ES2581983T3 - Derivados de polisacáridos de la eritropoyetina - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que es un derivado de polisacárido N- terminal de la eritropoyetina (EPO), o de una proteína similar a EPO, la proteína similar a EPO es un homólogo de EPO que tiene al menos 50% de la actividad de la EPO y tiene 90% o más de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos con los residuos 28- 193 de la sec. con núm. de ident.: 1, en donde el polisacárido es ácido polisiálico y comprende entre 2 y 200 unidades de sacárido.

Description

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DESCRIPCION
Derivados de polisacaridos de la eritropoyetina
La presente invencion se refiere a nuevos derivados de polisacaridos de la EPO y metodos para producir tales derivados. Los derivados son utiles para mejorar la estabilidad, farmacocinetica y farmacodinamica de la EPO.
La eritropoyetina es una hormona glicoproteica y es una citoquina de los precursores de eritrocitos (globulos rojos) en la medula osea. Ademas llamada hematopoyetina o hemopoietin, se produce por el rinon, y regula la produccion de globulos rojos.
La eritropoyetina es el principal regulador de la eritropoyesis en el cuerpo. (Martindale, 1996). La eritropoyetina humana recombinante esta disponible comercialmente en formas conocidas como epoetina alfa y epoetina beta. Estas se usan en el manejo de la anemia en pacientes con insuficiencia renal cronica. La epoetina gamma ademas esta disponible. Todos tienen la misma secuencia de 165 aminoacidos, pero difieren en su patron de glicosilacion.
La eritropoyetina humana recombinante se debe usar con precaucion en pacientes con hipertension, antecedentes de convulsiones, trombocitosis, insuficiencia hepatica cronica, enfermedad vascular isquemica, o en pacientes con tumores malignos. La epoetina alfa y beta exhiben algunas diferencias en su farmacocinetica, posiblemente debido a diferencias en la glicosilacion y en la formulacion de las preparaciones comerciales. La epoetina alfa se absorbe lentamente y de forma incompleta despues de la inyeccion subcutanea y se ha reportado una biodisponibilidad de aproximadamente 10 a 50% con relacion a la administracion intravenosa. La epoetina beta se absorbe ademas lentamente y de forma incompleta y su biodisponibilidad absoluta se ha reportado que es alrededor de 40%.
Se han hecho intentos para derivatizar la EPO para mejorar sus propiedades farmacocineticas. Existe un producto en desarrollo por Roche, conocido como CERA (Activador Continuo del Receptor de Eritropoyesis), que es una forma de EPO derivatizada con polietilenglicol. Esto se ha demostrado que tienen una vida media mas larga que la EPO, reduciendo la necesidad de inyecciones frecuentes. Un nuevo agente estimulante adicional de la eritropoyesis es el Hematide, un peptido sintetico nuevo, PEGilado, para el tratamiento de la anemia asociada con la enfermedad renal cronica y el cancer. Esto se describe adicionalmente por Fan y otros (2006).
Otras formas de EPO se han desarrollado, ademas, tal como Darbepoetina, un analogo hiperglicosilado de eritropoyetina humana recombinante que tiene alrededor de tres veces mas larga la vida media terminal despues de la administracion i.v. que la EPO humana recombinante y la hormona natural.
El documento EP1219636 describe mutemas modificadas de EPO producidas a partir de un microorganismo con una vida media plasmatica prolongada en la circulacion. Una tecnica de smtesis de protemas libres de celulas se usa para producir una mutema de EPO con un aminoacido no natural que puede reaccionar con un modificador tal como pEg o un polisacarido. Generalmente, el PEG se une a un grupo sulfhidrilo libre en las mutemas de EPO.
El documento US7,128,913 se dirige a los conjugados N— terminal de la EPO con PEG. Los conjugados tienen una mayor vida media en circulacion y tiempo de residencia en el plasma.
El documento US2004/0082765 describe un mejor metodo para generar EPO conjugada a PEG. Los inventores encontraron que una composicion de conjugados que tiene 1— 3 moleculas de PEG lineales por molecula rhEPO proporciona la eficacia mas sostenida.
El documento US7,074,755 aborda ademas el problema de proporcionar composiciones mejoradas de conjugados de EPO activos biologicamente. La EPO se conjuga covalentemente a un polfmero hidrofflico no antigenico enlazado covalentemente a una molecula organica que aumenta la vida media serica en circulacion de la composicion. El polfmero soluble en agua puede ser un oxido de polialquileno, una poliamida, o un carbohidrato, entre otros.
Sin embargo, no ha habido ningun trabajo publicado hasta la fecha que describe la derivatizacion de la EPO con polisacaridos anionicos tal como el acido polisialico (PSA).
Los acidos polisialicos (PSA) son polfmeros no ramificados de acido sialico de origen natural producidos por ciertas cepas bacterianas y en los mairnferos en ciertas celulas. Pueden producirse en varios grados de polimerizacion de n = aproximadamente 80 o mas residuos de acido sialico hacia abajo a n = 2 mediante hidrolisis acida limitada o mediante digestion con neuraminidasa, o mediante fraccionamiento de las formas del polfmero natural, derivadas de bacterias.
En los ultimos anos, las propiedades biologicas de los acidos polisialicos, particularmente las del acido polisialico homopolimerico alfa— 2,8 enlazado, han sido explotadas para modificar las propiedades farmacocineticas de las protemas y moleculas de bajo peso molecular del farmaco. La derivatizacion del acido polisialico da lugar a mejoras espectaculares en la vida media en circulacion de un numero de protemas terapeuticas, que incluyen la catalasa y la asparaginasa, y permite ademas a tales protemas ser usadas en el hecho de que los anticuerpos pre— existentes aumentan como una consecuencia indeseable (y a veces inevitable) de la exposicion previa a la protema terapeutica. El
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acido polisialico alfa 2,8 enlazado ofrece una alternativa atractiva a PEG, siendo un poKmero biodegradable invisible inmunologicamente que es naturalmente parte del cuerpo humano, y que se degrada, a traves de neuraminidasas de tejido, a acido sialico, un sacarido no toxico.
Hemos descrito previamente metodos para la fijacion de polisacaridos (en particular PSA) a los agentes terapeuticos, tales como las protemas [US— A— 5846,951; WO— A— 0187922]. Algunos de estos metodos dependen tras la derivatizacion qmmica del extremo 'no reductor' del polfmero para crear una porcion aldehndo reactiva de la protema que reacciona en los grupos de amina primaria. Una unidad terminal de acido sialico no reductor, ya que contiene dioles vecinales, puede oxidarse facilmente (y selectivamente) con peryodato para producir una forma mono— aldehndo, que es mucho mas reactivo hacia las protemas, y que comprende un elemento adecuadamente reactivo para la union de protemas a traves de la aminacion reductora y otras qmmicas. La reaccion se ilustra en las Figuras 1 y 2 en donde;
La Figura 1 muestra la oxidacion del acido colommico (acido polisialico alfa— 2,8 enlazado de E. coli) con peryodato de sodio para formar un aldehndo reactivo de la protema en el extremo no reductor; y
La Figura 2 muestra la reduccion selectiva de la base de Schiff con cianoborohidruro de sodio para formar un enlace covalente irreversible estable con el grupo amino de la protema.
Durante las reacciones de conjugacion convencionales descritas anteriormente pueden generarse subproductos involuntarios mediante, por ejemplo, la reaccion del acido colommico con cadenas laterales de aminoacidos. Estos pueden ser suficientes para ser problematicos en la fabricacion de los conjugados qmmicamente definidos de acuerdo con las autoridades reguladoras para el uso terapeutico en el hombre y los animales.
No es sencillo purificar el producto de reaccion previsto (por ejemplo el producto monopolisialilado) separado de los diferentes productos no deseados, ya que las caractensticas fisicoqmmicas de la mayor parte de los productos de reaccion son similares. Esto significa que las tecnicas como la cromatograffa de intercambio ionico y cromatograffa de permeacion en gel (que separan sobre la base de la carga y tamano respectivamente) producen perfiles de purificacion pobres. Este problema puede superarse reduciendo la complejidad del producto en la reaccion de conjugacion.
El documento US 5305617 describe conjugados de fragmentos de heparina con activadores del plasminogeno, EPO, hormonas o anticuerpos. Los conjugados resultantes tienen una vida media mas larga que la protema nativa y son capaces de entregar la heparina al sitio de formacion de coagulos o prevenir la reoclusion con el torrente sangumeo.
El documento WO 2005/092928 describe conjugados de hidroxialquil almidon (HAS) y una protema, donde los conjugados se forman mediante una reaccion de aminacion reductora entre al menos un aldetndo, ceto, o derivado hemiacital de HAS y al menos un grupo amino de la protema. El documento WO 2005/092928 describe ademas que los derivados HAS pueden enlazarse predominantemente con el grupo amino N— terminal de una protema cuando la reaccion de aminacion reductora se lleva a cabo a un pH en el intervalo de 4— 7.
El documento EP 1681303 describe conjugados de almidon hidroxialquilo (HAS) y una protema donde el HAS se conjuga a la protema a traves de una porcion de carbohidrato o un tioeter. La porcion de carbohidrato puede enlazarse directamente a la cadena principal del polipeptido como parte de la cadena lateral de carbohidrato.
Hemos desarrollado un nuevo metodo para la conjugacion de los polisacaridos a las protemas mediante el cual puede utilizarse la alta reactividad del N— terminal de la protema y que evita la complejidad del producto obtenido por el metodo establecido (Figuras 1 y 2) de aminacion reductora de protemas con el acido colommico natural oxidado con peryodato.
En vista de la tecnica anterior, existe una necesidad de proporcionar mejores derivados de EPO que pueden usarse en la terapia humana y animal y tienen estabilidad, vida media optimizada y baja toxicidad. Hemos encontrado que fijar polisacaridos tales como los PSA a EPO imparte tales propiedades y de ese modo han llegado a esta invencion. Esta es la primera vez que se ha descrito la EPO enlazada a polisacaridos anionicos.
De acuerdo con un primer aspecto de esta invencion, proporcionamos un compuesto que es un derivado de polisacarido N— terminal de la EPO, o de una protema similar a EpO, siendo la protema similar a EPO un homologo de EPO que tiene al menos 50% de la actividad de EPO y que tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con los residuos 28— 193 de la sec. con num. de ident.: 1, en donde el polisacarido es acido polisialico y comprende entre 2 y 200 unidades de sacarido.
La invencion proporciona ademas un metodo para producir una poblacion de derivados de acido polisialico N— terminal (PSA) de la eritropoyetina (EPO) o de una protema similar a EPO, siendo la protema similar a EPO un homologo de EPO que tiene al menos 50% de la actividad de EPO y que tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con los residuos 28— 193 de sec. con num. de ident.: 1, el metodo comprende las etapas de:
a) reaccionar qmmicamente el grupo amino terminal de la protema EPO o similar a EPO con PSA o intermediario de la reaccion en una primera solucion acuosa de pH acido; en donde el PSA comprende 2— 200 unidades de sacarido;
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y en donde el PSA tiene un aldehudo reactivo en el extremo reductor y un extremo no reductor pasivado de manera que no reacciona con la protema EPO o similar a EPO; y
b) purificar la poblacion de los derivados de PSA amino— terminal resultantes de la EPO o protema similar a EPO en una segunda solucion acuosa de pH mayor que la primera solucion acuosa;
en donde al menos el 85% de los derivados de PSA de EPO o protema similar a EPO se derivatizan solo en el extremo N— terminal de la EPO o protema similar a EPO.
La invencion proporciona ademas una composicion que comprende una poblacion de derivados de acido polisialico (PSA) de la eritropoyetina (EPO), o de una protema similar a EPO, siendo la protema similar a EPO un homologo de EPO que tiene al menos 50% de la actividad de EPO y que tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con los residuos 28— 193 de sec. con num. de ident.: 1,
en donde el PSA comprende entre 2 y 200 unidades de sacarido y
en donde al menos el 85% de los derivados de PSA de EPO o protema similar a EPO se derivatizan solo en el extremo N— terminal de la EPO o protema similar a EPO.
En lo sucesivo, cuando se usa el termino EPO, pretendemos ademas cubrir las protemas similares a EPO. Por protema similar a EPO, se entiende una protema que tiene una actividad equivalente a la de EPO. La EPO regula la produccion de eritrocitos, como se detallo anteriormente. La actividad de la EPO o una protema similar a EPO puede medirse usando un ensayo estandar como se describe en Krystal (1983). La actividad de las muestras de EPO se mide al inducir la proliferacion in vitro de celulas progenitoras de eritrocitos aislados del bazo de un raton. Los ratones se han dejado previamente anemicos artificialmente a traves de inyeccion I.P. de fenilhidrazina. En el ensayo, la EPO se anade a los progenitores de eritrocitos y la velocidad de replicacion del ADN se mide determinando la velocidad de incorporacion de 3H— timidina. Una protema se clasifica como "similar a EPO" si induce de 10— 200% de la velocidad de replicacion en comparacion con el estandar de EPO de NIBSC. Tfpicamente, una protema similar a EPO tiene al menos 50% de la actividad de la EPO estandar.
Los mutantes de EPO que tienen la actividad requerida, como se detallo anteriormente, pueden usarse tambien. Una protema "similar a EPO" puede denominarse ademas como un "homologo de EPO". Si dos secuencias son homologas se calcula de forma rutinaria usando un porcentaje de similitud o identidad, terminos que son bien conocidos en la tecnica. Las secuencias deben ser comparadas con la sec. con num. de ident.:1, que es el precursor de la EPO humana con numero de acceso SwissProt PO1588. La EPO activa es los residuos 28— 193 de esta secuencia. Las secuencias homologas de EPO pueden compararse ya sea con la sec. con num. de ident.:1 completa, o los residuos 28— 193 de esta. Preferentemente, las secuencias homologas de EPO se comparan con la EPO activa, es decir, los residuos 28— 193.
En esta invencion, los homologos tienen 90% o mas, tal como 95% o 99% de identidad o similitud en el nivel de aminoacidos. Un numero de programas estan disponibles para calcular la similitud o identidad; programas preferidos son los programas BLASTn, BLASTp y BLASTX, corren con los parametros por defecto, disponibles en
www.ncbi.nlm.nih.gov. Por ejemplo, 2 secuencias de aminoacido pueden compararse usando el programa BLASTn con parametros por defecto (puntuacion = 100, longitud de palabra = 11, valor esperado = 11, filtro de baja complejidad = encendido). Los niveles anteriores de homologfa pueden calcularse usando estos parametros por defecto.
La EPO puede ser glicosilada o no glicosilada. Cuando la EPO es glicosilada, el compuesto comprende tipicamente 2— 100 unidades de sacarido. Mas tfpicamente, el compuesto comprende 10— 80 unidades de sacarido, preferentemente 20— 60 unidades de sacarido, con preferencia superlativa 40— 50 unidades de sacarido.
Cuando la EPO es no glicosilada, el compuesto comprende tfpicamente 80— 180 unidades de sacarido, preferentemente 100— 150 unidades de sacaridos, con mayor preferencia 120— 145, con preferencia superlativa 130— 140 unidades.
Preferentemente, el polisacarido anionico tiene al menos 2, con mayor preferencia al menos 5, con preferencia superlativa al menos 10, por ejemplo al menos 50 unidades de sacarido.
Preferentemente, el acido polisialico consiste esencialmente solo de unidades de acido sialico. Sin embargo, el polisacarido puede tener unidades distintas de acido sialico en la molecula. Por ejemplo, las unidades de acido sialico pueden alternar con otras unidades de sacarido. Preferentemente, sin embargo, el polisacarido consiste esencialmente en unidades de acido sialico.
El compuesto es un derivado N— terminal de la EPO o de una protema similar a EPO, es decir, el polisacarido se asocia con la EPO en su extremo N— terminal. En esta especificacion, por derivatizacion en el N— terminal, se entiende la derivatizacion en el grupo amino N— terminal de la EPO.
Preferentemente, el polisacarido tiene un grupo de acido sialico terminal, y como se detallo anteriormente, es con mayor
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preferencia un acido polisialico, que es un polisacarido que comprende al menos 2 unidades de acido sialico unidas entre sf a traves de enlaces a— 2— 8 o a— 2— 9. Un acido polisialico adecuado tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 2 a 50 kDa, preferentemente en el intervalo de 5 a 50 kDa. Con preferencia superlativa, el acido polisialico se deriva de una fuente bacteriana, por ejemplo el polisacarido B de E. coli Kl, N. meningitidis, Maraxella liquefaciens o Pasteurella aeruginosa o polisacarido K92 de la cepa E. coli K92. Es con preferencia superlativa el acido colommico de E. coli K1.
El acido polisialico puede estar en forma de una sal o del acido libre. Puede estar en una forma hidrolizada, de manera que el peso molecular se ha reducido despues de la recuperacion a partir de una fuente bacteriana.
El polisacarido, que es preferentemente acido polisialico puede ser el material que tiene una amplia difusion de pesos moleculares tales como que tienen una polidispersidad de mas de 1.3, por ejemplo tanto como 2 o mas. Preferentemente, la polidispersidad (p.d.) de peso molecular es menos de 1.3, con mayor preferencia menos de 1.2, por ejemplo menos de 1.1. La p.d. puede ser tan bajo como 1.01.
La EPO puede derivatizarse con mas de un polisacarido anionico. Por ejemplo, la EPO puede derivatizarse tanto en su N— terminal como en una cadena lateral interna de aminoacidos. Las cadenas laterales de lisina, cistema, acido aspartico, arginina, glutamina, tirosina, acido glutamico, serina e histidina, por ejemplo, pueden derivatizarse por un polisacarido anionico. La EPO puede ademas derivatizarse en una unidad glycon. Sin embargo, en una modalidad preferida de esta invencion, la ePo se derivatiza en solo su extremo N— terminal.
En esta descripcion, por derivatizacion en el N— terminal, se entiende la derivatizacion en el grupo amino N— terminal de la EPO.
En un ejemplo, el compuesto puede ser un conjugado enlazado covalentemente entre la EPO y un polisacarido anionico. Otros medios de asociacion entre el polisacarido y la EPO incluyen la atraccion electrostatica. Sin embargo, se prefiere el enlace covalente. La EPO puede enlazarse covalentemente al polisacarido en su aminoacido del N— terminal. El enlace covalente puede ser un enlace amida entre un grupo carboxilo y un grupo amino. Otro enlace por el que la EPO puede unirse de forma covalente al polisacarido es a traves de una base de Schiff. Los grupos adecuados para conjugar a las aminas se describen adicionalmente en el documento WO2006/016168.
En la invencion, el polisacarido puede ser un polisacarido de origen natural, o un derivado de un polisacarido de origen natural, por ejemplo, un polisacarido que se ha derivatizado mediante una reaccion de uno o mas grupos activos en los residuos de sacarido, o que se ha unido covalentemente a un grupo de derivatizacion en el extremo de la cadena de polisacarido.
El polisacarido puede enlazarse a la EPO ya sea a traves de su unidad terminal reductora o no reductora. Esto significa que una cadena de polisacarido puede enlazarse a dos protemas EPO, es decir derivatizarse tanto en su extremo reductor como no reductor.
Los metodos para unir polisacaridos a protemas son bien conocidos en la tecnica y se describen con mas detalle en el documento WO92/22331 y WO— A— 0187922. Los metodos se describen ademas en las Figuras 1 y 2 de esta solicitud.
El polisacarido puede enlazarse a la EPO o protema similar a EPO directamente, es decir, como se muestra en las Figuras 1 y 2, o a traves de un enlazador. Los enlazadores adecuados se derivan de reactivos que contienen N— maleimida, vinilsulfona, N— yodoacetamida, ortopiridilo o N— hidroxisuccinimida. El enlazador puede ser bioestable o biodegradable y comprender, por ejemplo, un polipeptido o un oligomero sintetico. El enlazador puede derivarse de una porcion bifuncional, como se describe adicionalmente en el documento WO2005/016973. Un reactivo bifuncional adecuado es, por ejemplo, Bis— NHS. El reactivo puede tener la formula general Z— R1— Z en donde cada Z es un grupo funcional y puede ser el mismo o diferente y R1 es un radical organico bifuncional. Preferentemente, R1 se selecciona del grupo que consiste en alcanodiilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y alquilheteroarileno, cualquiera de los cuales puede sustituirse y/o interrumpirse por carbonilo, ester, sulfuro, eter, amida y/o enlaces de amina. Particularmente se prefiere C3— C6 alcanodiilo. Con preferencia superlativa, R1 corresponde a la porcion apropiada del reactivo bifuncional adecuado.
Un compuesto preferido de esta invencion es de formula general (I)
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en donde m es al menos uno;
XB se deriva de B— XH que es EPO o una protema similar a EPO en donde XH es NH2;
L es un enlace, un grupo de enlace, o comprende un polipeptido o un oligomero sintetico;
GlyO es una unidad de sacarido anionico;
en donde el grupo de enlace, si esta presente, es de formula general — Y— C(O)— R1— C(O)— ; en donde Y es NR2 o NR2— NR2 y R1 es un radical organico bifuncional como se definio anteriormente; y R2 es H o Ci— 6alquilo.
En este aspecto de la invencion, la EPO se enlaza al extremo no reductor del polisacarido. La unidad de polisacarido terminal es una unidad de acido sialico. Las otras unidades de sacarido en el polisacarido se representan por GLyO y pueden ser el mismo o diferente. Unidades de sacaridos adecuados incluyen heparina, acido hialuronico y sulfato de condroitina.
Cuando la EPO se une directamente al polisacarido, el grupo L es un enlace. Sin embargo, el grupo L, alternativamente, puede derivarse de un reactivo que contiene N— maleimida, vinilsulfona, N— yodoacetamida, ortopiridilo o N— hidroxisuccinimida. El reactivo puede tener la formula general Z— R1— Z como se definio anteriormente. En esta modalidad, L es tipicamente un grupo
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XH es NH2 y es el N— terminal de la EPO o protema similar a EPO.
En un ejemplo, se describe una composicion farmaceutica que comprende un nuevo compuesto como se definio anteriormente y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
La composicion farmaceutica puede estar en la forma de una suspension acuosa. Las suspensiones acuosas contienen los compuestos nuevos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Las composiciones farmaceuticas pueden estar en la forma de una suspension acuosa u homogenea inyectable esteril. Esta suspension puede formularse de acuerdo con la tecnica conocida usando agentes humectantes o dispersantes y agentes de suspension.
Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por via oral, por via intravenosa, por via intraperitoneal, por via intramuscular, por via subcutanea, por via intranasal, por via intradermica, por via topica o por via intratraqueal para uso humano o veterinario.
Las composiciones pueden comprender ademas un aditivo de la formulacion. Por aditivo de la formulacion se entiende un excipiente que es capaz de estabilizar la EPO ya sea interna o externamente, como se describe en Wang y otros (1999). El excipiente puede ser un estabilizador, un solubilizador o un ion metalico. Los ejemplos adecuados de aditivos de la formulacion incluyen uno o mas tampones, estabilizadores, tensioactivos, sales, polfmeros, iones metalicos, azucares, polioles o aminoacidos. Estos pueden usarse solos o en combinacion.
Los estabilizadores actuan tipicamente mediante la desestabilizacion del estado desnaturalizado de una protema conduciendo a un aumento del cambio de la energfa libre de Gibbs para el despliegue de la protema. El estabilizador es preferentemente un azucar o un poliol, por ejemplo sacarosa, sorbitol, trehalosa, glicerol, manitol, lactosa y etilenglicol. Un tampon estabilizante es el fosfato de sodio.
El solubilizante es preferentemente un tensioactivo, preferentemente un tensioactivo no ionico. Los ejemplos adecuados incluyen Tween 80, Tween 20, Tween 40, Pluoronic F68, Brij 35 y Triton X100.
El ion metalico es preferentemente divalente. Los iones metalicos adecuados incluyen Zn2+, Ni2+, Co2+, Sr2+, Cu2+ y Fe2+.
El aditivo de la formulacion puede ser ademas un polfmero seleccionado a partir de albumina de suero humano, PSA, PEG o hidroxi— beta— ciclodextrina.
Los aminoacidos adecuados y derivados de aminoacidos para el uso como el aditivo de la formulacion incluyen histidina, glicina, otros aminoacidos similares y aspartato de sodio.
En un ejemplo, existe una composicion que comprende una poblacion de derivados de polisacaridos anionicos de EPO
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o una protema similar a EPO, en donde los derivados comprenden entre 2 y 125 unidades de sacarido y en donde la poblacion consiste en esencialmente solo derivados N— terminal de la protema. Por "poblacion" se entiende que existe mas de un derivado de polisacarido en la composicion. Los derivados pueden comprender los mismos o diferentes numeros de unidades de sacarido. Preferentemente, la polidispersidad del polisacarido en la composicion es menos de
1.3, con mayor preferencia menos de 1.1. Los polisacaridos preferidos son como se detallo anteriormente para los otros aspectos de esta invencion.
En la poblacion, esencialmente toda la EPO se derivatiza solo en el extremo N— terminal. Por esto, se entiende que 85%, preferentemente al menos 90%, con preferencia superlativa al menos 95% de la protema en la poblacion se derivatiza con PSA solo en el extremo N— terminal.
El grado de derivatizacion en el N— terminal puede determinarse mediante tecnicas conocidas en la tecnica tales como mapeo de peptidos o Degradacion de Edman.
Un aspecto adicional de la invencion es un compuesto como se ha descrito anteriormente para uso en la terapia.
En un ejemplo, existe un metodo para producir un derivado de polisacarido de la EPO o de una protema similar a EPO en donde un polisacarido anionico que comprende 2— 200 unidades de sacarido se hace reaccionar qmmicamente con la EPO o protema similar a EPO.
Se observara que el polisacarido puede reaccionar en cualquier grupo en la EPO o protema similar a EPO. Por ejemplo, el polisacarido puede reaccionar con un grupo amina, hidroxilo, carboxilo o sulfhidrilo. Preferentemente, el grupo es un grupo amina terminal.
Los polisacaridos pueden enlazarse a las cadenas laterales de los aminoacidos mediante metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un polisacarido puede acoplarse a C— terminal, — COOH o carboxilo de cadenas laterales de Asp o Glu mediante acoplamiento in vitro. Los grupos tiol de aminoacidos cistema pueden ademas enlazarse a polisacaridos mediante el acoplamiento in vitro. Estos metodos se describen adicionalmente en el documento WO03/055526, en particular, la tabla de las paginas 6 y 7. En esta referencia, el acoplamiento, in vitro se usa ademas para enlazar una porcion de oligosacarido con el grupo amida en la cadena lateral de Gln. Se describen ademas los grupos imidazol in vitro de los residuos de Arg y de His respectivamente.
El polisacarido puede reaccionar ademas con una forma modificada de EPO. Por ejemplo, uno o mas grupos en la EPO pueden haber sufrido una transformacion qmmica, por ejemplo, mediante reduccion u oxidacion. Un carbonilo reactivo puede generarse en el lugar del grupo amino terminal de la EPO usando por ejemplo condiciones de oxidacion.
Los polisacaridos adecuados para el uso en el metodo de esta invencion son como se describieron anteriormente para los compuestos nuevos.
Los compuestos de la invencion pueden fabricarse por cualquiera de los metodos adecuados descritos en la tecnica anterior. Por ejemplo, un metodo tfpico se describe en nuestra solicitud de patente anterior WO92/22331.
Tfpicamente, el polisacarido anionico se ha activado antes de la derivatizacion con EPO. Puede, por ejemplo, tener un grupo aldehndo reactivo y la reaccion de derivatizacion pueden llevarse a cabo bajo condiciones de reduccion. El grupo aldehndo reactivo puede producirse mediante la oxidacion controlada de un grupo hidroxilo del polisacarido. Con preferencia superlativa, este aldetndo reactivo se genera en una etapa preliminar, en la que se hace reaccionar el polisacarido bajo condiciones de oxidacion controladas, por ejemplo usando peryodato de sodio, en solucion acuosa. Preferentemente, la oxidacion es una oxidacion qmmica, aunque pueden ademas usarse enzimas que son capaces de llevar a cabo esta etapa. El grupo aldehndo reactivo puede estar en el extremo no reductor o extremo reductor del polisacarido. La EPO, tipicamente el N— terminal, puede despues reaccionar con el grupo aldehndo reactivo para producir un aducto que, cuando se reduce, produce el derivado de la EPO N— terminal.
La activacion del polisacarido debe llevarse a cabo preferentemente bajo condiciones de manera que no existe esencialmente la escision a mitad de la cadena de la cadena principal del polisacarido, que no es esencialmente la reduccion del peso molecular. El oxidante es convenientemente perrutenato, o, preferentemente, peryodato. La oxidacion puede llevarse a cabo con peryodato en una concentracion en el intervalo de 1 mM a 1 M, a un pH en el intervalo de 3 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60°C durante un tiempo en el intervalo de 1 min a 48 horas.
Las condiciones reductoras adecuadas para la reaccion de derivatizacion pueden usar hidrogeno con catalizadores o, preferentemente hidruros, tales como borohidruros. Estos pueden inmovilizarse tales como borohidruro soportado con Amberlita (marca comercial). Preferentemente los hidruros metalicos alcalinos tal como borohidruro de sodio se usa como el agente reductor, a una concentracion en el intervalo de 1|jM a 0.1 M, un pH en el intervalo de 5.0 a 10, una temperatura en el intervalo de 0 a 60°C y un penodo en el intervalo 1 min a 48 horas. Las condiciones de reaccion se seleccionan de manera que no se reducen los grupos carboxilo colgante del material de partida. Otros agentes reductores adecuados son cianoborohidruro bajo condiciones acidas, por ejemplo, polfmero apoyado en
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cianoborohidruro o cianoborohidruro de metal alcalino, acido L— ascorbico, metabisulfito de sodio, L— selectrida, triacetoxiborohidruro etc.
Otros derivados activados de los polisacaridos pueden tener utilidad en la presente invencion, que incluyen aquellos con grupos funcionales colgantes tales como NHS, como se describe en nuestra anterior solicitud de patente WO06/00540.
En una modalidad, el aldelddo reactivo esta en el extremo reductor del polisacarido y el extremo no reductor se ha pasivado de manera que no reacciona con los grupos colgantes en la EPO.
La reactividad del extremo reductor del acido colommico, aunque debil hacia las protemas objetivo, es suficiente para ser problematico en la fabricacion de los conjugados qmmicamente definidos.
La qmmica adecuada para preparar un polisacarido con un aldelddo reactivo en el terminal reductor de un polisacarido se describe en nuestra Solicitud anterior WO05/016974. El proceso implica una etapa de oxidacion selectiva preliminar seguido por la reduccion y despues la oxidacion adicional para producir un compuesto con un aldelddo en el terminal reductor y un extremo no reductor pasivado.
El documento WO2005/016973 describe derivados de acido polisialicos que son utiles para la conjugacion a protemas, particularmente los que tienen farmacos con sulfhidrilo libre. El compuesto de acido polisialico se hace reaccionar con un reactivo heterobifuncional para introducir un grupo funcional colgante para la conjugacion espedfica de sitio a los grupos sulfhidrilo. Los polisacaridos anionicos usados en la presente invencion pueden derivatizarse ademas con un reactivo heterobifuncional de esta manera.
El polisacarido puede derivatizarse antes de que reaccione con la EPO. Por ejemplo, el polisacarido puede reaccionar con un reactivo bifuncional.
El polisacarido puede someterse a una etapa de reaccion preliminar, en la que un grupo seleccionado de un grupo amina primaria, un grupo amina secundaria y una hidrazina se forma en el sacarido terminal, que es preferentemente acido sialico, seguido de una etapa de reaccion en la que este se hace reaccionar con un reactivo bifuncional para formar un intermediario de la reaccion, como se describe adicionalmente en el documento WO2006/016168. El producto intermediario puede despues reaccionar con la EPO. El reactivo bifuncional puede tener la formula general Z— R1— Z, como se definio anteriormente.
Se encontro que ciertas condiciones de reaccion promueven la derivatizacion selectiva en el extremo N— terminal de la EPO. Para promover la reaccion selectiva en el extremo N— terminal, la reaccion de derivatizacion debe llevarse a cabo en una primera solucion acuosa de pH acido, y el derivado de polisacarido resultante debe purificarse despues en una segunda solucion acuosa de pH mayor que la primera solucion acuosa. Tfpicamente, el pH de la primera solucion acuosa esta en el intervalo de 4.0— 6.0 y el pH de la segunda solucion acuosa esta en el intervalo de 6.5— 9.0, preferentemente de 6.5— 8.5 o 6.5— 8.0. El pH bajo de la reaccion de derivatizacion promueve la derivatizacion selectiva en el extremo N— terminal de la protema en lugar de en cualquiera de los sitios a mitad de la cadena.
Ademas, encontramos que el uso de ciertos aditivos de la formulacion promueven la formacion de un derivado de EPO polisacarido, estable, selectivo. El aditivo de la formulacion puede seleccionarse de uno o mas tampones, estabilizadores, tensioactivos, sales, poffmeros, iones metalicos, azucares, polioles o aminoacidos. Estos pueden anadirse al medio de reaccion, o, alternativamente, pueden anadirse a la composicion del producto final, como un estabilizador.
En una modalidad de esta invencion, el aditivo de la formulacion es sorbitol, trehalosa o sacarosa. En una modalidad diferente, el aditivo de la formulacion es un tensioactivo no ionico. El aditivo de la formulacion puede ser alternativamente un poffmero seleccionado de PSA, PEG o hidroxi— beta— ciclodextrina. En una modalidad diferente el aditivo de la formulacion es un ion metalico divalente. Los iones metalicos divalentes incluyen Zn2+, Ni2+, Co2+, Sr2+, Fe2+, Mg2+ o Ca2+.
El aditivo de la formulacion puede ser un tampon. Preferentemente, cuando el aditivo de la formulacion es un tampon, este es fosfato de sodio.
La purificacion del derivado de polisacarido en el metodo de la presente invencion puede llevarse a cabo usando una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Los ejemplos de metodos de purificacion adecuados incluyen HIC (cromatograffa de interaccion hidrofobica), SEC (cromatograffa de exclusion por tamano), HPLC (cromatograffa ffquida de alta eficacia), AEC (cromatograffa de intercambio anionico) y cromatograffa de afinidad por metal.
Una poblacion de acidos polisialicos que tienen una distribucion de peso molecular amplia puede fraccionarse en fracciones con polidispersidades mas bajas, es decir en fracciones con diferentes pesos moleculares promedios. El fraccionamiento se realiza preferentemente por cromatograffa de intercambio anionico, usando para la elucion un tampon basico adecuado, como se describio en nuestras solicitudes de patente anteriores WO2005/016794 y WO2005/03149. El metodo de fraccionamiento es adecuado para un material de partida polisacarido,
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asf como con los derivados. La tecnica puede asf aplicarse antes o despues de las etapas esenciales del proceso de esta invencion. Preferentemente, el derivado de polisacarido resultante de la EPO tiene una polidispersidad de menos de 1.3, con mayor preferencia menos de 1.2, con preferencia superlativa menos de 1.1.
La derivatizacion de la EPO de acuerdo con esta invencion, resulta en una mayor vida media, estabilidad mejorada, inmunogenicidad reducida, y/o control de la solubilidad de la protema. Por lo tanto la biodisponibilidad y las propiedades farmacocineticas de la EPO se mejoran. El nuevo metodo es de particular valor para la creacion de un conjugado de EPO monopolisialilado.
La invencion se ilustra mediante los Ejemplos 1 a 3.12 y como referencia a los siguientes dibujos:—
La Figura 1 es un esquema de reaccion que muestra la activacion de la tecnica anterior de la unidad terminal de acido sialico no reductor;
La Figura 2 es un esquema de reaccion que muestra la derivatizacion N— terminal o aleatoria de las protemas;
La Figura 3a muestra la degradacion del acido colommico de 24kDa (CA) a diferentes valores de pH usando Deteccion Triple GPC (Viscotek: RI + RALS + Viscosfmetro);
La Figura 3b muestra la cromatograffa de permeacion en gel del polfmero CA;
La Figura 4 muestra la caracterizacion de EPO PEGilada y polisialilada mediante SDS— PAGE;
La Figura 5 muestra la caracterizacion de EPO polisialilada mediante SDS— PAGE (lado derecho) y SE— HPLC (lado izquierdo);
La Figura 6 muestra la caracterizacion de EPO, EPO polisialilada y PEGilada mediante SE— HPLC;
La Figura 7 muestra los datos de FACS para EPO (conteo de reticulocitos);
La Figura 8 muestra la eliminacion in vivo de las formulaciones de EPO;
La Figura 9 muestra la eliminacion in vivo de las formulaciones de EPO;
La Figura 10 muestra la caracterizacion de conjugados de EPO— CA mediante SE— HPLC;
La Figura 11 muestra la eliminacion in vivo de la EPO no glicosilada frente a la EPO polisialilada no glicosilada;
La Figura 12 muestra la eliminacion in vivo de la EPO no glicosilada frente a EPO polisialilada no glicosilada;
La Figura 13 muestra la caracterizacion de los conjugados NG— EPO— CA mediante SE— HPLC y SDS PAGE;
La Figura 14 muestra la deteccion de la EPO PSA mediante ELISA de tipo sandwich;
La Figura 15 muestra la sensibilidad de ELISA para EPO— PSA en diluyente reactivo;
La Figura 16 muestra la estabilidad de los conjugados de EPO mediante HPLC de exclusion por tamano;
La Figura 17 muestra SDS— PAGE de EPO polisialilada;
La Figura 18 muestra la eficacia in vivo de formulaciones de EPO (n=3— 4±SE) con ratones hembras consangumeos; de 12 semanas de edad; SC (qmmica aldehfdo);
Figura 19 eficacia in vivo de las formulaciones de EPO (ratas Wistar hembra; de 8— 9 semanas de edad, n=5±SEM); y La Figura 20 muestra muestra la PEGilacion de NG EPO mediante SE— HPLC.
EJEMPLOS
Materiales
Carbonato de amonio, etilenglicol, polietilenglicol (8KDa), cianoborohidruro de sodio (> 98% puro), metaperyodato de sodio y marcadores de peso molecular, sulfato de amonio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, sorbitol, Tween 20 y Tris se obtuvieron de Sigma Chemical laboratorio, Reino Unido. El acetato de sodio y el fosfato de sodio eran de BDH, Reino Unido. El acido colommico usado, acidos polisialicos lineales alfa— (2,8)— enlazado de E. coli K1 (promedio 22.7kDa, alta polidispersidad 1.34, 39kDa p.d. 1.4; 11 kDa, p.d. 1.27) fue de Camida, Ireland y S.I.I.L. India Ltd. Otros materiales
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incluyen 2,4 dinitrofenil hidrazina (Aldrich Chemical Company, Reino Unido), tubo de dialisis (Kmites de corte 3.5KDa y 10 kDa; Medicell International Limited, Reino Unido), columnas Sefarosa SP HiTrap, columnas PD— 10, Q FF [columna de 1 ml o 5 ml]; columna Hitrap butilo HP [1 o 5 ml]; (Pharmacia, Reino Unido), geles de poliacrilamida con Tris— glicina (4— 20% y 8— 16%), tampon de corrida y de carga Tris— glicina dodecilsulfato de sodio (Novex, Reino Unido). Se obtuvo agua desionizada de una unidad de purificacion de agua Elgastat Option 4 (Elga Limited, Reino Unido). Todos los reactivos usados fueron de grado analftico. Se uso un lector de placas (Dynex Technologies, Reino Unido) para las determinaciones espectrofotometricas en los ensayos de protemas o CA. Los ratones y las ratas se compraron de Harlan, Reino Unido y aclimataron durante al menos una semana antes de su uso. La EPO se obtuvo de SIIL, India,
1. Determinacion de protema y acido colominico
La estimacion cuantitativa de acidos polisialicos (como acido sialico) con el reactivo resorcinol se llevo a cabo por el metodo de resorcinol [Svennerholm, 1957] como se describio en otra parte [Gregoriadis y otros, 1993; Fernandes y Gregoriadis, 1996, 1997]. La protema se midio mediante el metodo colorimetrico BCA o absorbancia UV a 280 nm.
2.1. Activation del acido colommico
La solucion recien preparada de metaperyodato de sodio (NaIO4) 0.02 M (exceso molar de 8 veces) se mezclo con CA a 20°C y la mezcla de reaccion se agito magneticamente durante 15 min en la oscuridad. Despues, se anadio un volumen de dos veces de etilenglicol a la mezcla de reaccion para gastar el exceso de NaIO4 y la mezcla se dejo agitar a 20°C durante unos 30 min. adicionales. El acido colommico oxidado se dializo (tubo de dialisis con corte de 3.5KDa de peso molecular) extensivamente (24 h) contra un tampon 0.01% carbonato de amonio (pH 7.4) a 4°C. La ultrafiltracion (corte mayor de 3.5 kDa de peso molecular) se uso para concentrar la solucion CAO a partir del tubo de dialisis. Despues de la concentracion hasta el volumen necesario, el filtrado se liofilizo y se almaceno a — 40°C hasta el uso mas adelante. Alternativamente, CAO se recupero de la mezcla de reaccion mediante precipitacion (dos veces) con etanol.
2.2. Determinacion del estado de oxidacion de CA y derivados
La estimacion cualitativa del grado de oxidacion del acido colommico se llevo a cabo con 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4— DNPH), que produce 2,4 dinitrofenil— hidrazonas moderadamente solubles en la interaccion con los compuestos carbonilo. (CA) No oxidado/ (CAO) oxidado se anadieron al reactivo 2,4— DNPH (1.0 ml)), las soluciones se agitaron y despues se dejaron reposar a 37°C hasta que se observo un precipitado cristalino [Shriner y otros, 1980]. El grado (cuantitativo) de oxidacion de CA se midio con un metodo [Park y Johnson, 1949] basado en la reduccion de los iones de ferricianuro en solucion alcalina a ferrocianuro ferrico (azul persa), que se mide despues a 630 nm. En este caso, la glucosa se uso como un estandar.
2.3. Cromatograffa de permeacion en gel
Las muestras de acido colommico (CA y CAO) se disolvieron en NaNO3 (0.2M), CH3CN (10%; 5mg/ml) y se cromatografiaron sobre columnas 2x GMPWxl con deteccion mediante mdice de refraccion (sistema GPC: bomba de disolvente VE1121 GPC, detector VE3580 RI y comparacion con el software Trisec 3 Viscotek Europe Ltd). Las muestras (5 mg/ml) se filtraron sobre membrana de nylon de 0.45 micras y corrieron a 0.7 cm/min con NaNO3 0.2 M y CH3CN (10%) como la fase movil.
Los resultados se muestran en la Figura 3b y las tablas 5 y 6.
2.4. Estabilidad del acido colommico
Las reglas para la qmmica de la PEGilacion no pueden aplicarse a polisialilacion como tal debido a la diferencia en las propiedades fisicoqmmicas de estas moleculas. El PSA es un polfmero labil en medio acido y es estable durante semanas alrededor de pH neutro (Figura 3a). Los resultados en la Figura 3a muestran que a pH 6.0 y 7.4 CA es estable durante 8 dfas, a pH 5.0 existe una degradacion lenta (despues de 48 horas 92% del PM inicial), y a pH 4.0 existe una degradacion lenta (despues de 48 horas 70 % del PM inicial). El acido polisialico es altamente hidrofflico, mientras que PEG es anfifflico. Cuando la polisialilacion se lleva a cabo usando condiciones usadas para la PEGilacion, la agregacion y precipitacion de las protemas se ve en muchos casos.
3. Preparacion de conjugados protema N— terminal— CA con aditivos de la formulacion
3.1. Preparacion de conjugados EPO— CA (metodo N— terminal)
La EPO se suministro como una solucion (0.34 mg/ml en tampon 10 mM fosfato de sodio 130 Mm NaCl pH 7.0; actividad espedfica: 110,000 U/mg, pm 30600) y almaceno a — 32° C, la protema se descongelo a 2— 8 ° C y la cantidad necesaria se tomo en un tubo Eppendorf de 2 ml. La cantidad necesaria (exceso molar de 25 veces) de acido colommico se tomo y se anadio la solucion de protema a CA solido y se mezclo suavemente. Se anadio el volumen necesario de solucion de cianoborohidruro de sodio para tener 50 mM o 3.17 mg/ml en la mezcla de reaccion, se agito en vortice y comprobo el pH de la mezcla de reaccion final; si fuera necesario, se ajusto el pH a 6.0. El tubo se cerro
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hermeticamente y se agito a la temperatura deseada durante 24 horas o la mezcla de reaccion se incubo primero a RT (22°C) durante 8 horas y despues se mantuvo a 4 ± 1°C durante toda la noche (14 horas). Despues de la incubacion, se tomaron las muestras necesarias (por ejemplo, para el ensayo de actividad, SDS— PAGE, SE— HPLC).
3.1.1 Purificacion y caracterizacion de conjugados de EPO— CA (metodo N— terminal)
La muestra de la mezcla de reaccion restante se diluyo con tampon A1 de HIC (3M sulfato de amonio, pH 6.3) de manera que resulta una concentracion final de 2 M y se cargo en la columna de HIC equilibrada previamente con tampon A de HIC a la velocidad de 1.5 ml/min a RT. La fraccion de la carga se colecto y marco. La columna se lavo con tampon A2 de HIC (2 M sulfato de amonio, pH 6.3) (al menos 6 volumenes de columna), las fracciones se recogieron y marcaron. El producto se eluyo con tampon B de HIC (50 mM Na2HPO4 pH 7.4), la primera fraccion (0.5 ml) y despues las fracciones de 0.5— 1 mL (6CV) se recogieron y se marcaron. Las muestras se mantuvieron en hielo (4±1°C) durante la purificacion.
La concentracion de protemas se analizo mediante UV (280 nm) (Abs de 1 mg/ml de EPO es de aproximadamente 0.743). Se tomaron las muestras para SDS— PAGE. La separacion de la EPO no conjugada se realizo usando cromatograffa de intercambio anionico (AEC) si el PM de CA es demasiado pequeno (por ejemplo, 22 kDa) para la separacion del conjugado y la EPO mediante SE— HPLC. Para AEC se diluyeron las fracciones de HIC que contienen la protema con tampon A de AEC (50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 8.0) (1 ml de muestra + 5 ml de tampon A de AEC) y se cargaron a la columna EC pre— equilibrada con tampon A de AEC a 1.0 ml/min. Las fracciones de la carga se recogieron y marcaron. La columna se lavo con tampon A de AEC (al menos 10 ml) las fracciones se recogieron y marcaron. Se eluyo el producto con tampon de elucion B (Tris 50 mM, 600 mM NaCl, pH 8.0), se recogieron y marcaron la primera fraccion de 0.5 ml y despues las fracciones de 0.5— 1 ml a 2.0 ml/min. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificacion.
Alternativamente la purificacion se puede realizar mediante SE— HPLC (por ejemplo, para separar los conjugados de EPO si el CA usado tiene un peso molecular alto, por ejemplo, 39kDa). La concentracion de protemas se analizo por UV (280 nm) (Abs de 1 mg/ml de EPO es de aproximadamente 0.743). Se tomaron muestras para SDS— PAGE.
Se saco una almuota para ensayo de protemas y ensayo de CA. La solucion restante se almaceno a — 20°C hasta el uso. Los productos se caracterizaron mediante SDS— PAGE. Se uso para determinar la actividad de las muestras de EPO y nG EPO al inducir la proliferacion in vitro de celulas progenitoras de eritrocitos aislados del bazo de un raton dejado anemico artificialmente a traves de inyeccion I.P. de fenilhidrazina. El protocolo se adapto basado en el metodo reportado por Krystal. El ensayo depende de la adicion de EPO a los progenitores de eritrocitos y la medicion de la velocidad de replicacion del ADN mediante la determinacion de la velocidad de incorporacion de 3H— timidina. Los estudios de farmacocinetica (PK) y farmacodinamica in vivo se realizaron en ratones B6D2F1.
3.2. Preparacion de conjugados de EPO— CA (Aleatorio)
(Ejemplo de Referencia)
La EPO se suministro como una solucion (0.34 mg/ml en tampon 10 mM fosfato de sodio 130 Mm NaCl pH 7.0; actividad espedfica: 110,000 U/mg, pm 30600) y almaceno a — 32° C, la protema se descongelo a 2— 8° C y la cantidad necesaria se tomo en un tubo Eppendorf de 2 ml. La cantidad necesaria de acido colommico se tomo y se anadio la solucion de protema a CA solido y se mezclo suavemente. Se anadio el volumen necesario de solucion de cianoborohidruro de sodio para tener 50 mM o 3.17 mg/ml en la mezcla de reaccion, se agito en vortice y comprobo el pH de la mezcla de reaccion final; si fuera necesario, se ajusto el pH a 7.4. El tubo se sello hermeticamente y se agito a la temperatura deseada (4±1°C) durante 24 horas. Despues de la incubacion, se tomaron las muestras necesarias (por ejemplo, para el ensayo de actividad, SDS— PAGE, SE— HPLC).
3.2.1. Purificacion y caracterizacion de conjugados de EPO— CA (Aleatorio)
La muestra de la mezcla de reaccion restante se diluyo con tampon A1 de HIC (3M sulfato de amonio, pH 6.3) de manera que una concentracion final de 2 M resulta y se cargo en la columna de HIC previamente equilibrada con tampon A de HIC a una velocidad de 1.5 ml/min a RT. La fraccion de carga se recogio y marco. La columna se lavo con tampon A2 de HIC (2 M sulfato de amonio, pH 6.3) (al menos 6 volumenes de columna), las fracciones de lavado se recogieron y marcaron. Se eluyo el producto con tampon B de HIC (50 mM Na2HPO4 pH 7.4), se recogieron y marcaron la primera fraccion de 0.5 ml y despues las fracciones de 0.5— 1 ml (6CV). Las muestras se mantuvieron en hielo (4±1°C) durante la purificacion.
La concentracion de protemas se analizo mediante UV (280 nm) (Abs de 1 mg/ml de EPO es de aproximadamente 0.743). Se tomaron las muestras para SDS— PAGE. La separacion de la EPO no conjugada se realizo usando cromatograffa de intercambio anionico (AXC) si el Mw de CA es demasiado pequeno (por ejemplo, 22 kDa) para la separacion del conjugado y la EPO mediante SE— HPLC. Para AXC se diluyeron las fracciones de HIC que contienen la protema con tampon A de AXC (50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 8.0) (1 ml de muestra + 5 ml de tampon A de AXC) y se cargaron a la columna AXC pre— equilibrada con tampon A de AXC a 1.0 ml/min. Las fracciones de carga se recogieron y marcaron. La columna se lavo con tampon A de aXc (al menos 10 ml) las fracciones se recogieron y marcaron. Se
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eluyo el producto con tampon de elucion (Tris 50 mM, 600 mM NaCI, pH 8.0), se recogio la primera fraccion (0.5 ml) y despues las fracciones de 0.5— 1 ml a 2.0 ml/min y marcaron. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificacion.
La purificacion alternativa se puede realizar mediante SE— HPLC (por ejemplo, para separar los conjugados de EPO si el Ca usado tiene un peso molecular alto, por ejemplo, 39kDa). La concentracion de protemas se analizo por UV (280 nm) (Abs de 1 mg/ml de EPO es de aproximadamente 0.743). Se tomaron las muestras para SDS— PAGE.
3.3. Qmmica de Glycon (Ejemplo de Referencia)
El acido colommico hidrazida se disolvio en la solucion de EPO para obtener la concentracion de Ca final de 10 mM. El pH de la solucion se ajusto a 5.5. Se anadio el volumen necesario de solucion de NaIO4 en solucion NaOAc para obtener la concentracion final de 5 mM NaIO4. La reaccion se detuvo con NaHSO3 (concentracion final de NaHSO3 que sea 20 mM). La mezcla de reaccion se incubo a temperatura ambiente. Finalmente se anadio el volumen necesario de solucion de NaCNBH3 en solucion NaOAc para dar la concentracion final de 50 mM NaCNBH3. La reaccion se continuo a 4±1°C en un agitador durante una hora. Despues de la incubacion se tomaron las muestras necesarias para SDS, SE— HPLC, ensayo de actividad.
3.3.1. Purificacion y caracterizacion de conjugados de EPO— CA (qmmica Glycon)
La muestra de la mezcla de reaccion restante se diluyo con tampon A1 de HIC (3 M sulfato de amonio, pH 6.3) de manera que una concentracion final de 2 M resulta y se cargo en la columna de HIC equilibrada previamente con tampon A de HIC a una velocidad de 1.5 ml/min a RT. La fraccion de carga se recoge y se marca (Li— Lx). La columna se lavo con tampon A2 de HIC (2 M sulfato de amonio, pH 6.3) (al menos 6 volumenes de columna) y se recogieron y marcaron las fracciones. El producto se eluyo con tampon B de HIC (50 mM Na2HPO4 pH 7.4), se recogieron y marcaron la primera fraccion de 0.5 ml y despues las fracciones de 0.5— 1 ml (6CV). Las muestras se mantuvieron en hielo (4±1°C) durante la purificacion.
La concentracion de protemas se analizo mediante UV (276 nm) (Abs de 1 mg/ml de EPO fue aproximadamente 0.743). Se tomaron las muestras para SDS— PAGE. La separacion de la EPO no conjugada se realizo usando cromatograffa de intercambio anionico (AXC) si el PM de CA es demasiado pequeno (por ejemplo, 22 kDa) para la separacion del conjugado y la EPO mediante SE— HPLC. Para AXC se diluyeron las fracciones de HIC que contienen la protema con tampon A de AXC (50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 8.0) (1 ml de muestra + 5 ml de tampon A de AXC) y se cargaron a la columna AXC pre— equilibrada con tampon A de AXC a 1.0 ml/min. Las fracciones de carga se recogieron y marcaron. La columna se lavo con tampon A de AXC (al menos 10 ml) las fracciones se recogieron y marcaron. Se eluyo el producto con tampon de elucion (Tris 50 mM, 600 mM NaCl, pH 8.0), se recogieron y marcaron la primera fraccion de 0.5 ml y despues las fracciones de 0.5— 1 ml a 2.0 ml/min. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificacion.
La purificacion alternativa puede hacerse mediante SE— HPLC (por ejemplo, para separar los conjugados de EPO si el CA usado tiene un peso molecular alto, por ejemplo, 39kDa). La concentracion de protemas se analizo por UV (280 nm) (Abs de 1 mg/ml de EPO es de aproximadamente 0.743). Se tomaron las muestras para SDS— PAGE.
3.4. PEGilacion de la EPO (Ejemplo de referencia):
La EPO (30.6kDa) se suministro como una solucion (0.954 mg/ml en tampon 10mM acetato de sodio, pH 4.0 que contiene 5% sorbitol, 0.025 mg/ml de polisorbato 80) y se almaceno a 2— 8 ° C. La solucion de EPO se concentro para preparar aproximadamente 1.0 mg/ml de solucion. La cantidad necesaria de EPO se tomo en un tubo Eppendorf y coloco en hielo. La cantidad de PEG anadido para la conjugacion se calculo basandose en la formula:
Peso de PEG
Cantidad de proteina (g)
--------------------------------x (PM de PEG) x (Exceso molar de PEG)
(PM de la proteina)
La cantidad necesaria de PEG 20K se peso. Se solubilizo en 10 mM NaOAc, 5% sorbitol, pH 5.5 (20% de volumen del volumen final de reaccion como se usa en la presente), la mezcla se agito en vortice suavemente hasta que todo el PEG se disolvio y despues o bien se filtro en un nuevo eppendorf o se centrifugo a 4000 rpm durante 5 min y el sobrenadante se transfirio a un nuevo eppendorf para eliminar cualquier material agregado/precipitado. Se anadio una cantidad necesaria de la solucion de proteina EPO a la solucion de PEG para dar un exceso molar de 25 veces de PEG y se mezclo suavemente, manteniendo la mezcla de reaccion en un agitador suave a 4±1°C. Se anadio el volumen necesario de solucion 100 mg/ml NaCNBH3 para tener 50 mM o 3.17 mg/ml en la mezcla de reaccion final, se mezclaron suavemente y el pH de la mezcla de reaccion final se comprobo, y si fuera necesario se ajusto a 5.5 con 1 M NaOH/HCl a 4±1°C. Finalmente el volumen de la reaccion se ajusto usando 20 mM NaOAc, 5% de sorbitol, y pH 5.5 para dar una
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concentracion de protema de 1 mg/ml en la mezcla de reaccion. El tubo se sello hermeticamente y se agito a la temperatura deseada (4±1°C) durante 24 horas. La reaccion se detuvo mediante un metodo adecuado y se tomaron las muestras para la actividad in vitro, SDS— PAGE (usando gel 4— 20% Tris— glicina), SE— HPLC (columna superosa 6) y se comprobo el pH de la mezcla de reaccion. Para eliminar cualquier precipitado la mezcla de reaccion se centrifugo a 13000 rpm durante 5 min antes del analisis SE— HPLC y la purificacion, el tampon preferido para SE— HPLC fue 0.1 M fosfato de sodio (pH 6.9). Los resultados se muestran en la Figura 5.
3.5 Preparacion de conjugados N— terminal de eritropoyetina no glicosilada (NG EPO— CA)
NG EPO se suministro como una solucion (0.18 mg/ml en tampon 20 mM fosfato de sodio 300mM NaCl pH 6.65; actividad espedfica 100000 U/mg; pm. 19000) y almaceno a — 32° C, la protema se descongelo a 2— 8° C y se tomo la cantidad necesaria en un eppendorf de 2 ml. La cantidad de acido colommico (por ejemplo, acido colommico oxidado o no oxidado) necesario para la conjugacion se calculo. La cantidad necesaria de acido colommico se peso La solucion de protema se anadio a CA solido y se mezclo suavemente. Se anadio el volumen necesario de solucion de cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion de manera que la concentracion final de cianoborohidruro de sodio debe ser de 50 mM o 3.17 mg/ml en la mezcla de reaccion. La mezcla de reaccion final se agito en vortex y se comprobo el pH; si fuera necesario el pH se ajusto a 7.4. El tubo se sello hermeticamente y se agito a la temperatura deseada (4±1°C) durante 24 horas. Despues de la incubacion, se tomaron las muestras necesarias para el ensayo de actividad, SDS— PAGE, SE— HPLC etc.
3.5.1 Purificacion y caracterizacion de conjugados de NG EPO— CA
La muestra de la mezcla de reaccion restante se diluyo con tampon A de HIC (1.2 M sulfato de amonio, pH 6.3) (1 ml de muestra + 4 ml de tampon A) y se cargo en la columna de HIC previamente equilibrada con tampon A de HIC. Las fracciones de la carga se recogieron y marcaron. La columna se lavo con tampon A de HIC (al menos 10 ml). Las fracciones de lavado se recogieron y marcaron. El producto se eluyo con tampon B de HIC, se recogieron y marcaron la primera fraccion de 0.5 ml y despues las fracciones de 0.5— 1 ml. Las muestras se mantuvieron en hielo durante la purificacion. La concentracion de protema se analizo mediante UV (280 nm) (Abs de 1 mg/ml de nEPO fue aproximadamente 0.743). Se tomaron las muestras para SDS— PAGE. Las condiciones de reaccion condujeron a NG EPO libre no significativa en la mezcla de reaccion por lo que no fue necesaria purificacion adicional. Si se presento NG EPO en la mezcla de reaccion, las fracciones de HIC que contienen protemas se concentraron usando Vivaspin 6 (5000 MWCO) y la purificacion se realizo mediante SE— HPLC. La concentracion de protema se analizo mediante UV (280 nm) (Abs de 1 mg/ml de NG EPO es aproximadamente 0.743). Se tomaron las muestras para SDS— PAGE.
Se saco una almuota para ensayo de protemas y ensayo de CA. Se almaceno el restante a — 20°C hasta el uso. El producto se caracterizo mediante SDS— PAGE.
3.6. SE— HPLC de las formulaciones de EPO
La HPLC se realizo en un Cromatografo Lfquido (Jasco) equipado con un Jasco, AS— 2057 mas automuestreador refrigerado a 4A°C, y un detector Jasco UV— 975 UV/VIS. Los datos se registraron mediante el software EZChrom Elite en una IBM/PC. Las muestras de la SEC se analizaron con una fase movil isocratica de 0.1 M fosfato de Na, pH 6.9; en una columna de Superosa 6 (Figura 5). La Figura 6 muestra un solo pico a RT=76.408, lo cual se atribuye a la EPO.
La tabla de los picos para la SEC que se muestra en el lado izquierdo de la Figura 5 es como sigue:
Pico
RT Area % Especies
1
33.896 13.9 Agregado
2
60.871 85.7 CA38K— EPO
3
76.229 0.4 EPO
Tabla 1
3.7. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, inmunoelectrotransferencia y ELISA
SDS— PAGE se realizo usando 4— 20% de geles con trisglicina. Las muestras se diluyeron con tampon ya sea reductor o no reductor y 5.0 ug de protema se cargo en cada pocillo. Los geles se corrieron en un sistema tampon triglicerina y se tino con azul de Coomassie. La inmunoelectrotransferencia se realizo usando el anticuerpo anti PSA (Figura 4). La Figura 4 muestra la SDS— PAGE de las formulaciones de EPO (espedfica de sitio; N— terminal).
3.8. Actividad in vitro
Se uso para determinar la actividad de las muestras de EPO al inducir la proliferacionin vitro de celulas progenitoras de
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eritrocitos aisladas del bazo de un raton dejado anemico artificialmente a traves de la inyeccion I.P. de fenilhidrazina. El protocolo se adapto basado en el metodo reportado por Krystal. El ensayo depende de la adicion de EPO a los progenitores de eritrocitos y la medicion de la velocidad de replicacion del ADN mediante la determinacion de la velocidad de incorporacion de 3H— timidina.
3.9. Estudios de estabilidad
Los conjugados de EPO esteriles se almacenaron en 20 mM fosfato de sodio, pH 7.4; 5% sorbitol y 0.025 mg/ml Tween 20; a 4°C durante seis semanas. SE— HPLC de las muestras se realizo usando columnas de SEC bajo las siguientes condiciones: Volumen de inyeccion 100 ul, velocidad de flujo 0.250 ml/min, tampon de corrida 0.1 M fosfato de sodio, pH
6.9.
3.10. Eficacia in vivo de las formulaciones de EPO
La eficacia in vivo de las formulaciones de EPO se estudio en ratones hembra B6D2F1, de 7— 8 semanas de edad, se inyecto 5— 15 ugs de dosis de protema (igual actividad) en ratones por via subcutanea. Los animales se dividieron en siete grupos de cuatro. Las formulaciones de EPO se les dieron a cada animal de cada grupo de la siguiente manera; EPO, conjugados de EPO— PSA, PBS, Aranesp (5 |jg). 50 jl de sangre se tomo de cada animal y se analizo mediante FACS despues de la tincion con colorante para el conteo de reticulocitos (Figuras 8 y 9).
5 jl de sangre total bien mezclada se mezclo con 1 ml de reactivo para el Conteo de Reticulocitos y se incubo a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Las muestras se analizaron despues con la ayuda de la maquina de FACS contando los reticulocitos.
3.11. Elisa
La EPO— PSA se capturo por el anticuerpo anti— PSA recubierto sobre la placa. La EPO— PSA capturada se detecto con el anticuerpo anti— EPO de manera que solo se detecto la EPO conjugada con PSA.
3.12. Eliminacion in vivo
La eliminacion in vivo de la formulacion de EPO se estudio en ratones. La cantidad adecuada de dosis de protema se inyecto a los ratones por via subcutanea e intravenosa. Las formulaciones de EPO se radiomarcaron con 125l y se midio la radioactividad de la muestra de sangre a intervalos frecuentes.
Resultados
Activacion de CA y determinacion del grado de oxidacion
Se uso acido colommico (CA), un homopolfmero lineal alfa— 2,8 enlazado de residuos de acido N— acetilneurammico (Neu5Ac). La exposicion de los acidos colommicos a la oxidacion se llevo a cabo durante 15 min usando 20 mM peryodato a temperatura ambiente. La integridad de los residuos Neu5Ac internos alfa— 2,8 enlazado despues del tratamiento con peryodato se analizo mediante cromatograffa de permeacion en gel y los cromatografos obtenidos para el material oxidado (CAO), se comparo con el de CA nativo. Se encontro que el CA oxidado y nativo exhiben perfiles de elucion casi identicos, sin evidencia de que la etapa de oxidacion sucesiva da lugar a la fragmentacion significativa de la cadena del polfmero.
La medicion cuantitativa del estado de oxidacion de CA se realizo mediante la reduccion del ion de ferricianuro en solucion alcalina a ferrocianuro (Azul de Prusia) [Park y Johnson, 1949] usando glucosa como un estandar. La Tabla 1 muestra que el acido colommico oxidado se encontro que tiene una cantidad del agente reductor mayor que la estequimetrica (> 100%), es decir, 112 % en moles de contenido de aldehfdo aparente que comprende el poder reductor combinado del hemicetal extremo reductor y el aldehfdo introducido (en el otro extremo, extremo no reductor).
Especies de CA
Grado de oxidacion
acido colommico (CA)
16.1 ± 0.63
acido colommico oxidado (CAO)
112.03 ± 4.97
acido colommico reducido (CAOR)
0; No detectable
acido colommico oxidado reducido oxidado (CAORO)
95.47 ± 7.11
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Tabla 2: Grado de oxidacion de varios intermediarios de acido colommico en el esquema de doble reaccion de oxidacion usando glucosa como un estandar (100%, 1 mol de aldelffdo por mol de glucosa; n=3 ± s.d).
Preparacion, purificacion y caracterizacion de los conjugados de EPO
El procedimiento para preparar y purificar los conjugados de acido colommico (CA) de Eritropoyetina (EPO) de manera selectiva N terminalmente conduciendo la reaccion a un pH reducido (pH 5,5) y pH aleatorio (7.4) y a 4A±1A°C se detalla anteriormente. Esto implica la conjugacion en la presencia de cianoborohidruro de sodio, seguido de purificacion usando cromatograffa de intercambio ionico (AEX) para eliminar la EPO libre seguido de eliminacion del CA mediante cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC). El pH bajo se uso para favorecer la derivatizacion selectiva del grupo alfa amino del extremo N— terminal, y ademas para minimizar la agregacion de EPO durante la reaccion. La composicion del tampon de reaccion final fue de 5% sorbitol, 0.5 mg/ml Tween 20 en 10 mM NaOAc a pH 5.5.
La formacion de los conjugados de EPO— CA se confirmo mediante el SE— HPLC (cambio de tiempo de retencion de EPO— CA en comparacion con la EPO; ademas coelucion de ambas porciones); cromatograffa de intercambio ionico (union de conjugados en la columna de AEC) y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS— PAGE; ensanchamiento y desplazamiento de bandas hacia arriba con especies de alto m.w.) (Figura 4). Las muestras polisialiladas fueron activas in vitro y mostraron perfil enormemente superior (PK y PD) a la EPO simple. Las Figuras 11 y 12 muestran los resultados in vivo.
La Figura 5, lado izquierdo, muestra la SE— HPLC de la conjugacion de EPO— CA 39kDa despues de 24 horas. La Tabla 3 es la tabla de analisis de picos. Condiciones de la caracterizacion: columna Superdex 200, tampon 0.15 M bicarbonato de amonio, pH 7.8.
Pico
RT Ar % Especies
1
31.421 3.38 Agregado
2
48.346 80.76 CA39— EPO
3
59.204 15.86 EPO
Tabla 3
El grado de derivatizacion se encontro que era mas en la EPO PEGilada que la EPO polisialilada (Figura 6). Esto puede deberse a la naturaleza inerte de PEG y la naturaleza cargada del acido sialico. El recuento de reticulocitos a partir de los datos de FACS fue mas para el conjugado PSA— EPO que la EPO (Figura 7). Despues de la purificacion del conjugado EPO— CAO no se observo EPO significativa en el cromatograma de SEC HPLC y la derivatizacion se demostro por el cambio del tiempo de retencion en SE— HPLC y la ampliacion y el desplazamiento de las bandas con mayor peso molecular en SDS PAGE. La polisialilacion de EPO se demostro ademas mediante inmunoelectrotransferencia usando un anticuerpo murino anti PSA. El perfil de eliminacion in vivo de conjugado PSA— EPO se encontro que era superior en comparacion con la EPO (Figura 8) cuando se administra IV y el area bajo la curva se aumento en 7.1 veces. Del mismo modo la dosis subcutanea de EPO— PSA muestra ademas una mayor retencion en comparacion con la EPO y el area bajo la curva se aumento en 2.5 veces. Se encontro ademas la polisialilacion de EPO que es proporcional al tiempo de incubacion para la mezcla de reaccion, el exceso molar y el pH. En el perfil de eliminacion in vivo (intravenoso y subcutaneo) para NG EPO polisialilada se encontro que era mejor que la NG EPO (Figuras 11 y 12). En algunos geles SDS fue visto ademas dipolisialilacion de EPO. Los conjugados de EPO— PSA se confirmaron ademas mediante el metodo ELISA (Figuras 14 y 15). Se encontro el fenomeno de eritropoyesis que es mayor con el conjugado EPO— PSA en comparacion con la EPO y se encontro que era proporcional al peso molecular del polfmero a partir de 6 a 15 kDa (Figura 18). Se encontro que 15 kDa es la longitud de cadena optima para la EPO mientras que con cadenas mas pesadas de acido sialico se reduce el fenomeno de la eritropoyesis. Esto puede deberse a la naturaleza del polfmero cargado negativamente lo que resulta en la repulsion del receptor. Este estudio se confirmo con la ayuda de la Figura 18. Se encontro que Emax de Aranesp es mucho mayor que EPO— PSA lo que no es clmicamente bueno y conduce a la trombosis y puede causar el agotamiento de la medula osea y se encontro ademas que disminuye los reticulocitos por debajo de la lmea de base despues del tratamiento. Se encontro que EPO— PSA es muy superior a la EPO y se encontro que la EPO— PSA es tan buena como la EPO— PEG y que la EPO— PSA conduce ademas a la eritropoyesis constante.
Se encontro que los conjugados de PSA son activos en el ensayo de actividad in vitro. El estudio de eficacia in vivo muestra que los conjugados PSA— EPO son tan buenos como los conjugados de PEG y ampliamente superior a la EPO (Figura 8 y 9).
La formacion de los conjugados de NG EPO— CA se confirmo mediante la SE— HPLC (cambio del tiempo de retencion de NG EPO— CA en comparacion con NGEPO; co— elucion ademas de ambas porciones); cromatograffa de intercambio ionico (union de conjugados en la columna de AEC) y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS— PAGE;
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desplazamiento de bandas con especies de alto pm). Las Figuras muestran esa conjugacion EPO— CA 39kDa despues de 24 horas. Las muestras polisialiladas fueron activas in vitro y demostraron perfil enormemente superior (PK y PD) a NGepo simple.
La Figura 10 muestra los resultados de SE— HPLC. El analisis de los picos se muestra en la tabla 4 mas abajo. Condiciones de la caracterizacion columna Superdex 200, tampon 0.15 M bicarbonato de amonio, pH 7.8.
Pico
RT Ar % Especies
1
31.863 3.41 agregado
2
33.212 6.65 agregado
3
42.667 14.72 (CA)2— nEPO
4
48.571 74.49 CA— n EPO
5
68.183 0.73 nEPO
Tabla 4
La Figura 12 muestra los resultados de la eliminacion in vivo . PSA— NG EPO mostro un perfil muy superior en comparacion con NG EPO.
La Tabla 5 muestra los valores de varios parametros usados y la tabla 6 da el peso molecular y la polidispersidad de las fracciones CA.
Parametros
Valores
Mn (Da)
26,666
PM (Da)
27,956
Mz (Da)
31,129
Mp (Da)
22,969
PM/Mn
1.048
IV (dl/g)
0.2395
Rh (nm)
4.683
Ramificaciones
0.00
Concentracion de la Muestra (mg/ml)
5.600
Recobrado de la Muestra (%)
90.71
dn/dc (ml/g)
0.156
dA/dc (ml/g)
0.000
Mark— Houwink a
— 0.048
Mark— Houwink logk
— 0.425
Tabla 5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Fraccion CA
PM (kDa) pd
475
97.2 1.285
450
52.3 1.109
425
37.9 1.062
400
28.0 1.048
375
19.0 1.080
*350
14.5 —
*300
10.0 —
*250
7.0 —
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Claims (24)

  1. 5
    10
    15
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que es un derivado de polisacarido N— terminal de la eritropoyetina (EPO), o de una protema similar a EPO, la protema similar a EPO es un homologo de EPO que tiene al menos 50% de la actividad de la EPO y tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con los residuos 28— 193 de la sec. con num. de ident.: 1, en donde el polisacarido es acido polisialico y comprende entre 2 y 200 unidades de sacarido.
  2. 2. Un compuesto de conformidad con la reivindicacion 1 en donde el PSA consiste esencialmente solamente de unidades de acido sialico.
  3. 3. Un compuesto de conformidad con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en donde la EPO o protema similar a EPO es glicosilada o no glicosilada.
  4. 4. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicacion anterior que tiene la formula general (I)
    imagen1
    en donde m es al menos uno;
    XB se deriva de B— XH que es EPO o una protema similar a EPO en donde XH es NH2 y es el N— terminal de la protema;
    L es un enlace, un grupo de enlace, o comprende un polipeptido o un oligomero sintetico;
    GlyO es una unidad de sacarido anionico,
    en donde el grupo de enlace, si esta presente, es de la formula general — Y— C(O)— R1— C(O)— ; en donde Y es Nr2 o NR2— NR2;
    R1 es un radical organico difuncional seleccionado del grupo que consiste en alcanodiilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y alquilheteroarileno, cualquiera de los cuales se sustituye opcionalmente y/o interrumpe por carbonilo, ester, sulfuro, eter, amida y/o enlaces de amina; y R2 es H o C1— 6 alquilo.
  5. 5. Un compuesto de conformidad con la reivindicacion 4, en donde L es un enlace o es un grupo
  6. 6. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicacion anterior en donde la EPO, o protema similar a EPO, es glicosilada y comprende 2— 100 unidades de sacarido o 10— 80 unidades de sacarido o 20— 60 unidades de sacarido o 40— 50 unidades de sacarido.
  7. 7. Un compuesto de conformidad con cualquier reivindicacion anterior en donde la EPO, o protema similar a EPO, es no glicosilada y comprende 80— 180 unidades de sacarido o 100— 150 unidades de sacarido o 120— 145 unidades de sacarido o 130— 140 unidades de sacarido.
  8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1— 7 y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
  9. 9. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1— 7 o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 8 para uso en la terapia.
  10. 10. Un metodo para producir una poblacion de derivados de acido polisialico (PSA) N— terminal de la eritropoyetina (EPO) o de una protema similar a EPO, siendo la protema similar a EPO un homologo de EPO que tiene al menos 50% de la actividad de la EPO y que tiene 90% o mas de identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con los residuos 28— 193 de la sec. con num. de ident.: 1, el metodo comprende las etapas de:
    a) reaccionar qmmicamente el grupo amino terminal de la protema EPO o similar a EPO con PSA o intermediario de la reaccion en una primera solucion acuosa de pH acido; en donde el PSA comprende 2— 200 unidades de sacarido; y en donde el PSA tiene un aldehudo reactivo en el extremo reductor y un extremo no reductor pasivado de manera que no reacciona con la protema EPO o similar a EPO; y
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    b) purificar la poblacion de los derivados de PSA amino— terminal resultantes de la EPO o protema similar a EPO en una segunda solucion acuosa de pH mayor que la primera solucion acuosa;
    en donde al menos el 85% de los derivados de PSA de EPO o protema similar a EPO se derivatizan solo en el extremo N— terminal de la EPO o protema similar a EPO.
  11. 11. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 10 en donde la reaccion de derivatizacion se lleva a cabo bajo condiciones de reduccion.
  12. 12. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10— 11 en donde el pH de la primera solucion acuosa esta en un intervalo de pH de 4.0 a 6.0 y la segunda solucion acuosa es de un pH mayor que la primera solucion acuosa, o en donde el pH de la primera acuosa solucion esta en un intervalo de pH de 4.0 a 6.0 y el pH de la segunda solucion acuosa esta en un intervalo de 6.5 a 9.0, o en donde el pH de la primera solucion acuosa esta en un intervalo de pH de 4.0 a 6.0 y el pH de la segunda solucion acuosa esta en un intervalo de 6.5 a 8.5, o en donde el pH de la primera solucion acuosa esta en un intervalo de pH de 4.0 a 6.0 y el pH de la segunda solucion esta en el acuosa esta en un intervalo de 6.5 a 8.0.
  13. 13. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10— 12, que se lleva a cabo en presencia de un aditivo de la formulacion seleccionado de uno o mas tampones, estabilizadores, tensioactivos, sales, polfmeros, iones metalicos, azucares, polioles o aminoacidos.
  14. 14. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13 en donde el aditivo de la formulacion es un tampon y el tampon es fosfato de sodio/acetato.
  15. 15. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10— 14 en donde el PSA tiene un grupo aldehfdo reactivo que se convierte en una etapa de reaccion preliminar en una amina, que se hace reaccionar despues con un reactivo bifuncional que comprende al menos un grupo funcional seleccionado de N— maleimida, vinilsulfona, N— yodoacetamida, grupo ortopiridilo o N— hidroxisuccinimida, para formar un intermediario de reaccion, en donde el intermedio de reaccion se hace reaccionar con la EPO o protema similar a EPO.
  16. 16. Una composicion que comprende una poblacion de derivados de acido polisialico (PSA) de la eritropoyetina (EPO), o de una protema similar a EPO, siendo la protema similar a EPO un homologo de EPO que tiene al menos 50% de la actividad de la EPO y que tiene 90% o mayor identidad de secuencia a nivel de aminoacidos con los residuos 28— 193 de la sec. con num. de ident.: 1,
    en donde el PSA comprende entre 2 y 200 unidades de sacarido y
    en donde al menos el 85% de los derivados de PSA de EPO o protema similar a EPO se derivatizan solo en el extremo N— terminal de la EPO o protema similar a EPO.
  17. 17. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 16, en donde los derivados de PSA de EPO o protema similar a EPO son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1— 9.
  18. 18. Una composicion de conformidad con la reivindicacion 16 o la reivindicacion 17, en donde el PSA comprende al menos 5 unidades de sacarido o al menos 10 unidades de sacarido o al menos 50 unidades de sacarido.
  19. 19. Una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16— 18, en donde la polidispersidad del PSA es menos de 1.3 o es menos de 1.2 o es 1.01.
  20. 20. Una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16— 19, en donde el PSA tiene un peso molecular promedio en el intervalo de 2 a 50 kDa.
  21. 21. Una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16— 20 en donde el PSA consiste esencialmente solo de unidades de acido sialico.
  22. 22. Una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16— 21 en donde la EPO o protema similar a EPO se derivatiza por el PSA en la unidad terminal reductora del PSA.
  23. 23. Una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16— 22, que es una composicion farmaceutica y comprende uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.
  24. 24. Una composicion de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16— 23 para su uso en terapia.
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