JP5096466B2 - N末端ポリシアリル化 - Google Patents
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Description
図2は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでシッフ塩基を選択的に還元して、タンパク質のアミノ基と安定な非可逆的共有結合を形成することを示す図である。
mは、少なくとも1であり、
HNBは、インスリン又はインスリン様ペプチドのN末端であるB−NH2に由来しており、
Lは結合又は連結基であり、又はポリペプチド若しくは合成オリゴマーを含み、
GlyOはアニオン性糖ユニットであり、
前記連結基は、存在する場合、一般式−Y−C(O)−R1−C(O)−で表され、
YはNR2又はNR2−NR2であり、R1は先に定義したような二官能有機基であり、R2はH又はC1−6アルキルである]。
レゾルシノール試薬を用いたポリシアル酸(シアル酸として)の量的評価を、他の文献[Gregoriadisら、1993年、FernandesとGregoriadis、1996年、1997年]に記載されているようなレゾルシノール法[Svennerholm、1957年]により実施した。タンパク質は、BCA比色法又は280nmでのUV吸収法によって測定した。
新たに調製した0.02Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)溶液(8倍モル過剰)を20℃でCAと混合し、この反応混合物を暗所で15分間磁気攪拌した。次いで、2倍体積のエチレングリコールをこの反応混合物に添加して過剰NaIO4を消費し、この混合物を20℃でさらに30分間攪拌した。酸化コロミン酸(CAO)を、4℃で、0.01%炭酸アンモニウムバッファー(pH7.4)に対して長時間(24h)透析した(分画分子量3.5kDa透析チューブ)。限外濾過(分画分子量3.5kDa)を使用して透析チューブからのCAO溶液を濃縮した。所定の体積まで濃縮した後、濾液を凍結乾燥し、次に使用するまで−40℃で保管した。あるいは、CAOをエタノールを用いた沈殿(2回)によって反応混合物から回収した。
2,4ジニトロフェニルヒドラジン(2,4−DNPH)を用いてコロミン酸の酸化度の質的評価を実施した。2,4ジニトロフェニルヒドラジンは、カルボニル化合物との相互作用で難溶性の2,4ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる。非酸化物(CA)/酸化物(CAO)を2,4−DNPH試薬(1.0ml)に添加し、それぞれの溶液を振とうした後、結晶状の沈殿が認められるまで37℃で静置した[Shrinerら、1980年]。CAの酸化の程度(量的)を、アルカリ溶液中でフェリシアン化物イオンが還元されるとフェロシアン化鉄(プルシアンブルー(Persian blue))になることに基づく方法[ParkとJohnson、1949年]を用いて測定し、次いで630nmで測定した。この例では、グルコースを標準として使用した。
コロミン酸の試料(CAとCAO)を、NaNO3(0.2M)、CH3CN(10%、5mg/ml)に溶解し、屈折率を検出する2×GMPWXLカラムでクロマトグラフィーによる分離を行った(GPCシステム:VE1121 GPC溶媒ポンプ、VE3580 RI検出器及びTrisec3ソフトウェア(Viscotek Europe Ltd)を使った照合)。各試料(5mg/ml)は0.45μmナイロン膜で濾過し、移動相として0.2M NaNO3とCH3CN(10%)を使って0.7cm/分で移動させた。
PEG化の化学反応のルールは、ポリシアリル化には適用することができない。なぜならば、これら分子では物理化学的特性が異なるからである。PSAは酸に不安定なポリマーであり、中性pH付近において数週間安定である(図3)。図3の結果は、pH6.0及び7.4においてCAOが8日間安定であること、pH5.0ではゆっくりと分解する(48時間後には最初の分子量の92%)こと、pH4.0でもゆっくりと分解する(48時間後には最初の分子量の70%)ことを示している。ポリシアル酸は高度に親水性であるが、PEGは両親媒性分子である。PEG化に使う条件を用いてポリシアリル化を実施すると、多くの場合タンパク質の凝集及び沈殿が見られる。
6.1 インスリン−CA複合体の調製(N末端法)
インスリン(5804Da)を白色固体として供給した。このインスリンを最小量の100mM HClで溶解し、次いで所定のpHに調整して氷の上に置いた。複合化のために添加すべきCAOの量は、下式に基づいて算出した。
CAOの重量={タンパク質の量(g)/(タンパク質の分子量)}×(CAOの分子量)×(CAOのモル過剰)
必要量のCAOを秤量した。CAOをpH6.0の10mM NaOAcに可溶化し、全CAOが溶解するまでこの混合物を穏やかにボルテックスで撹拌し、次いですべての凝集/沈殿物を除去すべく濾過して新しい容器に入れた。必要量のインスリンタンパク質溶液をこのCAO溶液に添加して7.5モル過剰(小規模)及び5モル過剰(大規模)のCAOを得、その反応混合物を4±1℃の穏やかな振とう機に置いておくことによって穏やかに混合した。100mg/ml NaCNBH3溶液を添加して最終反応混合物において8mg/mlとなるようにし、穏やかに混合した後、最終反応混合物のpHを確認し、場合によって、4±1℃で0.5M NaOH/HClを用いてpHを6.0に調整した。最後に、pH6.0の10mMのNaOAcを用いて反応混合物の体積を調整し、反応混合物中のタンパク質濃度を1mg/mlとした。チューブを密封し、所望の温度(4±1℃)で24時間攪拌した。適当な方法(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンバッファー、pH7.4)によって反応を停止し、SDS−PAGE(18%トリスグリシンゲルを使用)、SE−HPLC(Superose 12カラム)用に試料を取り出し、反応混合物のpHを確認した。すべての沈殿物を取り除くために、SE−HPLC分析及び精製の前に、反応混合物を13000rpmで5分間遠心した。SE−HPLC用の好ましいバッファーは、0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.9)であった。
N末端誘導体化及び無作為誘導体化のために、インスリン上に一定範囲の分子量を有するCAO(10〜30kDa)を用いて還元的アミノ化を実施した。複合化反応のためのプロセス変数の範囲を調べた。CAO10〜20(小規模)及び5〜10(大規模)モル過剰。試薬=50〜100mM NaCNBH3、反応用バッファー=10mM NaOAc pH5.5〜6.5、温度=4±1℃、時間=16〜24時間など。
前記混合物から遊離CAOを除去するために、HIC(HiTrap Butyl FF)を使用した。インスリン反応混合物を、濃縮(NH4)2SO4(例えば3M)、20mM Na2HPO4(pH7.4)を用いた最小限の体積で希釈してローディング溶液を調製し、ローディング溶液の(NH4)2SO4濃度を0.8Mとする。pHが7.4であるかどうか確認するか、0.5M HCl/NaOHで調整する。このローディング溶液は0.2μm膜フィルターで濾過する必要がある。
洗浄:グラジエントシステム:IECバッファーA:90%、AEXバッファーB(20mMリン酸バッファー+1M NaCl、pH7.4):10%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:68%、IECバッファーB:32%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:35%、IECバッファーB:65%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:0%、IECバッファーB:100%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
精製複合体を含有するIEC画分を合わせ、バッファーをPBSバッファーに変えて洗浄し塩を除去する。塩除去後のpHを7.4に調整する。次いで、溶液を4±1℃で濃縮し、タンパク質濃度をUV分光法(280nm)で分析した。複合体を滅菌濾過し、活性測定用及びSDS−PAGEとSE−HPLCによる特性評価用に試料を取った。必要に応じて、アリコートをタンパク質定量及びCA定量用に取り除いた。残りは、再び使用するまで、またSE−HPLCによる物理的安定性を調べるまで4±1℃で保管した。
インスリン(5808Da)を白色固体として供給した。このインスリンを、最小限量の100mM HClを添加して溶解し、所与のpHに調整して、氷上に置いた。複合化のために添加する14kDa CAの量は、下式に基づいて算出した。
14kDaCAOの重量={タンパク質の量(g)/(タンパク質の分子量)}×(CAOの分子量)×(CAOのモル過剰)
14kDa CAOの必要量を秤量した。14kDa CAOを、10mMリン酸バッファー、pH6.0に可溶化し(最終反応体積の20%体積をここで使用した)、すべての14kDa CAOが溶解するまでこの混合物を穏やかにボルテックス撹拌し、次いですべての凝集/沈殿物を除去すべく濾過して新しい容器に入れた。必要量のインスリンタンパク質溶液をこの14kDa CAO溶液に添加して7.5モル過剰(小規模)及び5モル過剰(大規模)の14kDa CAOを得、その反応混合物を4±1℃の穏やかな振とう機に置いておくことによって穏やかに混合した。100mg/ml NaCNBH3溶液を添加して最終反応混合物において63.5mM又は4mg/mlとなるようにし、穏やかに混合した後、最終反応混合物のpHを確認し、場合によって、4±1℃の0.5M NaOH/HClでpHを6.0に調整した。最後に、pH6.0の10mMのNaOAcを使って反応混合物の体積を調整し、反応混合物中のタンパク質濃度を1mg/mlとした。チューブを密封し、所望の温度(4±1℃)で24時間攪拌した。適当な方法によって反応を停止し、SDS−PAGE(18%トリスグリシンゲルを使用)、SE−HPLC(Superose 12カラム)用に試料を取り出し、反応混合物のpHを確認した。すべての沈殿物を取り除くために、SE−HPLC分析及び精製の前に、反応混合物を13000rpmで5分間遠心した。SE−HPLC用の好ましいバッファーは、0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.9)であった。
N末端誘導体化及び無作為誘導体化のために、インスリン上に一定範囲の分子量を有するCA(10〜30kDa)を用いて還元的アミノ化を実施した。複合化反応のためのプロセス変数の範囲を調べた。CAO 10〜20(小規模)及び5〜10(大規模)モル過剰。試薬=50〜100mM NaCNBH3、反応用バッファー=10mMリン酸バッファー、pH5〜7.4、温度=4〜37±1℃、時間=16〜24時間など。
混合物から遊離CAOを除去するために、HICを使用した。インスリン反応混合物を、濃縮(NH4)2SO4(例えば3M)、20mM Na2HPO4(pH7.4)を使った最小限の体積で希釈してローディング溶液を調製し、ローディング溶液の(NH4)2SO4濃度を0.8Mとする。pHが7.4であるかどうか確認し、7.4でなければ0.5M HCl/NaOHで調整する。このローディング溶液は0.2μm膜フィルターで濾過する必要がある。
洗浄:グラジエントシステム:IECバッファーA:90%、AEXバッファーB(20mMリン酸バッファー+1M NaCl、pH7.4):10%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:68%、IECバッファーB:32%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:35%、IECバッファーB:65%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
IECバッファーA:0%、IECバッファーB:100%、5CVでグラジエント及び3CVで洗浄、流速:0.25ml/分
精製複合体を含有するIEC画分を併せ、バッファーをPBSバッファーに変えて洗浄し塩を除去する。塩除去後のpHを7.4に調整する。次いで、溶液を4±1℃で濃縮し、タンパク質濃度をUV分光法(280nm)で分析する。複合体を滅菌濾過し、活性測定用及びSDS−PAGEとSE−HPLCによる特性評価用に試料を取った。必要に応じて、アリコートをタンパク質定量及びCA定量用に取り除いた。残りは、再び使うまで、またSE−HPLCによる物理的安定性を調べるまで4±1℃で保管した。
4℃で冷蔵されたJasco AS−2057 plusオートサンプラー、Jasco UV−975 UV/VIS検出器を装備したLiquid Chromatograph(JASCO)でHPLCを実施した。データは、IBM/PCでEZchrom Eliteソフトウェアを使って記録した。SEC試料を、0.1Mリン酸ナトリウム、pH6.9の均一濃度の移動相を用いて、Superose 12カラムで分析した(図8)。図8は、インスリンに起因すると考えられる、RT=75.408におけるただ1つのピークを示す。
18%トリグリインゲル(triglyine gel)を用いてSDS−PAGEを行った。試料を還元又は非還元バッファーのいずれかで希釈し、タンパク質5.0μgを各ウェルにロードした。ゲルをトリグリセリン緩衝系で泳動し、クーマシーブルーで染色した(図5及び7)。抗PSA抗体を使ってウェスタンブロットを行った。図4は、インスリン製剤(部位特異的、N−末端)のSDS−PAGEを示す。
Novex(登録商標)IEFゲルを用いて、インスリンとCAO−インスリン複合体等電点の差を測定した。試料を溶解して0.5mg/ml濃度とした。5μlの試料を5μlのNovex IEF試料バッファー、pH3〜10で希釈した後、タンパク質試料をゲルにロードした。
滅菌インスリン複合体をPBSバッファー中、4℃で、6週間保管した。試料の未変性PAGEを毎週行った。
インスリン製剤のin vivoでの有効性を、雌CD−1マウス、7〜8週齢で調べた。0.3 IUのタンパク質量(同一の活性)をマウスに皮内注射した。マウスは4匹ずつ7群に分け、インスリン製剤を、各群の各マウスに下記のように投与した。インスリン(0.3 IU/マウス)、Lantus(Aventis)インスリン−PSA複合体(14kDa)、PBS。各マウスから血液1滴を取り、血中グルコースをアキュチェックアクティブ(ACCU−CHEK Active)(Roche Diagnostics)で測定した。
CAの活性化及び酸化度の測定
N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)残基の線状α−2,8結合ホモポリマーであるコロミン酸(CA)を使用した。20mM過ヨウ素酸塩を用いて、コロミン酸の酸化曝露を室温で15分間実施した。過ヨウ素酸塩処理後の内部α−2,8結合Neu5Ac残基の完全性を、ゲル浸透クロマトグラフィーで分析し、酸化(CAO)物質に関して得られたクロマトグラフを、未酸化CAのクロマトグラフと比較した。酸化CA及び未酸化CAはほぼ一致した溶離プロファイルを呈していることが分かったが、連続する酸化工程がポリマー鎖の著しい開裂を引き起こしているという証拠はない。
温度、反応剤モル比、及び鎖長を変えながら、CAOとrh−インスリン1mgを使ってポリシアル化条件を最適化した。結果を図5〜12に示す。4℃は、CAOとインスリンの反応の間の安定性に関して最適な温度であるように思われる。しかし、これより高い温度では、複合化がより大きくなり、CAOのインスリンに対するモル比が7.5:1でより効果的になることができる。
15kDa CAO−インスリンのin vivo有効性に及ぼすpHの影響から、pH6.0の方がpH7.4よりもより有効であることが分かった。したがって、以後の実験はpH6.0で実施した。ペプチドマッピング及びエドマン分解からのデータによって、pH6.0のポリシアル化条件で得られた複合体が、インスリンB鎖においてN末端で特異的にブロックされることが確認された。
単分散CAO−インスリンをうまく複合化することができ、高度に純粋な複合体をスケールアップHIC及びIECによって精製することができた。精製効率は、図10に明示するようなIEC及びHICを分取HPLC機器と組み合わせた装置によって向上した。
700mgの出発反応物としてのインスリンの例では、スケールアップカラム精製を使って230mgの14kDa CAO−インスリン(タンパク質重量)を得た。
Claims (19)
- タンパク質の多糖誘導体の集団を含む組成物であって、前記タンパク質はインスリン又はインスリン様タンパク質であり、前記多糖はポリシアル酸であり、20個から125個の間のシアル酸ユニットを含み、前記集団のうち少なくとも85%がB鎖のN末端のみで誘導体化されている組成物。
- 前記ポリシアル酸がシアル酸ユニットのみからなる請求項1に記載の組成物。
- 前記インスリン又はインスリン様タンパク質が、前記多糖により、前記多糖の還元末端ユニットにおいて誘導体化されている請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記多糖誘導体が一般式(I)で表される、請求項1又は2に記載の組成物
HNBは、インスリン又はインスリン様タンパク質のB鎖のN末端であるB−NH2に由来し、
Lは、結合又は連結基であり、又はポリペプチドを
含み、
GlyOは、シアル酸ユニットであり、
前記連結基は、存在する場合、一般式−Y−C(O)−R1−C(O)−で表され、
YはNR2又はNR2−NR2であり、R1はアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレンからなる群から選択される二官能有機基であり、これらはいずれもカルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド及び/又はアミン結合によって置換及び/又は介在されていてよく、
R2はH又はC1−6アルキルである]。 - 前記多糖が20〜60個のシアル酸ユニットを含む、請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
- 前記アニオン性多糖の多分散度が1.3未満である、請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
- 医薬組成物であって、1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項1から7のいずれかに記載の組成物。
- 治療に使用するための、請求項1から7のいずれかに記載の組成物。
- 前記集団のうち、少なくとも90%がB鎖のN末端のみで誘導体化されている請求項1〜9の何れかに記載の組成物。
- 前記集団のうち、少なくとも95%がB鎖のN末端のみで誘導体化されている請求項10に記載の組成物。
- インスリン又はインスリン様タンパク質の多糖誘導体を製造する方法であって、20〜125個のシアル酸ユニットを含む酸化ポリシアル酸であるアニオン性多糖を、インスリン又はインスリン様タンパク質のB鎖のN末端アミンと、還元的条件下のpH範囲4.0〜6.0の酸性pHの第1の水溶液中で化学的に反応させ、
これによって得られる多糖誘導体が、pH範囲6.5〜8.5の第2の水性溶液中で精製され、
産生した多糖誘導体のうち、少なくとも85%が、B鎖のN末端のみで誘導体化される方法。 - 前記アニオン性多糖がインスリン又はインスリン様タンパク質と反応する反応性アルデヒド基を有する請求項12に記載の方法。
- 前記反応性アルデヒド基が前記多糖の非還元末端にある、請求項13に記載の方法。
- 前記反応性アルデヒドが前記多糖の還元末端にあり、前記非還元末端は、インスリン又はインスリン様タンパク質と反応しないように不動態化されている、請求項13に記載の方法。
- 前記アニオン性多糖又は反応中間体が、インスリン又はインスリン様タンパク質の末端アミン基と反応する、請求項12から15のいずれかに記載の方法。
- 1種又は複数のバッファーから選択される製剤添加剤の存在下で実施される、請求項12から16のいずれかに記載の方法。
- 前記の産生した誘導体のうち、少なくとも90%がB鎖のN末端のみで誘導体化される請求項12〜17の何れかに記載の方法。
- 前記の産生した誘導体のうち、少なくとも95%がB鎖のN末端のみで誘導体化される請求項18に記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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---|---|---|---|---|
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US7691826B2 (en) | 2003-08-12 | 2010-04-06 | Lipoxen Technologies Limited | Polysialic acid derivatives |
ES2521490T3 (es) | 2006-12-15 | 2014-11-12 | Baxter International Inc. | Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico con una vida media in vivo prolongada. |
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RU2472806C1 (ru) * | 2008-10-20 | 2013-01-20 | Юсв Лимитед | Усовершенствованный способ пегилирования белков |
WO2010051335A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Amgen Inc. | Materials and methods relating to stem cell mobilization by multi-pegylated granulocyte colony stimulating factor |
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WO2011156242A2 (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Lpath, Inc. | Improved anti-lysophospholipid antibody design using antibody structures |
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KR20210151780A (ko) * | 2019-02-04 | 2021-12-14 | 제네틱 바이오사이언시스, 인코포레이티드 | 글리코폴리시알화된 치료 단백질 사용 방법 |
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Family Cites Families (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
DE2930542A1 (de) | 1979-07-27 | 1981-02-12 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate und verfahren zu ihrer herstellung |
US5308617A (en) * | 1988-08-10 | 1994-05-03 | Halzyme Ltd. | Protein heparin conjugates |
AU646822B2 (en) | 1989-10-13 | 1994-03-10 | Kirin-Amgen Inc. | Erythropoietin isoforms |
US7217689B1 (en) * | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
US5846951A (en) | 1991-06-06 | 1998-12-08 | The School Of Pharmacy, University Of London | Pharmaceutical compositions |
GB9112212D0 (en) | 1991-06-06 | 1991-07-24 | Gregoriadis Gregory | Pharmaceutical compositions |
NO924985L (no) | 1991-12-30 | 1993-07-01 | Akzo Nv | Thyroaktiv blanding med vedvarende frigjoering |
JP2747967B2 (ja) * | 1993-07-23 | 1998-05-06 | 雪印乳業株式会社 | シアル酸粉末 |
US20030053982A1 (en) | 1994-09-26 | 2003-03-20 | Kinstler Olaf B. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
BR9815602A (pt) * | 1997-08-05 | 2001-12-11 | Bioniche Inc | Composição e processo para induzir uma respostaem células sensìveis de um animal para tratar umcancer |
WO1999043307A1 (en) | 1998-02-26 | 1999-09-02 | Prange Arthur J Jr | Thyroid hormone replacement using sustained release triiodothyronine |
RU2141531C1 (ru) | 1999-05-26 | 1999-11-20 | Российское акционерное общество открытого типа "Биопрепарат" | Способ получения рекомбинантного инсулина человека |
US6323311B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
DE60116137T2 (de) * | 2000-05-16 | 2006-08-24 | Lipoxen Technologies Ltd. | Derivatisierung von proteinen in wässrigem lösungsmittel |
US7276252B2 (en) | 2000-05-18 | 2007-10-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Method and form of a drug delivery device, such as encapsulating a toxic core within a non-toxic region in an oral dosage form |
US7118737B2 (en) * | 2000-09-08 | 2006-10-10 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Polymer-modified synthetic proteins |
WO2002032957A1 (fr) | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Erythropoietine modifiee par peg |
CA2431964C (en) | 2000-12-20 | 2013-09-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg) |
KR100401296B1 (ko) | 2000-12-27 | 2003-10-11 | 드림바이오젠 주식회사 | 수식물질에 의해 수식된 단백질 변이체 및 이것의 제조방법 |
US7125843B2 (en) * | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
ES2516041T3 (es) | 2001-10-10 | 2014-10-30 | Ratiopharm Gmbh | Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH) |
AU2002351746A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-15 | Maxygen Aps | Erythropoietin conjugates |
ITPD20010302A1 (it) | 2001-12-28 | 2003-06-28 | Bbs Riva Spa | Dispositivo idraulico per pompare e / p intercettare metallo allo stato fuso |
US6763226B1 (en) | 2002-07-31 | 2004-07-13 | Computer Science Central, Inc. | Multifunctional world wide walkie talkie, a tri-frequency cellular-satellite wireless instant messenger computer and network for establishing global wireless volp quality of service (qos) communications, unified messaging, and video conferencing via the internet |
EP1681303B1 (en) | 2002-09-11 | 2013-09-04 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
ES2214166T1 (es) * | 2002-09-11 | 2004-09-16 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada. |
AU2003253399B2 (en) * | 2002-09-11 | 2010-10-14 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin |
EP2599502B1 (en) | 2003-04-11 | 2017-03-01 | Antriabio, Inc. | Method for preparation of site-specific protein conjugates |
JPWO2004101619A1 (ja) | 2003-05-15 | 2006-10-26 | 塩野義製薬株式会社 | 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成 |
US7074755B2 (en) | 2003-05-17 | 2006-07-11 | Centocor, Inc. | Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives |
EP1651661B1 (en) | 2003-07-03 | 2008-08-27 | Cipla Ltd. | Process for the preparation of finasteride form i |
WO2005016794A2 (en) | 2003-08-05 | 2005-02-24 | Dematic Corp. | Motorized roller transverse drive |
CA2844154C (en) | 2003-08-06 | 2016-12-20 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Polysaccharide-protein conjugate vaccines |
PL1660134T3 (pl) * | 2003-08-08 | 2011-05-31 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Koniugaty hydroksyalkiloskrobi i G-CSF |
WO2005016949A2 (en) * | 2003-08-12 | 2005-02-24 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives |
US7691826B2 (en) * | 2003-08-12 | 2010-04-06 | Lipoxen Technologies Limited | Polysialic acid derivatives |
AU2004293103C1 (en) * | 2003-11-24 | 2010-12-02 | Ratiopharm Gmbh | Glycopegylated erythropoietin |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
KR101237884B1 (ko) * | 2003-12-03 | 2013-02-27 | 바이오제너릭스 에이지 | 글리코 peg화 과립구 콜로니 자극인자 |
CN101659704A (zh) * | 2004-03-11 | 2010-03-03 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物 |
FR2868071B1 (fr) * | 2004-03-26 | 2006-06-09 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
DE102004030392A1 (de) | 2004-06-23 | 2006-01-19 | Endress + Hauser Flowtec Ag, Reinach | Meßwandler vom Vibrationstyp |
WO2006014148A2 (fr) | 2004-08-04 | 2006-02-09 | Sergey Alexandrovich Orlov | Procede permettant d'organiser un processus de jeu a action intermittente |
GB2416993A (en) | 2004-08-11 | 2006-02-15 | Dinesh Verma | Opthalmic prosthesis |
JP5026266B2 (ja) | 2004-08-12 | 2012-09-12 | リポクセン テクノロジーズ リミテッド | 分別 |
EP1776389B1 (en) * | 2004-08-12 | 2016-06-29 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives |
EP1858543B1 (en) | 2005-01-10 | 2013-11-27 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
TWI376234B (en) * | 2005-02-01 | 2012-11-11 | Msd Oss Bv | Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide |
EP1853634B1 (en) | 2005-02-23 | 2016-08-10 | Lipoxen Technologies Limited | Activated sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation |
JP3989936B2 (ja) * | 2005-04-07 | 2007-10-10 | 進 須永 | 抗腫瘍剤及び新規dnアーゼ |
WO2007047997A2 (en) | 2005-10-19 | 2007-04-26 | Smartcells, Inc. | Methods for reducing the mitogenicity of lectin compositions |
CN103169984B (zh) * | 2006-07-25 | 2016-08-03 | 利普生技术有限公司 | N末端聚唾液酸化 |
EP2455090A4 (en) | 2009-07-16 | 2013-01-02 | Kao Corp | MEANS TO INHIBIT THE INCREASE OF THE POSTPRANDIAL BLOOD INSULIN MIRROR |
UY34346A (es) | 2011-09-26 | 2013-04-30 | Novartis Ag | Proteínas de fusión para tratar trastornos metabólicos |
-
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013049675A (ja) * | 2006-07-25 | 2013-03-14 | Lipoxen Technologies Ltd | N末端ポリシアリル化 |
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