática, não associada com o consumo do álcool, caracterizada por alteração gordurosa de hepatócitos.

[00092] "Esteatohepatite não alcoólica (NASH)"é uma doença hepática, não associada com o consumo do álcool, caracterizada por alteração gordurosa de hepatócitos, acompanhada por inflamação intralobular e fibrose.

[00093] "Hipertensão"ou pressão arterial alta é uma elevação tran sitória ou sustentada da pressão arterial sistêmica para um nível que provavelmente induzirá cardiovascular ou outras consequências adversas. A hipertensão foi arbitrariamente definida como pressão arterial sistólica acima de 140 mmHg ou pressão arterial diastólica abaixo de 90 mmHg.

[00094] "Doenças cardiovasculares"são doenças relacionadas ao coração ou a vasos sanguíneos.

[00095] O "infarto agudo do miocárdio"ocorre quando há uma interrupção do suprimento sanguíneo a uma parte do coração. A isquemia resultante e escassez de oxigênio, se deixadas sem tratamento por um período suficiente de tempo, pode causar dano ou morte (infarto) do tecido muscular cardíaco (miocárdio).

[00096] A "doença arterial periférica"ocorre quando uma placa se acumula nas artérias que levam o sangue para a cabeça, os órgãos e as extremidades. Com o tempo, a placa pode endurecer e estreitar as artérias, o que restringe o fluxo de sangue rico em oxigênio para os órgãos e outras partes do corpo.

[00097] "Aterosclerose"é uma doença vascular caracterizada por depósitos lipídicos irregularmente distribuídos na íntima de artérias de grande e médio tamanho, que causam o estreitamento de lúmens arteriais e prosseguem finalmente para fibrose e calcificação. As lesões são habitualmente focais e evoluem lentamente e de modo intermitente. A restrição do fluxo sanguíneo é responsável pela maioria das ma-nifestações clínicas, as quais variam com a distribuição e a gravidade das lesões.

[00098] "Acidente vascular cerebral"é qualquer evento clínico agudo, relacionado ao comprometimento da circulação cerebral, que dura mais de 24 horas. Um acidente vascular cerebral envolve dano irreversível ao cérebro, em que o tipo e a gravidade dos sintomas dependem da localização e da extensão de tecido cerebral cuja circulação foi comprometida.

[00099] "Insuficiência cardíaca", também chamada de insuficiência cardíaca congestiva, é uma condição na qual o coração não consegue mais bombear sangue suficiente para o resto do corpo.

[000100] "Doença cardíaca coronária", também chamada de doença da artéria coronária, é um estreitamento dos pequenos vasos sanguíneos que suprem sangue e oxigênio ao coração.

[000101] "Doença renal" ou nefropatia é qualquer doença do rim. A nefropatia diabética é uma importante causa de morbidade e mortalidade em pessoas com diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2.

[000102] "Neuropatias"são quaisquer doenças que envolvam os nervos cranianos ou o sistema nervoso periférico ou autônomo.

[000103] "Gastroparesia"é a fraqueza da peristalse gástrica, que resulta em retardo do esvaziamento intestinal.

[000104] Os pacientes criticamente enfermos abrangidos pela presente invenção geralmente vivenciam um estado hipermetabólico instável. Este estado metabólico instável deve-se a alterações no metabolismo de substratos, o que pode levar a deficiências relativas em alguns nutrientes. Em geral, a oxidação de gordura e músculos está aumentada.

[000105] Além do mais, pacientes criticamente enfermos são de preferência pacientes que apresentam síndrome da resposta inflamatória sistêmica ou de angústia respiratória. Redução em morbidade significa reduzir a probabilidade de que um paciente criticamente enfermo venha a desenvolver enfermidades, condições ou sintomas adicionais ou reduzir a gravidade de enfermidades, condições ou sintomas adicionais. Por exemplo, reduzir a morbidade pode corresponder a diminuir a incidência de bacteremia ou sepse ou de complicações associadas com falência de múltiplos órgãos.

[000106] Neste relatório descritivo, as formas no singular "um", "uma", "o" e “a” incluem referências no plural a menos que o conteúdo claramente dite em contrário. Portanto, por exemplo, a referência a "um anticorpo" inclui uma mistura de dois ou mais de tais anticorpos.

[000107] Neste relatório descritivo, o termo "aproximadamente"refere-se a +/- 20%, mais preferivelmente, +/-10% ou ainda mais preferivelmente +/- 5% de um valor.

[000108] Os termos "polipeptídeo"e "proteína" são usados alternadamente e se referem a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, os quais podem incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos de ocorrência natural e de não natural, aminoácidos química ou bioquímicamente modificados ou derivados e polipeptídeos com cadeias principais peptídicas modificadas. O termo inclui proteínas de fusão, inclusive, entre outras, proteínas de fusão com uma sequência heteróloga de aminoácidos, fusões com sequências líderes heterólogas e homólogas, resíduos de metionina com ou sem N-terminal; proteínas marcadas imunologicamente com tags (etiquetas); e os semelhantes.

[000109] Os termos "indivíduo”, "sujeito”, "hospedeiro" e "paciente"são usados alternadamente e se referem a qualquer indivíduo para o qual o diagnóstico, o tratamento ou a terapia é desejado, especialmente humano. Outros sujeitos podem incluir gado, cães, gatos, cobaias, coelhos, ratos, camundongos, cavalos e os semelhantes. Em algumas concretizações preferidas, o sujeito é um ser humano.

[000110] Neste relatório descritivo, o termo "amostra" refere-se ao material biológico de um paciente. A amostra analisada pela presente invenção não está limitada a qualquer tipo em particular. Amostras incluem, como exemplos não limitantes, células únicas, células múltiplas, tecidos tumores, líquidos biológicos, moléculas biológicas ou so- brenadantes ou extratos de qualquer um dos precedentes. Os exemplos incluem amostras de tecido removido por biopsia, tecido removido durante ressecção, sangue, urina, tecido linfático, líquido linfático, lí- quido cefalorraquidiano, mucosa e de fezes. A amostra usada variará com base no formato do ensaio, no método de detecção e na natureza dos tumores, tecidos, células ou extratos a serem analisados. Os métodos para preparar amostras são bem conhecidos na técnica e podem ser rapidamente adaptados a fim de ser obtida uma amostra que seja compatível com o método utilizado.

[000111] Neste relatório descritivo, o termo "molécula biológica" inclui, entre outras, de polipeptídeos, ácidos nucleicos e de sacarídeos.

[000112] Neste relatório descritivo, o termo "modular" refere-se a uma alteração na qualidade ou quantidade de um gene, proteína ou qualquer molécula que esteja dentro, fora ou sobre a superfície de uma célula. A alteração pode ser aumento ou diminuição em expressão ou nível da molécula. O termo "modula"também inclui alterar a qualidade ou quantidade de uma função biológica/atividade, inclusive, entre outras, a capacidade de diminuir os níveis sanguíneos de glicose, insulina, triglicerídeos ou de colesterol; reduzir os níveis de lipídios ou triglicerídeos no fígado; reduzir o peso corporal; e melhorar a tolerância à glicose, o gasto energético ou a sensibilidade à insulina.

[000113] Neste relatório descritivo, o termo "modulador" refere-se a uma composição que modula um ou mais eventos fisiológicos ou bioquímicos associados com um distúrbio associado ao FGF21, tal como diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2 ou uma condição metabólica do tipo obesidade. Os referidos eventos incluem, entre outros, a capacidade de diminuir os níveis sanguíneos de glicose, insulina, triglicerídeos ou de colesterol; reduzir os níveis de lipídios ou triglicerídeos no fígado; reduzir o peso corporal; e melhorar a tolerância à glicose, o gasto energético ou a sensibilidade à insulina.

[000114] "Produto gênico" é um produto biopolimérico que é expresso ou produzido por um gene. Um produto gênico pode ser, por exemplo, um RNA não submetido ao splicing, um mRNA, uma variante de splicing do mRNA, um polipeptídeo, um polipeptídeo modificado após a tradução, um polipeptídeo variante de splicing, etc. Este termo também abrange produtos biopoliméricos que são confeccionados usando um produto gênico de RNA como modelo (ou seja, cDNA do RNA). Um produto gênico pode ser confeccionado enzimaticamente, por recom- binação, quimicamente ou dentro de uma célula à qual o gene é nativo. Em algumas concretizações, se for proteináceo, o produto gênico exibe uma atividade biológica. Em algumas concretizações, se for um ácido nucleico, o produto gênico pode ser traduzido em um produto gênico proteináceo que exibe uma atividade biológica.

[000115] "Modulação da atividade de FGF21", neste relatório descritivo, refere-se a aumento ou diminuição em atividade do FGF21 que pode ser resultante, por exemplo, da interação de um agente com um polinucleotídeo ou polipeptídeo de FGF21, da inibição da transcrição e/ou tradução de FGF21 (por exemplo, através da interação antisense ou de siRNA com o gene do FGF21 do transcrito de FGF21, através da modulação de fatores de transcrição que facilitam a expressão de FGF21) e os semelhantes. Por exemplo, modulação de uma atividade biológica refere-se a aumento ou diminuição em uma atividade biológica. A atividade de FGF21 pode ser avaliada por meios que incluem, entre outros, analisar os níveis de glicose sanguínea, insulina, triglice- rídeos ou de colesterol em um indivíduo, avaliar os níveis do polipeptí- deo FGF21 ou avaliar os níveis de transcrição de FGF21. Comparações da atividade de FGF21 podem também ser realizadas, por exemplo, medindo-se os níveis de um biomarcador downstream do FGF21 e medindo aumentos na sinalização do FGF21. A atividade de FGF21 também pode ser avaliada medindo-se: a sinalização celular; a atividade de quinases; a captação de glicose em adipócitos; as oscilações dos níveis de insulina, triglicerídeos ou de colesterol no sangue; as alterações em níveis de lipídios ou de triglicerídeos no fígado; as intera- ções entre FGF21 e um receptor do FGF21; ou a fosforilação de um receptor do FGF21. Em algumas concretizações, a fosforilação de um receptor do FGF21 pode ser a fosforilação de tirosina. Em algumas concretizações, a modulação da atividade de FGF21 pode provocar a modulação de um fenótipo relacionado ao FGF21.

[000116] As comparações da atividade de FGF21 também podem ser realizadas, por exemplo, medindo-se os níveis de um biomarcador downstream do FGF21 e medindo os aumentos na sinalização de FGF21. A atividade de FGF21 também pode ser avaliada medindo-se: a sinalização celular; a atividade de quinases; a captação de glicose em adipócitos; as oscilações dos níveis de insulina, triglicerídeos ou de colesterol no sangue; as alterações em níveis de lipídios ou de triglice- rídeos no fígado; as interações entre FGF21 e um receptor (FGFR-1c, FGFR-2c ou FGFR-3c); ou a fosforilação de um receptor do FGF21. Em algumas concretizações a fosforilação de um receptor do FGF21 pode ser a fosforilação de tirosina. Em algumas concretizações, a modulação da atividade de FGF21 pode provocar a modulação de um fe- nótipo relacionado ao FGF21.

[000117] "Biomarcador downstream do FGF21", neste relatório descritivo,é um gene ou produto gênico, ou indícios mensuráveis de um gene ou de produto gênico. Em algumas concretizações, um gene ou atividade de que seja um marcador downstream do FGF21 exibe um nível alterado de expressão ou em um tecido vascular. Em algumas concretizações, uma atividade do marcador downstreamé alterada na presença de um modulador do FGF21. Em algumas concretizações, os marcadores downstream exibem níveis alterados de expressão quando o FGF21 é afetado com um modulador de FGF21 da presente invenção. Os marcadores downstream de FGF21 incluem, entre outros, a captação de glicose ou de 2-desoxi-glicose, pERK e outras proteínas fosforiladas ou acetiladas ou os níveis de NAD.

[000118] Neste relatório descritivo, o termo "regula positivamente" refere-se a um aumento, ativação ou estimulação de uma atividade ou quantidade. Por exemplo, no contexto da presente invenção, os modu- ladores de FGF21 podem aumentar a atividade de um receptor do FGF21. Em uma concretização, um ou mais de FGFR-1c, FGFR-2c ou FGFR-3c podem ser regulados positivamente em resposta a um mo- dulador do FGF21. Regulação positiva pode também se referir a uma atividade relacionada ao FGF21, tal como, por exemplo, a capacidade de diminuir os níveis sanguíneos de glicose, insulina, triglicerídeos ou de colesterol; reduzir o peso corporal; melhorar a tolerância à glicose, o gasto energético ou a sensibilidade à insulina; ou provocar a fosfori- lação de um receptor do FGF21; ou aumentar um marcador downstream do FGF21. O receptor FGFR21 pode ser um ou mais de FGFR-1c, FGFR-2c ou FGFR-3c. A regulação positiva pode ser de pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 250%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% quando comparada a um controle.

[000119] Neste relatório descritivo, o termo "terminação N" refere-se ao menos aos primeiros 20 aminoácidos de uma proteína.

[000120] Neste relatório descritivo, os termos "domínio N-terminal" e "região N-terminal"são usados alternadamente e se referem a um fragmento de uma proteína que inicia no primeiro aminoácido da proteína e termina em qualquer aminoácido na metade do N-terminal da proteína. Por exemplo, o domínio N-terminal de FGF21 é do aminoácido 1 da SEQ ID NO:1 a qualquer aminoácido entre os aminoácidos 10 e 105 da SEQ ID NO:1.

[000121] Neste relatório descritivo, o termo "terminação C" refere-se ao menos aos últimos 20 aminoácidos de uma proteína.

[000122] Neste relatório descritivo, os termos "domínio C-terminal" e "região C-terminal"são usados alternadamente e se referem a um fra- gmento de uma proteína que inicia em qualquer aminoácido na metade do C-terminal da proteína e termina no último aminoácido da proteína. Por exemplo, o domínio C-terminal do FGF21 inicia em qualquer aminoácido do aminoácido 105 a aproximadamente aminoácido 200 da SEQ ID NO:1 e termina no aminoácido 209 da SEQ ID NO:1.

[000123] O termo "domínio"neste relatório descritivo refere-se a uma parte estrutural de uma biomolécula que contribui para uma função conhecida ou suspeitada da biomolécula. Os domínios podem abrangerregiões ou partes destes e podem também incorporar uma parte de uma biomolécula que seja distinta de uma região em particular, além de toda ou parte daquela região.

[000124] Neste relatório descritivo, o termo "domínio de sinalização" (também chamado de "sequência de sinalização"ou "peptídeo de sinalização") refere-se a um domínio peptídico que se situa em um trechocontínuo de uma sequência de aminoácidos na região N-terminal de uma proteína precursora (frequentemente uma proteína ligada à membrana ou secretada) e está envolvido no transporte após a tradução da proteína. Em muitos casos, o domínio de sinalização é removido da proteína completa por peptidases especializadas em sinalização após o processo de separação ter sido concluído. Cada domínio de sinalização especifica um destinado específico na célula para a proteína precursora. O domínio de sinalização de FGF21 é representado pelos aminoácidos 1-28 da SEQ ID NO:1.

[000125] Neste relatório descritivo, o termo "domínio de ligação ao receptor" refere-se a qualquer parte ou região de uma proteína que contata uma proteína receptora ligada à membrana, resultando em uma resposta celular, tal como um evento de sinalização.

[000126] Neste relatório descritivo, o termo "domínio de ligação a li- gante" refere-se a qualquer parte ou região de uma proteína de fusão da invenção que retém ao menos uma atividade qualitativa de ligação de uma sequência nativa correspondente.

[000127] O termo "região"refere-se a uma parte fisicamente contígua da estrutura primária de uma biomolécula. No caso de proteínas, uma região é definida por uma parte contígua da sequência de amino- ácidos daquela proteína. Em algumas concretizações, uma "região" está associada com uma função da biomolécula.

[000128] O termo "fragmento" neste relatório descritivo refere-se a uma parte fisicamente contígua da estrutura primária de uma biomolé- cula. No caso de proteínas, uma parte é definida por uma parte contígua da sequência de aminoácidos daquela proteína, e este se refere ao menos a 3-5 aminoácidos, ao menos 8-10 aminoácidos, ao menos 11-15 aminoácidos, ao menos 17-24 aminoácidos, ao menos 25-30 aminoácidos e ao menos a 30-45 aminoácidos. No caso de oligonu- cleotídeos, uma parte é definida por uma parte contígua da sequência de ácido nucleico daquele oligonucleotídeo e se refere ao menos a 915 nucleotídeos, ao menos 18-30 nucleotídeos, ao menos 33-45 nu- cleotídeos, ao menos 48-72 nucleotídeos, ao menos 75-90 nucleotí- deos e ao menos a 90-130 nucleotídeos. Em algumas concretizações, partes de biomoléculas possuem uma atividade biológica. No contexto da presente invenção, fragmentos polipeptídicos do FGF21 não com-preendem a sequência polipeptídica inteira do FGF21 apresentada na SEQ ID NO:1.

[000129] Um polipeptídeo com "sequência nativa"é aquele que possui a mesma sequência de aminoácidos que um polipeptídeo derivado da natureza. Tais polipeptídeos com sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. Portanto, um polipeptídeo com sequência nativa pode ter a sequência de aminoácidos do polipeptídeo humano de ocorrência natural, do polipeptídeo murinho ou do polipeptídeo de qualquer outra espécie de mamífero.

[000130] Neste relatório descritivo, a expressão "sequência homóloga de nucleotídeos"ou "sequência homóloga de aminoácidos", ou suasvariações, refere-se a sequências caracterizadas por uma homolo- gia, em nível de núcleotídeo ou de aminoácido, de ao menos uma porcentagem especificada e é usada alternadamente com "identidade de sequência". Sequências homólogas de nucleotídeos incluem aquelas sequências que codificam isoformas de proteínas. Tais isoformas podem ser expressas em diferentes tecidos do mesmo organismo como resultado de, por exemplo, splicing alternativo de RNA. Alternativamente, as isoformas podem ser codificadas por genes diferentes. Sequências homólogas de nucleotídeos incluem sequências de nucleotí- deos que codificam uma proteína de outra espécie diferente da humana, inclusive, entre outras, de mamíferos. Sequências homólogas de nucleotídeos também incluem, entre outras, variações alélicas de ocorrência natural e mutações das sequências de nucleotídeos apresentadas neste relatório descritivo. Sequências homólogas de aminoácidos incluem aquelas sequências de aminoácidos que contêm substituições conservadoras de aminoácidos e cujos polipeptídeos possuem a mesma ligação e/ou atividade. Em algumas concretizações, uma se-quência de nucleotídeos ou de aminoácidos é homóloga se apresentar ao menos 60% ou mais até 99% de identidade com uma sequência comparadora. Em algumas concretizações, uma sequência de nucleo- tídeos ou de aminoácidos é homóloga se compartilhar uma ou mais, indo até 60, substituições, adições ou deleções de nucleotí- deos/aminoácidos com uma sequência comparadora. Em algumas concretizações, as sequências homólogas de aminoácidos possuem no máximo 5 ou no máximo 3 substituições conservadoras de aminoá- cidos.

[000131] O percentual de homologia ou de identidade pode ser determinado, por exemplo, pelo programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 do UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, Wl), usando configurações padrão, o qual emprega o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). Em algumas concretizações, a homologia entre a sonda e o alvo é entre aproximadamente 75% e aproximadamente 85%. Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos possuem nu- cleotídeos que são aproximadamente 95%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% e aproximadamente 100% homólogos à SEQ ID NO:2, ou a uma parte desta.

[000132] A homologia pode também ser em nível de peptídeo. Em algumas concretizações, os polipeptídeos constituintes das proteínas de fusão da invenção podem ser ao menos 95% homólogos às suas versões completas do tipo selvagem ou às sequências nativas correspondentes, ou a partes destas. O grau ou a porcentagem de identidade de proteínas de fusão da invenção, ou de partes destas, e sequências diferentes de aminoácidos é calculado como o número de acertos exatos em um alinhamento das duas sequências dividido pelo comprimento da "sequência da invenção"ou da "sequência estranha", o que for mais curto. O resultado é expresso em percentual de identidade.

[000133] Neste relatório descritivo, o termo "misturar" refere-se ao processo de combinar um ou mais compostos, células, moléculas e os semelhantes em conjunto na mesma área. A mistura pode ser realizada, por exemplo, em um tubo de teste, placa de Petri ou qualquer recipiente que permita que um ou mais compostos, células ou moléculas sejam misturados.

[000134] Neste relatório descritivo, o termo "substancialmente purificado" refere-se a um composto (por exemplo, um polinucleotídeo, po- lipeptídeo ou um anticorpo) que é removido de seu ambiente natural e que está livre em pelo menos 60%, livre em pelo menos 75% e livre em pelo menos 90% dos outros componentes com os quais está naturalmente associado.

[000135] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável"refere-se a um veículo para a administração de um agente terapêutico, tal como anticorpos ou um polipeptídeo, genes, e outros agentes terapêuticos. O termo refere-se a qualquer veículo farmacêutico que não induza por si mesmo a produção de anticorpos nocivos ao indivíduo que recebe a composição, e que possa ser administrado sem indevida toxicidade. Veículos adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de amino- ácidos, agregados lipídicos e partículas virais inativas. Tais veículos são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Veículos farmaceuti- camente aceitáveis em composições terapêuticas podem incluir líquidos, como água, solução salina, glicerol e etanol. Substâncias auxiliares, tais como agentes hidratantes ou emulsionantes, substâncias de tamponamento do pH e as semelhantes podem também estar presentes em tais veículos.

[000136] Melhoria da estabilidade física das proteínas de fusão da invenção

[000137] Ligações dissulfeto de ocorrência natural, conforme fornecidas por resíduos de cisteína, geralmente aumentam a estabilidade termodinâmica de proteínas. Exemplos bem-sucedidos de estabilidade termodinâmica aumentada, conforme medida em aumento da temperatura de fusão, são mutantes com múltiplas ligações dissulfeto das enzimas T4 lisozima (Matsumura et al., PNAS 86:6562-6566 (1989)) e barnase (Johnson et al., J. Mol. Biol. 268:198-208 (1997)). Um aspecto da presente invenção é uma melhoria da estabilidade física de FGF21 na presença de um conservante, conseguida pela presença de ligações dissulfeto dentro das variantes, o que restringe a flexibilidade do FGF21 do tipo selvagem e assim limita o acesso do conservante ao núcleo hidrofóbico da proteína.

[000138] O segundo aspecto da presente invenção, portanto, provê variantes do FGF21 humano, ou um peptídeo biologicamente ativo deste, com estabilidade farmacêutica reforçada gerada pela incorporação de ligações dissulfeto adicionais, por exemplo, através da incorporação ou substituição de resíduos de cisteína na proteína FGF21 do tipo selvagem ou no polipeptídeo ou variantes proteicas da invenção. O técnico na área reconhecerá que as cisteínas nativas, cisteína 103 e cisteína 121, poderiam ser utilizadas como lócus para introdução de uma nova ligação dissulfeto que pode transmitir propriedades melhoradas,além das concretizações sugeridas e descritas neste pedido de patente.

[000139] Estas incluem proteínas de fusão que incorporam o FGF-21 do tipo selvagem com a substituição de dois ou mais dos seguintes aminoácidos por cisteína: glutamina 46, arginina 47, tirosina 48, leuci- na 49, tirosina 50, treonina 51, aspartato 52, aspartato 53, alanina 54, glutamina 55, glutamina 56, treonina 57, glutamato 58, alanina 59, his- tidina 60, leucina 61, glutamato 62, isoleucina 63, valina 69, glicina 70, glicina 71, alanina 72, alanina 73, leucina 144, histidina 145, leucina 146, prolina 147, glicina 148, asparagina 149, lisina 150, serina 151, prolina 152, histidina 153, arginina 154, aspartato 155, prolina 156, alanina 157, prolina 158, arginina 159, glicina 160, prolina 161, alanina 162, arginina 163, fenilalanina 164, em que a numeração dos aminoá- cidos tem como base a sequência completa do hFGF21, SEQ ID NO:1, formada por 209 aminoácidos.

[000140] Além do mais, as proteínas de fusão da invenção que podem incorporar variantes do FGF21 humano do tipo selvagem, ou de um peptídeo biologicamente ativo deste, e aprimoradas com ligações dissulfeto construídas, além daquela de ocorrência natural em Cys103- Cys121, são como segue: Gln46Cys-Ala59Cys, Gln46Cys-His60Cys, Gln46Cys-Leu61Cys, Gln46Cys-Glu62Cys, Gln46Cys-lle63Cys, Arg47Cys-Ala59Cys, Arg47Cys-His60Cys, Arg47Cys-Leu61Cys, Arg47Cys-Glu62Cys, Arg47Cys-lle63Cys, Tyr48Cys-Ala59Cys, Tyr48Cys-His60Cys, Tyr48Cys-Leu61Cys, Tyr48Cys-Glu62Cys, Tyr48Cys-lle63Cys, Leu49Cys-Ala59Cys, Leu49Cys-His60Cys, Leu49Cys-Leu61Cys, Leu49Cys-Glu62Cys, Leu49Cys-lle63Cys, Tyr50Cys-Ala59Cys, Tyr50Cys-His60Cys, Tyr50Cys-Lue61Cys, Tyr50Cys-Glu62Cys, Tyr50Cys-lle63Cys, Leu144Cys-Gly160Cys, Leu144Cys-Pro161Cys, Leu144Cys-Ala162Cys, Leu144CysArg163Cys, Leu144Cys-Phe164Cys, His145Cys-Gly160Cys, His145Cys-Pro161Cys, His145Cys-Ala162Cys, His145Cys-Arg163Cys, His145Cys-Phe164Cys, Leu146Cys-Gly160Cys, Leu146CysPro161Cys, Leu146Cys-Ala162Cys, Leu146Cys-Arg163Cys, Leu146Cys-Phe164Cys, Pro147Cys-Gly160Cys, Pro147CysPro161Cys, Pro147Cys-Ala162Cys, Pro147Cys-Arg163Cys, Pro147Cys-Phe164Cys, Gly148Cys-Gly160Cys, Gly148CysPro161Cys, Gly148Cys-Ala162Cys, Gly148Cys-Arg163Cys, Gly148Cys-Phe164Cys, Thr57Cys-Val69Cys, Thr57Cys-Gly70Cys, Thr57Cys-Gly71Cys, Thr57Cys-Ala72Cys, Thr57Cys-Ala73Cys, Glu58Cys-Val69Cys, Glu58Cys-Glu70Cys, Glu58Cys-G71Cys, Glu58Cys-Ala72Cys, Glu58Cys-Ala73Cys, Ala59Cys-Val69Cys, Ala59Cys-Gly70Cys, Ala59Cys-Gly71Cys, Ala59Cys-Ala72Cys, Ala59Cys-Ala73Cys, His60Cys-Val69Cys, His60Cys-Gly70Cys, His60Cys-Gly71Cys, His60Cys-Ala72Cys, His60Cys-Ala73Cys, Leu61Cys-Val69Cys, Leu61Cys-Gly70Cys, Leu61Cys-Gly71Cys, Leu61Cys-Ala72Cys, Leu61Cys-Ala73Cys, Arg47Cys-Gly148Cys, Tyr48Cys-Gly148Cys, Leu49Cys-Gly148Cys, Tyr50Cys-Gly148Cys, Thr51Cys-Gly148Cys, Asp52Cys-Gly148Cys, Asp53Cys-Gly148Cys, Ala54Cys-Gly148Cys, Gln55Cys-Gly148Cys, Gln56Cys-Gly148Cys, Thr57Cys-Gly148Cys, Glu58Cys-Gly148Cys, Arg47Cys-Asn149Cys, Tyr48Cys-Asn149Cys, Leu49Cys-Asn149Cys, Tyr50Cys-Asn149Cys, Thr51Cys-Asn149Cys, Asp52Cys-Asn149Cys, Asp53Cys-Asn149Cys, Ala54Cys-Asn149Cys, Gln55Cys-Asn149Cys, Gln56Cys-Asn149Cys, Thr57Cys-Asn149Cys, Glu58Cys-Asn149Cys, Arg47Cys-Lys150Cys, Tyr48Cys-Lys150Cys, Leu49Cys-Lys150Cys, Tyr50Cys-Lys150Cys, Thr51Cys-Lys150Cys, Asp52Cys-Lys150Cys, Asp53Cys-Lys150Cys, Ala54Cys-Lys150Cys, Gln55Cys-Lys150Cys, Gln56Cys-Lys150Cys, Thr57Cys-Lys150Cys, Glu58Cys-Lys150Cys, Arg47Cys-Ser151Cys, Tyr48Cys-Ser151Cys, Leu49Cys-Ser151Cys, Tyr50Cys-Ser151Cys, Thr51Cys-Ser151Cys, Asp52Cys-Ser151Cys, Asp53Cys-Ser151Cys, Ala54Cys-Ser151Cys, Gln55Cys-Ser151Cys, Gln56Cys-Ser151Cys, Thr57Cys-Ser151Cys, Glu58Cys-Ser151Cys, Arg47Cys-Pro152Cys, Tyr48Cys-Pro152Cys, Leu49Cys-Pro152Cys, Tyr50Cys-Pro152Cys, Thr51Cys-Pro152Cys, Asp52Cys-Pro152Cys, Asp53Cys-Pro152Cys, Ala54Cys-Pro152Cys, Gln55Cys-Pro152Cys, Gln56Cys-Pro152Cys, Thr57Cys-Pro152Cys, Glu58Cys-Pro152Cys, Arg47Cys-His153Cys, Tyr48Cys-His153Cys, Leu49Cys-His153Cys, Tyr50Cys-His153Cys, Thr51Cys-His153Cys, Asp52Cys-His153Cys, Asp53Cys-His153Cys, Ala54Cys-His153Cys, Gln55Cys-His153Cys, Gln56Cys-His153Cys, Thr57Cys-His153Cys, Glu58Cys-His153Cys, Arg47Cys-Arg154Cys, Tyr48Cys-Arg154Cys, Leu49Cys-Arg154Cys, Tyr50Cys-Arg154Cys, Thr51Cys-Arg154Cys, Asp52Cys-Arg154Cys, Asp53Cys-Arg154Cys, Ala54Cys-Arg154Cys, Gln55Cys-Arg154Cys, Gln56Cys-Arg154Cys, Thr57Cys-Arg154Cys, Glu58Cys-Arg154Cys, Arg47Cys-Asp155Cys, Tyr48Cys-Asp155Cys, Leu49Cys-Asp155Cys, Tyr50Cys-Asp155Cys, Thr51Cys-Asp155Cys, Asp52Cys-Asp155Cys, Asp53Cys-Asp155Cys, Ala54Cys-Asp155Cys, Gln55Cys-Asp155Cys, Gln56Cys-Asp155Cys, Thr57Cys-Asp155Cys, Glu58Cys-Asp155Cys, Arg47Cys-Pro156Cys, Tyr48Cys-Pro156Cys, Leu49Cys-Pro156Cys, Tyr50Cys-Pro156Cys, Thr51Cys-Pro156Cys, Asp52Cys-Pro156Cys, Asp53Cys-Pro156Cys, Ala54Cys-Pro156Cys, Gln55Cys-Pro156Cys, Gln56Cys-Pro156Cys, Thr57Cys-Pro156Cys, Glu58Cys-Pro156Cys, Arg47Cys-Ala157Cys, Tyr48Cys-Ala157Cys, Leu49Cys-Ala157Cys, Tyr50Cys-Ala157Cys, Thr51Cys-Ala157Cys, Asp52Cys-Ala157Cys, Asp53Cys-Ala157Cys, Ala54Cys-Ala157Cys, Gln55Cys-Ala157Cys, Gln56Cys-Ala157Cys, Thr57Cys-Ala157Cys, Glu58Cys-Ala157Cys, Arg47Cys-Pro158Cys, Tyr48Cys-Pro158Cys, Leu49Cys-Pro158Cys, Tyr50Cys-Pro158Cys, Thr51Cys-Pro158Cys, Asp52Cys-Pro158Cys, Asp53Cys-Pro158Cys, Ala54Cys-Pro158Cys, Gln55Cys-Pro158Cys, Gln56Cys-Pro158Cys, Thr57Cys-Pro158Cys, Glu58Cys-Pro158Cys, Arg47Cys-Arg159Cys, Tyr48Cys-Arg159Cys, Leu49Cys-Arg159Cys, Tyr50Cys-Arg159Cys, Thr51Cys-Arg159Cys, Asp52Cys-Arg159Cys, Asp53Cys-Arg159Cys, Ala54Cys-Arg159Cys, Gln55Cys-Arg159Cys, Gln56Cys-Arg159Cys, Thr57Cys-Arg159Cys, Glu58Cys-Arg159Cys, Arg47Cys-G160Cys, Tyr48Cys-G160Cys, Leu49Cys-G160Cys, Tyr50Cys-Gly160Cys, Thr51Cys-Gly160Cys, Asp52Cys-Gly160Cys, Asp53Cys-Gly160Cys, Ala54Cys-Gly160Cys, Gln55Cys-Gly160Cys, Gln56Cys-Gly160Cys, Thr57Cys-Gly160Cys, Glu58Cys-Gly160Cys, Arg47Cys-Pro161Cys, Tyr48Cys-Pro161Cys, Leu49Cys-Pro161Cys, Tyr50Cys-Pro161Cys, Thr51Cys-Pro161Cys, Asp52Cys-Pro161Cys, Asp53Cys-Pro161Cys, Ala54Cys-Pro161Cys, Gln55Cys-Pro161Cys, Gln56Cys-Pro161Cys, Thr57Cys-Pro161Cys, Glu58Cys-Pro161Cys, Arg47Cys-Ala162Cys, Tyr48Cys-Ala162Cys, Leu49Cys-Ala162Cys, Tyr50Cys-Ala162Cys, Thr51Cys-Ala162Cys, Asp52Cys-Ala162Cys, Asp53Cys-Ala162Cys, Ala54Cys-Ala162Cys, Gln55Cys-Ala162Cys, Gln56Cys-Ala162Cys, Thr57Cys-Ala162Cys, Glu58Cys-Ala162Cys, Arg47Cys-Arg163Cys, Tyr48Cys-Arg163Cys, Leu49Cys-Arg163Cys, Tyr50Cys-Arg163Cys, Thr51Cys-Arg163Cys, Asp52Cys-Arg163Cys, Asp53Cys-Arg163Cys, Ala54Cys-Arg163Cys, Gln55Cys-Arg163Cys, Gln56Cys-Arg163Cys, Thr57Cys-Arg163Cys, Glu58Cys-Arg163Cys.

[000141] Outro aspecto da presente invenção provê proteínas de fusão que compreendem variantes do FGF21 humano do tipo selvagem, ou um peptídeo biologicamente ativo deste, contendo uma substituição de qualquer aminoácido com carga e/ou polar, porém sem carga, em quaisquer das posições de aminoácidos indicadas na primeira concretização da presente invenção, combinada com a substituição de uma cisteína em duas ou mais posições de aminoácidos indicadas na segundaconcretização da invenção.

[000142] Melhora das proteínas de fusão da invenção acima de proteínas comparadoras do tipo selvagem e suas variantes

[000143] É bem conhecido na técnica que um desafio considerável no desenvolvimento de substâncias farmacêuticas proteicas é lidar com as estabilidades física e química de proteínas. Este desafio é ainda mais evidente quando uma formulação farmacêutica de proteína é destinada para uma formulação injetável de uso múltiplo que requer uma solução estável, concentrada e conservada, ao mesmo tempo em que manter um perfil favorável de bioatividade. A caracterização biofísica do FGF21 do tipo selvagem na literatura estabeleceu que uma solução proteica concentrada (>5 mg/mL), quando exposta a condições de estresse, tais como alta temperatura ou baixo pH, leva à associação acelerada e agregação (ou seja, baixa estabilidade física e propriedades biofarmacêuticas). A exposição de uma solução proteica concentrada de FGF21 a conservantes farmacêuticos (por exemplo, m-cresol) também tem um impacto negativo sobre a estabilidade física.

[000144] Por conseguinte, uma concretização da presente invenção é reforçar a estabilidade física de soluções concentradas, enquanto mantendo a estabilidade química e a potência biológica, em condições fisiológicas e de formulação com conservantes. Acredita-se que a as- sociação e a agregação possam resultar de interações hidrofóbicas, pois a uma dada concentração proteica, a temperatura e a força iônica exercem impacto considerável sobre a estabilidade física. Na maioria das vezes, os alvos são resíduos de aminoácidos não conservados, supostamente expostos na superfície. O ambiente local destes resíduos foi analisado, e aqueles, não considerados estruturalmente importantes, foram selecionados para mutagênese. Um método para iniciaralterações específicas é diminuir ainda mais o pI da proteína pela introdução de resíduos de ácido glutâmico ("varredura de ácido glutâ- mico"). É postulado que a introdução de substitutos com carga inibiria a agregação de mediação hidrofóbica via a repulsão carga-carga e que potencialmente melhoraria a compatibilidade com o conservante. Adicionalmente, o técnico no assunto reconheceria também que, com grau suficiente de mutagênese, o pI poderia se desviaria para uma faixabásica de pH pela introdução de uma carga positiva sem ou com a diminuição concomitante em carga negativa, assim permitindo a repulsão carga-carga.

[000145] Uma dificuldade adicional associada com aplicações terapêuticas de FGF21 do tipo selvagem como agente bioterapêutico, por exemplo, é que sua meia-vida é muito curta in vivo (na ordem de 0,5 e 2 h, respectivamente, em camundongo e primata). Há, por conseguinte, necessidade de serem desenvolvidos compostos de seguimento que sejam mais eficazes, seja através de potência mais alta ou de meia-vida mais longa. As proteínas de fusão da invenção foram desenvolvidas como uma maneira para conseguir os efeitos desejáveis do tratamento com FGF21 a uma potência mais alta e em uma formulação de meia-vida ampliada.

[000146] Tal como descrito mais detalhadamente neste pedido de patente, a meia-vida das proteínas de fusão da invenção é superior a duas semanas no camundongo, quando comparada à meia-vida mais curta do FGF21 do tipo selvagem e à meia-vida de 17 horas da proteína de fusão Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) na Publicação PCT WO10/129600. As proteínas de fusão da invenção também demonstram meia-vida e propriedades farmacocinéticas melhoradas quando comparadas à V76 PEGuilada, conforme descritas neste pedido de patente e no Pedido de Patente US 61/415 476, depositado em 19 de novembro de 2010.

[000147] Além disso, as proteínas de fusão Fc-FGF21 da invenção a 1 mpk são mais eficazes do que V76 a 5 mpk em reduzir glicose, insulina, peso corporal e lipídio no fígado. Em um estudo do tratamento durante 12 dias em camundongos ob/ob, as proteínas de fusão mostraram as seguintes % de alterações em relação ao veículo (todas as fusões são administradas a 1,0 mg/kg, e V76 é administrada a 5,0 mg/kg): % de alteração em glicose total (AUC) em relação ao veículo: V76 igual a -42%; V101 igual a -53%, V103 igual a -46% e V188 igual a -42%; % de alteração em insulina plasmática total em relação ao veículo: V76 igual a -46%; V101 igual a -82%, V103 igual a -69% e V188 igual a -59%; % de alteração em peso corporal total em relação ao veículo: V76 igual a -7%; V101 igual a -12%, V103 igual a -12% e V188 igual a -11%; e % de alteração em lipídios totais no fígado em relação ao veículo: V76 igual a -30%; V101 igual a -44%, V103 igual a - 50% e V188 igual a -51%. Do mesmo modo, ensaios in vitro revelaram a mesma potência 5 vezes maior ou superior das proteínas de fusão da invenção acima de V76: No ensaio de pERK em adipócitos humanos (EC50 média ± SEM), o valor de V76 é 21 ± 2 nM (n=3); de V101 é 1,0 ± 0,1 nM (n=3), de V103 é 1,3 ± 0,2 nM (n=3) e de V188 é 1,4 ± 0,4 nM (n=3); No ensaio de pERK em HEK293 com β-klotho humano (EC50 média ± SEM), o valor de V76 é 13 ± 4 nM (n=5), de V101 é 0,60 ± 0,06 nM (n=5), de V103 é 0,9 ± 0,3 nM (n=5) e de V188 é 0,4 ± 0,1 nM (n=3); e No ensaio de captação de glicose em adipócitos de camundongos (EC50 média ± SEM), o valor de V76 é 5 ± 1 nM (n=3), de V101 é 0,60 ± 0,06 nM (n=3), de V103 é 0.60 ± 0.07 nM (n=3) e de V188 é 0,48 ± 0,14 nM (n=3).

[000148] Embora as concretizações da presente invenção digam respeito à estabilidade física e química em condições fisiológicas e de formulação com conservantes, manter a potência biológica das proteínas de fusão da invenção quando comparadas a, por exemplo, o FGF21 do tipo selvagem, é um importante fator de consideração também. Portanto, a potência biológica das proteínas da presente invenção é definida pela capacidade das proteínas de afetar a captação de glicose e/ou de reduzir os níveis plasmáticos de glicose, conforme aqui mostrado nos exemplos.

[000149] As proteínas, os polipeptídeos e/ou os peptídeos da invenção administrados de acordo com esta invenção podem ser gerados e/ou isolados por qualquer meio conhecido na técnica. O método mais preferido para produzir a variante é através de metodologias do DNA recombinante e é bem conhecido pelos técnicos no assunto. Tais métodosestão descritos em Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.), aqui incorporado por referência neste pedido de patente.

[000150] Adicionalmente, as concretizações preferidas incluem um peptídeo biologicamente ativo derivado da variante aqui descrita. Tal peptídeo conterá ao menos uma das substituições descritas e a vari- ante possuirá atividade biológica. O peptídeo pode ser produzido por todos e quaisquer meios conhecidos pelos técnicos no assunto, cujos exemplos incluem, entre outros, digestão enzimática, síntese química ou metodologias do DNA recombinante.

[000151] Na técnica, é estabelecido que fragmentos de peptídeos de certos fatores de crescimento de fibroblastos são biologicamente ativos. Ver, por exemplo, Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988) e J. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106 (1987). Consequentemente, a seleção de fragmentos ou peptídeos da variante baseia-se em critérios conhecidos na técnica. Por exemplo, sabe-se que a dipeptidil peptidase IV (DPP-IV ou DPP-4) é uma protease do tipo serina envolvida na inativação de neuropeptídios, peptídeos endócri- nos e citocinas (Damme et al., Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)). O N-terminal de FGF21 (HisProllePro) contém dois dipeptídeos que poderiam ser substratos para DPP-IV, resultando em um fragmento de FGF21 truncado no N-terminal por 4 aminoácidos. Inesperadamente, este fragmento de FGF21 do tipo selvagem demonstrou reter atividade biológica, sendo assim, proteínas da presente invenção truncadas no N-terminal em até 4 aminoácidos é uma concretização da presente invenção.

[000152] A invenção também abrange polinucleotídeos que codificam as variantes descritas acima, os quais podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA, em que DNA inclui cDNA, DNA genômico e DNA sintético. O DNA pode ser de dupla fita ou de fita simples. As sequências codificadoras que codificam as proteínas da presente invenção podem variar como resultado da redundância ou da degeneração do código genético.

[000153] Os polinucleotídeos que codificam as proteínas de fusão da invenção podem incluir os seguintes: somente a sequência codificadora da variante, a sequência codificadora da variante e sequência codi- ficadora adicional, tal como um polipeptídeo funcional ou uma sequêncialíder ou secretora ou uma sequência de pró-proteína; a sequência codificadora da variante e uma sequência não codificadora, tal como introns ou sequência 5' e/ou 3'não codificadora da sequência codificadora da variante. Por conseguinte, o termo "polinucleotídeo que codifica uma variante" abrande um polinucleotídeo que pode incluir não só a sequência codificadora da variante, mas também um polinucleotídeo que inclua uma sequência adicional codificadora e/ou não codificadora.

[000154] A invenção refere-se ainda às variantes dos polinucleotí- deos descritos que codificam fragmentos, análogos e derivados do po- lipeptídeo que contenham as substituições indicadas. A variante do polinucleotídeo pode ser uma variante alélica de ocorrência natural da sequência do FGF21 humano, uma variante que não seja de ocorrência natural ou uma variante truncada conforme descrito acima. Por conseguinte, a presente invenção também inclui polinucleotídeos que codificam as variantes descritas acima, bem como variantes de tais polinucleotídeos, cujas variantes codificam um fragmento, derivado ou análogo da variante descrita. Tais variantes de nucleotídeos incluem variantes de deleção, variantes de substituição, variantes truncadas e variantes de adição ou inserção, desde que ao menos uma das substituições indicadas de aminoácidos da primeira ou da segunda concretização esteja presente.

[000155] Os polinucleotídeos da invenção serão expressos em hospedeiros depois que as sequências tiverem sido operacionalmente ligadas a uma sequência de controle de expressão (ou seja, posicionadas de modo a assegurar o seu funcionamento). Esses vetores de expressão são tipicamente capazes de replicação nos organismos hospedeiros, seja como epissomos ou como parte integrante do DNA cromossômico do hospedeiro. De modo comum, os vetores de expres- são conterão marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina, neo- micina e dihidrofolato redutase, para permitir a detecção daquelas células transformadas com as sequências desejadas de DNA. A variante de FGF21 pode ser expressa em células de mamíferos, insetos, leveduras, bacterianas ou outras células sob o controle de promotores apropriados. Sistemas de tradução livre em células podem também ser empregados para produzir tais proteínas que fazem uso de RNAs derivados de construções de DNA da presente invenção.

[000156] E. colié um hospedeiro procariótico especialmente útil para a clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem Bacillus subtilus, Salmonella typhimurium e várias espécies de Serratia, Pseudomonas, Streptococcus e Staphylococcus, embora outros possam também ser empregados como matéria de escolha. Nesses hospedeiros procarióti- cos, é possível também produzir vetores de expressão, os quais conterão tipicamente sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Adicionalmente, qualquer um de uma série de promotores bem conhecidos pode estar presente, tal como sistema promotor de lactose, sistema promotor de triptofano (Trp), sistema promotor de beta-lactamase ou sistema promotor derivados de fagos lambda ou T7. Os promotores controlarão tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e terão sequências de sítios de ligação a ribosso- mos e as semelhantes, para dar início e concluir a transcrição e a tradução.

[000157] O técnico no assunto da expressão de proteínas reconhecerá que a sequência de metionina ou de metionina-arginina pode ser introduzida no N-terminal da sequência madura (SEQ ID NO: 3) para expressão em E. coli e estas são contempladas dentro do contexto desta invenção. Por conseguinte, a menos que observado de outra forma, as proteínas da presente invenção expressas em E. colipossuem uma sequência de metionina introduzida no N-terminal.

[000158] Outros micróbios, como leveduras ou fungos, podem também ser usados para expressão. Pichia pastoris, Saccharomyces ce- revisiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia angustasão exemplos de hospedeiros preferidos do tipo levedura, com vetores adequados contendo sequências de controle de expressão, tais como promotores, inclusive de 3-fosfoglicerato quinase ou de outras enzimas glicolíticas, e uma origem de replicação, sequências de terminação e os semelhantes conforme desejado. Aspergillus niger, Trichoderma reesei e Schizophyllum communesão exemplos de hospedeiros do tipo fungo, embora outros possam ser empregados como matéria de escolha.

[000159] A cultura celular de tecidos de mamíferos pode também ser utilizada para expressar e produzir os polipeptídeos da presente invenção. Células eucarióticas são atualmente preferidas pelo fato de uma série de linhagens de células hospedeiras adequadas capazes de secretar variantes intactas ter sido desenvolvida, e estas incluem linhagens de células CHO, várias linhagens de células COS, células NSO, linhagens de células do ovário do hamster sírio, células HeLa ou linhagens de células renais embrionárias humanas (ou seja, HEK293, HEK293EBNA).

[000160] Os vetores de expressão para estas células podem incluir sequências de controle de expressão, tal como uma origem de replica- ção, um promotor, um intensificador, e os sítios necessários para o processamento de informações, tais como sítios de ligação a ribosso- mos, sítios de splicing do RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras da transcrição. Sequências preferidas de controle de expressão são promotores derivados de SV40, adenovírus, vírus do pa- piloma bovino, citomegalovírus, vírus do sarcoma de Raus e os semelhantes.Sítios preferidos de poliadenilação incluem sequências deri- vadas de SV40 e do hormônio de crescimento bovino.

[000161] Os vetores contendo as sequências polinucleotídicas de interesse (por exemplo, as proteínas de fusão da invenção e sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conhecidos, os quais variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção mediada por cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, ao passo que o tratamento com fosfato de cálcio ou a eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares.

[000162] Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) e Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, SpringerVerlag, NY (1982). As etapas selecionadas da purificação dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção usado para as proteínas de fusão da invenção.

[000163] As proteínas, os polipeptídeos e/ou os peptídeos da invenção, por exemplo, as proteínas de fusão de atividade dupla da invenção, devem ser formuladas e administradas de maneira compatível com as boas práticas médicas, levando em consideração a condição clínica do paciente, o sítio de liberação das composições de proteínas, o modo de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos por praticantes. A "quantidade terapeuticamente eficaz" das proteínas de fusão da invenção para fins do presente é assim determinada por tais considerações.

[000164] As composições farmacêuticas as proteínas da presente invenção podem ser administradas por quaisquer meios que atinjam o objetivo em geral pretendido: tratar diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, obesidade, síndrome metabólica ou pacientes criticamente enfermos. Meios não limitantes permitidos de administração incluem, por exem- plo, por inalação ou supositório ou para o tecido mucoso, tal como por lavagem ao tecido vaginal, retal, uretral, bucal e sublingual, por via oral, nasal, tópica, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intraesternal, por injeção intra-articular, intralinfática, intersticial, intra-arterial, subcutânea, intrassinovial, transepitelial e transdérmica. Em algumas concretizações, as composições farmacêuticassão administradas por lavagem, via oral ou intra-arterial. Outros modos adequados de introdução podem também incluir dispositivos recarregáveis ou biodegradáveis e dispositivos poliméricos para liberação lenta ou sustentada. As composições farmacêuticas desta invenção podem também ser administradas como parte de uma terapia combinada com outros agentes metabólicos conhecidos.

[000165] A dose administrada dependerá da idade, da saúde e do peso do receptor, do tipo de tratamento concomitante, se houver, da frequência do tratamento e da natureza do efeito desejado. Composições abrangidas pelo âmbito da invenção incluem todas as composições em que uma variante do FGF21 está presente em uma quantidade que seja eficaz para alcançar o efeito médico desejado no tratamento de diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2, obesidade ou de síndrome metabólica. Apesar de necessidades individuais poderem variar de um paciente para outro, a determinação das faixas ideais de quantidades eficazes de todos os componentes está ao alcance da capacidade do clínico com competência comum.

[000166] As proteínas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos para preparar composições far- maceuticamente úteis. Uma formulação desejada seria aquela que é um produto liofilizado estável que é reconstituído com um diluente apropriado ou uma solução aquosa de alta pureza com veículos far- maceuticamente aceitáveis opcionais, conservantes, excipientes ou estabilizantes [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16aedição (1980)]. As proteínas da presente invenção podem ser combinadas com um tampão farmaceuticamente aceitável, e o pH ajustado para proporcionar estabilidade aceitável e um pH aceitável para administração.

[000167] Para administração parenteral, em uma concretização, as proteínas de fusão da invenção são formuladas geralmente misturando-se uma ou mais destas no grau desejado de pureza, em uma forma injetável de dose unitária (solução, suspensão ou emulsão), com um veículo farmaceuticamente aceitável, ou seja, aquele que não é tóxico para os receptores nas doses e concentrações empregadas e que seja compatível com outros ingredientes da formulação. De preferência, um ou mais agentes antimicrobianos farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados. Fenol, m-cresol e álcool benzílico são agentes microbianos farmaceuticamente aceitáveis preferidos.

[000168] Opcionalmente, um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados para ajustar a força iônica ou a tonicidade. Um ou mais excipientes podem ser adicionados para ajustar ainda mais a isotonicidade da formulação. Glicerina, cloreto de sódio e mani- tol são exemplos de excipiente para ajuste da isotonicidade.

[000169] Os técnicos na área podem rapidamente aperfeiçoar as doses farmaceuticamente eficazes e os esquemas de administração para as composições terapêuticas que compreendem as proteínas da invenção, conforme determinados pelas boas práticas médicas e a condição clínica individual do paciente. Uma faixa típica da dose para as proteínas da presente invenção variará de aproximadamente 0,01 mg por dia a aproximadamente 1000 mg por dia (ou de aproximadamente 0,05 mg por semana a aproximadamente 5000 mg por semana, administrados uma vez por semana) para um adulto. De preferência, as faixas da dose variam de aproximadamente 0,1 mg por dia a aproximadamente 100 mg por dia (ou de aproximadamente 0,5 mg por semana a aproximadamente 500 mg por semana, administrados uma vez por semana), mais preferivelmente de aproximadamente 1,0 mg/dia a aproximadamente 10 mg/dia (ou de aproximadamente 5 mg por semana a aproximadamente 50 mg por semana, administrados uma vez por semana). Mais preferivelmente, a dose é de aproximadamente 1-5 mg/dia (ou de aproximadamente 5 mg por semana a aproximadamente 25 mg por semana, administrados uma vez por semana). A dose apropriada de uma variante de FGF21 administrada resultará em redução dos níveis sanguíneos de glicose e aumento do gasto energético pela utilização mais rápida e mais eficiente da glicose e, pelo qual, é útil para tratar diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, obesidade e síndrome metabólica.

[000170] Além disso, pelo fato de hiperglicemia e resistência à insulina serem comuns em pacientes criticamente enfermos a quem é fornecido suporte nutricional, algumas unidades de tratamento intensivo administram insulina para hiperglicemia excessiva em pacientes criticamente enfermos alimentados. De fato, estudos recentes documentam o uso de insulina exógena para manter a glicose sanguínea em um nível de no máximo 110 mg por decilitro e reduzir a morbidade e a mortalidade entre pacientes criticamente enfermos na unidade de tratamento intensivo cirúrgico, independentemente de apresentarem ou não histórico de diabetes (Van den Berghe et al., N Engl J Med., 345(19):1359, (2001)). Dessa forma, as proteínas da presente invenção são adequadas de modo único para ajudar a restaurar a estabili-dademetabólica em pacientes criticamente enfermos instáveis meta- bolicamente. Proteínas da invenção, tais como aquelas que contêm variantes de FGF21, são únicas no sentido de que estimulam a captação de glicose e melhoram a sensibilidade à insulina, porém não induzem hipoglicemia.

[000171] Em outro aspecto da presente invenção, é contemplado o uso de proteínas da invenção como medicamento para o tratamento de obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipide- mia, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteatohepati- te não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, infarto agudo do miocárdio, condições associadas com mutações inativadoras graves no receptor da insulina e de outros distúrbios metabólicos.

Mutantes em sítio-específico de FGF21

[000172] Em algumas concretizações, as proteínas de fusão da invenção incluem mutantes adicionais de FGF21 ou análogos de FGF21 com aminoácidos não naturais.

[000173] Em algumas concretizações, as proteínas de fusão da invenção compreendem agonistas do FGF21 com uma ou mais das se-guintesmodificações adicionais do FGF21 do tipo selvagem: dissulfetos adicionais, aminoácidos não naturais ou modificações para promover a dimerização, tais como a formação de um dissulfeto em R154C ou a introdução de uma cisteína em outro sítio, a dimerização através de um domínio Fc fundido ou a formação de dí- meros através de um reticulante como um PEG bifuncional; fragmentos de FGF21; proteínas selecionadas para terem atividade de FGF21 (ligação ao beta-klotho e ligação e ativação de seus FGFR); e um anticorpo mimético do FGF21 (de vários formatos como Fab, unibody, svFc, etc.).

[000174] Em algumas concretizações, as proteínas de fusão da invenção compreendem um ou mais dos seguintes ligantes: ligação simples de amida, peptídeos curtos (especialmente repetições Ser/Gly), resíduos adicionais da sequência traduzida do FGF21 ou um ligante maior até uma proteína inteira (tal como um domínio Fc, um feixe em hélice de ligação à HSA, HSA, etc.). Os dois grupos podem também ser ligados por outros meios químicos, tais como através de aminoácidos não naturais ou ligantes químicos do tipo padrão (malei- mida-Cys, NHS-Lys, click, etc.)

[000175] Outras concretizações da invenção incluem, entre outros, os seguintes acoplamentos para ampliação da meia-vida: lipídio de ligação à HSA ou pequena molécula ou micela para a versão mono- mérica ou dimérica da fusão.

[000176] Em certas concretizações da invenção, outros acoplamentos podem ser efetuados a proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos da invenção, para conseguir ampliar a meia-vida e para outras propriedadesbiológicas melhoradas. Estes podem incluir anexar conjugados PEG-colesterol (incluindo micelas e lipossomos) a proteínas, polipeptí- deos e/ou peptídeos da invenção, e/ou anexar açúcares (glicosilato) às proteínas, aos polipeptídeos e/ou aos peptídeos da invenção. Em ainda outras concretizações, técnicas semelhantes são empregadas para adicionar conjugados de, por exemplo, ácido polisiálico (PSA), hidroxi- etil amido (HES), ligantes de ligação à albumina ou carboidratos como escudo às proteínas, aos polipeptídeos e/ou aos peptídeos.

[000177] A técnica de HESilação, por exemplo, acopla cadeias de hidroxietil amido (HES) (60 kDa ou 100 kDa, fragmentos de amilopec- tina altamente reamificados derivados de amido de milho) a uma proteína, polipeptídeos e/ou peptídeos via alquilação redutora. A polisiala- ção conjuga proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos de interesse com polímeros de ácido polisilálico (PSA) de maneira semelhante à PEGui- lação. Polímeros de PSA são polímeros não imunogênicos com carga negative que ocorrem naturalmente no corpo e estão disponíveis em pesos moleculares de 10-50 kD.

[000178] Em ainda outras concretizações da invenção, outras ligações ou modificações podem ser efetuadas a proteínas, polipeptídeos e/ou peptídeos da invenção para conseguir ampliar a meia-vida e ou- tras propriedades biológicas melhoradas. Estas incluem a criação de grupos PEG recombinantes (rPEG) e sua ligação às proteínas, aos polipeptídeos e/ou aos peptídeos da invenção. Assim como desenvolvida pela empresa Amunix, Inc., a tecnologia rPEG tem como base sequências proteicas com propriedades semelhantes ao PEG que são geneticamente fundidas a substâncias biofarmacêutias, evitando a etapa extra de conjugação química. rPEGs são construções de exena- tida de meia-vida ampliada e contêm uma cauda longa não estrutura de aminoácidos hidrofílicos e que são capazes de aumentar a meia- vida sérica de uma proteína ou peptídeo e tornar mais lenta sua taxa de absorção, pelo qual reduzem significativamente a razão pico-vale. rPEGs possuem um raio hidrodinâmico aumentado e mostram uma massa molar aparente que é aproximadamente 15 vezes mais sua massa molar real, mimetizando a maneira pela qual a PEGuilação alcança uma meia-vida sérica longa.

Polipeptídeos FGF21 truncados

[000179] Uma concretização da presente invenção é direcionada a formas truncadas do polipeptídeo FGF21 maduro (SEQ ID NO:3). Esta concretização da presente invenção surgiu de uma tentativa para identificarpolipeptídeos FGF21 truncados que fossem capazes de fornecer uma atividade semelhante e, em alguns casos, superior às formas não truncadas do polipeptídeo maduro de FGF21.

[000180] Neste relatório descritivo, o termo "polipeptídeo FGF21 truncado" refere-se a um polipeptídeo FGF21 no qual os resíduos de aminoácidos foram removidos da extremidade amino-terminal (ou N- terminal) do polipeptídeo FGF21, resíduos de aminoácido foram removidos da extremidade carboxila-terminal (ou C-terminal) do polipeptí- deo FGF21 ou resíduos de aminoácidos foram removidos nas extremidades amino-terminal e carboxila-terminal do polipeptídeo FGF21. Os vários truncamentos aqui descritos foram preparados de acordo com a descrição neste pedido de patente.

[000181] É possível avaliar a atividade de polipeptídeos FGF21 truncados em N-terminal e de polipeptídeos FGF21 truncados em C- terminal utilizando um ensaio in vitro de fosfo-ERK. Detalhes específicos dos ensaios in vitro que podem ser usados para examinar a atividade de polipeptídeos FGF21 truncados podem ser encontrados nos exemplos.

[000182] A atividade dos polipeptídeos FGF21 truncados da presente invenção pode também ser avaliada em um ensaio in vivo, tal como em camundongos ob/ob. Em geral, para avaliar a sua atividade in vivo, o polipeptídeo FGF21 truncado é administrado a um animal de teste por via intraperitoneal. Depois de um período desejado de incubação (por exemplo, uma hora ou mais), uma amostra de sangue pode ser coletada, e os níveis sanguíneos de glicose podem ser medidos.

Truncamentos no N-terminal

[000183] Em algumas concretizações da presente invenção, os truncamentos no N-terminal compreendem 1,2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos da extremidade N-terminal do polipeptídeo FGF21 maduro. Polipeptídeos FGF21 truncados tendo truncamentos inferiores a 9 resíduos de aminoácidos retêm a capacidade do polipeptídeo maduro de FGF21 para diminuir a glicose sanguínea em um indivíduo. Dessa forma, em concretizações específicas, a presente invenção abrange formas truncadas do polipeptídeo FGF21 maduro ou variantes proteicas do FGF21 tendo truncamentos no N-terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos.

b. Truncamentos no C-Terminal

[000184] Em algumas concretizações da presente invenção, os truncamentos no C-terminal compreendem 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoácidos da extremidade C-terminal do polipeptí- deo FGF21 maduro. Polipeptídeos FGF21 truncados com truncamen- tos no C-terminal que eram inferiores a 13 resíduos de aminoácidos exibiram uma eficácia pelo menos 50% daquela do FGF21 do tipo selvagem em um ensaio in vitro de ELK-luciferase (Yie J. et al., FEBS Letts 583:19-24 (2009)), indicando que estes FGF21 mutantes retêm a capacidade do polipeptídeo FGF21 maduro para reduzir a glicose sanguínea em um indivíduo. Dessa forma, em concretizações específicas, a presente invenção abrange formas truncadas do polipeptídeo FGF21 maduro ou de variantes proteicas do FGF21 com truncamentos no C- terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoáci- dos.

c. Truncamentos no N-terminal e no C-terminal

[000185] Em algumas concretizações da presente invenção, polipep- tídeos FGF21 truncados podem ter uma combinação de truncamentos no N-terminal e no C-terminal. Os polipeptídeos FGF21 truncados que exibem truncamentos combinados em N-terminal e em C-terminal compartilham a atividade dos polipeptídeos FGF21 truncados correspondentes que apresentam truncamentos apenas no N-terminal ou no C-terminal. Em outras palavras, polipeptídeos FGF21 truncados tendo truncamentos no N-terminal inferiores a 9 resíduos de aminoácidos e truncamentos no C-terminal inferiores a 13 resíduos de 13 aminoáci- dos possuem atividade semelhante ou maior de redução da glicose sanguínea que polipeptídeos FGF21 truncados tendo truncamentos no N-terminal inferiores a 9 resíduos ou que polipeptídeos FGF21 truncados tendo truncamentos no C-terminal inferiores a 13 resíduos de ami- noácidos. Dessa forma, em concretizações específicas, a presente in-venção abrange formas truncadas do polipeptídeo FGF21 maduro ou de variantes proteicas do FGF21 tendo truncamentos no N-terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos e truncamentos no C- terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoáci- dos.

[000186] Tal como com todas as variantes de FGF21 da presente invenção, os polipeptídeos FGF21 truncados podem opcionalmente compreender um resíduo de metionina no amino-terminal, o qual pode ser introduzido por mutação direta ou como resultado de um processo de expressão bacteriana.

[000187] Os polipeptídeos FGF21 truncados da presente invenção podem ser preparados conforme descrito nos exemplos apresentados abaixo. Os técnicos no assunto, familiarizados com técnicas padrão de biologia molecular, podem empregar esse conhecimento, acoplado a esta invenção, para produzir e usar os polipeptídeos FGF21 truncados da presente invenção. Técnicas padrão podem ser utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, cultura de tecidos e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente para quaisquer fins. Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações dos fabricantes, conforme comumente executado na técnica ou conforme aqui descrito. A menos que sejam fornecidas definições especí-ficas, as nomenclaturas utilizadas em conexão, além dos procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica, descritos neste pedido de patente, são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Técnicas-padrão podem ser utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, para o preparo farmacêutico, formulação e liberação e tratamento de pacientes.

[000188] Os polipeptídeos FGF21 truncados da presente invenção podem também ser fundidos a outra entidade, as quais podem transmitir propriedades adicionais ao polipeptídeo FGF21 truncado. Em uma concretização da presente invenção, um polipeptídeo FGF21 truncado pode ser fundido a um domínio constante de IgG ou seu fragmento (por exemplo, a região Fc), à albumina sérica humana (HSA) ou a polipeptídeos que se ligam à albumina. Tal fusão pode ser realizada utilizando métodos conhecidos de biologia molecular e/ou a orientação fornecida neste relatório descritivo. Os benefícios de tais poli- peptídeos de fusão, bem como métodos para produzir tais polipeptí- deos de fusão, são discutidos mais detalhadamente a seguir.

Proteínas de fusão de FGF21

[000189] Neste relatório descritivo, o termo "polipeptídeo de fusão de FGF21" ou "proteína de fusão de FGF21" refere-se a uma fusão de um ou mais resíduos de aminoácidos (tais como uma proteína ou peptídeo heterólogo) no N-terminal ou no C-terminal de qualquer variante proteica do FGF21 descrita neste pedido de patente.

[000190] As proteínas de fusão de FGF21 podem ser produzidas fundindo sequências heterólogas na terminação N ou na terminação C de, por exemplo, uma variante da proteína FGF21, conforme aqui definida. Neste relatório descritivo, uma sequência heteróloga pode ser uma sequência de aminoácidos ou um polímero não contendo amino- ácidos. As sequências heterólogas podem ser fundidas diretamente à variante da proteína FGF21 ou através de um ligante ou uma molécula adaptadora. Um ligante ou molécula adaptadora pode ser um ou mais resíduos de aminoácidos (ou ímeros), por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos (ou ímeros), de preferência de 10 a 50 resíduos de ami- noácidos (ou ímeros), por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 resíduos (ou ímeros), e mais preferi-velmente de 15 a 35 resíduos de aminoácidos (ou ímeros). Um ligante ou molécula adaptadora também pode ser desenhado com um sítio de clivagem para uma endonuclease de restrição do DNA ou para uma protease e permitir a separação dos grupos fundidos.

[000191] Peptídeos e polipeptídeos heterólogos incluem, entre ou- tros, um epítopo para permitir a detecção e/ou o isolamento de uma variante da proteína FGF21; uma proteína receptora transmembrana ou uma parte desta, tal como um domínio extracelular ou um domínio transmembrana e intracelular; um ligante ou uma parte deste que se liga a uma proteína receptora transmembrana; uma enzima ou parte desta com atividade catalítica; um polipeptídeo ou peptídeo que promove a oligomerização, tal como um domínio zíper de leucina; um po- lipeptídeo ou peptídeo que aumenta a estabilidade, tal como uma região constante de imunoglobulina; um anticorpo funcional ou não funcional ou uma de suas cadeias pesadas ou leves; e um polipeptídeo que possui uma atividade, tal como uma atividade terapêutica, diferente das variantes da proteína FGF21 da presente invenção. A presente invenção também abrange FGF21 mutantes fundidos à albumina séri- ca humana (HSA).

Fusões de Fc

[000192] Em uma concretização da presente invenção, uma variante da proteína FGF21 é fundida a um ou mais domínios de uma região Fc de IgG humana. Os anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável conhecido como "Fab", que liga um antígeno, e um domínio constante conhecido como "Fc", que está envolvido em funções efetoras tais como ativação do complemento e ataque por células fagocitárias. Um Fc possui uma meia-vida séri- ca longa, ao passo que um Fab é de vida curta (Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31). Quando unido a uma proteína terapêutica, um domínio Fc pode prolongar a meia-vida ou incorporar tais funções como ligação ao receptor Fc, ligação à proteína A, fixação do complemento e talvez mesmo transferência placentária (Capon et al., 1989).

[000193] Por todo este relatório descritivo, Fc-FGF21 refere-se a uma proteína de fusão na qual a sequência de Fc está fundida ao N- terminal de FGF21. Do mesmo modo, por todo o relatório descritivo, FGF21-Fc refere-se a uma proteína de fusão na qual a sequência de Fc está fundida ao C-terminal de FGF21.

[000194] Concretizações preferidas da invenção são proteínas de fusão Fc-FGF21 que compreendem variantes de FGF21 conforme aqui descritas. Concretizações especialmente preferidas são proteínas de fusão Fc-FGF21 que compreendem um fragmento Fc modificado (por exemplo, FcLALA) e variantes de FGF21 conforme aqui descritas.

[000195] A proteína de fusão pode ser purificada, por exemplo, pelo uso de uma coluna de afinidade pela proteína A. Peptídeos e proteínas fundidos a uma região Fc demonstraram exibir uma meia-vida significativamente maior in vivo do que homólogos não fundidos. Adicionalmente, uma fusão a uma região Fc permite a dimeriza- ção/multimerização do polipeptídeo de fusão. A região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural ou pode ser alterada para melhorar certas qualidades, tais como qualidades terapêuticas, tempo de circulação ou agregação reduzida.

[000196] Modificações úteis de agentes terapêuticos proteicos por fusão com o domínio "Fc" de um anticorpo são discutidas detalhadamente na Publicação PCT No WO 00/024782.

[000197] Este documento discute a ligação a um “veículo” tal como polietilenoglicol (PEG), dextrano ou uma região Fc.

b. Ligantes de proteínas de fusão

[000198] Na formação das proteínas de fusão da presente invenção, um ligante pode, mas não precisa ser empregado. Quando presente, a estrutura química do ligante pode não ser crítica, visto que serve primariamente como espaçador. O ligante pode ser constituído por ami- noácidos unidos por ligações peptídicas. Em algumas concretizações da presente invenção, o ligante é constituído por 1 a 20 aminoácidos unidos por ligações peptídicas, em que os aminoácidos são selecionados a partir dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em várias con- cretizações, o 1 a 20 aminoácidos são selecionados a partir dos ami- noácidos glicina, serina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Em algumas concretizações, um ligante é constituído por, na maioria,aminoácidos sem impedimento estereoquímico, tais como glicina e alanina. Em algumas concretizações, os ligantees são poliglicinas, po- lialaninas, combinações de glicina e alanina (tais como poli(Gly-Ala)) ou combinações de glicina e serina (tais como poli(Gly-Ser)). Embora tenha sido constatado que um ligante de 15 resíduos de aminoácidos opere especialmente bem para proteínas de fusão de FGF21, a presente invenção contempla ligantes de qualquer comprimento ou composição.

[000199] Os ligantes aqui descritos são exemplares, e ligantes muito mais longos e que incluem outros resíduos são contemplados pela presente invenção. Ligantes não peptídicos são também contemplados pela presente invenção. Por exemplo, ligantees formados por alquila podem ser utilizados. Estes ligantes de alquila podem estar ainda substituídos com um grupo sem impedimento estereoquímico, inclusive, entre outros, alquila inferior (por exemplo, C1-C6), acila inferior, halogênio (por exemplo, CI, Br), CN, NH2 ou fenila. Um ligante não peptídico exemplar é um ligante de polietilenoglicol, em que o ligante possui peso molecular de 100 a 5000 kD, por exemplo, 100 a 500 kD.

Proteínas de fusão modificadas quimicamente

[000200] Formas modificadas quimicamente das proteínas de fusão aqui descritas, inclusive, por exemplo, formas truncadas e variantes das fusões de FGF21 aqui descritas, podem ser preparadas pelo técnico no assunto, dada às descrições aqui contidas. Tais proteínas de fusão modificadas quimicamente são alteradas de tal modo que o mutante modificado quimicamente seja diferente do mutante não modificado, quer no tipo ou na localização das moléculas naturalmente ligadas ao mutante. Mutantes modificados quimicamente podem incluir moléculas formadas pela deleção de um ou mais grupos químicos ligados naturalmente.

[000201] Em uma concretização, proteínas da presente invenção podem ser modificadas pela ligação covalente de um ou mais polímeros. Por exemplo, o polímero selecionado é tipicamente solúvel em água de modo que a proteína à qual está ligado não precipita em ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. No âmbito de polímeros adequados, está incluída uma mistura de polímeros. De preferência, para uso terapêutico do preparado do produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. Polímeros não solúveis em água conjugados a proteínas da presente invenção também formam um aspecto da invenção.

[000202] Polímeros exemplares podem ser cada um de qualquer peso molecular e podem ser ramificados ou não. Os polímeros possuem tipicamente peso molecular médio individual entre aproximadamente 2 kDa e aproximadamente 100 kDa (o termo "aproximadamente"indicando que em preparados de um polímero solúvel em água, algumas moléculas pesarão mais e outras menos do que o peso molecular declarado). O peso molecular médio de cada polímero é preferivelmente entre aproximadamente 5 kDa e aproximadamente 50 kDa, mais preferivelmente entre aproximadamente 12 kDa e aproximadamente 40 kDa e, o mais preferível, entre aproximadamente 20 kDa e aproximadamente 35 kDa.

[000203] Polímeros adequados solúveis em água ou suas misturas incluem, entre outros, carboidratos N-ligados ou O-ligados, açúcares, fosfatos, polietilenoglicol (PEG) (inclusive as formas de PEG que têm sido utilizadas para derivação de proteínas, incluindo mono-(C1-C10), alcóxi, ou ariloxi-polietilenoglicol), monometoxi-polietilenoglicol, dextra- no (tais como dextrano de baixo peso molecular de, por exemplo, aproximadamente 6 kD), celulose ou outros polímeros à base de car- boidratos, poli-(N-vinilpirrolidona) polietilenoglicol, homopolímeros de propilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietoxilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico. A presente invenção também abrange moléculas reticuladoras bifuncio- nais que podem ser utilizadas para preparar multímeros de variantes da proteína FGF21 ligados covalentemente. A presente invenção também abrange FGF21 mutantes ligados covalentemente ao ácido poli- siálico.

[000204] Polímeros de polissacarídeos representam outro tipo de polímero solúvel em água que podem ser utilizados para modificação proteica. Por conseguinte, as proteínas de fusão da invenção fundidas a um polímero de polissacarídeo formam concretizações da presente invenção. Dextranos são polímeros de polissacarídeos que compreendem subunidades individuais de glicose predominantemente ligadas por ligações alfa-1-6. O próprio dextrano está disponível em muitas faixas de peso molecular e está rapidamente disponível em pesos moleculares de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 70 kD. Dex- trano é um polímero adequado solúvel em água para uso como veículo por si mesmo ou em combinação com outro veículo (por exemplo, Fc). Ver, por exemplo, a Publicação Internacional No WO 96/11953. O uso de dextrano conjugado a imunoglobulinas terapêuticas ou diagnósticas foi relatado. Ver, por exemplo, a Publicação da Patente Europeia No 0 315 456, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente. A presente invenção também abrange o uso de dextrano de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD.

[000205] Em geral, a modificação química pode ser realizada em qualquer condição adequada utilizada para reagir uma proteína com uma molécula polimérica ativada. Os métodos para preparar polipeptí- deos modificados quimicamente compreenderão geralmente as etapas de: (a) reagir o polipeptídeo com a molécula polimérica ativada (tal como um éster reativo ou derivado de aldeído da molécula polimérica) em condições pelas quais uma variante da proteína FGF21 torna-se ligada a uma ou mais moléculas do polímero e (b) obter os produtos da reação. As condições ideais de reação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão de moléculas do polímero para a proteína, maior a porcentagem de molécula polimérica ligada. Em uma concretização da presente invenção, mutantes quimicamente modificados do FGF21 podem ter uma única molécula polimérica na terminação amino (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5 234 784).

[000206] Em outra concretização da presente invenção, proteínas da invenção podem ser quimicamente acopladas à biotina. As proteí- nas/biotina da invenção são depois deixadas para que se liguem à avidina, resultando em avidina/biotina/proteínas tetravalentes da invenção. Proteínas da invenção podem também se acopladas covalen- temente a dinitrofenol (DNP) ou trinitrofenol (TNP) e os conjugados resultantes precipitados com IgM anti-DNP ou anti-TNP para formar conjugados decaméricos com valência igual a 10.

[000207] Em geral, as condições que podem ser atenuadas ou moduladas pela administração dos FGF21 mutantes quimicamente modificados da presente invenção incluem aquelas aqui descritas para proteínas da invenção. Contudo, os FGF21 mutantes quimicamente modificados aqui revelados podem ter atividades adicionais, atividade biológica reforçada ou reduzida ou outras características, tais como a meia-vida aumentada ou diminuída, quando comparados a FGF21 mu- tantes não modificados.

Composições terapêuticas de proteínas de fusão e sua administração

[000208] A presente invenção também provê composições terapêuticas que compreendem uma ou mais das proteínas de fusão da invenção, aqui descritas, e em mistura com um agente de formulação far- macêutico ou fisiologicamente aceitável ou com um veículo farmaceu- ticamente aceitável selecionado para adequação com o modo de administração. As composições são especificamente contempladas à luz de of, por exemplo, a identificação de proteínas de fusão exibindo propriedadesreforçadas.

[000209] Em algumas concretizações, as composições terapêuticas são preparadas como injetáveis, seja como soluções líquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção podem também ser preparadas. Li- possomos estão incluídos dentro da definição de um veículo farmaceu- ticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem também estar presentes na composição farmacêutica, por exemplo, sais minerais de ácidos tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e os semelhantes; e sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e os semelhantes. Uma discussão profunda de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkins.

[000210] Os materiais aceitáveis para formulação são de preferência não tóxicos para os receptores nas doses e concentrações empregadas.

[000211] A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, a osmolaridade, a viscosidade, a clareza, a cor, a isotonicidade, o odor, a esterilidade, a estabilidade, a taxa de dissolução ou de liberação, a adsorção ou a penetração da composição. Os materiais adequados de formulação incluem, entre outros, aminoácidos (como glicina, glutami- na, asparagina, arginina ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfeto de sódio ou hidrogenossulfeto de sódio), tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos ou ou- tros ácidos orgânicos), agentes de massa (como manitol ou glicina), agentes quelantes (como ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)), agentes de complexação (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta- ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina), materiais de preen-chimento,monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextrinas), proteínas (como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas), agentes corantes, flavorizantes e diluen- tes, agentes emulsionantes, polímeros hidrofílicos (como polivinilpirro- lidona), polipeptídeos de baixo peso molecular, contraíons formadores de sal (como sódio), conservantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio), solventes (como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol), álcoois de açúcares (como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, surfac- tantes ou agentes hidratantes (como plurônicos; PEG; ésteres do sor- bitano; polissorbatos como polissorbato 20 ou polissorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes reforçadores da estabilidade (como sacarose ou sorbitol), agentes reforçadores da tonicidade (como haletos de metais alcalinos; de preferência cloreto de sódio ou de potássio; ou manitol sorbitol), veículos de liberação, dilu- entes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences(18aed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) e suas edições subsequentes, aqui incorporados por referência neste pedido de patente para qualquer fim).

[000212] A composição farmacêutica ideal será determinada pelo técnico no assunto dependendo, por exemplo, da via pretendida de administração, do formato de liberação e da dose desejada (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra). Tais composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de libe- ração in vivo e a taxa de depuração in vivo da proteína de fusão da invenção.

[000213] O veículo ou carreador primário em uma composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou carreador adequado para injeção pode ser água, solução salina fisiológica ou ser líquido cefalorraquidiano artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina neutra tamponada ou solução salina misturada com albumina sérica são ainda veículos exemplares. Outras composições farmacêuticas exemplares compreendemtampão Tris com pH de aproximadamente 7,0-8,5, ou tampão acetato com pH de aproximadamente 4,0-5,5, as quais podem incluir ainda sorbitol ou um substituto adequado. Em uma concretização da presente invenção, composições farmacêuticas de função dupla podem ser preparadas para armazenamento, misturando-se a composição selecionada tendo o grau desejado de pureza com agentes opcionais de formulação (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de bolo liofilizado ou de solução aquosa. Além do mais, o produto proteico de função dupla pode ser formulado em liofilizado utilizando excipientes apropriados como sacarose.

[000214] As composições farmacêuticas contendo as proteínas de fusão da invenção podem ser selecionadas para liberação parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para liberação através do trato digestivo, tal como por via oral. O prepare de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está ao alcance da competência na técnica.

[000215] Os componentes da formulação estão presentes em concentrações que sejam aceitáveis para o sítio de administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de pH entre aproximadamente 5 e aproximadamente 8.

[000216] Quando a administração parenteral é contemplada, as composições terapêuticas para uso nesta invenção podem estar na forma de solução aquosa livre de pirógenos, aceitável para via parenteral, compreendendo a proteína desejada de função dupla em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo especialmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril na qual uma proteína de função dupla é formulada como solução isotônica estéril, apropriadamente conservada. Ainda outro preparo pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bioerosíveis, compostos poliméricos (como ácido po- lisiálico ou ácido poliglicólico), microesferas ou lipossomos, que proporcione a liberação controlada ou sustentada do produto que pode então ser liberado através de uma injeção de depósito. O ácido hialu- rônico pode também ser utilizado e este pode ter o efeito de promover a duração sustentada na circulação. Outro meio adequado para a introdução da molécula desejada inclui dispositivos implantáveis para liberação de fármacos.

[000217] Em uma concretização, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, uma proteína de função dupla da invenção pode ser formulada em pó seco para inalação. As soluções contendo a proteína de função dupla para inalação podem ser formuladas com um propelente para liberação de aerossóis. Em ainda outra concretização, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é descrita mais detalhadamente na Publicação Internacional No WO 94/20069, que descreve a liberação pulmonar de proteínas modificadas quimicamente.

[000218] Contempla-se também que certas formulações possam ser administradas por via oral. Em uma concretização da presente invenção, proteínas de fusão da invenção que são administradas nessa maneira podem ser formuladas com ou sem aqueles carreadores habitualmente usados na composição de formas farmacêuticas sólidas tais como comprimidos ou cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser criada para liberar a parte ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade estiver no máximo e a degradação pré-sistema estiver no mínimo. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção das proteínas de fusão da invenção. Diluentes, flavorizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes desintegrantes de comprimidos e aglutinantes podem também ser empregados.

[000219] Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz das proteínas de fusão da invenção em uma mistura com excipientes não tóxicos que sejam adequados para a fabricação de comprimidos. A dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, permite que as soluções possam ser preparadas em forma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, entre outros, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

[000220] Composições farmacêuticas adicionais compreendendo proteínas de fusão da invenção serão evidentes para os técnicos no assunto, inclusive formulações envolvendo proteínas de fusão da invenção em formulações para liberação sustentada ou controlada. Técnicas para formular uma variedade de outros meios para liberação sustentada ou controlada, como carreadores lipossômicos, micropartí- culas bioerosíveis ou microesferas porosas e injeções de depósito, são também conhecidas pelos técnicos no assunto (ver, por exemplo, a Publicação Internacional No WO 93/15722, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a liberação de composições farmacêuticas, além de Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J Pharm. 364: 298-327 e Freiberg & Zhu, 2004, Int. J Pharm. 282: 1-18, que discutem o preparo e uso de microesferas/micropartículas).

[000221] Exemplos adicionais de preparados de liberação sustentada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de itens moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (Patente U.S. No 3 773 919 e Patente Europeia No 0 058 481), copolí- meros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), vinil acetato de etileno (Langer et al., supra) ou ácido poli-D-3-hidroxibutírico (Patente Europeia No 0 133 988). Composições de liberação sustentada podem também incluir liposso- mos, os quais podem ser preparados por qualquer um de diversos métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92; e as Patentes Europeias Nos 0 036 676, 0 088 046 e 0 143 949.

[000222] As composições farmacêuticas da invenção a serem usadas para administração in vivo tipicamente precisam ser estéreis. Isso pode ser realizado pela passagem através de membranas de filtração estéril. Quando a composição é liofilizada, a esterilização utilizando este método pode ser conduzida antes ou depois da liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser armazenada em forma liofilizada ou em uma solução. Adicionalmente, as composições parenterais são em geral colocadas em um recipiente com porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco-ampla com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.

[000223] Uma vez tenha sido formulada, pode-se armazenar a com- posição farmacêutica em frascos-ampola estéreis em uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou em forma de pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma de uso imediato ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que requeirareconstituição antes da administração.

[000224] Em uma concretização específica, a presente invenção é direcionada a kits para produzir uma unidade em dose única para administração. Os kits podem cada um conter um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. O âmbito desta invenção também inclui kits que contêm seringas pré-carregadas com um único compartimento ou múltiplos compartimentos (por exemplo, seringas contendo líquidos e seringas contendo liofilizado).

Doses de proteínas de fusão e sua administração

[000225] A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e dos objetivos terapêuticos. O técnico no assunto reconhecerá que os níveis adequados de dose para o tratamento variará, portanto, dependendo, em parte, da molécula derivada, da indicação para qual a variante da proteína de fusão está sendo utilizada, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e da condição (a idade e a saúde geral) do paciente. Dessa forma, o clínico pode titular a dose e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal. Uma dose típica pode variar de aproximadamente 0,1 μg/kg até aproximadamente 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores citados acima. Em outras concretizações, a dose pode variar de 0,1 μg/kg até aproximadamente 100 mg/kg; ou de 1 μg/kg até aproximadamente 100 mg/kg.

[000226] A frequência da administração dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de função dupla na formulação em uso. Tipicamente, um clínico administrará a composição até ser atingida uma dose que alcance o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada em dose única, em duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo ou como infusão contínua através de um dispositivo ou cateter implantado. O refinamento adicional da dose apropriada é efetuado rotineiramente pelos técnicos no assunto e está dentro do âmbito das tarefas que executam de rotina. As doses apropriadas podem ser averiguadas pelo uso de dados apropriados de dose-resposta.

[000227] A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, por via oral; através de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparen- quimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada (que podemtambém ser injetados); ou por dispositivos implantados. Quando desejado, as composições podem ser administradas por injeção em bolus, continuamente por infusão ou por dispositivo implantado.

[000228] Alternativa ou adicionalmente, a composição pode ser administrada localmente via o implante de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Quando um dispositivo implantado é usado, este pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a liberação da molécula desejada pode ser através de difusão, bolus de liberação cronometrada ou administração contínua.

Usos terapêuticos de proteínas de fusão

[000229] As proteínas da invenção podem ser utilizadas para tratar, diagnosticar, atenuar ou prevenir uma série de doenças, distúrbios ou condições, inclusive, entre outros, distúrbios metabólicos. Em uma concretização, o distúrbio metabólico a ser tratado é diabetes, por exemplo, diabetes mellitus tipo 2. Em outra concretização, o distúrbio metabólico é obesidade. Outras concretizações incluem condições ou distúrbios metabólicos como diabetes mellitus tipo 1, pancreatite, disli- pidemia, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato- hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, infarto agudo do miocárdio, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, doença renal, complicações diabéticas, neuropatia, distúrbios associados com mutações inativadoras graves no receptor da insulina, gastroparesia e outros distúrbios metabólicos.

[000230] Na aplicação, um distúrbio ou condição como diabetes mel- litus tipo 1 ou tipo 2 ou obesidade pode ser tratado pela administração de uma variante da proteína FGF21 conforme aqui descrita a um paciente com necessidade desse tratamento na quantidade de uma dose terapeuticamente eficaz. A administração pode ser realizada conforme aqui descrito, tal como por injeção IV, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular ou por via oral na forma de comprimido ou formação líquida. Na maioria das situações, uma dose desejada pode ser determinada por um clínico, conforme aqui descrito, e pode representar uma dose terapeuticamente eficaz do polipeptídeo FGF21 mutante. Será evidente para os técnicos no assunto que uma dose terapeutica- mente eficaz do polipeptídeo FGF21 mutante dependerá, entre outros, do esquema de administração, da dose unitária de antígeno adminis-trado, se a molécula de ácido nucleico ou de polipeptídeo é administrada com outros agentes terapêuticos, da situação imune e da saúde do receptor. O termo "dose terapeuticamente eficaz", neste relatório descritivo, significa aquela quantidade de polipeptídeo FGF21 mutante que suscita a resposta biológica ou medicinal em um sistema tecidual, animal ou humano, a qual um pesquisador, médico ou outro clínico está à procura, e que inclua o alívio dos sintomas da doença ou do distúrbio em tratamento.

[000231] Tendo sido agora descrita detalhadamente, a presente invenção será mais claramente entendida por referência aos exemplos a seguir, os quais estão incluídos para fins de ilustração apenas e não para servir de limitação à invenção.

[000232] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da competência da técnica. Tais técnicas são inteiramente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences,18aedição (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology, Vol. I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); e Sam- brook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2aedição, 1989).

Exemplos Exemplo 1: Preparo de proteínas variantes de FGF21

[000233] Construção para expressão de FGF21 V76: As variantes de FGF21 foram clonadas no vetor de expressão modificado de E.coli pET30a, descrito por Achmuller et al. (2007) (Nature Methods4:10371043), para gerar fusões in frame a uma etiqueta de hexa-histidina seguida pela etiqueta Npro-EDDIE no N-terminal de FGF21 (aa 33-209).

[000234] Expressão e purificação de FGF21 V76: O plasmídeo de expressão pET30a-His-Npro-EDDIE-FGF21 foi transformado em células competentes de E. coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen). O crescimento durante a noite de uma única colônia de células recentemente transformadas foi realizado em 50 mL de Caldo Terrific (TB) contendo ca- namicina 50 μg/mL a 37 °C. A pré-cultura foi transferida para 1 L de meio TB com canamicina e cultivada em balões com reentrâncias no fundo a 37 °C com agitação a 250 rpm. Depois de 6 horas de cultura, a expressão de FGF21 foi induzida pela adição de IPTG a uma concentração final de 1 mM, e as culturas foram cultivadas durante a noite a 37 °C. As células foram então colhidas e ressuspensas em 50 mL de tampão de lise gelado; Tris-HCI 50 mM, pH 8, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, seguido pela lisa utilizando um Microfluidizer™.

[000235] Corpos de inclusão (IBs) foram precipitados por centrifugaçãoa 30.000 x g por 1 hora a 4 °C. Os IBs foram lavados com Tris-HCI 50 mM, pH 8, NaCI 150 mM e depois dissolvidos em 30 mL de tampão de dissolução; Tris-HCI 10 mM, pH 8, NaH2P04 100 mM, GnHCI 6 M. Os IBs dissolvidos foram clarificados por centrifugação a 30.000 x g por 1 hora a 25 °C. A solução de IB foi carregada em uma coluna de 5 mL de resina de Ni-NTA de alta eficiência (GE Healthcare) equilibrada com tampão de dissolução. As proteínas ligadas à resina foram eluí- das diminuindo o pH para 4,5. O eluído foi condicionado por ajuste do pH e adição de ditiotreitol (DTT) a uma concentração de 20 mM. O elu- ído condicionado foi lentamente diluído para 1 L de tampão de redo- bramento; Tris-HCI 50 mM, pH 8, arginina 0,5 M, DTT 20 mM, seguido por incubação por 2 dias a 4 °C. A amostra diluída foi concentrada e o tampão trocado para Tris-HCI 20 mM, pH 9 usando um método de ul- trafiltração. A amostra concentrada foi carregada em uma coluna de 10 mL de resina Q sepharose de fluxo rápido (GE Healthcare) equilibrada com Tri-HCI 20 mM (pH 9).

[000236] Depois da lavagem da resina com o tampão de equilibra- ção, as proteínas ligadas à resina foram eluídas com Tris-HCl 20 mM, pH 9, NaCI 500 mM. Para remover o fragmento de fusão His-Nproclivado e qualquer proteína de fusão não clivada da proteína FGF21 novamente dobrada, o eluído foi carregado em uma coluna de 5 mL de resina de Ni-NTA de alta eficiência equilibrada com Tris 20 mM, pH 8,0, imidazol 50 mM, e a fração através do fluxo contendo FGF21 foi coletada. Para reduzir os níveis de endotoxinas, a fração de FGF21 foi tratada com uma resina EndoTrap HD (Hyglos) equilibrada com Tris 10 mM, pH 8, imidazol 50 mM, NaCI 500 mM, CaCI2 1 mM. A amostra com baixo nível de endotoxinas foi dialisada contra PBS e depois esterilizada com filtro de 0,22 μm. A proteína FGF21 purificada foi instantaneamente congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -80 °C. A concentração da proteína foi determinada por absorbância a 280 nm usando 9362 M-1 cm-1 como o coeficiente de extinção molar para FGF21. A pureza e a integridade da proteína foram determinadas por HPLC, SDS-PAGE e cromatografia líquida-espectrometria de massa.

[000237] PEGguilação de cisteína de FGF21 variantes: A variante V75 de FGF21 (R154C) tem a tendência para dimerizar via a cisteína construída; portanto, antes da PEGuilação, a solução contendo a proteína (tipicamente 5 mg/mL em tampão Tris) foi suavemente reduzida com mercaptoetilamina 5 mM por 30 minutos em gelo e imediatamente dessalinizada em Tris 20 mM, pH 7. A proteína recentemente reduzida (tipicamente 3 mg/mL) foi depois imediatamente PEGuilada com 1,5 equivalentes do reagente maleimido-PEG ramificado de 40 kDa (NOF, Cat. no GL2-400MA da série Sunbright) durante 3 horas em gelo. A proteína PEGuilada foi finalmente purificada por cromatografia de troca aniônica (MonoQ) com rendimentos globais de aproximadamente 25%.

[000238] Construções para expressão de variantes de fusão Fc- FGF21: Os cDNAs de variantes de FGF21 que codificam os aminoáci- dos 33-209 foram clonados em um vetor de expressão mamífera a jusante do promotor do citomegalovírus (CMV) in frame com as sequências do N-terminal incluindo um peptídeo líder (cadeia kappa de imu- noglobulina) para direcionar a secreção das proteínas, seguidas por um domínio Fc e um ligante curto.

[000239] Expressão e purificação de variantes Fc-FGF21: As proteínas variantes Fc-FGF21 foram expressas em células HEK293T (American Type Culture Collection). As células foram cultivadas em cultura por suspensão a 37 °C, CO2 8%, em Meio de Expressão Freestyle 293 (Invitrogen, Cat. no 12338-018) até o dia da transfecção. As células foram centrifugadas a 1000 x g por 7 minutos em rotor horizontal e foram contadas com um contador automático de células. As células foram diluídas em 900 mL de meio Freestyle 293 para uma concentração final de 1,4 x 106células/mL e colocadas em um balão sem reentrância no fundo de 3 L (Corning, Cat. no 431252). As células foram transfectadas utilizando uma mistura de polietilenoimina (PEI) e plas- mídeo como segue: três mL de um estoque estéril a 1 mg/mL de PEI linear, M.W. 25.000, (Alfa Aesar, Cat. no 43896) foram adicionados a 50 mL de meio Freestyle 293, misturados gentilmente e incubados a 25 °C por 5 minutos. Ao mesmo tempo, 1 mg de plasmídeo isento de endotoxinas foi adicionado a 50 mL de meio Freestyle 293 e filtrado estéril utilizando um filtro de 0,2 μM. A mistura de PEI foi depois adicionada ao DNA filtrado estéril, misturada gentilmente e deixada incubar a 25 °C por 10 minutos. A mistura PEI-plasmídeo foi depois adicionada ao balão de 3 L contendo as células HEK 293T diluídas e colocada em uma incubadora agitada a 125 RPM, 37°C, CO2 8%.

[000240] No 6o dia após a transfecção, as células foram centrifugadas a 2000 x g por 10 minutos e o sobrenadante foi colhido. O sobre- nadante foi clarificado mais por filtração através de um filtro de 0,8/0,2 μM (Pall Corporation, Cat. no 4628).

[000241] A purificação em batelada da proteína FGF21 foi efetuada pela adição de 1 mL de Sepharose Fast Flow de Proteína A recombi- nante (GE, Cat. no 17-5138-03) por 20 mg de proteína prevista para ser purificada, diretamente para o sobrenadante clarificado, e incubação por 1 hora a 4 °C com rotação suave. A mistura do sobrenadante foi depois despejada sobre uma coluna descartável de cromatografia Poly-Prep (Bio-Rad, Cat. no 731-1550), e descartado o fluxo atraves- sado. As microesferas retidas foram lavadas com 5 volumes da coluna de DPBS, pH 7,4 (Invitrogen, Cat. no 14190-144). A eluição da proteína das microesferas de proteína A foi efetuada adicionado 20 volumes da coluna de tampão de citrato de sódio, pH 3,0. O tampão de eluição foi neutralizado pela adição de tampão de Tris-HCl 20%, pH 9,0. A croma- tografia de exclusão por tamanho foi realizada como etapa secundária de polimento pela corrida do material purificado em batelada de proteína A em coluna High Load 26/600 Superdex 200pg (GE, Cat. no 289893-36). O rendimento de proteína purificada foi quantificado por A280. Foi efetuada uma corrida de SDS-Page para verificar a pureza e o peso molecular. O nível de endotoxinas foi quantificado utilizando o sistema Endosafe PTS (Charles River Labs).

Exemplo 2: Medição da captação de 2-desoxiglicose (2-DOG) dependente de FGF21

[000242] FGF21 demonstrou estimular a captação de glicose em adipócitos 3T3-L1 de camundongos na presença e ausência de insulina, e aumentar os níveis sanguíneos de glicose, triglicerídeos e glucagon no estado alimentado e de jejum em camundongos ob/ob e db/db e ratos ZDF com 8 semanas de idade em maneira dependente da dose, assim, fornecendo a base para o uso de FGF21 como uma terapia para tratar diabetes e obesidade (ver, por exemplo, a Publicação da Patente WO03/011213, e Kharitonenkov et al., (2005) Jour. of Clinical Invest. 115:1627-1635). Adicionalmente, foi observado que FGF21 estimulava a fosforilação de tirosina de FGFR-1 e FGFR-2 em adipócitos 3T3-L1.

[000243] Fibroblastos 3T3-L1 foram adquiridos da ATCC (Cat. no CL173). As células foram cultivadas para confluência em placa de Petri de 150 cm e foram mantidas em DMEM com alto teor de glicose (In- vitrogen, Cat. no 11995065) suplementado com soro fetal bovino 10% e penicilina-estreptomicina 1% por mais 4 dias. As células foram então diferenciadas no meio acima suplementado com insulina 4 μg/mL (Sigma, Cat. no I-5500), IBMX 115 μg/mL (Sigma, Cat. no I5879) e de- xametasona 0,0975 μg/mL (Sigma, Cat. no D1756) por 3 dias depois dos quais o meio de diferenciação foi substituído por DMEM completo. Uma placa de adipócitos 3T3-L1 diferenciada foi semeada em quatro placas de 96 poços no dia seguinte à substituição do meio.

[000244] Os adipócitos foram depois tratados com FGF21-WT e a proteína variante de FGF21 (ver a Tabela 2 para a lista de variantes; 30 pM a 100 nM é a faixa típica de concentração utilizada) durante a noite em meio completo. Os adipócitos tratados com amostras de FGF21 foram privadas de soro em 50 μL por poço de tampão KRH (NaCI 0,75%; KCI 0,038%; CaCI2 0,0196%; MgS04 0,032%; HEPES 0,025 M, pH 7,5; BSA 0,5%; piruvato de sódio 2 mM) por 2 horas. Os poços para o branco foram adicionados com 1 μL (concentração final: 5 μg/ml) de citochalasina B por 15 minutos. [3H]-2-DOG (20,6 mCi/mmoL, 1 mCi/mL) foi diluída 1:20 em 2-DOG frio 5,1 mM e 1 μL de 2-DOG diluída foi adicionado por poço, e as células foram incubadas por 5 minutos. As células foram lavadas três vezes com tampão KRH 100 μL/poço. SDS 1% 40 μL/poço foi adicionado às células que foram agitadas por pelo menos 10 minutos. Líquido de cintilação 200 μL/poço foi adicionado e as placas foram agitadas durante a noite e lidas em leitor de microplacas-beta. Os valores obtidos de toda uma coluna/linha, que foram tratados citochalasina B, foram calculados em média e subtraídos de todos os outros valores. Os dados foram analisados pelo software GraphPad Prism, cujos resultados estão resumidos na Tabela 2. As variantes de fusão Fc-FGF21 V101, V103 e V188 são superiores à variante PEGuilada V76 de FGF21 para indução da captação de 2-desoxiglicose por adipócitos 3T3L1 de camundongos.

Exemplo 3: pERK em ensaio celular Western (ICW)

[000245] Células HEK293 transfectadas estavelmente com β-klotho humano, cultivadas em DMEM com alto teor de glicose, FBS 10%, PS 1% e G418 600 ng/mL, são semeadas em placas de 96 poços revestidas com poli-D-lisina (BD bioscience, Cat. no 356640) a 30.000 células por poço durante a noite. As células foram privadas de soro em DMEM com alto teor de glicose, BSA 0,5% e HEPES 10 mM por 4 horas. FGF21 WT e as variantes de FGF21 (ver a Tabela 3 para a lista de variantes) foram diluídos para várias concentrações (100 pM a 300 nM é a faixa típica de concentração utilizada) em meio de privação. As células foram estimuladas com FGF21 por 10 minutos. Após a estimulação com FGF21 ou a proteína variante de FGF21, o meio foi aspirado dos poços e as células foram lavadas uma vez com 100 μL de PBS frio e depois fixadas com 100 μL de formaldeldeído 4% por 15 minutos à temperatura ambiente e seguido por uma incubação por mais 10 minutos com 100 μL de metanol gelado.

[000246] Após a fixação, as células foram lavadas quatro vezes com Triton X-100 0,3% em PBS, 5 minutos cada. 150 μL de tampão de bloqueio Odyssey foram adicionados às células permeabilizadas à temperatura ambiente por 1,5 horas. O anticorpo fosfo-ERK (pERK) foi diluído para uma concentração de 0,17 μg/mL (diluição 1:200 ou as diluições indicadas) e o anticorpo ERK-total (tERK) foi diluído para uma concentração de 2,2 μg/mL (diluição 1:200 ou as diluições indicadas) em tampão de bloqueio Odyssey. 50 μL foram adicionados a cada poço, omitindo uma coluna que foi somente tratada com o anticorpo secundário para normalizar o fundo. A placa foi coberta com a torre de papel úmido e a tampa para evitar a evaporação e depois incubada a 4 °C durante a noite.

[000247] Depois desse período, o anticorpo primário foi aspirado e as células foram lavadas quatro vezes com Tween 20 0,3% em PBS por 5 minutos cada. Durante a lavagem, a mistura de reação com o anticorpo secundário foi preparada em tampão de bloqueio Odyssey contendo o anticorpo de cabra Alexa 680 anti-camundongo diluído 1:1000 (ou as diluições indicadas) e o anticorpo de cabra IRDye800 anti-coelho diluído 1:1000 (ou as diluições indicadas). Uma vez concluída a lavagem, 40 μL da mistura de reação foram adicionados a cada poço. As placas foram cobertas com uma tampa preta para proteger o anticorpo secundário da luz, e foram incubadas à temperatura ambiente por 1 hora em um agitador. Finalmente, as células foram novamente lavadas quatro vezes com Tween 20 0,3% em PBS por 5 minutos cada e, depois, foram submetidas à varredura no sistema de imagens por infravermelho LI-COR Bioscience Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) nos canais de 700 nm (vermelho) e 800 nm (verde). Alexa 680 corou o tERK com fluorescência no vermelho distante (comprimento de onda de emissão: 668 nm), enquanto IRDye800 corou o pERK com fluorescência verde (comprimento de onda de emissão: 800 nm). Para eliminar o fundo fluorescente, os valores obtidos de toda uma coluna/linha que foi tratada com somente o anticorpo secundário, foram calculados em média e subtraídos de todos os outros valores obtidos da placa. Para normalização da quantidade de pERK presente em cada amostra, os valores para pERK em cada poço foi dividido pelos valores de tERK. Os dados foram analisados pelo software GraphPad Prism, cujos resultados estão resumidos na Tabela 2. As variantes de fusão Fc-FGF21 V101, V103 e V188 são superiores à variante PEGuilada V76 de FGF21 neste ensaio de fosfo- rilação de ERK. Tabela 2: Resumo de ERK em resultados do ensaio celular Western e de captação de glicose por adipócitos 3T3L1 de camundongos

Exemplo 4: Teste in vivo de variantes de FGF2

[000248] O camundongo ob/obé um modelo de camundongo para diabetes tipo 2. Os camundongos são desprovidos de leptina funcional e são caracterizados por hiperglicemia, resistência à insulina, hiperfa- gia, esteatose hepática e obesidade. Camundongos ob/ob machos (10-13 semanas de idade) foram usados para medir o efeito sobre a glicose sanguínea da variante PEGuilada V76 de FGF21 e as seguintes variantes de fusão Fc-FGF21 V101, V103 e V188.

[000249] Variantes de FGF21 ou o veículo PBS foram administrados por via S.C. a 1 mg/kg (V101, V103 e V188) ou a V76 por via S.C. a 5 mg/kg duas vezes por semana por 12 dias (4 doses no total). No primeiro dia do estudo, a glicose do sangue do rabo e o peso corporal foram medidos, e os camundongos foram distribuídos em diferentes grupos (n=8 por grupo), em que a glicose média e o peso corporal se equivaliam entre os grupos. A glicose sanguínea foi medida com medidor de glicose (OneTouch). A insulina plasmática foi medida no Dia 1 antes da administração e no Dia 12, 24 horas após a última dose. Os resultados desses estudos estão resumidos na Tabela 5.

[000250] Os resultados desses estudos estão resumidos na Tabela 3 e nas Figuras 1-3. As variantes de fusão Fc-FGF21 V101, V103 e V188 são superiores à variante PEGuilada V76 de FGF21 em todo momento medido nestes estudos e a uma dose cinco vezes mais baixa. Tabela 3. % de alterações em comparação ao veículo em glicose e insulina plasmática, ganho de peso corporal (BW), TG/lipídios no fígado por variantes de FGF21 durante estudos de 12 dias em camundongosob/ob

Exemplo 5: Farmacocinética de variantes de fusão de FGF21 em ca-mundongos

[000251] Para determinar o perfil farmacocinético das variantes de fusão Fc-FGF21 V101, V103 e V188, camundongos C57BL/6J foram injetados por via IV com o item em teste 1 mg/kg e sangrados em vários momentos de 16 dias (384 horas). As amostras de sangue foram coletadas em tubos microtainer revestidos com EDTA do plexo submandibular ou do retro-orbital. Aproximadamente 50 μL de sangue foram coletados em cada momento, rendendo ~25 μL de plasma.

[000252] Para medir as concentrações plasmáticas de itens em teste por ELISA, placas de 384 poços foram revestidas durante a noite à temperatura ambiente (RT) com 2 μg/mL de anticorpo policlonal de cabra anti-Fc-gama humano (30 μL/poço) e depois bloqueadas com diluente à base de caseína por 2 horas a RT (100 μL/poço). Amostras diluídas, padrões e controles foram adicionados à placa (30 μL/poço) e incubados por 2 horas a RT. Depois que as amostras foram removidas, os poços foram lavados três vezes com uma solução de lavagem à base de fosfato (100 μL/poço). O anticorpo de detecção, uma versão marcada com HRP do anticorpo de captura, foi adicionado à placa e incubado por 1 hora a RT (30 μL/poço). Depois que a placa foi novamente lavada três vezes com uma solução de lavagem à base de fosfato (100 μL/poço), um substrato quimioluminescente foi adicionado (30 μL/poço) e a luminescência da placa foi lida dentro de 5 minutos usando um leitor apropriado de placa. Como mostrado nas Figuras 4A e 4B, as variantes de fusão Fc-FGF21 apresentaram uma meia-vida grandemente aumentada em relação às fusões de Fc-FGF21 conhecidas na técnica (Figura 4A) e em relação à variante PEGuilada V76 de FGF21 (Figura 4B).

[000253] Os níveis séricos dos itens em teste Fc-FGF21 foram validados pela técnica de Western Blotting por comparação a níveis medidos por ELISA para assegurar que a variante completa Fc-FGF21 e não só Fc isolado estava sendo detectada no ensaio ELISA. Dois μL de soro de camundongo foram combinados com 2,5 μL de 4X o tampão de carregamento, 1 μL de 10X o desnaturante e 4 μL de dH2O, aquecidos para 95 °C por 5 minutos e carregados em gel de poliacri- lamida com gradiente de 4-12% e submetidos à eletroforese por 1 hora a 100 Volts (voltagem constante). As amostras foram transferidas para papel-filtro de nitrocelulose por Western Blotting usando o sistema iblot (Invitrogen, Cat. no IB1001, tempo de corrida de 7 minutos). Os filtros de nitrocelulose foram bloqueados com 30 mL de solução de bloqueio Rockland (Cat. no MB-070), sondadas seguindo o protocolo do sistema snap iblot com um anticorpo primário de cabra anti-FGF21 a uma diluição de 1:2000 (R&D systems, Cat. no BAF2539) e estrepavidina marcada por fluorescência como secundário a uma diluição de 1:10000 (Licor, Cat. no 926-68031). Os níveis de proteínas foram visualizados no sistema Licor Odyssey a 700 nm e comparados com a corrida de V101 de controle a 2 nM no mesmo gel. Como mostrado na Figura 4C, as variantes completas V101, V103 e V188 de Fc-FGF21 são detectá- veis utilizando a técnica de Western Blotting com anticorpo anti-FGF21 do soro de camundongo de 15 dias obtido do estudo farmacocinético.

[000254] Exemplo 6: Variantes de fusão Fc-FGF21 V101, V103 e V188 são extremamente estáveis termodinamicamente

[000255] Proteínas podem desdobrar-se em uma faixa específica de temperatura. A temperatura de desdobramento de proteínas é um parâmetro intrínseco para descrever a estabilidade térmica de proteínas. A calorimetria diferencial de varredura (DSC) é usada para detectar a temperatura de desdobramento da proteína. Esta temperatura característica é descrita como temperatura de fusão (Tm), que é o pico de temperatura durante o desdobramento da proteína.

[000256] Amostras de proteína original são diluídas em PBS para uma concentração de ~1 mg/mL (0,5 mg/mL a 1,2 mg/mL) até um volume total de 0,5 mL. Uma alíquota de 0,4 mL por poço de amostra de proteína diluída, padrão, PBS e de água DI são adicionadas à placa de DSC com 96 poços. A placa é coberta depois com um selo. As amostras foram analisadas em um calorímetro diferencial de varredura de 96 poços da MicroCal. A temperatura foi submetida à varredura de 10 - 110 graus C a uma taxa de 1 grau por minuto.

[000257] Como mostrado na Figura 4D, as temperaturas de fusão das variantes V101, V103 e V188 de FGF21 são extremamente altas. Esse dado contrasta com as temperaturas de fusão mais baixas da variante V76 de FGF21 e do FGF21 do tipo selvagem (não mostrado). A estabilidade melhorada de V101, V103 e de V188 é atribuída à adição específica de uma segunda ligação dissulfeto resultantes das novas mutações Q55C e G148C. Esse tipo de estabilidade mecânica é conhecido por proteger proteínas da proteólise e podem adicionalmente traduzir-se em estabilidade significativamente prolongada in vivo e nos perfis farmaco- cinéticos melhorados exemplificados pelos dados nas Figuras 4B e 4C.

Claims

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que com-preende uma variante do FGF21 e uma região Fc, em que a variante de FGF21 compreende as seguintes mutações relativas à sequência de comprimento completo de hFGF21 SEQ ID NO: 1: Q55C, R105K, G148C, K150R, P158S, S195A, P199G e G202A.

2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizada pelo fato de que a variante do FGF21 é fusionada à referida região Fc por um ligante GS.

4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizada pelo fato de que a região Fc é um fragmento Fc modificado com uma mutação LALA.

5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma ligação dis- sulfeto projetada entre Gln55Cys e um resíduo de cisteína em um dentre Cys103, Cys121, Gly148Cys, Asn149Cys, Ser151Cys, Pro152Cys, His153Cys, Arg154Cys, Asp155Cys, Pro156Cys, Ala157Cys, Arg159Cys, Gly160Cys, Pro161Cus, Ala162Cys e Arg163Cys.

6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma ligação dissulfeto projetada entre Gly148Cys e um resíduo de cisteína em um dentre Cys103, Cys121, Arg47Cys, Tyr48Cys, Leu49Cys, Tyr50Cys, Thr51Cys, Asp52Cys, Asp53Cys, Ala54Cys, Gln55Cys, Gln56Cys, Thr57Cys, Glu58Cys, Gly160Cys, Pro161Cys, Ala162Cys, Arg163Cys e Phe164Cys.

7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 6, ca-racterizada pelo fato de que é aprimorada ainda mais com a ligação dissulfeto projetada Gln55Cys-Gly148Cys.