PT2424557T - Compstatina modificada com estrutura peptídica e modificações no terminal c - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
COMPSTATINA MODIFICADA COM ESTRUTURA FEPTÍDICA E MODIFICAÇÕES NO TERMINAL C
CAMPO DE INVENÇÃO
Esta invenção refere-se à ativação da cascata do complemento no corpo. Em particular, esta invenção proporciona péptidos e peptidomiméticos capazes de ligar a proteína C3 e inibir a ativação do complemento.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O sistema de complemento humano é um jogador poderoso na defesa contra organismos patogênicos e a mediação de respostas imunes. O complemento pode ser ativado através de três caminhos diferentes: o clássico, a lectina e os caminhos alternativos. O principal evento de ativação que é compartilhado por todos os três caminhos é a clivagem proteolítica da proteína central do sistema do complemento, C3, nos seus produtos de ativação C3a e C3b por C3 convertases. A geração desses fragmentos leva à opsonização de células patogénicas por C3b e iC3b, um processo que os torna suscetíveis a fagocitose ou depuração e à ativação de células imunes através de uma interação com recetores do complemento (Markiewski & Lambris, 2007, Am J Pathol 171: 715-727). A deposição de C3b em células alvo também induz a formação de novos complexos convertase e, desse modo, inicia um ciclo de auto-amplificação.
Um conjunto de plasma e proteínas ligadas à superfície celular regula cuidadosamente a ativação do complemento para evitar que as células hospedeiras se autoataquem pela cascata do complemento. No entanto, a ativação excessiva ou a regulação inadequada do complemento podem levar a uma série de condições patológicas, que vão desde doenças autoimunes até inflamatórias (Holers, 2003, Clin Immunol 107: 140- 51; Markiewski & Lambris, 2007, supra; Ricklin & Lambris, 2007, Nat Biotechnol 25: 1265-75; Sahu et al., 2000, J Immunol 165: 2491-9). O desenvolvimento de inibidores do complemento terapêutico é, portanto, altamente desejável. Neste contexto, C3 e C3b emergiram como alvos promissores porque seu papel central na cascata permite a inibição simultânea da iniciação, amplificação e acionamento do complemento a jusante (Ricklin & Lambris, 2007, supra). A compstatina foi o primeiro inibidor de complemento não derivado do hospedeiro que mostrou ser capaz de bloquear as três vias de ativação {Sahu et al., 1996, J Immunol 157: 884-91; Patente US 6319897). Este tridecapeptideo cíclico liga-se a C3 e C3b e evita a clivagem de C3 nativo pelas converstases C3. A sua alta eficácia inibitória foi confirmada por uma série de estudos utilizando modelos experimentais que apontaram para o seu potencial como agente terapêutico (Fiane et al., 1999a, Xenotransplantation 6: 52-65; Fiane et al·., 1999b, Transplant Proc 31: 934-935; Nilsson et al·., 1998 Blood 92: 1661-1667; Ricklin & Lambris, 2008, Adv Exp Med Biol 632: 273-292; Schmidt et al., 2003, JBiomed Mater Res A 66: 491-499; Soulika et al., 2000, Clin Immunol 96: 212-221). A otimização progressiva da compstatina produziu análises com atividade melhorada (Ricklin & Lambris, 2008, supra; W02004/026328; WO2007/ 062249) . Um desses análogos está atualmente a ser testado em ensaios clínicos para o tratamento da degeneração macular relacionada à idade (DMAE), principal causa de cegueira em pacientes idosos em países industrializados (Coleman et al., 2008, Lancet 372: 1835-1845; Ricklin & Lambris, 2008, supra). Em vista do seu potencial terapêutico em AMD e outras doenças, uma maior otimização da compstatina para alcançar uma eficácia ainda maior é de importância considerável.
Estudos de estrutura-atividade anteriores identificaram a natureza ciclica do péptido de compstatina e a presença de um grupo de giro β e hidrofóbico como caracteristicas-chave da molécula (Morkikis et al., 1998, Protein Sei 7: 619-627; W099/13899; Morikis et al., 2002, J Biol Chem 277: 14942-14953; Ricklin & Lambris, 2008, supra). Por exemplo, a W099/ 13899 revelou que os resíduos de aminoácidos nas posições 5 a 8 têm uma conformação restrita formando uma curva β do Tipo I e declarou que a presença de Gly na posição 8 era a mais favorável para esta estrutura. Outro trabalho utilizando análises de compstatina e compstatina para o desenvolvimento de modelos de farmacófero revelou que a substituição de Gly8 por Ala eliminou a atividade inibitória do péptido (Mallik e Morikis, 2005, J Am Chem Soc 127: 10967-10976). Os resíduos hidrófobos nas posições 4 e 7 revelaram-se de particular importância e a sua modificação com aminoácidos não naturais gerou um análogo com uma atividade melhorada de 264 vezes sobre o péptido de compstatina original (Katragadda et al., 2006, J Med Chem 49: 4616-4622; WO2007/062249).
Embora as etapas de otimização anteriores tenham sido baseadas em estudos de triagem combinatória, estruturas de solução e modelos computacionais (Chiu et al·., 2008, Chem Biol Drug Des 72: 249-256; Mulakala et al., 2007, Bioorg Med Chem 15: 1638-1644; Ricklin & Lambris, 2008, supra), a publicação recente de uma estrutura de co-cristal de compstatina complexada com o fragmento de complemento C3c (Janssen et al., 2007, J Biol Chem 282: 29241-29247; WO2008/ 153963) representa um marco importante para iniciar a otimização racional. A estrutura de cristal revelou um local de ligação superficial na interface de macroglobulina (MG) domínios 4 e 5 de C3c e mostrou que 9 dos 13 aminoácidos estavam diretamente envolvidos na ligação, seja através de ligações de hidrogénio ou efeitos hidrofóbicos. Em comparação com a estrutura do péptido de compstatina em solução (Morikis et al., 1998, supra), a forma ligada de compstatina experimentou uma mudança conformacional, com uma mudança na localização da fase β dos resíduos 5-8 para 8-11 (Janssen et al., 2007, supra; WO2008/153963).
Em vista do exposto, é claro que o desenvolvimento de péptidos de compstatina modificados ou miméticos com atividade ainda maior constituirá um avanço significativo na arte.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona análogos e miméticos do péptido inibidor do complemento, compstatina, ICWQDWGHHRCT (C2-C12 cíclico) ; SEQ ID NO: 1) , que têm uma atividade inibidora do complemento melhorada em comparação com a compstatina.
Um aspeto da invenção apresenta um composto que compreende um péptido de compstatina modificado (ICWQDWGHHRCT (C2-C12 cíclico); SEQ ID NO: 1), no qual o Gly na posição 8 é modificado para restringir a conformação do esqueleto do péptido naquele local. Numa forma de realização, a estrutura é limitada pela substituição do Gly por N-metil Gly. O péptido pode ser modificado adicionalmente por um ou mais de: substituição de His na posição 9 com Ala; substituição de Vai na posição 4 com Trp ou um análogo de Trp; substituição de Trp na posição 7 com um análogo de Trp; acetilação do resíduo N-terminal; e substituição de Thr na posição 13 com Ile, Leu, Nle, N-metil Thr ou N-metil Ile. Em concretizações particulares, o análogo de Trp na posição 4 é 1-metil Trp ou 1-formil Trp e o análogo de Trp na posição 7, se presente, é um Trp halogenado.
Certas formas de realização apresentam um análogo de compstatina compreendendo um péptido possuindo uma sequência de SEQ ID NO: 2, que é:
Xaal - Cys - Vai - Xaa2 - Gin - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 -His - Arg - Cys - Xaa5 (C2 - C12 cíclico) em que Gly na posição 8 é modificado para restringir a conformação do esqueleto do péptido naquele local, e em que:
Xaal é lie, Vai, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu ou um dipéptido que compreende Gly-Ile;
Xaa2 é Trp, Trp halogenado, Trp compreendendo um substituinte alcoxi inferior ou alcanoílo na posição 1;
Xaa3 é Trp ou Trp halogenado; Xaa4 é His, Ala, Phe ou Trp; e
Xaa5 é Thr, lie, Leu, Nle, N-metil Thr ou N-metil Ile, em que um substituinte carboxi-OH de qualquer um dos Thr, Ile, Leu, Nle, N-metil Thr ou N-metil Ile opcionalmente é substituído por -NH2 .
Em certas formas de realização, Xaa2 participa de uma interação não-polar com C3. Em outras formas de realização, Xaa3 participa de uma ligação de hidrogénio com C3. Em várias formas de realização, o análogo de Trp de Xaa2 é um trpitofano halogenado, tal como 5-fluoro-l-triptofano ou 5-fluoxo-l-triptofano. Em outras formas de realização, o análogo de Trp em Xaa2 compreende um substituinte alcoxi inferior ou alquilo inferior na posição 5, por exemplo, 5-metoxitriptofano ou 5-metiltriptofano. Em outras formas de realização, o análogo Trp em Xaa 2 compreende um substituinte alquilo inferior ou um substituinte alcenóilo inferior na posição 1, com concretizações exemplificativas compreendendo 1-metiltriptofano ou 1-formiltriptofano. Em outras formas de realização, o análogo de Trp de Xaa3 é um triptofano halogenado tal como 5-fluoro-l-triptofano ou 6-fluoro-l-triptofano.
Em certas formas de realização, Xaal é Ac-Ile, Xaa2 é 1-metil-Trp ou 1-formil-Trp, Xaa3 é Trp, Xaa4 é Ala e Xaa5 é Thr, lie, Leu, Nle, N-metil Thr ou N- metil Ile, em particular, Xaa5 pode ser Ile, N-metil Thr ou N-metil-He. Em particular, o análogo de compstatina possui qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 9, 10 ou 11.
Em algumas formas de realização, o composto compreende um péptido produzido por expressão de um polinucleótido que codifica o péptido. Em outras formas de realização, o composto é produzido pelo menos em parte por síntese de péptidos. Uma combinação de métodos sintéticos também pode ser usada.
Outro aspeto da invenção apresenta um composto de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um componente adicional que prolonga a retenção in vivo do composto. O componente adicional é polietilenoglicol (PEG) em uma forma de realização. O componente adicional é uma molécula pequena de ligação a albumina em outra forma de realização. Noutra forma de realização, o componente adicional é um péptido de ligação à albumina. 0 péptido de ligação à albumina pode compreender a sequência RLIEDICLPRWGCLWEDD (SEQ ID NO: 14) . Formas de realização particulares compreendem qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 9, 10 ou 11 ligadas ao péptido de ligação à albumina. Opcionalmente, o composto e o péptido de ligação à albumina são separados por um espaçador. O espaçador pode ser uma molécula de polietilenoglicol (PEG), como mini-PEG ou mini-PEG 3.
Outro aspeto da invenção possui um composto que inibe a ativação do complemento, compreendendo um mimético não peptídico ou péptido parcial de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 9, 10 ou 11, em que o composto liga-se a C3 e inibe a ativação do complemento com atividade, pelo menos, 500 vezes maior do que um péptido compreendendo SEQ ID NO: 1 em condições de ensaio equivalentes.
Os análogos de compstatina, conjugados e miméticos da invenção são de utilidade prática para qualquer finalidade para a qual a compstatina propriamente dita é utilizada, como é conhecido na técnica e descrito em maior detalhe aqui. Certas dessas utilizações envolvem a formulação dos compostos em composições farmacêuticas para administração a um paciente. Tais formulações podem compreender sais dos compostos farmaceuticamente aceitáveis, bem como um ou mais diluentes farmaceuticamente aceitáveis, transportadores excipientes e semelhantes, tal como estarão dentro da competência do especialista na técnica. Várias características e vantagens da presente invenção serão entendidas por referência à descrição detalhada, desenhos e exemplos que se seguem. DESCRIÇÃO DETALHADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVAS Definições: Vários termos relativos aos métodos e outros aspetos da presente invenção são utilizados em toda a especificação e reivindicações. Esses termos devem ter seu significado comum na arte, a menos que seja indicado de outra forma. Outros termos especificamente definidos devem ser interpretados de uma maneira consistente com a definição aqui fornecida. O termo "cerca", tal como aqui utilizado quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, pretende englobar variações de ± 20% ou ± 10%, em algumas concretizações ± 5%, em alguns formas de realização + 1%, e em algumas formas de realização ± 0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são apropriadas para produzir e utilizar os compostos e composições descritos. 0 termo "compstatina" tal como aqui utilizado refere-se a um péptido compreendendo SEQ ID NO: 1, ICWQDWGHHRCT (C2-C12 cíclico). 0 termo "análogo de compstatina" refere-se a uma compstatina modificada compreendendo substituições de aminoácidos naturais e não naturais, ou análogos de aminoácidos, bem como modificações dentro ou entre vários aminoácidos, como descrito em maior detalhe aqui e como é conhecido na técnica. Ao se referir à localização de aminoácidos ou análogos particulares nos análogos de compstatina ou compstatina, esses locais às vezes são chamados de "posições" dentro do péptido, com as posições numeradas de 1 (Ile em compstatin) para 13 (Thr em compstatin). Por exemplo, o resíduo Gly ocupa a "posição 8."
Os termos "farmaceuticamente ativos" e "biologicamente ativos" referem-se à capacidade dos compostos da invenção para ligar C3 ou fragmentos destes e inibir a ativação do complemento. Esta atividade biológica pode ser medida por um ou mais de vários ensaios reconhecidos em arte, como descrito em maior detalhe aqui.
Tal como aqui utilizado, "alquilo" refere-se a um hidrocarboneto saturado linear, ramificado ou cíclico opcionalmente substituído possuindo de cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de intervalos e números específicos de átomos de carbono nele), com cerca de 1 sendo preferido cerca de 7 átomos de carbono. Os grupos alquilo incluem, mas não estão limitados a metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, ciclo-hexilo, ciclooctilo, adamantilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo e 2,3-dimetilbutilo. 0 termo "alquilo inferior" refere-se a um hidrocarboneto saturado linear, ramificado ou cíclico opcionalmente substituído com cerca de 1 a cerca de 5 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de intervalos e números específicos de átomos de carbono no mesmo).
Tal como aqui utilizado, "halo" refere-se a F, Cl, Br ou I.
Tal como aqui utilizado, "alcanoílo", que pode ser utilizado de forma intercambiável com "acilo", refere-se a um resíduo acilo alifático linear ou ramificado opcionalmente substituído tendo de cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de intervalos e números específicos de átomos de carbono no mesmo), sendo preferido de cerca de 1 a cerca de 7 átomos de carbono. Os grupos alcanoílo incluem, mas não estão limitados a formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo pentanoilo, isopentanoilo, 2-metil-butirilo, 2,2-dimetilpropionilo, hexanoílo, heptanoílo, octanoílo e semelhantes. O termo "alcanoílo inferior" refere-se a um resíduo acilo alifático linear ou ramificado opcionalmente substituído tendo de cerca de 1 a cerca de 5 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de intervalos e números específicos de átomos de carbono nele.
Tal como aqui utilizado, "arilo" refere-se a um sistema de anel aromático mono- ou bicíclico opcionalmente substituído tendo de cerca de 5 a cerca de 14 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de intervalos e números específicos de átomos de carbono nele), com cerca de 6 sendo preferido cerca de 10 carbonos. Exemplos não limitativos incluem, por exemplo, fenilo e naftilo.
Tal como aqui utilizado, "aralquilo" refere-se a radicais alquilo com um substituinte arilo e tem de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de intervalos e números específicos de átomos de carbono nele), com cerca de 6 a cerca de 12 átomos de carbono sendo preferidos os átomos. Os grupos aralquilo podem ser opcionalmente substituídos. Exemplos não limitativos incluem, por exemplo, benzilo, naftilmetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, feniletilo e difeniletilo.
Tal como aqui utilizado, os termos "alcoxi" e "alcoxilo" referem-se a um grupo alquilo-O- opcionalmente substituído em que alquilo é como anteriormente definido. Exemplos de grupos alcoxi e alcoxilo incluem metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi e heptoxi, entre outros.
Tal como aqui utilizado, "carboxi" refere-se a um grupo -C (= 0) OH.
Tal como aqui utilizado, "alcoxicarbonilo" refere-se a um grupo -C (= 0) 0-alquilo, em que o alquilo é como anteriormente definido.
Tal como aqui utilizado, "aroílo" refere-se a um grupo -C (= 0) -arilo, em que o arilo é como anteriormente definido. Exemplos de grupos aroílo incluem benzoílo e naftoílo.
Tipicamente, as porções químicas substituídas incluem um ou mais substituintes que substituem o hidrogénio em locais selecionados numa molécula. Os substituintes exemplares incluem, por exemplo, halo, alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo, sulfidrilo, hidroxilo (-0H), alcoxilo, ciano (-CN), carboxilo (-C00H), acilo (alcanoílo: -C (= 0) R) ; -C (= 0) 0-alquilo, aminocarbonilo (-C (= 0) NH2) , -N-aminocarbonilo substituído (-C {= 0) NHR"), CF3 , CF2CF3, e semelhantes. Em relação aos substituintes acima mencionados, cada porção R "pode ser, independentemente, qualquer um de H, alquilo, cicloalquilo, arilo ou aralquilo, por exemplo.
Tal como aqui utilizado, "L-aminoácido" refere-se a qualquer dos alfa-aminoácidos levógiros de ocorrência natural normalmente presentes em proteínas ou os ésteres de alquilo desses alfa-aminoácidos. O termo D-aminoácido "refere-se a ácidos alfa-aminoácidos dextrorotadores. Salvo indicação em contrário, todos os aminoácidos aqui referidos são L-aminoácidos. "Hidrofóbico" ou "não polar" são usados aqui de forma sinónima e referem-se a qualquer interação ou interação molecular não caracterizada por um dipolo. "PEGuilação" refere-se à reação em que pelo menos uma porção de polietileno glicol (PEG), independentemente do tamanho, está ligada quimicamente a uma proteína ou péptido para formar um conjugado PEG-péptido. "PEGuilado significa que pelo menos uma porção de PEG, independentemente do tamanho, está ligada quimicamente a um péptido ou proteína. 0 termo PEG é geralmente acompanhado por um sufixo numérico que indica o peso molecular médio aproximado dos polímeros de PEG, por exemplo PEG-8000 refere-se a polietilenoglicol com um peso molecular médio de cerca de 8000.
Tal como aqui utilizado, "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a derivados dos compostos descritos em que o composto original é modificado fazendo seus sais ácidos ou de base. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a sais de ácidos minerais ou orgânicos de resíduos básicos tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos tais como ácidos carboxílicos; e similar. Assim, o termo "sal de adição de ácido" refere-se ao derivado de sal correspondente de um composto original que foi preparado pela adição de um ácido. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais convencionais ou os sais de amónio quaternário do composto original formado, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos. Por exemplo, tais sais convencionais incluem, mas não estão limitados a, aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como ácido fumárico, acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maleico, hidroxelémico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, toluenossulfónico, metanossulfónico, etano dissulfónico, oxálico, isetiónico e semelhantes. Certos compostos ácidos ou básicos da presente invenção podem existir como zwitterions. Todas as formas dos compostos, incluindo ácido livre, base livre e zwitterions, estão contempladas dentro do âmbito da presente invenção.
Descrição:
De acordo com a presente invenção, foram utilizadas informações sobre as características biológicas e físico-químicas da ligação de compstatina a C3 para conceber péptidos de compstatina modificados com atividade significativamente melhorada em comparação com o péptido de compstatina parental. Em algumas formas de realização, os análogos têm uma atividade pelo menos 300 vezes maior do que a compstatina. Em outras formas de realização, os análogos têm uma atividade de 350, 400, 450, 500, 550, 600 vezes ou maior do que a compstatina, em comparação utilizando os ensaios descritos nos exemplos.
Os análogos de compstatina sintetizados de acordo com abordagens anteriores mostraram possuir atividade melhorada em comparação com o péptido parental, isto é, até cerca de 99 vezes (Mallik, B. et al., 2005, supra; WO2004/026328), e até cerca de 264 vezes (Katragadda et al., 2006, supra; W02007/062249). Os análogos produzidos de acordo com a presente invenção demonstram uma atividade melhorada através de modificação numa posição de compstatina até agora não utilizada e podem conferir uma atividade melhorada à compstatina ou a qualquer análogo descrito atualmente. Os análogos da presente invenção possuem assim uma atividade ainda maior do que o péptido original ou seus análogos produzidos até à data, tal como demonstrado por ensaios In vitro como mostrado nas figuras e nos exemplos aqui apresentados. A tabela abaixo mostra a sequência de aminoácidos e as atividades inibitórias do complemento de análogos exemplificados selecionados com atividade significativamente melhorada sobre a compstatina (Ic [CWQDWGHHRC] T; SEQ ID NO: 1) . Os análogos selecionados são referidos por modificações especificas de posições designadas (1-13) em comparação com um análogo de compstatina potente (Ac-Ic [CV (i-Mefl) qdwGAHRC] T-NH2, SEQ ID NO: 4, também referido como o péptido 14 no Exemplo 1) que foi descrito em WO2007/ 062249. Os péptidos de SEQ ID NOS: 5 e 7-11 (também referidos como péptidos 15 e 17-21 no Exemplo 1) são representativos de modificações feitas de acordo com a presente invenção, resultando em análogos de compstatina significativamente mais potentes.
Exemplos de análogos de compstatina, IC50 e mudança na dobra na atividade relativamente à SEQ ID NO: 4 (Ac-lc [CV (í-m. w) qdwGAHRC] T-NH2) , de IC50 de 206 nM) :
Uma modificação de acordo com a presente invenção compreende a restrição da estrutura do péptido na posição 8 do péptido. Numa forma de realização particular, a estrutura é limitada por substituição de glicina na posição 8 (Gly8) com N-metil glicina. É feita referência aos péptidos 8 e 15 exemplares como discutido no Exemplo 1.
Sem pretender estar limitado ou limitado pela teoria, é notado que a N-metilação pode afetar um péptido de várias maneiras. Em primeiro lugar, o potencial doador de ligação de hidrogénio é substituído por um grupo metilo, que não pode formar uma ligação de hidrogénio. Em segundo lugar, o grupo N-metilo é fracamente doação de eletrões, o que significa que pode aumentar ligeiramente a basicidade do grupo carbonilo vizinho. Em terceiro lugar, o tamanho do grupo N-metilo pode causar restrição estérica. Finalmente, a N-metilação pode alterar a população trans/cis da ligação amida, alterando assim a conformação peptídica local de uma maneira similar a uma prolina. 0 aumento da atividade de [Trp (Me)4 Gly (N-Me)8 Ala9]-Ac-compstatina (SEQ ID NO: 5; péptido 15) é uma melhoria notável em comparação com o análogo anteriormente mais ativo, [Trp (Me)4 Gly8 Ala9]-Ac-compstatina (SEQ ID NO: 4; péptido 14) . A N-metilação de Gly8 provavelmente melhora o reconhecimento de alvo e a estabilidade complexa através de reforço de ligação em forma de pico, aumento das restrições locais da estrutura e interações hidrofóbicas melhoradas envolvendo a cadeia lateral do Trp7.
Em formas de realização particulares, a modificação na posição 8 é suplementada com uma modificação adicional compreendendo a substituição de Thr na posição 13 por Ile, Leu, Nle (norleucina) , N-metil Thr ou N-metil Ile. É feita referência aos péptidos exemplares 16, 17, 18, 19, 20 e 21 (SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10 e 11) como discutido no Exemplo 1. Novamente, sem pretender ser limitado ou limitado por Teoria, a substituição de Thr por Ile hidrofóbica foi considerada benéfica. Os efeitos semelhantes observados para os dois isómeros de Ile (ie, Leu e Nle) sugerem que propriedades fisico-quimicas e estéticas, em vez de contatos específicos, podem ser responsáveis por essa melhoria. No entanto, observou-se uma melhora mais distinta na afinidade e na atividade na N-metilação da coluna vertebral de Thr13 e Ile13. Embora as melhorias observadas possam resultar do aumento das restrições da estrutura e, portanto, das penalidades entrópicas conformacionais mais baixas após a ligação, é também o caso de a natureza do resíduo na posição 13 influenciar ainda mais a formação e estabilização de conformações ativas, seja de forma estereótica ou via formação de contatos hidrofóbicos intramoleculares.
As modificações acima descritas na posição 8 e na posição 13 podem ser combinadas com outras modificações de compstatina anteriormente demonstradas para melhorar a atividade, para produzir péptidos com atividade de inibição do complemento significativamente melhorada. Por exemplo, a acetilação do terminal N tipicamente aumenta a atividade inibidora do complemento da compstatina e seus análogos. Consequentemente, a adição de um grupo acilo no terminal amino do péptido, incluindo, mas não limitado a N-acetilação, é uma forma de realização preferida da invenção, de particular utilidade quando os péptidos são preparados de forma sintética. No entanto, às vezes é vantajoso preparar os péptidos pela expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica um péptido num sistema de expressão procariótica ou eucariótica ou por transcrição in vitro e tradução. Para estas formas de realização, o terminal N de ocorrência natural pode ser utilizado.
Como outro exemplo, sabe-se que a substituição de Ala para His na posição 9 melhora a atividade de compstatina e também é uma modificação preferida dos péptidos da presente invenção. Determinou-se também que a substituição de Tyr por Vai na posição 4 pode resultar em uma modesta melhoria na atividade (Klepeis et al., 2003, J Am Chem Soc 125: 8422-8423).
Foi divulgado em WO2004/026328 e WO2007/0622249 que Trp e certos análogos Trp na posição 4, bem como certos análogos Trp na posição 7, especialmente combinados com Ala na posição 9, produz uma atividade muito maior do que a compstatina. Estas modificações são também utilizadas com vantagem na presente invenção.
Em particular, os péptidos compreendendo 5-fluoro- 1-troptofano ou o 5-metoxi, o 5-metil- ou o 1-metil-triptofano, ou o 1-formil-triptofano na posição 4 demonstraram possuir uma atividade 31-264 vezes maior do que a compstatina. Particularmente preferidos são 1-metilo e triptofano de 1-formilo. Acredita-se que uma ligação de hidrogénio induzida por N’-mediada não é necessária na posição 4 para a ligação e atividade da compstatina. A ausência desta ligação de hidrogénio ou redução do carácter polar através da substituição de hidrogénio com alquilo inferior, alcanoilo ou azoto de indol na posição 4 aumenta a ligação e a atividade da compstatina. Sem pretender limitar-se a qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, acredita-se que uma interação ou efeito hidrofóbico na posição 4 fortalece a interação da compstatina com C3. Consequentemente, as modificações de Trp na posição 4 (por exemplo, alterando a estrutura da cadeia lateral de acordo com métodos bem conhecidos na técnica) ou substituições na posição 4 ou na posição 7 de análogos de Trp que mantêm ou aumentam a interação hidrofóbica acima mencionada são contemplados na presente invenção como uma modificação vantajosa em combinação com as modificações nas posições 8 e 13 como descrito acima. Tais análogos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados aos análogos aqui exemplificados, bem como derivados não substituídos ou alternativamente substituídos deles. Exemplos de análises adequadas podem ser encontrados por referência às seguintes publicações, e muitas outras:
Beene, et al., 2002, Biochemistry 41:10262-10269(descrevendo, inter alia, análogos de Trp individualmente e multi-halogenados); Babitzky & Yanofsky, 1995, J. Biol. Chem. 270: 12452-12456(descrevendo, inter alia, Trp metilado e halogenado e outros análogos de Trp e indol); e as Patentes US 6214790, 6169057, 5776970, 4870097, 4576750 e 4299838. Os análogos de Trp podem ser introduzidos no péptido de compstatina por expressão in vitro ou in vivo, ou por síntese de péptidos, como é conhecido na técnica.
Em certas formas de realização, o Trp na posição 4 de compstatina é substituído por um análogo que compreende um substituinte 1-alquilo, mais especialmente um grupo alquilo inferior (por exemplo, C1-C5) substituinte como definido acima. Estes incluem, mas não estão limitados a N (a) triptofano de metilo, N (a) formil triptofano e 5-metiltriptofano. Em outras formas de realização, Trp na posição 4 de compstatina é substituído por um análogo compreendendo um substituinte de 1-alcanoílo, mais particularmente um substituinte de alcanoílo inferior (por exemplo, C1-C5) como definido acima. Para além dos análogos exemplificados, estes incluem, mas não estão limitados a 1-acetil-L-triptofano e L-p-homotriptofano.
Foi divulgado em W02007/0622249 que a incorporação de 5-fluoro-l-toptofano na posição 7 na compstatina aumentou a entalpia da interação entre compstatina e C3, em relação à compstatina de tipo selvagem, enquanto a incorporação de 5-fluoro-triptofano na posição 4 na compstatina diminuiu a entalpia dessa interação. Consequentemente, as modificações do Trp na posição 7, conforme descrito em W02007/062224, são contempladas como modificações úteis em combinação com as modificações nas posições 8 e 13 como descrito acima.
Os péptidos de compstatina modificados da presente invenção podem ser preparados por vários métodos sintéticos de síntese de péptidos através de condensação de um ou mais resíduos de aminoácidos, de acordo com métodos convencionais de síntese de péptidos. Por exemplo, os péptidos são sintetizados de acordo com metodologias padrão de fase sólida, como pode ser realizada em um sintetizador de péptidos Applied Biosystems Model 431A (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia), de acordo com as instruções do fabricante. Outros métodos de síntese de péptidos ou peptidomiméticos, quer por metodologias em fase sólida quer em fase líquida, são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Durante o curso da síntese peptídica, os grupos amino e carboxilo de cadeia ramificada podem ser protegidos/desprotegidos conforme necessário, utilizando grupos protetores comumente conhecidos. Um exemplo de um método sintético peptídico adequado é apresentado no Exemplo 1. A modificação utilizando grupos protetores alternativos para péptidos e derivados peptídicos será evidente para os especialistas na técnica.
Alternativamente, certos péptidos da invenção podem ser produzidos por expressão num sistema procariótico ou eucariótico adequado. Por exemplo, uma construção de ADN pode ser inserida num vetor plasmídico adaptado para expressão numa célula bacteriana (tal como E. coli) ou uma célula de levedura (tal como Saccharomyces cerevisiae) , ou num vetor de baculovírus para expressão numa célula de inseto ou um vetor virai para expressão em uma célula de mamífero. Tais vetores compreendem os elementos reguladores necessários para a expressão do ADN na célula hospedeira, posicionados de modo a permitir a expressão do ADN na célula hospedeira. Tais elementos reguladores necessários para a expressão incluem sequências promotoras, sequências de iniciação da transcrição e, opcionalmente, sequências intensificadoras.
Os péptidos também podem ser produzidos por expressão de uma molécula de ácido nucleico in vitro ou in vivo. Uma construção de ADN que codifica um concatemer dos péptidos, sendo o limite superior do concatemer dependente do sistema de expressão utilizado, pode ser introduzido num sistema de expressão in vivo. Depois de produzido o concatemer, a clivagem entre o Asn C-terminal e o G N-terminal seguinte é realizada por exposição do polipéptido à hidrazina.
Os péptidos produzidos pela expressão de genes num sistema procariótico ou eucariótico recombinante podem ser purificados de acordo com métodos conhecidos na técnica. Uma combinação de expressão de genes e métodos sintéticos também pode ser utilizada para produzir análogos de compstatina. Por exemplo, um análogo pode ser produzido pela expressão do gene e subsequentemente submetido a um ou mais processos sintéticos pós-tradução, por exemplo, para modificar o terminal N ou C ou para ciclizar a molécula.
Vantajosamente, os péptidos que incorporam aminoácidos não naturais, por exemplo, aminoácidos metilados, podem ser produzidos por expressão in vivo em um sistema procariótico ou eucariótico adequado. Por exemplo, métodos como os descritos por Katragadda & Lambris (2006, Protein Expression and Purification 47: 289-295) para introduzir análogos de Trp não naturais em compstatina via expressão em auxotróficos de E. coli podem ser utilizados para introduzir aminoácidos N-metilados ou outros não naturais em posições selecionadas de compstatina. A estrutura da compstatina é conhecida na técnica e as estruturas dos análogos anteriores são determinadas por meios semelhantes. Uma vez que foi determinada uma conformação desejada particular de um péptido curto, métodos para desenhar um péptido ou peptidomimético para se ajustar a essa conformação são bem conhecidos na técnica. De particular relevância para a presente invenção, o desenho de análogos de péptidos pode ser ainda mais refinado considerando a contribuição de várias cadeias laterais de resíduos de aminoácidos, conforme discutido acima (isto é, para o efeito de grupos funcionais ou para considerações estéticas).
Será apreciado pelos especialistas na técnica que um imitador de péptido pode servir igualmente bem como um péptido com a finalidade de proporcionar a conformação do tronco específico e as funcionalidades da cadeia lateral necessárias para se ligar a C3 e inibir a ativação do complemento. Consequentemente, está contemplado estar dentro do âmbito da presente invenção para produzir compostos que inibem o complemento de ligação a C3 através da utilização de aminoácidos, derivados de aminoácidos, análogos ou moléculas de aminoácidos que ocorrem naturalmente capazes de serem unidos para formar a apropriada conformação da espinha dorsal. Um análogo não peptídico, ou um análogo que compreende componentes peptídicos e não peptidicos, às vezes é referido aqui como um "peptidomimético" ou "mimético isostático", para designar substituições ou derivações dos péptidos da invenção, 0 uso de peptidomiméticos para o desenvolvimento de análogos de péptidos de alta afinidade é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, Vagner et al., 2008, Curr. Opin. Chem. Biol. 12: 292-296; Robinson et al·., 2008, Drug Disc. Today 13: 944-951) supondo restrições de rotação semelhantes às dos resíduos de aminoácidos dentro de um péptido, podem ser analisados análogos que compreendem porções de aminoácidos e seus motivos conformacionais verificados por qualquer variedade de técnicas computacionais bem conhecidas na técnica.
Os péptidos de compstatina modificados da presente invenção podem ser modificados pela adição de componentes de polietilenoglicol {PEG) ao péptido. Como é bem conhecido na técnica, a PEGuilação pode aumentar a meia-vida de péptidos terapêuticos e proteínas In. vivo, Numa forma de realização, o PEG tem. um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 50 000. Noutra forma de realização, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 20000. Noutra forma de realização, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 10000. Numa forma de realização exemplar, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 5.000. G polietilenoglicol pode ser uma cadeia ramificada ou linear, e de preferência é uma cadeia linear.
Os análogos de compstatina da presente invenção podem ser covalentemente ligados a PEG através de um grupo de ligação. Tais métodos são bem conhecidos na técnica, (avaliado em Kozlowski A, et al. 2001, BioDrugs 15; 419-29; Veja também, Harris JM e Eaiipsky S, eds. Poli (etileno glicol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680 (1997)). Os exemplos não limitativos de grupes de ligação aceitáveis incluem um grupe éster, um grupo amida, um grupo ímida, um grupo carbamato, um grupo carboxilo, um grupo hidroxilo, um hidrato de carbono, um grupo succinimida (incluindo, sem limitação, succinato de succinimídilõ (SS) propionato de succinimidilo (SPA), succinimidil carboximetilato (SCM), succinimidil succinamida (SSA) e N-hidroxí succinimida (NHS)), um grupo epóxido, um grupo oxicarbonilimidazole (ineÍuindo> sem limitação, carbonildiimidazole (GDI)), um grupo .nitrofenilo: ( incluindo, sem limitação, carbonato de nitrofenilo (NPC) ou carbonato de triclorofenilo (TPC)), um grupo trisilato* um grupo aldeído, um grupo isocianato, um grupo vinilsulfona, um grupo tirosina, um grupo çisteína, um grupo histidina ou uma amina primária. Em certas formas de realização, o grupo de ligação é um grupo succinimida. Numa forma de realização, de ligação é NHS.
Os análogos de compstatina da presente invenção podem alternativamente ser acoplados diretamente a PEG (isto é, sem um grupo de ligação) através de um grupo amino, um grupo sulfidral, um grupo hidroxilo ou um grupo carboxilo. Numa forma de realização, o PEG é acoplado a um resíduo de lisina adicionado ao terminal C da compstatina.
Como alternativa à PEGuilação, a depuração in vivo de péptidos também pode ser reduzida ligando os péptidos a certas outras moléculas ou péptidos. Por exemplo, certos péptidos de ligação à albumina exibem uma meia-vida excecionalmente longa de 2,3 h quando injetados por bolus intravenoso em coelhos (Dennis et al., 2002, J Biol Chem. 277: 35035-35043). Um péptido deste tipo, fundido com o fator Fab anti-tecido de D3H44 permitiu que o Fab se ligasse à albumina, mantendo a capacidade do Fab de se ligar ao fator de tecido (Nguyen et al·., 2006, Protein Eng Des Sei. 19: 291-297.). Esta interação com a albumina resultou em uma redução significativa da folga in vivo e da semivida prolongada em ratinhos e coelhos, quando comparada com o Fab D3H44 de tipo selvagem, comparável com os observados para moléculas Fab PEGiladas, imunoadesinas e fusões de albumina. A W02007/062249 descreve um análogo de compstatina fundido com um péptido de ligação a albumina (ABP) e relata que a proteína de fusão é ativa na inibição da ativação do complemento. No entanto, a síntese foi longa e o rendimento do produto de fusão foi menor do que o desejado. 0 Exemplo 2 aqui apresenta estratégias de síntese melhoradas utilizando uma ABP bem como uma molécula pequena de ligação a albumina (ABM), e opcionalmente empregando um espaçador entre os componentes. Esses procedimentos resultaram na produção de conjugados de análogos ABP e ABM-compstatina capazes de inibir a ativação do complemento e também exibir sobrevivência extensa in vivo. Na verdade, o ABP foi capaz de melhorar a meia-vida de um análogo de compstatina em 21 vezes sem comprometer significativamente a sua atividade inibitória. Assim, tais conjugados permitem a administração sistémica do inibidor sem infusão. A atividade inibidora de ativação do complemento de análogos de compstatina, peptidomiméticos e conjugados pode ser testada por uma variedade de ensaios conhecidos na técnica. Numa forma de realização, o ensaio descrito no Exemplo 1 é utilizado. Uma lista não exaustiva de outros ensaios é apresentada em Patente US 6319897, W099/13899, W02004/026328 e W02007/06224 incluindo, mas não limitado a, (1) ligação peptídica a fragmentos C3 e C3; (2) vários ensaios hemoliticos; (3) medição da clivagem mediada por C3 convertase de C3; e (4) a medição da clivagem do Fator B pelo Fator D.
Os péptidos e peptidomiméticos aqui descritos são de utilidade prática para qualquer finalidade para a qual a própria compstatina é utilizada, como é conhecido na técnica. Tais usos incluem, mas não estão limitados a: (1) inibir a ativação do complemento no soro, tecidos ou órgãos de um paciente (humano ou animal), o que pode facilitar o tratamento de certas doenças ou condições, incluindo, entre outras, degeneração macular relacionada, artrite reumatoide, lesão da medula espinhal, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, cancro e distúrbios respiratórios, como asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), inflamação alérgica, enfisema, bronquite, bronquioestase, fibrose cética, tuberculose, pneumonia, síndrome de dificuldade respiratória (RDS - neonatal e adulto), rinite e sinusite; por exemplo, por revestimento ou tratamento de outras células, órgãos, órgãos artificiais ou implantes com um péptido da invenção); (3) inibindo a ativação do complemento que ocorre durante a derivação extracorpórea de fluidos fisiológicos (sangue, urina) (por exemplo, por revestimento da tubulação através da qual os fluidos são desviados com um péptido da invenção); e (4) no rastreio de bibliotecas de pequenas moléculas para identificar outros inibidores da ativação da compstatina (por exemplo, ensaios de alto rendimento de fase líquida ou sólida projetados para medir a capacidade de um composto de teste para competir com um análogo de compstatina para ligação com C3 ou um fragmento C3) .
Para implementar uma ou mais das utilidades mencionadas acima, outro aspeto da invenção apresenta composições farmacêuticas compreendendo os análogos ou conjugados de compstatina descritos e exemplificados aqui. Tal composição farmacêutica pode consistir apenas no ingrediente ativo, numa forma adequada para administração a um sujeito, ou a composição farmacêutica pode compreender o ingrediente ativo e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, um ou mais ingredientes adicionais, ou alguma combinação destes. 0 ingrediente ativo pode estar presente na composição farmacêutica na forma de um éster ou sal fisiologicamente aceitável, tal como em combinação com um catião ou anião fisiologicamente aceitável, como é bem conhecido na técnica.
As formulações das composições farmacêuticas podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou desenvolvido na técnica da farmacologia. Em geral, tais métodos preparatórios incluem o passo de colocar o ingrediente ativo em associação com um transportador ou com um ou mais outros ingredientes acessórios, e então, se necessário ou desejável, moldar ou empacotar o produto em uma unidade desejada única ou múltipla.
Tal como aqui utilizado, o termo "transportador farmaceuticamente aceitável" significa uma composição química com a qual um inibidor do complemento pode ser combinado e que, após a combinação, pode ser utilizado para administrar o inibidor do complemento a um mamífero.
Os seguintes exemplos são fornecidos para descrever a invenção em maior detalhe. Destina-se a ilustrar, não a limitar, a invenção.
Exemplo 1
Uma varredura mono-N“-metilação foi realizada em [Tyr4 Ala9] -Ac-compstatina (Ac-Ic [CVYQDWGAHRC] T-NH2; SEQ ID NO: 3). Com base nos resultados do ensaio destes análogos, a N-metilação seletiva e a substituição na posição 13 foram realizadas em [Trp (Me)4 Ala9]-Ac-compstatina (Ac-Ic [CV (1_ Me W) QDWGAHRC] T-NH2; SEQ ID NO: 4) . Os análogos selecionados foram ainda caracterizados usando ressonância plasmática de superfície (SPR) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). As simulações de dinâmica molecular (MD) também foram realizadas para investigar possíveis mecanismos para o aumento observado de afinidade.
Materials e métodos:
Abreviaturas. Ac, grupo acetilo; Acm, acetamidometilo; Boc, terc-butoxicarbonilo; CHARMM, Química na Mecânica Macromolecular de Harvard; DCM, diclorometano; DIC, 1,3-diisopropilcarbodiimida; DIPEA, N,N- diisopropiletilamina; DMF, N,N dimetilformamida;ELISA, ensaio de imunoabsorção enzimática; ESI, ionização por eletropulverização; Fmoc, 9-fluorenilmetoxicarbonilo; HOAt, l-hidroxi-7-aza-benzotriazole; ITC, calorimetria de titulação isotérmica; MALDI, ionização por dessorção a laser assistida por matriz; MBHA, 4-metilbenzidrilamina; MOE, ambiente operacional molecular; NAMD, dinâmica molecular em nanoescala; Nle, L- inorleucina; NMP, N-metilpirrolidinona; RMSD, desvio quadrático médio; SPR, ressonância plasmática superficial; TIPS, triisopropilsilano; Trt, trityl.
Produtos quimicos. A resina de MBHA de amida de pista de baixa carga e os seguintes aminoácidos de Fmoc foram obtidos de Novabiochem (San Diego, CA) : Ile, Cys (Acm) , Vai, Tyr (tBu) , Gin (Trt) , Asp (OtBu) , Trp (Boc) , Gly, Sar, Ala, MeAla, His (Trt), Arg (Pmc), Melle, Nle, Phe e Thr (tBu). DIC e Fmoc-Trp (Me)-OH foram adquiridos da AnaSpec (San Jose, CA) . HOAt foi adquirido da Advanced ChemTech (Louisville, KY) . NMP e DCM foram obtidos da Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) . Todos os outros reagentes quimicos para síntese foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e utilizados sem purificação adicional. Síntese e purificação de péptidos. Todos os péptidos foram sintetizados manualmente por metodologia Fmoc em fase sólida usando DIC e HOAt como reagentes de acoplamento. Quando os aminoácidos N-metilados não estavam comercialmente disponíveis, a N-^-metilação foi realizada usando a metodologia otimizada relatada por Biron et al. (2006, J Peptide Sei 12: 213-219). Foram utilizados os seguintes procedimentos para a síntese dos péptidos lineares: colocou-se uma resina MBHA de amido de rink (294 mg, 0,34 mmol/g) em uma seringa de polipropileno HSW de 10 mL com fritas no fundo (Torviq, Niles, MI) e inchada DCM (5 mL) durante 30 min. Após a remoção do grupo protetor Fmoc (25% de piperidina em NMP, 5 mL, 5 e 10 min), a resina foi lavada quatro vezes com NMP (5 mL por lavagem) e DCM (5 mL por lavagem) e os aminoácidos individuais foram acoplados à resina. Para cada acoplamento, foram utilizados 3 equivalentes (3 mmol) do aminoácido, HOAt e DIC, com pré-ativação de 10 min em NMP. Todos os acoplamentos foram realizados durante lhe monitorados pelo teste de Kaiser ou pelo teste de cloranil. No caso de um resultado de teste positivo, o acoplamento foi repetido até um resultado de teste negativo foi observado. 0 grupo amino N-terminal foi acetilado com 20 equivalentes de anidrido acético e 2 equivalentes de DIPEA em 5 mL de DCM durante 30 min. Os péptidos lineares contendo resíduos de Cyc (Acm) foram ciclizados em resina usando acetato de tálio em DMF/anisole (19:1) à temperatura ambiente durante 3 h. A resina foi lavada quatro vezes com DMF, DCM e DCM/éter dietílico (1: 1) (cada 5 mL por lavagem) e secou-se sob vácuo durante 4 h. Os péptidos foram clivados da resina com uma mistura de 95% de TFA, 2,5% de água e 2,5% de DICAS durante 3 h. Após evaporação do TFA sob vácuo, os péptidos foram precipitados e lavados três vezes com 30 mL de éter dietílico frio por lavagem. O líquido foi separado do sólido por centrifugação e decantado. Os péptidos em bruto foram secos no ar e dissolvidos em acetonitrilo e 0,1% de TFA em água (1:is 218TP152022, Western Analytical Products, Murrieta, CA) e eluição com um gradiente linear de 15-50% de acetonitrilo em solução aquosa de 0,1% de TFA ao longo de 35 min a uma taxa de fluxo de 15 mL/min. As frações contendo os produtos desejados foram recolhidas, concentradas e liofilizadas. Os péptidos purificados foram isolados em rendimentos globais de 10-15% e foram > 95% puros como determinado por RP-HPLC analítica (coluna Phenomenex 00G-4041-E0 Luna 5 μ Cie 100A, 250x4,60 mm, Phenomenex, Torrance, CA) . A massa de cada péptido foi confirmada usando os instrumentos Micro MX da ThermoQuest Finnigan LCQ Duo e Waters MALDI.
Purificação de C3. C3 foi purificado a partir de plasma humano fresco obtido do banco de sangue do Hospital da Universidade da Pensilvânia. Em resumo, o plasma foi fracionado com PEG 3350 a 15% (p/v) e o sedimento foi ressuspenso em tampão de fosfato 20 mM, pH 7,8, e depois submetido a cromatografia de permuta aniónica numa coluna DEAE-HR 40 (50 χ 5 cm; Millipore Inc., Billerica, MA) com o mesmo tampão. As proteínas foram eluídas com 6 L de um gradiente linear (15-70%) de tampão de fosfato 20 mM, pH 7,8, contendo 500 mM de NaCl. C3 foi ainda purificado em um de exclusão de tamanho Superdex 200 26/60 (Amersham Biosciences) e uma coluna Mono S (Amersham Biosciences) para separar C3 a partir de C3 (H2O) .
Inibição da ativação do complemento. A capacidade dos análogos de compstatina de inibir a ativação da via clássica do complemento foi avaliada por ELISA (Mallik et al., 2005, J Med Chem 48: 274-86). Em resumo, o complemento foi ativado no soro humano usando um complexo antígeno-anticorpo na presença ou ausência de análogos de compstatina, e a deposição de fragmentos C3 na superfície da placa foi detetada usando um anticorpo policlonal anti-C3 conjugado com HRP. Os dados de absorvência obtidos a 405 nm foram traduzidos em% de inibição, com base na absorvência correspondente a 100% de ativação do complemento. A percentagem de inibição foi traçada em relação à concentração de péptido, e o conjunto de dados resultante foi ajustado à função logística de dose-resposta usando o software Origin 7.0. Os valores de IC50 foram obtidos a partir dos parâmetros ajustados que produziram o menor valor χ2. Cada analógico foi ensaiado pelo menos três a sete vezes. Os desvios-padrão foram todos dentro de 30% do valor médio.
Análise ITC. Todos os experimentos de ITC foram realizados com o calorímetro Microcal VP-ITC (Microcal Inc., Northampton, MA) , utilizando concentrações de proteína de C3 de 1,8-5 μΜ nas concentrações de células e péptidos de 40-100 μΜ de análogos de compstatina individuais na seringa. Todas as titulações foram realizadas em PBS (tampão de fosfato 10 mM com NaCl 150 mM, pH 7,4) a 25°C usando múltiplas injeções de péptido de 2-7 pL cada. Os isotermas brutos foram corrigidos para as calorias de diluição, subtraindo os isotermas que representam injeções de péptido no tampão. Os isotermas resultantes foram instalados em um único site de modelos de sites usando o software Origin 7.0 e o modelo que produziu o valor de χ2 mais baixo foi considerado apropriado para o respetivo conjunto de dados. A energia livre de Gibbs foi calculada como AG = ΔΗ - TAS. Cada experiência foi repetida pelo menos duas vezes. Os erros estavam dentro de 20% dos valores médios.
Análise SPR. A cinética da interação entre C3b e cada análogo de compstatina foi analisada por SPR em um instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare Corp., Piscataway, NJ) a 25°C usando PBS-T (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% Tween-20, pH 7,4) como o tampão de corrida, como descrito acima. Em resumo, o C3b biotinilado (30 pg/mL) foi imobilizado num chip de sensor revestido com estreptavidina e uma série de diluição em série de duas vezes (1 μΜ-500 pM) de cada análogo foi injetada durante 2 minutos a 30 μΐ/min, com uma fase de dissociação de 5-10 min. Péptido [Trp (Me)4] -Ac-compstatina foi incluído em cada série experimental como um controle interno e referência. A análise de dados foi realizada usando Scrubber (Biologic Software, Campbell, Austrália). Os sinais de uma célula de fluxo não tratada e um conjunto de injeções de buffer em branco foram subtraídos para corrigir os efeitos do tampão e os artefactos da injeção. Os dados de biossensor processados foram globalmente adaptados a um modelo de ligação de Langmuir 1: lea constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada a partir da equação K D = kd/k&. As soluções de péptido foram injetadas em duplicado em cada experiência, e cada teste de rastreio foi realizado pelo menos duas vezes. 0 erro de k a e k d estavam dentro de 10% dos valores médios.
Simulação de dinâmica molecular. Todas as simulações MD foram realizadas com o programa NAMD {Phillips, et al., 2005, J. Comput. Chem. 26: 1781-1802) usando o campo de força CHARMM27. Para os análogos de compstatina livres, a estrutura de RMN (Morikis & Lambris, 2002, Biochem. Soc. Trans. 30: 1026-1036) (Código PDB: 1A1P) foi adotado para construir estruturas iniciais. As mutações de ponto foram introduzidas com o programa Molecular Operating Environment (MOE, Chemical Computing Group, 2005). Os resíduos mutados dos análogos de compstatina foram minimizados usando CHARMM (Brooks et al., 1983, J. Comput. Chem. 4: 187-217) versão c33bl, com o CHARMM27 (MacKerell et al., 1998, J. Phys. Chem. B 102: 3586-3616) conjunto de parâmetros, enquanto as restrições harmónicas foram colocadas nos átomos da espinha dorsal. Os resíduos do complemento C3c que estavam faltando na estrutura de cristal foram adicionados usando modelagem de homologia e também minimizados usando CHARMM.
As moléculas de água cristalográficas no arquivo PDB foram mantidas, e as estruturas foram solvatadas em caixas periódicas cúbicas de TIP3P (Jorgensen et al., 1983, J. Chem. Phys. 79: 926-935) moléculas de água. As distâncias entre as bordas da caixa de simulação de água e o átomo mais próximo dos solutos foram de pelo menos 10 Ã. Os contra-iões de sódio e cloreto foram então adicionados usando o programa VMD (Humphrey et al., 1996, J Mol. Graphics 14: 33-38, 27-28), a fim de manter a eletricidade dos sistemas.
Os sistemas foram primeiro minimizados em três passos consecutivos, durante os quais a proteína foi inicialmente mantida fixa e as moléculas de água foram permutadas para mover-se para 10 000 passos de gradiente conjugado; Em seguida, apenas a estrutura da proteína foi mantido fixa por 100000 passos; Finalmente, todos os átomos foram autorizados a mover-se para mais 10 000 passos. O método Ewald da malha de partículas (Darden et al., 1993, J. Chem. Phys. 98: 10089-10092) foi usado para tratar interações eletrostáticas de longo alcance em condições de fronteira periódicas com uma grade de aproximadamente 1 ponto por Ã. As interações de van der Waals não combinadas foram trocadas suavemente sobre 3 Â entre 9 e 12 A. Os comprimentos de ligação que envolvem ligações a átomos de hidrogénio foram restringidos usando SHAKE (Ryckaert et al., 1977, J. Comput. Phys. 23: 327-341). O passo de tempo para toda a simulação de MD foi de 2 fs. O pistão Nange-Hoover Langevin (Feller et al., 1995, J. Chem. Phys. 103: 4613-4621; Martyna et al., 1994, J. Chem. Phys. 101: 4177-4189) foi utilizado para controlo de pressão, com o período do pistão ajustado para 200 fs e uma decomposição do pistão de 100 fs. As simulações de DM a 100 ps foram realizadas em volume constante, durante o qual os sistemas foram aquecidos a 310 K em incrementos de 30 K; uma subsequente simulação isotarica de MD isotérmica foi utilizada por 20 ns e 5 ns para ajustar a densidade do solvente sem quaisquer restrições em todos os átomos de soluto para análogos e complexos de compstatina livres, respetivamente. Finalmente, as estruturas de energia mais baixas foram obtidas a partir de arquivos de trajetória equilibrados de MD e posteriormente utilizadas na análise de contribuição de estrutura e entropia.
Resultados:
Inibição da ativação do complemento. Uma varredura de N-metilação da estrutura foi realizada num modelo [Tyr4 Ala9] -Ac-compstatina (péptido 1; SEQ ID NO: 3) para gerar análogos 2-13 (Tabela 1-1) . Embora o péptido 1 tenha sido menos potente do que o composto de chumbo atual, [Trp (Me)4 Ala9] -Ac-compstatinaa (péptido 14, SEQ ID NO: 4), foi escolhido para a varredura inicial devido ao menor custo de síntese. A capacidade de cada péptido para inibir a ativação do complemento foi então avaliada por ELISA e comparada à atividade do péptido 1 (Tabela 1-1). 0 efeito mais negativo foi observado para a N-metilação de Vai3, Tyr4 e Ala9, o que tornou os péptidos 3, 4 e 9 completamente inativos. Em contraste, a N-metilação de Gly8 e Thr13 produziu péptidos 8 e 13 com potência ligeiramente aumentada {1,7 e 1,3 vezes, respetivamente). A N-metilação em todas as outras posições resultou em atividade inibitória detetável, porém significativamente reduzida (Tabela 1-1) .
Tabela 1-1. Inibição da ativação da via clássica do complemento por análogos N“-metilados de [Tyr4 Ala9] -Ac-compstatina (péptido 1; SEQ ID NO: 3)
Em seguida, aplicou os resultados da verificação de N-metilação para a de um análogo potente corrente, Ac-I [CV (i-Me çj) QDWGAHRC] T-NH2 (SEQ ID NO: 4, também aqui referido como [Trp (Me)4 Ala9]-Ac-compstatina, péptido 14) e análogos sintetizados com N-metilação seletiva e substituições de aminoácidos nas posições 8 e 13 (péptidos 15-23; Tabela 1-2). Uma vez que estudos anteriores indicaram limitações para a substituição da cadeia lateral na posição 8 (Morikis et al., 1998, Protein Sei. 7: 619-627; Furlong et al·., 2000, Immunopharmacology 48: 199-212), as modificações foram restritas à ausência (Gly8) ou presença de N-metilação (NMeGly8, isto é, Sar8) . Em contrapartida, trabalhos anteriores mostraram que a posição C-terminal 13 permitiu maior flexibilidade para substituições e até sugeriu preferência por lie Over Thr (Morikis & Lambris, 2002, Biochem. Soc. Trans. 30: 1026-1036). Por isso, investigamos ainda mais a importância da posição 13 e desenhamos uma série de análogos de Sar8 para incluir vários resíduos N-metilados, hidrofóbicos ou aromáticos nesta posição. Consistente com os resultados da varredura de N-metilação, a introdução de um único grupo N-metilo na posição 8 (Sar8, péptido 15) aumentou a potência inibidora em 1,3 vezes (Tabela 1-3). Além disso, a substituição de Thr por Ile na posição 13 levou a um aumento significativo tanto para os péptidos Gly8 quanto para Sar8. No entanto, nem a substituição de Ile por Leu ou Nle, nem a introdução de His ou Phe produziram qualquer melhoria em relação ao análogo Ile13. Em contraste, a N-metilação de Thr13 e Ile13 resultou num aumento significativo da atividade inibidora (IC 50 = 86 e 62 nM, respetivamente) , gerando os análogos de compstatina mais potentes descritos até agora.
Tabela 1-2: Avaliação da potência inibitória, parâmetros cinéticos e tprmnrii nâmi ms para uma série de análogos de compstatina (Ac-Ile-c [Cys-Val-Trp (1-Me) -Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His -Arg-Cys] -Thr-Nlfe) (péptido 14, SEQ ID NO: 4) com modificações na posição 8 e 13. (Os números entre parêntesis a seguir aos números de péptidos são as SEQ ID NOs).
Caracterização cinética vinculativa. Os péptidos 15-21 foram ainda caracterizados por SPR para avaliar o efeito de substituições individuais no perfil cinético e afinidade de ligação para C3b (Tabela 1-2). Em geral, os valores relativos de K □ mostraram boa consistência com os resultados de ELISA (R2 = 0,79; Tabela 1-3). N-metilação de GlyB (péptidos 14 a 15, 16 a 17) melhoraram claramente a cinética e a afinidade de ligação, com efeitos significativos em ambas as constantes de taxa cinética. Em contraste, as substituições de Thr-a-Ile (péptidos 14 a 16, 15 a 17) tiveram apenas um impacto leve, ainda que benéfico, nos perfis SPR. Novamente, a combinação de ambas as substituições (péptido 17) teve um efeito sinérgico, com uma afinidade 2,7 vezes maior do que o péptido 14, em comparação com o impacto das modificações Sar8 e Ile13 sozinhas (2,2 e 1,1 vezes, respetivamente). As substituições na posição 13 isoladamente pareciam influenciar principalmente a taxa de dissociação (kd = 3,4-7,2 * IO-3 s-1) ; a taxa de associação permaneceu essencialmente constante para todos os análogos Sar8 (ka = 1,3-1,7 x 106 M-1 s_1) . Nesta série, a N-metilação de Thr13 (péptido 20) e Ile13 (péptido 21) novamente teve o impacto mais forte na taxa de dissociação, tornando análogo 21 o aglutinante mais forte, com um aumento de mais de 5 vezes na afinidade sobre o péptido 14. Os isómeros avaliados de Ile13 (Leu, Nle; péptidos 18 e 19) tiveram uma influência insignificante no perfil cinético e afinidade, indicando um modo de ligação comum para este andaime.
Caracterização da termodinâmica vinculativa. Experiências ITC foram realizadas para os péptidos 15-17 e 20-21 para correlacionar os efeitos observados sobre afinidade e potência com seus perfis termodinâmicos (Tabela 1-2 e 1-3) . Embora os valores absolutos de K D no ITC tenham sido ligeiramente superiores aos da SPR, foram altamente correlacionados com os resultados de ELISA e SPR (R2 = 0,89 e 0,96, respetivamente). O valor de entalpia altamente benéfico (ΔΗ = - 17,6 kcal/mol) do composto de chumbo anterior (péptido 14) não foi superado por nenhum dos análogos recém-projetados. Em contraste, todo o painel teve valores de entropia significativamente melhorados (-TAS = 0,6 - 5,7 kcal/mol) quando comparados ao péptido 14 (-TAS = 6,9 kcal/mol).
Tabela 1-3: Melhoria relativa na potência e parâmetros de ligação de análogos de compstatina recém-projetados guando comparados a [Trp (Me)4 Ala9] -Ac-compstatina(péptido 14)
O péptido 15 (Sar8 Thr13; -TAS = 0,6 kcal/mol) exibiu a menor penalidade entrópica de todos os análogos de compstatina relatados. No entanto, a maior parte deste grande ganho entrópico foi compensada por uma perda de entalpia favorável (ΔΔΗ = 5,9 kcal/mol). Tendências semelhantes foram observadas para todo o painel, indicando a influência da compensação entalpia-entropia. Substituição adicional de Ile13 por Thr13 como no péptido 17 recuperou parte da entalpia perdida (ΔΗ = -14,1 kcal/mol), enquanto produziu algum ganho de entropia (-TAS = 2,9 kcal/mol) no péptido 15. N-metilação na posição 13, como nos péptidos 20-21, trouxe seus valores de entalpia ainda mais próximos do péptido 14. Em geral, a afinidade de ligação aumentada para esses péptidos pareceu ser alcançada principalmente por uma redução na penalidade entrópica. Além disso, os dados do ITC confirmaram os resultados de SPR indicando que era o Sar8 e não a substituição Ile13 que mais contribuíram para a maior afinidade do péptido 17.
Simulações de MD. O grande impacto de modificações peptidicas mesmo pequenas nos perfis termodinâmicos dos análogos foi ainda investigado usando simulações MD com base na estrutura de RMN da compstatina e na estrutura cristalina de [Trp4]-Ac-compstatina com C3c (Morikis et al., 1998), supra ; Janssen et al., 2007, J. Biol Chem. 282: 29241-29247). No caso da N-metilação na posição 8 (péptido 17), suspeitamos que esta modificação afetou a cadeia lateral do resíduo crítico Trp7, que está diretamente conectado ao nitrogénio Gly8 metilado e ocupa um bolso apertado. As simulações de DM foram, portanto, realizadas para comparar a distribuição de moléculas de água nos bolsos de ligação de Trp7 dos péptidos 14 e 17. Descobrimos que, enquanto que quatro moléculas de água podem ser observadas para o péptido 14, nenhuma encontrou após repetir a simulação com o péptido 17. Isso O resultado indica que a N-metilação na posição 8 permite que a cadeia lateral do Trp7 se encaixe melhor no bolso de ligação C3c.
As comparações anteriores entre as estruturas baseadas em solução e ligadas a proteínas revelaram rearranjo conformacional significativo, incluindo uma mudança na etapa β importante (Janssen et al.f 2007, supra). Uma vez que a N-metilação foi relatada como afetando a conformação local do esqueleto peptídico, realizamos simulações MD para o péptido 14 e 17 na ausência e presença de C3c e depois comparamos os conformadores de energia mais baixos resultantes dos péptidos livres e ligados (Chatterjee et al., 2008, Acc. Chem. Res. 41: 1331-1342). Os resultados mostraram que os resíduos de 5-8 que abarcam os resíduos abriram, e uma nova volta foi formada entre os resíduos 8 e 11 nas estruturas livres de ambos os péptidos. Além disso, as voltas β se sobrepõem bem com as estruturas ligadas. No entanto, uma ligação de hidrogénio intramolecular entre Trp7 e Arg11 com uma distância de 2,9 A foi formada apenas no caso do péptido 17, provavelmente restringindo a conformação de 17 livres e tornando-a mais rigida.
Exemplo 2
Este exemplo descreve uma síntese melhorada e a determinação da semivida plasmática, de um análogo de compstatina (péptido 17 descrito no Exemplo 1: Ac-Ile-c [Cys-Val-Trp (Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala His-Arg-Cys]-Ile-NH2; SEQ ID NO: 7), conjugada com um péptido de ligação a albumina (ABP) ou uma molécula pequena de ligação a albumina (ABM), mostrada abaixo. ABP: Ac-RLIEDI C LPRWG C LWEDD-NH 2 (ligação dissulfureto CC) (SEQ ID NO: 14) ABM.
Foram utilizadas duas moléculas mini-PEG-3 como espaçador e acopladas ao C-terminal do péptido 17.
Farâ comparação, a semivida plasmãtica do péptido não osn j ugado 17 também, .foi 'MmàmsÊm£m..:e· métgdosr
Abreviaturas. Ac, grupo acetilo; Acm, acetamidometilo; Acm, acetamidometilo;- DCM, diclorometano; DIC, 1*;3~: diisopropilcarbodiimida; DIPEA, dilíSdprdpiletilâmina; DMF, !7,-Í^diméfcil:Íormamida..r E:LlM*: onsaio de imunoabsorfiO' enzimática; ESI, ionização por élebfopalverização, Emoc, 9-fluorenilmetoxicarbonilo; HLB, ftidrofílico-lipofilico. equilibrado; HOA.t, 1 -hidroxi -7-aza-beηzotríazole; HSW,
Henke sass wolf;; ITC, calorimetria, de titulação, isotérmica; MALDI, ionização por dessorçãio a laser assistida, por matriz; MBHA, 4-metilbenz-hidrilamina; Mmt,
Monome:Êoxitritll;: NanoESI, ionização por nano eletropulverização; NMP, íl^ifiiíòlidinona;· PyBOP, hexaf1uorofosfato de benzotriazol-l-il- oxitripirrolidinofosfónio; SPR, ressonância plasmática. superficial; TBTA, Tris- (benziltriazolilmetil) amina; TEA, trietilamina; TFA, ácido trifluoroacético; DICAS, triisopropilsilano; Trt, tritil.
Materiais. DIC e Fmoc-Trp (Me)-OH forara adquiridos da AnaSpec (San Jose, CA). A resina NovaSyn® TGR de baixa carga e outros aminoácidos Fmoc foram obtidos de Novabiochem (San Diego, CA). Mini-PEG e mini-PEG-3 foram adquiridos da Peptide International (Louisville, Kentucky). HOAt foi adquirido da Advanced ChemTech (Louisville, KY) . A ABM foi obtida da Enamine Ltd. (Kiev, Ucrânia) . NMP e DCM foram obtidos da Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) . A água foi purificada utilizando um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore Corporate, Billerica, MA). Todos os outros reagentes químicos para síntese foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e utilizados sem purificação adicional. Síntese de péptidos lineares (péptido 17-mini-(PEG-3>2-Lys (Mmt)-NH2 e ABP). Todos os péptidos foram sintetizados manualmente por metodologia Fmoc em fase sólida usando DIC e HOAt como reagentes de acoplamento. Em resumo, a resina (294 mg, 0,34 mmol/g) foi colocada em uma seringa de polipropileno HSW de 10 mL com fritas no fundo (Torviq, Niles, MI) e inchada em DCM (5 mL) durante 30 min. Após a remoção do grupo protetor Fmoc (25% de piperidina em NMP, 5 mL, 5 e 10 min), a resina foi lavada quatro vezes com NMP (5 mL por lavagem) e DCM (5 mL por lavagem) e o amino individual os ácidos foram acoplados à resina. Para cada acoplamento, utilizaram-se 3 equivalentes (0,3 mmol) do aminoácido, HOAt e DIC, com 10 minutos de pré-ativação em NMP. Todos os acoplamentos foram realizados durante lhe monitorados até a conclusão pelo teste de Kaiser ou pelo teste de cloranil. Se necessário, o grupo amino N-terminal foi acetilado com 20 equivalentes de anidrido acético e 2 equivalentes de DIPEA em 5 mL de DCM durante 30 min.
Ciclização, modificação e clivagem da póptidos. Os péptidos lineares contendo resíduos Cyc (Acm) foram ciclizados em resina utilizando 1,2 equivalentes de trifluoroacetato de tálio em DMF/anisole (19:1) à temperatura ambiente durante 3 h. Para sintetizar o péptido azido 17, o grupo de proteção Mmt da cadeia lateral das Lys C-terminais do derivado do péptido 17 foi removido utilizando 1% de TFA em DCM com 5% de DICAS. Em seguida, o ácido 2-azidoacetico foi acoplado à cadeia lateral usando PyBOP/HOAt/ DIPEA em NMP. O péptido 17-ABM foi sintetizado de maneira semelhante. Para sintetizar Alquileno-ABP, o ácido propiólico foi acoplado ao N-terminal de ABP usando DIC/HOAt em NMP/DCM (1:1). A resina foi cuidadosamente lavada com DCM, DCM/éter dietílico (1: 1) e seca sob alto vácuo durante 4 h antes de os péptidos serem clivados numa mistura de 95% de TFA, 2,5% de água e 2,5% de DICAS durante 2 h. Após evaporação do TFA sob vácuo, os péptidos foram precipitados e lavados três vezes com 30 mL de éter dietílico frio por lavagem. 0 líquido foi separado do sólido por centrifugação e decantado. Os péptidos em bruto foram secos no ar e dissolvidos em acetonitrilo e 0,1% de TFA em água (1:3) para purificação por HPLC.
Cicatrização de azida-alquimia Huisgen mediada por cobre (I) pela síntese do péptido 17-ABP. 50 mg (22 pmol) de cada az ida purificada e péptido alcino foi dissolvido em 5 mL de t-BUOH/H2O (2:1) . Adicionou-se 10 equiv (220 pmol) de TEA para tornar a solução básica. Em seguida, a 5% (1,1 mol) de CuSCM, 25% de ácido ascórbico de sódio, e 1% de TBTA foi adicionado à mistura. A mistura foi agitada durante a noite, monitorizada por HPLC-MS. Foi então concentrado sob vácuo e purificado por HPLC de fase reversa.
Purificação de péptidos. Os péptidos foram injetados numa coluna de RP-HPLC preparativa (Xbridge™ BEH130 Prep Cie 5um 19x150mm, PN # 186003945, Waters, Milford, MA) e eluiram-se com um gradiente linear de 15-50% de acetonitrilo em 0,1% de TFA ao longo de 15 min a uma taxa de fluxo de 20 mL/min. As frações contendo os produtos desejados foram recolhidas baseD em massa e liofilizadas. Os péptidos purificados foram > 95% puros como determinado por RP-HPLC analítica (Xbridge™ BEH130 C18 5um, 4,6x150 mm, PN # 186003580, Waters, Milford, MA) . A massa de cada péptido foi confirmada usando os instrumentos MX MALDI da Waters ou SYNAPT HDMS.
Inibição da ativação do complemento. A capacidade dos análogos de compstatina para inibir a ativação da via clássica do complemento foi avaliada por ELISA como descrito no Exemplo 1. Cada conjugado foi ensaiado pelo menos três vezes.
Análise SPR.A cinética da interação entre C3b e cada análogo de compstatina foi analisada por SPR em um instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare Corp., Piscataway, NJ) a 25°C usando ΡΒΞ-Τ (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 150 mM, 0,005% Tween-20, pH 7,4) como o tampão de corrida, como descrito no Exemplo 1. Em resumo, o C3b biotinilado (30 pg/ml) foi imobilizado num chip de sensor revestido com estreptavidina e uma série de diluição em série dupla (1 μΜ-500 pM) de cada análogo foi injetado durante 2 min a 30 μΐ/min, com uma fase de dissociação de 5-10 min. O péptido 17 (não conjugado) foi incluído em cada série experimental como controle interno e referência. A análise de dados foi realizada usando Scrubber (BioLogic Software, Campbell, Austrália). Os sinais de uma célula de fluxo não tratada e um conjunto de injeções de buffer em branco foram subtraídos para corrigir os efeitos do buffer e os artefactos da injeção. Os dados do biossensor processado foram globalmente adaptados a um modelo de ligação de Langmuir 1:1 e a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada a partir da equação Kd = ka/ka. As soluções de péptido foram injetadas em duplicado em cada experiência, e cada teste de rastreio foi realizado pelo menos duas vezes.
Extração de análogos de compstatina de amostras de plasma pela SPE. Uma placa de 96 poços HLB Oasis 10 mg (Waters, Milford, MA) foi empregada para extração. 0 material SPE foi condicionado pela adição de 500 μΐ de metanol seguido por adição de 500 pL de água mili-Q. A amostra foi preparada por adição do padrão interno seguido de diluição 1:1 com 4% de H3PO4. Após o carregamento da amostra, lavou-se com 500 pL de metanol a 5% em ácido fórmico a 0,1%. A amostra foi eluída com 150 pL de metanol a 65% em ácido fórmico a 0,1% e recolhida na placa de recolha. O solvente foi evaporado até à secura num concentrador de velocidade e reconstituído em 5% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%. As amostras foram mantidas a -20°C até a análise.
Isolamento do péptido 17-ABP e péptido 17-ABM a partir de amostras de plasma por digestão. As amostras de plasma Baboon, 40 pL, foram misturadas com padrão interno e dissolvidas 1:1 com tampão de carbonato de amónio 40 mM. O detergente mais rápido foi adicionado a uma concentração final de 0,1%. As pontes de dissulfureto foram reduzidas em DTT 5 mM durante 30 min a 60°C. A alquilação de cisteínas foi feita por adição de iodoacetamida até uma concentração final de 15 mM e incubação durante 30 min em escuro. A amostra foi digerida enzimaticamente por adição de 16 pL de uma solução de tripsina 1 pg/pL e incubação durante a noite a 37°C. Depois disso, o pH da amostra foi reduzido com 5% de TFA para induzir a degradação do detergente. Para evitar a adsorção inespecífica de péptidos muito hidrofóbicos, adicionou-se acetonitrilo a 20%. As amostras foram centrifugadas a 6°C e 14000 rpm durante 30 min e o sobrenadante foi diluído com 0,1% de ácido fórmico para reduzir a concentração de acetonitrilo a 10% antes da filtração com um filtro microcon centrífugo de corte de 10 kDa (Millipore, Billerica, MA). O filtro foi lavado com 50 pL de 10% de ACN em 0,1% de ácido fórmico e a amostra recolhida foi evaporada até à secura e reconstituída com 10% de ACN em 0,1% de ácido fórmico.
Análise LC-MS/MS. A análise LC-MS/MS foi realizada em um SYNAPT HDMS (Waters, Milford, MA), controlado pelo software MassLynx 4.1 (Waters) e equipado com uma fonte nanoESI. Cada amostra foi injetada em triplicado. Foi utilizado um sistema nano ACQUITY UPLC (Waters) para separação de péptidos por cromatografia líquida de fase reversa. Após a injeção, os analitos foram presos durante 3 minutos com 3% de fase móvel A (0,1% de ácido fórmico em água) a 5 μΐ/min em 5 pm de simetria C íscoluna (180 pm x 20 mm, Waters) e mais separada em uma coluna 1,1 pm BEH130 C18 (75 pm x 150 mm, Waters). A temperatura da coluna analítica foi mantida a 35°C. Os péptidos foram separados à taxa de fluxo 0,3 3 pl/min. 0 gradiente foi linear 3-40% B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo) , 50 minutos de duração, ou 60 min para as amostras digeridas. A tensão capilar era de 3,2 kV, a tensão do cone era de 35 V e a temperatura da fonte era de 100 ° C. [Glul] - péptido de fibrinogénio foi usado para a correção de bloqueio-massa com uma taxa de amostragem de 30 s. Os espectros de massa foram adquiridos em modo positivo em uma faixa m/z 400-2000 Da à taxa de varredura 0,6 s. A janela de tempo usada para a função MS/MS foi ± 3 min do tempo de retenção do péptido selecionado. A presença do analito foi confirmada pelo MS/MS.
Retenção in vivo. Foram utilizados babuínos juvenis (F. AnubiSr Baboon Research Resources, Universidade de Oklahoma) com peso de 5-8 kg. Foram utilizados três babuínos para o estudo; um para cada composto. Todos os animais receberam uma dose em bolus de péptidos (10 mg) por injeção através da veia periférica. As amostras de sangue para o ensaio LC-MS/ MS foram recolhidas em tubérculos plásticos de 1 ml contendo 50 pg de lepirudina e centrifugadas a 2000 g durante 20 min a 4°C para a separação do plasma. As amostras de plasma foram armazenadas a -7Q°C. As amostras de sangue foram recolhidas a 20, 40, 60 90, 120 min após a injeção do péptido 17; e 1 min, 30 min, depois 1, 6, 24 e 48 horas após a injeção do péptido 17-ABP e do péptido 17-ABM. R&sultados: Síntese do péptido 17-ABM. 0 péptido 17-ABM foi obtido após síntese de péptido em fase sólida e purificação por HPEC, conforme resumido no esquema de reação abaixo. 0 péptido linear foi sintetizado com um único acoplamento de cada aminoácido. Tanto o trifluoroacetato de tálio como o iodo foram avaliados quanto à formação da ligação dissulfureto. O primeiro produziu reações mais limpas e, posteriormente, utilizado para todas as ciclizações. A massa do péptido 17-ABM foi confirmada por HPLC-MS e ESI-TOP { [MH]2+ calc. 1211.06, encontrado 1211.05).
Síxitese do péptido 17-ABP. Na solução, adicionou-se a cicloadição de azida-alquimia Huisgen para a conjugação, de acordo com o esquema de reação abaixo. O ácido 2-azidoacetico foi sintetizado a partir de ácido 2-bromoacético e azida de sódio. Foi então acoplado à cadeia lateral L-terminal C após a formação da ligação dissulfureto na resina. Qs intermediários 2 e 3 foram obtidos em 12,7% e 12,3% de rendimento, respetivamente, após clivagem e purificação por HPIiG:,
Foram comparados três sistemas de solventes diferentes para a cicloadição Azide-Alkne Huisgen. 0 melhor resultado foi observado com o sistema t/H-BuOJHsO, seguido pelo sistema ACN/ H^O. Nenhum produto foi observado quando EMF sozinho foi usado como solvente. A importância da base terciária também foi avaliada. Nenhum produto foi detetado após 2 h sem adição de excesso de TEA. Em condições otimizadas, a reação foi limpa e o péptido 17-ABP foi isolado com 50% de rendimento após purificação por HPLC. A massa do produto foi ainda confirmada por ESI-TOF ([MH]4+ calc. 1131.78, encontrado 1131.52).
Inibição da ativação do complemento. A capacidade do péptido 17-ABM e do péptido 17-ABP para inibir a ativação do complemento da via clássica foi avaliada por ELISA, utilizando soro humano. Os resultados são mostrados na Tabela 2-1.
Tabela 2-1. Resultados das análises ELISA e SPR dos conjugados do péptido 17 e ABP ou ABM
Concentração plasmática em babuínos. As concentrações plasmáticas do péptido 17 e os conjugados ABP e ABM foram determinados usando LC-MS/MS após uma injeção intravenosa de bolus em babuínos. 0 péptido 17 mostrou uma meia-vida de cerca de 60 min. 0 péptido 17-ABM apresentou uma melhoria de 5 vezes com uma meia-vida de 5 h. A maior semivida de 21 h foi observada para o péptido 17-ABP, que era 21 vezes maior do que o peptídeo não conjugado 17.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <1 10» TíiísíMsâf lhe- Udiversity gí Pérsnsyfea«ià Lôtnbns. -John D. Qu. HooQchar-g f>feip:íí^ie::: Bac-i<feQ;0e.;:Siid';:pvT^eLr^^'iaji-s^àílert <í fe á4í5â2^0S3: (VS126 PCT) <140> t4o£:2et:3s8-g:b«3 «Ml» :201¾¾^ <150» US 61/·; 74.575 <7:S1» 2009-05-07 <150» L?S 61/369.458 <15-i > 2010-03 04 «180 14 <17&amp;0 Patent-n version 3 4 <210> í <211> 1:3:
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Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto que compreende um péptido de compstatina modificado com SEQ ID NO: 1, que é: ICWQDWGHHRCT (C2-C12 ciclico) , no qual o Gly na posição 8 é modificado para restringir a conformação da estrutura do péptido naquele local; em que a estrutura é restringida substituindo Gly por N-metil Gly.
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda a substituição de His na posição 9 com Ala.
  3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, compreendendo ainda a substituição de Vai na posição 4 com Trp, 1-metil Trp ou 1-formil Trp.
  4. 4. Composto de qualquer uma das reivindicações 1-3, compreendendo ainda a substituição de Trp na posição 7 com Trp halogenado.
  5. 5. Composto de qualquer uma das reivindicações 1-4, compreendendo ainda a acetilação do resíduo N-terminal.
  6. 6. Composto de qualquer uma das reivindicações 1-5, compreendendo ainda a substituição do Thr na posição 13 por Ile, Leu, Nle, N-metil Thr ou N-metil Ile.
  7. 7. Análogo de compstatina compreendendo um péptido com SEQ ID NO: 2, que é: Xaal - Cys - Vai - Xaa2 - Gin - Asp -Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (C2 - C12 cíclico) em que Gly na posição 8 é modificado para restringir a conformação da estrutura do péptido naquele local substituindo Gly por N-metil Gly, em que: Xaal é Ile, Vai, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu ou um dipéptido que compreende Gly-Ile; Xaa2 é Trp, Trp halogenado, Trp compreendendo um substituinte alcoxi inferior ou alquilo inferior na posição 5, ou Trp compreendendo um substituinte alquilo inferior ou alcanoilo inferior na posição 1; Xaa3 é Trp ou Trp halogenado; Xaa4 é His, Ala, Phe ou Trp; e Xaa5 é Thr, lie, Leu, Nle, N-metil Thr ou N-metil lie, em que um terminal carboxi -OH de qualquer um dos Thr, lie, Leu, Nle, N-metil Thr ou N-metil lie opcionalmente é substituído por -NH2.
  8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 7, em que Xaal é Ac-Ile, Xaa2 é 1-metil-Trp ou 1-formil-Trp, Xaa3 é Trp, Xaa4 é Ala e Xaa5 é Thr, lie, Leu, Nle, N- metil Thr ou N-metil Ile.
  9. 9. Composto da reivindicação 7 ou reivindicação 8, que compreende qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 7, 8, 9, 10 ou 11.
  10. 10. Composto de qualquer uma das reivindicações anteriores, ligado a um componente adicional que se estende a retenção in vivo do composto.
  11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 10, em que o componente adicional é polietilenoglicol (PEG) ou uma molécula pequena de ligação a albumina.
  12. 12. Composto da reivindicação 10, em que o componente adicional é um péptido de ligação à albumina; opcionalmente possuindo SEQ ID NO: 14, que é: RLIE DICLPRWGCLWE DD.
  13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 12, em que o composto e o péptido de ligação à albumina são separados por um espaçador; opcionalmente, em que o espaçador é uma molécula de polietilenoglicol.
  14. 14. Composição farmacêutica compreendendo o composto de qualquer uma das reivindicações anteriores e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  15. 15. Composto de qualquer uma das reivindicações precedentes para utilização na inibição da ativação do complemento.
  16. 16. Utilização in vitro de um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 14 para a inibição da ativação do complemento.
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