ES2904471T3 - Análogos de compstatina con solubilidad aumentada y propiedades farmacocinéticas mejoradas - Google Patents

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Abstract

Un péptido que consiste en la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

Description

DESCRIPCIÓN
Análogos de compstatina con solubilidad aumentada y propiedades farmacocinéticas mejoradas
APOYO GUBERNAMENTAL
La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno con los números de subvención AI030040 y AI068730 otorgados por el National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la activación de la cascada del complemento en el organismo. En particular, la presente invención proporciona análogos de compstatina que se unen a la proteína C3 con afinidad nanomolar y presentan una fuerte actividad inhibidora del complemento, mayor solubilidad a pH fisiológico, estabilidad plasmática y retención in vivo.
Antecedentes de la invención
A lo largo de la memoria descriptiva se citan diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y académicos. El sistema del complemento humano es un actor poderoso en la defensa contra los organismos patógenos y en la mediación de las respuestas inmunitarias. El complemento puede activarse a través de tres rutas distintas: la clásica, la de las lectinas y la alternativa. El principal acontecimiento de activación que comparten las tres rutas es la escisión proteolítica de la proteína central del sistema del complemento, C3, en sus productos de activación C3a y C3b por convertasas de C3. La generación de estos fragmentos conduce a la opsonización de células patógenas por C3b e iC3b, un proceso que las vuelve susceptibles a la fagocitosis o eliminación, y a la activación de células inmunitarias a través de una interacción con los receptores del complemento. El depósito de C3b en las células diana también induce la formación de nuevos complejos de convertasa y, de este modo, inicia un bucle de autoamplificación.
Un conjunto de proteínas plasmáticas y unidas a la superficie celular regula cuidadosamente la activación del complemento para evitar que las células hospedadoras se ataquen a sí mismas mediante la cascada del complemento. Sin embargo, la activación excesiva o la regulación inapropiada del complemento pueden conducir a una serie de condiciones patológicas, que varían de enfermedades autoinmunitarias a inflamatorias. Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores del complemento terapéuticos es sumamente conveniente. En este contexto, C3 y C3b han surgido como dianas prometedoras debido a que su papel fundamental en la cascada permite la inhibición simultánea de la iniciación, amplificación y activación aguas abajo del complemento.
A medida que aumenta el número de afecciones clínicas relacionadas con la activación anómala del sistema del complemento, también debe hacerlo el campo de las opciones terapéuticas del complemento para satisfacer la creciente demanda de tratamientos eficaces y adaptados a enfermedades. A pesar de los tremendos esfuerzos en curso en la investigación y el desarrollo de fármacos en este campo, el primer fármaco dirigido al complemento, eculizumab (Soliris®, Alexion), sigue siendo la única opción terapéutica en el mercado más de una década después de su aprobación por la FDA para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). El eculizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra C5 que impide su escisión en C5a y C5b, bloqueando así la activación de la ruta terminal del complemento. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar compuestos adicionales dirigidos al complemento como posibles opciones terapéuticas.
Se ha estudiado la intervención a nivel de C3, el componente principal de la cascada del complemento, como enfoque de intervención, dada la implicación de C3 en una diversidad de rutas patogénicas. La familia de las compstatinas, un grupo de péptidos cíclicos que consiste en aproximadamente 13 aminoácidos, se introdujo inicialmente hace dos décadas y muestra una fuerte afinidad de unión hacia C3 de seres humanos y primates no humanos (PNH) (Sahu et al., 1996, The Journal of Immunology 157:884-891). La investigación continua y el desarrollo adicional de la compstatina han dado como resultado una serie de análogos de última generación con actividad inhibidora del complemento y afinidad por la diana mejoradas, incluyendo el derivado más potente, Cp40 (véase Qu et al., 2011, Mol Immunol 48:481-489; Qu et al., 2013, Immunobiology 218:496-505). Como describe Qu et al. (2013, citado anteriormente), Cp40 tiene una afinidad de unión subnanomolar por C3, casi 6.000 veces mayor que la del péptido parental y una semivida plasmática prolongada. Sin embargo, a pesar de su alta solubilidad en agua, Cp40 muestra menos solubilidad a pH fisiológico, limitando así las vías de administración que pueden utilizarse para suministrar cantidades eficaces de Cp40 además de provocar potencialmente una precipitación aumentada en el sitio de la inyección, dando como resultado irritación local o dolor en el paciente. Adicionalmente, un análogo de compstatina con alta solubilidad a pH fisiológico mejoraría su idoneidad para la administración tanto intravenosa como subcutánea, proporcionando esta última diversos beneficios sobre la inyección intravenosa, tal como reducir el costo de los sistemas sanitarios, reducir la frecuencia de administración, aumentar la comodidad y el cumplimiento terapéutico de los pacientes, y proporcionar más opciones para la autoadministración.
Se han utilizado modificaciones peptídicas para mejorar potenciar la solubilidad y prolongar la semivida de los compuestos in vivo. Sin embargo, tales modificaciones pueden disminuir la actividad y/o la unión del compuesto, lo que reduciría las características beneficiosas del compuesto. Se ha utilizado la PEGilación para potenciar fármacos con propiedades no convenientes, y estos compuestos PEGilados tienden a presentar una solubilidad aumentada. Sin embargo, la solubilidad mejorada conferida por la PEGilación puede tener un costo, ya que conservar la actividad farmacológica de estos compuestos modificados sigue siendo un desafío en algunos casos, limitando así el beneficio terapéutico de determinados compuestos (por ejemplo, véase Zhang et al., 2014, Expert Opin Drug Megab Toxicol 10:1691-1702). De hecho, aunque la PEGilación se ha aplicado satisfactoriamente para prolongar la semivida plasmática y la solubilidad de Cp40, se ha informado que un Cp40 acoplado a un mPEG(40k) presentó una disminución de más de 100 veces de la afinidad de unión por fragmentos de C3 y una caída en la actividad inhibidora (Risitano et al., 2014, Blood 123:2019-2101). Adicionalmente, con respecto a la depuración de fármacos in vivo, se ha informado que la depuración del PEG del organismo disminuye proporcionalmente al tamaño del PEG (véase, por ejemplo, Webster et al., 2007, Drug Metab & Dispos 35: 9-16).
En vista de lo anterior, está claro que el desarrollo de péptidos de compstatina modificados con mayor actividad, estabilidad in vivo, tiempo de permanencia en plasma, solubilidad y/o la biodisponibilidad, constituiría un avance significativo en la técnica.
Yijun Huang, Expert Opinion on Drug Discovery, 13, 435-444, (2018) se refieren a la evolución de la familia de las compstatinas como inhibidores del complemento terapéuticos. El documento divulga que la modulación de la activación del complemento se considera un enfoque prometedor para el tratamiento del daño tisular del hospedador en varias enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, y que la proteína C3 componente del complemento es una diana farmacológica atractivo para los inhibidores del complemento debido a su papel fundamental en tres rutas de la cascada de activación del complemento.
Aliana Lopez de Victoria et al., Chemical Biology & Drug Design, 77, 431-440, (2011) se refieren a una generación de potentes inhibidores del complemento de la familia de las compstatinas. El documento divulga que los péptidos de la familia de las compstatinas son inhibidores potentes del sistema del complemento y candidatos a fármacos prometedores contra enfermedades que implican una activación del complemento insuficientemente regulada. El documento divulga tres variantes de compstatina que tienen sustitución de triptófano en las posiciones 1 y/o 13.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona análogos del péptido inhibidor del complemento, la compstatina. En particular, se proporciona un análogo de compstatina con una modificación C-terminal y/o N-terminal que mejora la solubilidad del péptido sin provocar una reducción significativa en sus propiedades farmacocinéticas y, en algunos casos, confiriendo inesperadamente una estabilidad plasmática y en vítreo y/o una afinidad de unión por C3 y sus fragmentos potenciadas.
En un primer aspecto, la invención proporciona un péptido que consiste en la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.
En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el péptido y un transportador farmacéuticamente aceptable.
Preferentemente, la composición farmacéutica está formulada para su administración a un individuo por una vía seleccionada de: oral, intranasal, tópica, intraocular, periodontal, pulmonar, subcutánea, intramuscular e intravenosa.
Preferentemente, la composición farmacéutica está formulada para administración intravítrea, o administración gingival o inyección de infiltración intrapapilar.
Preferentemente, la composición comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y el péptido para su uso como medicamento.
Preferentemente, la composición es para su uso en el tratamiento del síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa), enfermedad por depósitos densos (EDD); glomerulonefritis C3 (GNC3); glomerulopatías C3; nefropatías mediadas por el complemento y enfermedades inflamatorias glomerulares; degeneración macular senil (DMS); trastorno ocular caracterizado por degeneración macular, neovascularización coroidea (NVC), neovascularización retiniana (NVR), vitreorretinopatía proliferativa, glaucoma, uveítis, inflamación ocular o cualquier combinación de estos; hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN); enfermedad por crioaglutininas (EC); anemias hemolíticas autoinmunitarias por anticuerpos calientes (las AHAAc); anemia drepanocítica; microangiopatías trombóticas asociadas a trasplantes; artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); enfermedades renales autoinmunitarias y autoinflamatorias; miocarditis autoinmunitaria; esclerosis múltiple; traumatismo craneoencefálico y medular; lesión por isquemia-reperfusión (IR) cerebral, intestinal y renal; aborto espontáneo y habitual; síndrome antifosfolipídico (SAP); enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; afecciones inflamatorias neurodegenerativas sustentadas por remodelación sináptica anómala, actividad de la microglía y deterioro cognitivo; asma; vasculitis pauciinmunitaria asociada a anti-antígeno citoplasmático y nuclear (síndrome de Wegener); enfermedades de la piel autoinmunitarias no lúpicas y epidermólisis ampollosa; choque postraumático; cáncer; periodontitis; gingivitis; ateroesclerosis; asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación alérgica, enfisema, bronquitis, bronquiectasia, fibrosis quística, tuberculosis, neumonía, síndrome de dificultad respiratoria (SDR) del recién nacido o del adulto, rinitis y sinusitis. Preferentemente, la composición está formulada para la administración por una vía y en una dosificación seleccionadas de:
(a) vía intravenosa o vía subcutánea a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,125 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, opcionalmente entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg;
(b) vía intramuscular a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, opcionalmente entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg; (c) vía intravítrea a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 10 mg, opcionalmente entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 2.000 pg;
(d) vía periodontal a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 1.000 pg, opcionalmente entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 200 pg; y
(e) vía oral a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 20 mg, opcionalmente entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 10 mg.
Preferentemente, la composición está formulada para su administración como dosis única.
Preferentemente, una primera porción de la composición se formula para administración por vía intravenosa o vía subcutánea a una primera dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,125 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, y una segunda porción de la composición se formula para administración: (i) por vía intramuscular a una segunda dosis de mantenimiento terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg; o (ii) por vía oral a una segunda dosis de mantenimiento terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg.
Otras características y ventajas de la presente invención se entenderán con referencia a la descripción detallada, los dibujos y los ejemplos que siguen.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1, panel a) representa la estructura general de Cp40 y las modificaciones N-terminal y C-terminal de Cp40. La fIg . 1, panel B) representa un sumario de diversas realizaciones de los análogos basados en Cp40 descritos en el presente documento. La FIG. 1, panel C) es un fragmento de los cromatogramas de UV-HPLC de Cp40 y sus análogos eluyendo entre 13,9 y 18,7 min.
La FIG. 2 es un sumario de los espectros de MALDI de los análogos basados en Cp40. La FIG. 2A muestra: panel a) mPEG(3k)-Cp40, panel b) mPEG(2k)-Cp40, panel c) mPEG(1k)-Cp40, panel d) mPEG(1056)-Cp40 y panel e) mPEG(528)-Cp40; La FIG. 2B muestra: panel a) Cp40, panel b) Cp40-K, panel c) Cp40-KK y panel d) Cp40-KKK.
La FIG. 3 ilustra la inhibición del complemento de la ruta clásica por análogos de compstatina ilustrativos medida por ELISA, mostrándose en cada gráfico Cp40 para una comparación. El eje de ordenadas representa el porcentaje de inhibición de la actividad del complemento y el eje de abscisas es la concentración del péptido. La FIG. 4 es un análisis cinético de Cp40 en comparación con Cp40 modificado en el extremo N o extremo C. Cada sensograma de RPS es el resultado del análisis de un ejemplo representativo de al menos tres experimentos de RPS de una titulación cinética de ciclo único de un péptido individual en cinco concentraciones (negro: datos de RPS procesados; gris: ajuste cinético al modelo de Langmuir 1:1).
La FIG. 5, perfiles de la unión de análogos basados en Cp40 ilustrativos a C3b, según lo evaluado mediante experimentos de RPS después del ajuste a un modelo de unión de Langmuir 1:1.
La FIG. 6 es una evaluación farmacocinética de Cp40 y de péptidos de Cp40 modificados ilustrativos en PNH. El panel a) representa un esquema de la administración de una dosis única de péptido mediante inyección s.c. en dos monos cinomolgos a tiempo cero (flecha vertical). Se inyectó Cp40 o un Cp40 modificado en cada animal (2 mg/kg; 8 mg netos) y se recogieron muestras de sangre en diversos momentos (gotas). El panel b) es un perfil farmacocinético de Cp40. El panel c) es un perfil farmacocinético de mPEG(3k)-Cp40. El panel d) es un perfil farmacocinético de Cp40-KK. El panel e) es un perfil farmacocinético de Cp40-KKK evaluado por análisis por UPLC-ESI-MS de las muestras plasmáticas de PNH. Los niveles de C3 en cada animal se muestran en los colores correspondientes como líneas de puntos.
La FIG. 7, paneles a) y b) muestra la cuantificación de Cp40-KK en las muestras de plasma de dos monos cinomolgos, según lo determinado mediante UPLC-ESI-MS. La FIG. 7, paneles c) y d) muestra la cuantificación de Cp40-KKK en las muestras de plasma de dos monos cinomolgos, según lo determinado mediante UPLC-ESI-MS. También se incluyen los fragmentos que se detectaron en las muestras de los individuos y la suma de los fragmentos detectados correspondientes a la cantidad total de péptido en cada muestra.
La FIG. 8 es un extracto de los cromatogramas superpuestos de intensidad de pico base (IPB) de Cp40-KKK añadida a plasma de primate no humano (PNH) a una concentración de 8 pM (línea continua) y los de cuatro muestras de plasma recolectadas a los 5 min (línea de trazos largos), 30 min (línea de puntos), 1 h (línea de trazos y puntos) y 2 h (línea de trazos cortos) después de la inyección s.c. de dosis única de Cp40-KKK 2 mg/kg en PNH
La FIG. 9 es un gráfico de la concentración plasmática de Cp40-KKK en monos cinomolgos después de tres inyecciones intravenosas de 2 mg/kg cada 48 horas. El eje de abscisas representa la concentración de péptido (pM) en plasma de PNH determinada por espectrometría de masas, y el eje de ordenadas representa el tiempo después de la inyección (horas). La línea de puntos representa los niveles promedio de C3 plasmática.
La FlG. 10 es un gráfico de la concentración plasmática de PNH de Cp40 en monos cinomolgos después de cuatro inyecciones subcutáneas de Cp402 mg/kg administradas a las 0, 8, 16 y 24 horas (panel a) o de Cp40 4 mg/kg administradas a las 0, 12, 24 y 36 horas (panel b). El eje de abscisas representa la concentración de péptido (pM) en plasma de PNH y el eje de ordenadas representa el tiempo después de la inyección (horas). Las líneas de puntos representan los niveles promedio de C3 plasmática.
La FlG. 11 muestra gráficos de concentración de los péptidos a lo largo del tiempo en monos cinomolgos a los que se les administró una única inyección intravenosa de 2 mg/kg de Cp40-KK (panel a), Cp40-KKK (panel b), mPEG(1k)-Cp40 (panel c) y mPEG(3k)-Cp40 (panel d). El eje de abscisas representa la concentración de péptido (nM) en plasma de PNH y el eje de ordenadas representa el tiempo después de la inyección (horas). La FlG. 12 es una cuantificación de fragmentos de escisión peptídica en el plasma de monos cinomolgos después de una única inyección intravenosa de 2 mg/kg de Cp40-KK (paneles a y b) o Cp40-KKK (paneles c y d). El eje de abscisas representa la concentración de péptidos (pM) en el plasma de PNH, según lo determinado por UPLC-ESI-MS, y el eje de ordenadas representa el tiempo tras la inyección (horas).
La FlG. 13 muestra la concentración de péptidos en plasma PNH procedente de monos cinomolgos a lo largo del tiempo después de una única inyección intramuscular de 100 mg de Cp40 (panel a), Cp40-KK (panel b) y Cp40-KKK (panel c). El eje de abscisas representa la concentración de péptidos (pM) en el plasma de PNH, según lo determinado por mS, y el eje de ordenadas representa el tiempo tras la inyección (días).
La FlG. 14 es un ensayo ELISA directo ilustrativo que muestra la especificidad de los anticuerpos para Cp40 y Cp40-KKK fijados en una placa ELISA. El anticuerpo para Cp40 (AB-101) reacciona con la muestra biológica que contiene el péptido Cp40 (círculo negro), pero con un título 10 veces menor para el péptido Cp40-KKK (cuadrado negro). Asimismo, el anticuerpo para Cp40-KKK (AB-102) reacciona con la muestra biológica que contiene el péptido Cp40-KKK (cuadrado no sombreado), pero con un título 10 veces menor para el péptido Cp40 (círculo no sombreado). El eje de ordenadas representa la lectura de DO a 405 nm, mientras que el eje de abscisas representa la dilución de antisuero.
La FlG. 15 es una curva patrón representativa de cinco puntos (panel a) y un gel de transferencia Western simple (panel B) obtenido al tras procesar cantidades predeterminadas de péptido Cp40-KKK añadido a muestras de vítreo de conejo. En el panel a), el eje de abscisas representa la concentración de péptido (nM) y el eje de ordenadas representa el área del pico.
La FlG. 16 representa un diagrama esquemático del método de RPS para la cuantificación de los análogos de Cp40 en líquidos biológicos. Las muestras de plasma se diluyeron y calentaron a 95 °C durante 5 min (n.° 3), seguido de centrifugación y adición de C3 o una fuente plasmática de C3 (n.° 4). A continuación, las muestras se hicieron pasar sobre el correspondiente chip con análogo de Cp40 inmovilizado (n.° 5).
La FlG. 17 es una curva patrón representativa obtenida mediante análisis por resonancia de plasmón superficial de muestras de vítreo de conejo a las que se les añadió cantidades predeterminadas de péptido Cp40-KKK. El eje de abscisas representa la concentración de péptido (nM) y el eje de ordenadas representa unidades de luz relativas.
La FlG. 18 representa la concentración de los compuestos mPEG(3k)-Cp40 (barra punteada), mPEG(1k)-Cp40 (barra cuadriculada), Cp40-KK (barra negra) y Cp40-KKK (barra blanca) detectados en las muestras de vítreo de monos cinomolgos tras una única inyección intravítrea. El eje de abscisas representa el número de días después de la inyección de 500 pg de compuesto y el eje de ordenadas representa la concentración de compuesto (nM). La FlG. 19 es un perfil de RPS de la unión de Cp40-KKK a C3b purificada. El panel a) es una curva patrón de control positivo que muestra la unión de C3b por Cp40-KKK añadido al vítreo de conejo a concentraciones de 2, 4, 8 y 16 nM. El eje de abscisas representa la concentración de péptido (nM) y el eje de ordenadas representa unidades de luz relativas. El panel b) muestra la señal de unión a C3b obtenida del vítreo del ojo de PNH al que se le ha inyectado Cp40-KKK. El eje de ordenadas representa las unidades de luz relativas. Las muestras de vítreo se sometieron a inactivación por calor (barra blanca) o no se sometieron a inactivación por calor (barra negra) antes de la inmovilización en el chip.
La FlG. 20 representa la inhibición de la ruta clásica del complemento en plasma de ojo humano incubado con Cp40 (panel a), Cp40-K (panel b), Cp40-KK (panel c) y Cp40-KKK (panel d) en presencia de vítreo de conejo (cuadrado) o ausencia de vítreo de conejo (círculo). El eje de abscisas representa la concentración de análogo (nM) y el eje de ordenadas representa el porcentaje de inhibición de la deposición de C3b.
La FlG. 21 es un sumario de la escisión de Lys in vivo e in vitro en Cp40-KK (panel a) y Cp40-KKK (panel b).
Descripción detallada de las realizaciones ilustrativas
Definiciones:
A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se utilizan diversos términos relacionados con los métodos y otros aspectos de la presente invención. A tales términos se les debe proporcionar su significado habitual en la técnica, a menos que se indique otra cosa. Otros términos definidos de manera específica deben interpretarse de manera concordante con la definición proporcionada en el presente documento.
En el presente documento se pueden usar las siguientes abreviaturas: Ac, grupo acetilo; BSA, seroalbúmina bovina; DCM, diclorometano; DMF, dimetilformamida; ELISA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; ESI, ionización por electronebulización; Fmoc, 9-fluorenilmetoxicarbonilo; MALDI-TOF-EM, espectrometría de masas de desorción ionización láser asistida por matriz; PNH, primate no humano; PBS, solución salina tamponada con fosfato; RP-HPCL, cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa; Sar, N-metilglicina; s.c., subcutáneo; RPS, resonancia de plasmón superficial; TFA, ácido trifluoroacético; UPLC-ESI-MS, cromatografía líquida de ultrarrendimiento-ionización por electropulverización-espectrometría de masas en tándem; VBS, solución salina tamponada con barbital; API, agua para inyección.
La forma singular de una palabra incluye el plural y viceversa, a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa. Las referencias a "un", "una" y "el/la" generalmente incluyen los plurales de los términos respectivos. Por ejemplo, las referencias a "un compuesto" o "un método" incluye una pluralidad de tales "compuestos" o "métodos". De forma similar, las palabras "comprender", "comprende", y "que comprende" deben interpretarse de manera inclusiva en lugar de exclusiva. Asimismo, las expresiones "incluir", "que incluye" y "o" deben interpretarse como inclusivas, a menos que tal construcción esté claramente prohibida a partir del contexto.
Las expresiones "que comprende" o "que incluye" pretende incluir realizaciones abarcadas por las expresiones "que consiste esencialmente en" y "que consiste en". De forma similar, la expresión "que consiste esencialmente en" pretende incluir realizaciones abarcadas por la expresión "que consiste en". Además, la expresión "consistente esencialmente en" limita el alcance de una realización a los componentes o etapas especificados y a aquellos componentes o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la realización.
El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones del ± 20 % o ± 10 %, en algunas realizaciones ±5 %, en algunas realizaciones ± 1 % y en algunas realizaciones ±0,1 % a partir del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para fabricar y utilizar los compuestos y composiciones divulgados.
El término "compstatina", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que comprende la SEQ ID NO: 1, I[CVVQDWGHHRC]T (C2-C12 cíclicos por medio de un enlace disulfuro indicado por los corchetes). La expresión "análogo de compstatina" se refiere a una compstatina modificada que comprende sustituciones de aminoácidos naturales y/o no naturales, o análogos de aminoácidos, así como modificaciones dentro o entre diversos aminoácidos, como se describe con mayor detalle en el presente documento y como se conoce en la técnica. Al referirse a la ubicación de aminoácidos o análogos particulares dentro de la compstatina o análogos de compstatina, las ubicaciones a veces se denominan "posiciones" dentro del péptido, numerándose las posiciones del 1 (Ile en la compstatina) al 13 (Thr en la compstatina). Por ejemplo, el resto Gly ocupa la "posición 8".
Las expresiones "farmacéuticamente activo" y "biológicamente activo" se refieren a la capacidad de los compuestos de la invención para unirse a C3 o a fragmentos del mismo e inhibir la activación del complemento. Esta actividad biológica puede medirse mediante uno o más de varios ensayos reconocidos en la técnica, como se describe con mayor detalle en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "alquilo" se refiere a un hidrocarburo recto, ramificado o cíclico saturado opcionalmente sustituido que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 átomos de carbono. Los grupos alquilo incluyen, pero no se limita a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclooctilo, adamantilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo y 2,3-dimetilbutilo. La expresión "alquilo inferior" se refiere a un hidrocarburo recto, ramificado o cíclico saturado opcionalmente sustituido que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo). Los grupos de alquilo inferior incluyen, pero no se limita a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, ciclopentilo, isopentilo y neopentilo.
Como se usa en el presente documento, "halo" se refiere a F, Cl, Br o I.
Como se usa en el presente documento, "alcanoílo", que puede usarse indistintamente con "acilo", se refiere a un resto acílico alifático recto o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 átomos de carbono. Los grupos de alcanoílo incluyen, pero no se limita a, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoílo, isopentanoílo, 2-metil-butirilo, 2,2-dimetilpropionilo, hexanoílo, heptanoílo, octanoílo y similares. La expresión "alcanoílo inferior" se refiere a un resto acílico alifático recto o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo. Los grupos de alcanoílo inferior incluyen, pero no se limita a, formilo, acetilo, n-propionilo, iso-propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoílo, iso pentanoílo y similares.
Como se usa en el presente documento, "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático mono- o bicíclico, opcionalmente sustituido, que tiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 carbonos. Los ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, fenilo y naftilo.
Como se usa en el presente documento, "aralquilo" se refiere a alquilo como se define anteriormente, que porta un sustituyente arilo y que tiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono. Los grupos aralquilo pueden estar opcionalmente sustituidos. Los ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, bencilo, naftilmetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, feniletilo y difeniletilo.
Como se usa en el presente documento, los términos "alcoxi" y "alcoxilo" se refieren a un grupo alquil-O opcionalmente sustituido en donde el alquilo es como se define anteriormente. Los grupos alcoxi y alcoxilo ilustrativos incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi y heptoxi, entre otros.
Como se usa en el presente documento, "carboxilo" se refiere a un grupo -C(=O)OH.
Como se usa en el presente documento, "alcoxicarbonilo" se refiere a un grupo -C(=O)O-alquilo, en que el alquilo es como se define anteriormente.
Como se usa en el presente documento, "aroílo" se refiere a un grupo -C(=O)-arilo, en donde el arilo es como se define anteriormente. Los grupos aroílo ilustrativos incluyen benzoílo y naftoílo.
Normalmente, las fracciones químicas sustituidas incluyen uno o más sustituyentes que sustituyen al hidrógeno en ubicaciones seleccionadas en una molécula. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, halo, alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo, sulfhidrilo, hidroxilo (-OH), alcoxilo, ciano (-CN), carboxilo (-COOH), acilo (alcanoílo: -C(=O)R); -C(=O)O-alquilo, aminocarbonilo (-C(=O)NH2), aminocarbonilo N-sustituido (-C(=O)NHR"), CF3 , CF2CF3 y similares. En relación con los sustituyentes mencionados anteriormente, cada fracción R" puede ser, independientemente, cualquiera de H, alquilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo, por ejemplo.
Como se usa en el presente documento, "L-aminoácido" se refiere a cualquiera de los alfa-aminoácidos levógiros de origen natural normalmente presentes en proteínas o los ésteres de alquilo de los alfa-aminoácidos. La expresión "D-aminoácido" se refiere a alfa-aminoácidos dextrógiros. A menos que se especifique otra cosa, todos los aminoácidos a los que se hace referencia en el presente documento son L-aminoácidos.
"Hidrófobo" o "no polar" se usan como sinónimos en el presente documento y se refieren a cualquier interacción intermolecular o intramolecular no caracterizada por un dipolo.
"PEGilación" se refiere a la reacción en la que al menos una fracción de polietilenglicol (PEG), independientemente del tamaño, se une químicamente a una proteína o péptido para formar un conjugado de PEG-péptido. "PEGilado" significa que al menos una fracción de PEG, independientemente del tamaño, se une químicamente a un péptido o proteína. El término PEG generalmente va acompañado de un sufijo numérico que indica el peso molecular promedio aproximado de los polímeros de PEG; por ejemplo, PEG-8000 se refiere a polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 8.000 Dalton (o g/mol).
"Monodisperso" se refiere a un polímero compuesto por moléculas que tienen longitudes de cadena de aproximadamente la misma masa.
"Polidisperso" se refiere a un polímero compuesto de moléculas que tienen longitudes de cadena en un intervalo de masas moleculares, en que la masa se indica normalmente por el peso molecular promedio.
Como se usa en el presente documento, "sales farmacéuticamente aceptables" o "ésteres farmacéuticamente aceptables" se refieren a derivados de los compuestos divulgados en donde el compuesto parental se modifica creando un éster o una forma de sal ácida o básica, que es compatible con cualquier otro ingrediente de la composición farmacéutica, y que no es perjudicial para el sujeto al que se va a administrar la composición. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limita a, sales de ácidos minerales u orgánicos de restos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de restos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Por tanto, la expresión "sal de adición de ácido" se refiere al correspondiente derivado de sal de un compuesto parental que se ha preparado mediante la adición de un ácido. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto parental formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Por ejemplo, tales sales convencionales incluyen, pero no se limita a, las obtenidas a partir de ácidos inorgánicos, tales como, clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos, tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico, isetiónico y similares. Determinados compuestos ácidos o básicos de la presente invención pueden existir en forma de zwiteriones. Todas las formas de los compuestos, incluido ácido libre, base libre y zwiteriones, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, la expresión "fluidos farmacéuticamente adecuados" o "líquidos farmacéuticamente adecuados", especialmente con referencia a la solubilidad de los compuestos de la invención, pero no se limita a ello, se refiere colectivamente a fluidos que incluyen, pero no se limita a, tampones y otras soluciones acuosas que tienen un pH fisiológico, así como disolventes no acuosos y medios líquidos comúnmente utilizados para la preparación y suministro de fármacos al organismo por diversas vías, tal como se describe en el presente documento. Dichos disolventes no acuosos y medios líquidos incluyen: disolventes orgánicos polares próticos y/o apróticos no acuosos tales como alcoholes inferiores, metil y vinilpirrolidonas tales como polivinilpirrolidona, metilsulfonil metano, dimetilsulfóxido y compuestos relacionados, hidroxi y polihidroxiácidos tales como ácido poliláctico, entre otros. Esta expresión puede utilizarse indistintamente con la expresión "disolventes clínicamente importantes".
Como se usa en el presente documento, la expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" significa una composición química con la que se puede combinar un análogo de compstatina y que, después de la combinación, puede utilizarse para administrar el análogo de compstatina a un individuo.
Como se usa en el presente documento, "administración intraocular" o "administración ocular" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la introducción en el ojo, incluyendo "administración intravítrea". La expresión "administración intravítrea" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la introducción en la cavidad vítrea del ojo. El "vítreo" es una sustancia gelatinosa dentro de la cavidad vítrea que llena el espacio entre el cristalino y la retina y ayuda al ojo a mantener su forma.
Como se usa en el presente documento, "administración intramuscular" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la introducción en los músculos.
Como se usa en el presente documento, "administración periodontal" de una composición farmacéutica se refiere a la administración dentro de los tejidos que rodean y/o alrededor de un diente o dientes (por ejemplo, mediante inyección, aplicación tópica o implante biodegradable), e incluye "administración gingival" e "infiltración intrapapilar". Como se usa en el presente documento, "administración gingival" de una composición farmacéutica se refiere a e incluye cualquier vía de administración caracterizada por la introducción en o dentro de la encía o encías. La "infiltración intrapapilar" o "inyección de infiltración intrapapilar" es un tipo de administración gingival que se refiere a la administración de una composición farmacéutica en la papila interdental, que es el tejido gingival (encía) que existe coronal al margen gingival libre en las superficies bucal y lingual de los dientes.
Como se usa en el presente documento, "administración oral" o "administración entérica" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la introducción en el tubo digestivo. La "administración oral" incluye la alimentación por la boca, así como la sonda orogástrica o intragástrica. "Administración oral" o "administración entérica" también puede incluir administración sublingual, bucal, intranasal, pulmonar o rectal, entre otras vías conocidas en la técnica.
Como apreciará el experto en la materia, "pH fisiológico" normalmente se refiere al pH de la sangre humana, que se mantiene entre 7,35 y 7,45. Como se usa en el presente documento, la expresión incluye "pH fisiológico incluye un intervalo de pH de 7,3 a 7,5.
La expresión "que trata" se refiere a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejoría de la enfermedad o afección. El tratamiento puede incluir, por ejemplo, reducir o aliviar la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad o afección, o puede incluir reducir la frecuencia con la que los síntomas de una enfermedad, defecto, trastorno o afección adversa, y similares, se experimentan por un individuo, tal como un paciente humano.
La expresión "que previene" se refiere a la prevención de la enfermedad o afección en un individuo, tal como un paciente humano. Por ejemplo, si se trata a un individuo en riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria con los compuestos y/o utilizando los métodos de la presente invención y no desarrolla posteriormente la enfermedad o afección, entonces la enfermedad se ha prevenido en ese individuo.
La expresión "tratar o prevenir" se usa en ocasiones en el presente documento para referirse a un método que da como resultado algún nivel de tratamiento o mejoría de la enfermedad o afección, y contempla una gama de resultados dirigidos a ese fin, incluyendo, pero no restringido a, la prevención de la afección por completo.
El término "parámetro", como se usa en el presente documento, se refiere a la medición de cualquier función corporal que sea observable o medible mediante técnicas de medición adecuadas disponibles en la técnica. Como apreciará un experto en la materia, la medición de uno o más "parámetros" de la función corporal puede utilizarse para detectar una disfunción particular en comparación con los parámetros normales promedio y también puede utilizarse para determinar si esa función corporal ha mejorado después o durante el tratamiento. Dichos parámetros pueden ser generales, por ejemplo, la temperatura corporal, la tensión arterial, el pulso (frecuencia cardíaca) y la frecuencia respiratoria (tasa respiratoria), o pueden ser específicos de un órgano, tejido o enfermedad o afección en particular, por ejemplo, los resultados de pruebas funcionales de sangre u otros órganos/tejidos.
Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz" es la cantidad de una composición farmacéutica suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al individuo al que se administra la composición farmacéutica.
Descripción:
La presente invención tiene su origen, en parte, a partir del desarrollo por parte de los inventores de análogos de la compstatina que presentan una solubilidad aumentada y parámetros farmacocinéticos mejorados. La modificación de la compstatina o del análogo de compstatina con polímeros pequeños (por ejemplo, de aproximadamente 3000 Da o menos) en el extremo N da como resultado análogos de compstatina con solubilidad mejorada en disolventes de importancia clínica mientras que, al mismo tiempo, tienen una actividad inhibidora del complemento similar a la del compuesto parental no modificado en condiciones equivalentes. Son especialmente adecuados los polietilenglicoles (p Eg ) polidispersos, y particularmente monodispersos, con un peso molecular promedio de ~500-3.000 Da.
Adicionalmente, la modificación de la compstatina o análogo de compstatina en el extremo N o en el extremo C con la adición de uno o más restos de aminoácidos hidrófilos cargados, tales como lisina, puede conferir propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, solubilidad aumentada) a la compstatina o al análogo de compstatina. Por ejemplo, en el presente documento se describen modificaciones de la compstatina o del análogo de compstatina en el extremo C con la adición de uno o más restos hidrófilos cargados (por ejemplo, lisina), lo que no solo aumenta la solubilidad del péptido, sino que potencia inesperadamente el tiempo de permanencia y la afinidad de unión del análogo de compstatina por C3 o sus fragmentos. La evaluación farmacocinética del análogo de compstatina Cp40 modificado en primates no humanos reveló valores de semivida plasmática para los péptidos Cp40 modificados similares o incluso superiores a los del análogo basado en Cp40 no modificado. Por tanto, los presentes análogos de compstatina presentan perfiles farmacocinéticos mejorados, así como una solubilidad mejorada a pH fisiológico.
Por tanto, una modificación descrita en el presente documento comprende añadir un componente al extremo C de la compstatina (Ile-Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-His-His-Arg-Cys-Thr (C2-C12 cíclico) (SEQ ID NO: 1), o cualquier análogo del mismo como se describe con más detalle a continuación, que mejora la solubilidad del péptido a pH fisiológico, al tiempo que mantiene una afinidad de unión a C3, una semivida plasmática y/o una actividad inhibidora del complemento similares a las del péptido parental no modificado en condiciones equivalentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se añaden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos hidrófilos y/o cargados (por ejemplo, Arg o Lys) al extremo C. En algunas realizaciones, se añaden dos o más restos de aminoácidos hidrófilos y/o cargados al extremo C del análogo de compstatina. En otras realizaciones, se añaden tres o más restos de aminoácidos hidrófilos/cargados al extremo C del análogo de compstatina. En realizaciones particulares, el resto de aminoácido hidrófilo/cargado es Lys, Arg o una combinación de los mismos. En una realización más preferida, se añaden uno o más restos de aminoácido lisina al extremo C del análogo de compstatina o análogo de compstatina. Por ejemplo, en una realización ilustrativa descrita con más detalle a continuación, se añaden uno o más restos de aminoácidos lisina al extremo C del análogo de compstatina Cp40.
Las realizaciones ilustrativas de la invención presentan el análogo de compstatina Cp40, en el que se añaden dos o más restos de aminoácidos lisina al extremo C. Como se describe con más detalle a continuación y en los ejemplos, los inventores han descubierto que Cp40-KK y Cp40-KKK no solo presentan una solubilidad aumentada en comparación con Cp40 no modificado, sino que, sorprendentemente, presentan una retención aumentada en plasma y vítreo, y una unión a C3 potenciada en comparación con Cp40 y otros análogos basados en Cp40. De hecho, Cp40-KKK presenta in vivo tiempos de permanencia iguales o superiores a tres meses tras la administración intravítrea. Notablemente, los análogos Cp40-KK y Cp40-KKK presentan propiedades farmacocinéticas marcadamente mejoradas en comparación con Cp40.
Otra modificación en conformidad con la presente invención comprende añadir un componente a uno o ambos extremos N o C de la compstatina o análogos de la misma que mejora la solubilidad del péptido a pH fisiológico, al tiempo que mantiene una afinidad de unión a C3, una semivida plasmática y/o una actividad inhibidora del complemento similares a las del péptido parental no modificado en condiciones equivalentes. En realizaciones particulares, el componente añadido es la adición de un polímero corto, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) con una longitud de cadena más corta que los PEG que se han utilizado anteriormente. El PEG utilizado en conformidad con la presente invención tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 a aproximadamente de 5.000, por ejemplo, de 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900, 3.000, 3.100, 3.200, 3.300, 3.400, 3.500, 3.600, 3.700, 3.800, 3.900, 4.00, 4.100, 4.200, 4.300, 4.400, 4.500, 4.600, 4.700, 4.800, 4.900 o 5.000. En realizaciones preferidas, los PEG tienen un peso molecular promedio de menos de 5.000. En una realización, el análogo de compstatina se modifica en uno o ambos extremos para incluir PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000 Da. En otra realización, el PEG tiene un intervalo de peso molecular promedio de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 3.000 Da. En una realización ilustrativa, el análogo basado en Cp40 se modifica para incluir un PEG N-terminal con un peso molecular promedio de aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000 Da.
La modificación del polímero puede ser un PEG monodisperso o un PEG polidisperso unido covalentemente a la compstatina o a un análogo de compstatina. Por ejemplo, en una realización, la modificación terminal es un PEG monodisperso que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.000. En otras realizaciones, la modificación es un PEG polidisperso que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 3.000. El PEG monodisperso es particularmente adecuado para su uso en la presente invención debido a que facilita la purificación de los compuestos hasta la homogeneidad al permitir la recolección de los compuestos PEGilados a partir de un pico sustancialmente único (véase, por ejemplo, la Fig. 2A, paneles a-c, en comparación con los paneles d y e).
La compstatina y los análogos de compstatina de la presente invención se pueden unir covalentemente a PEG a través de un grupo de unión. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica. (Revisado en Kozlowski A. et al., 2001, BioDrugs NM: 419-29; véase también, Harris JM y Zalipsky S, eds. Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680 (1997)). Los ejemplos no limitantes de grupos de unión aceptables incluyen un grupo éster, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un hidrato de carbono, un grupo succinimida (que incluye, entre otros, succinimidil succinato (SS), succinimidil propionato (SPA), succinimidil carboximetilato (SCM), succinimidil succinamida (SSA) y N-hidroxisuccinimida (NHS)), un grupo epóxido, un grupo oxicarbonilimidazol (que incluye, pero sin limitación, carbonildimidazol (CDI)), un grupo nitrofenilo (que incluye, pero sin limitación, nitrofenil carbonato (NPC) o triclorofenil carbonato (TPC)), un grupo trisilato, un grupo aldehído, un grupo isocianato, un grupo vinilsulfona, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina o una amina primaria. En determinadas realizaciones, el grupo de unión es un grupo succinimida. En una realización, el grupo de unión es NHS.
La compstatina y los análogos de compstatina de la presente invención se pueden acoplar alternativamente directamente a PEG (es decir, sin un grupo de unión) a través de un grupo amino, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo. En una realización, el PEG se acopla a un resto de lisina añadido al extremo C de la compstatina. En una realización particular, el PEG se acopla a la compstatina o al extremo N del análogo de compstatina a través de un enlace amida.
En algunas realizaciones, una modificación de la compstatina o un análogo de compstatina comprende tanto la PEGilación como la adición de uno o más restos de aminoácidos hidrófilos o cargados al extremo C. En algunas de estas realizaciones, El PEG se acopla directamente a la compstatina o al extremo N del análogo de compstatina a través de un enlace amida y el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500 a aproximadamente 3.000, o un peso molecular real en ese intervalo, si es monodisperso. En algunas de estas realizaciones, uno o más restos de lisina están unidos covalentemente al extremo C.
En realizaciones ilustrativas que utilizan PEG (pm 500-3.000 DA) como polímero y lisina como resto cargado, se pueden seleccionar diversas disposiciones de los componentes como se indica a continuación (en donde "Comp A" significa "análogo de compstatina"):
PEG-Comp A
Comp A-Lys(1-3)
PEG-Comp A-Lys(i-3)
Comp A-LyS(1-3)-PEG
PEG-Comp A-LyS(1-3)-PEG
Los pesos moleculares de estos análogos de compstatina modificados se pueden aumentar o disminuir cambiando el tamaño del PEG. El experto en la materia también apreciará la diversidad de PEG disponibles en el mercado, incluyendo PEG polidisperso, PEG monodisperso, PEG heterobifuncional y ramificado (véase, por ejemplo, Creative PEGWorks, Chapel Hill, NC; XL-Protein Gm Bh , Frisinga, Alemania; BroadPharm, San Diego, CA)
Si el extremo N del análogo de compstatina no se modifica con un polímero (es decir, la disposición en la serie ilustrativas anterior es Comp A-Lys(1.3) o Comp A-Lys(1_3)-PEG), entonces el extremo N puede modificarse de otra manera. Por ejemplo, puede unirse al extremo N una molécula pequeña de unión a albúmina (por ejemplo, ABM2). Una realización particular de este tipo presenta el análogo de compstatina Cp40 que comprende 1-3 restos cargados (por ejemplo, Lys) unidos al extremo C y ABM2 unido al extremo N a través de un enlace amida.
Las modificaciones N-terminal y/o C-terminal descritas en el presente documento aumentan la solubilidad de la compstatina o del análogo de compstatina en los fluidos a un pH de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,5 en comparación con el péptido no modificado en condiciones equivalentes. En determinadas realizaciones, el aumento de la solubilidad es de al menos aproximadamente 5 veces. En una realización particular, el aumento de la solubilidad es de al menos aproximadamente 10 veces, o al menos aproximadamente 20 veces, o al menos aproximadamente 30 veces, o al menos aproximadamente 40 veces, o al menos aproximadamente 50 veces, o al menos 100 veces, 150 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces o incluso 500 veces o más, en comparación con el péptido equivalente, pero no modificado, en condiciones equivalentes. Adicionalmente, en aspectos particulares, la compstatina o los análogos de compstatina que contienen las modificaciones N-terminal y/o C-terminal descritas en el presente documento presentan una disminución de menos de aproximadamente 2 veces en la actividad inhibidora del complemento en comparación con el péptido no modificado en condiciones equivalentes. Adicionalmente, en realizaciones preferidas, la compstatina o los análogos de compstatina que contienen las modificaciones N-terminal y/o C-terminal descritas en el presente documento presentan una disminución de menos de aproximadamente 5 veces en la afinidad de unión a C3 en comparación con el péptido no modificado en condiciones equivalentes. En algunos aspectos, la compstatina o los análogos de compstatina que contienen las modificaciones N-terminal y/o C-terminal descritas en el presente documento presentan una disminución de menos de aproximadamente 10 veces en la afinidad de unión a C3 en comparación con el péptido no modificado en condiciones equivalentes. En otros aspectos, la compstatina o los análogos de compstatina que contienen las modificaciones N-terminal y/o C-terminal descritas en el presente documento presentan un aumento de la afinidad de unión a C3 en comparación con el péptido no modificado en condiciones equivalentes.
Como ejemplo ilustrativo, mientras que la modificación N-terminal de Cp40 por conjugación de mPEG dio como resultado una disminución de ~3 a 6 veces en la constante de asociación (ka) con su ligando, C3, no se observó variación significativa en la constante de disociación (kd) en comparación con el compuesto parental, Cp40. Los valores más bajos de ka se reflejaron en valores de afinidad más bajos, especialmente para los análogos que portan cadenas de PEG más grandes (mPEG(3k)-Cp40, 7,9 nM; mPEG(2k)-Cp40, 4,4 nM), en comparación con Cp40 (KD, 0,5 nM). La aparente menor afinidad, sin embargo, no afectó significativamente la actividad inhibidora del complemento de los análogos (véase la Tabla 3 en los Ejemplos). De forma similar, la adición de restos Lys a Cp40 no influyó significativamente en ninguno de los parámetros bioquímicos mencionados anteriormente, lo que indica que las modificaciones elegidas no indujeron cambios importantes en la interacción entre los análogos y su ligando, C3 (Tabla 3). Se enfatiza aquí que la Kd de disociación es de gran importancia para el tiempo de permanencia del compuesto.
Las modificaciones C- y/o N-terminal descritas en el presente documento pueden aplicarse a la propia compstatina o a cualquier análogo de la misma. Los ejemplos no limitantes de análogos de compstatina adecuados para su uso con las modificaciones N-terminal y/o C-terminal divulgadas en el presente documento se describirán ahora con mayor detalle.
Análogos de compstatina
Las modificaciones N-terminal y C-terminal descritas anteriormente pueden combinarse con otras modificaciones de la compstatina que anteriormente mostraron mejorar la actividad, produciendo de este modo péptidos con una actividad inhibidora del complemento significativamente mejorada. Por ejemplo, en realizaciones en donde el extremo N no está PEGilado, el extremo N puede estar acetilado. Adicionalmente, se sabe que la sustitución de His por Ala en la posición 9 mejora la actividad de la compstatina y también es una modificación preferida de los péptidos de la presente invención.
En los documentos WO2004/026328 y WO2007/062249 se divulgó que Trp y determinados análogos de Trp en la posición 4, así como determinados análogos de Trp en la posición 7, especialmente combinado con Ala en la posición 9, producen una actividad mucho mayor que la de la compstatina. Estas modificaciones también se utilizan con ventaja en la presente invención.
En particular, los péptidos que comprenden 5-fluorotriptófano o 5-metoxi-, 5-metil- o 1 -metil-triptófano, o 1-formiltriptófano en la posición 4, se ha demostrado que poseen una actividad mucho mayor que la compstatina no modificada. Son particularmente preferidos 1-metil y 1-formil triptófano. Se cree que un enlace de hidrógeno mediado por 'N' de indol no es necesario en la posición 4 para la unión y la actividad de la compstatina. La ausencia de este enlace de hidrógeno o la reducción del carácter polar al sustituir el hidrógeno por un alquilo inferior, alcanoílo o nitrógeno de indol en la posición 4 potencia la unión y la actividad de la compstatina. En determinadas realizaciones, Trp en la posición 4 de la compstatina se sustituye por un análogo que comprende un sustituyente 1 -alquilo, más particularmente un sustituyente alquilo inferior (por ejemplo, C1-C5) como se define anteriormente. Estos incluyen, pero no se limita a, N(D) metiltriptófano and 5-metiltriptófano. En otras realizaciones, Trp en la posición 4 de la compstatina se sustituyente por un análogo que comprende un sustituyente 1-alcanoílo, más particularmente un sustituyente alcanoílo inferior (por ejemplo, C1-C5) como se define anteriormente, por ejemplo, N(a) formil triptófano, 1 -acetil-L-triptófano y L-p-homotriptófano.
En el documento WO2007/062249 se divulga que la incorporación de 5-fluoro-triptófano en la posición 7 de la compstatina aumentó la entalpía de la interacción entre el análogo de compstatina resultante y C3, con respecto a la compstatina, mientras que la incorporación de 5-fluoro-triptófano en la posición 4 disminuyó la entalpía de esta interacción. Por consiguiente, las modificaciones de Trp en la posición 7, como se describe en el documento WO2007/062249, se contemplan como modificaciones útiles en combinación con las modificaciones N-terminales descritas anteriormente.
Un análogo de compstatina ilustrativo descrito en el documento WO2007/062249 es:
Xaa1 - Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (C2-C12 cíclico) (SEQ ID NO: 2); en donde:
Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile;
Xaa2 es Trp o un análogo de Trp, en donde el análogo de Trp tiene un carácter hidrófobo aumentado en comparación con Trp, con la condición de que, si Xaa3 es Trp, Xaa2 es el análogo de Trp;
Xaa3 es Trp o un análogo de Trp que comprende una modificación química de su anillo de indol en donde la modificación química aumenta el potencial de enlace de hidrógeno del anillo de indol;
Xaa4 es His, Ala, Phe o Trp;
Xaa5 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipéptido que comprende Thr-Asn, o un dipéptido que comprende Thr-Ala, o un tripéptido que comprende Thr-Ala-Asn, en donde un -OH carboxilo terminal de cualquiera de los L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly o Asn se sustituye opcionalmente por -NH2 ; y
los dos restos Cys están unidos por un enlace disulfuro.
En diversas realizaciones, el análogo de Trp de Xaa2 es un Trp halogenado, tal como 5-fluoro-/-triptófano o 6-fluoro-/-triptófano. En otras realizaciones, el análogo de Trp en Xaa2 comprende un sustituyente alcoxi inferior o alquilo inferior en la posición 5, por ejemplo, 5-metoxitriptófano o 5-metiltriptófano. En otras realizaciones, el análogo de Trp en Xaa 2 comprende un sustituyente alquilo inferior o alcanoílo inferior en la posición 1, con realizaciones ilustrativas que comprenden 1-metiltriptófano o 1 -formiltriptófano. En otras realizaciones, el análogo de Trp de Xaa3 es un Trp halogenado tal como 5-fluoro-l-triptófano o 6-fluoro-l-triptófano.
En determinadas realizaciones, Xaa2 comprende un sustituyente alcanoílo inferior o alquilo inferior en la posición 1 del triptófano, Xaa3 comprende opcionalmente un triptófano halogenado y Xaa4 comprende Ala.
Otras clases de análogos de compstatina con diversas modificaciones en las SEQ ID NO: 1 y 2 se describe en el documento WO2010/127336. Una modificación divulgada en ese documento comprende una restricción de la estructura principal peptídica en la posición 8 del péptido. En una realización particular, la estructura principal se restringe al sustituir la glicina en la posición 8 (Gly8) por N-metilglicina. Otra modificación divulgada en el documento comprende la sustitución de Thr en la posición 13 por Ile, Leu, Nle (norleucina), N-metil Thr o N-metil Ile. Esta clase de análogos está representada por la secuencia:
Xaa1 - Cys - Val - Xaa2 - Gln - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (C2-C12 cíclico) (SEQ ID NO: 3) en la que Gly en la posición 8 se modifica para restringir la conformación de la estructura principal peptídica en esa ubicación, y en donde:
Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile;
Xaa2 es Trp o un análogo de Trp, en donde el análogo de Trp tiene un carácter hidrófobo aumentado en comparación con Trp;
Xaa3 es Trp, o un análogo de Trp que comprende una modificación química de su anillo de indol en donde la modificación química aumenta el potencial de enlace de hidrógeno del anillo de indol;
Xaa4 es His, Ala, Phe o Trp; y
Xaa5 es Thr, Ile, Leu, Nle, N-metil Thr o N-metil Ile, en donde un -OH carboxilo terminal de cualquiera de los Thr, Ile, Leu, Nle, N-metil Thr o N-metil Ile se sustituye opcionalmente por -NH2.
En realizaciones de esta clase de análogo, el análogo de Trp en Xaa2 comprende un sustituyente alcoxi inferior o alquilo inferior en la posición 5, por ejemplo, 5-metoxitriptófano o 5-metiltriptófano; o un sustituyente alquilo inferior o alcanoílo inferior en la posición 1, con realizaciones ilustrativas que comprenden 1-m eti ltri ptófa n o o 1 -formiltri ptófano. En otras realizaciones, el análogo de Trp de Xaa3 es un triptófano halogenado tal como 5-fluoro-l-triptófano o 6-fluoro-l-triptófano.
En determinadas realizaciones de esta clase de análogo, la Gly en la posición 8 está N-metilada y Xaa1 es Ac-Ile, Xaa2 es 1-metil-Trp o 1-formil-Trp, Xaa3 es Trp, Xaa4 es Ala, y Xaa5 es Thr, Ile, Leu, Nle, N-metil Thr o N-metil Ile. En particular, Xaa5 puede ser Ile, N-metil Thr o N-metil Ile. En particular, el análogo de compstatina comprende el análogo Cp20: Ac-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2 (SEQ ID NO: 4)
Otro tipo de modificación de los análogos de compstatina se describe en el documento WO2012/040259. Una de tales modificaciones comprende la sustitución del enlace disulfuro C2-C12 con la adición de un CH2 para formar una homocisteína en C2 o C12, y la introducción de un enlace tioéter, para formar una cistationina, tal como una gammacistationina o una delta-cistationina. Otra modificación comprende la sustitución del enlace disulfuro C2-C12 por un enlace tioéter sin la adición de un CH2 , formando de este modo una lantitionina. Los análogos que comprenden el enlace tioéter demuestran una actividad que es sustancialmente la misma que la de determinados análogos con enlaces disulfuro y también poseen características de estabilidad equivalentes o mejoradas.
En el documento WO2013/036778 se describe otra clase de análogos de compstatina particularmente adecuados como armazones peptídicos para las modificaciones C-terminales o N-terminales de la presente invención para producir compuestos novedosos con nuevas propiedades farmacocinéticas. Esta clase de análogos está representada por la secuencia de aminoácidos Xaa1-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8 (SEQ ID NO: 5), en la que la Gly entre Xaa5 y Xaa6 se modifica opcionalmente para restringir la conformación de la estructura principal;
en donde Xaa1 está ausente o es Tyr, D-Tyr o Sar;
Xaa2 es Ile, Gly o Ac-Trp;
Xaa3 es Trp o un análogo de Trp, en donde el análogo de Trp tiene un carácter hidrófobo aumentado en comparación con Trp;
Xaa4 es un Asp o Asn;
Xaa5 es Trp o un análogo de Trp que comprende una modificación química de su anillo de indol en donde la modificación química aumenta el potencial de enlace de hidrógeno del anillo de indol;
Xaa6 es His, Ala, Phe o Trp;
Xaa7 es Arg u Orn; y
Xaa8 es Thr, Ile, Leu, Nle, N-metil Thr o N-metil Ile, en donde un - OH carboxilo terminal de cualquiera de los Thr, Ile, Leu, Nle o N-metil Thr, o N-metil Ile se sustituye opcionalmente por - NH2 , y el péptido es cíclico a través de un enlace Cys-Cys o tioéter.
El análogo de Trp de Xaa3 puede ser un triptófano halogenado, tal como 5-fluoro-l-triptófano o 6-fluoro-l-tri ptófano. El análogo de Trp en Xaa3 puede comprender un sustituyente alcoxi inferior o alquilo inferior en la posición 5, por ejemplo, 5-metoxitriptófano o 5-metiltriptófano. En otras realizaciones, el análogo de Trp en Xaa3 comprende un sustituyente alquilo inferior o alcanoílo inferior en la posición 1, con realizaciones ilustrativas que comprenden 1-metiltriptófano o 1 -formil-triptófano. En otras realizaciones, el análogo de Trp de Xaa5 es un triptófano halogenado tal como 5-fluoro-1-triptófano o 6-fluoro -1 -triptófano. En algunas realizaciones, la Gly entre Xaa5 y Xaa6 se sustituye por una Na-metil Gly (Sar).
Se hace referencia a los análogos de compstatina ilustrativos de esta clase expuestos a continuación:
Cp30:
Sar-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2
(SEQ ID NO: 6)
Cp40:
DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2
(SEQ ID NO: 7)
Como se describe en los ejemplos en el presente documento, los análogos modificados de forma N- y C-terminal ilustrativos en conformidad con la presente invención se prepararon modificando el análogo Cp40.
_________________ Tabla 1. Análogos modificados en el extremo C basados en Cp40._________________ Análogo_____ Secuencia*__________________________________________________________Seq. Id. N.° Cp40** DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2 7
Cp40-K DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-Lys-NH2 8
Cp40-KK DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-Lys-Lys-NH2 9
Cp40-KKK DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys1-mIle-Lys-Lys-Lys-NH2 10________ *Los corchetes indican un enlace Cys-Cys.
**Cp40 se muestra para comparación.____________________________________________________________
La PEGilación o la adición de restos Lys aumentó la solubilidad de Cp40 a pH fisiológico. De manera simultánea, la actividad inhibitoria de Cp40 de C3 favorable no se vio afectada por las modificaciones y, sorprendentemente, la afinidad de unión de los derivados de Lys hacia C3 fue incluso más fuerte que la del compuesto parental Cp40. Además, las variantes de Cp40 mostraron semividas similares o prolongadas tras la administración subcutánea, intravenosa, intravítrea y/o intramuscular en primates no humanos, al tiempo que las concentraciones de C3 se saturaron durante un período de tiempo prolongado cuando se utilizaron las variantes de Cp40.
Los compuestos más prometedores de los evaluados como se describe en los Ejemplos, llamados mPEG(3k)-Cp40, Cp40-KK y Cp40-KKK, mostraron una mejora drástica en su solubilidad (>200 veces) en comparación con el péptido parental, Cp40. Lo que es más importante, los análogos novedosos mantuvieron la actividad inhibitoria y mostraron perfiles farmacocinéticos mejorados en comparación con Cp40. Los estudios in vivo en los que se administró s.c. a primates no humanos 2 mg/kg de los análogos individuales indicaron que mPEG(3k)-Cp40 tenía una cmáx más alta (~2 veces), un mayor tiempo de saturación de C3 (~34 h), una ti/2 ligeramente extendida en ~15 h, un ABCo-t aumentado (~2,7 veces) y una CL/F disminuido (-3 veces) en comparación con el compuesto Cp40. Entre los análogos con restos adicionales de Lys, Cp40-KKK parecía ser el candidato con las características más potenciadas. Este efecto fue incluso más pronunciado cuando se administró Cp40-KKK mediante múltiples inyecciones s.c. Los estudios farmacocinéticos in vivo mostraron que la administración s.c. de Cp40-KKK se asoció con una mayor Cmáx (~2 veces), un mayor tiempo de saturación de C3 (~42 h), una ABCo-t aumentada (~2,6 veces) y una CL/F disminuida (~3 veces) en comparación con Cp40. Los estudios farmacocinéticos adicionales de los análogos individuales mostraron que después de una única inyección i.v., Cp40-KKK presentó un valor de ABC0-120 h que fue más de 3,5 veces mayor que Cp40-KK y comparable a mPEG(1k)-Cp40 y mPEG(3k)-Cp40. En estos estudios PK (forma siglada de pharmacokinetic, farmacocinéticos) i.v., mPEG(3k)-Cp40 parecía tener las características más potenciadas, mostrando una t1/2 prolongada en al menos ~30 h, en comparación con los otros análogos. Además, los estudios in vivo en los que se administraron por vía intravítrea (i.v.t.) 0,5 mg de Cp40-KK a primates no humanos, Cp40-KKK, mPEG(1 k)-Cp40 o mPEG(3k)-Cp40 mostraron tiempos de residencia intravítreos de al menos 14 días para los análogos de Cp40 PEGilados, mostrando Cp40-KK y Cp40-KKK tiempos de residencia superiores a 73 días. Aún más, Cp40-KKK presentó tiempos de residencia en vítreo a niveles saturantes de C3 incluso después de 90 días.
La mejora general en la solubilidad y el perfil farmacocinético asociado con estos análogos novedosos se ve reforzada por su potencial para reducir la frecuencia de administración del fármaco y reducir al mínimo la irritación local en el sitio de la inyección. Además, los estudios farmacocinéticos descritos en el presente documento indican que los parámetros farmacocinéticos que favorecen la administración sistémica de larga duración de estos compuestos mejoran notablemente en comparación con Cp40.
Por lo tanto, en realizaciones particulares, se proporciona un compuesto que se basa en la SEQ ID NO: 7 en el que al menos un aminoácido lisina está unido covalentemente al extremo C. En algunas realizaciones, al menos dos aminoácidos lisina están unidos covalentemente al extremo C mientras que en otras realizaciones, tres o más aminoácidos lisina están unidos covalentemente al extremo C. En realizaciones preferidas, se proporciona un compuesto basado en la SEQ ID NO: 7 en el que dos o tres aminoácidos lisina están unidos covalentemente al extremo C. En otras realizaciones, se proporciona un compuesto que consiste en la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. En otras realizaciones adicionales, el compuesto consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. Por ejemplo, en una realización, se proporciona un compuesto que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10 (Cp40-KKK), en donde el compuesto presenta una solubilidad, tiempo de permanencia en plasma, tiempo de permanencia en vítreo y/o una unión a C3 aumentados en comparación con un compuesto que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 7 (Cp40).
La adición de pequeños polímeros, pequeños PEG y/o la adición C-terminal de restos hidrófilos o cargados pueden aplicarse a cualquier otra clase de análogo de compstatina conocido en la técnica. Estos incluyen, pero no se limita a, análogos descritos en los documentos WO2012/155107, WO2013/036778, WO2014/078731, WO2014/078734, WO2014/152931 y WO2017/062879.
Los péptidos de compstatina modificados de la presente invención pueden prepararse mediante diversos métodos sintéticos de síntesis peptídica a través de condensación de uno o más restos de aminoácidos, en conformidad con métodos convencionales de síntesis peptídica. Por ejemplo, los péptidos se sintetizan de acuerdo con metodologías convencionales de fase sólida. Otros métodos de síntesis de péptidos o peptidomiméticos, ya sea mediante metodologías de fase sólida o en fase líquida, son bien conocidas por los expertos en la materia. Durante el transcurso de la síntesis peptídica, los grupos amino y carboxilo de la cadena ramificada pueden protegerse/desprotegerse según sea necesario, utilizando grupos protectores comúnmente conocidos. La modificación utilizando grupos protectores alternativos para péptidos y derivados de péptidos será evidente para los expertos en la materia.
Alternativamente, determinados péptidos de la invención pueden producirse mediante expresión en un sistema procariótico o eucariótico adecuado. Por ejemplo, puede insertarse una construcción de ADN en un vector plasmídico adaptado para la expresión en una célula bacteriana (tal como E. coli) o una célula de levadura (tal como Saccharomyces cerevisiae), o en un vector de baculovirus para la expresión en una célula de insecto o en un vector vírico para la expresión en una célula de mamífero. Dichos vectores comprenden los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula hospedadora, colocados de tal manera que permitan la expresión del ADN en la célula hospedadora. Dichos elementos reguladores necesarios para la expresión incluyen secuencias promotoras, secuencias de iniciación de la transcripción y, opcionalmente, secuencias potenciadoras.
Los péptidos también se pueden producir mediante la expresión de una molécula de ácido nucleico in vitro o in vivo. Una construcción de ADN que codifica un concatémero de los péptidos, dependiendo el límite superior del concatémero del sistema de expresión utilizado, puede introducirse en un sistema de expresión in vivo. Después de que se produce el concatémero, se logra la escisión entre la Asn C-terminal y la siguiente Gly N-terminal mediante la exposición del polipéptido a hidracina.
Los péptidos producidos por expresión génica en un sistema procariótico o eucariótico recombinante pueden purificarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Además, para producir análogos de compstatina puede utilizarse una combinación de expresión génica y métodos sintéticos. Por ejemplo, puede producirse un análogo por expresión génica y posteriormente someterlo a uno o más procesos sintéticos postraduccionales, por ejemplo, para modificar el extremo N- o C o para ciclar la molécula.
Ventajosamente, los péptidos que incorporan aminoácidos no naturales, por ejemplo, aminoácidos metilados, puede producirse por expresión in vivo en un sistema procariótico o eucariótico adecuado. Por ejemplo, pueden utilizarse métodos como los descritos por Katragadda y Lambris (2006, Protein Expression and Purification 47: 289-295) para introducir análogos de Trp no naturales en la compstatina mediante expresión en auxótrofas de E. coli para introducir aminoácidos N-metilados u otros no naturales en posiciones seleccionadas de compstatina.
La estructura de la compstatina es conocida en la técnica y las estructuras de los análogos anteriores se determinan por medios similares. Una vez que se ha determinado una conformación particular deseada de un péptido corto, se conocen bien en la técnica métodos para diseñar un péptido o peptidomimético para ajustarse a esa conformación. De particular relevancia para la presente invención, el diseño de los análogos peptídicos puede perfeccionarse adicionalmente teniendo en cuenta la contribución de diversas cadenas laterales de restos de aminoácidos, como se analizó anteriormente (es decir, por el efecto de los grupos funcionales o por consideraciones estéricas).
Los expertos en la materia apreciarán que un mimético peptídico puede actuar igualmente bien como un péptido para proporcionar la conformación de la estructura principal específica y las funcionalidades de cadena lateral necesarias para unirse a C3 e inhibir la activación del complemento. Por consiguiente, se contempla dentro del ámbito de la presente invención la producción de compuestos inhibidores del complemento de unión a C3 mediante el uso de aminoácidos de origen natural, derivados de aminoácidos, análogos o moléculas no aminoacídicas capaces de unirse para formar la conformación de la estructura principal adecuada. Un análogo no peptídico, o un análogo que comprenda componentes peptídicos y no peptídicos, se denomina en ocasiones en el presente documento "peptidomimético" o "mimético isostérico", para designar sustituciones o derivaciones de los péptidos de la invención, que posean las mismas características conformacionales de la estructura principal y/u otras funcionalidades, de manera que sean suficientemente similares a los péptidos ejemplificados para inhibir la activación del complemento.
El uso de peptidomiméticos para el desarrollo de análogos peptídicos de alta afinidad se conoce bien en la técnica (véanse, por ejemplo, Vagner et al., 2008, Curr. Opin. Chem. Biol. 12: 292-296; Robinson et al., 2008, Drug Disc. Today 13: 944-951) Suponiendo restricciones rotacionales similares a las de los restos de aminoácidos dentro de un péptido, pueden analizarse análogos que comprenden fracciones no de aminoácidos y verificarse sus motivos conformacionales, mediante cualquier diversidad de técnicas informáticas que son bien conocidas en la técnica.
Usos y administración terapéutica de análogos de compstatina
La actividad inhibidora del complemento de los análogos de compstatina, los peptidomiméticos y los conjugados puede probarse mediante una diversidad de ensayos conocidos en la técnica. En determinadas realizaciones, se utilizan los ensayos descritos en los Ejemplos. Se expone un listado no exhaustivo de otros ensayos en la patente de Estados Unidos 6.319.897, los documentos WO99/13899, WO2004/026328, WO2007/062249 y WO2010/127336, incluyendo, pero sin limitación, (1) la unión de péptidos a fragmentos de C3 y C3; (2) diversos ensayos hemolíticos; (3) la medición de la escisión de C3 mediada por convertasa de C3; y (4) la medición de la escisión del Factor B por el Factor D.
Los péptidos y peptidomiméticos descritos en el presente documento son de utilidad práctica para cualquier fin para el que se utilice la propia compstatina, como se conoce en la técnica. Dichos usos incluyen, pero no se limita a: (1) la inhibición de la activación del complemento en el suero y en las células, tejidos u órganos de un paciente (humano o animal), lo que puede facilitar el tratamiento de determinadas enfermedades o afecciones, incluyendo, pero sin limitación, degeneración macular senil, atrofia geográfica, neovascularización coroidea, neovascularización retiniana, inflamación ocular, inflamación inducida por hemodiálisis, glaucoma, uveítis, retinopatía diabética artritis reumatoide, lesión medular, traumatismo craneoencefálico, isquemia cerebral/lesión por reperfusión (por ejemplo, accidente cerebrovascular), politraumatismo agudo (choque hemorrágico), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, cáncer, septicemia, hemoglobinuria paroxística nocturna, trastornos hemolíticos de etiología autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad por crioaglutininas y AHAAc), psoriasis y trastornos respiratorios tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación alérgica, enfisema, bronquitis, bronquiectasia, fibrosis quística, tuberculosis, neumonía, síndrome de dificultad respiratoria (SDR - del recién nacido y del adulto), rinitis y sinusitis, microangiopatía trombótica asociada a trasplantes, enfermedades inflamatorias de la piel, periodontitis, gingivitis, enfermedades renales asociadas al complemento; (2) la inhibición de la activación del complemento que se produce durante el trasplante de células u órganos, o en el uso de órganos o implantes artificiales (por ejemplo, mediante la administración sistémica restringida en el tiempo antes, durante y/o después del procedimiento o recubriendo o tratando de otro modo las células, órganos, órganos artificiales o implantes con un péptido de la invención); (3) la inhibición de la activación del complemento que se produce durante la derivación extracorpórea de líquidos fisiológicos (sangre, orina) (por ejemplo, mediante la administración sistémica restringida en el tiempo antes, durante y/o después del procedimiento o recubriendo el tubo a través del cual se derivan los líquidos con un péptido de la invención); y (4) en la exploración de bibliotecas de moléculas pequeñas para identificar otros inhibidores de la activación de la compstatina (por ejemplo, ensayos de gran capacidad en fase líquida o sólida diseñados para medir la capacidad de un compuesto de prueba para competir con un análogo de compstatina para unirse con C3 o un fragmento de C3).
Para implementar una o más de las utilidades mencionadas anteriormente, otro aspecto de la invención presenta composiciones farmacéuticas que comprenden los análogos de compstatina o conjugados descritos y ejemplificados en el presente documento. Dicha composición farmacéutica puede consistir en el principio activo solo, en una forma adecuada para la administración a un sujeto, o la composición farmacéutica puede comprender el principio activo y uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales o una combinación de estos. El principio activo puede estar presente en la composición farmacéutica en forma de un éster o sal fisiológicamente aceptable, tal como en combinación con un catión o un anión fisiológicamente aceptable, como se conoce bien en la técnica.
Un análogo de compstatina particular de la invención puede seleccionarse para una formulación particular en función de sus características de solubilidad. Como se ha mencionado anteriormente, los análogos que son altamente solubles en agua o solución salina tamponada pueden ser particularmente adecuados para inyección sistémica debido a que el volumen de inyección puede minimizarse. En forma comparativa, los análogos con alta solubilidad en agua y menor solubilidad en solución salina tamponada podrían producir un gel, una suspensión o un precipitado más duradero para la aplicación tópica o la inyección local, tal como la inyección intraocular (incluida la inyección intravítrea).
Así pues, en realizaciones particulares, los análogos de compstatina basados en Cp40 se administran por vía subcutánea, intravenosa, intraocular (incluyendo intravítrea), inyección intramuscular, administración periodontal (incluyendo administración gingival o inyección de infiltración intrapapilar), o administración tópica. En aún otras realizaciones, los análogos de Cp40 se suministran por vía oral. En algunas realizaciones, los análogos basados en Cp40 se administran como una única inyección oral, subcutánea, intravenosa, intraocular (incluyendo intravítrea), intramuscular, administración periodontal o administración tópica. En otras realizaciones, los análogos basados en Cp40 se administran a través de múltiples inyecciones orales, subcutáneas, intravenosas, intraoculares (incluyendo intravítreas), intramusculares, administraciones periodontales o tópicas. En aún otras realizaciones, un análogo basado en Cp40 se administra a través de una dosis de ataque inicial subcutánea, intravenosa o intramuscular combinada con una dosificación repetida oral, intramuscular, subcutánea o intravenosa durante un período de tiempo prolongado para permitir una dosificación más baja de los análogos e intervalos de dosificación menos frecuente en comparación con los métodos de administración descritos anteriormente para los análogos de compstatina conocidos. En otras realizaciones adicionales, la dosificación de mantenimiento se logra a través del suministro de análogos de Cp40 mediante bombas de infusión subcutáneas o implantes oculares (véanse, por ejemplo, los documentos US2016/0060297 y US 6.692.759).
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado posteriormente en la técnica de la tecnología farmacéutica. En general, tales métodos preparatorios incluyen la etapa de poner el principio activo en asociación con un transportador o uno o más de otros ingredientes accesorios, y a continuación, si es necesario o conveniente, conformar y/o envasar el producto en una unidad de dosis individual o múltiples.
Las composiciones farmacéuticas útiles para poner en práctica la invención pueden administrarse para suministrar una dosis de entre 0,125 mg/kg y 50 mg/kg de peso corporal como una única inyección en embolada, o una dosis intravítrea de entre 1 pg y aproximadamente 10 mg, o en un régimen repetido, o una combinación de los mismos de acuerdo con lo que determine fácilmente el experto en la materia. En determinadas realizaciones, la dosificación comprende al menos 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, o al menos 0,2 mg/kg, o al menos 0,3 mg/kg, o al menos 0,4 mg/kg, o al menos 0,5 mg/kg, o al menos 0,6 mg/kg, o al menos 0,7 mg/kg, o al menos 0,8 mg/kg, o al menos 0,9 mg/kg, o al menos 1 mg/kg, o al menos 2 mg/kg, o al menos 3 mg/kg, o al menos 4 mg/kg, o al menos 5 mg/kg, o al menos 6 mg/kg, o al menos 7 mg/kg, o al menos 8 mg/kg, o al menos 9 mg/kg, o al menos 10 mg/kg, o al menos 15 mg/kg, o al menos 20 mg/kg, o al menos 25 mg/kg, o al menos 30 mg/kg, o al menos 35 mg/kg, o al menos 40 mg/kg, o al menos 45 mg/kg, o al menos 50 mg/kg, diariamente o con otro régimen periódico adecuado.
Se ha descubierto que la administración de los análogos basados en Cp40 divulgados en el presente documento (por ejemplo, PEG(1K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK) tienen tiempos de permanencia en plasma prolongados y tiempos de permanencia intravítreos prolongados en comparación con los análogos de compstatina conocidos anteriormente, por lo que se pueden administrar por vía intravenosa, vía intravítrea, vía intramuscular y/o vía subcutánea a dosis terapéuticamente eficaces más bajas e intervalos de dosificación menos frecuente. Como apreciará un experto en la materia, la vía específica de administración puede influir en la dosis necesaria para la eficacia terapéutica.
En una realización, la invención contempla la administración intravenosa o subcutánea de un análogo basado en Cp40, como se describe en el presente documento, a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 0,125 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, por ejemplo, 0,125 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,75 mg/kg, 2 mg/kg, 2,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 2,75 mg/kg, 3 mg/kg, 3,25 mg/kg, 3,5 mg/kg, 3,75 mg/kg, 4 mg/kg, 4,25 mg/kg, 4,5 mg/kg, 4,75 mg/kg, 5 mg/kg, 5,25 mg/kg, 5,5 mg/kg, 5,75 mg/kg, 6 mg/kg, 6,25 mg/kg, 6,5 mg/kg, 6,75 mg/kg, 7 mg/kg, 7,25 mg/kg, 7,5 mg/kg, 7,75 mg/kg, 8 mg/kg, 8,25 mg/kg, 8,5 mg/kg, 8,75 mg/kg, 9 mg/kg, 9,25 mg/kg, 9,5 mg/kg, 9,75 mg/kg o 10 mg/kg. En una realización preferida, el análogo basado en Cp40 se administra a través de suministro intravenoso o subcutáneo (por ejemplo, inyección o infusión) a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg. En otra realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg. En aún otra realización más, la dosis terapéuticamente eficaz es de entre aproximadamente 0,5 mg/kg y 4 mg/kg o entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 3 mg/kg. Por ejemplo, en una realización particular, el análogo basado en Cp40 (por ejemplo, PEG(1K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK) se inyecta i.v. o s.c. a un ser humano a una dosis de aproximadamente 3 mg/kg/24 horas.
En otra realización, la invención contempla la administración intramuscular de un análogo basado en Cp40, como se describe en el presente documento, a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, por ejemplo, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13 mg/kg, 13,5 mg/kg, 14 mg/kg, 14,5 mg/kg, 15 mg/kg, 15,5 mg/kg, 16 mg/kg, 16,5 mg/kg, 17 mg/kg, 17,5 mg/kg, 18 mg/kg, 18,5 mg/kg, 19 mg/kg, 19,5 mg/kg, 20 mg/kg, 20,5 mg/kg, 21 mg/kg, 21,5 mg/kg, 22 mg/kg, 22,5 mg/kg, 23 mg/kg, 23,5 mg/kg, 24 mg/kg, 24,5 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg o 50 mg/kg. En una realización preferida, el análogo basado en Cp40 se administra a través de suministro intramuscular (por ejemplo, inyección) a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg. En otra realización, la dosis terapéuticamente eficaz es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y 30 mg/kg. En aún otra realización más, la dosis terapéuticamente eficaz es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y 10 mg/kg. En otras realizaciones adicionales, la dosis terapéuticamente eficaz es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y 5 mg/kg. Por ejemplo, en una realización particular, el análogo basado en Cp40 (por ejemplo, PEG(1 K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK) se inyecta i.m. a una dosis de aproximadamente 2,5 mg/kg
En aún otra realización más, la invención contempla la administración intravítrea de un análogo basado en Cp40, como se describe en el presente documento, a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 10 mg, por ejemplo, 1 pg, 1,25 pg, 1,5 pg, 1,75 pg, 2 pg, 2,25 pg, 2,5 pg, 2,75 pg, 3 pg, 3,25 pg, 3,5 pg, 3,75 pg, 4 pg, 4,25 pg, 4,5 pg, 4,75 pg, 5 pg, 5,25 pg, 5,5 pg, 5,75 pg, 6 pg, 6,25 pg, 6,5 pg, 6,75 pg, 7 pg, 7,25 pg, 7,5 pg, 7,75 pg, 8 pg, 8,25 pg, 8,5 pg, 8,75 pg, 9 pg, 9,25 pg, 9,5 pg, 9,75 pg, 10 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 90 pg, 100 pg, 150 pg, 200 pg, 250 pg, 300 pg, 350 pg, 400 pg, 450 pg, 500 pg, 550 pg, 600 pg, 650 pg, 700 pg, 750 pg, 800 pg, 850 pg 900 pg, 950 pg, 1 mg, 1,1 mg, 1,2 mg, 1,3 mg, 1,4 mg, 1,5 mg, 1,6 mg, 1,7 mg, 1,8 mg, 1,9 mg, 2 mg, 2,1 mg, 2,2 mg, 2,3 mg, 2,4 mg, 2,5 mg, 2,6 mg, 2,7 mg, 2,8 mg, 2,9 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg, 5 mg, 5,5 mg, 6 mg, 6,5 mg, 7 mg, 7,5 mg, 8 mg, 8,5 mg, 9 mg, 9,5 mg 0 10 mg; preferentemente, la dosis es de aproximadamente 1 pg y aproximadamente 2000 pg, por ejemplo, de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 2.000 pg o de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1.500 pg o de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 1.200 pg o de aproximadamente 500 pg a aproximadamente 1000 pg. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del análogo basado en Cp40 que se suministrar mediante administración intravítrea es de al menos aproximadamente 0,02 mg, por ejemplo, al menos de aproximadamente 0,02 mg, 0,03 mg, 0,04 mg, 0,05 mg, 0,06 mg, 0,07 mg, 0,08 mg, 0,09 mg, 0,1 mg, 0,15 mg, 0,2 mg, 0,25 mg, 0,3 mg, 0,35 mg, 0,4 mg, 0,45 mg, 0,5 mg, 0,55 mg, 0,6 mg, 0,65 mg, 0,7 mg, 0,75 mg, 0,8 mg, 0,85, mg, 0,9 mg, 0,95 mg o 1 mg. Por ejemplo, en una realización particular, el análogo basado en Cp40 (por ejemplo, PEG(1K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK) se inyecta i.v.t. a una dosis de aproximadamente 1 mg.
En otra realización, la invención contempla la administración oral de un análogo basado en Cp40, como se describe en el presente documento, a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, por ejemplo, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13 mg/kg, 13,5 mg/kg, 14 mg/kg, 14,5 mg/kg, 15 mg/kg, 15,5 mg/kg, 16 mg/kg, 16,5 mg/kg, 17 mg/kg, 17,5 mg/kg, 18 mg/kg, 18,5 mg/kg, 19 mg/kg, 19,5 mg/kg o 20 mg/kg. En una realización preferida, el análogo basado en Cp40 se administra a través de suministro oral a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. Por ejemplo, en una realización particular, el análogo basado en Cp40 (por ejemplo, PEG(1K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK) se suministra por vía oral a un ser humano a una dosis de aproximadamente 1 y 5 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis oral descrita en el presente documento se administra una vez. En otras realizaciones, se administra diariamente.
En otra realización, la invención contempla la administración periodontal, tal como la infiltración intrapapilar, de un análogo basado en Cp40, como se describe en el presente documento, a una dosis terapéuticamente eficaz que es de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 1.000 pg, por ejemplo, 1 pg, 5 pg, 10 pg, 15 pg, 20 pg, 25 pg, 30 pg, 35 pg, 40 pg, 45 pg, 50 pg, 55 pg, 60 pg, 65 pg, 70 pg, 75 pg, 80 pg, 85 pg, 90 pg, 95 pg, 100 pg, 110 pg, 120 pg, 130 pg, 140 pg, 150 pg, 160 pg, 170 pg, 180 pg, 190 pg, 200 pg, 210 pg, 220 pg, 230 pg, 240 pg 250 pg, 260 pg, 270 pg, 280 pg, 290 pg, 300 pg, 310 pg, 320 pg, 330 pg, 340 pg, 350 pg, 360 pg, 370 pg, 380 pg 390 pg, 400 pg, 410 pg, 420 pg, 430 pg, 440 pg, 450 pg, 460 pg, 470 pg, 480 pg, 490 pg, 500 pg, 550 pg, 600 pg 650 pg, 700 |jg, 750 |jg, 800 |jg, 850 |jg, 900 |jg, 950 |jg o 1.000 |jg. Por ejemplo, el análogo basado en Cp40 puede administrarse por vía periodontal a un ser humano a una dosis de entre aproximadamente 5 jig y aproximadamente 500 jig (por ejemplo, suministrado en la papila interdental mediante inyección). En una realización preferida, el análogo basado en Cp40 se suministra por vía periodontal a un ser humano a una dosis de entre aproximadamente 10 jg / papila interdental y aproximadamente 200 jg / papila interdental o a una dosis de entre aproximadamente 20 jg / papila interdental y aproximadamente 100 jg / papila interdental. Por ejemplo, en una realización particular, el análogo basado en Cp40 (por ejemplo, PEG(1 K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK) se administra por vía periodontal a un ser humano a una dosis de aproximadamente 25 jg / papila interdental o aproximadamente 50 jg / papila interdental.
En una realización, la invención contempla la administración de una dosis que da como resultado una concentración sérica del análogo basado en Cp40 de entre aproximadamente 0,01 jM y aproximadamente 30 jM en un individuo.
En determinadas realizaciones, la dosis y el régimen combinados darán como resultado una concentración sérica, o una concentración sérica promedio a lo largo del tiempo, del análogo basado en Cp40 de al menos aproximadamente 0,01 jM, o al menos aproximadamente 0,02 jM, o al menos aproximadamente 0,03 jM, o al menos aproximadamente 0,04 jM, o al menos aproximadamente 0,05 jM, o al menos aproximadamente 0,06 jM, o al menos al menos aproximadamente 0,07 jM, o al menos aproximadamente 0,08 jM, o al menos aproximadamente 0,09 jM, o al menos aproximadamente 0,1 jM, de 0,11 jM, o al menos aproximadamente 0,12 jM, o al menos aproximadamente 0,13 jM, o al menos aproximadamente 0,14 jM, o al menos aproximadamente 0,15 jM, o al menos aproximadamente 0,16 jM, o al menos aproximadamente 0,17 jM, o al menos aproximadamente 0,18 jM, o al menos aproximadamente 0,19 jM, o al menos aproximadamente 0,2 jM, o al menos aproximadamente 0,3 jM, o al menos aproximadamente 0,4 jM, o al menos aproximadamente 0,5 jM, o al menos aproximadamente 0,6 jM, o al menos aproximadamente 0,7 jM, o al menos aproximadamente 0,8 jM, o al menos aproximadamente 0,9 jM, o al menos aproximadamente 1 jM o al menos aproximadamente 1,5 jM, o al menos aproximadamente 2 jM, o al menos aproximadamente 2,5 jM, o al menos aproximadamente 3 jM, o al menos aproximadamente 3,5 jM, o al menos aproximadamente 4 jM, o al menos aproximadamente 4,5 jM, o al menos aproximadamente 5 jM, o al menos aproximadamente 5,5 jM, o al menos aproximadamente 6 jM, o al menos aproximadamente 6,5 jM, o al menos aproximadamente 7 jM, o al menos aproximadamente 7,5 jM, o al menos aproximadamente 8 jM, o al menos aproximadamente 8,5 jM, o al menos aproximadamente 9 jM, o al menos aproximadamente 9,5 jM, o al menos aproximadamente 10 jM, o al menos aproximadamente 10,5 jM, o al menos aproximadamente, 11 jM o al menos aproximadamente 11,5 jM, o al menos aproximadamente 12 jM, o al menos aproximadamente 12,5 jM, o al menos aproximadamente 13 jM, o al menos aproximadamente 13,5 jM, o al menos aproximadamente 14 jM, o al menos aproximadamente 14,5 jM, o al menos aproximadamente 15 jM, o al menos aproximadamente 15,5 jM, o al menos aproximadamente 16 jM, o al menos aproximadamente 16,5 jM, o al menos aproximadamente 17 jM, o al menos aproximadamente 17,5 jM, o al menos aproximadamente 18 jM, o al menos aproximadamente 18,5 jM, o al menos aproximadamente 19 jM, o al menos aproximadamente 19,5 jM, o al menos aproximadamente 20 jM, o al menos aproximadamente 20,5 jM, o al menos aproximadamente 21 jM o al menos aproximadamente 21,5 jM, o al menos aproximadamente 22 jM, o al menos aproximadamente 22,5 jM, o al menos aproximadamente 23 jM, o al menos aproximadamente 23,5 jM, o al menos aproximadamente 24 jM, o al menos aproximadamente 24,5 jM, o al menos aproximadamente 25 jM, o al menos aproximadamente 25,5 jM, o al menos aproximadamente 26 jM, o al menos aproximadamente 26,5 jM, o al menos aproximadamente 27 jM, o al menos aproximadamente 27,5 jM, o al menos aproximadamente 28 jM, o al menos aproximadamente 28,5 jM, o al menos aproximadamente 29 jM, o al menos aproximadamente 29,5 jM, o al menos aproximadamente 30 jM. En determinadas realizaciones, la dosis y el régimen combinados darán como resultado una concentración sérica, o una concentración sérica promedio a lo largo del tiempo, del análogo basado en Cp40 de hasta aproximadamente 0,1 jM, o hasta aproximadamente 0,11 jM, o hasta aproximadamente 0,12 jM, o hasta aproximadamente 0,13 jM, o hasta aproximadamente 0,14 jM, o hasta aproximadamente 0,15 jM, o hasta aproximadamente 0,16 jM, o hasta aproximadamente 0,17 jM, o hasta aproximadamente 0,18 jM, o hasta aproximadamente 0,19 jM, o hasta aproximadamente 0,2 jM, o hasta aproximadamente 0,3 jM, o hasta aproximadamente 0,4 jM, o hasta aproximadamente 0,5 jM, o hasta aproximadamente 0,6 jM, o hasta aproximadamente 0,7 jM, o hasta aproximadamente 0,8 jM, o hasta aproximadamente 0,9 jM, o hasta aproximadamente 1 jM o hasta aproximadamente 1,5 jM, o hasta aproximadamente 2 jM, o hasta aproximadamente 2,5 jM, o hasta aproximadamente 3 jM, o hasta aproximadamente 3,5 jM, o hasta aproximadamente 4 jM, o hasta aproximadamente 4,5 jM, o hasta aproximadamente 5 jM, o hasta aproximadamente 5,5 jM, o hasta aproximadamente 6 jM, o hasta aproximadamente 6,5 jM, o hasta aproximadamente 7 jM, o hasta aproximadamente 7,5 jM, o hasta aproximadamente 8 jM, o hasta aproximadamente 8,5 jM, o hasta aproximadamente 9 jM, o hasta aproximadamente 9,5 jM, o hasta aproximadamente 10 jM, o hasta aproximadamente 10,5 jM o hasta aproximadamente 11 jM o hasta aproximadamente 11,5 jM, o hasta aproximadamente 12 jM, o hasta aproximadamente 12,5 jM , o hasta aproximadamente 13 jM, o hasta aproximadamente 13,5 jM, o hasta aproximadamente 14 jM, o hasta aproximadamente 14,5 jM, o hasta aproximadamente 15 jM, o hasta aproximadamente 15,5 jM , o hasta aproximadamente 16 jM, o hasta aproximadamente 16,5 jM, o hasta aproximadamente 17 jM, o hasta aproximadamente 17,5 jM, o hasta aproximadamente 18 jM, o hasta aproximadamente 18,5 jM , o hasta aproximadamente 19 jM, o hasta aproximadamente 19,5 jM, o hasta aproximadamente 20 jM, o hasta aproximadamente 20,5 jM o hasta aproximadamente 21 jM o hasta aproximadamente 21,5 jM , o hasta aproximadamente 22 jM, o hasta aproximadamente 22,5 jM, o hasta aproximadamente 23 jM, o hasta aproximadamente 23,5 jM, o hasta aproximadamente 24 jM, o hasta aproximadamente 24,5 pM, o hasta aproximadamente 25 pM, o hasta aproximadamente 25,5 pM, o hasta aproximadamente 26 pM, o hasta aproximadamente 26,5 pM, o hasta aproximadamente 27 pM, o hasta aproximadamente 27,5 pM, o hasta aproximadamente 28 pM, o hasta aproximadamente 28,5 pM, o hasta aproximadamente 29 pM, o hasta aproximadamente 29,5 pM, o hasta aproximadamente 20 pM.
Los intervalos adecuados incluyen aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 pM, o aproximadamente 1 a aproximadamente 29 pM, o aproximadamente 2 a aproximadamente 28 pM, o aproximadamente 3 a aproximadamente 27 pM, o aproximadamente 4 a aproximadamente 26 pM, o aproximadamente 5 a aproximadamente 25 pM, o aproximadamente 6 a aproximadamente 24 pM, o aproximadamente 7 a aproximadamente 23 pM, o aproximadamente 8 a aproximadamente 22 pM, o aproximadamente 9 a aproximadamente 21 pM, o aproximadamente 10 a aproximadamente 20 pM, o aproximadamente 11 a aproximadamente 19 pM, o aproximadamente 12 a aproximadamente 18 pM, o aproximadamente 13 a aproximadamente 17 pM, o aproximadamente 1 a aproximadamente 5 pM, o aproximadamente 5 a aproximadamente 10 pM, o aproximadamente 10 a aproximadamente 15 pM, o aproximadamente 15 a aproximadamente 20 pM, o aproximadamente 20 a aproximadamente 25 pM, o aproximadamente 25 a aproximadamente 30 pM. Si bien la dosificación precisa administrada variará dependiendo de cualquier número de factores, incluyendo, pero sin limitación, el tipo de paciente y el tipo de patología que se está tratando, la edad del paciente y la vía de administración, el experto en la materia podrá determinar fácilmente dicha dosificación.
La composición farmacéutica que contiene el análogo basado en Cp40 puede administrarse a un paciente con una frecuencia de varias veces al día, o puede administrarse menos frecuentemente, tal como una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes o incluso menos frecuentemente, tal como una vez cada varios meses o incluso una vez al año o menos. La frecuencia de la dosis será fácilmente evidente para el experto en la materia y dependerá de cualquier número de factores, tales como, pero sin limitación, del tipo y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el tipo y la edad del paciente, como se describe anteriormente. Sin embargo, y como se ha señalado anteriormente, los análogos basados en Cp40 de la presente divulgación pueden administrarse a intervalos menos frecuentes en comparación con los análogos de compstatina conocidos previamente.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración intravenosa, intramuscular, intraocular (incluida la intravítrea), subcutánea, periodontal (incluida la administración gingival o la infiltración intrapapilar) o tópica de una composición farmacéutica que contenga el análogo basado en Cp40 es mediante una única inyección. En otras realizaciones, el análogo basado en Cp40 se administra por vía oral. Adicionalmente, y dado el tiempo de permanencia prolongado de los análogos basados en Cp40 descritos actualmente (es decir, análogos basados en Cp40 mPEGilados y/o que contienen Lys), la invención contempla la administración sistémica de larga duración de estos análogos basados en Cp40, en donde los análogos basados en Cp40 se administran por vía oral, intravenosa, intraocular (incluyendo intravítrea), subcutánea, intramuscular, periodontal (incluida la administración gingival o la infiltración intrapapilar) o vías de administración tópica a las dosis terapéuticas descritas anteriormente a través de suministros múltiples (por ejemplo, por la boca o por inyección) a lo largo del tiempo para proporcionar una dosis de mantenimiento terapéuticamente eficaz de los análogos basados en Cp40 dependiendo del tipo y la edad del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad tratada. Por tanto, en algunas realizaciones, se suministra por vía intravenosa, por vía intraocular (incluyendo por vía intravítrea), por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía periodontal (por ejemplo, mediante infiltración intrapapilar) o por vía tópica un análogo basado en Cp40 (por ejemplo, PEG(1K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK), mediante múltiples inyecciones de una composición farmacéutica que comprende el análogo administrado una vez cada aproximadamente 12 horas a aproximadamente una vez cada tres meses, por ejemplo, una vez cada 12 horas, una vez cada 24 horas, una vez cada 2 días, una vez cada 3 días, una vez cada 4 días, una vez cada 5 días, una vez cada 6 días, una vez cada 7 días, una vez cada 8 días, una vez cada 9 días, una vez cada 10 días, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses. En otras realizaciones, el análogo basado en Cp40 se administra por vía oral mediante la ingestión de una composición farmacéutica que comprende el análogo administrado una vez cada aproximadamente 12 horas a aproximadamente una vez cada tres meses, por ejemplo, una vez cada 12 horas, una vez cada 24 horas, una vez cada 2 días, una vez cada 3 días, una vez cada 4 días, una vez cada 5 días, una vez cada 6 días, una vez cada 7 días, una vez cada 8 días, una vez cada 9 días, una vez cada 10 días, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses.
Además, en el presente documento se proporcionan métodos de suministro que incluyen una combinación de vías de administración y dosis. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan métodos de tratamiento sistémico de composiciones farmacéuticas que contienen los análogos basados en Cp40 de la presente divulgación (por ejemplo, PEG(1K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK) que incluyen una dosis saturante inicial seguida de una dosificación múltiples a dosis terapéuticamente eficaces más bajas e intervalos de dosificación menos frecuente. Este método novedoso de tratamiento sistémico proporcionaría un prolongado mantenimiento/control de la inhibición del complemento in vivo. Para este fin, en algunas realizaciones, se administra por vía subcutánea, vía intravenosa o vía intramuscular una primera dosis de ataque de un análogo basado en Cp40 a una dosis terapéuticamente eficaz más alta seleccionada de los intervalos descritos anteriormente, lo que luego es seguido por la administración intramuscular u oral a intervalos regulares de dosificación. En una de tales realizaciones, se inyecta por vía subcutánea o vía intravenosa una composición farmacéutica que contiene uno de los análogos basados en Cp40 analizados en el presente documento (por ejemplo, Cp40-KKK) a una dosis terapéuticamente eficaz inicial de al menos aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 mg/kg y posteriormente se administra por vía oral o vía intramuscular a una dosis de mantenimiento terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, en donde la dosis de mantenimiento se suministra una vez cada 2 días a 3 meses, por ejemplo, una vez cada 2 días, 3 días, 3 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 31 días, 32 días, 33 días, 34 días, 35 días, 36 días, 37 días, 38 días, 39 días, 42 días, 45 días, 50 días, 56 días, 60 días, 65 días, 70 días, 77 días, 80 días, 84 días o 90 días. Por ejemplo, en una realización particular, una composición farmacéutica que contiene Cp40-KKK se administra i.v. a una dosis saturante de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg y posteriormente se administra i.m. semanalmente o cada dos semanas a una dosis de mantenimiento de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/kg.
Como se ha señalado anteriormente, las composiciones farmacéuticas que contienen los análogos basados en Cp40 que son útiles en los métodos de la invención pueden administrarse sistémicamente por vía oral, parenteral, oftálmica o intraocular (incluida la intravítrea), intravenosa, subcutánea, intramuscular (i.m.), periodontal (por ejemplo, inyección de infiltración intrapapilar), por supositorio, por aerosol, tópica, transdérmicas u otras formulaciones similares. Dichas composiciones farmacéuticas pueden contener transportadores farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes para potenciar y facilitar la administración de fármacos. Otras formulaciones, tales como nanopartículas, liposomas, eritrocitos resellados y sistemas de base inmunológica también pueden utilizarse para administrar un análogo de compstatina de acuerdo con los métodos de la invención.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen normalmente soluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los transportadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.), solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución de Ringer.
Convencionalmente se utilizan como disolvente o medio de suspensión aceites no volátiles, estériles. Con este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volátil, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, así como los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas pueden contener también un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se utilizan habitualmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos utilizados habitualmente, tales como Tween, Span y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se utilizan habitualmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables también pueden utilizarse con fines de formulación.
En general, la composición debe ser estéril, y debe ser fluida de modo que exista una fácil inyectabilidad. Las formulaciones farmacéuticas preferidas son estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. En general, el transportador pertinente puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Preferentemente, las soluciones para inyección son sin endotoxinas. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para administración oral comprenden el principio activo combinado con un transportador farmacéuticamente aceptable, en una diversidad de formas de dosificación, incluidas, pero sin limitación, pastillas, comprimidos, gránulos, polvos, cápsulas, dispersiones, suspensiones, soluciones, emulsiones, microemulsiones, geles y películas, por citar algunos. Dichas formas de dosificación normalmente incluyen transportadores, excipientes y o potenciadores de la penetración para facilitar la formulación y el suministro de los principios activos.
Los transportadores farmacéuticamente aceptables se seleccionan de proteínas, hidratos de carbono, lípidos, moléculas orgánicas e inorgánicas, y combinaciones de los mismos. Los principios activos pueden combinarse con el transportador en un diluyente apropiado para formar una solución o una suspensión. Dichas formulaciones líquidas pueden ser viscosas o no viscosas dependiendo de la cantidad y el transportador utilizado. Las formulaciones líquidas pueden utilizarse directamente o pueden formularse adicionalmente en una cápsula, cápsula de gel o sólido adecuados por métodos conocidos por los expertos en la materia. Alternativamente, las formulaciones sólidas pueden fabricarse combinando componentes sólidos. Dichas formulaciones sólidas pueden utilizarse en forma de polvo o se pueden formular en gránulos, cápsulas, comprimidos o películas, cualquiera de las cuales puede fabricarse como una formulación de liberación prolongada.
Las proteínas adecuadas para su uso como transportadores en formas de dosificación oral incluyen proteínas de la leche tales como caseína, caseinato de sodio, suero de la leche, suero reducido en lactosa, concentrado de proteínas de suero, gelatina, proteína de soja (aislada), proteína de algas pardas, proteína de algas rojas, extracto de levadura de panadería y albúminas. Los hidratos de carbono adecuados incluyen celulosas tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de celulosa y etilcelulosa, almidones tales como el almidón de maíz, almidón de patata, almidón de tapioca, almidón de trigo, almidón modificado con ácido, almidón pregelatinizado y almidón no modificado, alginatos tales como el alginato de amonio, alginato de sodio y alginato de calcio, glútenes tales como el gluten de maíz y el gluten de trigo, gomas como la de acacia (goma arábiga), goma ghatti, goma guar, goma karaya (goma esterculia) y goma (tragacanto), preparados de enzima glucosa isomerasa insoluble, azúcares tales como el azúcar de maíz, azúcar invertida, jarabe de maíz, jarabe de maíz de alto contenido de fructosa y gluconato de sodio. Los lípidos adecuados incluyen tocoferoles tales como acetato de a-tocoferol, ácidos grasos de cadena corta, media y larga y ésteres de los mismos, alcoholes grasos y éteres de los mismos, aceites tales como el aceite de coco (refinado), aceite de soja (hidrogenado) y aceite de colza, palmitato de aluminio, dilauril tiodipropionato, lecitina modificada con enzimas, estearato de calcio, grasas modificadas con enzimas, gliceril palmitoestereato, lecitina, mono- y diglicéridos, glicerina y ceras tales como la cera de abejas (amarilla y blanca), cera de candelilla y cera de carnauba, y aceite vegetal. Las sustancias orgánicas e inorgánicas adecuadas incluyen metil y vinilpirrolidonas tales como polivinilpirrolidona, metilsulfonil metano, dimetilsulfóxido y compuestos relacionados, hidroxi y polihidroxiácidos tales como ácido poliláctico, entre muchas otras.
En algunas realizaciones, las formas de dosificación oral de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento contienen uno o más potenciadores de la permeación y/o excipientes lipídicos para aumentar la biodisponibilidad de las composiciones después de la administración oral, tales como las descritas en Maher et al. (2016, Adv. Drug Deliv. Rev. 106:277-319). Los potenciadores de la penetración ilustrativos adecuados para su uso en el presente documento incluyen C12E9, caprilocaproil PEG 8 glicéridos, ácido cítrico, dodecil-p-D-maltopiranósido (DDM), gliceril monocaprato, laurilocarnitina, n-tetradecil p-D-maltopiranósido (TDM), quitosano N-trimetilado, palmitoilcarnitina, penetratina (D-penetratina), SNAC, caprato de sodio (C10), caprilato de sodio (Cs), colato de sodio, desoxicolato de sodio, dodecilsulfato de sodio, taurocolato de sodio y monolaurato de sacarosa. Los excipientes lipídicos ilustrativos adecuados para su uso en el presente documento incluyen polioxiglicéridos (por ejemplo, polioxil estearato, polietilenglicol monoestearato, caprilocaproil polioxil-8 glicéridos, caprilocaproil macrogol-8 glicéridos, lauraoil polioxilglicéridos, estearoil polioxiglicéridos, oleoil polioxil-6 glicéridos, linoleoil polioxil-6 glicéridos y lauroil polioxil-6 glicéridos), propilenglicol ésteres (por ejemplo, propilenglicol monocaprilato tipo I, propilenglicol monocaprilato tipo II, propilenglicol monolaurato tipo I y propilenglicol monolaurato tipo II), ésteres de poliglicerol (por ejemplo, poligliceril-3 dioleato), glicéridos (por ejemplo, monoglicéridos, diglicéridos, glicerol monoestearato 40-55 tipo I, triglicéridos de cadena media, propilenglicol dicaprilato/dicaprato, propilenglicol dicaprilocaprato, gliceril monolinoleato y glicerilo monooleato tipo 40) y disolventes hidroalcohólicos (por ejemplo, dietilenglicol monoetil éter).
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas formuladas para suministro oral pueden incluir nanopartículas como sistema de suministro de fármacos. Los polímeros adecuados para su uso en el recubrimiento de nanotransportadores que encapsulan los análogos Cp-40 proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limita a, carbopol, quitosano, polímeros de colesterilo, ciclodextrina, hidroxipropil metilcelulosa ftalato, poli(etil cianoacrilato), polietilenglicol, ácido poliacrílico, polilactida-co-glicólido y polialilamina (véase, por ejemplo, Gupta et al., 2013, Drug Deliv. 20(6):237-246).
Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden formularse en una pomada adecuada que contenga el componente farmacéuticamente activo suspendido o disuelto en uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables. Los transportadores farmacéuticamente aceptables para la administración tópica de la compstatina o los análogos de compstatina divulgados en el presente documento incluyen, pero no se limita a, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una loción o crema adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables. Los transportadores adecuados incluyen, pero no se limita a, aceite mineral, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, ásteres cetílicos de cera, alcohol cetearílico, 2 octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para el suministro local en el ojo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden formularse adecuadamente, por ejemplo (pero sin limitación), en solución salina estéril isotónica de pH ajustado o en agua, con o sin un conservante, tal como cloruro de benzalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una pomada tal como vaselina o como un colirio.
Los métodos de administración local en el ojo incluyen, por ejemplo, inyección coroidea, inyección transescleral o colocación de un parche escleral, cateterismo arterial selectivo, colirio o pomadas para los ojos, administración intraocular, incluyendo la inyección transretiniana, bulbar subconjuntival e intravítrea, inyección supracoroidea, inyección subtenón, bolsillo escleral, inyección de corte escleral, mediante bomba osmótica, etc. Los análogos Cp40 también se pueden administrar alternativamente por vía intravascular, tal como por vía intravenosa (i.v.) o vía intraarterial. En inyección coroidea y parche escleral, el médico o el tratante utiliza un enfoque local en el ojo después de iniciar la anestesia adecuada, que incluye analgésicos y oftalmopléjicos. Una aguja que contiene la composición farmacéutica se dirige hacia la coroides o la esclerótica del sujeto y se inserta en condiciones estériles. Cuando la aguja esté correctamente colocada, el análogo de Cp40 se inyecta en la coroides o la esclerótica, o en ambas. Al usar cualquiera de estos métodos, el médico o el tratante pueden elegir una formulación de liberación sostenida o de acción prolongada. Por tanto, el procedimiento puede repetirse solo cada varios meses o varios años, dependiendo de la tolerancia del sujeto al tratamiento y la respuesta.
La administración intraocular de fármacos es bien conocida en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.632.984 y 5.770.589 y la publicación de Estados Unidos N.° 2016/0060297 A1. La patente de Estados Unidos N.° 6.378.526 proporciona métodos para la inyección intraescleral de un material terapéutico o de diagnóstico en un lugar que recubre la retina, que proporcionan una técnica mínimamente invasiva para suministrar el agente al segmento posterior del ojo.
En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica que contiene un análogo de Cp40 de la presente invención se suministra en la proximidad del ojo, por ejemplo, en estrecha proximidad al segmento posterior del ojo. La "proximidad al ojo" se refiere a ubicaciones dentro de la órbita, que es la cavidad dentro del cráneo en la que se encuentran el ojo y sus anejos. Por lo general, las composiciones se administrarían cerca de su diana prevista dentro del ojo, por ejemplo, cerca (dentro de varios milímetros) de la porción de la esclerótica que recubre el segmento posterior del ojo, o inmediatamente adyacente a la superficie exterior de la esclerótica. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se suministran en la cavidad vítrea del ojo (es decir, por vía intravítrea).
Se han utilizado varios vehículos de suministro poliméricos para proporcionar una liberación controlada en un contexto ocular y se pueden utilizar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Pueden utilizarse diversos polímeros, por ejemplo, polímeros biocompatibles, que puede ser biodegradable. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.692.759 describe métodos para la fabricación de un dispositivo implantable para proporcionar una liberación controlada de agentes terapéuticos en el ojo. Se han descrito otros polímeros y sistemas de suministro útiles para la administración ocular de un agente terapéutico. El agente activo puede liberarse a medida que se degrada el polímero. Los polímeros que se han utilizado para el suministro de fármacos incluyen, pero no se limita a, poli(ácido láctico-co-glicólico), polianhídridos, etileno-acetato de vinilo, ácido poliglicólico, quitosano, poliortoésteres, poliéteres, ácido poliláctico y poli(beta amino ésteres). También se han utilizado péptidos, proteínas tales como el colágeno y la albúmina, y dendrímeros (por ejemplo, dendrímeros PAMAM). Cualquiera de estos puede utilizarse en diversas realizaciones de la invención.
Se han introducido poli(ortoésteres) en el ojo y han demostrado propiedades favorables para la liberación sostenida de fármacos oculares. (véase Einmahl, S., 2002, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43(5)). Se han utilizado partículas de polilactida para dirigir un agente a la retina y el EPR después de la inyección intravítrea de una suspensión de tales partículas (Bourges et al., 2003, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44(8)). Un dispositivo implantable macroscópico adecuado para su introducción en el segmento posterior o anterior del ojo se denomina en el presente documento implante ocular (véase Jaffe, G., 2000, Invest. Ophthalmol. Hs. Sci., 41(11)). Por lo tanto, en el presente documento se proporciona un implante ocular que comprende un análogo de Cp40, por ejemplo, en una cantidad terapéuticamente eficaz para suministrar el análogo de Cp40 al individuo con una enfermedad o afección que se puede tratar mediante la inhibición del complemento. Dichos dispositivos pueden ser implantes macroscópicos que comprenden el análogo de Cp40 o pueden comprender una pluralidad de nanopartículas o micropartículas impregnadas con el agente o que lo encapsulan. En una realización, el implante ocular es cualquier implante ocular conocido en la técnica. Se describen implantes ilustrativos y métodos para la fabricación de los mismos, por ejemplo, en el documento US 2009/0220572 A1. Además, pueden utilizarse otros implantes conocidos en la técnica.
Otras realizaciones incluyen composiciones formadoras de gel que comprenden un colágeno soluble que son útiles para el suministro de compstatina o de análogos de compstatina al segmento posterior del ojo. El colágeno es inicialmente soluble y forma una solución que tiene una baja viscosidad, pero es capaz de formar rápidamente un gel en condiciones apropiadas, por ejemplo, las condiciones encontradas tras la administración a un sujeto mamífero.
Por tanto, la invención proporciona un sistema para el suministro de los agentes farmacéuticamente activos al segmento posterior del ojo. El sistema está diseñado para localizar tales moléculas en una concentración suficiente para proporcionar un suministro sostenido y, al mismo tiempo, permitir que la macromolécula se libere en cantidades suficientes. Además, el gel de colágeno puede proteger la compstatina o los análogos de compstatina frente a la degradación, por ejemplo, por proteasas endógenas.
La composición forma un gel después de la introducción en el organismo, por ejemplo, al contacto con un líquido fisiológico. La composición también puede formar un gel al entrar en contacto con un líquido tal como solución salina tamponada con fosfato u otro líquido que contenga los iones apropiados. Por lo tanto, la composición puede inyectarse en un lugar apropiado, por ejemplo, en estrecha proximidad al segmento posterior del ojo, donde forma un gel. Como alternativa, puede fabricarse un implante de gel preformado, por ejemplo, introduciendo la solución en un molde o cavidad de la forma deseada y permitiendo que se produzca la formación de gel en presencia de una concentración adecuada de una sal. La sal puede añadirse antes o después de la introducción de la solución en el molde o la cavidad. El molde o cavidad puede ser, por ejemplo, cualquier estructura que contenga un espacio hueco o una depresión cóncava en la que se puede introducir una solución. En otra realización, se forma una película o membrana a partir de la solución de colágeno que contiene un agente terapéutico.
La liberación del agente a partir del gel puede producirse por cualquier mecanismo, por ejemplo, por difusión del agente fuera del gel, como resultado de la descomposición del gel, o ambos. Un aspecto de la invención es la selección de concentraciones adecuadas de colágeno soluble y sólidos de colágeno que dan como resultado un gel que retiene el agente dentro del gel para proporcionar un suministro sostenido durante un período de tiempo deseado y al mismo tiempo permitir la liberación del agente a partir del gel en concentración suficiente para ser eficaz en su sitio de acción en el segmento posterior del ojo.
En conformidad con determinadas realizaciones de la invención, se prepara una solución que contiene el colágeno soluble y la compstatina o un análogo de compstatina combinando el colágeno soluble y la compstatina o el análogo de compstatina en solución utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, añadiendo la compstatina o el análogo de compstatina a una solución que contiene colágeno soluble. La composición se suministra de forma local en un lugar apropiado en o cerca del ojo de un sujeto mamífero, normalmente a un área fuera y estrecha proximidad al segmento posterior del ojo. La solución forma rápidamente un gel en o cerca del sitio de administración. La compstatina o el análogo de compstatina quedan atrapados dentro del gel y luego difunden fuera del gel o se liberan a medida que el gel se degrada con el tiempo, proporcionando de este modo un suministro continuo de compstatina o análogo de compstatina a los tejidos y estructuras que están en contacto físico directo con el gel o ubicados cerca, o suministrándolo en el torrente sanguíneo. En determinadas realizaciones, la solución se administra detrás de la esclerótica del ojo, como se analiza adicionalmente más adelante. El suministro puede lograrse por inyección (por ejemplo, utilizando una aguja de calibre 30 o similar), mediante catéter, etc., como se describe adicionalmente más adelante.
En la presente invención puede utilizarse una diversidad de preparados de colágeno distintas siempre que el colágeno sea inicialmente soluble y sea capaz de formar rápidamente un gel en las condiciones apropiadas. Se describen preparados de colágeno adecuadas y métodos para su fabricación, por ejemplo, en las Pat. de EE.UU. N.° 5.492.135; 5.861.486; 6.197.934; 6.204.365; y en el documento WO 00/47130, pero la invención no se limita a tales preparados o métodos. Estos colágenos se preparan en forma soluble y forman rápidamente un gel tras la exposición a líquidos fisiológicos u otros líquidos que tengan una concentración adecuada de iones. En conformidad con la presente invención, inyectar o introducir de otro modo la solución de colágeno en el ojo o cerca del ojo da como resultado la formación de gel, presumiblemente inducida por el contacto con líquidos fisiológicos. Sin embargo, cabe señalar que la invención no está limitada de ningún modo por el mecanismo por el que se produce la formación de gel. Además, como se ha señalado anteriormente, el gel puede formarse in vitro e implantarse en un lugar apropiado, por ejemplo, en estrecha proximidad al segmento posterior del ojo.
Un método adecuado de preparación de una solución de colágeno soluble implica la extracción de colágeno de una fuente natural, solubilizar con ácido el colágeno y dializar el colágeno solubilizado contra a una solución que contenga un agente quelante, por ejemplo, un agente quelante de metales tal como el ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidrato (EDTA), al tiempo que se sube el pH. Además, pueden realizarse una o más etapas de diálisis contra a una solución tal como agua desionizada que carezca del agente quelante. A diferencia de las soluciones de colágeno convencionales que experimentan fibrilogénesis espontánea a pH neutro y temperatura ambiente, las soluciones de colágeno para su uso en la presente invención permanecen en solución durante el almacenamiento durante periodos prolongados y experimentan rápidamente la formación de gel cuando se exponen a líquidos fisiológicos. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría, el agente quelante puede alterar la concentración de uno o más cationes e impedir así la fibrilogénesis que de otro modo se produciría al aumentar el pH. El agente quelante puede tener otros efectos convenientes sobre la solución de colágeno y, en determinadas realizaciones de la invención, la solución de colágeno comprende un agente quelante, por ejemplo, EDTA. El agente quelante puede permanecer en la solución de colágeno después de la diálisis o puede añadirse a la solución de colágeno. La concentración del agente quelante puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,02 M y aproximadamente 0,05 M, por ejemplo, entre aproximadamente 0,025 M y aproximadamente 0,035 M. Además, pueden utilizarse otros agentes quelantes que incluyen, pero sin limitación, los descritos en la Pat. de EE.UU.
N. ° 5.861.486.
En determinadas realizaciones la solución de colágeno tiene una concentración de colágeno soluble que varía entre 1 mg/ml y 100 mg/ml, por ejemplo, entre 10 mg/ml y 70 mg/ml, entre 20 mg/ml y 50 mg/ml, por ejemplo, 30 mg/ml, etc. En determinadas realizaciones de la invención el pH de la solución de colágeno es de entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5, por ejemplo, 7,0.
En determinadas realizaciones de la invención la composición de colágeno comprende además un componente fibrilar que comprende sólidos de colágeno fibrilar. Por ejemplo, determinadas composiciones de colágeno contienen entre 0,5 mg/ml y 30 mg/ml de sólidos de colágeno fibrilar, o entre 1 mg/ml y 20 mg/ml de sólidos de colágeno fibrilar, por ejemplo, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, etc. En términos de porcentaje de sólidos de colágeno fibrilar en peso/volumen, determinadas composiciones de colágeno contienen entre el 0,05 y el 3 % de sólidos de colágeno fibrilar, o entre el 0,1 y el 2 % de sólidos de colágeno fibrilar, por ejemplo, el 0,2 %, O, 3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,8 %, 1 %, 1,2 %, etc. En las composiciones de colágeno de la invención puede utilizarse cualquier componente fibrilar adecuado. Los sólidos de colágeno fibrilar pueden prepararse utilizando una diversidad de métodos. Por ejemplo, el colágeno fibrilar puede ser colágeno reconstituido preparado a partir de fuentes animales tales como piel bovina (Frontiers in Matrix Biology, Vol. 10, pág. 1-58, en Methods of Connective Tissue Research, Eds. Robert, Moczar y Moczar, S. Karger, Basilea, 1985). El colágeno fibrilar puede prepararse a partir de fuentes humanas o animales como se describe en las Pat. de EE.UU. N.° 4.969.912 y 5.322.802. Los sólidos de colágeno fibrilar se suspenden en una solución a una concentración que normalmente oscila de aproximadamente 10-100 mg/ml. La suspensión de colágeno que contiene sólidos fibrilares de colágeno se combina con, por ejemplo, se añade a, una composición de colágeno soluble ya sea antes o después de la adición del agente terapéutico a una solución que comprende colágeno soluble.
En algunas realizaciones de la invención, la preparación de colágeno soluble comprende un agente de reticulación químico. El agente puede reticular moléculas de colágeno y/o fibrillas entre sí y/o puede reticular un agente terapéutico tal como compstatina o un análogo de la misma con una molécula o fibrilla de colágeno. Los agentes de reticulación típicos reticulan los grupos de amina del colágeno entre sí o con los grupos de amina, carboxilo, fenol, sulfonilo o hidrato de carbono de los agentes terapéuticos. Los agentes de reticulación adecuados incluyen, pero no se limita a, los descritos en el documento WO 00/47130. Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, la reticulación puede estabilizar el gel de colágeno (por ejemplo, disminuir su velocidad de descomposición) y/o disminuir la velocidad de liberación del agente terapéutico a partir del gel.
Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, la presencia de sólidos de colágeno fibrilar puede tener cualquiera de una diversidad de efectos ventajosos. A modo de ejemplo no limitante, los sólidos de colágeno fibrilar pueden aumentar la estabilidad del gel de colágeno in vivo, por ejemplo, pueden disminuir la velocidad de descomposición del gel. Los sólidos de colágeno fibrilar pueden aumentar la estabilidad de un agente terapéutico contenido en el gel y/o disminuir o modular la velocidad a la que el agente se libera a partir del gel por difusión y/o descomposición del gel.
Las preparaciones de colágeno preferentemente forman un gel al cabo de 5 minutos (300 segundos) después del contacto con líquidos fisiológicos. Más preferentemente, las preparaciones de colágeno forman un gel al cabo de los 90 segundos, 2 minutos (120 segundos) o al cabo de los 3 minutos (180 segundos) siguientes al contacto con líquidos fisiológicos. Además, pueden utilizarse preparaciones que formen un gel al cabo de periodos de tiempo más cortos, por ejemplo, al cabo de 5-90 segundos, o más largos, por ejemplo, 3-5 minutos.
Se pueden utilizar en la presente invención cualquiera de los tipos de colágeno I-XXVIII, o mezclas de los mismos. El colágeno puede purificarse a partir de fuentes naturales (por ejemplo, tejido humano o tejido animal tal como de bovino, conejo, etc.) como se describe en las patentes y publicaciones mencionadas anteriormente. Alternativamente, el colágeno puede fabricarse utilizando técnicas de ADN recombinante, en cuyo caso la secuencia puede ser de origen humano o animal. Véanse, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. N.° 5.593.854 y 5.667.839. Los métodos para la producción de proteínas, por ejemplo, un polipéptido de interés tal como una cadena de colágeno, que utilizan tecnología de ADN recombinante, son bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen los descritos anteriormente. El término "colágeno" incluye fragmentos de colágeno. Por tanto, en determinadas realizaciones, el colágeno soluble comprende o consiste en un fragmento de colágeno o una combinación de fragmentos. En determinadas realizaciones, se utiliza una cadena polipeptídica de colágeno completa.
Si bien las preparaciones de colágeno tales como las descritas anteriormente son particularmente preferidas en determinadas realizaciones de la invención, en una composición formadora de gel de la invención también podría utilizarse una diversidad de otros materiales formadores de gel. En determinadas realizaciones el gel es un hidrogel, por lo que se entiende un gel que contiene una cantidad sustancial de agua. Preferentemente, el material y el gel que forma son biocompatibles. En determinadas realizaciones el material y el gel que forma son biodegradables. Una diversidad de colágenos modificados o derivatizados también son útiles en diversas realizaciones de la invención. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 5.201.764. Por ejemplo, el colágeno se puede acilar con uno o más agentes acilantes tales como anhídrido glutárico, anhídrido succínico y anhídrido maleico y al menos otro agente acilante seleccionado del grupo que consiste en anhídrido metacrílico, cloruro de beta-estireno sulfonilo, copolímero de etileno-anhídrido maleico, copolímero de estireno-anhídrido maleico o poli ácido (vinil)sulfónico.
Otros materiales formadores de gel incluyen, pero no se limita a, ácido hialurónico y formas modificadas del mismo, polisacáridos tales como alginato y formas modificadas del mismo, péptidos de autoensamblaje, etc. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 6.129. 761 para una descripción adicional del alginato y las formas modificadas del mismo, del ácido hialurónico y formas modificadas del mismo, y ejemplos adicionales de materiales formadores de gel solubles que son de uso en diversas realizaciones de la presente invención. Como se describe allí, otros precursores de hidrogeles poliméricos incluyen copolímeros de bloques de óxido de polietileno- polipropilenglicol, tales como Pluronics™ o Tetronics™, que se reticulan mediante puentes de hidrógeno y/o mediante un cambio de temperatura, como se describe en Steinleitner et al., Obstetrics & Gynecology, 77:48-52 (1991); y Steinleitner et al., Fertility and Sterility, 57:305-308 (1992). Otros materiales que pueden utilizarse incluyen proteínas tales como fibrina o gelatina. Además, pueden utilizarse mezclas de polímeros. Por ejemplo, puede utilizarse una mezcla de óxido de polietileno y ácido poliacrílico que gelifica mediante enlaces de hidrógeno tras la mezcla.
Los precursores de hidrogel reticulables covalentemente también son útiles. Por ejemplo, una poliamina soluble en agua, tal como quitosano, puede reticularse con un diisotiocianato soluble en agua, tal como polietilenglicol diisotiocianato. Los isotiocianatos reaccionarán con las aminas para formar un gel reticulado químicamente. Además, pueden utilizarse reacciones con aminas, por ejemplo, con dialdehído de polietilenglicol. Además, puede utilizarse un polímero soluble en agua hidroxilado.
Alternativamente, pueden utilizarse polímeros que incluyen sustituyentes que se reticulan mediante una reacción de radicales al entrar en contacto con un iniciador de radicales. Por ejemplo, pueden utilizarse polímeros que incluyen grupos no saturados con etileno que pueden reticularse fotoquímicamente, como se divulga en el documento WO 93/17669. En esta realización, se proporcionan macrómeros solubles en agua que incluyen al menos una región soluble en agua, una región biodegradable y al menos dos regiones polimerizables por radicales libres. Los macrómeros se polimerizan por exposición de las regiones polimerizables a los radicales libres generados, por ejemplo, por productos químicos fotosensibles y o la luz. Los ejemplos de estos macrómeros son PEG-oligolactilacrilatos, en donde los grupos acrilato se polimerizan utilizando sistemas iniciadores de radicales, tales como un colorante de eosina, o por una breve exposición a la luz ultravioleta o visible. Adicionalmente, pueden utilizarse polímeros solubles en agua que incluyen grupos cinamoílo que pueden reticularse fotoquímicamente, como se divulga en Matsuda et al., ASAlD Trans., 38:154-157 (1992). En general, los polímeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas o soluciones acuosas de alcohol. Los expertos en la materia conocen los métodos para la síntesis de los otros polímeros descritos anteriormente. Véase, por ejemplo, Concise Encyclopedia of Polymer Science y Polymeric Amines and Ammonium Salts, E. Goethals, editor (Pergamen Press, Elmsford, N. Y. 1980). Muchos polímeros, tales como el poli(ácido acrílico), se encuentran disponibles en el mercado. Los polímeros naturales y sintéticos pueden modificarse utilizando reacciones químicas disponibles en la técnica y descritas, por ejemplo, en March, "Advanced Organic Chemistry", 4a edición, 1992, Wiley-lnterscience Publication, Nueva York.
Los polímeros solubles en agua con grupos laterales cargados pueden reticularse haciendo reaccionar el polímero con una solución acuosa que contiene iones de carga opuesta, ya sea cationes si el polímero tiene grupos laterales ácidos o aniones si el polímero tiene grupos laterales básicos. Los ejemplos de cationes para la reticulación de los polímeros con grupos laterales ácidos para formar un hidrogel son cationes monovalentes tales como el sodio y cationes multivalentes tales como cobre, calcio, aluminio, magnesio, estroncio, bario y estaño, y cationes orgánicos di-, tri- o tetrafuncionales tales como sales de alquilamonio. Las soluciones acuosas de las sales de estos cationes se añaden a los polímeros para formar hidrogeles y membranas blandas y muy hinchadas. Cuanto mayor sea la concentración de catión, o mayor sea la valencia, mayor es el grado de reticulación del polímero. Adicionalmente, los polímeros se pueden reticular enzimáticamente, por ejemplo, fibrina con trombina. En algunas realizaciones, se utiliza un péptido de autoensamblaje, tal como los descritos en la Pat. de EE.UU. N.° 6.800.481. Estos péptidos se autoensamblan para formar una estructura de hidrogel al entrar en contacto con cationes monovalentes, por ejemplo, tales como los presentes en el líquido extracelular.
En las realizaciones de la invención en las que el gel se forma mediante la reticulación de cadenas poliméricas entre sí, la composición puede incluir un agente reticulante apropiado, que se selecciona de acuerdo con el polímero particular. Como alternativa, el agente de reticulación se puede administrar después de la administración de la composición que contiene el material formador de gel, sustancialmente en el mismo lugar. Cualquiera de estos geles se puede formar in vitro, por ejemplo, como se describió anteriormente para geles que comprenden colágeno soluble, e implantarse en un lugar apropiado en o en la proximidad del ojo.
En determinadas realizaciones, los implantes descritos en el presente documento comprenden entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 50 mg de un análogo de Cp40, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 40 mg entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 30 mg entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 20 mg entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 10 mg entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 9 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 8 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 7 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 6 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 5 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 4 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 3 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 2 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 1 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 500 pg.
Los métodos para fabricar micropartículas y nanopartículas son conocidos en la técnica. Generalmente, una micropartícula tendrá un diámetro de 500 micrómetros o menos, por ejemplo, entre 50 y 500 micrómetros, entre 20 y 50 micrómetros, entre 1 y 20 micrómetros, entre 1 y 10 micrómetros, y una nanopartícula tendrá un diámetro inferior a 1 micrómetro. Preferentemente, el dispositivo se implanta en el espacio ocupado por el humor vítreo. El implante ocular puede comprender una matriz polimérica. La invención también proporciona implantes perioculares, que son dispositivos implantables macroscópicos adecuados para su introducción en la proximidad del ojo, por ejemplo, en estrecha proximidad del ojo. En determinadas realizaciones, el implante periocular está fabricado de materiales similares a los descritos anteriormente.
En otras realizaciones, las células que expresan un análogo de Cp40 pueden implantarse en el ojo. La Pat. de EE.UU. N.° 6.436.427 proporciona un método para suministrar moléculas biológicamente activas al ojo implantando cápsulas biocompatibles que contienen una fuente celular de la molécula biológicamente activa.
En algunas realizaciones, pueden prepararse formas de liberación controlada para lograr una liberación sostenida o específica de la ubicación del análogo de compstatina en el tubo digestivo para mejorar la absorción y prevenir determinadas formas de metabolismo. Por ejemplo, pueden utilizarse recubrimientos resistentes a los ácidos de los materiales de los comprimidos o cápsulas resistentes a los ácidos para impedir la liberación de análogos de compstatina en el estómago y proteger el compuesto del metabolismo por las enzimas gástricas. Los materiales y recubrimientos adecuados para lograr una liberación controlada después del paso por el estómago se componen principalmente de ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales e incluyen, pero no se limita a, copolímeros de metil acrilato-ácido metacrílico, acetato succinato de celulosa, hidroxi propil metil celulosa ftalato, acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (acetato succinato de hipromelosa), acetato ftalato de polivinilo, alginato de sodio o ácido esteárico. La liberación sostenida en el tubo gastrointestinal se puede lograr, por ejemplo, incluyendo análogos de compstatina en una matriz de sustancias insolubles tales como diversos acrílicos, quitina y otros. Los expertos en la materia conocen métodos para preparar tales formulaciones.
La compstatina puede formularse en supositorios o enemas para administración rectal, vaginal o uretral. Con este fin, los análogos de compstatina pueden disolverse o suspenderse en un transportador de base grasosa tal como la manteca de cacao que es sólida o semisólida a temperatura ambiente, pero se derrite a la temperatura corporal, o en una base sólida soluble en agua tal como polietilenglicol o glicerina (elaborada de glicerol y gelatina). Se pueden añadir otros excipientes para mejorar la formulación, y los supositorios se conformarán en una forma que facilite la administración. En otras realizaciones, pueden utilizarse supositorios líquidos que consisten en análogos de compstatina disueltos o suspendidos en un transportador líquido adecuado para suministro rectal para ser aplicado con una jeringa pequeña.
Para el tratamiento de afecciones pulmonares crónicas o agudas en las que está implicada la activación del complemento, una vía preferida de administración de una composición farmacéutica es la administración pulmonar. Por consiguiente, una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse y/o comercializarse en una formulación adecuada para la administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Dicha formulación puede comprender partículas secas que comprenden el principio activo y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 7 nanómetros, y preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 nanómetros. Dichas composiciones están convenientemente en forma de polvos secos para la administración utilizando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al que se puede dirigir una corriente de propulsor para dispersar el polvo o utilizar un recipiente autopropulsor dispensador de disolvente/polvo tal como un dispositivo que comprende el principio activo disuelto o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente sellado. Preferentemente, tales polvos comprenden partículas en donde al menos el 98 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 0,5 nanómetros y al menos el 95 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 7 nanómetros. Más preferentemente, al menos el 95 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 1 nanómetro y al menos el 90 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 6 nanómetros. Las composiciones de polvo seco incluyen preferentemente un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en una forma de dosis unitaria.
Los propulsores de bajo punto de ebullición por lo general incluyen propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición inferior a 18,3 °C (65 °F) a presión atmosférica. Por lo general, el propulsor puede constituir el 50 al 99,9 % (p/p) de la composición, y el principio activo puede constituir el 0,1 al 20 % (p/p) de la composición. El propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo no iónico líquido o aniónico sólido, o un diluyente sólido (preferentemente con un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el principio activo).
Las composiciones farmacéuticas de la invención formuladas para suministro pulmonar también pueden proporcionar el principio activo en forma de gotitas de una solución o suspensión. Dichas formulaciones pueden prepararse, envasarse o comercializarse como soluciones o suspensiones acuosas o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden el principio activo, y pueden administrarse convenientemente utilizando cualquier dispositivo de nebulización o atomización. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, un agente saborizante tal como sacarina de sodio, un aceite volátil, un agente tamponante, un agente tensioactivo, incluyendo un tensioactivo pulmonar de sustitución, o un conservante tal como metilhidroxibenzoato. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración pueden tener preferentemente un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 nanómetros.
Las formulaciones descritas en el presente documento como útiles para el suministro pulmonar también son útiles para el suministro intranasal de una composición farmacéutica de la invención.
Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el principio activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 a 500 micrómetros. Dicha formulación se administra de la misma manera que se toma el rapé, es decir, por inhalación rápida a través de las fosas nasales desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de los orificios nasales.
Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender de aproximadamente tan solo el 0,1 % (p/p) y tanto como el 100 % (p/p) del principio activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "administración parenteral" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la ruptura física de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la rotura del tejido. La administración parenteral incluye, así, pero sin estar limitado a, la administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, mediante aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra en el tejido, y similares. En particular, se contempla que la administración parenteral incluya, pero sin estar limitado a, inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intravítrea, intraesternal y técnicas de infusión dialítica renal.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral comprenden el principio activo combinado con un transportador farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Dichas formulaciones pueden prepararse, envasarse o comercializarse en una forma adecuada para la administración por inyección en embolada o para la administración continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, envasarse o comercializarse en formas farmacéuticas unitarias, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contengan un conservante. Las formulaciones para administración parenteral incluyen, pero no se limita a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilización o dispersantes. En una realización de una formulación para administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir, en polvo o granulada) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse, envasarse o comercializarse en forma de una suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución puede formularse de acuerdo con la técnica conocida, y puede comprender, además del principio activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en el presente documento. Dichas formulaciones inyectables estériles pueden prepararse utilizando un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como, por ejemplo, agua o 1,3-butanodiol. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero no se limita a, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y aceites no volátiles tales como mono- o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones administrables por vía parenteral que son útiles incluyen las que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposómica, en microburbujas para suministro por liberación por ultrasonido o como componente de sistemas de polímeros biodegradables. Las composiciones para la liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble o una sal poco soluble.
Como se usa en el presente documento, "ingredientes adicionales" incluyen, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: excipientes; agentes tensioactivos que incluyen tensioactivos pulmonares de sustitución; agentes dispersantes; diluyentes inertes; agentes de granulación y disgregantes; agentes aglutinantes; agentes lubricantes; agentes edulcorantes; agentes saborizantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiológicamente degradables tales como gelatina; vehículos y disolventes acuosos; vehículos y disolventes oleosos; agentes de suspensión; agentes de dispersión o humectantes; agentes emulsionantes, emolientes; tampones; sales; agentes espesantes; rellenos; agentes emulsionantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Se conocen en la técnica otros "ingredientes adicionales" que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas de la invención y están descritos, por ejemplo, en Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Métodos:
Otro aspecto de la invención presenta métodos de regulación de la activación del complemento. En general, los métodos comprenden poner en contacto un medio en el que se desea la regulación de la activación del complemento con un análogo de compstatina de la presente invención, en donde la puesta en contacto da como resultado la regulación de la activación del complemento en el medio. El medio puede ser cualquier medio en el que se desee la regulación de la activación del complemento. En determinadas realizaciones, el medio incluye células o tejidos de un organismo, incluyendo (1) células o tejidos cultivados, (2) células o tejidos dentro del organismo de un sujeto o paciente, y (3) células o tejidos que se han extraído del organismo de un sujeto y serán sustituidos en el organismo del mismo paciente (por ejemplo, derivación extracorpórea de sangre o trasplante autólogo) o transferidos a otro paciente. En relación con la última realización, el medio puede comprender además un biomaterial, tal como tubos, filtros o membranas que entran en contacto con las células o tejidos durante la derivación extracorpórea. Alternativamente, el medio puede comprender biomateriales que se implantan en un sujeto.
En determinadas realizaciones, los métodos de regulación de la activación del complemento se aplican a pacientes o sujetos vivos y comprenden parte o la totalidad de un método de tratamiento del paciente para una afección patológica asociada con la activación del complemento, particularmente la activación del complemento mediada por la RA, que puede amplificar las respuestas efectoras del complemento y exacerbar el daño inflamatorio en tejidos y células, independientemente del mecanismo desencadenante de la activación del complemento. Muchas de estas afecciones patológicas son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Holers, 2008, citado anteriormente, e incluyen, pero no se limita a, el síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa); enfermedad por depósitos densos (EDD); glomerulonefritis C3 (GNC3); glomerulopatías C3; otras nefropatías mediadas por el complemento y enfermedades inflamatorias glomerulares; degeneración macular senil (DMS); cualquier trastorno ocular caracterizado por degeneración macular, neovascularización coroidea (NVC); neovascularización retiniana (NVR), vitreorretinopatía proliferativa, glaucoma, uveítis, inflamación ocular o cualquier combinación de estos; hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN); enfermedad por crioaglutininas (EC); anemias hemolíticas autoinmunitarias por anticuerpos calientes (las AHAAc); anemia drepanocítica; microangiopatías trombóticas asociadas a trasplantes; artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES); varias enfermedades renales autoinmunitarias y autoinflamatorias; miocarditis autoinmunitaria; esclerosis múltiple; traumatismo craneoencefálico y medular; lesión por isquemia-reperfusión (IR) cerebral, intestinal o renal; aborto espontáneo y habitual; síndrome antifosfolipídico (SAP); enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; otras afecciones inflamatorias neurodegenerativas sustentadas por remodelación sináptica anómala, hiperactividad de la microglía y deterioro cognitivo; asma; vasculitis pauciinmunitaria asociada a antiantígeno citoplasmático y nuclear (síndrome de Wegener); enfermedades de la piel autoinmunitarias no lúpicas tales como pénfigo, penfigoide ampolloso y epidermólisis ampollosa; choque postraumático, cáncer; periodontitis; gingivitis; y ateroesclerosis. En realizaciones particulares, la afección patológica se ha asociado con mutaciones y polimorfismos en el gen que codifica a FH y/o CD46, incluyendo, pero sin limitación: DMS, SHUa y glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II (GM-II, también denominada enfermedad por depósitos densos (EDD)). En otras realizaciones, los análogos de compstatina de la presente invención son adecuados para su uso como sustitutos de Eculizumab en el tratamiento de enfermedades para las que actualmente se prescriben esos agentes, o para las que se están desarrollando en estudios preclínicos y clínicos. Esas enfermedades incluyen, pero no se limita a, SUHa, HPN, C3G (EDD/C3GN), EC y DMS
Los métodos de tratamiento normalmente comprenden (1) la identificación de un sujeto con una enfermedad o afección que se puede tratar mediante la regulación de la activación del complemento como se describe anteriormente en el presente documento, (2) la medición de un parámetro de la enfermedad o afección que se puede tratar mediante la regulación de la activación del complemento utilizando técnicas convencionales de la técnica dentro del alcance del ámbito en la materia (por ejemplo, biopsia, histología, RMN, gammagrafía ósea, rayos X, tolerancia al dolor, postura, y similares), (3) la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un análogo de compstatina de la invención utilizando un régimen de tratamiento y una duración apropiada para la afección que se está tratando, y (4) la medición del parámetro de la enfermedad o afección como un indicio de que la enfermedad o afección ha experimentado mejoría o se ha tratado. La administración de la compstatina o del análogo de compstatina se puede realizar mediante cualquier vía de administración adecuada conocida en la técnica, incluyendo la vías oral, nasal (por ejemplo, a través de un aerosol nasal), intraocular (incluyendo intravítrea), rectal, inyección/infusión intravenosa, inyección/perfusión subcutánea, intramuscular, periodontal (por ejemplo, administración gingival o infiltración intrapapilar), tópica y similares. El desarrollo de dosificaciones y regímenes de tratamiento apropiados variará dependiendo de una serie de factores, incluyendo, pero sin limitación, el tipo de paciente y el tipo de patología que se está tratando, la edad del paciente y la vía de administración. El experto en la materia está familiarizado con el diseño de pautas de dosificación que tienen en cuenta tales variables. Por ejemplo, será evidente para el experto en la materia que la administración oral de un análogo de compstatina de la invención precisará una dosificación inicial más alta, debido a la menor biodisponibilidad a partir de la vía en comparación con, por ejemplo, la inyección intravenosa. Asimismo, la administración intramuscular de un análogo de compstatina de la invención precisará una dosis mayor que el suministro del mismo análogo por inyección intravenosa o intravítrea.
Las dosis terapéuticamente eficaces adecuadas se describen con más detalle en otra parte en el presente documento.
En una realización, se proporciona un método para tratar a un individuo, tal como un paciente humano o un primate no humano, con una enfermedad o afección que se puede tratar mediante la regulación de la activación del complemento, que incluye las etapas de identificar primero a un individuo con la enfermedad o afección que se pude tratar mediante la regulación de la activación del complemento y, a continuación, administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo basado en Cp40 de la invención, en donde la vía de administración es intravenosa o subcutánea, y en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del análogo basado en Cp40 es de entre aproximadamente 0,125 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg; preferentemente, la cantidad es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente de 5 mg/kg, o entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, o entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 4 mg/kg, o entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 3 mg/kg, o aproximadamente 3 mg/kg. En otra realización, la vía de administración es intramuscular, y la cantidad terapéuticamente eficaz del análogo basado en Cp40 es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg; preferentemente, la cantidad es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente de 35 mg/kg, o entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, o entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, o entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, o aproximadamente 2,5 mg/kg. En algunos aspectos, la vía de administración es por vía oral, y la cantidad terapéuticamente eficaz del análogo basado en Cp40 es de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg; preferentemente, la cantidad es de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg o entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg. En otra realización, la vía de administración es intravítrea, y la cantidad terapéuticamente eficaz del análogo basado en Cp40 es de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 10 mg; preferentemente, la cantidad es de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 2.000 pg o aproximadamente 1 mg. Otras dosis y vías de administración terapéuticamente eficaces adecuadas se describen con más detalle en otra parte del presente documento. En estas realizaciones, el método también incluye una o más etapas de medición que incluyen la medición de al menos un parámetro de la enfermedad o afección que se puede tratar mediante la regulación de la activación del complemento, utilizando técnicas convencionales en la técnica dentro del alcance del experto en la materia (por ejemplo, biopsia, histología, RMN, gammagrafía ósea, rayos X, tolerancia al dolor, postura, y similares), por lo que la medición del parámetro de la enfermedad o afección puede utilizarse como un indicio de que la enfermedad o afección se ha tratado, entendiéndose que la etapa de medición puede realizarse antes, durante y/o después de administrar el análogo basado en Cp40.
En otra realización, se proporciona un método de tratamiento de un individuo con una enfermedad o afección que se puede tratar mediante la regulación de la activación del complemento, que incluye administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz inicial de un análogo basado en Cp40 de la invención, en donde la vía de administración es intravenosa o subcutánea, y en donde la cantidad terapéuticamente eficaz inicial del análogo basado en Cp40 es de al menos aproximadamente 0,125 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg; preferentemente, la cantidad es de entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 3 mg/kg. Luego, este tratamiento es seguido por la administración al individuo de una dosis de mantenimiento de un análogo basado en Cp40 de la invención, en donde la vía de administración es intramuscular, y en donde la dosis de mantenimiento del análogo basado en Cp40 es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg; preferentemente, es de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. Alternativamente, la dosis de mantenimiento se administra por vía oral, y la dosis de mantenimiento del análogo basado en Cp40 es de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg; preferentemente, es de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. Otras vías de administración de la dosis de mantenimiento también se describen en otra parte del presente documento. Luego, la dosis de mantenimiento se administra a través de múltiples suministros proporcionados de una vez cada 2-3 días a aproximadamente una vez cada 1 mes; preferentemente, una vez cada 2 semanas. Alternativamente, la dosis terapéuticamente eficaz inicial es de al menos aproximadamente 2 mg/kg administrados por vía intramuscular. En estas realizaciones, el método también incluye una o más etapas de medición que incluyen la medición de al menos un parámetro de la enfermedad o afección que se puede tratar mediante la regulación de la activación del complemento, utilizando técnicas convencionales en la técnica dentro del alcance del experto en la materia (por ejemplo, biopsia, histología, RMN, gammagrafía ósea, rayos X, tolerancia al dolor, postura, y similares), por lo que la medición del parámetro de la enfermedad o afección puede utilizarse como un indicio de que la enfermedad o afección se ha tratado, entendiéndose que la etapa de medición puede realizarse antes, durante y/o después de administrar el análogo basado en Cp40.
Además, en el presente documento se proporcionan métodos novedosos de generación de anticuerpos contra análogos de compstatina. El método normalmente incluye la inmunización de un animal adecuado para generar anticuerpos, tal como una rata, ratón, mono, conejo, cabra, cerdo u oveja. En una realización preferida, un conejo se inmuniza con un análogo de compstatina; preferentemente, el análogo de compstatina es Cp40 o un análogo basado en Cp40 (por ejemplo, Cp40-KK o Cp40-KKK). En tales aspectos, el análogo de compstatina se conjuga con una proteína transportadora adecuada, tal como la hemocianina de lapa californiana (HLC), antes de la inmunización. En otras realizaciones, el análogo de compstatina se conjuga con la proteína transportadora en una mezcla que comprende además un adyuvante; preferentemente, es un adyuvante fuerte. Los adyuvantes típicos incluyen compuestos inorgánicos (por ejemplo, alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, hidróxido fosfato de calcio), aceite mineral, detergentes, saponinas vegetales, citocinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-12, copolímeros de bloques y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, en una realización particular, se inmuniza un conejo con Cp40 o un análogo basado en Cp40 conjugado con HLC en presencia de un adyuvante fuerte. La dosis de inmunización varía entre aproximadamente 50 pg y aproximadamente 500 pg; preferentemente, la dosis es de aproximadamente 100 pg. Después, al animal inmunizado se le administra la composición de análogo-HLC-adyuvante mediante inyección cada 2 días a cada 4 semanas; preferentemente, el animal se inyecta semanalmente. Las inyecciones se continúan durante al menos 2 semanas, por ejemplo, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más. En una realización preferida, al animal inmunizado se le proporcionan inyecciones de 4 semanas de la composición de análogo-HLC-adyuvante durante 5 semanas. Las inyecciones comprenden intervalos de dosis de 10 pg a aproximadamente 100 pg; preferentemente, la dosis es de aproximadamente 50 pg. A continuación, los anticuerpos específicos para Cp40 se purifican a partir del suero animal mediante cualquier técnica de purificación de proteínas adecuada conocida en la técnica, por ejemplo, cromatografía de afinidad. Los anticuerpos para Cp40 y Cp40-Lisina producidos por el método descrito en el presente documento son altamente específicos para el péptido Cp40 o Cp40-Lisina como se describe con mayor detalle a continuación en el Ejemplo 7. Por tanto, estos anticuerpos novedosos no solo pueden detectar específicamente los distintos análogos de compstatina, sino que pueden discriminar además entre las versiones no modificadas y modificadas con lisina de los mismos. En una realización preferida, los anticuerpos novedosos son anticuerpos monoclonales.
Además, en el presente documento se proporcionan métodos novedosos y sensibles para la detección de los análogos basados en Cp40 descritos en el presente documento, en líquidos biológicos, incluidos aquellos de los que solo se pueden extraer escasas muestras de volumen mínimo, tales como el vítreo. Dichos métodos precisan solo cantidades muy pequeñas de líquido biológico. Estos métodos emplean análisis por RPS realizados en muestras de vítreo o muestras de plasma que contienen los análogos basados en Cp40 de interés. En una realización, se proporciona un método de detección de un análogo basado en Cp40 en una muestra biológica que incluye las etapas de (1) proporcionar una muestra biológica que contiene moléculas de análogo basado en Cp40, en que al menos una porción de estos análogos están unidos a C3/C3b/C3c; (2) proporcionar un chip sensor CM5 al que se unen covalentemente una pluralidad de moléculas de Cp40 o de análogo de Cp40; (3) inactivar con calor la muestra biológica para liberar los análogos de compstatina de las moléculas diana (es decir, C3/C3b/C3c); (4) mezclar la muestra inactivada por calor con una cantidad predeterminada de C3 de plasma humano como fuente de C3; (5) poner en contacto la mezcla de la muestra inactivada por calor con una cantidad fija de C3 o de plasma humano con el chip sensor CM5, por lo que las moléculas de análogo de Cp40 liberadas de los complejos de Cp40 unido a la diana en la muestra biológica, competirán con las moléculas de/análogos Cp40 inmovilizados en el chip sensor CM5 para unirse a C3 o a C3 procedente de plasma; y (6) detectar la C3 libre por la unión a Cp40 o sus análogos inmovilizados en el chip sensor CM5. La señal por RPS es directamente proporcional a la cantidad de C3 unida a las moléculas de Cp40 inmovilizadas o sus análogos. Por lo tanto, una reducción de la señal por RPS corresponde a la reducción de la unión de C3 libre a Cp40 inmovilizado y sirve como medida de la cantidad de Cp40 o análogos de Cp40 libres presentes en la muestra biológica inactivada por calor. La cuantificación de la cantidad desconocida de análogo de Cp40 en la muestra se realiza de acuerdo con una curva patrón de concentraciones conocidas de péptido. En una realización preferida, las moléculas de Cp40 que están unidas covalentemente al chip sensor CM5 son las mismas moléculas de análogo basado en Cp40 de interés en la muestra biológica. Por ejemplo, en una realización particular, Cp40-KKK se une covalentemente al chip sensor CM5 y la muestra biológica (por ejemplo, una muestra de vítreo) primero se inactiva con calor, como se describe anteriormente, y posteriormente se mezcla con una fuente calibrada de C3 y se hice fluir sobre el chip para permitir la detección competitiva del péptido liberado de los complejos de Cp40-KKK unida a C3/C3b/C3c en la muestra.
Para describir la invención con mayor detalle se proporcionan los siguientes ejemplos. Su objetivo es ilustrar, no limitar, la invención.
Ejemplo 1. Diseño de análogos basados en Cp40.
Cp40 (DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-NH2) (SEQ ID NO: 7), Cp40-Lys-NH2 (Cp40-K; SEQ ID NO: 8), Cp40-Lys-Lys-NH2 (Cp40-KK; SEQ ID NO: 9) y Cp40-Lys-Lys-Lys-NH2 (Cp40-KKK; SEQ ID NO: 10) se sintetizaron en el laboratorio o en GL Biochem (Shanghai, China) utilizando síntesis peptídicas de fase sólida de Fmoc y se purificaron utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) basada en técnicas conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, Qu, H. et al., 2011, Mol Immunol 48:481-489; Qu, H. et al., 2013, Immunobiology 218:496-505). Como se ilustra en la FIG. 2, la pureza de los compuestos se verificó mediante RP-HPLC y espectrometría de masas de desorción ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) en un Micromass® MALDI micro MX™ (Waters Corporation, Milford, MA). Dependiendo de la cantidad de reticulación, para la RP-HPLC se utilizó una columna xBridge BEH C18 (tamaño de partícula de 5 pm, longitud de 150 mm, Waters Corporation, Milford, MA) con un diámetro de 4,6, 10 o 19 mm, y la elución se logró con un gradiente de acetonitrilo al 5-70 % en una solución acuosa de TFA al 0,1 % en 30 min a un caudal de 2, 4,5 o 16 ml/min, respectivamente.
La síntesis de mPEG(3k)-, mPEG(2k)-, mPEG(1k)- y mPEG(1056)-Cp40 se llevó a cabo basándose en procedimientos de PEGilación conocidos en la técnica (documento US 8.962.553; Risitano et al., 2014, Blood 123:2094-2101). En resumen, se disolvió 1 equiv. de Cp40 (5 mg/ml) en acetonitrilo/agua (1:1) y se añadieron 2 equiv. del éster de mPEG activado respectivo. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 8 utilizando nmetilmorfolina. Después de agitar durante 0,5-1 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se inactivó con la adición de TFA acuoso al 0,1 % (pH 2). Todos los péptidos se purificaron por RP-HPLC como se describe anteriormente y se caracterizaron por MALDI-TOF MS (véase la FIG. 2).
Para la preparación de mPEG(528)-Cp40, se sintetizó el Cp40 lineal en resina como se describe anteriormente (véanse, por ejemplo, Qu, H. et al., 2011, Mol 48:481-489; Qu, H. et al., 2013, Immunobiology 218:496-505). Después de la desprotección de Fmoc del aminoácido N-terminal final Fmoc-DTyr(tBu)-OH mediante el uso de piperidina al 20 % en DMF, se añadieron 3 equiv. de mPEG(528)-NHS éster en d Mf a las perlas secas. El pH se ajustó a 8,0 utilizando n-metilmorfolina, y se permitió que prosiguiera la agitación durante 2 h en un rotador. La finalización de la reacción se confirmó mediante la prueba de Kaiser. Posteriormente, las perlas se lavaron con DMF y DCM y se secaron al vacío. El péptido se escindió de la resina como se describe en Qu et al. (citado anteriormente). El péptido desprotegido lineal bruto liofilizado (1 equiv.) se disolvió en metanol acuoso al 80 % y se añadió lentamente yodo 20 mM (13 equiv.) en metanol con agitación vigorosa. Después de 30 min de agitación a temperatura ambiente, la reacción de ciclación se inactivó mediante la adición de ácido ascórbico acuoso 20 mM. Se eliminó el metanol a presión reducida y el péptido bruto se purificó por RP-HPLC como se describe anteriormente. A continuación, el péptido se caracterizó mediante MALDITOF MS (véase la FIG. 2).
Todos los péptidos se obtuvieron inicialmente como una sal de TFA y además se convirtieron en una sal de acetato en la columna de HPLC utilizando acetato de amonio acuoso 25 mM como se describe en el documento EP 2163558 A3. La masa de los compuestos finales se confirmó mediante MALDI-TOF MS. Los péptidos utilizados para los experimentos in vivo se probaron en cuanto a la presencia de endotoxina (<0,03 UE/ml). Cp40, Cp40-K, Cp40-KK y Cp40-KKK se sintetizaron en GL Biochem (Shanghai, China) utilizando síntesis peptídica de fase sólida Fmoc y se purificaron utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) basada en un procedimiento descrito anteriormente por Qu et al. La pureza de los compuestos se verificó mediante RP-HPLC y MALDI-TOF MS (FIG. 2) en un Micromass® MALDI micro MX™ (Waters Corporation, Milford, MA). Dependiendo de la cantidad de reticulación, para la RP-HPLC se utilizó una columna XBridge BEH C18 (tamaño de partícula de 5 pm, longitud de 150 mm, Waters Corporation, Milford, MA) con un diámetro de 4,6, 10 o 19 mm, y la elución se logró con un gradiente de acetonitrilo al 5-70 % en una solución acuosa de TFA al 0,1 % en 30 min a un caudal de 2, 4,5 o 16 ml/min, respectivamente.
Ejemplo 2. Solubilidad de los análogos basados en Cp40.
Para probar la solubilidad de los análogos basados en Cp40 diseñados en el Ejemplo 1, para cada análogo, se pesaron 5-10 mg del péptido en un tubo Eppendorf LoBind y se mezclaron con 20 pl de PBS (pH 7,4). La mezcla se sometió a agitación vorticial y se centrifugó durante 2 min a 16.873 x g. A menos que se indique otra cosa, si el péptido respectivo no se disolvía, se añadía PBS en porciones de 10 pl, seguido de agitación vorticial y centrifugación, hasta que desapareciera todo el precipitado. El pH de las soluciones peptídicas se determinó con papel indicador (tiras reactivas de amplio intervalo de pH Whatman™ 2614-991, tipo CF, con tabla colorimétrica, intervalo de pH 4,5-10, tamaño 6x80 mm). Las concentraciones de las soluciones finales se determinaron basándose en la absorbancia medida en un espectrofotómetro NanoDrop™ 2000c (Thermo Scientific, Wilmington, DE) a 280 nm, utilizando la ecuación c = A/sb (c = concentración, A = absorbancia, £ = coeficiente de extinción, b = longitud de la trayectoria).
Mientras que Cp40 es altamente soluble en agua, es menos soluble a pH fisiológico (0,8 mg/ml en PBS a pH 7,4) (Qu et al., 2013, Immunobiology 218:496-505). Por lo tanto, para crear un Cp40 con solubilidad mejorada sin disminuir significativamente la actividad inhibitoria o la afinidad de unión por C3, Cp40 se modificó en su región N-terminal o en su región C-terminal como se describe en el Ejemplo 1.
Informes anteriores indicaron que Cp40 modificado con una cadena de PEG de 40 kDa en su extremo C se asoció con una caída en la actividad inhibitoria, mientras que el Cp40 modificado con una cadena de PEG de 40 kDa en su extremo N presentó un tiempo de permanencia prolongado en plasma después de la administración in vivo en PNH, pero tenía una afinidad de unión más de 100 veces menor en comparación con Cp40 no modificado (Risitano et al., 2014, Blood 123:2094-2101; véanse las Fig. 2 y 3. En el presente estudio, el extremo N del Cp40 se acopló a cadenas de PEG polidisperso de 1, 2 o 3 kDa mediante acoplamiento de amida. Los análogos resultantes se denominaron mPEG(3k)-Cp40, mPEG(2k)-Cp40 y mPEG(1k)-Cp40 (FIG. 1). La PEGilación aumentó en gran medida la solubilidad de los análogos basados en Cp40 resultantes, mostrando mPEG(3k)-Cp40 la mayor solubilidad en PBS, >270 mg/ml (pH = 7,0, Tabla 2).
Los compuestos PEGilados con polímeros polidispersos tienen una estructura menos definida haciéndolos más difíciles de caracterizar (Veronese, 2001, Biomaterials 22:405-417). Para crear una estructura mejor definida que se pueda caracterizar mejor, se llevó a cabo PEGilación de Cp40 utilizando polímeros monodispersos utilizando los ésteres de NHS activados de mPEG(1056) y mPEG(528). Mientras que la PEGilación utilizando PEG polidispersos y mPEG(1056) se realizó con Cp40 presintetizado, la PEGilación del compuesto monodisperso mPEG(528)-Cp40 se llevó a cabo sobre resina, eliminando una etapa adicional de purificación por HPLC. Se descubrió que las propiedades de solubilidad del análogo mPEG(1056)-Cp40 monodisperso resultante eran muy similares a las de su homólogo polidisperso. Por lo contrario, la unión de una cadena de PEG más pequeña (528 Da) dio como resultado una caída significativa de la solubilidad, de aproximadamente 140 a 2,3 mg/ml en PBS (Tabla 2).
Además de la PEGilación, se utilizó la incorporación de restos hidrófilos/cargados como un enfoque alternativo para aumentar la solubilidad de Cp40. Para este fin, uno, dos o tres restos de lisina se unieron al extremo C de Cp40 durante la síntesis peptídica. Notablemente, la solubilidad del compuesto aumentó con el número creciente de restos de Lys, es decir, la solubilidad de Cp40-K (37 mg/ml) fue mucho menor que la de Cp40-KK y Cp40-KKK (>245 mg/ml) (Tabla 2). Notablemente, mientras que se midió un pH de 7 - 7,5 en soluciones de Cp40-KK 277 mg/ml en PBS, la presencia del tercer resto de Lys condujo a un pH más alto en las respectivas soluciones de Cp40-KKK. Se observó un pH en el intervalo de 7 solo con una concentración de Cp40-KKK de 7 mg/ml (Tabla 2).
Tabla 2. Solubilidad y pH de los análogos basados en Cp40 en PBS.
Análogo Conc. (mg/ ml) pH
Cp40 1,08 7,5
mPEG(3k)-Cp40 >270 7
mPEG(2k)-Cp40 172 7,5
mPEG(1k)-Cp40 157 7-7,5
mPEG(1056)-Cp40 137 7-7,5
mPEG(528)-Cp40 2,3 7-7,5
Cp40-K 7,1 7,5
Cp40-KK >272 7-7,5
Cp40-KKK >245 8,5
Cp40-KKK 7,0 7,5*
Cp40-KKK >100** 9,5
*pH ajustado tras la adición de PBS.
**después de liofilización adicional de H2O.
Ejemplo 3. Potencia inhibidora del complemento y afinidad por la diana de los análogos basados en Cp40.
Para determinar si los péptidos modificados conservaban la actividad inhibidora de Cp40 y la afinidad por la diana, se evaluó la inhibición de la actividad de la ruta clásica del complemento en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) in vitro (véase, por ejemplo, Mallik, 2005, Journal of Medicinal Chemistry 48:274-286). En resumen, se detectó basándose en la deposición de C3b la activación del complemento mediada por el complejo antígenoanticuerpo en plasma humano normal en presencia o ausencia de Cp40 y sus análogos. Con este fin, se recubrieron pocillos de microtitulación (NUNC) con 50 pl de ovoalbúmina al 1 % en PBS (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 2 h. Los pocillos se bloquearon con 200 pl de BSA al 1 % en PBS durante 1 h, luego se recubrieron con 50 pl de anticuerpo policlonal para a-ovoalbúmina 1:1000 en PBS durante 1 h. Entre cada etapa, la placa se lavó tres veces con 200 pl de Tween 20 al 0,05 % en PBS (PBS-T); se pusieron 30 pl de VBS (tampón de barbital IX; barbital 5 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 150 mM, CaCl 0,5 mM2 y MgCl 0,5 mM2) en todos menos el primer pocillo de cada fila de la placa de 96 pocillos, y se prepararon soluciones de péptido 5 pM en VBS. Las concentraciones de péptidos se determinaron en un espectrofotómetro Nanodrop™ 2000c de Thermo Scientific a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 12.615 M"1cm"1 para todos los péptidos. Se incubó plasma humano diluido 1:40 en VBS durante 15 min con péptido de 0,005 a 2,5 pM. Después de lavar con PBS-T, se añadieron a los pocillos 50 pl/pocillo de anticuerpo a-C3 humana en cabra conjugado a HRP 1:1000 en BSA al 1 % en PBS y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La fijación del complemento que indica la activación se detectó mediante la adición de sustrato de HRP (ABTS al 0,05 % y el 0,1 % de H2O2 acuosa al 30 %) en citrato de sodio 0,1 M, pH 4,2) y lectura a 405 nm. Los datos de absorbancia obtenidos a 405 nm se tradujeron en % de inhibición, considerando el 100 % como igual a la activación del complemento en ausencia de péptido. El porcentaje de inhibición se representó frente al logaritmo de las concentraciones y el conjunto de datos resultante se ajustó a la ecuación "log(inhibidor) frente a respuesta normalizada" utilizando GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA). Los valores de CI50 se obtuvieron de los parámetros ajustados de la media de al menos tres experimentos independientes. Cp40 siempre se utilizó como control interno.
Las afinidades de unión y los perfiles cinéticos de los análogos basados en Cp40 con C3b se evaluaron mediante RPS utilizando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare, Piscataway Township, NJ) basándose en los protocolos descritos anteriormente (véanse, por ejemplo, Qu et al., 2011, Mol Immunol 48:481-489; Qu et al., 2013, Immunobiology 218:496-505; Magotti et al., 2009, jMol Recognit 22:495-505; Huang et al., 2014, ChemMedChem 9:2223-2226). Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C utilizando HEPES 0,01 M, pH 7,4, con NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005 % (HBS-EP) como tampón de ejecución. Se recubrió C3b humana purificado (Complement Technology, Inc., Tyler, TX) en un chip sensor CM5 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) a densidades de 11.000-20.000 unidades de resonancia (RU) mediante acoplamiento de amida, según se adapta del procedimiento de inmovilización proporcionado con el Amine Coupling Kit de GE Healthcare. Se utilizó una celda de flujo no recubierta como superficie de referencia. Se inyectó sucesivamente una serie de cinco muestras de concentraciones crecientes de cada análogo Cp40 (2,5, 5, 10, 20, 40 nM) durante 2 min, cada una a un caudal de 30 pl/min, con una etapa final de disociación de 80 min. Cp40 se incluyó en cada experimento de RPS como control interno. Cada péptido se exploró en al menos tres experimentos independientes. Todos los sensogramas se procesaron utilizando el programa informático Scrubber (BioLogic Software, Campbell, Australia). Los datos resultantes se ajustaron globalmente a un modelo de unión de Langmuir 1:1 en el programa informático BIAe Evaluation (GE Healthcare) para obtener la constante de disociación de equilibrio (KD) de la ecuación KD = kd/ka.
Como se muestra en la Tabla 3 y en la FIG. 3, la actividad inhibidora del péptido Cp40 modificado no se vio significativamente influenciada por la PEGilación en el extremo N o la adición de restos de Lys en el extremo C. Por lo contrario, la afinidad de unión de los péptidos individuales a C3b se vio afectada por las modificaciones de Cp40 (Tabla 3). Mientras que la adición de la cadena de PEG más corta al extremo N de Cp40 (mPEG(528)-Cp40) dio como resultado una caída de 5 veces de la afinidad de unión hacia C3b, el aumento de la longitud de la cadena de PEG disminuyó aún más la afinidad de mPEG(3k)-Cp40 (Kd 7,9 nM) en comparación con la de Cp40 (Kd 0,5 nM) (Tabla 3 y FIG. 4 y 5). Por otra parte, la unión de restos de Lys tuvo un efecto positivo sobre la unión de los análogos resultantes a C3b. Mientras que la adición de un único resto de Lys no afectó significativamente la unión, la adición de dos o tres restos de Lys dio como resultado un aumento de 1,25 y 2,5 veces en la afinidad de unión para C3b, respectivamente (Tabla 3 y FIG. 4 y 5). En general, la variación en la tasa de asociación ((0,7 - 4) x 106 M' V ) de los diversos análogos fue superior a la de la tasa de disociación ((1,2 - 2,8) x 10' V ) .
________Tabla 3. Actividad inhibidora y afinidad de unión a C3b de los análogos basados en Cp40.*________ Análogo CI 50 (nM) ka (10 ° M ' s ' ) kD (10 -3 s -1 ) Kd (nM) ~ Cp40 5° ,8 ± 3,0 3 57 ± 0,70 1,84 ± 0,40 0 53 ± 014 mPEG(3k)-Cp40 83,0 ± 7,0 045 ± 0,27 2,40 ± 0,91 791 ± 202 mPEG(2k)-Cp40 83,8 ± 4,5 054 ± 0,13 2,39 ± 0,4° 4 47 ± 0 °1 mPEG(1k)-Cp40 52,7 ± 2,9 07° ± 0,15 2,18 ± 014 2 98 ± 054 mPEG(105°)-Cp40 52,0 ± 2,7 072 ± 0,25 2,80 ± 0,95 3 93 ± 039 mPEG(528)-Cp40 83,5 ± 8, 1 100 ± 0,27 2,45 ± 028 258 ± 051
Cp40-K 95,° ± 9,2 198 ± 0,20 1,85 ± 0,50 092 ± 020
Cp40-KK °1 ,8 ± 4,2 3 94 ± 1,2° 1,52 ± 0,25 044 ± 017
Cp40-KKK 81,7 ± 5,3 3.83 ± 2,58 1,24 ± 0,42 0,21 ± 009 ka, constante de asociación
kd, constante de disociación
Kd , constante de disociación de equilibrio
*Todos los valores se calcularon a partir de la media de al menos tres experimentos independientes._____________
Ejemplo 4. Análisis farmacocinético de análogos basados en Cp40 en plasma de primates no humanos después de administración subcutánea.
Métodos. Cp40, mPEG(3k)-Cp40, Cp40-KK y Cp40-KKK se evaluaron in vivo en PNH para evaluar la influencia de la PEGilación y la conjugación de Lys en sus perfiles farmacocinéticos. Los estudios se realizaron en el Simian Conservation Breeding and Research Center (SlCONBREC), Inc. (Makati, Filipinas). Cada análogo peptídico (Cp40, Cp40-KK, Cp40-KKK, mPEG(3k)-Cp40) se probó en dos monos machos sanos de ° a 7 años (Macaca fascicularis), con un peso corporal de aproximadamente 4 kg. Cada péptido se administró a 2 mg/kg en una única inyección subcutánea: se disolvieron 8 mg de Cp40 neto en 2 ml de solución salina estéril (Cp40, Cp40-KK), 0,5 ml de solución salina estéril (mPEG(3k)-Cp40) o 0,25 ml de tampón de fosfato 100 mM (Cp40-KKK) y se inyecto por vía subcutánea con una jeringa de seguridad de insulina de 3/10 ml con aguja 29GX1/2". Las muestras de sangre se recolectaron antes (0 h) y en varios puntos de tiempo después de la administración de la muestra (t = 5 min, 30 min, 1, 2, 4, °, 12, 24, 48, 72, 9°, 120 h) en tubos de recolección de sangre vacutainer con EDTA para impedir la coagulación y la activación del complemento. Todas las muestras de sangre se centrifugaron a ~800 x g durante 10 min y las muestras de plasma resultantes se congelaron inmediatamente y se enviaron a la Universidad de Pensilvania para su posterior análisis. Todos los estudios en PNH se realizaron en conformidad con las leyes y normas de bienestar animal.
Para analizar las muestras de plasma y determinar la semivida en plasma, primero se realizó la preparación de soluciones patrón y de muestras de plasma. Las curvas de calibración se prepararon junto con las muestras de plasma analizadas: Se añadieron soluciones madre del péptido respectivo (Cp40, Cp40-KK, Cp40-KKK o mPEG(3k)-Cp40) en plasma de PNH no tratado a concentraciones finales de 1, 2, 4, 8 y 1° pM. Las concentraciones de las soluciones madre se determinaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop™ 2000c de Thermo Scientific a 280 nm. Antes de continuar con el análisis, todas las muestras de plasma se trataron con metanol para la precipitación de proteínas de la siguiente manera: se mezclaron 50 pl de plasma de PNH a analizar en un tubo Eppendorf LoBind de 0,5 ml con 150 pl de metanol que contenía Cp40 marcado con isótopo (DTyr-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-[13C°;15N4]Arg-Cys]-mIle-NH2 , Bachem, Torrance, CA) 0,5 pg/ml, lo que sirvió como patrón interno (PI). La mezcla se agitó durante -8 min, se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 min y se centrifugó durante 20 min a 16.873 x g. El sobrenadante se mezcló 1:1 con una solución de metanol al 20 % en formiato de amonio acuoso 10 mM (pH 3) en un vial de inyección (TruView LCMS Certified Clear Glass 12x32mm Screw Neck Total Recovery Vial, Waters Corporation, Milford, MA). Para las muestras de mPEG(3k)-Cp40, se utilizó MeCN acuoso al 3 % en lugar de la solución de formiato de amonio.
Para la cromatografía líquida y la espectrometría de masas, las muestras de plasma se procesaron como se describe anteriormente y se analizaron mediante cromatografía líquida de ultrarrendimiento-ionización por electropulverización-espectrometría de masas en tándem (UPLC-ESI-MS) basándose en los procedimientos descritos en la técnica (véanse Qu et al., 2013, Immunobiology 218:496-505; Primikyri et al., 2017, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 1041-1042:19-26). El método se ajustó ligeramente para el análisis de las muestras de plasma que contenían mPEG(3k)-Cp40. En este caso, se aplicó una energía de colisión fija de 35 V en la trampa de iones. Para la preparación de curvas patrón, las áreas bajo la curva (las ABC) de los respectivos picos de Ms (Cp40 triple cargado y Cp40 marcado con isótopos, Cp40-K de carga cuádruple (fragmento), Cp40-KK y Cp40-KKK, y el fragmento monocargado a 436,256 m/z de mPEG(3k)-Cp40 (-Sar-Ala-His-Arg-)) se determinaron por integración y se representaron frente a la concentración. La concentración plasmática en cada punto de tiempo se calculó a partir del área del pico extraída de los mismos picos de masa de cada péptido utilizando la curva patrón correspondiente.
Para determinar la semivida plasmática y parámetros farmacocinéticos adicionales, la semivida de los péptidos en plasma de PNH se determinó como se describe en Qu et al. (citado anteriormente) y Primikyri et al. (citado anteriormente). La concentración máxima (cmáx) y el tiempo de máxima concentración observado (tm áx) se determinaron manualmente a partir de los perfiles farmacocinéticos. El ABC de 0-120 h (ABC0.t), el ABC desde 0-tiempo infinito (ABCo-0.~), el volumen aparente de distribución Vz/F, (F = biodisponibilidad) y la depuración aparente CL/F se calcularon utilizando las siguientes ecuacionesABC0_tn / n utnc(t), ABCü-~ = ABCü-t + ABCt -~— F = fc —e] F — = AB DC0Sq-1mS , con tn= 120 h, kei = la constante de eliminación. Los parámetros farmacocinéticos individuales se calcularon utilizando un enfoque no compartimental con el programa informático Phoenix 64 WinNonlin Build 8.0.0.3176. Se utilizó el modelo de plasma (dosificación extravascular) con interpolación lineal trapezoidal lineal.
Se llevó a cabo inmunonefelometría para determinar los niveles del componente C3 del complemento en plasma de PNH, utilizando el kit Human Complement Factors (C3c) assay kit (Dade Behring, Marburgo, Alemania). Para validar el ensayo para la cuantificación de C3 en plasma de PNH, se midieron primero las concentraciones de C3 en ser humano y luego en plasma de PNH para determinar los diferentes grados de reactividad de los anticuerpos en el kit. Con este fin, se añadieron diluciones en serie de plasma de PNH con concentraciones conocidas de C3 purificada de monos cinomolgos. Se correlacionaron las concentraciones de C3 determinadas en plasma humano y de PNH, y se obtuvo un factor de corrección (FC) de 1,2 para la concentración de C3 en plasma de PNH. Las concentraciones de C3 en plasma de PNH cc3* se midieron por nefelometría y se corrigieron con respecto las concentraciones finales utilizando la ecuación cc 3 = cc 3* ■ CF. Los niveles de referencia de C3 y los niveles de C3 durante el transcurso de los experimentos se evaluaron utilizando el ensayo descrito.
Para la evaluación de la proteólisis de Cp40-KK y Cp40-KKK en plasma de PNH y humano y en proteínas totales de tejido cutáneo de PNH, se añadió Cp40-KK o Cp40-KKK a plasma de PNH o humano a una concentración final de 16 pM. También se añadió Cp40-KKK a las proteínas totales de piel PNH (de monos cinomolgos; Zyagen, San Diego, CA) a una concentración final de 20 pM. Las muestras se incubaron durante 24 h a 37 °C en un baño de agua y se tomaron muestras antes y en diversos puntos de tiempo durante y al final de la incubación. Las muestras se sometieron a precipitación de proteínas como se describe anteriormente y se analizaron por UPLC-ESI MS como se describe anteriormente.
Resultados. Cada péptido se inyectó por vía subcutánea (s.c.) en una única dosis (8 mg; 2 mg/kg) en dos monos, y se recolectaron muestras de sangre durante un período de 5 días (t = preinyección, 5, 30 min, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 h tras la inyección, FIG. 6A). Como se muestra en la FIG. 6B y en la Tabla 4, la semivida de Cp40 fue de 41 h y de 48 h para los dos monos. En comparación, los perfiles farmacocinéticos de mPEG(3k)-Cp40 administrado como una inyección s.c. de dosis única a dos monos cinomolgos mostraron que se había alcanzado una concentración máxima más alta de mPEG(3k)-Cp40 y que la semivida se había prolongado (t1/2 65 h y 53 h, respectivamente) (FIG. 6C y Tabla 4).
Tabla 4. Parámetros farmacocinéticos calculados a partir de los perfiles farmacocinéticos de Cp40, Cp40-KK, Cp40-KKK y mPEG(3k)-Cp40 en plasma PNH después de la administración s.c.__________________________
Análogo Animal C máx
inyecc ión(mg/ml) ABCü -4 ABCin f Vz/F CL/F
t1/2 (h) tmáx (h) c
(pM) (pMh) (pMh) (ml/kg) ((mg/kg)/pMh) Cp40 1 4* 40,9 2 6,20 233 263 448946 7605
2 48,1 2 5,53 218 255 545665 7856
Cp40-KK 1 5 1 12,90 329 597 700664 3348 (SUMA) 2 4* 14
276 1 9,26 257 755 1055443 2648 Cp40-KKK 1 32** 46,7 6 11,90 658 805 167382 2483 (SUMA) 2 41,8 2 15,10 573 685 176010 2921 mPEG(3k)- 1 16* 64,8 6 11,10 654 922 202917 2169 Cp40 2 53,7 2 8,99 529 656 236127 3050
Abreviaturas: b/2, semivida; tmáx, tiempo de máxima concentración observada; cmáx, concentración máxima; ABC, área bajo la curva; Vz/F, volumen aparente de distribución (F = biodisponibilidad); y CL/F, depuración aparente. *disuelto en solución salina
**disuelto en tampón de fosfato 100 mM.
Además, cuando se administró mPEG(3k)-Cp40, el nivel de C3 se saturó durante un período de tiempo más largo (33-35 h, frente a 4-5 h para Cp40). Una única inyección s.c. de mPEG(3k)-Cp40 en monos cinomolgos dio como resultado un perfil farmacocinético comparable al obtenido para la administración del compuesto parental Cp40, con un tmáx de 2 a 6 h posinyección (véanse las FIG. 6B, C). A pesar de la curva farmacocinética similar, mPEG(3k)-Cp40 alcanzó una Cmáx de aproximadamente 10 pM, casi 2 veces mayor que la del péptido parental (FIG. 6C y Tabla 4). Adicionalmente, el ABC0-120 h (~592 pM h) fue mayor, la t i /2 (~59 h) fue mayor, y la CL/F (~2610 ml h-1 kg-1) fue más lento que los respectivos valores obtenidos para Cp40 (véase la Tabla 4). Además, la proteína diana C3 se saturó durante un período de tiempo más prolongado (~34 h frente a ~4,5 h para Cp40) (FIG. 6B, C, líneas de puntos).
La FIG. 6D muestra los perfiles farmacocinéticos de Cp40-KK a lo largo del tiempo en el plasma de dos monos cinomolgos inyectados s.c. con el compuesto. Cp40-KK alcanzó su concentración máxima en el plasma de ambos animales más rápido (tmáx = 1 h) que Cp40 (tmáx = 2 h), y se logró una mayor concentración; sin embargo, la concentración plasmática de Cp40-KK también disminuyó más rápidamente que la de Cp40 (FIG. 6A y D y Tabla 4). Mientras que Cp40 permaneció por encima del nivel plasmático de C3 durante 4-5 h, la concentración plasmática de Cp40-KK se redujo a un nivel inferior al de C3 después de 2,5-5 h. En general, la concentración del péptido parecía depender de la concentración de C3. La depuración global de Cp40-KK fue muy lenta, con una semivida de 145 h en un mono y de 276 h en el otro. Además de Cp40-KK, Cp40-K también se detectó en las muestras de plasma de PNH, comenzando a los 30 min después de la inyección s.c. de Cp40-KK, indicando la escisión enzimática del resto Lys terminal del péptido. Sin embargo, el nivel de Cp40-K permaneció casi sin cambios a lo largo del tiempo (FIG. 7A y B). Dado que Cp40-K era el resultado de la escisión de Lys de Cp40-KK, en la FIG. 6 se muestra la suma de las concentraciones de ambos conjugados.
Se administró Cp40-KKK a dos monos cinomolgos a través de una inyección s.c. de dosis única. En lugar de solución salina, se utilizó tampón fosfato para disminuir el pH de la solución de Cp40-KKK para llevar el pH al intervalo fisiológico. La inyección s.c. única de Cp40-KKK dio como resultado un perfil farmacocinético comparable al de Cp40 y mPEG(3k)-Cp40. Por ejemplo, el péptido Cp40-KKK alcanzó una Cmáx de aproximadamente 13,5 pM a las 2 a 6 h posinyección (f Ig .6E y Tabla 4), con un ABC0-120 h de ~616 pM h, una CL/F de ~2700 ml h-1 kg-1 y una t1/2 de ~44,3 h. Además, después de la administración de Cp40-KKK, los niveles plasmáticos de C3 permanecieron saturados durante aproximadamente 40 h, lo que era aproximadamente 7 veces más prolongado que el período de saturación observado con Cp40 modificado (FIG. 6E). Estos datos indican que los derivados de Cp40, mPEG(3k)-Cp40 y Cp40-KKK, tienen un perfil farmacocinético mejorado después de una inyección s.c. en comparación con el compuesto parental Cp40.
La cuantificación en plasma de PNH demostró ser más tediosa para Cp40-KKK que para los otros análogos peptídicos. El análisis por UPLC-ESI-MS reveló una concentración sospechosamente baja de Cp40-KKK en plasma, con valores que no superaban los 2 pM en ningún punto de tiempo en ambos animales (FIG. 7C y D). La superposición de los cromatogramas IBP de las muestras de plasma de PNH mostró picos crecientes en los tiempos de retención para Cp40-KK (tR = 4,35 min) y Cp40-K (tR = 4,65 min) a lo largo del tiempo después de la inyección de Cp40-KKK; el pico del propio compuesto (tR = 4,10 min) fue pequeño desde el principio. Ejemplos de estos cromatogramas se muestran en la FIG. 8. La intensidad del patrón interno, Cp40 marcado isotópicamente, que apareció al mismo tiempo de retención que Cp40 (tR = 4,92 min), se mantuvo sin cambios, lo que indica que uno o dos restos Lys se escinden de Cp40-KKK en el plasma de PNH, pero no el tercero. Por lo tanto, las concentraciones de Cp40-KKK, Cp40-KK, Cp40-K y Cp40 se determinaron en todas las muestras de plasma de ambos animales.
Como se muestra en las FIG. 7C y D, no se detectó Cp40 en ninguna de las muestras de plasma. La concentración más baja se encontró para Cp40-KKK, lo que indica que la mayor parte del compuesto se escinde inmediatamente en el plasma para formar Cp40-KK, aunque todavía se pudo detectar Cp40-KKK durante todo el período de estudio. A diferencia de las muestras de plasma de monos que recibieron Cp40-KK, una mayor cantidad de Cp40-KK se escindió aún más a Cp40-K; en un mono, fue detectable hasta 5 pM de Cp40-K 4 h después de la inyección de Cp40-KKK (FIG. 7D). Las cantidades de Cp40-K, de Cp40-KK y de Cp40-KKK se sumaron para evaluar la concentración total de péptido en plasma de PNH en cada punto de tiempo (FIG. 6E y FIG. 7). La semivida de Cp40-KKK (42 h y 47 h para los dos monos) fue comparable a la de Cp40 (Tabla 4). No obstante, la concentración máxima de Cp40-KKK fue mayor y se alcanzó más tarde que para Cp40, al menos en un animal. Además, el nivel de Cp40-KKK permaneció por encima de la concentración de C3 de seis a nueve veces más que el de Cp40.
La escisión de Cp40-KKK también se pudo observar después de múltiples inyecciones s.c. en monos cinomolgos (FIG. 9). Lo más interesante es que se observó una acumulación de los niveles de derivados que contienen lisina a lo largo del tiempo (FIG. 9). Dicho fenómeno de "acumulación" es intrínseco del análogo Cp40-KKK, ya que no se observó anteriormente tras múltiples inyecciones s.c. del compuesto Cp40 parental (FIG. 10). Cabe destacar que, la Cmáx observada de Cp40 después de múltiples inyecciones s.c. no superó los 8-10 pM incluso cuando el compuesto se dosificó en monos cinomolgos con una frecuencia de 8-12 horas (FIG. 10). En cambio, la Cmáx observada de una dosis idéntica de Cp40-KKK, después de múltiples dosis s.c., fue notablemente superior, alcanzando o incluso superando los 20 pM. Además, la biodisponibilidad plasmática del análogo Cp40-KKK fue notablemente más alta a pesar de que el compuesto se dosificó a través de la vía s.c. a intervalos menos frecuentes que Cp40 (es decir, cada 48 horas), lo que indica que la estructura exclusiva de Cp40-KKK puede conferir propiedades farmacocinéticas nuevas y beneficiosas a este compuesto que contribuyen a su residencia prolongada, su aumento de la biodisponibilidad y su actividad inhibitoria sostenida.
Ejemplo 5. Propiedades farmacocinéticas de análogos basados en Cp40 después de administración intravenosa
Se realizaron estudios farmacocinéticos in vivo, en los que se administraron inyecciones i.v. únicas de mPEG(1k)-Cp40, mPEG(3k)-Cp40, Cp40-KK o Cp40-KKK a monos cinomolgos. Los perfiles farmacocinéticos de los análogos de Cp40 se resumen en la Tabla 5 y la FIG. 11.
Tabla 5. Perfiles farmacocinéticos de los análo os de C 40 des ués de in ección i.v.
Figure imgf000036_0001
Los estudios de inyección i.v. revelaron que mPEG(1k)-Cp40, mPEG(3k)-Cp40 y Cp40-KKK tienen un ABC0-120 h mayor (304,4-312 pM h) en comparación con el análogo Cp40-KK (85,23 pM h) (véanse la Tabla 5 y la FIG. 11). Curiosamente, el análogo de Cp40-KKK presentó la t1/2 más corta de los análogos de Cp40 probados (véase la Tabla 5).
Al mismo tiempo, mientras que mPEG(1 k)-Cp40, Cp40-KK tenían valores de t1/2 similares, mPEG(3k)-Cp40, en comparación, tenía una t1/2 extendida en al menos D30 h (Tabla 5). La tn2 prolongada de mPEG(3k)-Cp40 señala el potencial de avance de este análogo como terapéutico para el tratamiento i.v. de afecciones sistémicas mediadas por el complemento.
Curiosamente, como se muestra en el ejemplo 4, La cuantificación basada en UPLC/ESI-MS de fragmentos de escisión peptídica de Cp40-KK o Cp40-KKK en el plasma de monos cinomolgos inyectados por vía s.c. reveló que Cp40-KK se escinde in vivo generando cantidades mínimas de Cp40-K, mientras que el análogo Cp40-KKK se metaboliza casi por completo a Cp40-KK y pequeñas cantidades de Cp40-K (véase la FIG. 7). Estos datos sugieren una escisión rápida de Cp40-KKK a Cp40-KK tras la inyección s.c. e indican que la mayor proporción de compuesto activo en el plasma de PNH está representada por la especie metabólica Cp40-KK).
De forma similar, después de la inyección i.v., Cp40-KK también se metabolizó a cantidades mínimas de Cp40-K (véase la FIG. 12). Adicionalmente, a las 12 h posinyección, la mayor parte del análogo Cp40-KKK se metabolizó también a Cp40-KK y pequeñas cantidades de Cp40-K (véase la FIG. 12). Por consiguiente, los datos muestran que Cp40-KK es el compuesto principal que permanece en la circulación tras la inyección de Cp40-KK o Cp40-KKK. La FIG. 18 es un sumario de la escisión de Lys in vivo e in vitro en Cp40-KK y Cp40-KKK.
Ejemplo 6. Propiedades farmacocinéticas de análogos basados en Cp40 después de administración intramuscular.
Los perfiles farmacocinéticos de Cp40, Cp40-KK y Cp40-KKK se probaron in vivo después de una única inyección i.m. de 100 mg de compuesto, equivalente a 25 mg/kg (FIG. 13). Notablemente, los compuestos muestran un perfil farmacocinético distinto después de la inyección i.m. en relación con el perfil observado después de inyecciones i.v. o s.c., sugiriendo así que la vía de administración i.m. puede aprovecharse en novedosos protocolos de dosificación para el suministro adaptado de estos compuestos en determinadas indicaciones mediadas por el complemento. Lo más interesante, es que la t1/2 después de una única inyección i.m. de estos análogos es de aproximadamente 8 días (FIG. 13). Estas observaciones sugieren que después de una inyección inicial s.c. o i.v. de los análogos de Cp40 divulgados para saturar los niveles de la diana del compuesto, las inyecciones i.m. posteriores pueden utilizarse como dosis de mantenimiento (por ejemplo, administradas por vía i.m. cada dos semanas).
Ejemplo 7. Generación y especificidad de anticuerpos para Cp40 y análogos de Cp40 con lisina.
Para generar anticuerpos contra análogos de compstatina para los métodos de detección WES y RPS descritos en los Ejemplos 8 y 9, se inmunizaron conejos (n=2/análogo) con 100 pg de Cp40 o de otros análogos de lisina conjugados con hemocianina de lapa californiana (HLC) en presencia de un adyuvante fuerte (100 pl de TiterMax Gold) seguido de inyecciones semanales de 50 pg de HLC-Cp40 más adyuvante durante un total de 5 semanas. La producción de anticuerpos se controló con un ELISA directo mediante el cual se recubrieron análogos Cp40 (10 pg/ml) en una placa de 96 pocillos, seguido de bloqueo con PBS/BSA al 1 % e incubación con diluciones en serie de plasma pre- y posinmunización. El ensayo se desarrolló después de la incubación con IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP), de la adición del sustrato cromogénico apropiado y de la medición de la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de placas de ELISA. Este procedimiento de inmunización dio como resultado la producción de un anticuerpo anti-Cp40 y anti-análogo con Lys (AB101 y AB102, respectivamente), que se purificaron adicionalmente de suero de conejo mediante cromatografía de afinidad con Proteína A. Los datos de ELISA y transferencia de Western muestran que estos anticuerpos son altamente específicos ya que solo reaccionan con muestras biológicas (plasma, vítreo) que contienen los mismos péptidos que se utilizaron como inmunógenos (véase la FIG. 14 para el ELISA. El anticuerpo AB102 mostró la misma especificidad para CP40-K, CP40-KK, CP40-KKK. El epítopo antigénico de AB101 precisa la mIle C-terminal de Cp40 y el de AB102 los restos de lisina del extremo C. Por tanto, estas características son exclusivas para detectar el CP40 y sus análogos.
Ejemplo 8. Tiempo de permanencia de análogos basados en Cp40 en el vitreo de primates no humanos.
Para determinar el tiempo de permanencia de mPEG(3k)-Cp40, mPEG(1k)-Cp40, Cp40-KK y Cp40-KKK en el vítreo de macacos cinomolgos, estos análogos basados en Cp40 se administraron por vía intravítrea (i.v.t.) a los animales después de la inducción de anestesia ligera con ketamina (10-15 mg/kg, por inyección intramuscular (i.m.)) y dilatación de las pupilas con solución oftálmica de tropicamida/fenilefrina (véase la Tabla 6 para el diseño del estudio).
T l . Di ñ l i r mini r i n in r ví r i n n l n 4 .
Figure imgf000037_0001
Para la inyección i.v.t., los monos cinomolgos se anestesiaron con una combinación de ketamina (15-25 mg/kg, i.m.) y xilacina (2 mg/kg, i.m.) y se limpió el ojo con solución de povidona yodada. Después de la aplicación de solución de clorhidrato de oxibuprocaína (solución oftálmica Benoxil® al 0,4 %) en la córnea como anestésico local, los análogos basados en Cp40 se administraron a los animales mediante inyección i.v. en el ojo derecho (G1, G3) o izquierdo (G2, G4) de cada animal. Inmediatamente después de cada inyección, se administró una dosis tópica única de levofloxacina al 0,5 %. Después de la inyección i.v.t. de mPEG(3k)-Cp40, mPEG(1k)-Cp40, Cp40-KK y Cp40-KKK, se extrajeron muestras de humor vítreo (aproximadamente 50 pl cada una) de los ojos tratados con análogos basados en Cp40 los días 14, 28, 42, (G1, G2, G3, G4), 56, 73, 90 (G1, G2) (esto se hizo tres o seis veces). Las muestras se recogieron en hielo y se almacenaron en un ultracongelador (-79,3 a -68,5 °C) hasta su posterior análisis. En los días 73 y 90, se extrajeron aproximadamente 100 pl de humor vítreo de G1 y G2. La presencia y concentración de los análogos basados en Cp40 se determinó mediante la tecnología de western simple (WES, Protein-Simple, San José, CA), o por medición en tiempo real basada en resonancia de plasmón superficial (RPS) de la cinética de unión en un chip de Cp40-KKK inmovilizado (véanse los métodos detallados a continuación). Se obtuvieron resultados similares con respecto al tiempo de permanencia intravítreo y los niveles de concentración de los compuestos de prueba independientemente del método de cuantificación seleccionado.
Para cuantificar los niveles de todos los compuestos de prueba en muestras de vítreo recolectadas en diferentes puntos de tiempo después de la inyección i.v.t. (ver FIG. 15), el análisis WES se realizó en un instrumento WES (ProteinSimple, San José, CA) utilizando un Módulo de Separación de 2 a 40 kDa y un Módulo de Detección de Anti­ Conejo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron las muestras de vítreo ocular sin diluir con una Mezcla Maestra Fluorescente y se calentaron a 95 °C durante 5 min. Las muestras, el reactivo de bloqueo, los anticuerpos primarios (desarrollados en el laboratorio, anti-Cp40; 1:1000 en reactivo de bloqueo), el anticuerpo secundario conjugado con HRP (IgG anti-conejo) y el sustrato quimioluminiscente se pipetearon en la placa (parte del Módulo de Separación). Los ajustes del instrumento utilizados fueron: apilamiento y separación a 375 V durante 27 min; reactivo de bloqueo durante 30 min, anticuerpo primario y secundario ambos durante 30 min; detección de quimioluminiscencia de Luminol/peróxido durante D15 min (exposiciones de 5, 15, 30, 60, 120, 240 y 480 s). Los electroferogramas resultantes se evaluaron utilizando el programa informático Compass (ProteinSimple, San José, CA). Se utilizaron los siguientes criterios para discriminar las señales bajas de péptidos del fondo: La relación señal máxima-ruido (S/R) proporcionada por el programa informático debe ser de >10, y la relación altura máxima/punto de referencia (calculada manualmente a partir de los valores de la altura máxima y del punto de referencia proporcionados por el programa informático) debe ser igual o mayor que 3. Se utilizó una curva patrón de cinco puntos de concentraciones conocidas (100-2.000 nM) de péptido añadido en vítreo de conejo para calcular la concentración de péptido en las muestras de vítreo utilizando el programa informático Compass (Compass Software Inc., Atlanta, GA). La curva mostró una R2 mayor que 0,98. En la FIG. 15 se muestra una curva patrón representativa generada utilizando el sistema WES y las bandas obtenidas al procesar cantidades predeterminadas de péptido purificado añadido a muestras de vítreo de conejo.
Para corroborar las mediciones basadas en WES para todos los compuestos de prueba, se desarrolló un ensayo de competición basado en RPS para detectar Cp40 y análogos de Cp40 en muestras biológicas. Brevemente, se utilizaron muestras de plasma diluidas 1/1000 para la prueba con o sin la adición de Cp40 o de análogos de Cp40. Las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 min. Después del tratamiento térmico, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se mezcló con una concentración fija de C3 o de plasma como fuente de C3, y se hizo pasar sobre un chip sensor CM5 al que se inmovilizó el análogo de Cp40 correspondiente (por ejemplo, unido covalentemente). A continuación, se midió la respuesta y se comparó con una curva patrón para la cuantificación. En la FIG. 16 se resume un esquema del método basado en RPS.
El nuevo ensayo de competición basado en RPS se realizó en las mismas muestras de vítreo utilizando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare, Piscataway Township, NJ) a 25 °C. Cp40-KKK se unió covalentemente a un chip sensor CM5 utilizando reacciones de acoplamiento de amina convencionales con HBS-EP como tampón de ejecución. Brevemente, el chip se activó durante 7 min con NHS/EDC (1:1), se recubrió con Cp40-KKK utilizando Cp40-KKK 300 pg/ml en acetato de sodio 5 mM (pH 5,0) durante 6 min y se desactivó con etanolamina-HCl (pH 9,5) 1 M durante 10 min. Una celda de flujo vacía sirvió como superficie de referencia. Para eliminar la unión no específica durante los experimentos, el tampón de ejecución se cambió a tampón fosfato 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 100 mM, Tween 20 al 0,05 %, EDTA 10 mM y sulfato de dextrano 1 mg/ml (500 kDa). Todos los experimentos se llevaron a cabo a un caudal de 10 pl/min con 2 min de inyección de muestra seguido de regeneración de la superficie del chip sensor. La superficie se regeneró con la inyección posterior de SDS al 0,5 % durante 1 min y tampón de glicina 50 mM (pH 9,5) durante 30 s.
En la FIG. 17 se representa una curva patrón representativa del análogo basado en Cp40 pertinente, que se preparó diluyendo concentraciones predeterminadas de péptido con vítreo de conejo seguido de inactivación por calor durante 5 min a 95 °C y 10 min de equilibrio en un baño de agua a temperatura ambiente. Las muestras de patrón se centrifugaron durante 10 min a 14.000 x g y los sobrenadantes se mezclaron con plasma humano normal. De forma similar, para la detección de concentraciones desconocidas de mPEG(3k)-Cp40, mPEG(1k)-Cp40, Cp40-KK y Cp40-KKK en vítreo del ojo, las muestras se diluyeron en tampón de ejecución seguido de inactivación por calor, equilibrado y centrifugación, como se describe anteriormente. Los sobrenadantes de las muestras se mezclaron con plasma humano diluido como se describe anteriormente, y se inyectaron. El procesamiento de datos se realizó con el programa informático Scrubber (BioLogic Software, Campbell, Australia).
Como se muestra en la FIG. 18, Cp40-KK, Cp40-KKK, PEG(1K)-Cp40, PEG(3K)-Cp40 se detectaron en el vítreo recogido de animales tratados 14 días después de una única inyección de 0,5 mg del análogo basado en Cp40. Cabe señalar que los compuestos PEG(1K)-Cp40 y PEG(3K)-Cp40 se detectaron el día 14 posinyección, pero no en puntos de tiempo posteriores (véase la FIG. 18), lo que indica que el tiempo de permanencia en vítreo de los compuestos PEGilados es de al menos 14 días, aunque significativamente más corto que el de los compuestos que contienen lisina (es decir, Cp40-KK y Cp40-KKK).
Los péptidos Cp40-KK y Cp40-KKK se detectaron los días 14, 28, 42, 56, 73 y 90 posinyección (FIG. 18). Si bien la concentración de CP40-KK en el vítreo de PNH disminuye a lo largo del tiempo, del día 42 al 73, los niveles de concentración de Cp40-KKK permanecieron estables durante el período de observación de 73 días (FIG. 18). Cabe destacar que, Cp40-KKK presentó el tiempo de permanencia más largo en los tejidos oculares, dado que se detectó incluso en el día 90 postratamiento. En cambio, el tiempo de permanencia de Cp40-KK en el vítreo fue notablemente más corto que el de Cp40-KKK, dado que ya no se detectó el día 90. Cabe señalar que la concentración intravítrea de Cp40-KKK alcanzó y mantuvo niveles de saturación respecto a los de su diana C3 en el compartimento intravítreo (0-140 nM; véase Loyet KM et al., 2012, Invest Ophthalmol Vis Sci. 53:6628-37) durante todo el período de observación previo al día 90 (véase la FIG. 18, línea de puntos).
Si bien la adición de fracciones de mini-PEG o la prolongación de un péptido con restos cargados hidrófilos, tales como lisina, son modificaciones químicas conocidas en la técnica por su capacidad de aumentar la solubilidad de un péptido, el tiempo de permanencia notablemente aumentado de Cp40-KK y Cp40-KKK en los tejidos oculares fue un resultado muy sorprendente y no se había informado anteriormente. La permanencia ocular prolongada del compuesto de prueba (Cp40-KK y Cp40-KKK) es exclusiva de su estructura y, aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, puede atribuirse a un mecanismo específico de tejido que aprovecha la presencia de la repetición de Lys en tándem en el extremo C del compuesto. Esto está respaldado por la observación de que, si bien el Cp40 mini-PEGilado presenta perfiles de solubilidad comparables con los compuestos Cp40-Lys (n) (véase la Tabla 1), tiene una permanencia ocular claramente más corta que Cp40-KK o Cp40-KKK. Además, el aumento inesperado y significativo de la permanencia ocular que ofrece la adición de un tercer resto Lys a Cp40-KKK en comparación con el derivado de Cp40-KK no puede explicarse simplemente teniendo en cuenta sus perfiles de solubilidad similares (véase la Tabla 1), sino que señala a una ruta novedosa por la cual el Cp40-KKK se retiene en el humor vítreo durante un período más largo incluso en comparación con el análogo Cp40-KK.
Cabe destacar que, la cantidad de compuestos detectada en el vítreo de los monos cinomolgos tratados el día 14 representa aproximadamente el 0,2 % de la dosis inyectada inicialmente, lo que sugiere un perfil de eliminación bifásico, dirigido por la diana, mediante el cual el compuesto en exceso de la concentración de la diana C3 se elimina rápidamente del ojo y solo el compuesto que está fuertemente unido a su diana permanece más tiempo en el tejido. En otras palabras, la administración i.v.t. con estos análogos basados en Cp40 puede lograr el tiempo de permanencia observado en dosis mucho más bajas (por ejemplo, incluso menos de aproximadamente 10 pg o incluso 1-2 pg). En cambio, cuando se administraron i.v.t. 100 pg de Cp40, no se observó detección de ningún compuesto después de un mes, lo que sugiere que el tiempo de permanencia de Cp40 es muy corto en comparación con los análogos basados en Cp40 analizados en el presente documento. Por lo tanto, los análogos basados en Cp40 divulgados confieren un aumento beneficioso del tiempo de permanencia además de una solubilidad potenciada en comparación con Cp40.
Resumiendo, los datos anteriores muestran que el tiempo de permanencia intravítreo de Cp40-KK es menor que el de Cp40-KKK, y el tiempo de permanencia de Cp40-KKK es igual o superior a aproximadamente 3 meses después de la i.v.t. Estos hallazgos tienen implicaciones importantes para el diseño de protocolos de administración crónica para el tratamiento de enfermedades oculares y otras patologías clínicas en las que participa la activación desregulada del complemento. La permanencia ocular prolongada de Cp40-KK y Cp40-KKK permitirá la aplicación de nuevos esquemas de dosificación de fármacos que implican una frecuencia de dosificación significativamente reducida con una menor carga para el paciente, en comparación con la de los compuestos análogos Cp40 y APL-2 de la generación anterior.
Ejemplo 9. Actividad de los análogos basados en Cp40 que contienen lisina en el vitreo de primates no humanos.
Para confirmar que el compuesto presente en el vitreo de PNH conserva la actividad de unión a C3b, lo que es un requisito previo para suscitar su acción inhibidora en todas las rutas del complemento, se realizaron experimentos de unión por resonancia de plasmón superficial (RPS). Brevemente, para un control de unión positivo, se añadieron diluciones en serie de Cp40-KKK (16, 8, 4 y 2 nM) a muestras de vitreo de conejo y se hicieron pasar sobre un chip Biacore CM5 con C3b humana purificado inmovilizada (Complement Technology Inc, Tyler, TX) (véase la FIG. 19A). A continuación, se recogieron muestras de vitreo de un ojo al que se le inyectó Cp40-KKK en el día 14 después de la inyección y se sometieron a inactivación por calor a 95 °C durante 5 min. Tanto las muestras inactivadas por calor como las no inactivadas por calor se hicieron pasar sobre un chip CM5 con C3b humana purificada inmovilizada como se indica anteriormente (FIG. 19B).
Como se muestra en la FIG. 14A, Cp40-KKK añadido a muestras de vítreo de conejo se une a C3b de manera dependiente de la dosis. Adicionalmente, la señal para la unión de C3b se observa tras la prueba de muestras de vítreo recogidas de un ojo al que se le inyectó Cp40-KKK (FIG. 19B), lo que indica que la Cp40-KKK presente en el vítreo mantiene su actividad de unión a C3b.
Notablemente, la señal de unión a C3b obtenida con una muestra de vítreo inactivada por calor (FIG. 19B, barra izquierda) fue mayor en comparación con la señal resultante de la muestra no inactivada por calor (FIG. 19B, barra derecha) (10 frente 2 unidades relativas, respectivamente). Como la etapa de inactivación por calor garantiza la disociación del compuesto de su diana, la respuesta diferencial observada en el análisis por RPS probablemente indica que la mayor parte del compuesto se une a la proteína C3 del complemento en el vítreo. Esta observación está en concordancia con la alta afinidad y fuerte unión de Cp40 y sus derivados (Cp40-KKK, Cp40-KK) a C3 y se alinea con el perfil de eliminación bifásico dirigido por la diana de estos compuestos, como se informó previamente en los estudios de PNH (véanse Risitano et al., 2014, Blood 123(13):2091-2101; Berger et al., 2018, J Med Chem 61(14):6153-6162).
Una explicación alternativa a la presentada anteriormente es que el vítreo contiene factores adicionales no identificados que se asocian con el análogo Cp40-KKK. Para investigar si un factor vítreo no identificado afecta la actividad inhibidora del complemento de los compuestos que contienen lisina, se realizaron ensayos de activación del complemento utilizando muestras de vítreo. Brevemente, se incubó plasma humano con inmunocomplejos OVA-anti-OVA en presencia de diluciones en serie de los análogos basados en Cp40 mezclados con vítreo de conejo. Los niveles de activación de la ruta clásica (deposición de C3b) se determinaron mediante ELISA utilizando un anticuerpo policlonal anti-C3 humano conjugado con HRP (MP Biomedicals, Solon, OH) (FIG. 20).
Como se muestra en la FIG. 20, en ausencia de vítreo, todos los compuestos probados (Cp40, Cp40-1K, Cp40-KK, Cp40-KKK) muestran actividad inhibidora mediada por la ruta clásica del complemento de una manera dependiente de la dosis (líneas continuas). Notablemente, las muestras de vítreo parecen tener una actividad inhibidora del complemento menor ya que la presencia del vítreo parece potenciar la actividad inhibidora del complemento de los compuestos probados (FIG. 20, compárense las líneas de trazos con las líneas continuas). Por tanto, los datos indican que la actividad de los compuestos probados (es decir, Cp40 y sus derivados que contienen lisina) no es inhibida por factores no identificados en el vítreo que puedan unirse en determinada medida a estos compuestos
Sumario: Comparación de las propiedades PK de análogos individuales a través de distintas vías de administración y su potencial para el desarrollo de agentes terapéuticos.
Los datos mostrados en el Ejemplo 8 indicaron que los compuestos Cp40-KKK y Cp40-KK presentan un tiempo de permanencia mejorado en el vítreo del ojo en comparación con otros compuestos probados, al tiempo que mantienen su actividad de unión, respaldando por tanto el potencial de desarrollo de estas moléculas como agentes terapéuticos para afecciones oculares. Adicionalmente, los datos farmacocinéticos obtenidos de estudios subcutáneos (s.c.) e intravenosos (i.v.) en monos cinomolgos indicaron que mPEG(1k)-Cp40, mPEG(3k)-Cp40, Cp40-KK y Cp40-KKK tienen propiedades farmacocinéticas distintas a las de su molécula parental, Cp40, y, en virtud de estas propiedades farmacocinéticas, tienen un potencial exclusivo para desarrollarlos como terapias administradas por vía local y por vía sistémica para modular la actividad del complemento en trastornos clínicos (véanse las FiG. 6 y 11; Tabla 4).
De manera específica, la administración s.c. del compuesto Cp40-KKK satura los niveles plasmáticos de C3 durante aproximadamente 40 h, lo que es aproximadamente 7 veces más largo que el período de saturación observado con Cp40 no modificado (Ejemplo 4; FIG. 6E). El largo período de saturación de la diana de Cp40-KKK, en combinación con su solubilidad aumentada, confiere un potencial exclusivo para el desarrollo como un agente terapéutico s.c., adecuado para el tratamiento de afecciones sistémicas y/o crónicas mediadas por el complemento. La estructura exclusiva del análogo Cp40-KKK puede dictar su semivida prolongada y probablemente una biodistribución potenciada en distintos compartimentos, tales como el vítreo del ojo, debido a los posibles efectos prolongados que pueden propiciar su acumulación durante una pauta de dosificación múltiple y su liberación más lenta en el tejido diana a través de posibles interacciones con otras proteínas de tipo transportadoras o de unión desconocidas. Además, la observación de que se detectó una cantidad significativa del metabolito Cp40-K en el plasma de monos cinomolgos a los que se les inyectó Cp40-KKK (FIG. 12), mientras que este metabolito estuvo casi ausente del plasma de animales inyectados con CP40-KK, indica que el metabolito Cp40-KK probablemente sea más estable en la circulación (por ejemplo, menos propenso a una mayor degradación proteolítica) y que la adición de un tercer resto de lisina al extremo C del Cp40 parental confiere un nuevo perfil de biotransformación y propiedades farmacocinéticas novedosas al péptido resultante, que potencian colectivamente su permanencia plasmática e intravítrea. Estas características otorgan al análogo Cp40-KKK un perfil farmacocinético más favorable que puede permitir la administración crónica de este análogo con intervalos de dosificación menos frecuente. En la FiG. 21 se muestra un sumario de la escisión de Lys in vivo e in vitro en Cp40-KK y Cp40-KKK.
Del mismo modo t1/2 prolongada de mPEG(3k)-Cp40, observada después de la inyección i.v. en PNH (Ejemplo 5; Tabla 5), señala el potencial de avance de este análogo como terapéutico para el tratamiento i.v. de afecciones sistémicas mediadas por el complemento. Además, como se muestra en el ejemplo 6, la vía de administración i.m. puede aprovecharse en protocolos de dosificación novedosos para el suministro personalizado de los análogos de Cp40 en indicaciones mediadas por el complemento.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido que consiste en la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.
2. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de la reivindicación 1 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, formulada para la administración a un individuo por una vía seleccionada de: oral, intranasal, tópica, intraocular, periodontal, pulmonar, subcutánea, intramuscular e intravenosa.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en donde: (a) la administración intraocular es administración intravítrea, o (b) la administración periodontal es administración gingival o inyección de infiltración intrapapilar del compuesto.
5. Una composición que comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y el péptido de la reivindicación 1 para su uso como medicamento.
6. Una composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento del síndrome urémico hemolítico atípico (SUHa); enfermedad por depósitos densos (EDD); glomerulonefritis C3 (GNC3); glomerulopatías C3; nefropatías mediadas por el complemento y enfermedades inflamatorias glomerulares; degeneración macular senil (DMS); trastorno ocular caracterizado por degeneración macular, neovascularización coroidea (NVC), neovascularización retiniana (NVR), vitreorretinopatía proliferativa, glaucoma, uveítis, inflamación ocular o cualquier combinación de estos; hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN); enfermedad por crioaglutininas (EC); anemias hemolíticas autoinmunitarias por anticuerpos calientes (las AHAAc); anemia drepanocítica; microangiopatías trombóticas asociadas a trasplantes; artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); enfermedades renales autoinmunitarias y autoinflamatorias; miocarditis autoinmunitaria; esclerosis múltiple; traumatismo craneoencefálico y medular; lesión por isquemia-reperfusión (IR) cerebral, intestinal y renal; aborto espontáneo y habitual; síndrome antifosfolipídico (SAF); enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; afecciones inflamatorias neurodegenerativas sustentadas por remodelación sináptica anómala, actividad de la microglía y deterioro cognitivo; asma; vasculitis pauciinmunitaria asociada a anti-antígeno citoplasmático y nuclear (síndrome de Wegener); enfermedades de la piel autoinmunitarias no lúpicas y epidermólisis ampollosa; choque postraumático; cáncer; periodontitis; gingivitis; ateroesclerosis; asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación alérgica, enfisema, bronquitis, bronquiectasia, fibrosis quística, tuberculosis, neumonía, síndrome de dificultad respiratoria (SDR) del recién nacido o del adulto, rinitis y sinusitis.
7. La composición para el uso de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, formulada para la administración por una vía y en una dosificación seleccionadas de:
(a) vía intravenosa o vía subcutánea a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,125 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, opcionalmente entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg;
(b) vía intramuscular a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, opcionalmente entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg; (c) vía intravítrea a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 10 mg, opcionalmente entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 2.000 pg;
(d) vía periodontal a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 1.000 pg, opcionalmente entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 200 pg; y
(e) vía oral a una dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 20 mg, opcionalmente entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 10 mg.
8. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, formulada para la administración como dosis única.
9. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde una primera porción de la composición se formula para administración por vía intravenosa o vía subcutánea a una primera dosis terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,125 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, y en donde una segunda porción de la composición es una formulación para administración: (i) por vía intramuscular a una segunda dosis de mantenimiento terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 0,25 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg; o (ii) por vía oral a una segunda dosis de mantenimiento terapéuticamente eficaz de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg.
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