CN104220086A - Peg化的c-肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PEG化的C-肽衍生物，其包含连接至N末端的至少一个PEG基团，其显示改善的体内药代动力学和生物学活性。

Description

PEG化的C-肽
本申请要求2011年11月17日提交的美国临时申请号61/561,254的权益，其公开内容通过引用纳入本文，就好像将其全文列于本文那样。
发明背景
技术领域
本发明涉及C-肽的修饰形式，及其应用方法。一方面，所述C-肽的修饰形式包含PEG化的C-肽衍生物，所述衍生物包含连接至N末端的至少一个PEG基团，其显示优越的体内药代动力学和生物学活性。
C-肽是胰岛素原分子中A-链和B链区段之间的连接肽区段。在胰腺胰岛β细胞的内质网中经过切割和加工之后，产生胰岛素和C-肽。C-肽与胰岛素以等摩尔的量从胰腺胰岛β细胞共同分泌进入门静脉循环。除其对双链胰岛素结构折叠的作用以外，C-肽的其它生物学活性在其被发现之后多年未能解释。
1型糖尿病的一般特征是胰岛素和C-肽缺陷，这归因于胰腺胰岛β细胞的自体免疫损毁。因此，患者依赖外源性胰岛素以维持生命。就该疾病的病理学而言，若干因素可能具有重要性，例如，遗传背景、环境因素以及临时感染后的侵袭性自体免疫反应(Akerblom HK等:Annual Medicine29(5):383-385,(1997))。目前对胰岛素需求型患者提供已与C-肽分离的外源性胰岛素，因此这些患者不接受外源性C-肽治疗。相反，大多数2型糖尿病对象初期仍内源性产生胰岛素和C-肽，但一般特征为骨骼肌、脂肪组织和肝脏等组织的胰岛素抵抗。
许多1型糖尿病患者和其它胰岛素需求型患者最终发展并患上种种糖尿病长期并发症，在许多情况下，这相较于2型糖尿病而言更加严重且广泛。例如，涉及视网膜、肾脏和神经的微血管并发症是1型糖尿病患者患病和致死的主要原因。
越来越多的证据支持这一观念：C-肽缺陷可能在胰岛素需求型糖尿病患者的长期并发症的发展中起重要作用。此外，对于糖尿病动物模型和1型糖尿病患者的体内和体外研究表明，C-肽具有激素活性(Wahren J等:American Journalof Physiology278:E759-E768,(2000)；Wahren J等:收录于InternationalTextbook of Diabetes Mellitus(《糖尿病国际教科书》)Ferranninni E,Zimmet P,DeFronzo RA,Keen H编.约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons),(2004),第165-182页)。因此，C-肽作为传统胰岛素治疗的补充使用可能会提供对控制胰岛素需求型患者的长期并发症的有效方法。
迄今的研究表明，C-肽的治疗活性涉及C-肽与G蛋白偶联膜受体的结合，Ca2+依赖性胞内信号转导通路的激活，以及MAP激酶复合体的磷酸化，这导致钠/钾ATP酶和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性增加(Hills CE等:Clin Sci(Lond)116:565-574,(2009))。已知后面两种酶系统在糖尿病中有缺，并且与糖尿病周围神经病变病理学有关。C-肽对神经传导的正效应作用的细胞机制是基于多种不同细胞类型(特别是内皮细胞、成纤维细胞和肾小管细胞)中所证明C-肽与细胞膜的结合(Rigler R等:Proc Natl Acad Sci USA96:13318-13323,(1999))。
尽管采用C-肽具有治疗并预防胰岛素需求型糖尿病的长期并发症的前景，生物学半衰期短和每天要多次通过皮下(S.C.；s.c.)注射或静脉内(I.V.；i.v.)给予完成C-肽用药的要求妨碍了市场开发。
在对1型糖尿病患者进行的单剂量C-肽药代动力学研究中，重组人C-肽以150nmol、600nmol、1800nmol的剂量皮下给予，并以150nmol的剂量静脉给予并伴随至少三天的洗脱期。该研究得到如下检测的药代动力学参数：
表A-不同C-肽剂量的药代动力学参数(平均值±SD)(n＝12)
一项独立研究发现，1型糖尿病对象中C-肽的半衰期是42.5分钟(39.4-48.5分钟范围)，而在健康对象中C-肽的半衰期是33.5分钟(24.9-45.3分钟范围)(FaberOK等,J.Clin.Invest.,62；197-203,(1978))。基于对天然C-肽积累的广泛临床数据，需要目标血浆浓度在1-3nM范围内以获得完全治疗益处，这与天然肽的生理学范围一致(Polonsky KS等,J.Clin.Invest.,81；442-448,(1988))。为在每天中大多数时间获得1-3nM血浆浓度所需的天然C-肽剂量是1.5mg/天或10.5mg/周，而获得1-3nM范围内的血浆浓度所需的CBX129801剂量是大约1mg/周。CBX129801的标称分子量是46,000Da。提供标称重量是因为一个C-肽分子(3019Da)偶联至平均分子量为43,000Da的PEG。因此，1mg CBX129801剂量中包含的C-肽当量可表示如下(以mg计)：
因为1mg CBX129801包含0.066mg摩尔当量的C-肽，所以C-肽的全身性接触由PEG化而显著改善(按摩尔基础计改善约160倍)。所述改善的接触归因于较低的表观清除率和延长的半衰期。
本发明着眼于C-肽的PEG化形式的开发，其保留了天然C-肽的生物学活性并显示优越的药代动力学性质。这些改善的C-肽治疗性形式使得能够开发更有效的治疗方案来用于治疗胰岛素需求型糖尿病患者的长期并发症并需要显著更低的给药频率。
一方面，这些治疗是针对糖尿病患者，并且在更深一方面是针对胰岛素需求型患者。在另一方面，所述胰岛素需求型患者患有一种或多种糖尿病长期并发症。
这些改善的方法基于显示C-肽的PEG化形式保留该天然分子的生物学活性同时显示优越的药代动力学特点的临床研究。
发明内容
在一个实施方式中，本发明包括PEG化的C-肽，其包含与C-肽的N末端共价连接的PEG部分。一方面，本发明的PEG化的C-肽包含线性聚合物PEG聚合物。另一方面，本发明的PEG化的C-肽肽包含支化链的PEG聚合物。
在另一个实施方式中，本发明包括PEG化的C-肽，其中，所述PEG化的C-肽具有如下结构：
其中；
R1＝烷基；
n1是200～800；
n2是200～800。
在任何所述PEG化C-肽的另一个方面，所述PEG部分的分子量是约10kDa～约80kDa。在另一个方面，所述PEG部分的分子量是约20kDa～约60kDa。在另一个方面，所述PEG部分的分子量是约30kDa～约50kDa。在另一个方面，所述PEG部分的分子量是约35kDa～约45kDa。在另一个方面，所述PEG部分的分子量是约40kDa。
在某些实施方式中，本文公开向有需要的患者给予PEG化C-肽的方法，所述方法包括给予所述患者PEG化的C-肽。
在某些实施方式中，本文公开治疗一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗剂量的PEG化的C-肽。
在其它实施方式中，所述糖尿病长期并发症选自下组：周围神经病变、自主神经病变、肾病、勃起功能障碍、女性性功能障碍和视网膜病。
在其它实施方式中，所述糖尿病长期并发症是周围神经病变。
在其它实施方式中，所述糖尿病长期并发症是肾病。
在其它实施方式中，所述糖尿病长期并发症是勃起功能障碍。
在其它实施方式中，所述糖尿病长期并发症是女性性功能障碍。
在其它实施方式中，所述糖尿病长期并发症是视网膜病。
在其它实施方式中，所述方法还包括配量和给予胰岛素。
在其它实施方式中，所述方法还包括如下步骤：基于在给予治疗剂量的PEG化C-肽之后监控患者的胰岛素需求变化来调节给予胰岛素的剂量、类型或频率，其中，所述调节后的胰岛素剂量减少低血糖症的风险、发生或严重性，其中所述调节后的胰岛素剂量比开始PEG化的C-肽治疗之前所述患者的胰岛素剂量低至少10％。
在其它实施方式中，所述调节后的胰岛素剂量比开始PEG化的C-肽治疗之前所述患者的胰岛素剂量低约10％～约50％。
在其它实施方式中，给予等摩尔摩尔量的PEG化的C-肽产生的AUC或C平均是C-肽的2倍，产生的AUC或C平均是C-肽的5倍，产生的AUC或C平均是C-肽的10倍，产生的AUC或C平均是C-肽的20倍，产生的AUC或C平均是C-肽的30倍，产生的AUC或C平均是C-肽的40倍，产生的AUC或C平均是C-肽的50倍，产生的AUC或C平均是C-肽的60倍，产生的AUC或C平均是C-肽的70倍，产生的AUC或C平均是C-肽的80倍，产生的AUC或C平均是C-肽的90倍，产生的AUC或C平均是C-肽的100倍，产生的AUC或C平均是C-肽的110倍，产生的AUC或C平均是C-肽的120倍，产生的AUC或C平均是C-肽的130倍，产生的AUC或C平均是C-肽的140倍，或者产生的AUC或C平均是C-肽的150倍。
在其它实施方式中，给予等摩尔摩尔量的CBX129801产生的AUC或C平均是C-肽的2倍，产生的AUC或C平均是C-肽的5倍，产生的AUC或C平均是C-肽的10倍，产生的AUC或C平均是C-肽的20倍，产生的AUC或C平均是C-肽的30倍，产生的AUC或C平均是C-肽的40倍，产生的AUC或C平均是C-肽的50倍，产生的AUC或C平均是C-肽的60倍，产生的AUC或C平均是C-肽的70倍，产生的AUC或C平均是C-肽的80倍，产生的AUC或C平均是C-肽的90倍，产生的AUC或C平均是C-肽的100倍，产生的AUC或C平均是C-肽的110倍，产生的AUC或C平均是C-肽的120倍，产生的AUC或C平均是C-肽的130倍，产生的AUC或C平均是C-肽的140倍，或者产生的AUC或C平均是C-肽的150倍。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的剂量低于C-肽等效剂量的90％，低于C-肽等效剂量的80％，低于C-肽等效剂量的70％，低于C-肽等效剂量的60％，低于C-肽等效剂量的50％，低于C-肽等效剂量的40％，低于C-肽等效剂量的30％，低于C-肽等效剂量的20％，低于C-肽等效剂量的10％，低于C-肽等效剂量的9％，低于C-肽等效剂量的8％，低于C-肽等效剂量的7％，低于C-肽等效剂量的6％，低于C-肽等效剂量的5％，低于C-肽等效剂量的4％，低于C-肽等效剂量的3％，低于C-肽等效剂量的2％，低于C-肽等效剂量的1％，或者低于C-肽等效剂量的0.67％。
在其它实施方式中，CBX129801的剂量低于C-肽等效剂量的90％，低于C-肽等效剂量的80％，低于C-肽等效剂量的70％，低于C-肽等效剂量的60％，低于C-肽等效剂量的50％，低于C-肽等效剂量的40％，低于C-肽等效剂量的30％，低于C-肽等效剂量的20％，低于C-肽等效剂量的10％，低于C-肽等效剂量的9％，低于C-肽等效剂量的8％，低于C-肽等效剂量的7％，低于C-肽等效剂量的6％，低于C-肽等效剂量的5％，低于C-肽等效剂量的4％，低于C-肽等效剂量的3％，低于C-肽等效剂量的2％，低于C-肽等效剂量的1％，或者低于C-肽等效剂量的0.67％。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的清除率是C-肽的1/2，是C-肽的1/5，是C-肽的1/10，是C-肽的1/20，是C-肽的1/50，是C-肽的1/100，是C-肽的1/200，是C-肽的1/400，是C-肽的1/600，是C-肽的1/800，是C-肽的1/1000，是C-肽的1/1200，是C-肽的1/1400，或者是C-肽的1/1600。
在其它实施方式中，CBX129801的清除率是C-肽的1/2，是C-肽的1/5，是C-肽的1/10，是C-肽的1/20，是C-肽的1/50，是C-肽的1/100，是C-肽的1/200，是C-肽的1/400，是C-肽的1/600，是C-肽的1/800，是C-肽的1/1000，是C-肽的1/1200，是C-肽的1/1400，或者是C-肽的1/1600。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的半衰期是C-肽的2倍，是C-肽的5倍，是C-肽的10倍，是C-肽的20倍，是C-肽的50倍，是C-肽的100倍，是C-肽的200倍，是C-肽的300倍，是C-肽的400倍，是C-肽的500倍，是C-肽的600倍，是C-肽的700倍，是C-肽的800倍，是C-肽的900倍，是C-肽的1000倍，是C-肽的1100倍，是C-肽的1200倍，是C-肽的1300倍，是C-肽的1400倍，或者是C-肽的1500倍。
在其它实施方式中，CBX129801的半衰期是C-肽的2倍，是C-肽的5倍，是C-肽的10倍，是C-肽的20倍，是C-肽的50倍，是C-肽的100倍，是C-肽的200倍，是C-肽的300倍，是C-肽的400倍，是C-肽的500倍，是C-肽的600倍，是C-肽的700倍，是C-肽的800倍，是C-肽的900倍，是C-肽的1000倍，是C-肽的1100倍，是C-肽的1200倍，是C-肽的1300倍，是C-肽的1400倍，或者是C-肽的1500倍。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最小是约0.1nM～约15nM，约0.34nM～约9.0nM，约0.47nM～约6.8nM，约1.7nM～约4.9nM，约0.1nM～约1.5nM，约0.34nM～约0.60nM，约0.8nM～约1.6nM，约1.4nM～约2.1nM，约4.6nM～约9.0nM，约0.1nM～约0.2nM，约0.2nM～约0.3nM，约0.3nM～约0.4nM，约0.4nM～约0.6nM，约0.6nM～约0.8nM，约0.8nM～约1.0nM，约0.1nM～约0.5nM，约0.5nM～约1.0nM，约1.0nM～约1.5nM，约1.5nM～约2.0nM，约2.0nM～约2.5nM，约2.5nM～约3.0nM，约3.0nM～约3.5nM，约3.5nM～约4.0nM，约4.0nM～约4.5nM，约4.5nM～约5.0nM，约0.1nM～约1.0nM，约1.0nM～约2.0nM，约2.0nM～约3.0nM，约3.0nM～约4.0nM，约4.0nM～约5.0nM，约5.0nM～约6.0nM，约6.0nM～约7.0nM，约7.0nM～约8.0nM，约8.0nM～9.0nM，约9.0nM～约10nM，约10nM～约11nM，约11nM～约12nM，约12nM～约13nM，约13nM～约14nM，约14nM～约15nM，约0.1nM～约2.0nM，约2.0nM～约4.0nM，约4.0nM～约6.0nM，约6.0nM～约8.0nM，约8.0nM～约10nM，约10nM～约12nM，约12nM～约14nM，约0.1nM～约5.0nM，约5.0nM～约10nM，约10nM～约15nM，或者约15nM或约20nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最小是约0.34nM～约9.0nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最小是约0.47nM～约6.8nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最小是约1.7nM～约4.9nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最小是约1.7nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最小是约4.9nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C平均是约0.5nM～约15.0nM，约0.44nM～约12.2nM，约0.62nM～约9.5nM，约2.0nM～约5.9nM，约0.44nM～约0.79nM，约1.4nM～约1.9nM，约1.7nM～约2.4nM，约1.2nM～约2.0nM，约4.0nM～约9.0nM，约6.9nM～约12.2nM，约0.1nM～约0.2nM，约0.2nM～约0.3nM，约0.3nM～约0.4nM，约0.4nM～约0.6nM，约0.6nM～约0.8nM，约0.8nM～约1.0nM，约0.1nM～约0.5nM，约0.5nM～约1.0nM，约1.0nM～约1.5nM，约1.5nM～约2.0nM，约2.0nM～约2.5nM，约2.5nM～约3.0nM，约3.0nM～约3.5nM，约3.5nM～约4.0nM，约4.0nM～约4.5nM，约4.5nM～约5.0nM，约0.1nM～约1.0nM，约1.0nM～约2.0nM，约2.0nM～约3.0nM，约3.0nM～约4.0nM，约4.0nM～约5.0nM，约5.0nM～约6.0nM，约6.0nM～约7.0nM，约7.0nM～约8.0nM，约8.0nM～9.0nM，约9.0nM～约10nM，约10nM～约11nM，约11nM～约12nM，约12nM～约13nM，约13nM～约14nM，约14nM～约15nM，约0.1nM～约2.0nM，约2.0nM～约4.0nM，约4.0nM～约6.0nM，约6.0nM～约8.0nM，约8.0nM～约10nM，约10nM～约12nM，约12nM～约14nM，约0.1nM～约5.0nM，约5.0nM～约10nM，约10nM～约15nM，或者约15nM或约20nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C平均是约0.44nM～约12.2nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C平均是约0.62nM～约9.5nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C平均是约2.0nM～约5.9nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C平均是约2.0nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C平均是约5.9nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最大是约1.0nM～约20nM,约0.5nM～约14.5nM，约0.72nM～约11.2nM，约2.3nM～约6.7nM，约0.50nM～约0.92nM，约1.6nM～约2.1nM，约2.0nM～约2.6nM，约7.9nM～约14.5nM，约0.1nM～约0.2nM，约0.2nM～约0.3nM，约0.3nM～约0.4nM，约0.4nM～约0.6nM，约0.6nM～约0.8nM，约0.8nM～约1.0nM，约0.1nM～约0.5nM，约0.5nM～约1.0nM，约1.0nM～约1.5nM，约1.5nM～约2.0nM，约2.0nM～约2.5nM，约2.5nM～约3.0nM，约3.0nM～约3.5nM，约3.5nM～约4.0nM，约4.0nM～约4.5nM，约4.5nM～约5.0nM，约0.1nM～约1.0nM，约1.0nM～约2.0nM，约2.0nM～约3.0nM，约3.0nM～约4.0nM，约4.0nM～约5.0nM，约5.0nM～约6.0nM，约6.0nM～约7.0nM，约7.0nM～约8.0nM，约8.0nM～9.0nM，约9.0nM～约10nM，约10nM～约11nM，约11nM～约12nM，约12nM～约13nM，约13nM～约14nM，约14nM～约15nM，约0.1nM～约2.0nM，约2.0nM～约4.0nM，约4.0nM～约6.0nM，约6.0nM～约8.0nM，约8.0nM～约10nM，约10nM～约12nM，约12nM～约14nM，约0.1nM～约5.0nM，约5.0nM～约10nM，约10nM～约15nM，或者约15nM或约20nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最大是约0.5nM～约14.5nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最大是约0.72nM～约11.2nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最大是约2.3nM～约6.7nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最大是约2.3nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的C最大是约6.7nM。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的T最大是约1.8～约3.3天，0.5～10天，1～7天，1～2天，2～3天，3～4天，4～5天，5～6天，6～7天，7～8天，8～9天，9～10天，1～3天，2～4天，5～7天，6～8天，7～10天，1～4天，2～5天，3～6天，4～7天，5～8天，6～9天，或7～10天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的T最大是约1.8～约3.3天。
在某些实施方式中，PEG化的C-肽的半衰期超过约6小时，超过约12小时，超过约18小时，超过约1天，超过约2天，超过约3天，超过约4天，超过约5天，超过约6天，超过约7天，超过约8天，超过约9天，超过约10天，超过约11天，超过约12天，超过约13天，超过约14天，超过约15天，超过约16天，超过约17天，超过约18天，超过约19天，超过约20天，是1～20天，1～2天，2～3天，3～4天，4～5天，5～6天，6～7天，7～8天，8～9天，9～10天，10～11天，11～12天，12～13天，13～14天，14～15天，15～16天，16～17天，17～18天，18～19天，19～20天，1～3天，2～4天，3～5天，4～6天，5～7天，6～8天，7～9天，8～10天，9～11天，10～12天，11～13天，12～14天，13～15天，14～16天，15～17天，16～18天，17～19天，18～20天，1～4天，2～5天，3～6天，4～7天，5～8天，6～9天，7～10天，8～11天，9～12天，10～13天，11～14天，12～15天，13～16天，14～17天，15～18天，16～19天，17～20天，1～6天，2～7天，3～8天，4～9天，5～10天，6～11天，7～12天，8～13天，9～14天，10～15天，11～16天，12～17天，13～18天，14～19天，15～20天，约5.0天～约20天，约5.0天～约7.1天，或约5.0天～约11.2天。
在某些实施方式中，PEG化的C-肽的半衰期是约5.0天～约11.2天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的AUCτ是约3.1nM·天～约85nM·天，约4.3nM·天～约67nM·天，约13.8nM·天～约41.5nM·天，约3.5nM·天～约70nM·天，约3.1nM·天～约5.6nM·天，约10nM·天～约13nM·天，约12nM·天～约17nM·天，约48nM·天～约85nM·天，约1nM·天～约3nM·天，约3nM·天～约5nM·天，约7nM·天～约9nM·天，约9nM·天～约11nM·天，约11nM·天～约13nM·天，约13nM·天～约15nM·天，约5nM·天～约10nM·天，约10nM·天～约15nM·天，约15nM·天～约20nM·天，约20nM·天～约25nM·天，约5nM·天～约15nM·天，约10nM·天～约20nM·天，约15nM·天～约25nM·天，约20nM·天～约30nM·天，约25nM·天～约35nM·天，约30nM·天～约40nM·天，约35nM·天～约45nM·天，约40nM·天～约50nM·天，约45nM·天～约55nM·天，约50nM·天～约60nM·天，约55nM·天～约65nM·天，约60nM·天～约70nM·天，约65nM·天～约75nM·天，约70nM·天～约80nM·天，约75nM·天～约85nM·天，约5nM·天～约25nM·天，约15nM·天～约35nM·天，约25nM·天～约45nM·天，约35nM·天～约55nM·天，约45nM·天～约65nM·天，约55nM·天～约75nM·天，或者约65nM·天～约85nM·天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的AUCτ是约3.1nM·天～约85nM·天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的AUCτ是约4.3nM·天～约67nM·天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的AUCτ是约13.8nM·天～约41.5nM·天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的AUCτ是约13.8nM·天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的AUCτ是约41.5nM·天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的分布容积是约5L～约30L，约5.8L～约22L，约10.4L～约22L，约8L～约22L，约12L～约15L，约5L～约10L，约10L～约15L，约15L～约20L，约20L～约25L，约25L～约30L，约30L～约35L，约5L～约15L，约10L～约20L，约15L～约25L，约20L～约30L，或者约25L～约35L。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的分布容积是约5.8L～约22L。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的分布容积是约10.4L～约22L。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的分布容积是约10L～约15L。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的清除率是约0.8L/天～约2.2L/天，约0.9L/天～约2.2L/天，约1.1L/天～约1.6L/天，约1.3L/天～约1.7L/天，约0.1L/天～约5.0L/天，约0.2L/天～约0.6L/天，约0.4L/天～约0.8L/天，约0.6L/天～约1.0L/天，约0.8L/天～约1.2L/天，约1.0L/天～约1.4L/天，约1.2L/天～约1.6L/天，约1.4L/天～约1.8L/天，约1.6L/天～约2.0L/天，约1.8L/天～约2.2L/天，约2.0L/天～约2.4L/天，约2.2L/天～约2.6L/天，约2.4L/天～约2.8L/天，约2.6L/天～约3.0L/天，约0.1L/天～约1.0L/天，约0.5L/天～约1.5L/天，约1.0L/天～约2.0L/天，约1.5L/天～约2.5L/天，约2.0L/天～约3.0L/天，约2.5L/天～约3.5L/天，或者约3.0L/天～约4.0L/天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的清除率是约0.8L/天～约2.2L/天。
在其它实施方式中，PEG化的C-肽的清除率是约1.1L/天～约1.6L/天。
在其它实施方式中，C平均、C最小、C最大或AUCτ中至少一个在0.3mg～3.3mg的范围内与剂量成比例。
在其它实施方式中，给予的PEG化的C-肽的量是约0.25mg～约0.50mg，约0.5mg～约1.0mg，约1.0mg～约1.5mg，约1.5mg～约2.0mg，约2.0mg～约3.0mg，约3.0mg～约4.0mg，约4.0mg～约5.0mg，约3.0mg～约5.0mg，或者约5.0mg～约10.0mg。
在某些实施方式中，PEG化的C-肽先以加载剂量给予，然后以维持剂量给予。
在某些实施方式中，每7天给予PEG化的C-肽。
在其它实施方式中，所述PEG化的C-肽是CBX129801。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每7天约0.3mg～约3.3mg。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每7天约0.3mg。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每7天约1mg。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每7天约0.8mg。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每7天约2.4mg。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每7天约3.3mg。
在其它实施方式中，在第一天给予1.6mg的CBX129801的加载剂量，然后每7天给予约0.8mg的CBX129801的维持剂量。
在其它实施方式中，在第一天给予1.8mg的CBX129801的加载剂量，然后每7天给予约0.8mg的CBX129801的维持剂量。
在其它实施方式中，在第一天给予2mg的CBX129801的加载剂量，然后每7天给予约0.8mg的CBX129801的维持剂量。
在其它实施方式中，在第一天给予2.4mg的CBX129801的加载剂量，然后每7天给予约0.8mg的CBX129801的维持剂量。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每14天约2.4mg。
在其它实施方式中，在第一天给予3.3mg的CBX129801的加载剂量，然后每14天给予约2.5mg的CBX129801的维持剂量。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每14天约3.3mg。
在其它实施方式中，给予的CBX129801的量是每30天约12.5mg。
在其它实施方式中，PEG化C-肽的稳态血浆浓度在如下给药期内的重复给药后达到：在约3天给药期内，在约4天给药期内，在约5天给药期内，在约6天给药期内，在约7天给药期内，在约8天给药期内，在约9天给药期内，在约10天给药期内，在约11天给药期内，在约12天给药期内，在约13天给药期内，在约14天给药期内，在约15天给药期内，在约16天给药期内，在约17天给药期内，在约18天给药期内，在约19天给药期内，在约20天给药期内，在约21天给药期内，在约22天给药期内，在约23天给药期内，在约24天给药期内，在约25天给药期内，在约26天给药期内，在约27天给药期内，在约28天给药期内，在约29天给药期内，在约30天给药期内，在约31天给药期内，在约32天给药期内，在约33天给药期内，在约34天给药期内，在约35天给药期内，在约36天给药期内，在约37天给药期内，在约38天给药期内，在约39天给药期内，或在约40天给药期内。
在其它实施方式中，PEG化C-肽的稳态血浆浓度在约3天重复给药内达到。
在其它实施方式中，PEG化C-肽的稳态血浆浓度在约40天重复给药内达到。
在其它实施方式中，C-肽水平保持在高于最小有效治疗水平。
在要求保护的任何PEG化C-肽的某些方面中，所述PEG化C-肽具有与未经修饰的C-肽等力的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的某些方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少95％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的某些方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少90％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的某些方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少80％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少70％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少60％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少50％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少40％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少30％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少20％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少10％的生物学活性。在要求保护的任何PEG化C-肽的另一个方面中，所述PEG化C-肽保留未经修饰的C-肽的至少5％的生物学活性。
在另一个实施方式中，本发明包括使有需要的患者内维持C-肽水平高于最小有效治疗水平的方法，所述方法包括给予所述患者治疗剂量的任何要求保护的PEG化C-肽。
在任何要求保护的PEG化C-肽的另一个方面，所述PEG化C-肽在以有效治疗剂量皮下给予哺乳动物时基本没有不利副作用。
在另一个实施方式中，本发明包括治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗剂量的任何要求保护的PEG化C-肽。
在另一个实施方式中，本发明包括治疗胰岛素需求型患者的方法，所述方法包括联合给予所述患者PEG化C-肽治疗剂量的任何要求保护的PEG化C-肽，以及胰岛素。
在某些实施方式中，胰岛素需求型患者患有糖尿病。
在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以1天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以3天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以4天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以5天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以6天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以7天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以10天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以14天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以17天或更久的给药间隔给予。在任何这些方法的一个方面中，所述PEG化C-肽以21天或更久的给药间隔给予。
在任何这些方法的另一方面，皮下给予PEG化C-肽的治疗剂量。在任何这些方法的另一方面，经口给予PEG化C-肽的治疗剂量。
在另一个实施方式中，本发明包括任何要求保护的PEG化C-肽作为C-肽替代疗法在有需要的患者中的应用。
在另一个实施方式中，本发明包括任何要求保护的PEG化C-肽用于治疗有需要的患者的胰岛素需求型糖尿病的一种或多种长期并发症的应用。在某些实施方式中，所述糖尿病长期并发症选自下组：微血管疾病、大血管疾病、视网膜病、周围神经病变、自主神经病变和肾病。在某些实施方式中，所述胰岛素需求型糖尿病长期并发症是周围神经病变。在某些实施方式中，所述周围神经病变是已确立的周围神经病变。在某些实施方式中，治疗导致相较于PEG化C-肽治疗开始之前的神经传导速度而言，神经传导速度提高至少1m/s。
在某些实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/2。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/5。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/10。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/20。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/40。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/60。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/80。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/100。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/120。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/140。在其它实施方式中，为获得治疗有效浓度所需的PEG化C-肽剂量低于C-肽相当有效剂量的1/160。
在另一个实施方式中，本发明包括包含任何要求保护的PEG化C-肽和药学上可接受的运载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施方式中，所述药学上可接受的运载体或赋形剂是山梨醇。在某些实施方式中，所述山梨醇以约2％～约8％wt/wt的浓度存在。在某些实施方式中，所述山梨醇以约4.7％的浓度存在。在某些实施方式中，所述药物组合物被缓冲至pH在约pH5.5～约pH6.5范围内。在某些实施方式中，所述药物组合物被缓冲至pH约6.0。在某些实施方式中，所述药物组合物用浓度为约5mM～约25mM的磷酸盐缓冲液缓冲。在某些实施方式中，所述药物组合物用浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液缓冲。在任何这些实施方式的一个方面中，所述药物组合物的特点在于任何要求保护的PEG化C-肽的稳定性优于包含相同PEG化C-肽和0.9％盐水的pH7.0的药物组合物，其中所述稳定性是在40℃孵育预定时间后测得。在不同实施方式中，所述预定时间是约1周、约2周、约3周、约4周，或约5周，或约6周。
在另一个实施方式中，本发明包括包含任何要求保护的PEG化C-肽和胰岛素的药物组合物。
某些实施方式包括任何本文公开的PEG化C-肽在降低胰岛素需求型患者的低血糖症风险的方案中的应用，所述方案另包括给予胰岛素，所述方案包括：a)给予所述患者胰岛素；b)在与患者胰岛素给予位点不同的位点给予治疗剂量的PEG化C-肽；c)基于所述PEG化C-肽治疗剂量导致的患者对胰岛素需求的变化来调节给予胰岛素的剂量、类型或频率。
在一些实施方式中，所述患者患有至少一种糖尿病长期并发症。
某些实施方式包括治疗胰岛素需求型人患者的方法，所述方法包括如下步骤：a)给予所述患者胰岛素，其中所述患者有神经病变；b)在与给予该患者胰岛素的位点不同的位点皮下给予所述患者治疗剂量的任何本文公开的PEG化C-肽；c)基于对所述治疗剂量的PEG化C-肽导致的患者的胰岛素需求变化的监测来调节胰岛素给予的剂量、类型或频率，其中所述调节后的胰岛素剂量减少低血糖症的风险、发生或严重性，其中所述调节后的胰岛素剂量比开始PEG化C-肽治疗之前的该患者胰岛素剂量低至少10％。
某些实施方式包括减少胰岛素需求型人患者的胰岛素用量的方法，所述方法包括如下步骤：a)给予所述患者胰岛素；b)在与对所述换者给予胰岛素的位点的不同位点皮下给予所述患者治疗剂量的任何本公开的PEG化C-肽；c)基于对所述治疗剂量的PEG化C-肽导致的该患者对胰岛素需求变化的监测来调节给予胰岛素的剂量、类型或频率，其中所述调节后的胰岛素剂量不诱导低血糖症，其中所述调节后的胰岛素剂量比开始所述PEG化C-肽治疗之前该患者的胰岛素剂量低至少10％。
附图简要说明
可参考以下详述和附图更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式，附图中：
图1显示C-肽、PEG试剂和PEG化C-肽的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)：。
图2显示C-肽、PEG试剂和PEG化C-肽的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)的放大区域。
图3显示在D2O中采集的C-肽、PEG试剂和PEG化C-肽的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)。
图4显示在D2O中采集的C-肽、PEG试剂和PEG化C-肽的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)。
图5显示用胰凝乳蛋白酶孵育之后的C-肽(1mg/mL)和PEG化C-肽(10mg/mL)的肽图。
图6显示PEG化C-肽(约0.6mg/mL)在PBS缓冲液中的标准化沉降系数分布。
图7显示C-肽和PEG化C-肽的圆二色性分析。
图8显示PEG化C-肽样品H的尺寸排阻色谱(SEC)。
图9显示20kDa PEG化C-肽和40kDa PEG化C-肽的色谱覆盖。
图10显示十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE的结果：PEG化C-肽与样品以2～10mcg上样的凝胶电泳。
图11显示ERK磷酸化测定中PEG化C-肽相较于天然C-肽的生物学活性评估结果，其中批号1007-119、1008-134、1008-080和1-FIN-0988表示不同CBX129801样品，而批号209400是天然C-肽样品。
图12以线性刻度显示在人增加剂量研究中皮下给予CBX129801之后的平均血浆CBX129801浓度与时间的关系。
图13以对数刻度显示在人增加剂量研究中皮下给予CBX129801之后的平均血浆CBX129801浓度与时间的关系。
图14显示在皮下给予多个CBX129801剂量之后的血浆CBX129801C最大。
图15显示在皮下给予多个CBX129801剂量之后的个体血浆CBX129801AUCτ。
图16显示在每7天皮下给予0.8mg CBX129801之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图17显示在皮下给予1.6mg CBX129801的加载剂量然后每7天给予0.8mgCBX129801的维持剂量之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图18显示在皮下给予2.4mg CBX129801的加载剂量然后每7天给予0.8mgCBX129801的维持剂量之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图19显示在每7天皮下给予2.4mg CBX129801之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图20显示在皮下给予2.0mg CBX129801的加载剂量然后每7天给予0.8mgCBX129801的维持剂量之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图21显示在皮下给予3.3mg CBX129801的加载剂量然后每14天给予2.5mgCBX129801的维持剂量之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图22显示在每14天皮下给予3.3mg CBX129801之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图23显示在每30天皮下给予12.5mg CBX129801之后的血浆CBX129801浓度的模拟时程。
图24显示用CBX129801和PEG化大鼠C-肽处理的大鼠组在治疗4周和8周时对比基线的NCV变化。*p<0.05，与载剂(对照)组对比。
图25显示通过注射(每3天)用CBX129801皮下处理和通过植入渗透泵用C-肽皮下处理12周过程中的大鼠内的药物水平。在处理期间定时取血样并获得血浆用于通过ELISA测定CBX129801(PEG化C-肽)或C-肽。三种剂量水平不同，并且在各剂量水平组(低、中、高)中，PEG化和未修饰的C-肽之间有相似接触。
图26显示在STZ诱导的糖尿病大鼠中的处理12周后对比基线(STZ诱导后8～10天)的感觉/运动尾椎神经传导的变化。
图27显示在STZ诱导的糖尿病大鼠中处理12周之后的处理组对比载剂组的感觉/运动尾椎神经传导的变化。
图28显示在STZ诱导的糖尿病大鼠中处理12周之后的对比基线的指神经传导的变化。
发明详述
定义：
术语“激活”或“激活的”在与特定官能团联用时指与另一个分子上的亲电体或亲核体容易反应的反应性官能团。这不同于需要强催化剂或在高度不具可行性反应条件下才能反应的那些基团(即，“无反应性”或“惰性”基团)。如本文所用，术语“官能团”或其任何同义词意在涵盖其保护形式以及未保护形式。
术语“烷氧基"指-O-R基团，其中R是烷基或经取代的烷基，优选C1-6烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
术语“烷(烃)基”指烃，通常是长度为约1～12个碳原子的烃。烃可以是支链烃或直链烃，并且优选但不必是饱和的。示例性的烷(烃)基基团包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、2-甲基丁基、2-乙基丙基等。本文所述的“烷(烃)基”包括环烷(烃)基和亚环烷(烃)基。术语“低级烷(烃)基”指包含1～6个碳原子的烷(烃)基基团，其可以是直链的或支链的。
本文所用的术语“房室药代动力学分析”是假定药代动力学模型来评价药代动力学参数的方法。
本文所用的术语“非房室药代动力学分析”是计算药代动力学参数而不作药代动力学模型假定的方法。
本文所用的术语“C最大”是给药后药物的最大血清或血浆浓度。
本文所用的术语“C最小”是重复给药之后观察到的最小血浆浓度。
本文所用的术语“C平均”是由AUCτ除以给药间隔计算的平均血浆浓度。
本文所用的术语“T最大”是达到C最大的时间。
本文所用的术语"半衰期"或"t1/2"是由ln(2)除以λ计算的终末半衰期，其中λ是末期log-线性部分的速率速率常数。血浆浓度-时间曲线的后分布相中需要最少三个值来计算λ，并且R2(就所用数据的个数进行调整后的回归线的相关性拟合)值≥0.75。
本文所用的术语“T时延”或“延迟时间”是药物给予和首次观察到浓度高于血浆中定量极限之间的时间延迟(来自观察到的血浆浓度-时间数据)。
本文所用的术语“AUC”指血清或血浆浓度-时间曲线的“曲线下面积”，其在全部样品收集间隔以梯形积分法计算得到。
本文所用的术语"AUC最末"是采用线性梯形积分法得到的血浆浓度-时间曲线从时间为零至最末可检测的血浆浓度(CT)的曲线下面积。其计算为从时间为零直至最末可定量血浆浓度(CT)的面积之和。
本文所用的术语"AUCτ"或"AUC给药间隔"是在给药间隔中的血浆浓度-时间曲线下面积，并且采用线性梯形积分法计算。
本文所用的术语"AUC∞"或"AUC无穷"是从时间为零至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积。其计算为从时间为零至最末可定量血浆浓度(CT)的面积与从T至无穷大的面积之和，后者由最末可定量血浆浓度除以λ计算，其中λ是终末消除期速率常数，如下：
AUC &infin; = AUC &tau; + C T &lambda;
本文所用的术语“％AUC外推"是由(AUC∞-AUC最末)/AUC∞*100计算的外推的AUC。
本文所用的术语“CL/F”是SC注射之后的表观全身清除率。在非房室分析中，其通过将总剂量除以单一剂量的AUC∞或由总剂量除以稳态AUCT来确定。在房室分析中，CL/F是药代动力学模型中的拟合参数。
本文所用的术语“Vz/F”是基于SC注射后的终末期的表观分布容积。其在非房室分析中通过将Cl/F除以λ来确定。
本文所用的术语“Vc/F”是中心房室的表观分布容积。其在药代动力学房室分析中是拟合参数。
本文所用的术语“DNC最小”、“剂量标准化的C最小”、“剂量标准化的最小浓度”或“剂量标准化的最小血浆浓度”是经剂量标准化的重复给药后观察到的最小血浆浓度。其通过将C最小除以给药重量来计算。
本文所用的术语"DNAUCτ"、"剂量标准化的AUCτ"或"剂量标准化的AUC给 药间隔"是在给药间隔内的血浆浓度-时间曲线下的剂量标准化的面积。其通过将AUCτ除以给药重量来计算。
本文所用的术语“DNC最大”、“剂量标准化的C最大、“剂量标准化的最大浓度”或“剂量标准化的最大血浆浓度”是经剂量标准化的重复给药后观察到的最大血浆浓度。其通过将C最大除以给药重量来计算。
本文所述的术语“D1”指药物从皮下注射位点输入进入全身循环的时程。剂量除以D1描述的是药物输入进入循环的零级速率常数。
本文所用的术语“LD”是加载剂量，该剂量大于维持剂量并在处理过程起始时给予以更快速地达到所需血浆浓度并更快地获得效果。
本文所用的术语“MD”是维持剂量并且屡次给予以维持所需血浆浓度或治疗效果。
本文所用的术语“％CV”是变化的百分比系数。
术语“生物利用度”指到达循环的药物的量，表示为相对于用静脉内给药所得量的百分比。生物利用度通常表示为％生物利用度形式，其为某一药物(例如C-肽)在给予缓释组合物之后获得的该药物的生物利用度除以静脉内给予相同当量剂量的该药物之后获得的该药物的生物利用度，乘以100。
短语“保守性氨基酸取代”或“保守突变”指一个氨基酸被具有共同性质的另一个氨基酸替代。确定个体氨基酸之间的共同性质的实用方法是分析同源生物的对应蛋白质之间的氨基酸变化的标准化频率(Schulz GE和RH Schirmer,Principles of Protein Structure(《蛋白质结构原理》),Springer-Verlag(1979))。根据此类分析，可对氨基酸分组，其中一组内的氨基酸优先彼此交换，并因而在其对总体蛋白质结构的影响上彼此最为相似(Schulz GE和RH Schirmer,Principles of Protein Structure(《蛋白质结构原理》),Springer-Verlag(1979))。
以这种方法定义的氨基酸组的示例包括：“带电/极性组”，其由Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His组成；“芳族或环状组”，其由Pro、Phe、Tyr和Trp组成；以及“脂族组”，其由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys组成。
还可在各组中定义亚组，例如，所述带电/极性氨基酸的组可以再分为如下亚组：“带正电亚组”(由Lys、Arg和His组成)；“带负电亚组”(由Glu和Asp组成)，以及“极性亚组”(由Asn和Gln组成)。所述芳族或环状组可以再分为如下亚组：“氮环亚组”(由Pro、His和Trp组成)；和“苯基亚组”(由Phe和Tyr组成)。所述脂族组还可再分为如下亚组：“大脂族非极性亚组”(由Val、Leu和Ile组成)；“脂族轻极性亚组”(由Met、Ser、Thr和Cys组成)；以及“小残基亚组”(由Gly和Ala组成)。
保守突变的示例包括上述亚组内氨基酸的氨基酸取代，例如，Lys取代Arg以及反之，从而可保持带正电；Glu取代Asp以及反之，从而可保持带负电；Ser取代Thr从而可保持游离-OH；以及Gln取代Asn从而可保持游离-NH2。“半保守突变”包括上述相同组的氨基酸的氨基酸取代，其不在同一亚组。例如，Asp取代Asn的突变，或Asn取代Lys的突变，这均包括相同组内但不同亚组的氨基酸。“非保守突变”包括不同组之间的氨基酸取代，例如，Lys取代Leu，Phe取代Ser。
术语“道尔顿”、“Da”或“D”指质量的人为单位，其为碳-12的核素质量的1/12，等价于1.657×10-24g。术语“kDa”指千道尔顿(即，1000道尔顿)。
除非另有特定说明，术语“糖尿病(diabetes)”、“糖尿病(diabetes mellitus)”或“糖尿病病症”涵盖所有形式的糖尿病以及因手术切除、先天缺陷、损伤或物理伤害而缺乏功能性胰腺的患者。术语“1型糖尿病患者”或“1型糖尿病”指患者的禁食血浆葡萄糖浓度高于约7.0mmoL/L且禁食C-肽水平约为或低于约0.2nmoL/L。术语“2型糖尿病患者”或“2型糖尿病”一般指患者的禁食血浆葡萄糖浓度高于约7.0mmoL/L且禁食C-肽水平在早期阶段处于或高于C-肽水平的正常生理学范围(约0.47～2.5nmoL/L)。应理解，初始诊断为患有2型糖尿病的患者可能后续发展胰岛素需求型糖尿病，但即便其C-肽水平降至<0.2nmol/L，其仍被诊断为2型糖尿病患者。
除非另有指定，术语“胰岛素需求型患者”或“胰岛素需求型糖尿病”涵盖需要给予胰岛素来充分保持正常葡萄糖水平的糖尿病患者/糖尿病。
糖尿病通常通过检测禁食血液葡萄糖来诊断，有时通过糖化血红蛋白水平(其通常称作血红蛋白A1c或HbA1c)来诊断。正常禁食成人葡萄糖水平是70～99mg/dL。正常HbA1c水平一般低于6％。世界卫生组织定义，禁食血浆葡萄糖浓度的诊断值是7.0mmoL/L(126mg/dL)，高出该水平即为糖尿病，或者餐后2小时葡萄糖水平高于或等于11.1mmoL/L(高于或等于200mg/dL)。表明或暗示糖尿病高风险的其它值包括：动脉压升高大于或等于140/90mm Hg；血浆甘油三酯升高(大于或等于1.7mmoL/L[150mg/dL])和/或低HDL-胆固醇(男性少于0.9mmoL/L[35mg/dL]；女性少于1.0mmoL/L[39mg/dL])；向心性肥胖(BMI超过30kg/m2)；微量白蛋白尿，其中尿液白蛋白排泄率大于或等于20μg/分钟，或白蛋白肌酸酐率大于或等于30mg/g。
术语“递送剂”指在经口递送治疗剂中有效的运载体化合物或运载体分子，并且可与“运载体”互换使用。
术语“同源性”描述对序列相似度的基于数学的比较，其用于鉴定功能或基序相似的基因或蛋白质。本发明的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”以对公共数据库进行检索，以例如鉴定其它家族成员、相关序列或同源物。此类检索可采用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215:403-410的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)来进行。可采用NBLAST程序，分数＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸检索来获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可采用XBLAST程序，分数＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对以用于比较目的，可利用如Altschul等，1997，NucleicAcids Res.，25(17):3389-3402所述的缺口BLAST。当采用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
术语“同源性的”指具有“共同进化来源”的两种蛋白质之间的关系，包括来自相同动物物种中的总科(例如，免疫球蛋白总科)的蛋白质，以及来自不同动物物种的同源性蛋白质(例如，肌球蛋白轻链多肽；参见Reeck等:Cell50:667,(1987))。此类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，该序列同源性如其序列相似性所反映，无论是以相同性百分比形式反映还是通过特定残基或基序以及保守位置的存在来反映。在特定实施方式中，当两种核酸序列在所述核酸序列的确定长度上有至少约85％，且更优选地至少约90％或至少约95％的核苷酸匹配，则这两种核酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”，所述核苷酸的匹配情况由序列比对算法(如已知的BLAST、FASTA、DNA Strider、CLUSTAL等)来确定。此类序列的一个示例是本发明特定基因的等位基因或物种变体。基本同源的序列还可通过杂交(例如，在Southern杂交实验中于例如在对特定系统限定的严谨条件下)鉴定。
相似地，在本发明的具体实施方式中，当两种氨基酸序列有大于80％的氨基酸残基相同，或有大于约90％的氨基酸残基相似(即，功能上相同)时，这两种氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。优选地，所述相似或同源的多肽序列通过比对来鉴定，采用例如GCG(威斯康星州麦迪逊的遗传计算机组(Genetics Computer Group)，第7版)堆积程序(pileup program)或采用任何上述程序和算法。所述程序可采用Smith和Waterman的局部同源性算法，应用默认值：缺口生成罚分＝-(1+1/3k)，k是缺口延伸数，平均匹配＝1，平均错配＝-0.333。
本文所用的术语“相同性”指当两条或多条序列对齐以使序列匹配最大化(即，考虑缺口和插入)时，在所述序列的对应位置上相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。相同性易于用已知方法计算，包括但不限于如下所述的算法：Computational Molecular Biology(计算机分子生物学),Lesk,A.M.编，纽约牛津大学出版社(Oxford University Press)，1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects(生物运算：信息学和基因组工程)，Smith,D.W.编，纽约学术出版社(Academic Press)，1993；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编，新泽西州胡马纳出版公司(Humana Press)，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学的序列分析)，von Heinje,G.，学术出版社，1987；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov,M.和Devereux,J.编，纽约M斯托克顿出版社(M Stockton Press)，1991；和Carillo,H.和Lipman,D.，SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。设计测定相同性的方法以给出测试序列之间的最大匹配。另外，公共可用计算机程序中编码了测定相同性的方法。测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包(Devereux,J.等，Nucleic Acids Research12(1):387(1984))，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,SF等，J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和Altschul SF等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。BLAST X程序在NCBI和其它来源(BLAST Manual,Altschul,SF等，马里兰州贝塞斯达的NCBI NLM NIH，20894；Altschul,SF等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))中公开可用。众所周知的Smith Waterman算法(Smith TF,Waterman MS:J.Mol.Biol.147(1):195-197,(1981))也可用于测定序列间的相似性。
术语"胰岛素"包括胰岛素的所有形式和类似物，包括但不限于，速效形式，例如胰岛素赖脯胰岛素rDNA来源：HUMALOG(1.5mL,10mL,印第安纳州印第安纳波利斯的礼来公司(Eli Lilly and Company))、来自牛和猪的胰岛素注射物(常规胰岛素)(常规ILETIN I，礼来公司)，人：rDNA：HUMULIN R(礼来公司)、NOVOLIN R(纽约州纽约的诺和诺德公司(Novo Nordisk))、半合成：VELOSULIN(人)(诺和诺德公司)、rDNA(人)，有缓冲：VELOSULIN BR，猪：常规胰岛素(诺和诺德公司，猪纯化的：猪常规ILETIN II(礼来公司)，常规纯化猪胰岛素(诺和诺德公司)，和常规(浓缩)ILETIN II U-500(500单位/mL,礼来公司)；中间体作用形式，例如胰岛素锌混悬液，牛和猪：LENTE ILETIN G I(礼来公司)，人，rDNA:HUMULIN L(礼来公司),NOVOLIN L(诺和诺德公司),猪纯化的:LENTE ILETIN II(礼来公司),低精蛋白锌胰岛素混悬液(NPH):牛和猪:NPH ILETIN I(礼来公司),人,rDNA:HUMULIN N(礼来公司),诺和灵N(Novolin N)(诺和诺德公司),猪纯化的:猪NPH Eetin II(礼来公司),NPH-N(诺和诺德公司)；以及长效形式，例如胰岛素锌混悬液(长期型)(ULTRALENTE,礼来公司),人,rDNA:HUMULIN U(礼来公司)。胰岛素类似物包括但不限于：优泌乐(Humalog)(赖脯胰岛素)、诺和锐(Novolog)(天冬胰岛素)、诺和平(Levemir)(地特胰岛素)、兰德仕(Lantus)(甘精胰岛素)，以及阿匹卓(Apidra)(赖谷胰岛素)，及其混合物。
术语"检测"或"测量"指评估临床来源或患者来源样品中给定物质的存在、不存在、定量或量(其可以是有效量)，包括导出此类物质的定性或定量浓度水平，或者其它对患者临床参数的数值或分类评价。
本文所用的术语“餐”指标准餐和/或混合餐。
除非另有说明，术语“平均”用在药代动力学值之前时(例如，平均t最大)指该药代动力学值的算术平均值。
本文中所用的术语“平均基线水平”指用作比较基础的某个值的度量、计算或水平，其为例如，贯穿单一临床研究或多于一个临床研究的组合的具有统计学意义的数量的对象的平均值。
术语“多剂量”指该患者已按药物组合物的给药间隔接受至少两次所述药物组合物的给药。
术语“NCV”或“神经传导速度”指电化学信号沿神经通路传送的速度。神经传导速度可视轴突直径、髓鞘形成、轴突内部阻抗和温度而不同。神经传导速度在物种与物种间不同，且在个体与个体间有较低程度的不同。
术语“神经病变”在“神经病变患者”或“具有神经病变”的患者的语境中，指患者达到England等归纳的四个标准至少之一，England等(Distal symmetricpolyneuropathy:A definition for clinical research:Report of the AmericanAcademy of Neurology,the American Association of Electrodiagnostic Medicine,and the American Academy of Physical Medicine and Rehabilitation(远端对称性多发性神经病变：临床研究定义：美国神经病学学会、美国电诊断医学协会和美国理疗与康复学会报告),Neurology,2005,64,199-207)，其简要包括1)多发性神经病变的临床征兆，2)神经功能障碍的症状，3)至少两条神经内的神经传导障碍，或4)定量感觉缺陷。术语“确立的神经病变”指患者达到圣安东尼奥会议(San Antonio Conference)对糖尿病神经病变归纳出的四个标准中至少两个。术语“初期或亚临床神经病变”指患者仅显示神经传导缺陷，而没有其它神经病变的症状。
术语“正常葡萄糖水平”可与术语“血糖量正常”和“正常”互换使用，并且指禁食静脉血浆葡萄糖浓度少于约5.6mmol/L(100mg/dL)。认为葡萄糖水平持续高于血糖量正常水平(但低于糖尿病水平)是糖尿病前期症状，并且称为葡萄糖耐量降低(或葡萄糖耐受不良患者)。
本文所用的术语“患者”在本发明内容中优选是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、或牛，但不限于这些示例。可有利地采用除人以外的哺乳动物作为患者来表现胰岛素需求型糖尿病或糖尿病病症的动物模型。患者可以是雄性或雌性。患者可以是先前已被诊断或鉴定为患有胰岛素需求型糖尿病或糖尿病病症的那些，并且任选地已经历或正在经历针对糖尿病的治疗性介入。患者还可以是患有糖尿病长期并发症的那些。优选所述患者是人。
本文所用的术语"PEG"、“聚乙二醇”或"聚(乙二醇)"指任何水溶性的聚(环氧乙烷)，并且包括含有-(CH2CH2O)n-结构(其中n是2～约800的整数)的分子。常用的PEG是封端的PEG，其中所述PEG的一端被相对无活性基团(如烷氧基)封端，而另一端则是可被进一步修饰的羟基基团。常用的封端基团是甲氧基，而对应的封端的PEG通常称作mPEG。概念PEG通常用作mPEG的替代。本发明的具体PEG形式是支链的、直链的、分叉的PEG等，并且所述PEG基团通常多分散，具有低于约1.05的低多分散性指数。给定分子量的本发明的PEG部分通常将由一定范围的乙二醇(或环氧乙烷)单体组成。例如，分子量2000Da的PEG部分将通常将由43±10个(平均约43个)单体组成。术语“PEG化”指PEG共价连接至另一个分子，例如C-肽。
C-肽替代治疗语境中的术语“替代剂量”所指C-肽或PEG化C-肽剂量维持C-肽或PEG化C-肽的血液内水平在所需范围内，特别是维持在处于或高于最小有效治疗血液浓度的水平。在某些实施方式中，所述最小有效治疗浓度是处于在健康非糖尿病对象内观察到的正常生理学范围内的水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约0.1nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约0.2nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约0.4nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约0.6nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约0.8nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约1.0nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约1.2nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约1.4nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约1.6nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约1.8nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约2.0nM的最低水平。在某些方面，所述替代剂量使平均稳态浓度C-肽或PEG化C-肽水平维持在给药间隔之间高于约4.9nM的最低水平。
提及胰岛素或PEG化C-肽的给予模式时，术语“皮下”或“通过皮下”或“S.C.”或“s.c.”指药物以推注注射或通过可植入装置给予进入皮下组织(直接处于统称为皮肤的真皮和表皮下的皮肤层)内或下。供于皮下给予和/或植入的优选位点包括上臂外部、稍高于或低于腰部除环绕肚脐的区域(2英寸圆圈)以外的区域。臀部上部髋骨稍后部的区域。大腿前侧，中间至外侧，大腿顶部下4英寸至膝盖上4英寸。
术语“单一剂量”指患者已接受药物组合物的单剂量给药，或已接受其间经历清除期的重复单剂量给药。除非特别定义为“单剂量”或处于“稳态”，本文公开且主张的药代动力学参数涵盖单剂量和多剂量情况。
术语“序列相似性”指可能共有或不共有进化来源的核酸序列或氨基酸序列之间的相同性或相应性程度(参见Reeck等，同上)。然而，在一般应用和本申请中，术语“同源性”在副词例如“高度”修饰下可指序列相似性并且可以关于或不关于共有进化来源。
“统计学显著的”指结果不太可能偶然发生。统计学显著性可用本领域已知的任何方法测定。常用的显著性测量法包括p值，其代表若零假设成立时观察到的事件会发生的频率或可能性。若获得的p值小于显著性水平，则排除零假设。在简单情况下，将显著性水平定义为p值是0.05或更小。
如本文定义，术语“控释”、“缓释”或“缓控释制剂”指药物例如PEG化C-肽从缓释组合物或控释装置的释放发生一段时间，这段时间比直接I.V.或S.C.给予单剂量药物可获得药物的时间要长。一方面，缓释是释放发生持续的时间至少约1～2周、约2～4周、约1～2个月、约2～3个月或约3～6个月。在某些方面，缓释是释放发生持续时间约6个月～约1年。释放的连续性和释放水平会受如下因素影响：缓释装置类型(例如，可编程的泵或渗透性驱动的泵)或缓释组合物类型，以及所用PEG化C-肽的类型(例如，单体比例、分子量、封闭组合物和不同聚合物的组合)、装载的多肽，和/或为产生所需效果所作赋形剂选自，其在本文中有更详细描述。
根据本发明的任何方法，可提供不同的缓释情形。“缓释情形”指在植入/插入或其它给药方法过程中，在给予后最初24小时内释放情形低于体内总药物释放的50％。在本发明的一个优选实施方式中，控释情形选自下组：a)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的48～72小时之间；b)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的72～96小时之间；c)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的96～110小时之间；d)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的1～2周之间；e)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的2～4周之间；f)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的4～8周之间；g)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的8～16周之间；h)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的16～52周(1年)之间，和i)50％释放点的出现时间在植入/插入或其它给予方法后的52～104周之间。
此外，采用缓释组合物能降低药物血清浓度的“波动度(DFL)”。DFL是对药物血浆水平在给药间隔过程中变化的度量[(C最大-C最小)/C平均]。在简单情况下，例如I.V.给予，波动度通过消除半衰期(T1/2)和给药间隔之间的关系来确定。若给药间隔等于半衰期，则波谷浓度恰为波峰浓度的一半，并且波动度是100％。因此，在DFL降低(就相同给药间隔而言)的缓释组合物意味着减小了波峰和波谷血浆水平之间的差异。在某些实施方式中，接受PEG化C-肽缓释组合物的患者的DFL大约是100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。在其它实施方式中，接受PEG化C-肽缓释组合物的患者的DFL是约36％～约50％。
术语“治疗”或“处理”表示缓解、减轻、延迟、降低、逆转、改善、控制或防止对象中的至少一种病症症状。术语“治疗”也可表示终止、延迟病症发生(即疾病临床表现之前的阶段)和/或降低病症发展或恶化的风险。
本文中所用的术语“治疗有效量”、“预防有效量”或“诊断有效量”是在给予后引发所需生物学响应所需要的药物(如胰岛素或PEG化C-肽)的量。
术语“单位剂型”指适于人类和动物患者且如本领域已知单独包装的物理上离散的单位。出于本发明目的设想包含治疗有效量药物的本发明剂型可包括一个或多个单位剂量(例如，片剂、胶囊剂、粉剂、半固体[例如，软胶囊或薄膜]、经口给予用的液体、注射用的安瓿或小瓶、已装载的注射器)以获得治疗效果。出于本发明目的还设想所述剂型的优选实施方式是可皮下注射剂型。
术语“约”或“大约”表示在本领域普遍技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，这将取决于该数值的测量或确定方式，即测量体系的极限。例如，“约”可按本领域实践表示在1个标准偏差之内或大于1个标准偏差。
或者，关于所述组合物的“约”可指加减至多20％的范围，优选至多10％，更优选至多5％。
除非上下文另有明确说明，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。因此，例如，提及“一个分子”包括一个或多个此类分子，“一种试剂”包括一种或多种此类不同试剂，提及“一种抗体”包括一种或多种此类不同抗体，以及提及“所述方法”包括提及本领域普通技术人员已知的能够改进或取代该方法和本文所述药物组合物的相当步骤和方法。
除非有限定，在此使用所有技术和科学术语均与本发明所述领域的技术人员的通常理解一致。下表B中所列缩写用于本公开内容的某些部分：
虽然与本文公开那些相似或等同的任何方法、组合物、试剂、细胞均可用于实践或测试本发明，但本文描述优选的方法和材料。
本说明书中引用的包括但不限于专利和专利申请的全部出版物和参考文献均通过引用其全文纳入本文，就像指示各出版物或参考文献特定且独立地通过如陈述全文一样通过引用纳入本文。被本申请要求优先权的任何专利申请也以就上述出版物和参考文献而言的方式通过引用其全文纳入本文。
除非另有说明，本发明的实践将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这均属于本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中已有描述。参见例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册I》),第二版,第1-3册,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Ausubel,F.M.等.(1995版和定期增补版；Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》),第9、13和16章，纽约州纽约的约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons))；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques(《DNA分离与测序：基础技术》),约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)；J.M.Polak和James O'D.McGee,1990,In SituHybridization:Principles and Practice(《原位杂交：原理与实践》)；牛津大学出版社(Oxford University Press)；M.J.Gait(编),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(《寡核苷酸合成：实践方法》),Irl出版社；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesisand Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology(《酶学方法：DNA结构部分A：酶学DNA合成与物理分析方法》),学术出版社(Academic Press)；Handbookof Drug Screening(《药物筛选手册》),Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes编(2001,纽约州纽约,马塞尔德克尔出版社(Marcel Dekker),ISBN0-8247-0562-9)；Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and Other ReferenceTools for Use at the Bench(《实验室参考：关于批量使用配方、试剂和其它参考工具的手册》),Jane Roskams和Linda Rodgers编,2002,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory),ISBN0-87969-630-3；Harris,JM和Zalipsky,S编,Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications(《聚(乙二醇)，化学与生物学应用》),ACS,华盛顿,1997；Veronese,F.和J.M.Harris,编,Peptide andprotein PEGylation,Advanced Drug Delivery Reviews(《肽与蛋白质的PEG化，高等药物递送综述》),54(4)453-609(2002)；Zalipsky,S.等,“Use offunctionalized Poly(Ethylene Glycols)for modification of polypeptides(功能化的聚(乙二醇)在多肽修饰中的应用)”刊于“聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用”(Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and BiomedicalApplications)。这些一般文本各自通过引用纳入本文。
提供上文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。
I.聚乙二醇(PEG)
PEG是熟知的在多种水性和有机溶剂中具有良好溶解性的聚合物，其显示低毒性，无免疫原性并且澄清、无色、无味且稳定。出于这些及其它原因，PEG已被选择作为连接用的最优选聚合物，但其仅用于说明而非限制目的。可用其它水溶性聚合物获得类似产物，包括但不限于：聚乙烯醇、其它聚(烯化氧)例如聚(丙二醇)等，聚(氧乙基化多元醇)例如聚(氧乙基化甘油)等，羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-l,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐和多聚氨基酸。本领域技术人员能够基于所需剂量、循环时间、对蛋白水解的抵抗及其它考虑选择所需聚合物。
用于使此类聚合物与活性部分接合的代表性聚合试剂与方法在如下文献中有描述：Harris,J.M.和Zalipsky,S.编,聚(乙二醇),Chemistry and BiologicalApplications(《化学与生物学应用》),ACS,华盛顿,1997；Veronese,F.和J.M.Harris,编,Peptide and Protein PEGylation,Advanced Drug Delivery Reviews(《肽与蛋白质的PEG化，高级药物递送综述》),54(4)；453-609(2002)；Zalipsky,S.等,"Use of Functionalized Poly Ethylene Glycols)for Modification ofPolypeptides(功能化聚乙二醇用于修饰多肽的应用)"刊于Polyethylene GlycolChemistry:Biotechnical and Biomedical Applications(《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用》),J.M.Harris编,纽约的普莱纳斯出版社(Plenus Press)(1992)；Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews16:157-182；以及Roberts等,Adv.DrugDelivery Reviews,54,459-476(2002)。
多种PEG衍生物市售可得且适合应用于本发明PEG接合物的制备。例如，NOF公司的系列(www.peg-drug.com)提供多种PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇和活化的PEG衍生物，例如琥珀酰亚胺酯、甲氧基-PEG胺、马来酰亚胺和羧酸类，可用于通过不同方法与C-肽偶联，奈他治疗高级PEG化公司(Nektar Therapeutics'Advanced PEGylation)也提供不同的PEG-偶联技术以改善治疗安全性和治疗功效。用于形成本发明C-肽接合物的其它PEG包括可从聚合纯公司(Polypure)(挪威)、量子生物设计有限公司(QuantaBioDesign LTD)(俄亥俄州)和尚柏公司(Sunbio,Inc)(韩国)获得的那些。适用于形成本发明接合物的其它PEG试剂以及接合方法描述于Pasut.G.等,Expert Opin.Ther.Patents(2004),14(6)859-893。
对于专利、公开专利申请和相关出版物的检索也为阅读本公开的本领域技术人员提供有意义的可用的PEG偶联技术和PEG衍生物。例如，美国专利号7,026,440；6,858,736；6,828,401；6.602,498；6,495,659；6,448,369,6,436,386；5,990,237；5,932,462；5,900,461；5,824,784；5,739,208；5.672,662；5,650,234；5,629,384；5,252,714；和4,904,584；其内容通过引用其全文纳入本文，描述此类技术和衍生物以及用于其制备的方法。
本发明的PEG化C-肽的PEG部分的分子量在约4,000Da～80,000Da范围内变化。所述分子量通常是约4000Da～约10,000Da、约10,000Da～约20,000Da、约20,000Da～约30,000Da、约30,000Da～约40,000Da、约40,000Da～约50,000Da、约50,000Da～约60,000Da、约60,000Da～约70,000Da，和约70,000Da～约80,000Da。PEG部分的平均分子量的非限制性示例是约10,000Da、约20,000Da、约30,000Da、约40,000Da、约50,000Da、约60,000Da、约70,000Da和约80,000Da。
因为所有PEG聚合物实际上以不同高分子质量的混合物形式存在，所以PEG分子量(MW)通常报告为数量平均(Mn)、重量平均(Mw)或z均(Mz)分子量。重量平均通常是所述三者中最有用的一种，因为其适当考虑了不同大小的链对聚合物总体性能的作用，并与大多数感兴趣的物理性质关联最好。
其中“Ni”是聚合物混合物中分子量为“Mi”的分子的摩尔分数(或数量分数)。已知Mw与Mn的比是多分散性指数(PDI)，并且提供对分布宽度的粗略指示。MW分布非常窄的特定聚合物的PDI接近1.0(下限)。
给定分子量的本发明的PEG基团通常将由一定范围的乙二醇(或环氧乙烷；OCH2CH2)单体组成。例如，分子量2000Da的PEG基团将通常将由43±10个(平均约43～44个)单体组成。
本发明的PEG基团通常包含多种亚基，例如，要求保护的任何化合物中的各n、n1或n2或n3可各自独立地是约1～约1000个亚基、约1～约800个亚基、约1～约600个亚基、约1～约400个亚基、约1～约300个亚基，或者约1～约200个亚基。充分合适的PEG基团如下，其中亚基(即n1、n2和n3)的数目独立地选自下组：约800～约1000个亚基；约800～约950个亚基；约600～约850个亚基；约400～约650个亚基；约200～约450个亚基；约180～约350个亚基；约100～约150个亚基；约35～约55个亚基；约42～约62个亚基；约12～约25个亚基；或者约1～10个亚基。在某些实施方式中，所述PEG化C-肽将具有约40kDa的分子量，因此支链PEG中的各PEG链的n1和n2将在约440～约550个亚基或约450～约520个亚基的范围内。
II.C-肽的治疗形式
本文所用的术语“C-肽”或“胰岛素原C-肽”包括保留C-肽活性的C-肽的全部天然产生形式与合成形式。此类C-肽包括人的肽，以及源自其它动物物种和属(优选哺乳动物)的肽或其功能等价衍生物，其可具有不同氨基酸序列，例如，截短形式(例如，从N-或C-末端或两个末端截短)或其它氨基酸缺失、添加、插入、取代或翻译后修饰。C-肽的截短形式必须至少包含序列EGSLQ(SEQ.ID.No.2,示于表C)的五个氨基酸。天然产生的化学衍生物，包括C-肽的翻译后修饰和降解产物，也具体包括在本发明的任何方法与药物组合物中，其包括例如焦谷氨酰、异天冬胺酰、蛋白水解的、磷酸化的、糖基化的、氧化的、异构化的和脱氨基的C-肽变体。优选地，"C-肽"指具有如下氨基酸序列的人类C-肽：EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ(SEQ.ID.No.1，示于表C)。
C-肽、C-肽变体、衍生物及其片段的PEG化形式在其具有可检测的C-肽活性方面是功能上等同的。更具体地，其显示天然胰岛素原C-肽(尤其是人C-肽)活性的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或高于100％。因此，其能够起胰岛素原C-肽的作用，即，能够替代C-肽本身。所述活性指天然C-肽显示的任何活性，不论是在体内或体外测试系统中显示的生理学响应，还是由天然C-肽介导的任何生物学活性或反应，例如，在酶测定或在与测试组织、膜或金属离子的结合中的反应。因此，已知C-肽造成钙流入并启动一定范围的胞内信号转导级联反应，例如MAP-激酶通路的磷酸化，包括PKC、RhoA、ERK1和2、JNK和p38MAPK的磷酸化，导致eNOS、Na+K+ATP酶以及多种转录因子(CREB、NF-κB、ATF1、ZEB和PPARγ)的表达和活性增加。因此，可通过将在研的肽(例如片段或衍生物)添加或给予至来自相关目标组织(例如内皮、肾、成纤维细胞和免疫细胞)的细胞之后测定任何这些通路的活化或上调来测定C-肽活性。此类测定在如下文献中有描述，例如，Ohtomo Y等.(Diabetologia39:199-205,(1996)),Kunt T等.(Diabetologia42(4):465-471,(1999)),Shafqat J等.(Cell Mol.Life Sci.59:1185-1189,(2002)).Kitamura T等.(Biochem.J.355:123-129,(2001)),Hills和Brunskill(Exp Diab Res2008)，如WO 98/13384或Ohtomo Y等.(同上)或OhtomoY等.(Diabetologia41:287-291,(1998))所述。Kunt T等.(同上)中还描述了基于内皮细胞一氧化氮合成酶(eNOS)活性采用牛动脉细胞和报告细胞试验的C-肽活性的测定。与特定细胞的结合也可用于评估或测定C-肽活性，例如与人肾小管细胞、皮肤成纤维细胞和大隐静脉内皮细胞的细胞膜的结合，采用荧光相关分光光度计测定，其在如下文献中有描述，例如，Rigler R等.(PNAS USA96:13318-13323,(1999)),Henriksson M等.(Cell Mol.Life Sci.57:337-342,(2000))和Pramanik A等.(Biochem Biophys.Res.Commun.284:94-98,(2001))。
一方面，所述哺乳动物是狗。一方面，所述哺乳动物是大鼠。一方面，所述哺乳动物是猴子。一方面，所述哺乳动物是人。
III.C-肽与PEG化C-肽制备
C-肽制备
C-肽可合成性地采用标准固相肽合成法，或通过重组技术(例如作为从人胰岛素原生成人胰岛素的副产物)，或采用遗传修饰的宿主来产生(总体参见WO1999007735；Jonasson P等,J Biotechnol.(2000)76(2-3):215-26；Jonasson P等,Gene(1998)；210(2):203-10；Li SX,Tian等,Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu WuLi Xue Bao(上海)(2003)35(11):986-92；Nilsson J等,J Biotechnol.(1996)48(3):241-50；Huang YB等,Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)(2006)38(8):586-92)。
在直接偶联至N末端的替代性方法中，可在肽合成过程中将PEG试剂或赖氨酸残基纳入C-肽的所需位置。通过该方法，可实现一个或多个PEG的位点选择性纳入。参见例如，国际专利申请号WO 95/00162，其描述接合肽的位点选择性合成。
C-肽可采用例如美国专利号6,500,645中公开的胰岛素生物合成所用熟知技术，通过使编码在研C-肽的DNA序列在合适的宿主细胞中表达来产生。所述C-肽可直接表达，或如美国专利号6,558,924中公开作为多聚化构建体表达以提高产物产量。所述多聚化产物在从培养物液中分离后于体外切割。
可通过建立的标准方法来合成制备编码C-肽的多核苷酸序列，所述方法例如Beaucage等人所述的亚磷酰胺方法(Beaucage et al.(1981)Tetrahedron Letters22:1859-1869)或Matthes等人所述的方法(Matthes et al.(1984)EMBO Journal3:801-805)。根据所述亚磷酰胺方法合成寡核苷酸，例如在自动化DNA合成仪中合成，纯化、双链化并连接以形成合成的DNA构建体。目前优选的制备DNA构建体的方法是通过聚合酶链式反应(PCR)。
所述多核苷酸序列还可以具有混合的基因组、cDNA和合成起点。例如，可将编码前导肽的基因组或cDNA序列接至编码A链或B链的基因组或cDNA序列，此后可按熟知方法通过插入编码同源重组所需氨基酸序列的合成的寡核苷酸来在某一位点修饰该DNA序列，或优选地通过PCR采用合适的寡核苷酸生成所需序列。
所述重组方法通常会利用能够在所选微生物或宿主细胞中复制的载体，所述载体携带编码本发明亲本单链胰岛素的多核苷酸序列。所述重组载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，所述载体例如，质粒、染色体外元件、小染色体(mini-chromosome)或人造染色体。
所述载体可包含任何手段以确保自复制。或者，所述载体可以是在引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并随被整合的染色体一起复制的载体。此外，可采用含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA的单一载体或质粒或两种或更多种载体或质粒，或采用转座子。所述载体可以是线性的或闭合环状质粒，并且将优选包含如下一个或多个元件来允许所述载体稳定整合入宿主细胞基因组或使载体在所述细胞内独立于基因组自主复制。
所述重组表达载体能够在酵母中复制。使所述载体能够在酵母中复制的序列的示例有，酵母质粒2pm复制基因REP1-3和复制起点。所述载体可包含一个或多个可检测标志物，所述标志物使得易于选择转化的细胞。可选择的标志物是基因，该基因的产物提供生物杀灭剂或病毒抗性、对重金属的抗性、营养缺陷型的原养生物等。细菌可选择标志物的示例有，来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或提供抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标志物。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标志物包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)和trpC(磷氨基苯甲酸酯合成酶)。用于酵母宿主细胞的合适标志物有ADE2、H153、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于酵母的充分合适的选择性标志物是粟酒裂殖酵母TPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。
在所述载体中，使多核苷酸序列操作性地连接至合适的启动子序列。所述启动子可以是任何核酸序列，其在所选宿主细胞中显示转录活性，包括突变、截短和杂交启动子，并且可获自编码胞外或胞内多肽的基因，其可与所述宿主细胞同源或异源。
用于引导细菌宿主细胞内的转录的合适启动子的示例有，获自如下基因的启动子：大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)和地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)。用于引导丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的示例有获自如下基因的启动子：米曲菌(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶基因、米黑根毛菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶基因和黑曲霉酸稳定α-淀粉酶基因。在酵母宿主中，有用的启动子有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Mal、TPI、ADH或PGK启动子。编码本发明C-肽的多核苷酸序列通常也操作性地连接至合适的终止子。酵母中的合适终止子是TPI终止子(Alber等.(1982)J.Mol.AppI.Genet.1:419-434)。
用于将编码本发明亲本单链胰岛素的多核苷酸序列分别连接所述启动子与所述终止子的方法，以及用于将其插入包含在所选宿主中复制所必需的信息的合适载体的方法是本领域技术人员熟知的。应理解，所述载体可通过先制备包含编码本发明单链胰岛素的完整DNA的DNA构建体，并后续将该片段插入合适的表达载体来构建，或通过依次插入编码个体元件遗传信息的DNA片段，然后连接来构建。
将包含编码本发明C-肽的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞，从而该载体作为染色体的部分或作为染色体外自复制载体保持。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代因复制过程中发生的突变而与所述亲本细胞不尽相同。所述宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。可用的单细胞细胞是细菌细胞，例如，革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞、链霉菌属细胞，或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌属和假单胞菌属。真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞。所述酵母生物可以是任何合适的在培酵母生物，其产生大量本发明单链胰岛素。合适的酵母生物的示例有选自下组酵母物种的菌株：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁糖酵母(Sacchoromyces uvarum)、乳酸克鲁维酵母(Kluyvero-myces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowiailpolytica)、假丝酵母(Candida sp.)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、地霉(Geotrichum sp.)和发酵性地霉(Geotrichumfermentans)。
所述酵母细胞的转化可能会受例如以本身已知方式转化之前的原生质体形成的影响。用于培养所述细胞的培养基可以是适合酵母生物生长的任何常规培养基。分泌的单链胰岛素将以显著比例以正确加工形式存在于培养基中，可通过常规方法从所述培养基回收，所述回收方法包括：通过离心从培养基分离酵母细胞，过滤或通过离子交换基质或通过反相吸附基质捕获胰岛素前体，利用盐(例如，硫酸铵)使上清液或滤液中的蛋白质成分沉淀，然后通过不同色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱等)进行纯化。
PEG化C-肽制备
在某些实施方式中，使C-肽在合适碱的存在下，在合适溶剂中与合适激活的PEG衍生物反应。在其它实施方式中，所述激活的PEG衍生物是支链的约40kDa-NHS酯PEG衍生物(SUNBRIGHT GL2-400GS2(NOF公司))。在其它实施方式中，所述碱是N-甲基吗啉。在其它实施方式中，所述溶剂是乙腈与水的混合物。在其它实施方式中，所述溶剂是乙腈与水50/50的混合物。在其它实施方式中，将所述N-甲基吗啉分成几份间隔性地添加。在其它实施方式中，将所述N-甲基吗啉分成几份以一小时间隔添加。在其它实施方式中，监测所述反应混合物的pH并按需添加N-甲基吗啉以维持pH。在其它实施方式中，将所述pH维持在8.0～8.2。
在某些实施方式中，所述PEG化C-肽通过制备型反相色谱纯化。在其它实施方式中，柱是反相二氧化硅柱。在其它实施方式中，所述反相二氧化硅是C-18反相二氧化硅。在其他实施方式中，所述反相二氧化硅是Diasogel C-18,15μm,300埃。在其它实施方式中，包含C-肽混合物的反应混合物用酸和水的混合物稀释。在其它实施方式中，包含C-肽混合物的反应混合物用6体积0.1％三氟乙酸(TFA)/水稀释。在其它实施方式中，通过加载内含梯度乙腈(ACN)的稀释水性酸来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽。在其它实施方式中，通过加载内含梯度ACN的稀释水性TFA来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽(缓冲液A是0.1％TFA，缓冲液B是100％ACN:5分钟内0～25％B，然后25％～50％B用时100分钟然后保持直至产物被洗脱)。
在某些实施方式中，所述PEG化C-肽通过制备型反相色谱纯化并脱盐。在其它实施方式中，柱是反相二氧化硅柱。在其它实施方式中，所述反相二氧化硅是C-18反相二氧化硅。在其它实施方式中，所述反相二氧化硅是Diasogel C-18,15μm,300埃。在其它实施方式中，通过加载内含梯度ACN的稀释水性酸来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽。在其它实施方式中，通过加载内含梯度ACN的稀释水性乙酸(AcOH)来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽(缓冲液A是2％乙酸，缓冲液B是100％乙腈:5分钟内0～25％B，然后25％～50％B用时50分钟然后保持直至产物被洗脱)。在其它实施方式中，使包含分级成分的PEG化C-肽冻干。
在某些实施方式中，所述PEG化C-肽通过制备型离子交换色谱纯化。在其它实施方式中，所述离子交换柱是改性纤维素柱。在其它实施方式中，所述离子交换柱是DEAE52Cellulose(DEAE52纤维素)柱。在某些实施方式中，使所述PEG化C-肽溶解于水性溶剂混合物中并加载至所述柱。在其它实施方式中，所述水性溶剂混合物是ACN/水。在其它实施方式中，所述水性溶剂混合物是5％ACN/水。在其它实施方式中，用水性缓冲液从所述柱洗脱所述PEG化C-肽。在其它实施方式中，所述缓冲液是氯化钠和乙酸铵的水性溶液。在其它实施方式中，所述缓冲液是氯化钠(1M)和乙酸铵(1M)的水性溶液。在其它实施方式中，所述缓冲液是水性的内含AcOH的5％ACN。在其它实施方式中，所述水性5％AcOH以梯度加载。在其它实施方式中，所述水性AcOH梯度是1％～5％。
在某些实施方式中，所述PEG化C-肽通过制备型反相色谱纯化。在其它实施方式中，柱是反相二氧化硅柱。在其它实施方式中，所述反相二氧化硅是C-18反相二氧化硅。在其它实施方式中，所述反相二氧化硅是Diasogel C-18,15μm,300埃。在其它实施方式中，来自所述离子交换色谱步骤的包含C-肽混合物的分级分离部分用水稀释。在其它实施方式中，所述柱用稀释的酸冲洗。在其它实施方式中，所述柱用2％AcOH冲洗。在其它实施方式中，通过加载内含梯度ACN的稀释AcOH来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽。在其它实施方式中，通过加载内含梯度ACN的稀释AcOH来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽(缓冲液A是2％AcOH，缓冲液B是100％ACN:5分钟内0～25％B，然后25％～50％B用时50分钟然后保持直至产物被洗脱)。在某些实施方式中，将包含分级成分的PEG化C-肽冻干。
在某些实施方式中，使PEG化C-肽重溶成水性酸溶液。在其它实施方式中，使所述PEG化C-肽在2％水性AcOH中重溶。在其它实施方式中，使所述PEG化C-肽以约15～20g/L的浓度重溶。在其它实施方式中，将所述PEG化C-肽溶液冻干以获得其游离酸形式的纯PEG化C-肽药物物质。
IV.使用方法
一方面，本发明包括使有需要的患者内的C-肽水平维持在高于最小有效治疗水平的方法，所述方法包括给予所述患者治疗剂量的任何要求保护的PEG化C-肽。
另一方面，本发明包括使有需要的患者内的C-肽水平维持在处于或高于平均有效治疗水平的方法，所述方法包括给予所述患者治疗剂量的任何要求保护的PEG化C-肽。
另一方面，本发明包括治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗剂量的任何要求保护的PEG化C-肽。
另一方面，本发明包括治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括联合给予所述患者治疗剂量的任何本发明要求保护的PEG化C-肽和胰岛素。
另一方面，本发明包括任何本发明要求保护的PEG化C-肽作为C-肽替代治疗或剂量用于有需要的患者的应用。
广义上讲，糖尿病指身体对其自身胰岛素反应不当、不制造足够胰岛素，或两者皆有的状况。胰岛素产量减少的主要结果是血液中葡萄糖的累积，而C-肽缺乏则导致各种短期和长期并发症。糖尿病有三种主要形式：
1型：由身体无法产生胰岛素和C-肽造成。估计被诊断为患有糖尿病的美国人中有5～10％患有1型糖尿病。目前，几乎所有1型糖尿病患者必须接受胰岛素注射。术语“1型糖尿病”已替代了一些之前的术语，包括儿童期发病糖尿病、青少年糖尿病和胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。就1型糖尿病患者而言，C-肽的基础水平通常低于0.20nM(Ludvigsson等:New Engl.J.Med.359:1909-1920,(2008))。
2型：由组织胰岛素抵抗造成，组织胰岛素抵抗是细胞无法适当响应胰岛素的状况，有时还结合有相关胰岛素缺乏。术语“2型糖尿病”已替代了一些之前的术语，包括成人发病糖尿病、肥胖相关糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。就基础状态的2型患者而言，已报道其C-肽水平为约0.8nM(0.64～1.56nM)，而葡萄糖受激水平为约5.7nM(3.7～7.7nM)。(Retnakaran R等:Diabetes Obes.Metab.(2009)DOI10.11111/j.1463-1326.2009.01129.x；Zander等:Lancet359:824-830,(2002))。
除1型和2型糖尿病患者以外，还越来越多地鉴定出了一种糖尿病亚类，该糖尿病亚类被称为成人潜伏性自体免疫性糖尿病(LADA)或成人期延迟发作自体免疫性糖尿病，或“迟缓发作1型”糖尿病，有时还被称为“1.5型”或“1型半”糖尿病。在该疾病中，糖尿病一般在35岁或更高年龄发作，并且总是呈现针对胰岛素生成细胞的成分的抗体，这表明自体免疫活性是LADA的重要特征。发现的主要是针对谷氨酸脱羧酶(GAD)的抗体。一些LADA患者显示与2型患者相似的表型，其具有增加的体重指数(BMI)或肥胖、胰岛素抵抗和异常血脂。LADA的遗传特征与1型和2型糖尿病均相似。在首次出现后的最初6～12个月，患者可能不需要胰岛素给予，并且其能够通过调节饮食和/或口服抗糖尿病药物来保持相对正常的血糖量。然而，最终所有患者变为胰岛素依赖型，这可能是因为愈发严重的自体免疫活性导致对胰腺胰岛β-细胞的逐步破坏。在这个阶段，LADA患者显示低或无内源性胰岛素与C-肽水平，并且其倾向于发展糖尿病长期并发症，包括与1型糖尿病患者相似的眼部、周围神经或肾脏病变，并因此成为C-肽治疗的候选者(Palmer等:Diabetes54(suppl2):S62-67,(2005)；Desai等:Diabetic Medicine25(suppl2):30-34,(2008)；Fourlanos等:Diabetologia48:2206-2212,(2005))。
将会从给予本文公开的PEG化C-肽而获益的胰岛素需求型患者的其他亚类包括因受伤、先天缺陷或通过损伤或物理伤害而缺乏正确发挥作用的胰腺的患者。
因此，在任何这些方法中，术语“患者”指具有一种或多种所述糖尿病症状的个体。在任何这些方法的一方面中，术语“患者”指具有任何胰岛素需求型糖尿病的一种或多种症状的个体。在任何这些方法的一方面中，术语“患者”指具有任何2型糖尿病的一种或多种症状的个体。在任何这些方法的一方面中，术语“患者”指具有LADA的一种或多种症状的个体。因此，在任何这些方法的一方面中，术语“患者”指其禁食C-肽水平低于约0.4nM的个体。在任何这些方法的另一方面中，术语“患者”指其禁食C-肽水平低于约0.2nM的个体。
另一方面，本发明包括治疗有需要的患者的一种或多种糖尿病长期并发症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗剂量的任何本发明要求保护的PEG化C-肽。
另一方面，本发明包括治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括联合给予所述患者治疗剂量的任何本发明要求保护的PEG化C-肽和胰岛素。
在该语境中，“联合”指：1)相同单一剂型的部分；2)分开给予但作为相同治疗性处理计划或方案的部分，通常但非必须地，在同一天给予。一方面，任何本发明要求保护的PEG化C-肽可以固定的每天剂量给予，而视需要摄取基础胰岛素。
另一方面，本发明包括任何本发明要求保护的PEG化C-肽用于治疗有需要的患者中的糖尿病的一种或多种长期并发症的应用。
在任何这些方法中，术语“1型糖尿病的长期并发症”或“糖尿病长期并发症”指与1型糖尿病相关联的血糖控制减弱和C-肽缺乏的长期并发症。1型糖尿病的长期并发症通常与1型糖尿病患者相关联。然而，该术语也可指1.5型和2型糖尿病患者，或者具有受损胰腺或缺失胰腺的因缺乏胰腺胰岛β-细胞而发展出C-肽缺陷并因而成为胰岛素需求型的患者中出现的糖尿病长期并发症。广义来说，许多此类并发症由血管原发性损伤(血管病)而出现，导致后续的问题，这些问题可按“微血管疾病”(归因于小血管损伤)和“大血管疾病”(归因于动脉损伤)来归类。
术语糖尿病长期并发症下涵盖的特定疾病和紊乱包括但不限于：视网膜病，包括微动脉瘤的早期视网膜病、增殖性视网膜病和黄斑水肿；周围神经病变，包括感觉运动多神经病、痛性感觉神经病、涉及心血管系统、胃肠道、呼吸系统、泌尿生殖系统、催汗功能和乳突功能的自主神经病；以及肾病，包括微量白蛋白尿、明显蛋白尿和末期肾病。
微循环灌流量减少似乎对糖尿病患者中的神经病变和视网膜病变的发病机理至关重要。这进而反映了高血糖介导的血管内皮功能紊乱，其导致：蛋白激酶C活化过度、一氧化氮(NO)可用度减少、过氧化物和内皮素-1(ET-1)产量增加、胰岛素功能减弱、前列环素/PGE1合成减少，和白细胞活化及内皮粘附增加。这最终是不利的临床事件组。
因此，在一些实施方式中，术语“患者”指具有一种或多种所述糖尿病长期并发症症状的个体。
糖尿病视网膜病变是导致微血管病的小血管系统性损伤的眼部表现。在视网膜病变中，视网膜中脆性和低质量新血管的生长以及黄斑水肿(黄斑肿胀)可导致严重视力丧失或失明。由于眼睛后部形成的新血管是增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)的部分，其会流血(出血)并使视线模糊。患糖尿病10年或更久的所有患者中的多至80％受其影响。
糖尿病视网膜病变的症状通常发展迟缓且细微，并且包括视觉模糊和逐渐失明。可使失明更加快速的黄斑水肿在某些时期可能没有任何警告迹象。然而，一般而言，患有黄斑水肿的人可能会有视觉模糊，使其难以做事，如阅读或驾驶。在一些情况中，在一天之中视觉可能会变好或变差。
因此，在一些实施方式中，术语“患者”指具有糖尿病视网膜病变的一种或多种症状的个体。
糖尿病神经病变是与糖尿病微血管损伤相关联的神经疾病，所述微血管损伤包括供给神经的小血管(神经滋养血管)的损伤。与糖尿病神经病变相关联的相对常见的病症包括：糖尿病肌萎缩；痛性多神经病变；和自主神经病变。
糖尿病神经病变影响所有周围神经：疼痛纤维、运动神经元、自主神经。因此，其必然会影响所有器官和系统，因为它们均受神经支配。基于受影响的器官系统和成员有数种明显症状，但这些绝非排他的。患者可具有感觉运动和自主神经病变或任何其它组合。症状视受影响的神经而不同，并且可包括所列那些以外的症状。症状常逐渐发展数年。
糖尿病神经病变的症状可包括：四肢麻痹和刺痛，感觉迟钝(身体某部分感觉减少或丧失)，腹泻，勃起功能障碍，女性性功能障碍，尿失禁(膀胱失控)，阳痿，面、口及眼睑下垂，视觉变化，眩晕，肌无力，吞咽困难，言语障碍，束颤(肌肉收缩)，性快感缺失病和灼烧或电刺痛。
此外，不同神经以不同方式受神经病变影响。感觉运动多神经病变，其中较长神经纤维比较短神经纤维受影响程度较高，因为神经传导速度的减慢与神经长度成比例。在该症状中，首先在各脚脚趾中出现感觉减少和反射丧失，然后该情况向上延伸。常将其描述为麻木的套-袜分布(glove-stocking distribution)、感觉丧失、感觉迟钝和夜间疼痛。该疼痛可有灼烧感、刺痛感、持续疼痛或钝感。常见针刺感。早期感到本体感受丧失，肢体悬空。这些患者在踩在外部物体(如碎片)或当其在不合脚的鞋中磨出老茧时，没有感觉。因此，他们有腿脚发展溃疡和感染的风险，这会导致截肢。类似地，这些患者会发生膝盖、踝部或脚部多处骨折，并发展出夏科氏关节(Charcot joint)。运动功能丧失导致背屈、脚趾挛缩、骨间肌肉功能丧失，并导致指/趾挛缩，所谓锤状趾。这些挛缩不仅在脚部出现，还在手部出现，其中肌肉组织损失使手看上去骨瘦如柴。所述肌肉功能丧失是进行性的。
自主神经病变影响支配心脏、胃肠系统和泄殖系统的自主神经系统。糖尿病患者中的最常识别的自主功能障碍是起立性低血压或起立时昏厥。所述糖尿病自主神经病变的情况归因于心脏和动脉无法适当调节心率和血管张力以保持血液持续且完全流向大脑。该症状常伴随正常呼吸所见心率常规变化的丧失。这两项结果表明心脏自主神经病变。
与自主神经病变相关联的胃肠系统症状包括胃排空延迟、胃病、恶心、胀气和腹泻。因为许多糖尿病患者口服糖尿病药物，这些药物的吸收受胃排空延迟的大幅影响。若口服糖尿病试剂在餐前服用并在数小时后才被吸收，则所述吸收不良会导致高血糖。小肠蠕动迟缓会导致细菌过度生长，存在高血糖时情况更加糟糕。这导致胀气、排气和腹泻。
与自主神经病变相关联的生殖泌尿系统症状包括：尿频、尿急、失禁、潴留、阳痿、勃起功能障碍和女性性功能障碍。尿潴留会导致膀胱憩室、结石、反流性肾病和频繁尿道感染。已显示给予C-肽改善胰岛素需求型糖尿病患者的勃起功能(Wahren等:Diabetes60,Suppl1:A285,(2011))。因此，在任何这些方法中，术语“患者”指具有一种或多种自主神经病变症状的个体。在某些方法中，术语“患者”指具有勃起功能障碍、女性性功能障碍或阳痿中一种或多种症状的个体。
因此，在一些实施方式中，术语患者摂指具有糖尿病神经病变的一种或多种症状的个体。在任何这些方法的另一反面中，所述患者具有“已确立的周围神经病变”，其特点为两条或更多条周围神经中神经传导速度(NCV)降低(对于匹配正常个体的身高校正参照值而言低于-1.5SD)。在某些实施方式中，术语“患者”指具有初期神经病变的一种或多种症状的个体。
因此，在某些实施方式中，本发明包括治疗或预防对象内或患者的经身高调节的感觉或运动神经传导速度降低的方法。在该方法的一方面中，所述运动神经传导速度是初始神经传导速度。在另一个实施方式中，所述运动神经传导速度是神经传导峰值速度。
在某些实施方式中，所述对象是糖尿病患者。在某些实施方式中，所述对象具有至少一种糖尿病长期并发症。一方面，所述患者显示的神经传导峰值速度距相似身高匹配对象组的平均神经传导峰值速度至少约两个标准偏差。一方面，所述患者的神经传导峰值速度低于约35m/s。在本发明要求保护的任何方法的一方面中，所述患者的神经传导峰值速度低于约40m/s。一方面，所述患者的神经传导峰值速度低于约45m/s。一方面，所述患者的神经传导峰值速度低于约50m/s。
在本发明要求保护的任何方法的一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约0.2m/s。在本发明要求保护的任何方法的一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约0.4m/s。在本发明要求保护的任何方法的一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约0.6m/s。在本发明要求保护的任何方法的一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约0.8m/s。在本发明要求保护的任何方法的一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约1.0m/s。在本发明要求保护的任何方法的一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约1.2m/s。在本发明要求保护的任何方法的一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约1.5m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约2.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约2.5m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约3.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约3.5m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约4.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约4.5m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约5.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约5.5m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约6.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约7.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约8.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约9.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约10.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约15.0m/s。在这些方法的另一方面中，治疗导致神经传导速度提高至少约20.0m/s。
在其它实施方式中，神经传导速度的提高在如下时间内达到：1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月或两年。
糖尿病肾病是由肾脏肾小球中毛细管血管病所致的进行性肾病。其特点为肾病症状和满盈性肾小球硬化。其归因于长久的糖尿病，并且是许多西方国家中透析的主要原因。
糖尿病肾病的症状可在慢性糖尿病患者中(发作后15年或更久)观察到。该疾病是进行性的，并且在男性中更加常见。糖尿病肾病在美国是慢性肾衰竭和末期肾病的最常见病因。患有1型和2型糖尿病的患者均有风险。若血糖水平控制不佳，该风险更高。此外，一旦发展出肾病，在血压控制不良患者中观察到最大进展速率。血液中具有高胆固醇水平的人也比其他人具有高得多的风险。
糖尿病肾病过程中最早可检测的变化是肾小球滤过屏障异常。在该阶段，肾脏会开始允许尿中的血清白蛋白多于正常情况(蛋白尿)，而这可通过白蛋白灵敏医学测试检测。这个阶段被称作“微量白蛋白尿”。随着糖尿病肾病的进展，越来越多的肾小球被结节性肾小球硬化破坏。此时排泄进入尿液的白蛋白的量增加，并且这可通过常规尿检技术来检测。在该阶段，肾活检清晰显示糖尿病肾病。
由肾小球硬化症所致的肾衰竭导致流体滤过不足和其它肾功能紊乱。身体中会有血压升高(高血压)和液体潴留加上导致水肿的血浆膨胀压降低。其它并发症可以是肾动脉硬化和蛋白尿。
贯穿糖尿病肾病的早期阶段均无症状。其在晚期阶段发展并且会导致大量蛋白质排泄入尿或归因于肾衰竭。症状包括水肿和肿胀，通常于早晨在眼周体现；之后，会发生全面身体肿胀例如腿肿、尿呈泡沫状或过度起泡(由蛋白尿造成)、无意识增重(液体累积所致)、食欲不振(胃口差)、恶心和呕吐、不适(普通病感)、疲劳、头痛、频繁打嗝和全身瘙痒。
因此，在一些实施方式中，术语“患者”指具有糖尿病肾病的一种或多种症状的个体。
糖尿病的大血管疾病包括冠状动脉疾病，其导致咽痛或心肌梗塞("心脏病")、中风(主要是缺血型)、外周血管疾病，其导致间歇性跛行(用力相关的腿脚疼痛)，以及糖尿病性足和糖尿病性肌坏死(“肌肉萎缩”)。
在某些实施方式中，术语“患者”指具有一种或多种糖尿病大血管疾病症状的个体。
预防低血糖症的方法。
在某些实施方式中，本发明包括任何本文公开的PEG化C-肽在一个方案中的应用，由此降低患胰岛素需求型糖尿病的人类患者的低血糖症的风险，所述方案还包括给予胰岛素，包括：a)给予所述患者胰岛素；b)在与所述患者的胰岛素给予位点不同的位点给予治疗剂量的PEG化C-肽；c)基于所述PEG化C-肽的治疗剂量导致的所述患者对胰岛素需求的变化来调节给予胰岛素的剂量、类型或频率。
在另一个方面，本发明包括减少对于胰岛素需求型患者的胰岛素用量的方法，所述方法包括如下步骤：a)给予所述患者胰岛素；b)在与对所述患者给予胰岛素的位点不同的位点皮下给予所述患者治疗剂量的任何本文公开的PEG化C-肽；c)基于所述治疗剂量的PEG化C-肽导致的所述患者对胰岛素需求的变化的监测来调节给予胰岛素的剂量、类型或频率，其中所述调节后的胰岛素剂量不导致高血糖症，其中所述调节后的胰岛素剂量比所述PEG化C-肽起始之前所述患者的胰岛素剂量低至少10％。(参见例如美国专利号7,855,177，其通过引用纳入本文)。
在任何这些方法中，术语“低血糖”或“低血糖事件”指异常低血浆葡萄糖浓度的所有情况，这可能对患者有害。经美国糖尿病联合工作组(AmericanDiabetes Association Workgroup)推荐，患有胰岛素需求型糖尿病的人需要注意发展血浆葡萄糖浓度低于70mg/dL(3.9mmoL/L)的低血糖的可能性。因此，在本发明要求保护的任何方法的一方面，术语“低血糖”或“低血糖事件”指患者的血浆葡萄糖浓度下降至低于约70mg/dL(3.9mmoL/L)的状况。
低血糖是糖尿病治疗中的严重医学并发症，并且导致大多数1型糖尿病患者和许多晚期2型糖尿病患者的反复发病，并且有时是致命的。此外，低血糖破坏了针对随后降低的血浆葡萄糖浓度的生理和行为防御，并因而导致反复低血糖和低血糖性意识障碍的恶性循环。因此，预防低血糖在糖尿病治疗以及糖尿病长期并发症治疗中具有显著重要性。
不幸的是，低血糖就大多数1型糖尿病患者而言是事实(Cryer PE等:Diabetes57:3169-3176,(2008))。平均而言，患者会有多次无症状低血糖状况并受每星期反复的症状性低血糖的折磨。他或她可能还会遭受严重的临时影响行动的低血糖(常伴有癫痫或昏迷)的周期事件，需要第三方的协助。
总体上，低血糖在2型糖尿病中频率较低；然而，低血糖的风险在2型糖尿病病程晚期会进展性地变得更加频繁且限制血糖控制。Donnelly等人的预期的基于群体的数据(Diabetes Med.22:749-755,(2005))指示，胰岛素治疗的2型糖尿病中的低血糖总体发生率是1型糖尿病中的约1/3。任何低血糖和严重低血糖的发生率在1型糖尿病中分别是4,300和115次/100患者年，在胰岛素治疗的2型糖尿病中分别是1600和35次/100患者年。
低血糖可基于低血糖事件的严重性来分类。例如，美国糖尿病联合工作组建议对糖尿病中的低血糖进行如下分类：1)严重低血糖(即，需要他人协助的低血糖性昏迷)；2)记录的症状性低血糖(有症状且血浆葡萄糖浓度低于70mg/dL)；3)无症状性低血糖(血浆葡萄糖浓度低于70mg/dL，无症状)；4)可能的症状性低血糖(有归因于低血糖的症状但没有血浆葡萄糖检测)；和5)相对低血糖(血浆葡萄糖浓度高于70mg/dL但向该水平下降)。
因此，在本文公开的任何方法的另一个方面，术语“低血糖”指严重低血糖和/或低血糖性昏迷。在任何这些方法的另一个方面，术语“低血糖”指症状性低血糖。在任何这些方法的另一个方面，术语“低血糖”指可能的症状性低血糖。在任何这些方法的另一个方面，术语“低血糖”指无症状性低血糖。在任何这些方法的另一个方面，术语“低血糖”指相对低血糖。
胰岛素类型和给予形式
全球已开发超过180种可用的个体胰岛素制剂来提供不同的活性长度(活性概况)。这其中有大约25％是可溶性胰岛素(未修饰形式)；约35％是长效或中效基础胰岛素(与NPH[中性鱼精蛋白哈根多恩(Hagedorn)]胰岛素或慢胰岛素(Lente insulin)[胰岛素锌悬液]混合，或者经修饰以具有升高等电点的形式[甘精胰岛素]，或者酰化形式[地特胰岛素]；这些形式相对于可溶性胰岛素而言溶解度降低，皮下吸收缓慢，并且作用时间长)；约2％是速效胰岛素(例如，通过改变氨基酸工程改造的那些，并且自聚集减少且皮下吸收增多)；以及约38％是预混的胰岛素(例如，短效、中效和长效胰岛素的混合物；这些制剂的益处是减少每天注射的次数)。
美国市售可得的短效胰岛素制剂包括常规胰岛素和速效胰岛素。常规胰岛素在30～60分钟开始作用，作用峰值时间在1.5～2小时，而活性持续5～12小时。速效胰岛素，例如天冬胰岛素(诺和锐)、赖脯胰岛素(优泌乐)和赖谷胰岛素(阿匹卓)，在10～30分钟开始作用，作用峰值时间在约30分钟，而活性持续3～5小时。
中效胰岛素(例如，NPH和慢胰岛素(Lente insulin))，在1～2小时开始作用，作用峰值在4～8小时，而活性持续10～20小时。
长效胰岛素(例如特慢胰岛素(Ultralente insulin))，在2～4小时开始作用，作用峰值在8～20小时，而活性持续16～24小时。长效胰岛素的其它示例包括甘精胰岛素(兰德仕(Lantus))和地特胰岛素(诺和平(Levemir))。甘精胰岛素在1～2小时开始作用且作用持续24小时，但没有峰值效应。
在许多情况下，在糖尿病控制中采用胰岛素的方案会联合长效和短效胰岛素。这些方案中的一些涉及预混胰岛素制剂。来自安万特制药公司(AventisPharmaceuticals Inc.)的来得时(Lantus)(甘精胰岛素)是重组人胰岛素类似物，其为长效肠胃外降血糖试剂，其较长作用时长(长至24小时)与其较慢吸收速率直接相关。来得时每天皮下给予一次，优选在就寝时间给予，并且据说提供持续胰岛素水平，该水平与正常胰腺提供的缓慢、稳定(基础)胰岛素分泌水平相类似。此类长效胰岛素的活性导致24小时内相对恒定的浓度/时间曲线，没有明显的峰，因此允许其每天给予一次作为患者的基础胰岛素。此类长效胰岛素的长效作用是因为其化学组合物而非胰岛素的额外性质。
最近，已开发出供于持续输注胰岛素的自动化无线控制系统(例如以商标OMNIPODTM售卖的胰岛素控制系统(Insulin Management System)(马萨诸塞州贝德福德的Insulet公司)。这些系统以审慎的两部系统提供带血糖监测技术的持续皮下胰岛素递送。该系统免去了对每日胰岛素注射的需求，并且无需以管连接的传统胰岛素泵。
OMNIPODTM是小型轻便装置，其可像输液器一样穿戴在皮肤上。其根据从个性化糖尿病管理器(PDM)无线传来的预编写的指令来递送胰岛素。PDM是无线手持装置，其用于利用个体化胰岛素递送指令来对OMNIPODTM胰岛素管理系统编程，监控该系统的操作，并利用血液葡萄糖测试条来检查血液葡萄糖水平，所述血液葡萄糖测试条以商标FREESTYLETM售卖。所述装置与PDM不通过管连接。OMNIPODTM胰岛素管理系统穿戴在衣服下面，而PDM能够分开携带在背包、公文包或手包内。与现用胰岛素泵类似，OMNIPODTM胰岛素管理系统的特点是具有多基础率和推注选项的完全可编程持续皮下胰岛素递送，带有推注计算、安全检查和警报功能。
对于糖尿病患者进行胰岛素治疗的目的通常是给予足够的胰岛素，从而使患者的血液葡萄糖水平落在生理学范围内并且全天碳水化合物代谢正常。因为糖尿病个体的胰腺全天不分泌足够的胰岛素，为了通过胰岛素治疗有效控制糖尿病，必须给予长效胰岛素治疗(称为基础胰岛素)以提供控制血液葡萄糖浓度所需的缓慢且稳定的胰岛素释放，并在没有食物消化时保持细胞的能量供给。基础胰岛素是抑制餐间与夜间的葡萄糖生成所必需的，并且优选在24小时期间模拟患者的正常胰腺基础胰岛素分泌。因此，可在每天皮下给予糖尿病患者具有约24小时持续作用的单剂量长效胰岛素。
此外，为了通过利用控制葡萄糖水平餐后升高的胰岛素治疗来有效控制糖尿病，还须给予推注速效治疗。一般通过皮下给予的推注胰岛素使血浆内胰岛素水平在给予后约1小时升高，由此限制餐后高血糖。因此，可在患者血液葡萄糖水平趋于上升过高时(例如进餐时)的那些时间皮下给予这些额外量的定期胰岛素(作用持续时间例如5～6小时)。作为联合给予基础胰岛素和推注胰岛素的替代，可重复且定期给予较低剂量的推注胰岛素以替代长效基础胰岛素，并且可按需在餐后给予推注胰岛素。
目前，定期皮下注射的胰岛素推荐在餐前30～45分钟给予。所以，糖尿病患者和其它胰岛素使用者必须对其餐饮和与其餐饮相关的胰岛素给予作出大量计划。不幸的是，在胰岛素给药和餐饮摄入之间会发生干预事件，这可能会影响预计的葡萄糖偏移。
此外，若给予的胰岛素提供的治疗效果一时过高则还有可能导致低血糖，例如，因摄食发生的葡萄糖水平升高已被降低后。因此，在本文公开的任何方法的一方面中，本发明包括用于降低患者发展低血糖风险的方法，所述方法通过如下方式进行：在PEG化C-肽治疗开始之后将给予所述患者的胰岛素平均每日剂量减少约5％～约50％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约45％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约40％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约35％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约30％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约25％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约20％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约15％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约5％～约10％。
在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约2％～约10％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约2％～约15％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约2％～约20％。
在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约10％～约50％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约10％～约45％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约10％～约40％。在另一方面，相较于C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约10％～约35％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约10％～约30％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约10％～约25％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少约10％～约20％。在另一方面，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者胰岛素剂量，将给予的胰岛素剂量减少至少10％。
在任何这些方法的一方面中，以上述所列任何范围选择性减少给予的短效胰岛素的剂量。在任何这些方法的另一方面中，以前述所列任何范围选择性减少给予的中效胰岛素的剂量。在任何这些方法的一方面中，以上述所列任何范围选择性减少给予的长效胰岛素的剂量。
在任何这些方法的另一方面，以上述所列任何范围独立地减少给予的中效和长效胰岛素的剂量，而使短效胰岛素剂量保持基本不变。
在这些方法的一方面中，相较与PEG化C-肽治疗开始之前的所述患者的胰岛素剂量将给予的短效胰岛素减少约5％～约50％。在另一个实施方式中，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者的胰岛素剂量将给予的短效胰岛素剂量减少约5％～约35％。在另一个实施方式中，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者的胰岛素剂量将给予的短效胰岛素剂量减少约10％～约20％。在这些方法的一个方面中，将餐前给予的短效胰岛素剂量减少。在这些方法的另一个方面中，将早晨或夜间给予的短效胰岛素剂量减少。在这些方法的另一方面中，将给予的短效胰岛素剂量减少但保持给予患者的长效和/或中效胰岛素剂量基本不变。
在本文公开的任何方法的另一方面中，本发明包括用于降低患者发展低血糖风险的方法，所述方法通过如下方式进行：在PEG化C-肽治疗开始之后将给予所述患者的中效胰岛素平均每日剂量减少约5％～约35％。在这些方法的一方面中，相较与PEG化C-肽治疗开始之前的所述患者的胰岛素剂量，将给予的中效胰岛素剂量减少约5％～约50％。在另一个实施方式中，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者的胰岛素剂量，将给予的中效胰岛素剂量减少约5％～约35％。在另一个实施方式中，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者的胰岛素剂量，将给予的中效胰岛素剂量减少约10％～约20％。在这些方法的另一个方面中，将早晨或夜间给予的中效胰岛素剂量减少。在这些方法的另一方面中，将给予的中效胰岛素剂量减少但保持给予患者的短效胰岛素剂量基本不变。
在本文公开的任何方法的另一方面中，本发明包括用于降低患者发展低血糖风险的方法，所述方法通过如下方式进行：在PEG化C-肽治疗开始之后将给予所述患者的长效胰岛素平均每日剂量减少约5％～约50％。在一个实施方式中，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者的胰岛素剂量，将给予的长效胰岛素剂量减少约5％～约35％。在另一个实施方式中，相较于PEG化C-肽治疗开始之前的患者的胰岛素剂量，将给予的长效胰岛素剂量减少约10％～约20％。在这些方法的另一个方面中，将早晨或夜间给予的长效胰岛素剂量减少。在这些方法的另一方面中，将给予的长效胰岛素剂量减少但保持给予患者的短效胰岛素剂量基本不变。
在某些优选实施方式中，所述患者实现胰岛素利用与胰岛素灵敏度的改善，同时相较于治疗之前的基线水平而言，在用PEG化C-肽治疗之后其发展低血糖的风险降低。优选地，胰岛素利用和胰岛素灵敏度的改善通过HOMA(稳态模式评估法)的统计学显著下降来检测(Turner等:Metabolism28(11):1086-1096,(1979))。
皮下给予PEG化C-肽的位点通常不是最近用于胰岛素给予的同一位点，即，PEG化C-肽和胰岛素将在不同位点注射。具体而言，一方面，PEG化物给予的位点通常距离最近用于胰岛素给予的位点至少约10cm。在另一方面，PEG化C-肽给予的位点通常距离最近用于胰岛素给予的位点至少约15cm。在另一方面，PEG化C-肽给予的位点通常距离最近用于胰岛素给予的位点至少约20cm。
不同位点的示例包括但不限于，例如，注射进入左臂与右臂，或注射进入左大腿与右大腿，或注射进入左臀或右臀，或注射进入腹部的相对侧。不同位点的其它明显变化形式包括注射进入手臂和大腿，或注射进入手臂和臀部，或注射进入手臂和腹部等。
此外，基于现有技术的教导，以及多种教科书和对于胰岛素给予的指导，公开了如何选择不同胰岛素注射位点的，本领域普通技术人员(即，医师或糖尿病患者)应认识并理解如何将PEG化C-肽和胰岛素注射进入不同位点的任何其它组合。参见例如，如下代表性教科书(Learning to live well with diabetes(《如何在患糖尿病时好好生活》)，Cheryl Weiler编,(1991)明尼苏达州明尼阿波利斯的DCI出版公司；American Diabetes Association Complete Guide to Diabetes(《美国糖尿病协会对糖尿病的完全指导》)，ISBN0-945448-64-3(1996))。
在本发明要求保护的任何方法的一方面，将PEG化C-肽给予至最近用于胰岛素给予的位点的相对侧腹部，距离该位点约15～20cm处。
一方面，带正电的离子可以是二价金属离子。一方面，所述金属离子选自钙、镁和锌。
在其它实施方式中，给予的PEG化C-肽的量是：约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1.0mg、约1.1mg、约1.2mg、约1.3mg、约1.4mg、约1.5mg、约1.6mg、约1.7mg、约1.8mg、约1.9mg、约2.0mg、约2.1mg、约2.2mg、约2.3mg、约2.4mg、约2.5mg、约2.6mg、约2.7mg、约2.8mg、约2.9mg、约3.0mg、约3.1mg、约3.2mg、约3.3mg、约3.4mg、约3.5mg、约3.6mg、约3.7mg、约3.8mg、约3.9mg、约4.0mg、约4.1mg、约4.2mg、约4.3mg、约4.4mg、约4.5mg、约4.6mg、约4.7mg、约4.8mg、约4.9mg、约5.0mg、约0.1mg～约0.5mg、约0.3mg～约0.7mg、约0.5mg～约0.9mg、约0.7mg～约1.1mg、约0.9mg～约1.3mg、约1.1mg～约1.5mg、约1.3mg～约1.7mg、约1.5mg～约1.9mg、约1.7mg～约2.1mg、约1.9mg～约2.3mg、约2.1mg～约2.5mg、约2.3mg～约2.7mg、约2.5mg～约2.9mg、约2.7mg～约3.1mg、约2.9mg～约3.3mg、约3.1mg～约3.5mg、约3.3mg～约3.7mg、约3.5mg～约3.9mg、约3.7mg～约4.1mg、约3.9mg～约4.3mg、约4.1mg～约4.5mg、约4.3mg～约4.7mg、约4.5mg～约5.0mg、约5mg～约6mg、约6mg～约7mg、约7mg～约8mg、约8mg～约9mg、约9mg～约10mg、约10mg～约11mg、约11mg～约12mg、约12mg～约13mg、约13mg～约14mg，或者约14mg～约15mg。
在其它实施方式中，作为加载剂量给予的PEG化C-肽的量是：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.0mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg、4.0mg、4.1mg、4.2mg、4.3mg、4.4mg、4.5mg、4.6mg、4.7mg、4.8mg、4.9mg、5.0mg、约0.1mg～约0.5mg、约0.3mg～约0.7mg、约0.5mg～约0.9mg、约0.7mg～约1.1mg、约0.9mg～约1.3mg、约1.1mg～约1.5mg、约1.3mg～约1.7mg、约1.5mg～约1.9mg、约1.7mg～约2.1mg、约1.9mg～约2.3mg、约2.1mg～约2.5mg、约2.3mg～约2.7mg、约2.5mg～约2.9mg、约2.7mg～约3.1mg、约2.9mg～约3.3mg、约3.1mg～约3.5mg、约3.3mg～约3.7mg、约3.5mg～约3.9mg、约3.7mg～约4.1mg、约3.9mg～约4.3mg、约4.1mg～约4.5mg、约4.3mg～约4.7mg、or约4.5mg～约4.9mg、约5mg～约6mg、约6mg～约7mg、约7mg～约8mg、约8mg～约9mg、约9mg～约10mg、约10mg～约12mg、约12mg～约14mg、约14mg～约16mg、约16mg～约18mg、约18mg～约20mg、约20mg～约22mg、约22mg～约24mg、约24mg～约26mg、约26mg～约28mg，或者约28mg～约30mg。
在其它实施方式中，作为维持剂量给予的PEG化C-肽的量是：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.0mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg、4.0mg、4.1mg、4.2mg、4.3mg、4.4mg、4.5mg、4.6mg、4.7mg、4.8mg、4.9mg、5.0mg、约0.1mg～约0.5mg、约0.3mg～约0.7mg、约0.5mg～约0.9mg、约0.7mg～约1.1mg、约0.9mg～约1.3mg、约1.1mg～约1.5mg、约1.3mg～约1.7mg、约1.5mg～约1.9mg、约1.7mg～约2.1mg、约1.9mg～约2.3mg、约2.1mg～约2.5mg、约2.3mg～约2.7mg、约2.5mg～约2.9mg、约2.7mg～约3.1mg、约2.9mg～约3.3mg、约3.1mg～约3.5mg、约3.3mg～约3.7mg、约3.5mg～约3.9mg、约3.7mg～约4.1mg、约3.9mg～约4.3mg、约4.1mg～约4.5mg、约4.3mg～约4.7mg，或者约4.5mg～约5.0mg。
在其它实施方式中，通过如下频率的持续输注给予PEG化C-肽：每天四次、每天三次、每天两次、每天一次、2天一次、3天一次、4天一次、5天一次、6天一次、7天一次、8天一次、9天一次、10天一次、11天一次、12天一次、13天一次、14天一次、15天一次、16天一次、17天一次、18天一次、19天一次、20天一次、21天一次、22天一次、23天一次、24天一次、25天一次、26天一次、27天一次、28天一次、29天一次、30天一次、31天一次，或每月一次。
可在一天之中任何时间给予所述PEG化C-肽。对人而言，总剂量(每周)可在如下范围：约0.1～约200mg/周的PEG化C-肽，例如，约0.1mg/周、约0.2mg/周、约0.3mg/周、约0.4mg/周、约0.5mg/周、约0.6mg/周、约0.7mg/周、约0.8mg/周、约0.9mg/周、约1.0mg/周、约1.1mg/周、约1.2mg/周、约1.3mg/周、约1.4mg/周、约1.5mg/周、约1.6mg/周、约1.7mg/周、约1.8mg/周、约1.9mg/周、约2.0mg/周、约2.1mg/周、约2.2mg/周、约2.3mg/周、约2.4mg/周、约2.5mg/周、约2.6mg/周、约2.7mg/周、约2.8mg/周、约2.9mg/周、约3.0mg/周、约3.1mg/周、约3.2mg/周、约3.3mg/周、约3.4mg/周、约3.5mg/周、约3.6mg/周、约3.7mg/周、约3.8mg/周、约3.9mg/周、约4.0mg/周、约4.1mg/周、约4.2mg/周、约4.3mg/周、约4.4mg/周、约4.5mg/周、约4.6mg/周、约4.7mg/周、约4.8mg/周、约4.9mg/周、约5.0mg/周、约5.5mg/周、约6mg/周、约7mg/周、约8mg/周、约9mg/周、约10mg/周、约12mg/周、约15mg/周、约18mg/周、约21mg/周、约24mg/周、约27mg/周、约30mg/周、约33mg/周、约36mg/周、约39mg/周、约42mg/周、约45mg/周、约50mg/周、约60mg/周、约70mg/周、约80mg/周、约90mg/周、约100mg/周、约110mg/周、约120mg/周、约130mg/周、约140mg/周、约150mg/周、约160mg/周、约170mg/周、约180mg/周、约190mg/周、约200mg/周、约0.1mg/周～约0.5mg/周、约0.3mg/周～约0.7mg/周、约0.5mg/周～约0.9mg/周、约0.7mg/周～约1.1mg/周、约0.9mg/周～约1.3mg/周、约1.1mg/周～约1.5mg/周、约1.3mg/周～约1.7mg/周、约1.5mg/周～约1.9mg/周、约1.7mg/周～约2.1mg/周、约1.9mg/周～约2.3mg/周、约2.1mg/周～约2.5mg/周、约2.3mg/周～约2.7mg/周、约2.5mg/周～约2.9mg/周、约2.7mg/周～约3.1mg/周、约2.9mg/周～约3.3mg/周、约3.1mg/周～约3.5mg/周、约3.3mg/周～约3.7mg/周、约3.5mg/周～约3.9mg/周、约3.7mg/周～约4.1mg/周、约3.9mg/周～约4.3mg/周、约4.1mg/周～约4.5mg/周、约4.3mg/周～约4.7mg/周、约4.5mg/周～约5.0mg/周、约5.0～约10mg/周、约10～约20mg/周、约20～约40mg/周、约40～约60mg/周、约60～约80mg/周、约80～约100mg/周、约100～约120mg/周、约120～约140mg/周、约140～约160mg/周、约160～约180mg/周，以及约180～约200mg/周。
优选地，所用PEG化C-肽的每周总剂量是：约0.8mg～约3.5mg、约1mg～约20mg、约20mg～约50mg、约50mg～约100mg、约100mg～约150mg、或约150mg～约200mg。
PEG化C-肽的每周总剂量可以是：约0.1mg、约0.5mg、约0.8mg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、约5mg、约5.5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约12mg、约15mg、约18mg、约21mg、约24mg、约27mg、约30mg、约33mg、约36mg、约39mg、约42mg、约45mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg，或约200mg。(应理解，上述提及的PEG化C-肽的量取决于递送系统的生物利用度并基于分子量约40,000Da的PEG化C-肽的应用而定。)
V.药物组合物
一方面，本发明包括含有PEG化C-肽和药学上可接受运载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
适合于递送PEG化C-肽的药物组合物及其制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的，并且可包含任何已知的运载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物及其制备方法可在如下文献中找到，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第19版(马克出版公司(Mack Publishing Company)，1995)。
一方面，所述药物组合物可以是以下形式：药物活性成分的无菌水性溶液和/或悬浮液，气溶胶、软膏等。最优选水性溶液制剂。此类制剂通常包含PEG化C-肽本身、水和起稳定剂作用的一种或多种缓冲剂(例如，含磷酸盐缓冲剂)，以及任选的一种或多种防腐剂或抗氧化剂(例如BHT)。此类制剂包含，例如，约0.5～200mg、约0.5～100mg、约0.5～80mg、约0.5～60mg、约0.5～40mg、约0.5～30mg、约0.3～3.3mg、约1～3.3mg、约1～2mg、约1～3.3mg、约2～3.3mg，或本文所述的任何范围，例如，约200mg、约150mg、约120mg、约100mg、约80mg、约60mg、约50mg、约40mg、约30mg、约20mg，或约10mg，或约8mg，或约6mg，或约5mg，或约4mg，或约3mg，或约2mg，或约1mg，或约0.5mg的PEG化C-肽，并构成本发明的另一个方面。
药物组合物可包含PEG化C-肽的药学上可接受的盐。关于合适的盐的综述，参见《药用盐手册：性质、选择及用途》(Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)，Stahl和Wermuth编著(Wiley-VCH,2002)。合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。代表性的示例包括铝盐、精氨酸盐、苄星青霉素盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、甲葡胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、缓血酸胺盐和锌盐。也可形成酸和碱的半盐，例如，半硫酸盐和半钙盐。在一个实施方式中，可将PEG化C-肽制备为带有药学上可接受的带正电离子的凝胶形式。
一方面，所述带正电的离子可以是单价金属离子。一方面，所述金属离子选自钠和钾。
所述剂量可以在或不在溶液中。若所述剂量在溶液中给予，应理解虽然剂量的体积可以变化，但通常是20μL～2mL。优选地，供于S.C.给予的剂量将以如下体积给予：2000μL、1500μL、1200μL、1000μL、900μL、800μL、700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、100μL、50μL或20μL。
溶液中的PEG化C-肽剂量还可包含防腐剂和/或缓冲剂。例如，可采用防腐剂间甲酚或苯酚。防腐剂的浓度通常包括0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL。因此，防腐剂的浓度范围可包括0.2～10mg/mL，特别是0.5～6mg/mL或0.5～5mg/mL。可用的缓冲剂的示例包括组氨酸(pH6.0)、磷酸钠缓冲剂(pH6～7.5)或碳酸氢钠缓冲剂(pH7～7.5)。应理解PEG化C-肽剂量可包含天然或完整的C-肽、C-肽的片段、衍生物或其它功能等价变体中的一种或多种。
溶液中的PEG化C-肽剂量还可包含抗氧化剂和/或缓冲剂。例如，可采用抗氧化剂丁羟甲苯(BHT)。抗氧化剂的浓度包括0.005％～0.03％BHT。应理解PEG化C-肽剂量可包含天然或完整的C-肽、C-肽的片段、衍生物或其它功能等价变体中的一种或多种。
本发明中适用于肠胃外给予的药物组合物通常是药物活性成分的无菌水性溶液和/或悬浮液，优选制成与受者的血液等张。此类组合物一般包含赋形剂、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH3～9)，例如氯化钠、甘油、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。
就一些应用而言，可将供于肠胃外给予的药物组合物合适地制成无菌非水性溶液或干燥形式，以与合适的载体(如无菌无热原水)联用。无菌条件下肠胃外制剂的制备(例如，通过冻干)可容易地采用本领域技术人员熟知的标准药学技术来实现。
供于肠胃外给予的PEG化C-肽的药物组合物可直接给予进入血流、进入肌肉或进入内部器官。用于肠胃外给予的合适方法包括经静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内和皮下给予。供于肠胃外给药的合适装置包括针头(包括微针头)注射器、无针头注射器和输注技术。
PEG化C-肽的皮下给予位点通常不同于最近的胰岛素给予所用同一位点。在本发明要求保护的任何方法和药物组合物的一方面，将PEG化C-肽给予至与最近用于胰岛素给予的位点的相对侧腹部。在本发明要求保护的方法和药物组合物的另一方面，将PEG化C-肽给予上臂。在本发明要求保护的方法和药物组合物的另一方面，将PEG化C-肽给予腹部。在本发明要求保护的方法和药物组合物的另一方面，将PEG化C-肽给予臀部靠上区域。在本发明要求保护的方法和药物组合物的另一方面，将PEG化C-肽给予大腿前部。
实施例
缩写。说明书和实施例中采用如下缩写：ACN＝乙腈；Bzl＝Bn＝苄基；DIEA＝N,N-二异丙基乙胺；DMF＝N,N-二甲基甲酰胺；tBu＝叔丁基；OtBu＝叔丁氧基；TSTU＝O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯；THF＝四氢呋喃；EtOAc＝乙酸乙酯；DIPEA＝DIEA＝二异丙基乙胺；HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑；HOBt＝1-羟基-苯并三唑；NMP＝N-甲基吡咯烷-2-酮；TEA＝三乙胺；SA＝芥子酸；Su＝1-琥珀酰亚胺基＝2,5-二氧代-吡咯烷-1-基；TFA＝三氟乙酸；DCM＝二氯甲烷；DMSO＝二甲亚砜；RT＝室温；Fmoc＝芴基甲氧羰基；Trt＝三苯甲基；DIC＝N,N'-二异丙基碳二亚胺；NMM＝N-甲基吗啉；TIS＝三异丙基硅烷；EtOH＝乙醇；
一般方法：如下实施例和一般方法涉及本说明书中指出的中间体化合物和终产物。或者，可应用本文公开的其它反应或其它传统方式来制备本发明的相应化合物。在所有制备方法中，所有起始物质是已知物质或易于从已知起始物质制备。所有温度均以摄氏度(℃)计，并且除非另有说明，当提及产量时所有部分和百分数均以重量计(即，w/w)，并且当提及溶剂和洗脱液时所有部分均以体积计(即，v/v)。
实施例1：PEG化C-肽(CBX129801)的GMP批量制备
概述
人类C-肽(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ)(SEQ.ID.No.1)
C-肽合成：
根据如下所述的标准方法和成熟建立的方案进行固相肽合成(SPPS)。SPPS是通过反复循环进行锚定在固体支持物上的肽链的按序合成，所述循环包括如下步骤：去除最末氨基酸所加的N末端保护基团；冲洗；偶联活化的氨基酸；通过乙酰化加帽；冲洗。该循环重复直至如下所述合成所需肽序列。
按上文概括的一般固相法进行C-肽(CBX129800)的合成，其中各氨基酸的α-氨基基团用碱敏感的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护，而侧链官能团用酸不稳定的基团保护，C末端Gln为例外，其通过使α-羧基基团用酸不稳定的基团保护来活化谷氨酸的α-羧基基团而连接至固体支持物。所有氨基酸均具有侧链标准保护基团：Glu(O-t-Bu)、Glu-O-t-Bu、Ser(t-Bu)、Gln(Trt)和Asp(O-t-Bu)。氨基酸Ala、Leu、Gly、Pro和Val没有侧链保护。
首先用DIC/HOBt、DMF将Fmoc-Rink-OH接头偶联至树脂以获得Fmoc-Rink-酰胺树脂。然后，通过Fmoc-SPPS将所述肽组装至所述Fmoc-Rink-酰胺树脂。所述偶联采用用于活化的二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)用不同氨基酸等价物在DMF中进行。偶联可通过采用乙酸酐和N-甲基吗啡啉(NMM)通过未反应氨基酸加帽来终止。在各偶联之后，在下一次偶联之前采用含哌啶的DMF去除Fmoc基团。将最终带保护的CBX129800肽树脂洗涤并干燥。
采用茚三酮/凯瑟(Kaiser)或氯醌测试的过程监测在各合成循环末期进行，作为评价步骤。这些是检测残余树脂-结合氨基基团的色彩测试(阴性测试结果指示无游离胺)。然后该过程可进行至下一个偶联步骤。阳性测试结果的强度指示应执行哪个替代步骤。若测试指示不完全偶联，则应进行Fmoc-氨基酸的延长偶联或再偶联。最后在叔胺存在下通过乙酸酐来阻断任何残留的游离胺位点。
通过在清除剂(水和TIS)存在下用TFA处理来从所述树脂切割粗制肽。这导致所述肽从所述树脂切割，伴以所述侧链保护基团从所述肽移除。然后用乙酸铵的水性溶液中和该混合物。滤出树脂，获得溶液状的粗制肽。
所述粗制肽中间体通过制备型反相HPLC技术在C18反相二氧化硅上采用三步法(RPC1、RPC2和RPC3)纯化，其过程中通过分析型HPLC评估分级分离物的纯度。使合并的分级分离物浓缩、过滤并冻干。
粗制CBX129800肽溶液通过过滤进行预处理。
通过制备型反相色谱的纯化(RPC1)
粗制CBX129800溶液通过制备型RPC采用反相二氧化硅或基于等价物的填充材料来纯化。通过加载包含乙醇和乙酸铵缓冲剂的水性溶液将吸附的肽从柱上洗脱(常温)。
通过制备型反相色谱的纯化(RPC2)
来自RPC1的合并的分级分离物通过制备型RPC采用反相二氧化硅或基于等价物的填充材料来纯化。通过加载包含乙醇和水性乙酸铵缓冲剂的水性溶液将吸附的肽从柱上洗脱(常温)。
通过制备型反相色谱的反离子交换(RPC3)
对来自RPC2的合并的分级分离物进行反离子交换，该反离子交换通过制备型HPLC采用经水性乙酸钠和乙醇预平衡过的反相二氧化硅或等价物填充材料进行。吸附的肽首先用乙酸钠/乙醇缓冲液冲洗，然后用水和乙醇冲洗，然后通过加载包含乙醇的水性溶液从柱上洗脱(常温)。
冻干之前使肽汇集物浓缩。将该浓缩溶液过滤并冻干成最终的CBX129800钠盐。然后将其包装在带有聚丙烯(PP)旋盖的高密度聚乙烯(HDPE)容器中，并将瓶子置于阻隔铝箔中并通过加热密封。
PEG化：
人PEG化C-肽的合成通过在NMM存在下使所述人C-肽(钠盐)的N末端与支化的约40kDa-NHS酯PEG衍生物(SUNBRIGHT GL2-400GS2(NOF公司))偶联来以一步法进行。
先使SUNBRIGHT GL2-400GS2(115g)溶解于600mL的(50/50)乙腈/水的溶液中。所得溶液经搅拌并加入另一内含人C-肽(7.9g)的175mL的乙腈/水溶液，然后添加1.2mL的NMM。NMM的添加以约1小时的间隔重复数次，在每次添加之前通过HPLC监测该反应的进程。该过程重复约8～10次，然后该反应搅拌过夜持续约8～12小时(在替代性方法中，监测该反应混合物的pH并按需添加NMM以将pH维持在8.0～8.2)。一旦该反应由HPLC分析验证为反应完全，即对所得反应混合物继续纯化步骤。通常而言，在该过程中，制备若干小批，然后合并以供下述纯化。
通过制备型反相色谱纯化粗制PEG化C-肽
粗制PEG化C-肽溶液用6体积的0.1％TFA/水稀释。将pH调节至pH≤3并通过制备型HPLC采用反相二氧化硅(Diasogel C-18,15μm,300埃)纯化。通过加载梯度ACN的稀释水性TFA来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽(缓冲液A是0.1％TFA，缓冲液B是100％ACN:5分钟内0～25％B，然后25％～50％B用时100分钟然后保持直至产物被洗脱)。洗脱物通过UV在230nm监测。汇集纯度≥90％，没有单一杂质>6.0％的分级分离物。纯度>70％的分级分离物可进行再循环。
通过制备型反相色谱对PEG化C-肽进行脱盐和纯化
使从前述步骤获得的合并的纯分级分离物通过制备型HPLC采用反相二氧化硅脱盐并纯化。该柱用稀释水性TFA冲洗，然后用稀释水性乙酸铵冲洗。然后通过加载梯度ACN的稀释水性AcOH来从所述柱洗脱吸附的PEG化C-肽(缓冲液A是2％乙酸，缓冲液B是100％ACN：5分钟内0～25％B，然后25％～50％B用时75分钟，然后保持直至产物被洗脱)。洗脱物通过UV在230nm监测。汇集从色谱获得的纯分级分离物(纯度≥95％，无单一杂质>3.0％)并将其冻干。纯度>80％的分级分离物可进行再循环以供进一步纯化。
通过制备型HPLC对PEG化C-肽进行离子交换纯化
使来自上述步骤的粗制冻干的PEG化人C-肽(约180g)溶解于5％ACN/水中，然后加载至离子交换柱(DEAE52纤维素)。然后，该柱用约50L水冲洗，随后用约40L氯化钠(1M)/乙酸铵(1M)的水性溶液将产物从该柱洗脱。在替代性方法中，该产物用内含乙酸的5％ACN(1％～5％AcOH)水性溶液从该柱洗脱。发现采用水性乙酸梯度液的洗脱致使游离PEG的去除率升高和终产物的纯度提高，并且GMP材料的稳定性提高(基于短期迫降解研究)。洗脱物通过UV在230nm监测。汇集获自色谱的纯分级分离物(纯度≥92％；无单一杂质>4％)，并且继续进行脱盐/纯化。纯度>80％的分级分离物可进行再循环。
通过制备型反相色谱对CBX129801进行脱盐和纯化
来自离子交换色谱步骤的纯分级分离物用等体积的水稀释并加载至制备型HPLC柱(二氧化硅)。然后该柱用稀释2％乙酸(1BV)冲洗，随后该产物用含ACN的稀释乙酸溶液洗脱(缓冲液A是2％乙酸，缓冲液B是100％ACN：5分钟内0～25％B，然后25％～50％B用时50分钟，然后保持直至产物洗脱)。洗脱物通过UV在230nm监测。汇集获自色谱的纯分级分离物(纯度≥95％，无单一杂质>3.0％)并将其冻干。纯度>80％的分级分离物可进行再循环。
PEG化C-肽的冻干
将前述纯化的产物以约15～20g/L的浓度在2％水性乙酸中重溶并冻干以获得纯PEG化C-肽药物物质(其游离酸形式)。
实施例2：PEG化C-肽的生物物理表征
如上述实施例1所述制备类似于GMP批次的PEG化C-肽参比标准批次，经RP-HPLC用UV检测测定纯度为99.5％，除非另有说明，其用于下述分析研究。进行的结构研究列于表E1。所有分析物确定该药物物质的化学结构。
通过MS得到分子质量：
采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)来验证药物物质的分子质量。该样品具有阳离子MALDI-TOF质谱，观察到中心约在m/z45743的单一荷电准分子离子宽簇。
傅里叶变换红外光谱(FT-IR)：
在配备有TGS检测器和固定在ATR附件上的单反射ZnSe晶体的Jasco 4200FT-IR光谱仪上收集C-肽、PEG试剂和PEG化C-肽的FT-IR谱。用Teflon棒将固体样品按向ZnSe晶体。从图谱减去残余湿气的峰。结果示于图1和图2(放大区域)。PEG化C-肽的光谱与PEG试剂的光谱极其相似。考虑到肽与PEG的质量比，这并不意外。
然而，在图2所示的酰胺I区域有微小差异。具体而言，PEG化C-肽的酰胺I谱带在1627和1653cm-1处显示两个峰，而游离C-肽的光谱则仅在1634cm-1处显示一个酰胺I谱带宽峰。近1630cm-1处的酰胺I谱带一般与β-转角的β-折叠结构相关联，而近1650cm-1处的酰胺I谱带一般认为是α-螺旋，无规律或无规卷曲结构。1653cm-1处吸收峰的出现与PEG化肽相较于C-肽更加无规的结构相一致。
为研究所示酰胺I区域中的差异是否归因于酰胺基团和溶剂水之间的氢键差异，在D2O中收集的FT-IR光谱示于图3和图4。为收集D2O光谱，将D2O溶液中的样品置于相距6μm的两扇CaF2窗之间。
D2O中的PEG化C-肽的FT-IR光谱显示最小酰胺II谱带强度(1566cm-1处)，其指示所有酰胺基团都经历了H-D交换。H-D交换后，该酰胺II谱带从1566cm-1移至1465cm-1(成为酰胺II'谱带)。D2O中较高浓度(约25mg/mL)和较低浓度(约12.5mg/mL)均有游离C-肽的残留酰胺II强度，指示一些未交换的酰胺基团。所述未交换的酰胺基团可能被β-转角中的分子内氢键或高浓度时的肽寡聚物(聚集物)间形成的分子间氢键保护。就D2O中的PEG化C-肽而言，有效C-肽浓度要低很多，这归因于C-肽与40kDa PEG的低质量比。
然而，如次级衍生的FT-IR光谱(示于图4)中所示，C-肽的高浓度样品(约25mg/mL)的I′谱带显示1639cm-1处的主峰，在1645cm-1处有肩峰，然而低浓度样品(约12.5mg/mL)在1639cm-1和1645cm-1处均显示有主峰。这指示酰胺I'区域中的差异可能是浓度相关的。相较于PEG化C-肽的光谱，游离C-肽的光谱显示在1635-1640cm-1处强度更大，指示游离C-肽中有更多β-转角结构。注意到C-肽样品的更稀释样品信噪情况不理想，无法评估更低浓度。
通过氨基酸分析得到个体氨基酸的鉴定和比例：
为确保组成氨基酸的鉴定和正确比例，对PEG化C-肽进行氨基酸分析。该方法包括使肽在强酸中水解，在离子交换柱上分离氨基酸，最后在茚三酮衍生后检测洗脱物。该研究的结果示于表E2。氨基酸分析的结果证实PEG化C-肽中的氨基酸鉴定和理论相对发生率在试验误差内。
通过GC的个体氨基酸鉴定和手性：
进行手性氨基酸分析以研究组成氨基酸残基的手性鉴定。使肽在氘化溶剂(DCl/D2O)中水解，衍生为N(O,S)-氟代乙酰氨基酸酯，然后用GC-MS分析以确定各氨基酸对映体。采用被覆有Chirasil-Val的去活化玻璃毛细管进行GC。载气是氢。结果示于表E3。所获的值证实构成PEG化C-肽结构的氨基酸的预期手性。
通过MS/MS得到氨基酸序列：
考虑到PEG的大小尺寸和多分散性，在C-肽阶段(PEG化之前)通过MS/MS进行测序。通过采用CID(碰撞诱导解离)进行MS/MS来研究C-肽的氨基酸序列，CID技术中故意将完整样品分子片段化以从通过该方法产生的产物离子谱获得结构信息。
MS/MS谱中观察到的片段离子类型取决于多个因素，包括一级序列、内部能量多少、能量如何引入、荷电状态等。公认的用于片段离子的命名法最先由Roepstorff和Fohlman提出[Biomedical Spectrometry,1984,11(11):601]，并后续由Johnson等修改[Annals of Chemistry,1987,59(21):2621-2625]。
仅检测携带至少一个电荷的片段。若该电荷保留在N末端片段上，则将该离子分类为a、b或c。若该电荷保留在C末端上，则该离子类型为x、y或z。下标表示片段中残基的数量。
除了带电的质子以外，c离子和y离子概括了来自前体肽的其它质子。因此，可能有六个单一带电序列离子。注意到这些结构包括单一带电质子。在电喷射离子化中，肽一般带有两个或多个电荷，从而片段离子可能带有多于一个质子。
预期带有多电荷的b和y以及片段离子采用Croker等人开发的计算机程序计算[Journal of Biomolecular Techniques,2000,第11卷,第3期,135-141]。结果示于表E4和E5。通过MS/MS和MS/MS/MS进行的片段化和序列分析证实了提出的C-肽的一级序列。
肽图：
肽图是通过用蛋白水解酶消化蛋白质产生的片段化模式。肽片段的模式可表征特定蛋白质，并且可用于鉴定结构。先前已开发出对C-肽作图的方法，并且通过质谱鉴定四个片段。所述四个片段包含氨基酸25-31(标记为片段A)、13-24(标记为片段B)、1-12(标记为片段C)，和1-24(标记为片段D)，如图5下图中所示。
进行并排比较，其中使C-肽(1mg/mL)和PEG化C-肽(10mg/mL)溶解于25mM碳酸氢铵缓冲液。向各1mL样品添加40μL的0.25mg/mL糜蛋白酶，并且使各样品在37℃孵育4小时。消化通过添加甲酸来终止，并且通过RP-HPLC分析所述样品。结果示于图5。
如同对PEG化C-肽预期的那样，没有观察到片段C(1-12)和D(1-24)，因为N末端连接有PEG部分。PEG化C-肽上观察到了片段25-31和13-24。为了研究14分钟时的峰是否是未消化的PEG化C-肽，进行了长达27小时的消化时程研究。没有获得与消化至完成一致的其它片段。此外，通过RP-HPLC采用延伸的梯度分析未消化PEG化C-肽和已消化PEG化C-肽的50/50混合物，以研究是否能实现任何分离；然而，仅观察到单个峰。因此，总结出14分钟时的峰包含PEG化的1-12和1-24片段，并且可能有一些完整的PEG化C-肽。无法对这些片段进行分辨是未预料到的，因为该分子的色谱表现被较大PEG部分的主导。
不存在反离子：
通过离子色谱(IC)检测铵含量，通过HPLC检测乙酸，并且通过ICP/MS检测钠，已确保脱盐处理之后几乎没有或没有反离子余留。
经测定铵含量为0.035％w/w，且发现钠含量为0.02％w/w，低于规范限制。
尽管所述药物物质中的反离子水平低，当基于摩尔计算时，指示终药物物质可能与铵(0.9摩尔比)和或钠(0.4摩尔比)有一些关联。
通过分析超速离心得到沉降速度：
为评估PEG化C-肽中的均匀性与任何聚集体的分布，在分析超速离心中检测沉降速度。利用该技术，可基于聚集体的不同沉降系数来对其进行检测。沉降速度是基于简单物理原理的绝对法。其校准基于时间和长度的基本单位，无需标准分子作为参比。沉降系数基于分子形状以及分子质量，因此在尽管已知单体沉降系数的情况下也不可能预计寡聚物的沉降系数。
图6中显示标准化的PEG化C-肽1008-134批(以约0.6mg/mL)在PBS缓冲液中的沉降系数分布。0.802S处的主峰是98.1％，指示该样品是均匀的。先前测定了C-肽(未PEG化)的沉降系数在约0.4～0.5S范围。该范围内没有检测到信号，指示没有游离的C-肽。此外，沉降系数与40kDa的支化PEG(0.82S)一致。
C-肽和PEG化C-肽的圆二色性分析：
对C-肽和PEG化C-肽进行近紫外和远紫外圆二色性(CD)分析。以1mg/mL的C-肽和约10.4mg/mL的PEG化C-肽(等同于0.69mg/mL的C-peptide)使样品溶解于20mM磷酸盐缓冲液(含4.7％山梨醇，pH6.0)。采用肽浓度(1或0.69mg/mL)、平均残基重量(97.4)和检测池光程(就吸光度检测而言是1cm或就CD而言是0.02cm)来将减去溶剂的光谱转换成平均残基椭圆度。在Jasco J-715分光偏振计上进行检测。
如图7所示，C-肽(上方曲线)和PEG化C-肽(下方曲线)的平均残基椭圆度在近紫外区两个样品均基本为零，因为没有芳族基团和二硫键(示于图7上图)。
C-肽和PEG化C-肽的远紫外CD谱显示二级结构是高度无序的。在220和208nm处没有双最小值(α-螺旋特征)且在217nm处没有谷(反平行β-折叠特征)。
CD分析显示在针对浓度校正之后，C-肽和PEG化C-肽的谱形接近相同(图7下图)(注意浓度评估中有一些误差，因为样品重量没有针对水或盐/溶剂校正)。因此，总结出PEG化不改变肽的二级结构。
尺寸排阻色谱法(SEC)：
实施例1的PEG化C-肽样品(100μg在20mM磷酸盐缓冲液中，4.7％山梨醇，pH6.0)通过尺寸排阻色谱法分析，如图8所示。
作为SEC方法定性的部分，独立合成20kDa的PEG化肽并且通过SEC分析以显示该方法能够基于尺寸区分相关的化合物。20kDa的PEG化C-肽(两种样品均以100μg上样，在相同缓冲系统中)与PEG化C-肽的色谱的重叠示于图9。如图9所示，较低分子量的峰较晚从SEC柱洗脱。主峰之前没有峰，指示PEG化C-肽中没有可见水平的较高分子量物质。类似地，主峰后没有峰，指示没有可见水平的较低分子量物质。
SDS-PAGE：
采用4-12％Tris-甘氨酸凝胶进行凝胶电泳。如图10所示，分子量标准品(参见英杰公司(Invitrogen)的Blue Plus2，预染色标准品)在泳道2和10中上样。2μg～10μg的不同量的PEG化C-肽在凝胶泳道4、6和8中上样。通过考马斯染色(Coomassie staining)观察到64-98kDa之间有单一强条带。已知PEG的流体动力学半径大于基于所述蛋白质标志物的分子量预计的尺寸。因此，该结果并非预料之外。SDS-PAGE结果还显示不存在其它较高分子量的杂质。
活性分析：
将PEG化C-肽样品与标准未标记的C-肽作比较，以证实PEG化产物保留了未标记肽的活性。
方法：
将人肾(HK2)细胞以20,000个细胞/孔的密度接种于(未被覆的)96孔(bl/cl)板中并孵育48小时。在实验当天，冲洗HK2细胞并使其在达氏修正依氏培养基+0.5％牛血清白蛋白中饥饿1小时。细胞用1nM(终浓度)处理，10个重复，5分钟。C-肽PEG GMP(批号#1-FIN-0988)、C-肽PEG Tox(批号#1007-119)、C-肽PEGTox(批号#1008-090)、未修饰的C-肽(批号#209400-3)和C-肽PEG参比(批号#1008-134)以等体积添加。培养板以1000rpm离心5分钟。总处理时间为7～10分钟。处理后立刻将细胞与2％(终)仲甲醛固定并用冰冷甲醇渗透。然后，细胞用抗-pERK抗体处理，并按标准方法用IF+酪胺放大处理培养板。
结果：
结果示于图11，证明PEG化C-肽保留未经PEG化产物的活性，而该活性在数种不同批次的C-肽间一致。
实施例3：药物组合物
药物产品是CBX129801(20mg/mL)在10mM磷酸钠缓冲液(4.7％山梨醇，pH6.0)中的无菌水性溶液。
该制剂的组合物和各成分的功能示于表E6。
表E6：CBX129801药物产品的组合物
为达所需剂量，药物产品可在给予前在临床地点以市售可得的无菌标准盐水(0.9％)稀释。
制备法说明
批量溶液制剂
通过将磷酸钠(单碱和二碱)溶解于约80％的所需总体积的注射用水(WFI)中在混合容器中制备10mM磷酸盐缓冲溶液。向该缓冲溶液添加山梨醇，混合直至溶解。用1M NaOH或HCl调节pH至6.0。缓冲液用WFI补至终体积。以约80％的终批量大小(以体积计)向含有磷酸盐/山梨醇缓冲液的另一容器添加CBX129801药物物质。混合使药物物质溶解。药物物质溶解后，用1M NaOH或HCl将pH调节至6.0。然后添加足够量的磷酸盐/山梨醇缓冲液将该批次补至终体积。然后进行微生物消减过滤(bioburden reduction filtration)。在无菌过滤之前即刻对样品进行微生物测试(过滤前微生物)。
无菌过滤
将批式溶液无菌过滤(连续两个0.22μm PVDF亲水滤器)至无菌接受容器中。测试各滤器在使用前后的完整性。
填充
采用自动化填充器进行填充。将CBX129801药物产品无菌填充至用橡皮塞封闭的小瓶中，然后用铝制顶封加塑料盖密封。
检查/贴标
将小瓶转移进入视查区并在控制室温下进行100％视查。视查后，对小瓶贴标并将其置入纸盒以避光并贮存在2～8℃。
稳定性
CBX129801药物产品临床批次被放置在关于稳定性推荐的5℃贮存条件下。在带有Teflon面塞子和顶封的5mL玻璃瓶(标定4mL填充体积)中进行研究。18个月的结果示于表E7。
表E7：CBX129801药物产品批号1-FIN-0988在5℃下的10mM磷酸钠(4.7％山梨醇，pH6.0)中的稳定性数据。
LC＝标示量
N/R＝研究方案中不要求。
实施例4：1期药代动力学研究
通过皮下注射给予进行1期无规、盲性、安慰剂对照的、多递增剂量的CBX129801扩大研究。该研究的一个目的是评估皮下(SC)给予后血浆CBX129801的单剂量和多剂量药代动力学(PK)。
处理组：
将18～55岁的患1型糖尿病至少5年且接受稳定、最优糖尿病方案至少三个月的其它健康状况良好的对象纳入研究。对象不具有可检测的C-肽水平(禁食C-肽浓度<0.3ng/mL(<0.1nmol/L))。体重指数(BMI)≥18.0且<35.0kg/m2。在筛选过程中需要对象对两次诱导在两根腓肠神经中都具有可记录的感觉神经传导反应。排斥性实验值包括异常肝功能测试(血清天冬氨酸转氨酶[AST]或丙氨酸转氨酶[ALT]>1.5x上限标准[ULN])，大量白蛋白尿定义为试纸尿蛋白>2+，甘油三酯≥600mg/dL，促甲状腺激素(TSH)>1.3x ULN，或血清肌酸酐>1.5mg/dL(>128μmol/L)。将该研究的6个月内经历了严重低血糖事件(定义为需要他人协助)或反复经历临床显著性非严重低血糖(平均≥3次/周)的对象排除。排除离给药30天内采用糖尿病周围神经药物的治疗包括但不限于Neurontin(加巴喷丁)、Lyrica(普瑞巴林)、不同的抗癫痫药物(例如，欣百达(度洛西汀)、阿密曲替林、癫能停(苯妥英)、得理多(酰胺咪嗪))、止痛膏和凝胶(产自利多卡因或辣椒素)和麻醉剂。四个顺序剂量组(对于A-C组，每组对象n＝10，8位给予活性药物而2位给予安慰剂；对于D组，29位给予活性药物而13位给予安慰剂)如下给予CBX129801：A组：0.3mg CBX129801或安慰剂；B组：1.0mg CBX129801或安慰剂；C组：3.3mg CBX129801或安慰剂；和D组：在第1天给予2.0mg CBX129801的加载剂量之后给予0.8mg CBX129801。
对于A组(0.3mg)和B组(1.0mg)中纳入的对象，给予一次皮下剂量；三周后，每周一次给予四次皮下剂量，共计五次剂量。对于C组(3.3mg)中纳入的对象，给予一次皮下剂量；三周后，每周一次给予三次皮下剂量，共计四次剂量。对于D组(0.8mg,2.0mg加载剂量)中纳入的对象，给予一次皮下剂量；一周后，每周一次给予十一次皮下剂量，共计十二次剂量。
收集药代动力学样品，给药前和给药后的24、48、72、120、168、240、336、408(仅第一次剂量)，和在A、B和C组的部分1的第一次和最后一次剂量之后504小时(就C组而言还在672小时)，以及各其它剂量之前；第一次剂量之后的504小时给药后样品是第2剂量之前的给药前样品。此外，在所有A、B和C组中，在第1剂量之后的给药后2和6小时收集药代动力学样品。在D组中，收集给药前样品以确定在第0、7、14、28、42、56、70和84天收集的药代动力学。此外，在第105天收集样品。
方法：
采用Mercodia公司的市售试剂盒通过ELISA测定C-肽的血浆浓度。13.6～0.21nM的CBX129801标准品和质量对照(QC)样品(高、中和低QC)在大鼠血浆中制备，并且取代C-肽标准品和QC。将可定量限度(BQL)值之下的血浆样品浓度在非房室药代动力学分析中设为零，并且在房室药代动力学分析排除。
表E8中所示的标准非房室药代动力学参数采用WinNonlin5.3版(Pharsight，密苏里圣路易斯的CertaraTM公司)由获得的血浆浓度-时间谱来计算。采用来自最近剂量的标定时间来计算药代动力学参数。
表E8：非房室药代动力学参数
非房室药代动力学参数值采用WinNonlin5.3版计算。
采用非线性混合效果建模法来建立房室群药代动力学模型。采用NONMEM程序(7.2版，马里兰州埃利科特城的ICON开发方案公司(ICONDevelopment Solutions))中的一级条件最大似然估计法和NM-TRAN预处理器。采用Fortran编译程序gfortran(GNU工程)在个人计算机(联想T410)上于微软Windows7操作系统下运行模型。采用R(2.11.1版，统计计算R基金会)来处理NONMEM并生成图形输出。NONMEM中的子程序是线性乳突型模型(ADVAN1与TRANS2在PREDPP文库中合用)以采用零阶输入(zero order input)拟合单房室模型。采用附加残差模型对log-转化的数据进行分析。由下降的目标函数值、条件数、拟合分析的图形化优度以及参数评估似真性来指导模型选择。
采用自房室药代动力学参数评估和协方差矩阵估计的500个参数来模拟血浆浓度时间曲线。以R生成图形输出图像。
结果：
表E9-皮下给予单剂量CBX129801后CBX129801的算术(％CV)和几何平均非房室药代动力学参数
NC–未计算
表E10-皮下给予多剂量CBX129801后CBX129801的算术(％CV)和几何平均非房室药代动力学参数
NC–未计算
AUC的RAUCT累积指数计算自AUCT
C最大的RC最大累积指数计算自C最大
药代动力学参数计算自最末剂量
表E11-增加皮下给药研究(D组,2.0mg加载剂量，然后11次每周0.8mgCBX129801剂量)中的算术(％CV)和平均给药前血浆CBX129801浓度
天 平均 ％CV
0 0.00 NC
7 2.70 50.0
14 2.38 43.6
28 2.04 43.1
42 1.97 37.6
56 1.90 40.5
70 1.73 37.1
84 1.82 32.3
EOS NC NC
EOS-研究结束时
表12-对于增加皮下剂量研究中患者的CBX129801剂量比例性评估的统计
在0.3～3.3mg剂量范围的单剂量和多剂量给予后3～7天观察到了中值血浆CBX129801峰浓度(C最大)，表明给药量和多剂量不改变从皮下注射吸收进入循环血浆的时程。图12以线性标尺显示在增加剂量研究中皮下给予CBX129801之后的平均血浆浓度与时间的关系。图13以对数标尺显示在增加剂量研究中皮下给予CBX129801之后的平均血浆浓度与时间的关系。
表E9显示皮下给予单剂量CBX129801后的非房室药代动力学参数。表E10显示皮下给予多剂量CBX129801后的非房室药代动力学参数。表E12显示增加皮下给药研究中(D组)的给药前血浆CBX129801浓度。表E12显示单剂量和多剂量的剂量比例性参数。
多剂量C最大和AUCτ值在0.3～3.3mg剂量范围内以剂量比例性方式增加。在每7天给予0.3～3.3mg多剂量之后，C最大和AUCτ似乎随剂量线性增加(表E12、图14和图15)。
在1.0或3.3mg单剂量和0.3、1.0和3.3mg多剂量之后，C最大、AUC∞和AUCτ的对象间差异(以差异系数百分比(％CV)表示)低于46％。0.3mg单剂量之后的％CV值较高，这归因于低于该测定定量限度的样品。
单剂量给药之后，CBX129801的平均终末血浆半衰期是约6.37和6.92天，而多剂量给药之后是6.33～7.92天，表明多剂量给药后半衰期不变。
房室药代动力学分析
具有零阶输入的一房室模型较好地描述了观察到的数据，如良好的拟合图和视觉预检所指示。药代动力学参数的参数估计(SE)是：CL/F为0.0522(0.0032)L/小时，Vc/F为17.1(1.28)L，且D1为65.2(3.63)小时。CL/F和Vc/F的对象间差异估计分别是：0.0733(0.0313)和0.149(0.0375)。D1值指示药物从注射位点输入至系统循环是2.7天。由房室分析计算的平均半衰期(9.46天)；该值稍大于非房室分析。
达到稳态的时间是约40天；采用加载剂量，达到稳态的时间会缩短至约3天。
计划的治疗剂量和方案
采用带有零阶输入、一级消除的药代动力学方程来描述观察到的血浆浓度的log与时间的关系。采用拟合药代动力学参数来模拟血浆浓度的时程(图16-23)并估计不同治疗方案后的暴露。
实施例4：在大鼠1型糖尿病周围神经病变模型中皮下给予PEG化C-肽的功效研究
采用链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，在两个研究中评估CBX129801的生物学活性及其相对未修饰C-肽的功效，所述大鼠模型发展的并发症与1型糖尿病患者所经历的那些相似，例如多神经病变和肾病。特定对于糖尿病周围神经病变而言，已用STZ大鼠模型证明皮下替换大鼠C-肽至C-肽缺陷型大鼠(在6周糖尿病后给予2周)部分修正了运动神经和感觉神经中的神经传导速度(NCV)缺陷(Cotter MA等:Diabetes52:1812-1817,(2003))。在以预防性策略皮下给予人C-肽五周时发现运动NCV有类似结果(Ido Y等:Science277,563-566,(1997))。
这些研究的目的是：1)研究CBX129801在预防或改善糖尿病大鼠中NCV衰退的可能效果，和2)将这些效果与等量接触未修饰C-肽产生的效果作比较。
STC诱导的糖尿病大鼠
在第1天通过静脉内给予临床级STZ(研究#1中50mg/kg而研究#2中33mg/kg)诱导重约400g的雄性SD大鼠(哈伦实验室公司(HarlanLaboratories,Inc.)；印第安纳州印第安纳波利斯)患1型糖尿病。在第3天(研究#1)或第4天(研究#2)，收集血液并分析K3EDTA血浆的内源性C-肽水平，而C-肽<0.4nM的动物在第7天(研究#1)或第9天(研究#2)随机排列，随机排列时考虑体重和血液葡萄糖(标准是在400-600mg/dL范围内)。采用Covance的BRAT系统进行随机排列。在各研究中，未接受STZ的五只大鼠作为对照。
在两个研究中都采用胰岛素(长效甘精胰岛素)，并在晚上皮下给予，然后在动物房中开始12小时的黑暗周期(发生最大食物消耗的时间段)。在研究#1中，在该研究早期(进入到处理阶段3天)开始有数起动物死亡之后开始用胰岛素处理大鼠。所有动物接受3U/天的胰岛素至该研究结束。在研究#2中，部分为了避免研究#1中观察到的死亡，当动物血液葡萄糖达到550mg/dL时开始用胰岛素处理动物。随着动物开始接受胰岛素，大多数情况下，对其进行共同处理，表示对全部动物使用增加的胰岛素以保持血液/血浆葡萄糖得到控制(例如，<550mg/dL)。所有动物接受5U/天的胰岛素至该研究结束。在贯穿研究中于需要限制脱水时，给予动物无菌温盐水(由兽医确定体积)，并且特别是在研究#2中，在经历手术以供泵植入之前24小时给予动物无菌温盐水。
测试物
所有测试物在第10天开始对大鼠的背部-肩胛区皮下给予。每周一次(研究#1)或每3天一次(研究#2；仅CBX129801)通过注射给予PEG化的人C-肽(CBX129801；研究#1用批号#1007-119；研究#2用GMP批次(实施例1))和PEG化大鼠II C-肽(1mL/kg)。通过植入渗透泵(型号2ML4；2.5μL/h)来给予未修饰的(非PEG化的)人C-肽和大鼠II C-肽(仅研究#1)，渗透泵每4周更换一次。所有测试物在研究地点以作为载剂的无菌磷酸盐缓冲盐水制得备用。基于分析证明的纯度校正剂量浓度。
活体评估
临床观察：每天或按需以更高频率检查动物的一般健康状况，包括疼痛或痛苦的迹象。在第1天于STZ处理之前作为随机过程的部分进行称重，并在第7/9天、第11天(第一剂量后一天)和之后每周进行称重。按与体重相同的计划表记录食物消耗。
血液葡萄糖：在第3/4天、第7/9天、第11天和之后的每周在动物禁食至少3小时之后通过尾静脉取一滴血。采用最大读数为600mg/mL的手持葡萄糖检测仪(Aviva系统，罗氏公司(Roche))或临床装置(日立(Hitachi)912临床化学分析仪)进行血液葡萄糖测定。
PEG化C-肽和未修饰的C-肽的检测：从禁食至少3小时的动物尾静脉收集血液(350μL)置入K3EDTA管，并在处理成血浆之前置于冰上。血浆样品在置于干冰上运往迈康斯德公司(加利福尼亚州圣迭戈)分析之前，贮存于-70℃。就所有动物而言，在第3/4天和7/9天，采用用于大鼠C-肽的市售可得的试剂盒(瑞典的默克迪亚AB公司(Mercodia AB)；产品编号10-1172-01)检测内源性大鼠C-肽水平。在处理过程中，定期从动物收集血液样品以测定采用PEG化C-肽和未修饰C-肽的不同处理方案的药代动力学概况。基于C-肽来源是大鼠还是人，以及所述肽是否经PEG化来开发用于大鼠血浆中四种基质的方法。采用上述用于大鼠C-肽的默克迪亚试剂盒检测未修饰的和PEG化的大鼠C-肽的血浆水平；采用用于人类C-肽的默克迪亚试剂盒(产品编号10-1136-01)检测未修饰的和PEG化的人类C-肽。按照针对未修饰C-肽的生产商说明使用所述试剂盒。就PEG化C-肽而言，通过采用PEG化C-肽作为质量控制和标准样品来修改所述试剂盒，因此产生特定用于分析含PEG化物质的样品的标准曲线。
神经传导速度(NCV)
在基线(第8-10天[在第10天的处理之前])，处理启动后4周(仅研究#1)、8周，和12周(仅研究#2)，在后肢(趾神经、胫神经[仅研究#1])和尾(尾椎神经)中检测电生理学终点，包括NCV。动物用异氟烷麻痹，并在整个记录期间以前倾姿势放置。在电生理学记录过程中监测呼吸和体温。评估NCV的人员不知晓各被评估大鼠的处理分配。在研究#2中，所有动物在用于检测NCV的相同麻醉期间植入泵(若对处理分配适用)。(在研究#1中，泵植入和NCV检测的日子紧挨)。
趾神经动作电位：采用置于踝、侧踝后的活动记录电极和后爪第二趾底部的刺激阴极记录该度量。通过将刺激阴极和活动电极之间的距离除以初始去极化电流的绝对发生潜伏期(absolute onset latency)来计算速度。
尾侧神经动作电位：采用置于尾部毛缘线下10mm处(观察确定)的活动记录电极和更远端60～70mm的刺激阴极来记录该度量。通过将刺激阴极和活动电极之间的距离除以初始去极化电流的绝对发生潜伏期(absolute onset latency)来计算速度。
胫动作传导(仅研究#1)：采用位于后爪内附肌中的活动电极和靠近踝、侧踝后的刺激阴极来记录该度量。
采用阻抗为大约50千欧1,000Hz的铂针电极(Grass-Telefactor公司)作为所有周围神经记录的活动电极(active lead)和参考电极(reference lead)。活动电极、参考电极和接地电极的放置按各个模态调整，并参照各动物中的骨骼标志定位。神经电信号采用单位增益前置放大器进行阻抗匹配，采用多极滤器进行合适的带通(band-pass)处理，然后进一步采用0.5～50K的增益系数来差异放大。对各模态调整滤器设置。调节一般模式抑制电平(rejection level)和增益系数，以使60-Hz干扰最小化，并使各记录系列的信噪比最优化。扩大的信号被锁时(time-locked)至诱发刺激(evoking stimulus)，复用至选择的通道并以超过5倍于取样最高频率的比率数字化。扫描数据中的伪迹(采用预定的抑制电平；80％的数字化窗口)并数字平均化以供合适于研究模态的初相(epoch)。对各检测调整各平均水平中包括的各个追踪的数量以使信噪比最优化并便利准确评估发生潜伏期和峰值幅度的度量。
在使信号最优化之后对全部电生理学数据评分。检测从刺激伪迹至去极化开始的发生潜伏期(精确至0.01毫秒)。检测从基线至去极化峰值的幅度(就感觉反应而言精确至0.01μV，而就运动反应而言精确至0.01mV)。所有检测均用跟随数字化踪迹的内部计算机光标来执行。电子储存所有波形并可用于离线分析。
统计学分析
平均(SEM)的平均值、标准偏差(SD)和标准误差采用Excel软件计算。采用邓奈特事后检验(Dunnett’s post-hoc test)的单向ANOVA(用于Mac OS X的Prism5，加利福尼亚州拉荷亚市的图形软件有限公司(GraphPad Software,Inc.))来比较处理组和载剂组NCV自基线的绝对或百分比变化的结果，以p<0.05判为具有显著性。
治疗组
研究#1：采用总计65只动物；其中60只通过注射STZ而诱导糖尿病。七个处理组，N只每组，以及测试物的剂量、频率和体积示于表E13。
表E13.研究#1中的处理组
a在第一周中，给予两次注射(第10天和第13天)。
UM＝未修饰的；CP＝C-肽；PEG＝聚乙二醇。
研究#2：采用总计110只动物；其中105只通过注射STZ而诱导糖尿病。八个处理组，N只每组，以及测试物的剂量、频率和体积示于表E14。
表E14.研究#2中的处理组
NA＝不适用；Q3D＝每3天一次；UM＝未修饰；CP＝C-肽。
结果-研究#1
动物存活率和临床观察
65只接受STZ的大鼠中，63只在第3天的内源性(大鼠)C-肽水平<0.4nM(33只大鼠的水平<0.1nM)。STZ诱导的糖尿病状态与高血糖相关联，而在最初几周中所有组中出现体重下降和一些死亡(表E15)。未修饰C-肽组的STZ大鼠是最受影响的，这大概归因于手术泵植入麻醉继发性的脱水加剧；没有对这两组(组5和6)进行NCV比较分析因为存活动物很少。STZ大鼠组之间的食物消耗没有显著差异；然而，在8周处理期间，其平均食物消耗量是对照组的1.5～2倍。
表E15.存活至研究结束的动物和临床观察结果
a结果是平均值±标准偏差(SD)。
b包括原始组中的所有动物。
c检测血浆。
d对照(未经-STZ)无死亡。
e无SD测定(N＝1)。
在测试物处理第一周起始以1U/天的剂量对所有动物给予胰岛素。该胰岛素剂量在两周后增加至2U/天，并在三周后增加至3U/天。所有存活动物完成了接受3U/天的胰岛素的8周处理阶段。
CBX129801和C-肽水平
用于该研究的CBX129801的剂量(1.3和4.0mg/kg/周)高于PEG化大鼠C-肽的剂量(0.3mg/kg/周)，这是因为大鼠和人C-肽的氨基酸序列之间的差异(即，31个氨基酸中有9个取代)。在低剂量CBX129801、高剂量CBX129801和PEG化大鼠C-肽组中，第三周中给药后两天评估的平均最大血浆浓度分别为约129nM、431nM和12nM。在低剂量CBX129801、高剂量CBX129801和PEG化大鼠C-肽组中，在该研究结束时的平均最小血浆浓度分别为约22nM、94nM和2nM。接受未修饰C-肽的STZ大鼠组(组5和6)中的损失了大多数动物，因此放弃了对PEG化C-肽与未修饰C-肽功效之间的比较。
神经传导速度
载剂组和PEG化C-肽组(N＝5～9只/组)中的STZ大鼠的两种神经的NCV相较于对照而言在糖尿病8～9天之后均有所减慢(即，确立处理之前基线处的NCV降低)。这些STZ大鼠相对于对照大鼠的基线处NCV缺陷大约是趾神经16％(29.0m/s对比34.4m/s)和尾神经19％(42.7m/s对比53.0m/s)。处理下的胫神经未显示任何变化，从而未显示结果。
如表E16中所示，在所述8周期间，载剂处理的STZ大鼠的趾NCV减小而尾NCV稍有增大。采用人和大鼠PEG化C-肽的处理对防止疾病发展导致的趾NCV降低具有统计学显著的作用。具体而言，就高剂量CBX129801而言，基线NCV缺陷有部分逆转(基线处28.6m/s和8周时30.1m/s，对比对照8周时的32.9m/s)。采用PEG化C-肽处理的尾NCV中相对于基线的变化不显著，但是有NCV缺陷恢复的趋势(例如，基线处43.8m/s而高剂量CBX129801处理8周时46.1m/s，对比对照8周时的56.8m/s)。
表E16.趾神经与尾神经相对于基线的变化百分数
a平均值±标准偏差，计算为个体动物变化％的平均值。
*p<0.05，对比载剂组。
在4周时于载剂处理组中观察到的趾NCV的减慢在PEG化C-肽组中有所减轻(图24；平均值±平均值的标准误差；p<0.05)，但差异无统计学显著性。4～8周的持续处理逆转了任何明显的短期NCV缺陷，并且在8周时相较于基线而言NCV总体未变化或有所提高。在对STZ大鼠模型以及BB/Wor大鼠模型(自然发展的1型糖尿病)采用未修饰C-肽的前期研究中已发现相当的NCV处理效果。
结论
对1型糖尿病大鼠模型皮下给予CBX129801防止了疾病进展导致的感觉NCV的减慢。PEG化大鼠C-肽也是有效的。这些结果证明，当C-肽被PEG化时仍保留了其天然肽的生物学活性，而PEG化延长了其循环半衰期并因而减少了更换剂量的频率。
结果-研究#2
动物存活率和临床观察
在105只接受STZ的大鼠中，在第4天有41只动物中的内源性(大鼠)C-肽水平<0.4nM(未见水平<0.1nM)。在第8天，由于糖尿病状态进一步发展，该数目增加至77；在一周后评估内源性C-肽水平>0.5nM的那些动物，而仅有两只动物的C-肽水平升高(0.57nM和0.61nM)。STZ诱导的糖尿病状态与高血糖和体重下降相关联(表E17)。有5只动物死亡(组4～6中各一只；组7中两只)。在动物接受泵的组6～8中还有两个技术问题；第一是测试物剂量混乱(在组6和组8各五只动物之间)，第二是一批九个有缺陷的泵。因此，这些组的N显著少于组2～5。
表E17.研究结束时的动物和临床观察
a结果是平均值±平均值的标准误差。
b包括原始组中的所有动物。
c对照(未经-STZ)无死亡。
在其血液葡萄糖达到550mg/dL时，以1.5U/天的起始剂量对动物给予胰岛素。一旦用胰岛素处理，即随着接受胰岛素的集合组处理动物；若动物血液葡萄糖降至<300mg/dL则兽医停止每天给予胰岛素剂量。基于集合组的血液或血浆葡萄糖读数接近550mg/dL，在该研究的最初7周期间以1-2U/天增加胰岛素剂量，直至每天6U的最大剂量。所有存活动物完成了接受5U/天的胰岛素的12周处理阶段。
CBX129801和C-肽水平
PEG化C-肽组和未修饰C-肽组的所选剂量(表E14)的目的是获得匹配的低、中和高剂量水平，这能够便利对某一剂量范围中的NCV研究并比较两种C-肽形式的功效。如图25所示，通过每3天注射CBX129801和通过植入的渗透泵持续递送未修饰C-肽获得了三种不同的接触范围。
神经传导速度
载剂组、PEG化C-肽组和未修饰C-肽组(N＝15只/组)中的STZ大鼠的两种神经的NCV相较于对照而言在糖尿病8～10天之后均有所减慢(即，确立处理之前基线处的NCV损伤)。这些STZ大鼠相对于对照大鼠的基线处NCV缺陷大约是趾感觉神经14％(27.4m/s对比31.7m/s)和尾感觉/运动神经13％(44.9m/s对比51.4m/s)。
如图26所示，在12周处理期间，载剂处理的动物的尾NCV自基线减小约1.8m/s。在PEG化和未修饰C-肽组中，低剂量动物对比基线的NCV也有减小，尽管其减小少于对照。就中等剂量而言，在所述12周期间CBX129801使NCV增大，而采用未修饰C-肽的NCV减小。高剂量组中的NCV提高在PEG化C-肽与未修饰C-肽之间相似。高剂量的两种C-肽形式之间功效相当的剂量依赖性NCV提高趋势也示于图27。NCV变化的幅度约为4m/s，其与研究#1中趾神经的结果相当。在处理8周后观察到了增加C-肽剂量使尾神经中NCV提高的相似趋势，但不显著。此外，在处理12周期间，趾神经中有较小NCV提高，这与剂量没有强关联(图28)。
结论
该研究支持研究#1的结果：CBX129801(PEG化C-肽)具有生物学活性。此外，该研究证明，CBX129801具有与未修饰的天然C-肽相当的生物学活性。
实施例5：皮下给予C-肽对BB/Wor大鼠中糖尿病诱导的神经功能障碍的功效研究
关于BB/Wor大鼠中神经功能和结构恢复评价了C-肽(大鼠、未修饰)的不同剂量方案，所述BB/Wor是与胰岛素缺乏和胰岛炎(归因于胰腺β细胞的自体免疫破坏)相关联的自发性1型糖尿病的模型。所述动物发展出严重的高血糖、胰岛素分泌过少和酮病性问题。因此，该模型极其类似人类状况，包括相关联的血管、肾脏以及神经性退行性并发症。
该研究的目的是研究：1)s.c.持续给予75nmol大鼠C-肽/kg/24小时是否与每天分为3次s.c.注射给予等同量的C-肽具有相似功效，和2)每天注射一次给予相同量的C-肽是否具有相似功效。
BB/Wor糖尿病大鼠
50只前驱糖尿病雄性BB/Wor大鼠和10只年龄与性别匹配的无糖尿病倾向的BB/Wor大鼠获自生物医学研究模型公司(Biomedical Research Models)(美国马萨诸塞州伍斯特)。所有动物保持在空气过滤的代谢笼中，允许大鼠随意进食大鼠饲料(韦恩实验室饲料F.6(Wayne lab blox F.6)，美国伊利诺斯州芝加哥的韦恩公司食品部(Wayne Food Division))和饮水。每天监测体重和尿葡萄糖以确定糖尿病的发作。在糖尿病发作后，每天以滴定剂量(0.5-3.5IU)对73±6天龄的糖尿病动物给予精朊锌胰岛素(美国南加州的蓝岭制药公司(Blue RidgePharmaceuticals))，以使血液葡萄糖水平维持在20-25mmol/L并防止酮酸中毒。每两周并在该研究结束时检测血液葡萄糖。在糖尿病发作后随即将大鼠随机分配至处理组(表E18)，10只动物/组。糖尿病大鼠通过泵接受盐水(B组；未处理的大鼠)或合成的大鼠C-肽75nmol/kg/天(通过加利福尼亚州圣迭戈的多重肽系统公司(Multiple Peptide Systems)生产，RP-HPLC检测纯度>95％)。使大鼠C-肽溶解于磷酸盐缓冲盐水，并通过皮下植入渗透泵(美国加利福尼亚州帕罗阿尔托的阿尔扎公司(Alza Corporation))(D组)或通过每天一次皮下注射(C组)或分成3个等剂量每天注射(E组)来递送。非糖尿病对照动物(n＝10)也通过渗透泵接受盐水(A组)。
表E18.处理组
组
A 非糖尿病大鼠
B 糖尿病大鼠；无处理
C 糖尿病大鼠，每天一次s.c.给予75nmol大鼠C-肽/kg
D 糖尿病大鼠，通过渗透泵s.c.给予75nmol大鼠C-肽/kg/24小时
E 糖尿病大鼠，分成3等份剂量s.c.给予75nmol大鼠C-肽/kg/24小时
通过市售可得的RIA试剂盒(美国密苏里州圣查尔斯的林可研究公司(LincoResearch))测定大鼠C-肽血浆浓度。为了使血量减少性效应最小化，仅从各动物收集两份血浆样品。就A、B和D组而言，在早晨收集样品，间隔15分钟。就C和E组而言，在动物间分散取样以覆盖如下时间点区段：对于C组和E组分别在注射C-肽之后0～24小时和0～3小时。
剂量选择
为了恢复1型糖尿病患者中C-肽的生理血浆水平，在若干临床试验中采用了s.c.600nmol/24小时的剂量。该剂量在正常体重患者中相当于约8nmol/kg/24小时。因为啮齿类的总体代谢率高于人类，所以总结出大鼠中需要较高剂量来获得生理血浆水平。因此，在关于C-肽对神经功能的效果的前期研究中，通过渗透泵s.c.持续给予75nmol大鼠C-肽/kg/24小时，这导致C-肽浓度的74％恢复。
电生理学研究
在糖尿病发作24小时内检测基线神经传导速度，并在此后每周一次至四周和之后的糖尿病6周和8周检测。在早晨进行检测和组织收集(见下文)，对于C组在每天注射前进行，而对于E组在第一次注射和第二次注射之间进行。在控制温度(35～37℃)条件下检测左侧髋-胫神经内的神经传导离子。采用肌电描记器(5200A，美国华盛顿肯涅威克的凯德威尔实验室公司(Cadwell Laboratory))用方波脉冲(20Hz)在坐骨切迹超大限度地(8V)刺激左髋神经并在踝处刺激胫神经。从第一骨间间隔获得复合诱发运动反应，并检测从刺激伪迹至M-波偏转发生的运动反应。各NCV值代表8或16个记录的平均值，并且通过(近端潜伏期-远端潜伏期)除两个刺激电极间的距离来计算，获得以m/s计的NCV。
组织收集和刺激纤维测试
两个月的处理后，动物用过量戊巴比妥钠(i.p.100mg/kg体重)处死，并切除两侧髋神经，称重并速冻在液氮中并储存在-70℃以检测Na+、K+-ATP酶活性。将右侧腓肠神经用内含2.5％戊二醛的0.1M二甲砷酸盐缓冲液(pH7.40)原位固定，切除并在相同固定剂中于4℃下浸泡固定过夜，然后于4℃下在内含二甲砷酸盐缓冲(0.1M)的1％四氧化锇(pH7.40)中进行后固定处理过夜。使该腓肠神经脱水并如前所述在未聚合的环氧树脂(Epon)中刺激单根有髓鞘的纤维。在生物化学和刺激纤维分析之前对所有组织样品编码以掩盖动物身份。来自每根腓肠神经的平均257±2根有髓鞘的纤维被刺激并对特定变化评分，获得对有髓鞘纤维病理学的三维评估。为显示有髓鞘纤维病理学的时间顺序和增加的严重性，对其进行如下分类：常态、副结肿胀、副结脱髓鞘、过度髓鞘起皱、间生节间、节段性脱髓鞘、沃勒变性(Wallerian degeneration)和再生。各纤维按其最严重变化对其评分并以总纤维百分数形式表示。刺激纤维分析是比通过光学显微镜的评估更灵敏的技术，其能够检测尚未变为更强健的光学显微镜可见的那些变化。
神经Na+、K+-ATP酶活性的评估
为评估神经Na+、K+-ATP酶活性，使神经样品在2mL的0.2M蔗糖和0.02MTris-HCI(pH7.5)中均质化。在1mL的100mM NaCL、10mM KCI、2.5mMMgCl2、1mM ATP、1mM磷酸烯醇丙酮酸、30mM咪唑HCl缓冲液(pH7.3)、0.15mM NADH、50μL乳酸脱氢酶和30μg丙酮酸激酶中对10～20μL的所述均质物酶促分析总ATP酶活性。为检测哇巴因(ouabain)-可抑制的ATP酶活性，添加20μL的25mM哇巴因。Na+、K+-ATP酶活性确定为添加哇巴因之前和之后的活性差异，并表示为：形成的μmol ADP/克湿重/小时。双份重复进行测定。
神经传导速度
在C-肽处理期间，未见影响血液葡萄糖水平或每天的胰岛素需求。糖尿病引起未处理大鼠中运动和感觉神经传导速度(NCV)的显著减小，C-肽显著防止NCV减慢(p<0.001)并且在不同C-肽方案的效果之间没有显著差异。功能变化伴随着神经Na+、K+-ATP酶活性和形貌的变化。C-肽处理2个月显著提高了Na+、K+-ATP酶活性(p<0.001)并且所有剂量方案的效果均相似。
在糖尿病未处理大鼠中，糖尿病诱导异常神经纤维增加至6倍，发现在糖尿病未处理神经纤维中有显著的副结肿胀和脱髓鞘现象。这些结构变化通过持续给予C-肽而被完全防止，而每天给予一次C-肽也改善所述退化但效果稍差。来自未处理糖尿病大鼠的神经中的轴突退化也是明显的，因为过度髓鞘起皱增加且沃勒变性增加。不论何种剂量方案，C-肽处理均完全防止这些糖尿病诱导的变化。
以复合评分形式对功能和形貌变化的评价显示，C-肽对糖尿病所致的神经功能障碍具有显著有益效果。这些效果独立于C-肽给予模式。然而，每天给予一次C-肽的功效显著低于每天给予3次C-肽或持续输注C-肽的功效(p<0.033)。

Claims (53)

1.一种给予有需要的患者PEG化C-肽的方法，所述方法包括给予所述患者足以产生PEG化C-肽的C平均为约0.44nM～约12.2nM的PEG化C-肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C平均是约2.0nM～约5.9nM。
3.如权利要求1～2中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最 小是约0.34nM～约9.0nM。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最小是约1.7nM～约4.9nM。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最 大是约0.5nM～约14.5nM。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最大是约2.3nM～约6.7nM。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的T最大是约1.8～约3.3天。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的半衰期是约5.0天～约11.2天。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的AUCτ是约3.1nM·天～约85nM·天。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的AUCτ是约13.8nM·天～约41.5nM·天。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的分布容积是约5.8L～约22L。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的分布容积是约10L～约15L。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的清除率是约0.8L/天～约2.2L/天。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的清除率是约1.1L/天～约1.6L/天。
15.如权利要求1～14中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的波动度是约36％～约50％。
16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽每7天给予一次。
17.如权利要求1～16中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽是CBX129801。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述CBX129801给予的量是每7天约0.3毫克～约3.3毫克。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述CBX129801给予的量是每7天约0.3毫克、约0.8毫克、约1.0毫克、约2.4毫克，或约3.3毫克。
20.一种治疗或预防糖尿病的一种或多种长期并发症的方法，所述方法包括给予患者治疗剂量的PEG化C-肽，所给予的PEG化C-肽足以产生约0.44nM～约12.2nM的PEG化C-肽的C平均。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C平均是约2.0nM～约5.9nM。
22.如权利要求20～21中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最小是约0.34nM～约9.0nM。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最小是约1.7nM～约4.9nM。
24.如权利要求20～23中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最大是约0.5nM～约14.5nM。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的C最大是约2.3nM～约6.7nM。
26.如权利要求20～25中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的T最大是约1.8～约3.3天。
27.如权利要求20～26中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的半衰期是约5.0天～约11.2天。
28.如权利要求20～27中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的AUCτ是约3.1nM·天～约85nM·天。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的AUCτ是约13.8nM·天～约41.5nM·天。
30.如权利要求20～29中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的分布容积是约5.8L～约22L。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的分布容积是约10～约15L。
32.如权利要求20～31中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的清除率是约0.8～约2.2L/天。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的清除率是约1.1～约1.6L/天。
34.如权利要求20～33中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的波动度是约36％～约50％。
35.如权利要求20～34中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽每7天给予一次。
36.如权利要求20～35中任一项所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽是CBX129801。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述CBX129801给予的量是每7天约0.3毫克～约3.3毫克。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述CBX129801给予的量是每7天约0.3毫克、约0.8毫克、约1.0毫克、约2.4毫克，或约3.3毫克。
39.如权利要求20～38中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖尿病的长期并发症选自下组：周围神经病变、自主神经病变、肾病、勃起功能障碍、女性性功能障碍和视网膜病。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述糖尿病的长期并发症是周围神经病变。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，治疗导致神经传导速度相较于开始PEG化C-肽给予之前的神经传导速度而言提高至少1m/秒。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，治疗导致神经传导速度相较于开始PEG化C-肽给予之前的神经传导速度而言提高至少2m/秒。
43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，采用PEG化C-肽的治疗相较于未治疗患者而言防止神经传导速度下降至少1m/秒。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，采用PEG化C-肽的治疗相较于未治疗患者而言防止神经传导速度下降至少2m/秒。
45.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述糖尿病的长期并发症是肾病。
46.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述糖尿病的长期并发症是勃起功能障碍或女性性功能障碍。
47.如权利要求20～46中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括配量和给予胰岛素。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：基于监控给予治疗剂量的PEG化C-肽之后的患者的胰岛素需求变化来调节给予胰岛素的剂量、类型或频率，其中，所述调节后的胰岛素剂量减少低血糖症的风险、发生或严重性，其中所述调节后的胰岛素剂量比开始PEG化的C-肽治疗之前所述患者的胰岛素剂量低至少10％。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述调节后的胰岛素剂量比开始PEG化的C-肽治疗之前所述患者的胰岛素剂量低约10％～约35％。
50.一种治疗或预防糖尿病的一种或多种长期并发症的方法，所述方法包括给予患者治疗剂量的PEG化C-肽，其中给予等摩尔量的PEG化C-肽产生的AUC或C平均至少2倍于C-肽所得。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，给予所述等摩尔摩尔量的PEG化C-肽产生的AUC或C平均至少100倍于C-肽所得。
52.一种治疗或预防糖尿病的一种或多种长期并发症的方法，所述方法包括给予患者治疗剂量的PEG化C-肽，其中所述PEG化C-肽的剂量低于等效的C-肽剂量的50％。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述PEG化C-肽的剂量低于等效的C-肽剂量的1％。
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