ES2780674T3 - Análogos de compstatina de acción prolongada y composiciones y métodos relacionados - Google Patents

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Abstract

Un análogo de compstatina de acción prolongada que comprende un resto reductor de la eliminación unido con dos restos análogos de compstatina, en donde cada resto análogo de compstatina comprende un péptido cíclico extendido por un residuo de lisina o una secuencia que comprende un residuo de lisina en el extremo N, extremo C o ambos, en donde el residuo de lisina está separado de la parte cíclica del péptido por un espaciador rígido o flexible que comprende un resto de oligo(etilenglicol); el resto reductor de la eliminación comprende un polímero, en donde cada extremo del polímero está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida; y el espaciador comprende ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (AEEAc) o ácido 11-amino-3,6,9-trioxaundecanoico. 2. El análogo de compstatina de acción prolongada de la reivindicación 1, en donde cada resto análogo de compstatina comprende un péptido cíclico extendido por un residuo de lisina o una secuencia que comprende un residuo de lisina en el extremo N, extremo C o ambos, en donde el residuo de lisina está separado de la parte cíclica del péptido por un espaciador rígido o flexible que comprende un resto de oligo(etilenglicol); y el resto reductor de la eliminación comprende un polímero, en donde cada extremo del polímero está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida y en donde el péptido cíclico comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 71, 72, 73 o 74.

Description

DESCRIPCIÓN
Análogos de compstatina de acción prolongada y composiciones y métodos relacionados
Antecedentes de la invención
El complemento es un sistema que consta de más de 30 proteínas plasmáticas y unidas a células que desempeña un papel importante en la inmunidad tanto innata como adaptativa. Las proteínas del sistema del complemento actúan en una serie de cascadas enzimáticas mediante diversas interacciones de proteínas y acontecimientos de escisión. La activación del complemento se produce a través de tres rutas principales: la ruta clásica dependiente de anticuerpos, la ruta alternativa y la ruta de lectina de unión a manosa (MBL). La activación inadecuada o excesiva del complemento es una causa subyacente o un factor que contribuye a varias enfermedades y afecciones graves y en las últimas décadas se ha dedicado un esfuerzo considerable a explorar diversos inhibidores del complemento como agentes terapéuticos. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de enfoques innovadores para inhibir la activación del complemento para diversos fines terapéuticos.
Sumario de la invención
La invención proporciona análogos de compstatina de acción prolongada, composiciones que comprenden análogos de compstatina de acción prolongada y métodos para fabricar análogos de compstatina de acción prolongada como se define en las reivindicaciones. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición de uso farmacéutico que comprende un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención.
La invención proporciona además una composición de uso farmacéutico que comprende un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en la reducción de la sensibilidad de una célula u órgano al daño mediado por el complemento. En algunas realizaciones, dicho uso comprende poner en contacto la célula con un análogo de compstatina reactivo con la célula. La célula puede ser cualquier tipo de célula en diversas realizaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula es una célula sanguínea. En algunas realizaciones, la célula sanguínea es un glóbulo rojo (RBC), también denominado eritrocito. En algunas realizaciones, la célula tiene expresión, densidad superficial y/o actividad anormalmente baja de una o más proteínas reguladoras del complemento. Por ejemplo, la célula puede tener una mutación en un gen que codifica dicha proteína, en donde la mutación da como resultado expresión reducida o ausente y/o actividad reducida de la proteína codificada. La célula puede ser de cualquier tipo o especie animal en diversas realizaciones. Por ejemplo, la célula puede ser de mamífero, p. ej., primate (ser humano o un primate no humano), roedor (p. ej., ratón, rata, conejo), ungulado (p. ej., cerdo, oveja, vaca), canino o felino. En muchas realizaciones, la protección es del complemento de primate, p. ej., complemento humano. En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto ex vivo (fuera del cuerpo de un sujeto). En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto in vivo (en un sujeto, p. ej., un ser humano). En algunas realizaciones, la célula se va a trasplantar a un sujeto o se ha trasplantado a un sujeto. Se desvela en el presente documento una célula aislada que tiene un análogo de compstatina unido covalentemente a la misma. También se desvela un tejido u órgano aislado que tiene un análogo de compstatina unido al menos a algunas de sus células.
La invención proporciona una composición de uso farmacéutico que comprende un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que necesite tratamiento para un trastorno mediado por el complemento. Dicho uso comprende administrar un análogo de compstatina de acción prolongada al sujeto. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada es un análogo de compstatina reactivo con células. En algunas realizaciones, el trastorno mediado por el complemento es la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), el síndrome hemolítico urémico atípico (SHUa) u otro trastorno asociado con la hemólisis mediada por el complemento. En algunas realizaciones, el trastorno es la lesión por isquemia/reperfusión (I/R) (p. ej., debida a infarto de miocardio, ictus tromboembólico o cirugía. En algunas realizaciones, el trastorno es traumatismo. En algunas realizaciones, el trastorno es el rechazo de trasplante. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno respiratorio crónico, p. ej., asma o EPOC.
La práctica de determinados aspectos descritos en el presente documento puede emplear técnicas convencionales de biología molecular, cultivo celular, tecnología de ácidos nucleicos recombinantes (p. ej., ADN), inmunología y/o síntesis de ácido nucleico y polipéptidos, detección, manipulación y cuantificación, etc., que están dentro de la experiencia habitual de la técnica. Véase, p. ej., Ausubel, F., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science y Current Protocols in Cell Biology, todos John Wiley & Sons, N.Y., p. ej., edición vigente en enero de 2010 o posterior; Sambrook, Russell y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001 o 4a ed., 2012.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que muestra el porcentaje de actividad inhibidora de la activación del complemento del análogo de compstatina CA28 (SEQ ID NO: 28) y tres análogos de compstatina de acción prolongada (CA28-1, CA28-2, CA28-3), en función de la concentración de péptidos (pM). Se probó la inhibición de la activación del complemento in vitro usando un ensayo clásico de inhibición del complemento. El diagrama muestra los valores obtenidos promediando los resultados de dos conjuntos de mediciones. CA28 (círculos; rojo), CA28-1 (cruces (x); azul); CA28-2 (triángulos, verde), CA28-3 (cuadrados, morado).
La figura 2 es un diagrama que muestra el porcentaje de actividad inhibidora de la activación del complemento de CA28 y los análogos de compstatina de acción prolongada CA28-2 y CA28-3, en función de la concentración del compuesto (|jM). CA28 (cuadrados, gris claro), CA28-2 (rombos, negro), CA28-3 (círculos, gris oscuro). CA28-3 es un compuesto que contiene múltiples restos peptídicos. Aunque la actividad por resto peptídico es menor que la actividad de una molécula de CA28 individual, la actividad total de CA28-3 supera la actividad de CA28 en molaridad.
La figura 3 es un diagrama que muestra las concentraciones en plasma frente al tiempo de CA28 y los análogos de compstatina de acción prolongada CA28-2 y CA28-3 en monos cinomolgos después de una única inyección intravenosa. CA28 se administró a 200 mg/kg. CA28-2 y CA28-3 se administraron cada uno a 50 mg/kg. Al calcular las dosis para estos experimentos, se supuso que la sustancia administrada de CA28-2 y CA28-3 consistía en 80 % del compuesto activo p/p en función del peso seco. Sin embargo, durante el análisis de la muestra, la curva patrón supuso un 100 % del compuesto activo p/p en función del peso seco, en una estimación del 30 %. Por tanto, los valores para Cmáx sobreestiman la Cmáx real. CA28 (cuadrados, gris claro), CA28-2 (triángulos, negro), CA28-3 (círculos, gris oscuro).
La figura 4 es un diagrama que muestra el porcentaje de actividad inhibidora de la activación del complemento de CA28 y los análogos de compstatina de acción prolongada CA28-4, en función de la concentración del compuesto (j M). Se probó la inhibición de la activación del complemento in vitro usando un ensayo clásico de inhibición del complemento. El diagrama muestra los valores obtenidos promediando los resultados de cuatro conjuntos de mediciones para CA28-4. CA28 (cuadrados, gris claro), CA28-4 (cruces, negro).
La figura 5 es un gráfico que muestra las concentraciones frente al tiempo de CA28 y los análogos de compstatina de acción prolongada CA28-2, CA28-3 y CA28-4 en monos cinomolgos después de una única inyección intravenosa. CA28 se administró a 200 mg/kg. CA28-2, CA28-3 y CA28-4 se administraron cada uno a 50 mg/kg. Al calcular las dosis para estos experimentos, se supuso que la sustancia administrada de CA28-2 y CA28-3 consistía en 80 % del compuesto activo p/p en función del peso seco. Sin embargo, durante el análisis de la muestra, la curva patrón supuso un 100 % del compuesto activo p/p en función del peso seco. Por tanto, los valores para la Cmáx sobreestiman la Cmáx que se alcanzaría si estos compuestos se hubieran administrado a las dosis indicadas en masa seca, en una estimación del 30 %. CA28 (cuadrados, gris claro), CA28-2 (triángulos, negro), CA28-3 (círculos, gris oscuro), CA28-4 (triángulos invertidos, negro).
La figura 6 es un cromatograma representativo que muestra la detección ultravioleta (UV) de un análogo de compstatina de acción prolongada basado en PEG usando HPLC de fase inversa. El pico con un tiempo de retención (TR) de 33,68 minutos representa el análogo de compstatina PEGilado y tenía un área relativa del 96 %. La figura 7 es un diagrama que muestra el porcentaje de actividad inhibidora de la activación del complemento de CA28 y los análogos de compstatina de acción prolongada, en función de la concentración del compuesto (j M). CA28-2CS (rombos, rojo); CA28-2GS (cruces, azul); CA28-2HS (triángulos, verde); CA28-2TS (cuadrados, negro). La figura 8 es un diagrama que muestra el porcentaje de actividad inhibidora de la activación del complemento de CA28 y el análogo de compstatina de acción prolongada bifuncionalizado, CA28-2GS-BF, en función de la concentración del compuesto (micromoles). CA28 (círculos vacíos, azul); CA28-2G-SBF (círculos rellenos, rojo) La figura 9 es un diagrama que muestra la concentración en plasma frente al tiempo de CA28 y el análogo de compstatina de acción prolongada CA28-2GS-BF en monos cinomolgos después de una única inyección intravenosa (CA28 (cuadrados, rojo) y CA28-2GS-BF (círculos, morado) o cuando se administran mediante inyección subcutánea una vez al día durante 7 días (solo CA28-2GS-BF, asteriscos, azul). Se administró CA28-2GSBF a 25 mg/ml. El volumen de dosificación fue de 2 ml/kg para IV y 0,28 ml/kg/día para la administración subcutánea. Los datos para CA28 fueron de un experimento diferente en el que el compuesto también estaba en dextrosa al 5 % y se formuló como 20 mg/ml con un volumen de dosificación de 10 ml/kg. El vehículo en cada caso fue dextrosa al 5 % en agua.
Las figuras 10(A) y 10(B) presentan diagramas que muestran el porcentaje de actividad inhibidora de la activación del complemento de c A28 y el análogo de compstatina de acción prolongada bifuncionalizado, CA28-2TS-BF, en función de la concentración del compuesto (micromoles). (A) Inhibición de la ruta clásica por CA28 (círculos, rojo) y CA28-2TS-BF (cruces, azul). (B) Inhibición de rutas alternativas. CA28 (círculos, rojo) y CA28-2TS-BF (cruces, azul).
La figura 10(C) (suponiendo un resto de PEG de 40 kD) muestra la estructura de CA28-2TS-BF.
La figura 11 es un diagrama que muestra la concentración en plasma frente al tiempo de CA28 y el análogo de compstatina de acción prolongada CA28-2TS-BF en monos cinomolgos después de una única inyección intravenosa de CA28 a 200 mg/kg (cuadrados, rojo), una única inyección intravenosa de CA28-2TS-BF a 7 mg/kg (asteriscos, morado), inyección subcutánea de CA28-2TS-BF a 7 mg/kg una sola vez (círculos, azul) o inyección subcutánea de CA28-2TS-BF a 7 mg/kg una vez al día durante 7 días consecutivos (triángulos invertidos, verde). El vehículo en cada caso fue dextrosa al 5 % en agua.
La figura 12 muestra el análisis de citometría de flujo del depósito de C3 en glóbulos rojos de un paciente con HPN, que se expusieron al complemento activado en una prueba de Ham modificada. (A) Se muestran los resultados de un experimento de dilución que demuestra el efecto de CA28 sobre el depósito de C3. (B) Se muestran los resultados de un experimento de dilución que demuestra el efecto de CA28-2GS-BF sobre el depósito de C3. Las concentraciones de compuesto usadas se muestran en y encima de cada panel.
La figura 13 muestra el análisis de citometría de flujo del depósito de C3 en glóbulos rojos de un paciente con HPN, que se expusieron al complemento activado en una prueba de Ham modificada en ausencia de inhibidores del complemento (panel izquierdo), en presencia del anticuerpo monoclonal anti-C5 eculizumab (panel central) y en presencia de CA28-2GS-BF (panel derecho).
Descripción detallada de determinadas realizaciones de la invención
I. Definiciones
Las expresiones "aproximadamente" o "alrededor de" en referencia a un número incluyen en general números que se encuentran dentro de ± 10 %, en algunas realizaciones ± 5 %, en algunas realizaciones ± 1 %, en algunas realizaciones ± 0,5 % del número salvo que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo por el contexto (excepto cuando dicho número superara de manera inadmisible el 100 % de un valor posible).
Un "componente del complemento" o "proteína del complemento" es una proteína que está implicada en la activación del sistema del complemento o participa en una o más actividades mediadas por el complemento. Los componentes de la ruta del complemento clásica incluyen, p. ej., C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, c7, C8, C9 y el complejo C5b-9, también denominado complejo de ataque a la membrana (MAC) y fragmentos activos o productos de escisión enzimática de cualquiera de los anteriores (p. ej., C3a, C3b, C4a, C4b, C5a, etc.). Los componentes de la ruta alternativa incluyen, p. ej., factores B, D y properdina. Los componentes de la ruta de lectina incluyen, p. ej., MBL2, MASP-1 y MASP-2. Los componentes del complemento también incluyen receptores unidos a células para componentes del complemento solubles, en donde dicho receptor media en una o más actividades biológicas de dicho componente del complemento soluble después de la unión del componente del complemento soluble. Dichos receptores incluyen, p. ej., receptor de C5a (C5aR), receptor de C3a (C3aR), receptor del complemento 1 (CR1), receptor del complemento 2 (CR2), receptor del complemento 3 (CR3, también conocido como CD45), etc. Se apreciará que no se pretende que la expresión "componente del complemento" incluya las moléculas y estructuras moleculares que actúan como "desencadenantes" para la activación del complemento, p. ej., complejos de antígenoanticuerpo, estructuras extrañas halladas en superficies microbianas o artificiales, etc.
Un "trastorno mediado por el complemento" es cualquier trastorno en el que se sabe o se sospecha que la activación del complemento es un factor contribuyente y/o al menos parcialmente causante en al menos algunos sujetos que padecen el trastorno, p. ej., trastornos en los que la activación del complemento da como resultado daño tisular. Los ejemplos no limitantes de trastornos mediados por el complemento incluyen, pero sin limitación, (i) diversos trastornos caracterizados por hemólisis o anemia hemolítica, tales como el síndrome hemolítico urémico atípico, la enfermedad de las aglutininas frías, la hemoglobinuria paroxística nocturna, reacciones a la transfusión; (ii) el rechazo de trasplante (p. ej., rechazo de trasplante hiperagudo o agudo) o disfunción del trasplante; (iii) trastornos que cursan con lesiones por isquemia/reperfusión, tales como traumatismo, cirugía (p. ej., reparación de aneurismas), infarto de miocardio, ictus isquémico; (iv) trastornos del sistema respiratorio tales como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); (v) artritis, p. ej., artritis reumatoide; (vi) trastornos oculares tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética, glaucoma y uveítis. "T rastorno" se usa indistintamente en el presente documento con "enfermedad", "afección" y palabras similares para hacer referencia a cualquier deterioro de la salud o estado de funcionamiento anómalo de un organismo, p. ej., cualquier estado en el que esté indicado el tratamiento médico y/o quirúrgico o para el que un sujeto busque de manera adecuada atención médica y/o quirúrgica. También debe entenderse que la enumeración de un trastorno particular dentro de una categoría particular es por conveniencia y no se pretende que limite la invención. Se entenderá que determinados trastornos podrían enumerarse adecuadamente en múltiples categorías.
Una "proteína reguladora del complemento" es una proteína implicada en la regulación de la actividad del complemento. Una proteína reguladora del complemento puede regular negativamente la actividad del complemento mediante, p. ej., inhibición de la activación del complemento o mediante inactivación o aceleración de la descomposición de una o más proteínas del complemento activadas. Los ejemplos de proteínas reguladoras del complemento incluyen inhibidor de C1, proteína de unión a C4, clusterina, vitronectina, FHC, factor I y las proteínas unidas a células CD46, CD55, CD59, CR1, CR2 y CR3.
"Aislado", como se usa en el presente documento, significa 1) separado de al menos algunos de los componentes con los que habitualmente está asociado en la naturaleza; 2) preparado o purificado por un proceso que implica la mano del hombre; y/o 3) que no se aparece en la naturaleza, p. ej., presente en un ambiente artificial. En general, salvo que se indique lo contrario o sea claramente evidente, cualquier entidad, producto, agente, composición, etc., puede considerarse "aislado", si se desea.
"Unidos", como se usa en el presente documento con respecto a dos o más restos, significa que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí para formar una estructura molecular que es suficientemente estable para que los restos permanezcan asociados en las condiciones en que se forma el enlace y, preferentemente, en las condiciones en las que se usa la nueva estructura molecular, p. ej., condiciones fisiológicas. Un enlace es preferiblemente un enlace covalente. Un enlace puede ser no covalente. Los restos pueden estar unidos directa o indirectamente. Cuando dos restos están unidos directamente, estos están enlazados covalentemente entre sí o están lo suficientemente cerca para que las fuerzas intermoleculares entre los dos restos mantengan su asociación. Cuando dos restos están unidos indirectamente, cada uno de ellos está unido covalente o no covalentemente con un tercer resto, que mantiene la asociación entre los dos restos. En general, cuando dos restos se denominan unidos por un "resto de unión" o "parte de unión", el enlace entre los dos restos unidos es indirecto y normalmente cada uno de los restos unidos está enlazado covalentemente con el resto de unión. Se pueden unir dos restos usando un "conector". Un conector puede ser cualquier resto adecuado que reaccione con las entidades para unir dentro de un periodo de tiempo razonable, en condiciones compatibles con la estabilidad de las entidades (partes de las cuales pueden protegerse según sea adecuado, dependiendo de las condiciones) y en cantidad suficiente, para producir un rendimiento razonable. Normalmente, el conector contendrá al menos dos grupos funcionales, uno de los cuales reacciona con una primera entidad y el otro de los cuales reacciona con una segunda entidad. Se apreciará que, después de que el conector haya reaccionado con las entidades para unir, el término "conector" puede referirse a la parte de la estructura resultante que se originó a partir del conector o al menos la parte que no incluye los grupos funcionales que han reaccionado. Un resto de unión puede comprender una parte que no participa en un enlace con las entidades que se unen y cuyo fin principal puede ser separar espacialmente las entidades entre sí. Dicha parte puede denominarse "espaciador".
Como se usa en el presente documento, "condiciones fisiológicas" se refiere a un conjunto de condiciones tales como temperatura, concentración de sal y pH que al menos en parte imitan la condiciones que se encuentran normalmente en un sujeto vivo, p. ej., un sujeto mamífero. En algunos aspectos, las condiciones fisiológicas se refieren a condiciones en un medio acuoso, p. ej., un medio que comprende al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 97 %, 99 % o aproximadamente 100 % de agua en volumen/volumen. Otros líquidos, si están presentes, normalmente no afectan sustancialmente a la estructura secundaria o terciaria de la proteína. Habitualmente, las condiciones fisiológicas imitan al menos en parte las halladas en un líquido corporal tal como sangre o líquido extracelular, p. ej., líquido intersticial, p. ej., de un sujeto mamífero. Se conocen en la técnica diversas condiciones fisiológicas útiles para, p. ej., ensayos in vitro. En general, un medio en condiciones fisiológicas contiene una concentración fisiológica de sal, p. ej., cloruro de sodio. Una concentración fisiológica de sal se refiere normalmente a una concentración que varía de aproximadamente 250 mOsm/l a aproximadamente 350 mOsm/l, p. ej., de aproximadamente 275 mOsm/l a aproximadamente 325 mOsm/l, p. ej., aproximadamente 300 mOsm/l. Normalmente, las condiciones fisiológicas son aproximadamente isotónicas para un líquido corporal, p. ej., sangre o líquido extracelular, p. ej., líquido intersticial. Normalmente, las condiciones fisiológicas incluyen un pH que varía de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,8, p. ej., de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5. Normalmente, un medio fisiológico comprende una sustancia tamponante que ayuda a mantener el pH del medio dentro de un intervalo fisiológico. Normalmente, las condiciones fisiológicas comprenden condiciones tales que una proteína habitual de mamífero, p. ej., una proteína normalmente hallada en un líquido corporal, tal como sangre o líquido extracelular, conserva sustancialmente la estructura secundaria y, si procede, terciaria que dicha proteína tiene en el líquido corporal en el que normalmente se encuentra. Normalmente, los componentes de un medio fisiológico sustancialmente no son tóxicos para las células de mamífero a la concentración a la que están presentes en el medio fisiológico. Se enumeran diversos medios fisiológicos (en ocasiones, denominados "tampones") en diversas referencias convencionales, tales como las citadas anteriormente (p. ej., Sambrook, et al., Protocols series). Normalmente, una temperatura fisiológica varía de aproximadamente 25 grados C a aproximadamente 38 grados C, p. ej., de aproximadamente 30 grados C a aproximadamente 37 grados C, p. ej., de 35 grados C a 37 grados C.
"Polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de aminoácidos, incluyendo opcionalmente uno o más análogos de aminoácidos. Una proteína es una molécula compuesta por uno o más polipéptidos. Un péptido es un polipéptido relativamente corto, normalmente de entre aproximadamente 2 y 60 aminoácidos de longitud, p. ej., entre 8 y 40 aminoácidos de longitud. Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" pueden usarse indistintamente. Los polipéptidos usados en el presente documento pueden contener aminoácidos tales como los que se encuentran de manera natural en proteínas, aminoácidos que no se encuentran de manera natural en proteínas y/o análogos de aminoácidos que no son aminoácidos. Como se usa en el presente documento, un "análogo" de un aminoácido puede ser un aminoácido diferente que se asemeja estructuralmente al aminoácido o un compuesto distinto de un aminoácido que se asemeja estructuralmente al aminoácido. Se conoce una gran cantidad de análogos reconocidos en la técnica de los 20 aminoácidos hallados habitualmente en las proteínas (los aminoácidos "convencionales"). Uno o más de los aminoácidos en un polipéptido pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo hidrato de carbono, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un conector para conjugación, funcionalización u otra modificación, etc. Determinados análogos y modificaciones adecuados no limitantes se describen en el documento WO2004026328 y/o a continuación. El polipéptido puede estar acetilado, p. ej., en el extremo N, y/o amidado, p. ej., en el extremo C.
La expresión "purificado", como se usa en el presente documento, se refiere a sustancias que se han separado de al menos algunos o la mayoría de los componentes con los que están asociados en la naturaleza o cuando se generaron originalmente o con los que se asociaron antes de la purificación. En general, dicha purificación implica la acción de la mano del hombre. Los agentes purificados pueden ser parcialmente purificados, sustancialmente purificados o puros. Dichos agentes pueden ser, por ejemplo, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de 99 % puros. Un ácido nucleico, polipéptido o molécula pequeña puede purificarse de manera que constituya al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, del material total de ácido nucleico, polipéptido o molécula pequeña, respectivamente, presente en una preparación. Una sustancia orgánica, p. ej., un ácido nucleico, polipéptido o molécula pequeña, puede purificarse de manera que constituya al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, del material orgánico total presente en una preparación. La pureza puede basarse en, p. ej., el peso seco, el tamaño de los picos en un trazado de cromatografía (GC, HPLC, etc.), la abundancia molecular, métodos electroforéticos, la intensidad de las bandas en un gel, los datos espectroscópicos (p. ej., RMN), el análisis elemental, la secuenciación de alto rendimiento, la espectrometría de masas o cualquier método de cuantificación aceptado en la técnica. Pueden estar opcionalmente presentes en una preparación purificada agua, sustancias tamponantes, iones y/o moléculas pequeñas (p. ej., precursores sintéticos tales como nucleótidos o aminoácidos). Se puede preparar un agente purificado separándolo de otras sustancias (p. ej., otros materiales celulares) o produciéndolo de tal manera para lograr el grado deseado de pureza. Normalmente, "parcialmente purificado" con respecto a una molécula producida por una célula significa que una molécula producida por una célula ya no está presente dentro de la célula, p. ej., la célula se ha lisado y, opcionalmente, al menos parte del material celular (p. ej., pared celular, membrana(s) celular(es), orgánulo(s) celular(es)) se ha eliminado y/o la molécula se ha separado o segregado de al menos algunas moléculas del mismo tipo (proteína, ARN, ADN, etc.) que estaban presentes en el lisado.
"Células hospedadoras recombinantes", "células hospedadoras" y otras expresiones similares, denotan células procariotas o eucariotas o líneas celulares que contienen un ácido nucleico exógeno (normalmente ADN) tal como un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés. Se entenderá que dichas expresiones incluyen los descendientes de la(s) célula(s) original(es) en la(s) que se ha introducido el vector u otro ácido nucleico. Las células hospedadoras adecuadas incluyen cualquiera de las que se usan habitualmente en la técnica para expresar polinucleótidos (p. ej., con el fin de producir polipéptido(s) codificado(s) por dichos polinucleótidos) incluyendo, por ejemplo, procariotas, tales como E. coli u otras bacterias tales como especies de Escherichia; Lactobacillus, Bacillus (p. ej., B. subtilis), Salmonella, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, etc; y eucariotas, incluyendo, por ejemplo, hongos, tales como levadura (p. ej., Pichia (p. ej., Pichia pastoris), Kluyveromyces, tal como K. lactis, Hansenula, p. ej., H. polymorpha). Son ejemplos de otras células fúngicas las células de hongos filamentosos, p. ej., Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. o Trichoderma spp., p. ej., cepas de A. oryzae, A. nidulans o A. niger, células de insecto (p. ej., Sf9), células vegetales y células animales, p. ej., células de mamífero tales como CHO, R1.1, B-W, L-M, células renales de mono verde africano (p. ej., COS-1, COS-7, BSC-1, BSC-40 y BMT-10) y células humanas cultivadas. También se incluyen células modificadas genéticamente en plantas o animales modificados genéticamente (p. ej., transgénicos), en donde un polipéptido recombinante es producido por al menos algunas de dichas células. Un polipéptido se puede secretar en la leche, recoger de material vegetal, etc. El ácido nucleico exógeno puede mantenerse de manera estable como un episoma, tal como un plásmido, o puede integrarse al menos en parte en el genoma de la célula hospedadora, opcionalmente después de copiarse o transcribirse de manera inversa. Expresiones tales como "células hospedadoras", etc., también se usan para hacer referencia a células o líneas celulares que pueden usarse como receptores para un ácido nucleico exógeno, antes de la introducción del ácido nucleico. Un "polinucleótido recombinante" en general es un polinucleótido que contiene secuencias de ácido nucleico que no se encuentran unidas directamente entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico pueden aparecer en diferentes genes o diferentes especies o una o más de las secuencias pueden ser una variante de una secuencia de origen natural o pueden ser al menos en parte una secuencia artificial que no es homóloga de una secuencia de origen natural. Un "polipéptido recombinante" es en general un polipéptido que se produce al menos en parte mediante transcripción y traducción de un ácido nucleico exógeno por una célula hospedadora recombinante o por un sistema de expresión in vitro sin células y/o que contiene secuencias de aminoácidos que no se encuentran unidas directamente entre sí en la naturaleza. En este último caso, el polipéptido recombinante puede denominarse "polipéptido quimérico". Las secuencias de aminoácidos en un polipéptido quimérico pueden, por ejemplo, aparecer en diferentes genes o en diferentes especies o una o más de las secuencias pueden ser una variante de una secuencia de origen natural o pueden ser al menos en parte una secuencia artificial que no es idéntica o no es homóloga de una secuencia de origen natural sobre una parte sustancial de la longitud. Se entenderá que un polipéptido quimérico puede comprender dos o más polipéptidos. Por ejemplo, el primer y el segundo polipéptidos A y B de un polipéptido quimérico pueden estar unidos directamente (A-B o B-A) o pueden estar separados por una tercera parte polipeptídica C (A-C-B o B-C-A). Normalmente, la parte C representa un conector polipeptídico que puede, por ejemplo, comprender múltiples residuos de glicina y/o serina o cualquiera de otros aminoácidos diversos. Dos o más polipéptidos pueden estar unidos por un conector o conectores no polipeptídicos. "Recombinante", como se usa en el presente documento, abarca polipéptidos producidos mediante unión (p. ej., conjugación química, conjugación enzimática), de polipéptidos recombinantes más cortos que pueden producirse en células hospedadoras recombinantes. Un polipéptido recombinante puede comprender una secuencia señal que dirige la secreción del polipéptido o una secuencia que dirige el polipéptido expresado a un compartimento u orgánulo específico. Se conocen en la técnica secuencias adecuadas. Pueden seleccionarse secuencias adecuadas para un tipo de célula hospedadora de interés (p. ej., bacteriana, fúngica, de mamífero, vegetal, etc.). Una secuencia señal puede estar ubicada en o cerca (p. ej., a una distancia de hasta 10-50 aminoácidos) del extremo N o el extremo C. Normalmente, un polipéptido comprende un marcador. Un marcador puede ser útil para facilitar la detección y/o purificación de una proteína que lo contiene. Los ejemplos de marcadores incluyen marcador de polihistidina (p. ej., marcador de His 6X), glutatión-S-transferasa, proteína de unión a maltosa, marcador de NUS, marcador de SNUt , marcador de estrep, marcadores epitópicos tales como V5, HA, Myc o FLAG. Un sitio de escisión de proteasa puede estar ubicado en la región entre el marcador y el polipéptido, permitiendo que el polipéptido se separe del marcador por exposición a la proteasa. Un polinucleótido que codifica un polipéptido recombinante puede tener codones al menos en parte optimizados para expresión en una célula hospedadora de interés (p. ej., bacteriana, fúngica, de mamífero, vegetal, etc.). Un marcador puede estar ubicado en o cerca (p. ej., a una distancia de hasta 10-50 aminoácidos) del extremo N o C de un polipéptido. Un polipéptido recombinante se puede aislar, purificar, etc., usando cualquiera de diversos métodos.
Véase, p. ej., Sambrook, serie Protocols, u otras referencias convencionales. Los métodos de uso pueden incluir, p. ej., diálisis (p. ej., usando membranas que tienen un tamaño de poro definido), cromatografía, precipitación, purificación en gel o métodos basados en afinidad que pueden utilizar un marcador o un reactivo de unión específico, tal como un anticuerpo.
"Grupos funcionales reactivos" como se usa en el presente documento se refiere a grupos que incluyen, pero sin limitación, olefinas, acetilenos, alcoholes, fenoles, éteres, óxidos, haluros, aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, cianatos, isocianatos, tiocianatos, isotiocianatos, aminas, hidracinas, hidrazonas, hidracidas, diazo, diazonio, nitro, nitrilos, mercaptanos, sulfuros, disulfuros, sulfóxidos, sulfonas, ácidos sulfónicos, ácidos sulfínicos, acetales, cetales, anhídridos, sulfatos, isonitrilos de ácidos sulfénicos, amidinas, imidas, imidatos, nitronas, hidroxilaminas, oximas, ácidos hidroxámicos, ácidos tiohidroxámicos, alenos, ortoésteres, sulfitos, enaminas, inaminas, ureas, pseudoureas, semicarbacidas, carbodiimidas, carbamatos, iminas, acidas, compuestos azoicos, compuestos azoxi y compuestos nitrosos, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas, sulfhidrilos y similares. Los métodos para preparar cada uno de estos grupos funcionales son bien conocidos en la técnica y su aplicación o modificación para un fin particular está dentro de la capacidad de un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sandler y Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989 y Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, 2a ed., Academic Press, San Diego, 2008).
"Unión específica" se refiere en general a una asociación física entre un polipéptido diana (o, de manera más general, una molécula diana) y una molécula de unión tal como un anticuerpo o ligando. La asociación depende normalmente de la presencia de una característica estructural particular de la diana, tal como un determinante antigénico, epítopo, bolsillo de unión o hendidura, reconocido por la molécula de unión. Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítopo A, la presencia de un polipéptido que contiene el epítopo A o la presencia de A libre sin marcar en una reacción que contiene tanto A libre marcado como la molécula de unión que se une con el mismo, reducirá la cantidad de A marcado que se une con la molécula de unión. Debe entenderse que no es necesario que la especificidad sea absoluta, sino que en general se refiere al contexto en el que se produce la unión. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que numerosos anticuerpos reaccionan de forma cruzada con otros epítopos además de los presentes en la molécula diana. Dicha reactividad cruzada puede ser aceptable dependiendo de la aplicación para la que se vaya a usar el anticuerpo. Un experto habitual en la materia podrá seleccionar anticuerpos o ligandos que tengan un grado de especificidad suficiente para funcionar adecuadamente en cualquier aplicación dada (p. ej., para la detección de una molécula diana, para fines terapéuticos, etc.). También debe entenderse que la especificidad puede evaluarse en el contexto de factores adicionales tales como la afinidad de la molécula de unión por la diana frente a la afinidad de la molécula de unión por otras dianas, p. ej., competidores. Si una molécula de unión presenta una alta afinidad por una molécula diana que se desea detectar y baja afinidad por moléculas no diana, el anticuerpo probablemente será un reactivo aceptable. Una vez que se establece la especificidad de una molécula de unión en uno o más contextos, se puede emplear en otros contextos, preferentemente similares, sin reevaluar necesariamente su especificidad. Normalmente, la afinidad (medida por la constante de disociación en equilibrio, Kd) de dos moléculas que presentan unión específica es 10-3 M o menos, p. ej., 10-4 M o menos, p. ej., 10-5 M o menos, p. ej., 10-6 M o menos, 10-7 M o menos, 10-8 M o menos o 10-9 M o menos en las condiciones probadas, p. ej., en condiciones fisiológicas.
Un "sujeto" tratado según la presente invención es normalmente un ser humano, un primate no humano o un animal inferior (p. ej., un ratón o una rata), que expresa o contiene al menos algún componente del complemento de primates (p. ej., humano) C3 y, opcionalmente, uno o más componentes adicionales del complemento de primates. En algunas realizaciones, el sujeto es masculino. En algunas realizaciones, el sujeto es femenino. En algunas realizaciones, el sujeto es un adulto, p. ej., un ser humano de al menos 18 años de edad, p. ej., entre 18 y 100 años de edad. En algunas realizaciones, un sujeto humano tiene al menos 12 años de edad. En algunas realizaciones, un sujeto es un adulto, p. ej., un ser humano de al menos 18 años de edad, p. ej., entre 18 y 100 años de edad. En algunas realizaciones, un sujeto tiene al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 años de edad. En algunas realizaciones, el sujeto es un niño, p. ej., un ser humano de entre 0 y 4 años de edad o entre 5 y 11 años de edad.
"Tratar", como se usa en el presente documento con respecto al tratamiento de un sujeto, se refiere a proporcionar tratamiento, es decir, proporcionar cualquier tipo de tratamiento médico o quirúrgico de un sujeto. El tratamiento se puede proporcionar para neutralizar, aliviar, inhibir la progresión de, prevenir o reducir la probabilidad de una enfermedad, o para neutralizar, aliviar, inhibir o prevenir la progresión de, prevenir o reducir la probabilidad de uno o más síntomas o manifestaciones de una enfermedad. "Prevenir" se refiere a provocar que una enfermedad o síntoma o manifestación de una enfermedad no se produzca durante al menos un periodo de tiempo en al menos algunos individuos. El tratamiento puede incluir la administración de un compuesto o una composición al sujeto después del desarrollo de uno o más síntomas o manifestaciones indicativos de una enfermedad, p. ej., para neutralizar, aliviar, reducir la gravedad de y/o inhibir o prevenir la progresión de la enfermedad y/o neutralizar, aliviar, reducir la gravedad y/o inhibir uno o más síntomas o manifestaciones de la enfermedad. Un compuesto o composición se puede administrar a un sujeto que ha desarrollado una enfermedad, o tiene un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad en relación con un miembro de la población general. Se puede administrar un compuesto o una composición a un sujeto que ha desarrollado una enfermedad y tiene mayor riesgo de desarrollar uno o más síntomas o manifestaciones particulares de la enfermedad o un agravamiento de la enfermedad en relación con otros individuos a los que se ha diagnosticado la enfermedad o en relación con el riesgo habitual o promedio del sujeto para dicho síntoma o manifestación o agravamiento. Por ejemplo, el sujeto puede haber estado expuesto a un "desencadenante" que lo ponga en mayor riesgo (p. ej., riesgo temporalmente mayor) de experimentar un agravamiento. Un compuesto o una composición se puede administrar de manera profiláctica, es decir, antes del desarrollo de cualquier síntoma o manifestación de la enfermedad. Normalmente, en este caso, el sujeto estará en riesgo de desarrollar la enfermedad, p. ej., en relación con un miembro de la población general, opcionalmente coincidente con respecto a edad, sexo y/u otras variables demográficas.
Un "vector" puede ser cualquiera de diversas moléculas de ácido nucleico, virus o partes de los mismos que son capaces de mediar en la entrada, p. ej., transferencia, transporte, etc., de un ácido nucleico de interés entre diferentes ambientes genéticos o en una célula. El ácido nucleico de interés puede unirse con, p. ej., insertarse en, el vector usando, p. ej., restricción y ligamiento. Los vectores incluyen, por ejemplo, plásmidos de ADN o ARN, cósmidos, genomas víricos de origen natural o modificados o partes de los mismos, ácidos nucleicos que se pueden empaquetar en cápsides víricas, mini-cromosomas, cromosomas artificiales, etc. Los vectores plasmídicos normalmente incluyen un origen de replicación (p. ej., para replicación en células procariotas). Un plásmido puede incluir parte o la totalidad de un genoma vírico (p. ej., un promotor vírico, potenciador, señales de procesamiento o empaquetamiento y/o secuencias suficientes para dar lugar a un ácido nucleico que puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora y/o dar lugar a virus infecciosos). Los virus o partes de los mismos que pueden usarse para introducir ácidos nucleicos en las células pueden denominarse vectores víricos. Los vectores víricos incluyen, p. ej., adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus (p. ej., lentivirus, virus vaccinia y otros poxvirus, virus del herpes (p. ej., virus del herpes simple) y otros. Los baculovirus se pueden usar, p. ej., en células de insectos. Se conoce una amplia gama de vectores víricos de plantas e incluyen, p. ej., los basados en o que comprenden el virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco o uno o más elementos genéticos de los mismos (p. ej., promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor). Los vectores víricos pueden contener o no suficiente información genética vírica para la producción de virus infecciosos cuando se introducen en células hospedadoras, es decir, los vectores víricos pueden ser competentes en replicación o defectuosos en replicación. Por ejemplo, cuando falte información suficiente para la producción de virus infeccioso, esta puede ser suministrada por una célula hospedadora o por otro vector introducido en la célula, p. ej., si se desea la producción de virus. Como alternativa, dicha información puede no ser suministrada, p. ej., si no se desea la producción de virus. Un ácido nucleico para transferir puede incorporarse a un genoma vírico de origen natural o modificado o una parte del mismo o puede estar presente dentro de una cápside vírica como una molécula de ácido nucleico separada. Un vector puede contener uno o más ácidos nucleicos que codifican un marcador adecuado para identificar y/o seleccionar células que han captado el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, diversas proteínas que aumentan o disminuyen la resistencia o la sensibilidad a antibióticos u otros agentes (p. ej., una proteína que confiere resistencia a un antibiótico tal como puromicina, higromicina o blasticidina), enzimas cuyas actividades son detectables mediante ensayos conocidos en la técnica (p. ej., p-galactosidasa o fosfatasa alcalina) y proteínas o ARN que afectan de manera detectable al fenotipo de las células que las expresan (p. ej., proteínas fluorescentes). Los vectores incluyen con frecuencia uno o más sitios colocados de manera adecuada para enzimas de restricción, que pueden usarse para facilitar la inserción en el vector de un ácido nucleico, p. ej., un ácido nucleico para expresar. Un vector de expresión es un vector en el que se ha insertado o puede insertarse un ácido nucleico deseado de modo que esté unido operativamente a elementos reguladores (también denominados "secuencias reguladoras", "elementos de control de la expresión" o "secuencias de control de la expresión") y puede expresarse como un transcrito de ARN (p. ej., un ARNm que puede traducirse en proteína o un ARN no codificante). Los vectores de expresión incluyen secuencia(s) reguladora(s), p. ej., secuencias de control de la expresión, suficientes para dirigir la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente en al menos algunas condiciones; otros elementos necesarios o útiles para la expresión pueden ser suministrados por, p. ej., la célula hospedadora o por un sistema de expresión in vitro. Dichas secuencias reguladoras normalmente incluyen un promotor y pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba. Un vector puede incluir secuencias que codifican una región no traducida 5' y/o una región no traducida 3', que puede comprender una señal de escisión y/o poliadenilación. En general, los elementos reguladores pueden estar contenidos en un vector antes de la inserción de un ácido nucleico cuya expresión se desea o pueden estar contenidos en un ácido nucleico insertado o pueden insertarse en un vector después de la inserción de un ácido nucleico cuya expresión se desea. Como se usa en el presente documento, se dice que un ácido nucleico y elemento(s) regulador(es) están "unidos operativamente" cuando están unidos covalentemente para colocar la expresión o transcripción del ácido nucleico bajo la influencia o el control del (de los) elemento(s) regulador(es). Por ejemplo, una región promotora estaría unida operativamente con un ácido nucleico si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. Un experto habitual en la materia será consciente de que la naturaleza precisa de las secuencias reguladoras útiles para la expresión génica puede variar entre especies o tipos celulares, pero puede incluir, en general, según sea adecuado, secuencias implicadas en el inicio de la transcripción, el procesamiento de ARN o el inicio de la traducción. La elección y el diseño de un vector adecuado y elemento(s) regulador(es) están dentro la capacidad y el criterio de un experto habitual en la materia. Por ejemplo, un experto en la materia seleccionará un promotor adecuado (u otras secuencias de control de la expresión) para la expresión en una especie (p. ej., una especie procariota (bacteriana) o eucariota (p. ej., fúngica, vegetal, de mamífero) o tipo celular deseado. Un vector puede contener un promotor capaz de dirigir la expresión en células de mamífero, tal como un promotor vírico adecuado, p. ej., de un citomegalovirus (CMV), retrovirus, virus de simio (p. ej., SV40), virus del papiloma, virus del herpes u otro virus que infecte a células de mamíferos, o un promotor de mamíferos de, p. ej., un gen tal como EFIalfa, ubiquitina (p. ej., ubiquitina B o C), globina, actina, fosfoglicerato cinasa (PGK), etc., o un promotor compuesto tal como un promotor CAG (combinación del elemento potenciador temprano de CMV y el promotor beta-actina de pollo). Se puede usar un promotor humano. Se puede usar un promotor que generalmente dirige la transcripción por una ARN polimerasa eucariota I (un "promotor pol I"), p. ej., (un promotor U6, H1, 7SK o ARNt o una variante funcional del mismo). Se puede usar un promotor que generalmente dirige la transcripción por una ARN polimerasa II eucariota (un "promotor pol II") o una variante funcional de la misma. Un promotor que normalmente dirige la transcripción por una ARN polimerasa III eucariota (un "promotor pol III"), p. ej., se puede usar un promotor para la transcripción de ARN ribosómico (distinto de ARNr 5S) o una variante funcional del mismo. Un experto habitual en la materia seleccionará un promotor adecuado para dirigir la transcripción de una secuencia de interés. Los ejemplos de vectores de expresión que pueden usarse en células de mamífero incluyen, p. ej., la serie de vectores pcDNA, serie de vectores pSV2, serie de vectores pCMV, serie de vectores pRSV, serie de vectores pEF1, vectores Gateway®, etc. Normalmente, se usa(n) elemento(s) de control de la expresión regulable(s) (p. ej., inducibles o reprimibles), p. ej. un promotor regulable, de modo que la expresión pueda regularse, p. ej., activarse o aumentarse 0 inactivarse o disminuirse. Un vector puede comprender una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido, en donde la secuencia polinucleotídica se coloca en fase con un ácido nucleico insertado en el vector de modo que se cree una fusión N o C-terminal. Un polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica puede comprender una secuencia señal (que dirige la secreción de una proteína) o una secuencia que dirige la proteína expresada a un orgánulo o ubicación específico en la célula, tal como el núcleo o las mitocondrias. Un polipéptido puede comprender un marcador. Un marcador puede ser útil para facilitar la detección y/o purificación de una proteína que lo contiene. Los ejemplos de marcadores incluyen marcador de polihistidina (p. ej., marcador de His 6X), glutatión-S-transferasa, proteína de unión a maltosa, marcador de NUS, marcador de SNUT, marcador de estrep, marcadores epitópicos tales como V5, HA, Myc o FLAG. Un sitio de escisión de proteasa puede estar ubicado en la región entre la proteína codificada por el ácido nucleico insertado y el polipéptido, lo que permite que el polipéptido se elimine por exposición a la proteasa. Pueden introducirse vectores en células hospedadoras usando métodos conocidos en la técnica. Un experto habitual en la materia seleccionará un método adecuado, p. ej., en función del vector, tipo celular, etc. Los ejemplos de métodos adecuados incluyen, p. ej., transfección mediada por fosfato de calcio, transfección con cualquiera de diversos reactivos disponibles en el mercado, p. ej., a base de lípidos o a base de sustancias no lipídicas, tales como FuGENE, Lipofectamine, TurboFect; electroporación; bombardeo con micropartículas, etc. Dichos métodos se explican en detalle en referencias convencionales tales como Sambrook, serie Protocols, y otras.
Como se usa en el presente documento, el término "alifático" indica un resto de hidrocarburo que puede ser de cadena lineal (es decir, no ramificada), ramificado o cíclico (incluyendo policíclico fusionado, de enlace y espiro-fusionado) y puede estar completamente saturado o puede contener una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático. Salvo que se especifique otra cosa, los grupos alifáticos contienen 1-30 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-10 átomos de carbono. En otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-8 átomos de carbono. En otras realizaciones más, los grupos alifáticos contienen 1-6 átomos de carbono y en otras realizaciones más los grupos alifáticos contienen 1-4 átomos de carbono. Los grupos alifáticos adecuados incluyen, pero sin limitación, grupos alquilo, alquenilo y alquinilo lineales o ramificados, e híbridos de los mismos tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.
Como se usa en el presente documento, "alquilo" se refiere a un hidrocarburo saturado lineal, ramificado o cíclico que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 22 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 átomos de carbono en determinadas realizaciones de la invención. Los grupos alquilo incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, f-butilo, n-pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclooctilo, adamantilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo y 2,3-dimetilbutilo.
Como se usa en el presente documento, "halo" se refiere a F, Cl, Br o I.
Como se usa en el presente documento, "alcanoílo" se refiere a un residuo acíclico alifático lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene aproximadamente de 1 a 10 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y número específico de átomos de carbono) en el mismo, p. ej., de aproximadamente 1 a 7 átomos de carbono que, como se apreciará, está unido a un grupo C=O terminal con un enlace sencillo (y también puede denominarse "grupo acilo"). Los grupos alcanoílo incluyen, pero sin limitación, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoílo, isopentanoílo, 2-metil-butirilo, 2,2-dimetoxipropionilo, hexanoílo, heptanoílo, octanoílo y similares y, para fines de la presente invención, un grupo formilo se considera un grupo alcanoílo. "Alcanoílo inferior" se refiere a un residuo acíclico alifático lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y número específico de átomos de carbono). Dichos grupos incluyen, pero sin limitación, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoílo, isopentanoílo, etc.
Como se usa en el presente documento, "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático mono o bicíclico, opcionalmente sustituido, que tiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 carbonos. Los ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, fenilo y naftilo.
Como se usa en el presente documento, "aralquilo" se refiere a radicales alquilo que portan un sustituyente arilo y que tienen de aproximadamente 6 a aproximadamente 22 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de intervalos y números específicos de átomos de carbono en el mismo), prefiriéndose de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 átomos de carbono en determinadas realizaciones. Los grupos aralquilo pueden estar opcionalmente sustituidos. Los ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, bencilo, naftilmetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, feniletilo y difeniletilo.
Como se usa en el presente documento, los términos "alcoxi" y "alcoxilo" se refieren a un grupo alquil-O opcionalmente sustituido en donde el alquilo es como se ha definido anteriormente. Los grupos alcoxi y alcoxilo ilustrativos incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, /'-propoxi, n-butoxi y heptoxi.
Como se usa en el presente documento, "carboxilo" se refiere a un grupo -C(=O)OH.
Como se usa en el presente documento, "alcoxicarbonilo" se refiere a un grupo -C(=O)O-alquilo, donde el alquilo es como se ha definido anteriormente.
Como se usa en el presente documento, "aroílo" se refiere a un grupo -C(=O)-arilo, en donde el arilo es como se ha definido anteriormente. Los grupos aroílo ilustrativos incluyen benzoílo y naftoílo.
La expresión "sistema de anillo cíclico" se refiere a un sistema de anillo de 3 a 10 miembros aromático o no aromático, parcialmente insaturado o completamente saturado, que incluye anillos individuales de 3 a 8 átomos de tamaño y sistemas de anillos bicíclicos y tricíclicos que pueden incluir grupos heterocíclicos aromáticos o arilo de 5 o 6 miembros aromáticos fusionados con un anillo no aromático. Estos anillos heterocíclicos incluyen los que tienen de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de manera independiente del grupo que consiste en oxígeno, azufre y nitrógeno. En determinadas realizaciones, el término heterocíclico se refiere a un anillo no aromático de 5, 6 o 7 miembros o un grupo policíclico en donde al menos un átomo de anillo es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S y N, incluyendo, pero sin limitación, un grupo bi o tricíclico, que comprende anillos fusionados de seis miembros que tienen entre uno y tres heteroátomos seleccionados de manera independiente del grupo que consiste en oxígeno, azufre y nitrógeno. En algunas realizaciones, "sistema de anillo cíclico" se refiere a un grupo cicloalquilo que, como se usa en el presente documento, se refiere a grupos que tienen de 3 a 10, p. ej., de 4 a 7 átomos de carbono. Los cicloalquilos incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares, que están opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, "sistema de anillo cíclico" se refiere a un resto cicloalquenilo o cicloalquinilo, que está opcionalmente sustituido.
Normalmente, los restos químicos sustituidos incluyen uno o más sustituyentes que reemplazan hidrógeno. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, halo, alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo, sulfhidrilo, hidroxilo (-OH), alcoxilo, ciano (-CN), carboxilo (-COOH), -C(=O)O-alquilo, aminocarbonilo (-C(=O)NH2), aminocarbonilo -N-sustituido (-C(=O)NHR"), CF3, CF2CF3 y similares. En relación con los sustituyentes mencionados anteriormente, cada resto R" puede ser, de manera independiente, cualquiera de H, alquilo, cicloalquilo, arilo o aralquilo, por ejemplo.
Como se usa en el presente documento, "L-aminoácido" se refiere a cualquiera de los alfa-aminoácidos levógiros de origen natural en proteínas o los ésteres de alquilo de los alfa-aminoácidos. La expresión "D-aminoácido" se refiere a alfa-aminoácidos dextrógiros. Salvo que se especifique otra cosa, todos los aminoácidos a los que se hace referencia en el presente documento son L-aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, un "aminoácido aromático" es un aminoácido que comprende al menos un anillo aromático, p. ej., comprende un grupo arilo.
Como se usa en el presente documento, un "análogo de aminoácido aromático" es un análogo de aminoácido que comprende al menos un anillo aromático, p. ej., comprende un grupo arilo.
II. Visión de conjunto
La invención proporciona análogos de compstatina de acción prolongada, en donde los análogos de compstatina de acción prolongada comprenden un resto reductor de la eliminación que comprende un polímero y dos restos análogos de compstatina como se define en las reivindicaciones. Cada extremo del polímero está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida. El polímero puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) que prolonga la vida útil del compuesto en el cuerpo (p. ej., al reducir su eliminación de la sangre). En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada no comprende un resto de direccionamiento o un resto reactivo con células. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada comprende un resto de direccionamiento y/o un resto reactivo con células.
El análogo de compstatina de acción prolongada de la presente invención puede ser un análogo de compstatina reactivo con células. Los análogos de compstatina reactivos con células son compuestos que comprenden un resto análogo de compstatina y un grupo funcional reactivo con células que es capaz de reaccionar con un grupo funcional expuesto en la superficie de una célula, p. ej., en condiciones fisiológicas, para formar un enlace covalente. El análogo de compstatina reactivo con células se une, por tanto, de manera covalente con la célula. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, un análogo de compstatina unido a la célula protege la célula del daño mediado por el complemento mediante, por ejemplo, unión con C3 (que puede estar en forma de C3(H2O)) en la superficie celular y/o en las proximidades de la célula e inhibición de la escisión y activación de C3, y/o mediante unión con C3b e inhibición de su deposición en la célula o participación en la cascada de activación del complemento. Las células aisladas pueden ponerse en contacto con un análogo de compstatina reactivo con células ex vivo (fuera del cuerpo). Las células pueden estar presentes en un tejido u órgano aislado, p. ej., un tejido u órgano para trasplantar a un sujeto. Las células pueden ponerse en contacto con un análogo de compstatina reactivo con células in vivo, administrando el análogo de compstatina reactivo con células a un sujeto. El análogo de compstatina reactivo con células se une covalentemente con células in vivo. En consecuencia, las células, los tejidos y/o los órganos pueden protegerse de los efectos nocivos de la activación del complemento durante al menos dos semanas, sin necesidad de volver a tratar durante ese tiempo.
El análogo de compstatina de acción prolongada de la invención puede comprender un resto de direccionamiento que se une de manera no covalente con una molécula diana presente en la superficie de células o tejidos o con una sustancia extracelular no unida con células o tejidos. Dichos análogos de compstatina se denominan en el presente documento "análogos de compstatina dirigidos". Con frecuencia, la molécula diana es una proteína o un hidrato de carbono unido con la membrana celular y expuesta en la superficie celular. El resto de direccionamiento dirige el análogo de compstatina a una célula, un tejido o una ubicación susceptible de activación del complemento. Las células aisladas pueden ponerse en contacto con un análogo de compstatina dirigido ex vivo (fuera del cuerpo). Las células pueden estar presentes en un tejido u órgano aislado, p. ej., un tejido u órgano para trasplantar a un sujeto. Un análogo de compstatina dirigido puede administrarse a un sujeto y unirse de manera no covalente a una célula, tejido o sustancia extracelular in vivo. En consecuencia, las células, los tejidos y/o los órganos pueden protegerse de los efectos nocivos de la activación del complemento durante al menos dos semanas, sin necesidad de volver a tratar durante ese tiempo. Un análogo de compstatina dirigido puede comprender tanto un resto de direccionamiento como un resto reactivo con células. El resto de direccionamiento dirige el análogo de compstatina, p. ej., a un tipo celular particular, uniéndose de manera no covalente con una molécula en dichas células. El resto reactivo con células se une de manera covalente con la célula o sustancia extracelular. En otras realizaciones, un análogo de compstatina dirigido no comprende un resto reactivo con células.
III. Sistema del complemento
Para facilitar la comprensión de la invención, y sin pretender limitar la invención de ninguna manera, esta sección proporciona una visión de conjunto del complemento y sus rutas de activación. Se encuentran detalles adicionales, p. ej., en Kuby Immunology, 6a ed., 2006; Paul, W.E., Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6a ed., 2008; y Walport MJ., Complement. First of two parts. N Engl J Med., 344 (14): 1058-66, 2001.
El complemento es una rama del sistema inmunitario innato que desempeña un papel importante en la defensa del cuerpo contra agentes infecciosos. El sistema del complemento comprende más de 30 proteínas séricas y celulares que están implicadas en tres rutas principales, conocidas como las rutas clásica, alternativa y de lectina. La ruta clásica se desencadena habitualmente mediante la unión de un complejo de antígeno y anticuerpo IgM o IgG con C1 (aunque otros activadores determinados también pueden iniciar la ruta). C1 activado escinde C4 y C2 para producir C4a y C4b, además de C2a y C2b. C4b y C2a se combinan para formar C3 convertasa, que escinde C3 para formar C3a y C3b. La unión de C3b con C3 convertasa produce C5 convertasa, que escinde C5 en C5a y C5b. C3a, C4a y C5a son anafilotoxinas y median en múltiples reacciones en la respuesta inflamatoria aguda. C3a y C5a también son factores quimiotácticos que atraen células del sistema inmunitario, tales como neutrófilos.
La ruta alternativa se inicia mediante y se amplifica en, p. ej., superficies microbianas y diversos polisacáridos complejos. En esta ruta, la hidrólisis de C3 a C3(H2O), que se produce espontáneamente a un nivel bajo, conduce a la unión del factor B, que se escinde mediante el factor D, generando una C3 convertasa en fase fluida que activa el complemento escindiendo C3 en C3a y C3b. C3b se une con dianas tales como superficies celulares y forma un complejo con el factor B, que posteriormente se escinde mediante el factor D, dando como resultado una C3 convertasa. Las C3 convertasas unidas a la superficie escinden y activan moléculas C3 adicionales, dando como resultado deposición rápida de C3b muy cerca del sitio de activación y conduciendo a la formación de C3 convertasa adicional, que a su vez genera C3b adicional. Este proceso da como resultado un ciclo de escisión de C3 y formación de C3 convertasa que amplifica significativamente la respuesta. La escisión de C3 y la unión de otra molécula de C3b con la C3 convertasa da lugar a una C5 convertasa. Las C3 y C5 convertasas de esta ruta están reguladas por las moléculas de la célula hospedadora CR1, DAF, MCP, CD59 y fH. El modo de acción de estas proteínas implica la actividad aceleradora de la descomposición (es decir, la capacidad de disociar convertasas), la capacidad para actuar como cofactores en la degradación de C3b o C4b por el factor I, o ambos. Normalmente, la presencia de proteínas reguladoras del complemento en las superficies de células hospedadoras evita que se produzca activación significativa del complemento en las mismas.
Las C5 convertasas producidas en ambas rutas escinden C5 para producir C5a y C5b. C5b se une después con C6, C7 y C8 para formar C5b-8, que cataliza la polimerización de C9 para formar el complejo de ataque a la membrana (MAC) c5b-9. El MAC se inserta en membranas celulares diana y provoca lisis celular. Pequeñas cantidades de MAC en la membrana de las células pueden tener diversas consecuencias además de la muerte celular.
La ruta del complemento de lectina se inicia mediante la unión de lectina de unión a manosa (MBL) y serina proteasa asociada a MBL (MASP) con carbohidratos. El gen de MB1-1 (conocido como LMAN-1 en seres humanos) codifica una proteína de membrana integral de tipo I localizada en la región intermedia entre el retículo endoplásmico y el Golgi. El gen de MBL-2 codifica la proteína de unión a manosa soluble hallada en el suero. En la ruta de lectina humana, MASP-1 y MASP-2 están implicadas en la proteólisis de C4 y C2, lo que conduce a una C3 convertasa descrita anteriormente.
La actividad del complemento está regulada por diversas proteínas de mamíferos denominadas proteínas de control del complemento (PCC) o proteínas reguladoras de activación del complemento (RAC) (patente de los Estados Unidos n.° 6.897.290). Estas proteínas difieren con respecto a la especificidad del ligando y el (los) mecanismo(s) de inhibición del complemento. Pueden acelerar la descomposición normal de las convertasas y/o actuar como cofactores para el factor I, para escindir enzimáticamente C3b y/o C4b en fragmentos más pequeños. Las PCC se caracterizan por la presencia de múltiples (normalmente 4-56) motivos homólogos conocidos como repeticiones de consenso cortas (RCC), módulos de proteínas de control del complemento (PCC) o dominios SUSHi, de aproximadamente 50-70 aminoácidos de longitud que contienen un motivo conservado que incluye cuatro cisteínas unidas por enlaces disulfuro (dos enlaces disulfuro), prolina, triptófano y muchos residuos hidrófobos. La familia PCC incluye el receptor del complemento de tipo 1 (CR1; receptor de C3b:C4b), receptor del complemento de tipo 2 (CR2), proteína cofactor de membrana (MCP; CD46), factor acelerador de la descomposición (DAF), factor del complemento H (fH) y proteína de unión a C4b (C4bp). CD59 es una proteína reguladora del complemento unida a membrana que no está relacionada estructuralmente con las PCC. Las proteínas reguladoras del complemento normalmente sirven para limitar la activación del complemento que podría producirse de otro modo en las células y tejidos del mamífero, p. ej., hospedador humano. Por tanto, las células "propias" normalmente están protegidas de los efectos nocivos que se producirían de otro modo si se procediera a la activación del complemento en estas células. Las deficiencias o defectos en proteína(s) reguladora(s) del complemento están implicadas en la patogenia de diversos trastornos mediados por el complemento, p. ej., como se analiza en el presente documento.
IV. Análogos de compstatina
La compstatina es un péptido cíclico que se une con C3 e inhibe la activación del complemento. La patente de los Estados Unidos N.° 6.3l9.897 describe un péptido que tiene la secuencia Ile- [Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-His-His-Arg-Cys]-Thr (SEQ ID NO: 1), con el enlace disulfuro entre los dos cisteínas indicado entre paréntesis. Se entenderá que el nombre "compstatina" no se usó en la patente de los Estados Unidos n.° 6.319.897, pero fue adoptado posteriormente en la bibliografía científica y de patentes (véase, p. ej., Morikis, et al., Protein Sci., 7 (3): 619-27, 1998) para hacer referencia a un péptido que tiene la misma secuencia que la SEQ ID NO: 2 desvelada en la patente de los Estados Unidos N.° 6.319.897, pero amidado en el extremo C como se muestra en la tabla 1 (SEQ ID NO: 8). El término "compstatina" se usa en el presente documento de manera coherente con dicho uso (es decir, para hacer referencia a la SEQ ID NO: 8). Se han desarrollado análogos de compstatina que tienen mayor actividad inhibidora del complemento que la compstatina. Véase, p. ej., documento WO2004/026328 (PCT/US2003/029653), Morikis, D., et al., Biochem Soc Trans. 32 (parte 1): 28-32, 20O4, Mallik, B., et al., J. Med. Chem., 274-286, 2005; Katragadda, M., et al. J. Med. Chem., 49: 4616-4622, 2006; documento WO2007062249 (PCT/US2006/045539); documento WO2007044668 (PCT/US2006/039397), documento WO/2009/046198 (PCT/US2008/078593); documento WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345) y análisis a continuación.
Los análogos de compstatina pueden estar acetilados o amidados, p. ej., en el extremo N y/o extremo C. Por ejemplo, los análogos de compstatina pueden acetilarse en el extremo N y amidarse en el extremo C. De manera coherente con el uso en la técnica, "compstatina", como se usa en el presente documento, y las actividades de análogos de compstatina descritos en el presente documento en relación con la de compstatina, se refieren a compstatina amidada en el extremo C (Mallik, 2005, mencionado anteriormente).
Los concatámeros o multímeros de compstatina o un análogo inhibidor del complemento de los mismos también son útiles en la presente invención.
Como se usa en el presente documento, la expresión "análogo de compstatina" incluye compstatina y cualquier análogo inhibidor del complemento de la misma. La expresión "análogo de compstatina" abarca la compstatina y otros compuestos diseñados o identificados en función de la compstatina y cuya actividad inhibidora del complemento es al menos 50 % de la de la compstatina según lo medido, p. ej., usando cualquier ensayo de activación del complemento aceptado en la técnica o ensayos sustancialmente similares o equivalentes. Determinados ensayos adecuados se describen en la patente de los Estados Unidos n.° 6.319.897, documento WO2004/026328, Morikis, mencionado anteriormente, Mallik, mencionado anteriormente, Katragadda 2006, mencionado anteriormente, documento WO2007062249 (PCT/US2006/045539); documento WO2007044668 (PCT/US2006/039397), documento WO/2009/046198 (PCT/US2008/078593); y/o documento WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345). El ensayo puede, por ejemplo, medir la lisis de eritrocitos mediada por la ruta alternativa o clásica o ser un ensayo ELISA. En algunas realizaciones, se usa un ensayo descrito en el documento WO/2010/135717 (PCT/US2010/035871).
La actividad de un análogo de compstatina puede expresarse con respecto a su CI50 (la concentración del compuesto que inhibe la activación del complemento en 50 %), indicando una CI50 menor una actividad mayor como se reconoce en la técnica. La actividad de un análogo de compstatina preferido para su uso en la presente invención es al menos tan grande como la de compstatina. Se observa que determinadas modificaciones que se sabe que reducen o eliminan la actividad inhibidora del complemento y pueden excluirse de manera explícita de cualquier realización de la invención. La CI50 de compstatina se ha medido como 12 pM usando un ensayo de lisis de eritrocitos mediada por la ruta alternativa (documento WO2004/026328). Se apreciará que el valor de CI50 preciso medido para un análogo de compstatina dado variará con las condiciones experimentales (p. ej., la concentración en suero usada en el ensayo). Los valores comparativos, p. ej., obtenidos de experimentos en los que la CI50 se determina para múltiples compuestos diferentes en condiciones sustancialmente idénticas, son útiles. En una realización, la CI50 del análogo de compstatina no es mayor que la CI50 de compstatina. En determinadas realizaciones de la invención, la actividad del análogo de compstatina es entre 2 y 99 veces mayor que la de compstatina (es decir, el análogo tiene una CI50 que es menor que la CI50 de compstatina en un factor de entre 2 y 99). Por ejemplo, la actividad puede ser entre 10 y 50 veces mayor que la de compstatina o entre 50 y 99 veces mayor que la de compstatina. En determinadas realizaciones de la invención, la actividad del análogo de compstatina es entre 99 y 264 veces mayor que la de compstatina. Por ejemplo, la actividad puede ser 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260 o 264 veces mayor que la de compstatina. En determinadas realizaciones, la actividad es de entre 250 y 300, 300 y 350, 350 y 400 o 400 y 500 veces mayor que la de compstatina. La invención contempla además análogos de compstatina que tienen actividades entre 500 y 1000 veces mayores que la de compstatina, o más. En determinadas realizaciones, la CI50 del análogo de compstatina está entre aproximadamente 0,2 pM y aproximadamente 0,5 pM. En determinadas realizaciones, la CI50 del análogo de compstatina está entre aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 0,2 pM. En determinadas realizaciones, la CI50 del análogo de compstatina está entre aproximadamente 0,05 pM y aproximadamente 0,1 pM. En determinadas realizaciones, la CI50 del análogo de compstatina está entre aproximadamente 0,001 pM y aproximadamente 0,05 pM.
La Kd de compstatina que se une con C3 puede medirse usando calorimetría de valoración isotérmica (Katragadda, et al., J. Biol. Chem., 279 (53), 54987-54995, 2004). La afinidad de unión de diversos análogos de compstatina por C3 se ha correlacionado con su actividad, indicando una Kd menor una mayor afinidad de unión, como se reconoce en la técnica. Se mostró una correlación lineal entre la afinidad de unión y la actividad para determinados análogos probados (Katragadda, 2004, mencionado anteriormente; Katragadda 2006, mencionado anteriormente). En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de compstatina se une con C3 con una Kd de entre 0,1 pM y 1,0 pM, entre 0,05 pM y 0,1 pM, entre 0,025 pM y 0,05 pM, entre 0,015 pM y 0,025 pM, entre 0,01 pM y 0,015 pM o entre 0,001 pM y 0,01 pM.
Los compuestos "diseñados o identificados en función de compstatina" incluyen, pero sin limitación, compuestos que comprenden una cadena de aminoácidos cuya secuencia se obtiene mediante (i) modificación de la secuencia de compstatina (p. ej., reemplazando uno o más aminoácidos de la secuencia de compstatina con un aminoácido o análogo de aminoácido diferente, insertando uno o más aminoácidos o análogos de aminoácidos en la secuencia de compstatina o suprimiendo uno o más aminoácidos de la secuencia de compstatina); (ii) selección de una biblioteca de péptidos de presentación en fagos en la que uno o más aminoácidos de compstatina se seleccionan aleatoriamente y opcionalmente se modifican adicionalmente según el método (i); o (iii) identificado mediante exploración de compuestos que compiten con compstatina o cualquier análogo de la misma obtenido por los métodos (i) o (ii) para la unión con C3 o un fragmento del mismo. Muchos análogos de compstatina útiles comprenden un agrupamiento hidrófobo, una vuelta p y un enlace disulfuro.
En determinadas realizaciones de la invención, la secuencia del análogo de compstatina comprende o consiste esencialmente en una secuencia que se obtiene realizando 1, 2, 3 o 4 sustituciones en la secuencia de compstatina, es decir, 1, 2, 3 o 4 aminoácidos en la secuencia de compstatina se reemplazan por un aminoácido convencional diferente o por un aminoácido no convencional. En determinadas realizaciones de la invención, se altera el aminoácido en la posición 4. En determinadas realizaciones de la invención, se altera el aminoácido en la posición 9. En determinadas realizaciones de la invención, se alteran los aminoácidos en las posiciones 4 y 9. En determinadas realizaciones de la invención, solo se alteran los aminoácidos en las posiciones 4 y 9. En determinadas realizaciones de la invención, se altera el aminoácido en la posición 4 o 9 está alterado o en determinadas realizaciones, se alteran ambos aminoácidos 4 y 9 y además se alteran hasta 2 aminoácidos ubicados en las posiciones seleccionadas de 1, 7, 10, 11 y 13. En determinadas realizaciones de la invención, se alteran los aminoácidos en las posiciones 4, 7 y 9. En determinadas realizaciones de la invención, se alteran los aminoácidos en la posición 2, 12 o ambos, siempre que la alteración conserve la capacidad del compuesto para ciclar. Dicha(s) alteración(ones) en las posiciones 2 y/o 12 pueden ser adicionales a la(s) modificación(ones) en las posiciones 1, 4, 7, 9, 10, 11 y/o 13. Opcionalmente, la secuencia de cualquiera de los análogos de compstatina cuya secuencia se obtiene reemplazando uno o más aminoácidos de la secuencia de compstatina incluye además hasta 1,2 o 3 aminoácidos adicionales en el extremo C. En una realización, el aminoácido adicional es Gly. Opcionalmente, la secuencia de cualquiera de los análogos de compstatina cuya secuencia se obtiene reemplazando uno o más aminoácidos de la secuencia de compstatina incluye además hasta 5 o hasta 10 aminoácidos adicionales en el extremo C. Debe entenderse que los análogos de compstatina pueden tener una cualquiera o más de las características o los elementos de las diversas realizaciones descritas en el presente documento y las características o los elementos de cualquier realización pueden caracterizar adicionalmente cualquier otra realización descrita en el presente documento, salvo que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. En determinadas realizaciones de la invención, la secuencia del análogo de compstatina comprende o consiste esencialmente en una secuencia idéntica a la de compstatina, excepto en las posiciones correspondientes a las posiciones 4 y 9 en la secuencia de compstatina.
La compstatina y determinados análogos de compstatina que tienen actividad algo mayor que la compstatina contienen solo aminoácidos convencionales (los "aminoácidos convencionales" son glicina, leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, cisteína, metionina, arginina, lisina, prolina, serina, treonina e histidina). Determinados análogos de compstatina que tienen actividad mejorada incorporan uno o más aminoácidos no convencionales. Los aminoácidos no convencionales útiles incluyen aminoácidos halogenados individualmente y de manera múltiple (p. ej., fluorados), D-aminoácidos, homo-aminoácidos, N-alquil aminoácidos, deshidroaminoácidos, aminoácidos aromáticos (distintos de fenilalanina, tirosina y triptófano), ácido orto, meta o paraaminobenzoico, fosfoaminoácidos, aminoácidos metoxilados y aminoácidos a,a-disustituidos. En determinadas realizaciones de la invención, un análogo de compstatina se diseña reemplazando uno o más L-aminoácidos en un análogo de compstatina descrito en otra parte del presente documento con el D-aminoácido correspondiente. Dichos compuestos y métodos de uso de los mismos son un aspecto de la invención. Los aminoácidos no convencionales ilustrativos de uso incluyen 2-naftilalanina (2-NaI), 1-naftilalanina (1-NaI), ácido 2-indanilglicina carboxílico (2Ig1), dihidrotriptófano (Dht), 4-benzoil-L-fenilalanina (Bpa), ácido 2-a-aminobutírico (2-Abu), ácido 3-a-aminobutírico (3-Abu), ácido 4-a-aminobutírico (4-Abu), ciclohexilalanina (Cha), homociclohexilalanina (hCha), 4-fluoro-L-triptófano (4fW), 5-fluoro-L-triptófano (5fw), 6-fluoro-L-triptófano (6fw), 4-hidroxi-L-triptófano (4OH-W), 5-hidroxi-L-triptófano (5OH-W), 6-hidroxi-L-triptófano (6OH-W), 1-metil-L-triptófano (1MeW), 4-metil-L-triptófano (4MeW), 5-metil-L-triptófano (5MeW), 7-aza-L-triptófano (7aW), a-metil-L-triptófano (aMeW), p-metil-L-triptófano (pMeW), N-metil-L-triptófano (NMeW), ornitina (orn), citrulina, norleucina, ácido Y-glutámico, etc.
En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de compstatina comprende uno o más análogos de Trp (p. ej., en la posición 4 y/o 7 en relación con la secuencia de compstatina). Se han mencionado anteriormente análogos de Trp ilustrativos. Véase también Beene, et al. Biochemistry 41: 10262-10269, 2002 (que describe, entre otros, análogos de Trp halogenados individualmente y de manera múltiple); Babitzke y Yanofsky, J. Biol. Chem. 270: 12452­ 12456, 1995 (que describe, entre otros, Trp metilado y halogenado y otros análogos de Trp e indol); y las patentes de los Estados Unidos 6.214.790, 6.169.057, 5.776.970, 4.870.097, 4.576.750 y 4.299.838. Otros análogos de Trp incluyen variantes que están sustituidas (p. ej., por un grupo metilo) en el carbono a o p y, opcionalmente, también en una o más posiciones del anillo de indol. Los aminoácidos que comprenden dos o más anillos aromáticos, incluyendo variantes sustituidas, no sustituidas o sustituidas de manera alternativa de los mismos, son de interés como análogos de Trp. En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de Trp, p. ej., en la posición 4, es 5-metoxi, 5-metil-, 1-metil- o 1-formil-triptófano. En determinadas realizaciones de la invención, se usa un análogo de Trp (p. ej., en la posición 4) que comprende un sustituyente de 1-alquilo, p. ej., un sustituyente de alquilo inferior (p. ej., C1-C5). En determinadas realizaciones, se usa N(a) metil triptófano o 5-metiltriptófano. En algunas realizaciones, se usa un análogo que comprende un sustituyente de 1-alcanoílo, p. ej., un alcanoílo inferior (p. ej., C1-C5). Los ejemplos incluyen 1-acetil-L-triptófano y L-p-triptófano.
En determinadas realizaciones, el análogo de T rp tiene carácter hidrófobo aumentado en relación con T rp. Por ejemplo, el anillo de indol puede estar sustituido con uno o más grupos alquilo (p. ej., metilo). En determinadas realizaciones, el análogo de Trp participa en una interacción hidrófoba con C3. Dicho análogo de Trp puede estar ubicado, p. ej., en la posición 4 en relación con la secuencia de compstatina. En determinadas realizaciones, el análogo de Trp comprende un componente de anillo aromático bicíclico sustituido o no sustituido o dos o más componentes de anillo aromático monocíclico sustituido o no sustituido.
En determinadas realizaciones, el análogo de Trp tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno con C3 en relación con Trp, pero no tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. El análogo de Trp puede tener mayor polaridad en relación con Trp y/o una mayor capacidad para participar en una interacción electrostática con un donante de enlaces de hidrógeno en C3. Determinados análogos ilustrativos de Trp con mayor carácter formador de enlaces de hidrógeno comprenden un sustituyente electronegativo en el anillo de indol. Dicho análogo de Trp puede estar ubicado, p. ej., en la posición 7 en relación con la secuencia de compstatina.
En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de compstatina comprende uno o más análogos de Ala (p. ej., en la posición o 9 en relación a la secuencia de compstatina), p. ej., análogos de Ala que son idénticos a Ala, excepto que incluyen uno o más grupos CH2 en la cadena lateral. En determinadas realizaciones, el análogo de Ala es un aminoácido metílico sencillo no ramificado tal como 2-Abu. En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de compstatina comprende uno o más análogos de Trp (p. ej., en la posición 4 y/o 7 en relación con la secuencia de compstatina) y un análogo de Ala (p. ej., en la posición 9 en relación con la secuencia de compstatina).
En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de compstatina es un compuesto que comprende un péptido que tiene una secuencia de (X'aa)n-Gln-Asp-Xaa-Gly-(X"aa)m, (s Eq ID NO: 2) en donde cada X'aa y cada X"aa es un aminoácido o análogo de aminoácido seleccionado de manera independiente, en donde Xaa es Trp o un análogo de Trp y en donde n>1 y m>1 y n+m está entre 5 y 21. El péptido tiene una secuencia central de Gln-Asp-Xaa-Gly, donde Xaa es Trp o un análogo de Trp, p. ej., un análogo de Trp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno con un donante de enlaces de H en relación con T rp pero, en determinadas realizaciones, que no tiene mayor carácter hidrófobo en relación con T rp. Por ejemplo, el análogo puede ser uno en el que el anillo de indol de T rp está sustituido con un resto electronegativo, p. ej., un halógeno tal como flúor. En una realización, Xaa es 5-fluorotriptófano. Si no hay pruebas de lo contrario, un experto en la materia reconocería que cualquier péptido de origen no natural cuya secuencia comprenda esta secuencia central y que inhiba la activación del complemento y/o se una con C3 se habrá diseñado basándose en la secuencia de compstatina. En una realización alternativa, Xaa es un aminoácido o análogo de aminoácido distinto de un análogo de Trp que permite que el péptido Gln-Asp-Xaa-Gly forme una vuelta p.
En determinadas realizaciones de la invención, el péptido tiene una secuencia central de X'aa-Gln-Asp-Xaa-Gly (SEQ ID NO: 3), donde X'aa y Xaa se seleccionan de Trp y análogos de T rp. En determinadas realizaciones de la invención, el péptido tiene una secuencia central de X'aa-Gln-Asp-Xaa-Gly (SEQ ID NO: 3), donde X'aa y Xaa se seleccionan de Trp, análogos de Trp y otros aminoácidos o análogos de aminoácidos que comprenden al menos un anillo aromático. En determinadas realizaciones de la invención, la secuencia central forma una vuelta p en el contexto del péptido. La vuelta p puede ser flexible, permitiendo que el péptido adopte dos o más conformaciones según lo evaluado, por ejemplo, usando resonancia magnética nuclear (RMN). En determinadas realizaciones, X'aa es un análogo de Trp que comprende un componente de anillo aromático bicíclico sustituido o no sustituido o dos o más componentes de anillo aromático monocíclico sustituido o no sustituido. En determinadas realizaciones de la invención, X'aa se selecciona del grupo que consiste en 2-naftilalanina, 1-naftilalanina, ácido 2-indanilglicina carboxílico, dihidrotriptófano y benzoilfenilalanina. En determinadas realizaciones de la invención, X'aa es un análogo de Trp que tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. Por ejemplo, X'aa puede ser 1-metiltriptófano. En determinadas realizaciones de la invención, Xaa es un análogo de Trp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno en relación con Trp pero, en determinadas realizaciones, que no tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de Trp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno en relación con Trp comprende una modificación en el anillo de indol de Trp, p. ej., en la posición 5, tal como una sustitución de un átomo de H por un átomo de halógeno en la posición 5. Por ejemplo, Xaa puede ser 5-fluorotriptófano.
En determinadas realizaciones de la invención, el péptido tiene una secuencia central de X'aa-Gln-Asp-Xaa-Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), donde X'aa y Xaa se seleccionan de Trp y análogos de Trp y X''aa se selecciona de His, Ala, análogos de Ala, Phe y T rp. En determinadas realizaciones de la invención, X'aa es un análogo de Trp que tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp, tal como 1-metiltriptófano u otro análogo de Trp que tiene un sustituyente de alquilo en el anillo de indol (p. ej., en la posición 1, 4, 5 o 6). En determinadas realizaciones, X'aa es un análogo de Trp que comprende un componente de anillo aromático bicíclico sustituido o no sustituido o dos o más componentes de anillo aromático monocíclico sustituido o no sustituido. En determinadas realizaciones de la invención, X'aa se selecciona del grupo que consiste en 2-naftilalanina, 1-naftilalanina, ácido 2-indanilglicina carboxílico, dihidrotriptófano y benzoilfenilalanina. En determinadas realizaciones de la invención, Xaa es un análogo de Trp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno con C3 en relación con Trp pero, en determinadas realizaciones, que no tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de Trp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno en relación con Trp comprende una modificación en el anillo de indol de Trp, p. ej., en la posición 5, tal como una sustitución de un átomo de H por un átomo de halógeno en la posición 5. Por ejemplo, Xaa puede ser 5-fluorotriptófano. En determinadas realizaciones, X"aa es Ala o un análogo de Ala tal como Abu u otro aminoácido metílico sencillo no ramificado. En determinadas realizaciones de la invención, el péptido tiene una secuencia central de X'aa-Gln-Asp-Xaa-Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), donde X'aa y Xaa se seleccionan cada uno de manera independiente de Trp, análogos de Trp y aminoácidos o análogos de aminoácidos que comprenden al menos una cadena lateral aromática y X"aa se selecciona de His, Ala, análogos de Ala, Phe y T rp. En determinadas realizaciones, X"aa se selecciona de análogos de Trp, aminoácidos aromáticos y análogos de aminoácidos aromáticos.
El resto análogo de compstatina comprendido en el análogo de compstatina de acción prolongada de la invención comprende un péptido cíclico. El péptido puede ciclarse mediante un enlace entre dos aminoácidos cualesquiera, uno de los cuales es (X'aa)n y el otro de los cuales se ubica dentro de (X"aa)m. En determinadas realizaciones, la parte cíclica del péptido tiene entre 9 y 15 aminoácidos de longitud, p. ej., 10-12 aminoácidos de longitud. En determinadas realizaciones, la parte cíclica del péptido tiene 11 aminoácidos de longitud, con un enlace (p. ej., un enlace disulfuro) entre aminoácidos en las posiciones 2 y 12. Por ejemplo, el péptido puede tener 13 aminoácidos de longitud, con un enlace entre aminoácidos en las posiciones 2 y 12 que da como resultado una parte cíclica de 11 aminoácidos de longitud.
En determinadas realizaciones, el péptido comprende o consiste en la secuencia X'aa1-X'aa2-X'aa3-X'aa4-Gln-Asp-Xaa-Gly-X"aa1-X"aa2-X"aa3-X"aa4 -X"aa5 (SEQ ID NO: 5). En determinadas realizaciones, X'aa4 y Xaa se seleccionan de Trp y análogos de T rp, y X'aa1, X'aa2, X'aa3, X"aa1, X"aa2, X"aa3, X"aa4 y X"aa5 se seleccionan de manera independiente de entre aminoácidos y análogos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, X'aa4 y Xaa se seleccionan de aminoácidos aromáticos y análogos de aminoácidos aromáticos. Uno cualquiera o más de X'aa1, X'aa2, X'aa3, X"aa1, X"aa2, X"aa3, X"aa4 y X"aa5 pueden ser idénticos al aminoácido en la posición correspondiente en compstatina. En una realización, X"aa1 es Ala o un solo aminoácido no ramificado metílico sencillo. El péptido puede ciclarse mediante un enlace covalente entre (i) X'aa1, X'aa2 o X'aa3; y (ii) X"aa2, X"aa3, X"aa4 o X"aa5. En una realización, el péptido se cicla mediante un enlace covalente entre X'aa2 y X"aa4. En una realización, el aminoácido unido de manera covalente es cada uno Cys y el enlace covalente es un enlace disulfuro (S-S). En otras realizaciones, el enlace covalente es un enlace C-C, C-O, C-S o C-N. En determinadas realizaciones, uno de los residuos unidos de manera covalente es un aminoácido o análogo de aminoácido que tiene una cadena lateral que comprende una amina primaria o secundaria, el otro residuo unido de manera covalente es un aminoácido o análogo de aminoácido que tiene una cadena lateral que comprende un grupo ácido carboxílico y el enlace covalente es un enlace amida. Los aminoácidos o análogos de aminoácidos que tienen una cadena lateral que comprende una amina primaria o secundaria incluyen lisina y ácidos diaminocarboxílicos de estructura general NH2(CH2)nCH(NH2)COOH tales como ácido 2,3-diaminopropiónico (dapa), ácido 2,4-diaminobutírico (daba) y ornitina (orn), en donde n = 1 (dapa), 2 (daba) y 3 (orn), respectivamente. Los ejemplos de aminoácidos que tienen una cadena lateral que comprende un grupo de ácido carboxílico incluyen aminoácidos dicarboxílicos tales como ácido glutámico y ácido aspártico. También se pueden usar análogos tales como ácido beta-hidroxi-L-glutámico. En algunas realizaciones, un péptido se cicla con un enlace tioéter, p. ej., como se describe en el documento PCT/US2011/052442 (WO/2012/040259). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un enlace disulfuro en cualquiera de los péptidos se reemplaza con un enlace tioéter. En algunas realizaciones, se forma una cistationina. En algunas realizaciones, la cistationina es una delta-cistationina o una gamma-cistationina. En algunas realizaciones, una modificación comprende el reemplazo de un enlace disulfuro de Cys-Cys entre cisteínas en X'aa2 y X"aa4 en la SEQ ID NO: 5 (o posiciones correspondientes en otras secuencias) con la adición de un CH2, para formar una homocisteína en X'aa2 o X"aa4, y la introducción de un enlace tioéter, para formar una cistationina. En una realización, la cistationina es una gammacistationina. En otra realización, la cistationina es una delta-cistationina. Otra modificación de acuerdo con la presente invención comprende el reemplazo del enlace disulfuro con un enlace tioéter sin la adición de un CH2, formando de este modo una lantitionina. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina que tiene un tioéter en lugar de un enlace disulfuro tiene mayor estabilidad, al menos en algunas condiciones, en comparación con el análogo de compstatina que tiene el enlace disulfuro.
En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que comprende un péptido que tiene una secuencia: Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Xaa3-His-Arg-Cys-Xaa4 (SEQ ID NO: 6); en donde:
Xaa1 es Ile, Val, Leu, B1-Ile, B1-Val, B1-Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile o B1-Gly-Ile y B1 representa un primer resto bloqueante;
Xaa2 y Xaa2* se seleccionan de manera independiente de Trp y análogos de T rp;
Xaa3 es His, Ala o un análogo de Ala, Phe, Trp o un análogo de Trp;
Xaa4 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipéptido seleccionado de Thr-Ala y Thr-Asn o un tripéptido que comprende Thr-Ala-Asn, en donde un -OH carboxilo terminal de cualquiera de los L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala o Asn se reemplazan opcionalmente por un segundo resto bloqueante B2; y los dos residuos Cys están unidos por un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, Xaa4 es Leu, Nle, His o Phe o un dipéptido seleccionado de Xaa5-Ala y Xaa5-Asn, o un tripéptido Xaa5-Ala-Asn, en donde Xaa5 se selecciona de Leu, Nle, His o Phe, y en donde un -OH carboxilo terminal de cualquiera de los L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala o Asn se reemplazan opcionalmente por un segundo resto bloqueante B2; y los dos residuos Cys están unidos por un enlace disulfuro.
En otras realizaciones, Xaa1 está ausente o es cualquier aminoácido o análogo de aminoácido, y Xaa2, Xaa2*, Xaa3 y Xaa4 son como se ha definido anteriormente. Si Xaa1 está ausente, el residuo Cys N-terminal puede tener un resto bloqueante B1 unido al mismo.
En otra realización, Xaa4 es cualquier aminoácido o análogo de aminoácido y Xaa1, Xaa2, Xaa2* y Xaa3 son como se ha definido anteriormente. En otra realización, Xaa4 es un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en: Thr-Ala y Thr-Asn, en donde el -OH carboxilo terminal de los Ala o Asn se reemplaza opcionalmente por un segundo resto bloqueante B2.
En cualquiera de las realizaciones del análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 6, Xaa2 puede ser Trp.
En cualquiera de las realizaciones del análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 6, Xaa2 es un análogo de Trp que comprende un componente de anillo aromático bicíclico sustituido o no sustituido o dos o más componentes de anillo aromático monocíclico sustituido o no sustituido. Por ejemplo, el análogo de T rp puede seleccionarse de 2-naftilalanina (2-NaI), 1-naftilalanina (1-NaI), ácido 2-indanilglicina carboxílico (Ig1), dihidrotriptófano (Dht) y 4-benzoil-L-fenilalanina.
En cualquiera de las realizaciones del análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 6, Xaa2 puede ser un análogo de Trp que tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. Por ejemplo, el análogo de Trp puede seleccionarse de 1-metiltriptófano, 4-metiltriptófano, 5-metiltriptófano y 6-metiltriptófano. En una realización, el análogo de Trp es 1-metiltriptófano. En una realización, Xaa2 es 1-metiltriptófano, Xaa2* es Trp, Xaa3 es Ala y los otros aminoácidos son idénticos a los de compstatina.
En cualquiera de las realizaciones del análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 6, Xaa2* puede ser un análogo de Trp tal como un análogo de Trp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno con C3 en relación con Trp, que, en determinadas realizaciones, no tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. En determinadas realizaciones, el análogo de Trp comprende un sustituyente electronegativo en el anillo de indol. Por ejemplo, el análogo de Trp puede seleccionarse de 5-fluorotriptófano y 6-fluorotriptófano.
En determinadas realizaciones de la invención, Xaa2 es Trp y Xaa2* es un análogo de T rp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno con C3 en relación con Trp que, en determinadas realizaciones, no tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. En determinadas realizaciones del análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 6, Xaa2 es un análogo de T rp que tiene mayor carácter hidrófobo en relación con T rp, tal como un análogo de T rp seleccionado de 1-metiltriptófano, 4-metiltriptófano, 5-metiltriptófano y 6-metiltriptófano, y Xaa2* es un análogo de Trp que tiene mayor propensión a formar enlaces de hidrógeno con C3 en relación con Trp que, en determinadas realizaciones, no tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp. Por ejemplo, en una realización, Xaa2 es metiltriptófano y Xaa2* es 5-fluorotriptófano.
En algunas de las realizaciones mencionadas anteriormente, Xaa3 es Ala. En algunas de las realizaciones mencionadas anteriormente, Xaa3 es un aminoácido metílico no ramificado sencillo, p. ej., Abu.
La invención proporciona además análogos de compstatina de la SEQ ID NO: 6, como se ha descrito anteriormente, en donde Xaa2 y Xaa2* se seleccionan de manera independiente de Trp, análogos de Trp y otros aminoácidos o análogos de aminoácidos que comprenden al menos un anillo aromático y Xaa3 es His, Ala o un análogo de Ala, Phe, Trp, un análogo de Trp u otro aminoácido aromático o análogo de aminoácido aromático.
En determinadas realizaciones de la invención, el resto bloqueante presente en el extremo N o C de cualquiera de los análogos de compstatina descritos en el presente documento es cualquier resto que estabilice un péptido contra la degradación que de otro modo se produciría en sangre o líquido intersticial de mamífero (p. ej., ser humano o primate no humano). Por ejemplo, el resto bloqueante B1 podría ser cualquier resto que altere la estructura del extremo N de un péptido para inhibir la escisión de un enlace peptídico entre el aminoácido N-terminal del péptido y el aminoácido adyacente. El resto bloqueante B2 podría ser cualquier resto que altere la estructura del extremo C de un péptido para inhibir la escisión de un enlace peptídico entre el aminoácido C- del péptido y el aminoácido adyacente. Se podría usar cualquier resto bloqueante adecuado conocido en la técnica. En determinadas realizaciones de la invención, el resto bloqueante B1 comprende un grupo acilo (es decir, la parte de un ácido carboxílico que permanece después de la eliminación del grupo -OH). El grupo acilo normalmente comprende entre 1 y 12 carbonos, p. ej., entre 1 y 6 carbonos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la invención el resto bloqueante B1 se selecciona del grupo que consiste en: formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, valerilo, isovalerilo, etc. En una realización, el resto bloqueante B1 es un grupo acetilo, es decir, Xaa1 es Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o Ac-Gly-Ile.
En determinadas realizaciones de la invención, el resto bloqueante B2 es una amina primaria o secundaria (-NH2 o -NHR1, en donde R es un resto orgánico tal como un grupo alquilo).
En determinadas realizaciones de la invención, el resto bloqueante B1 es cualquier resto que neutralice o reduzca la carga positiva que de otro modo puede estar presente en el extremo N a pH fisiológico. En determinadas realizaciones de la invención, el resto bloqueante B2 es cualquier resto que neutralice o reduzca la carga negativa que de otro modo puede estar presente en el extremo C a pH fisiológico.
En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de compstatina está acetilado o amidado en el extremo N y/o extremo C, respectivamente. Un análogo de compstatina puede estar acetilado en el extremo N, amidado en el extremo C y/o tanto acetilado en el extremo N como amidado en el extremo C. En determinadas realizaciones de la invención, un análogo de compstatina comprende un grupo alquilo o arilo en el extremo N en lugar de un grupo acetilo.
En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que comprende un péptido que tiene una secuencia: Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Xaa3-His-Arg-Cys-Xaa4 (SEQ ID NO: 7); en donde:
Xaa1 es Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu o un dipéptido que comprende Gly-Ile o Ac-Gly-Ile;
Xaa2 y Xaa2* se seleccionan de manera independiente de Trp y análogos de T rp;
Xaa3 es His, Ala o un análogo de Ala, Phe, Trp o un análogo de Trp;
Xaa4 es L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, un dipéptido seleccionado de Thr-Ala y Thr-Asn o un tripéptido que comprende Thr-Ala-Asn, en donde un -OH carboxilo terminal de cualquiera de L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala o Asn se reemplaza opcionalmente por -NH2; y los dos residuos Cys están unidos por un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, Xaa4 es Leu, Nle, His o Phe o un dipéptido seleccionado de Xaa5-Ala y Xaa5-Asn, o un tripéptido Xaa5-Ala-Asn, en donde Xaa5 se selecciona de Leu, Nle, His o Phe, y en donde un -OH carboxilo terminal de cualquiera de los L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala o Asn se reemplazan opcionalmente por un segundo resto bloqueante B2; y los dos residuos Cys están unidos por un enlace disulfuro.
En algunas realizaciones, Xaa1, Xaa2, Xaa2*, Xaa3 y Xaa4 son como se ha descrito anteriormente para las diversas realizaciones de la SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, Xaa2* es Trp. En determinadas realizaciones, Xaa2 es un análogo de Trp que tiene mayor carácter hidrófobo en relación con Trp, p. ej., 1-metiltriptófano. En determinadas realizaciones, Xaa3 es Ala. En determinadas realizaciones, Xaa3 es un aminoácido metílico no ramificado sencillo.
En determinadas realizaciones de la invención, Xaa1 es Ile y Xaa4 es L-Thr.
En determinadas realizaciones de la invención, Xaa1 es Ile, Xaa2* es Trp y Xaa4 es L-Thr.
La invención proporciona además análogos de compstatina de la SEQ ID NO: 7, como se ha descrito anteriormente, en donde Xaa2 y Xaa2* se seleccionan de manera independiente de Trp, análogos de Trp, otros aminoácidos o análogos de aminoácidos aromáticos y Xaa3 es His, Ala o un análogo de Ala, Phe, Trp, un análogo de Trp u otro aminoácido aromático o análogo de aminoácido aromático.
En determinadas realizaciones de cualquiera de los análogos de compstatina descritos en el presente documento, se usa un análogo de Phe en lugar de Phe.
La tabla 1 proporciona una lista no limitante de análogos de compstatina útiles en la presente invención. Los análogos se mencionan en forma abreviada en la columna izquierda indicando modificaciones específicas en las posiciones designadas (1-13) en comparación con el péptido original, compstatina. De manera coherente con el uso en la técnica, "compstatina", como se usa en el presente documento, y las actividades de análogos de compstatina descritos en el presente documento en relación con la de compstatina, se refieren al péptido de compstatina amidado en el extremo C. Salvo que se indique lo contrario, los péptidos en la tabla 1 están amidados en el extremo C. El texto en negrita se usa para indicar determinadas modificaciones. La actividad en relación con la compstatina se basa en los datos publicados y los ensayos descritos en los mismos (documentos WO2004/026328, WO2007044668, Mallik, 2005; Katragadda, 2006). Cuando se consultaron múltiples publicaciones que informaban sobre una actividad, se usa el valor publicado más recientemente y se reconocerá que los valores pueden ajustarse en el caso de diferencias entre los ensayos. También se apreciará que en determinadas realizaciones de la invención, los péptidos enumerados en la tabla 1 se ciclan mediante un enlace disulfuro entre los dos residuos Cys cuando se usan en las composiciones y métodos terapéuticos de la invención. Los medios alternativos para ciclar los péptidos también están dentro del alcance de la invención. Como se ha observado anteriormente, en diversas realizaciones de la invención, uno o más aminoácidos de un análogo de compstatina (p. ej., cualquiera de los análogos de compstatina desvelados en el presente documento) puede ser un N-alquil aminoácido (p. ej., un N-metil aminoácido). Por ejemplo, y sin limitación, al menos un aminoácido dentro de la parte cíclica del péptido, al menos un aminoácido N-terminal con respecto a la parte cíclica y/o al menos un aminoácido C-terminal con respecto a la parte cíclica puede ser un N-alquil aminoácido, p. ej., un N-metil aminoácido. En algunas realizaciones de la invención, por ejemplo, un análogo de compstatina comprende una N-metilglicina, p. ej., en la posición correspondiente a la posición 8 de compstatina y/o en la posición correspondiente a la posición 13 de compstatina. En algunas realizaciones, uno o más de los análogos de compstatina en la tabla 1 contiene al menos una N-metilglicina, p. ej., en la posición correspondiente a la posición 8 de compstatina y/o en la posición correspondiente a la posición 13 de compstatina. En algunas realizaciones, uno o más de los análogos de compstatina en la tabla 1 contiene al menos una N-metilisoleucina, p. ej., en la posición correspondiente a la posición 13 de compstatina. Por ejemplo, un Thr en o cerca del extremo C-terminal de un péptido cuya secuencia se enumera en la tabla 1 o cualquier otra secuencia análoga de compstatina puede reemplazarse por N-metil Ile. Como se apreciará, en algunas realizaciones, los aminoácidos N-metilados comprenden N-metil Gly en la posición 8 y N-metil Ile en la posición 13. En algunas realizaciones, los aminoácidos N-metilados comprenden N-metil Gly en una secuencia central tal como la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, los aminoácidos N-metilados comprenden N-metil Gly en una secuencia central tal como la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.
T l 1
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continuación
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En determinadas realizaciones de las composiciones y métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia seleccionada de las secuencias 9-36. En determinadas realizaciones de las composiciones y métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 y 36. En determinadas realizaciones de las composiciones y/o métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 30 y 31. En una realización de las composiciones y métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 28. En una realización de las composiciones y métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 32. En una realización de las composiciones y métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 34. En una realización de las composiciones y métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones, un resto bloqueante B1 comprende un aminoácido, que se puede representar como Xaa0. En algunas realizaciones, el resto bloqueante B2 comprende un aminoácido, que se puede representar como XaaN. En algunas realizaciones, el resto bloqueante B1 y/o B2 comprende un aminoácido no convencional, tal como un D-aminoácido, N-alquil aminoácido (p. ej., N-metil aminoácido). En algunas realizaciones, un resto bloqueante B1 y/o B2 comprende un aminoácido no convencional que es un análogo de un aminoácido convencional. En algunas realizaciones, un análogo de aminoácido comprende un sustituyente de alquilo inferior, alcoxi inferior o halógeno, en comparación con un aminoácido convencional del que es un análogo. En algunas realizaciones, un sustituyente está en una cadena lateral. En algunas realizaciones, un sustituyente está en un átomo de carbono alfa. En algunas realizaciones, un resto bloqueante B1 que comprende un aminoácido, p. ej., un aminoácido no convencional, comprende además un resto B1a. Por ejemplo, el resto bloqueante B1 se puede representar como B1a-Xaa0. En algunas realizaciones, B1a neutraliza o reduce una carga positiva que de otro modo puede estar presente en el extremo N a pH fisiológico. En algunas realizaciones, B1a comprende o consiste en, p. ej., un grupo acilo que, p. ej., comprende entre 1 y 12 carbonos, p. ej., entre 1 y 6 carbonos. En determinadas realizaciones, el resto bloqueante B1a se selecciona del grupo que consiste en: formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, valerilo, isovalerilo, etc. En algunas realizaciones, un resto bloqueante B2 que comprende un aminoácido, p. ej., un aminoácido no convencional, puede comprender además un resto B2a Por ejemplo, fracción de bloqueo B2 puede ser representado como XaaN-B2a, donde N representa el número apropiado para el aminoácido (que dependerá de la numeración utilizada en el resto del péptido). En algunas realizaciones B2a neutraliza o reduce una carga negativa que de otro modo podría estar presente en el C-terminal a pH fisiológico. En algunas realizaciones B2a comprende o consiste en una amina primaria o secundaria (p. ej., NH2). Se entenderá que una actividad bloqueante del resto B1a-Xaa0 y/o XaaN-B2a puede ser proporcionada por uno o ambos componentes del resto en diversas realizaciones. En algunas realizaciones, un resto bloqueante o parte del mismo, p. ej., un residuo de aminoácido, puede contribuir a aumentar la afinidad del compuesto por C3 o C3b y/o mejorar la actividad del compuesto. En algunas realizaciones, una contribución a la afinidad o actividad de un residuo de aminoácido puede ser al menos tan importante como una contribución a la actividad de bloqueo. Por ejemplo, en algunas realizaciones Xaa0 y/o XaaN en B1a-Xaa0 y/o XaaN-B2a pueden actuar principalmente para aumentar la afinidad o actividad del compuesto, mientras que B1a y/o B2a pueden inhibir la digestión y/o neutralizar una carga del péptido. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 5-36, en donde las SEQ ID NO: 5-36 se extienden adicionalmente en el extremo N y/o C. En algunas realizaciones, la secuencia se puede representar como B1a-Xaa0-SECUENCIA-XaaN-B2a, donde SECUENCIA representa cualquiera de las SEQ ID NO: 5-36, en donde B1a y B2a puede estar de manera independiente presente o ausente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un análogo de compstatina comprende B1a-Xaa0-X'aa1-X'aa2-X'aa3-X'aa4-Gln-Asp-Xaa-Gly-X"aa1-X"aa2-X"aa3-X"aa4-X"aa5-XaaN-B2a (SEQ ID NO: 71), donde X'aa1-X'aa2-X'aa3-X'aa4, Xaa, X"aa1, X"aa2, X"aa3, X"aa4 y X"aa5 son como se ha expuesto anteriormente para la SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones, un análogo de compstatina comprende B1a-Xaa0-Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Xaa3-His-Arg-Cys-Xaa4-XaaN-B2a (SEQ ID No: 72), donde Xaa1, Xaa2, Xaa2*, Xaa3 y Xaa4 son como se ha expuesto anteriormente para la SEQ ID NO: 6 o en donde Xaa1, Xaa2, Xaa2*, Xaa3 y Xaa4 son como se ha expuesto para la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, un análogo de compstatina comprende B1a-Xaa0-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-XaaN-B2a (SEQ ID NO: 73) en donde Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12 y Xaa13 son idénticos a los aminoácidos en las posiciones 1-13 de cualquiera de las SEQ ID NO: 9-36.
En algunas realizaciones, Xaa0 y/o XaaN en cualquier secuencia análoga de compstatina comprende un aminoácido que comprende un anillo aromático que tiene un sustituyente alquilo en una o más posiciones. En algunas realizaciones, un sustituyente alquilo es un sustituyente alquilo inferior. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un sustituyente alquilo es un grupo metilo o etilo. En algunas realizaciones, un sustituyente está ubicado en cualquier posición que no destruya el carácter aromático del compuesto. En algunas realizaciones, un sustituyente está ubicado en cualquier posición que no destruya el carácter aromático de un anillo con el que está unido el sustituyente. En algunas realizaciones, un sustituyente está ubicado en la posición 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, Xaa0 comprende un análogo O-metílico de tirosina, 2-hidroxifenilalanina o 3-hidroxifenilalanina. Para los fines de la presente divulgación, una "m" minúscula seguida de una abreviatura de aminoácidos de tres letras se puede usar para indicar específicamente que el aminoácido es un N-metil aminoácido. Por ejemplo, cuando la abreviatura "mGly" aparece en el presente documento, indica N-metilglicina (también denominada en ocasiones sarcosina o Sar). En algunas realizaciones, Xaa0 es o comprende mGly, Tyr, Phe, Arg, Trp, Thr, Tyr(Me), Cha, mPhe, mVal, mIle, mAla, DTyr, DPhe, DArg, DTrp, DThr, DTyr(Me), mPhe, mVal, mIle, DAla o DCha. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un análogo de compstatina comprende un péptido que tiene una secuencia B1-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-mGly-Ala-His-Arg-Cys] -mIle-B2 (SEQ ID NO: 74) o B1-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-mGly-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-B2 (SEQ ID NO: 75). Los dos residuos Cys están unidos por un enlace disulfuro en los compuestos activos. En algunas realizaciones, el péptido se acetila en el extremo N y/o se amida en el extremo C. En algunas realizaciones, B1 comprende B1a-Xaa0 y/o B2 comprende XaaN-B2a, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, B1 comprende o consiste en Gly, mGly, Tyr, Phe, Arg, Trp, Thr, Tyr(Me), mPhe, mVal, mIle, mAla, DTyr, DPhe, DTrp, DCha, DAla y B2 comprende NH2, p. ej., un -OH carboxilo terminal de mIle se reemplaza por NH2. En algunas realizaciones, B1 comprende o consiste en mGly, Tyr, DTyr o Tyr(Me) y B2 comprende NH2, p. ej., un -OH carboxilo terminal de mIle se reemplaza por NH2. En algunas realizaciones, una Ile en la posición Xaa1 se reemplaza por Gly. La potencia de inhibición del complemento y/o los parámetros de unión a C3b de análogos de compstatina seleccionados se describen en el documento Wo /2010/127336 (PCT/US2010/033345) y/o en Qu, et al., Immunobiology (2012), doi:10.1016/j.imbio.2012.06.003.
En algunas realizaciones, un resto bloqueante o parte del mismo, p. ej., un residuo de aminoácido, puede contribuir a aumentar la afinidad del compuesto por C3 o C3b y/o mejorar la actividad del compuesto. En algunas realizaciones, una contribución a la afinidad o actividad de un aminoácido o análogo de aminoácido puede ser más significativa que una actividad bloqueante.
En determinadas realizaciones de las composiciones y métodos de la invención, el análogo de compstatina tiene una secuencia como se expone en la tabla 1, pero donde el grupo Ac se reemplaza por un resto bloqueante B1 alternativo, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el grupo -NH2 se reemplaza por un resto bloqueante B2 alternativo, como se describe en el presente documento.
En una realización, el análogo de compstatina se une sustancialmente con la misma región de la cadena p de C3 humano que la compstatina. En una realización, el análogo de compstatina es un compuesto que se une con un fragmento de la parte C-terminal de la cadena p de C3 humano que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa con el que se une la compstatina (Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol., 35:160, 1998; Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol. 43(12): 2023-9, 2006). En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que se une al sitio de unión de compstatina según lo determinado en una estructura de compstatina-C3, p. ej., una estructura cristalina o una estructura tridimensional obtenida por RMN. En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que podría sustituir la compstatina en una estructura de compstatina-C3 y formaría sustancialmente los mismos contactos intermoleculares con C3 que la compstatina. En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que se une con el sitio de unión de un péptido que tiene una secuencia expuesta en la tabla 1, p. ej., SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 o 36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75 u otra secuencia análoga de compstatina desvelada en el presente documento en una estructura de péptido-C3, p. ej., una estructura cristalina. En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que se une con el sitio de unión de un péptido que tiene la SEQ ID NO: 30 o 31 en una estructura de péptido-C3, p. ej., una estructura cristalina. En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que podría sustituir el péptido de las SEQ ID NO: 9-36, p. ej., un compuesto que podría sustituir el péptido de las SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 o 36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75 u otra secuencia análoga de compstatina desvelada en el presente documento en una estructura de péptido-C3 y formaría sustancialmente los mismos contactos intermoleculares con C3 que el péptido. En determinadas realizaciones, el análogo de compstatina es un compuesto que podría sustituir el péptido de las SEQ ID NO: 30 o 31 en una estructura de péptido-C3 y formaría sustancialmente los mismos contactos intermoleculares con C3 que el péptido.
Un experto habitual en la materia podrá determinar fácilmente si un análogo de compstatina se une con un fragmento de la parte C-terminal de la cadena p de C3 utilizando métodos experimentales rutinarios. Por ejemplo, un experto en la materia podría sintetizar una versión fotoreticulable del análogo de compstatina mediante la inclusión de un aminoácido fotorreticulante tal como p-benzoil-L-fenilalanina (Bpa) en el compuesto, p. ej., en el extremo C de la secuencia (Soulika, A.M., et al, mencionado anteriormente). Opcionalmente, se podrían incluir aminoácidos adicionales, p. ej., un marcador epitópico tal como un marcador FLAG o un marcador HA para facilitar la detección del compuesto, p. ej., mediante transferencia de Western. El análogo de compstatina se incuba con el fragmento y se inicia la reticulación. La localización conjunta del análogo de compstatina y el fragmento C3 indica unión. También se puede usar resonancia de plasmón superficial para determinar si un análogo de compstatina se une con el sitio de unión a compstatina en C3 o un fragmento del mismo. Un experto en la materia podría usar programas de software de modelado molecular para predecir si un compuesto formaría sustancialmente los mismos contactos intermoleculares con C3 que compstatina o un péptido que tenga la secuencia de cualquiera de los péptidos en la tabla 1, p. ej., SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 o 36 o, en algunas realizaciones, SEQ ID NO: 30 o 31, 37, 71, 72, 73, 74 o 75 u otra secuencia análoga de compstatina desvelada en el presente documento.
Los análogos de compstatina pueden prepararse mediante diversos métodos sintéticos de síntesis de péptidos conocidos en la técnica mediante condensación de residuos de aminoácidos, p. ej., de acuerdo con métodos convencionales de síntesis de péptidos, pueden prepararse mediante expresión in vitro o en células vivas a partir de secuencias de ácido nucleico adecuadas que los codifican usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse usando metodologías convencionales de fase sólida como se describe en Malik, mencionado anteriormente, Katragadda, mencionado anteriormente, documentos WO2004026328 y/o WO2007062249. Los restos potencialmente reactivos tales como grupos amino y carboxilo, grupos funcionales reactivos, etc., puede protegerse y posteriormente desprotegerse usando diversos grupos protectores y metodologías conocidas en la técnica. Véase, p. ej., "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a ed. Greene, T. W. y Wuts, P. G., Eds., John Wiley & Sons, Nueva York: 1999. Los péptidos pueden purificarse usando enfoques convencionales tales como HPLC de fase inversa. Se puede realizar separación de péptidos diastereoméricos, si se desea, usando métodos conocidos tales como HPLC de fase inversa. Las preparaciones pueden liofilizarse, si se desea, y posteriormente disolverse en un disolvente adecuado, p. ej., agua. El pH de la solución resultante se puede ajustar, p. ej., a pH fisiológico, usando una base tal como NaOH. Las preparaciones de péptidos se pueden caracterizar mediante espectrometría de masas, si se desea, p. ej., para confirmar la masa y/o formación de enlaces disulfuro. Véase, p. ej., Mallik, 2005 y Katragadda, 2006.
Un análogo de compstatina, opcionalmente unido con un resto reactivo con células o resto de direccionamiento, puede modificarse mediante la adición de una molécula tal como polietilenglicol (PEG) o moléculas similares para estabilizar el compuesto, reducir su inmunogenicidad, aumentar su vida útil en el cuerpo, aumentar o disminuir su solubilidad y/o aumentar su resistencia a la degradación. En la invención, el análogo de compstatina de acción prolongada comprende un resto reductor de la eliminación unido con dos restos análogos de compstatina, en donde el resto reductor de la eliminación comprende un polímero, por ejemplo, polietilenglicol. Se conocen bien en la técnica métodos para pegilación (Veronese, F. M. y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456, 2002; Davis, F. F., Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 457-458, 2002); Hinds, K. D. y Kim, S. W. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 505-530 (2002; Roberts, M. J., Bentley, M. D. y Harris, J. M. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 459-476; 2002); Wang, Y. S. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 547-570, 2002). Una amplia diversidad de polímeros, tales como PEG y PEG modificados, incluyendo PEG derivatizados con los que los polipéptidos se pueden unir convenientemente, se describen en el Catálogo de productos de Nektar Advanced Pegylation 2005-2006, Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, que también proporciona detalles de procedimientos de conjugación adecuados. El análogo de compstatina puede fusionarse con el dominio Fc de una inmunoglobulina o una parte de la misma. El análogo de compstatina puede conjugarse con un resto de albúmina o con un péptido de unión a albúmina. Por tanto, en algunas realizaciones, el análogo de compstatina se modifica con uno o más componentes polipeptídicos o no polipeptídicos, p. ej., el análogo de compstatina se pegila o se conjuga con otro resto. En algunas realizaciones, el componente no es el dominio Fc de una inmunoglobulina o una parte del mismo. Se puede proporcionar un análogo de compstatina como un multímero o como parte de un complejo supramolecular, que puede incluir una sola especie molecular o múltiples especies diferentes (p. ej., múltiples análogos diferentes).
En la invención, el análogo de compstatina de acción prolongada comprende dos restos análogos de compstatina unidos con un resto reductor de la eliminación que comprende un polímero, en donde cada extremo del polímero está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida. Los restos análogos de compstatina se unen por tanto de manera covalente con la cadena principal o el armazón polimérico. Los restos análogos de compstatina pueden ser idénticos o diferentes. En determinadas realizaciones de la invención, el análogo de compstatina de acción prolongada comprende múltiples casos, o copias, de un solo resto análogo de compstatina. En otras realizaciones de la invención, el análogo de compstatina de acción prolongada comprende uno o más casos de cada uno de dos restos análogos de compstatina no idénticos. En la invención, el número de restos análogos de compstatina ("n") es 2.
Los restos análogos de compstatina pueden estar unidos directamente con el armazón polimérico o pueden estar unidos a través de un resto de enlace que conecta el resto análogo de compstatina con el armazón polimérico.
El análogo de compstatina de acción prolongada de la invención comprende un residuo Lys o una secuencia que comprende un residuo Lys en el extremo N y/o extremo C del análogo de compstatina. El residuo Lys está separado de la parte cíclica del análogo de compstatina por un espaciador rígido o flexible que comprende un resto de oligo(etilenglicol). El espaciador comprende ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (AEEAc) o ácido 11-amino-3,6,9trioxaundecanoico.
En los análogos de compstatina de acción prolongada de la invención, los restos análogos de compstatina se unen de este modo con un resto reductor de la eliminación. El resto reductor de la eliminación comprende un polímero, cada extremo del cual está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida. Se puede usar cualquiera de diversas estructuras o armazones poliméricos. Por ejemplo, la cadena principal o el armazón polimérico puede ser una poliamida, polisacárido, polianhídrido, poliacrilamida, polimetacrilato, polipéptido, óxido de polietileno o dendrímero. Se describen métodos y cadenas principales poliméricas adecuados, p. ej., en los documentos WO98/46270 (PCT/US98/071) o WO98/47002 (PCT/US98/06963). En una realización, la cadena principal polimérica o el armazón comprende múltiples grupos funcionales reactivos, tales como ácidos carboxílicos, anhídrido o grupos succinimida. La cadena principal polimérica o el armazón se hace reaccionar con los análogos de compstatina. Como alternativa, las unidades monoméricas que podrían unirse entre sí para formar una cadena principal polimérica o armazón se hacen reaccionar en primer lugar con los análogos de compstatina y los monómeros resultantes se polimerizan. En otra realización, las cadenas cortas están prepolimerizadas, funcionalizadas y después se ensambla una mezcla de cadenas cortas de diferente composición en polímeros más largos.
V. Miméticos de compstatina
La estructura de compstatina se conoce en la técnica y también se conocen estructuras de RMN para varios análogos de compstatina que tienen mayor actividad que la compstatina (Malik, mencionado anteriormente). Se puede usar información estructural para diseñar miméticos de compstatina.
Se desvela en el presente documento un mimético de compstatina que es cualquier compuesto que compita con compstatina o cualquier análogo de compstatina (p. ej., un análogo de compstatina cuya secuencia se expone en la tabla 1) por la unión con C3 o un fragmento del mismo (tal como un fragmento de 40 kD de la cadena p con el que se une la compstatina). Un mimético de compstatina desvelado puede tener una actividad igual o mayor que la de compstatina. Un mimético de compstatina desvelado puede ser más estable, disponible por vía oral o tener una mejor biodisponibilidad que la compstatina. Un mimético de compstatina puede ser un péptido, ácido nucleico o molécula pequeña. Un mimético de compstatina desvelado puede ser un compuesto que se une con el sitio de unión de compstatina según lo determinado en una estructura de compstatina-C3, p. ej., una estructura cristalina o una estructura tridimensional obtenida de experimentos de RMN. Un mimético de compstatina desvelado puede ser un compuesto que podría sustituir la compstatina en una estructura de compstatina-C3 y formaría sustancialmente los mismos contactos intermoleculares con C3 que la compstatina. Un mimético de compstatina desvelado puede ser un compuesto que se une con el sitio de unión de un péptido que tiene una secuencia expuesta en la tabla 1, p. ej., SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 o 36 o, por ejemplo, SEQ ID NO: 30 o 31 u otra secuencia análoga de compstatina, en una estructura de péptido-C3. Un mimético de compstatina desvelado puede ser un compuesto que podría sustituir un péptido que tiene una secuencia expuesta en la tabla 1, p. ej., SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 o 36 o, por ejemplo, SEQ ID NO: 30 o 31 u otra secuencia análoga de compstatina, en una estructura de péptido-C3 y formaría sustancialmente los mismos contactos intermoleculares con C3 que el péptido. Un mimético de compstatina desvelado puede tener una cadena principal no peptídica pero tener cadenas laterales dispuestas en una secuencia diseñada en función de la secuencia de compstatina.
Un experto en la materia apreciará que una vez que se ha determinado una conformación particular deseada de un péptido corto, se conocen bien métodos para diseñar un péptido o peptidomimético para ajustarse a esa conformación. Véase, p. ej., G. R. Marshall (1993), Tetrahedron, 49: 3547-3558; Hruby y Nikiforovich (1991), en Molecular Conformation and Biological Interactions, P. Balaram y S. Ramasehan, eds., Indian Acad. of Sci., Bangalore, PP. 429­ 455), Eguchi M, Kahn M., Mini Rev Med Chem., 2 (5): 447-62, 2002. El diseño de los análogos peptídicos puede refinarse adicionalmente teniendo en cuenta la contribución de diversas cadenas laterales de residuos de aminoácidos, p. ej., para el efecto de grupos funcionales o por consideraciones estéricas como se describe en la técnica para compstatina y análogos de la misma, entre otros.
Los expertos en la materia apreciarán que un mimético peptídico puede actuar igualmente bien como un péptido con el fin de proporcionar la conformación de cadena principal específica y las funcionalidades de cadena lateral necesarias para unirse con C3 e inhibir la activación del complemento. En consecuencia, se desvela en el presente documento el concepto de producir y utilizar la unión con C3, compuestos inhibidores del complemento mediante el uso de aminoácidos de origen natural, derivados de aminoácidos, análogos o moléculas no aminoacídicas capaces de unirse para formar la conformación de cadena principal adecuada. Un análogo no peptídico, o un análogo que comprenda componentes peptídicos y no peptídicos, se denomina en ocasiones en el presente documento "peptidomimético" o "mimético isostérico", para designar sustituciones o derivaciones de un péptido que posee casi las mismas características conformacionales de cadena principal y/u otras funcionalidades, para que sea suficientemente similar a los péptidos ejemplificados para inhibir la activación del complemento. De manera más general, un mimético de compstatina es cualquier compuesto que sitúe farmacóforos de manera similar a su situación en compstatina, incluso si la cadena principal difiere.
El uso de peptidomiméticos para el desarrollo de análogos peptídicos de alta afinidad se conoce bien en la técnica. Suponiendo restricciones rotacionales similares a las de residuos de aminoácidos dentro de un péptido, pueden analizarse análogos que comprenden restos distintos de aminoácidos y verificarse sus motivos conformacionales, por medio del diagrama de Ramachandran (Hruby y Nikiforovich 1991), entre otras técnicas conocidas.
Un experto en la materia podrá establecer fácilmente ensayos de exploración adecuados para identificar miméticos de compstatina adicionales y seleccionar los que tienen actividades inhibidoras deseadas. Por ejemplo, la compstatina o un análogo de la misma podría marcarse (p. ej., con un marcador radioactivo o fluorescente) y ponerse en contacto con C3 en presencia de diferentes concentraciones de un compuesto de prueba. Se evalúa la capacidad del compuesto de prueba para disminuir la unión del análogo de compstatina con C3. Un compuesto de prueba que disminuye significativamente la unión del análogo de compstatina con C3 es un mimético de compstatina candidato. Por ejemplo, un compuesto de prueba que disminuye la concentración en estado estacionario de un complejo de análogo de compstatina-C3 o que disminuye la tasa de formación de un complejo de análogo de compstatina-C3 en al menos 25 % o en al menos 50 %, es un mimético de compstatina candidato. Un experto en la materia reconocerá que se pueden emplear varias variaciones de este ensayo de exploración. Los compuestos para explorar incluyen productos naturales, bibliotecas de aptámeros, bibliotecas de presentación en fagos, bibliotecas de compuestos sintetizadas usando química combinatoria, etc. Se desvela en el presente documento la síntesis de una biblioteca combinatoria de compuestos basada en la secuencia central descrita anteriormente y la exploración de la biblioteca para identificar miméticos de compstatina. Cualquiera de estos métodos también podría usarse para identificar nuevos análogos de compstatina que tengan mayor actividad inhibidora que los análogos de compstatina probados hasta ahora.
VI. Análogos de compstatina reactivos con células o de acción prolongada
Como se ha indicado anteriormente, el análogo de compstatina de acción prolongada de la invención puede comprender un resto reactivo con células. Un análogo de compstatina reactivo con células puede comprender un compuesto de fórmula A-L-M, en donde A es un resto que comprende un grupo funcional reactivo con células J, L es una parte de unión opcionalmente presente y M comprende un resto análogo de compstatina. El resto análogo de compstatina puede comprender cualquier análogo de compstatina, p. ej., cualquier análogo de compstatina descrito anteriormente. La fórmula A-L-M abarca realizaciones en las que A-L está presente en el extremo N del resto análogo de compstatina, realizaciones en las que A-L está presente en el extremo C del resto análogo de compstatina, realizaciones en las que A-L está unido con una cadena lateral de un aminoácido del resto análogo de compstatina. Se apreciará que cuando determinado(s) análogo(s) de compstatina están presentes como un resto análogo de compstatina en un compuesto de fórmula A-L-M, un grupo funcional del análogo de compstatina habrá reaccionado con un grupo funcional de L para formar un enlace covalente con A o L. Por ejemplo, un análogo de compstatina reactivo con células en el que el resto análogo de compstatina comprende un análogo de compstatina que contiene un aminoácido con una cadena lateral que contiene un grupo de amina primaria (NH2) (cuyo análogo de compstatina puede representarse mediante la fórmula R1-(NH2)), puede tener una fórmula R1-NH-L-A en el que se ha formado un nuevo enlace covalente con L (p. ej., N-C) y se ha perdido un hidrógeno. Por tanto, la expresión "resto análogo de compstatina" incluye estructuras moleculares en las que al menos un átomo de un análogo de compstatina participa en un enlace covalente con un segundo resto, p. ej., mediante modificación de una cadena lateral. Un resto bloqueante en el extremo N o extremo C de un análogo de compstatina, p. ej., un análogo de compstatina descrito en la sección IV anterior, puede ser reemplazado por A-L en la estructura de un análogo de compstatina reactivo con células. A o L pueden comprender un resto bloqueante. Un análogo de compstatina reactivo con células puede tener una actividad molar de al menos aproximadamente 10 %, 20 % o 30 %, p. ej., entre 30 % y 40 %, entre 30 % y 50 %, entre 30 % y 60 %, entre 30 % y 70 %, entre 30 % y 80 %, entre 30 % y 90 %, o más, de la actividad de un análogo de compstatina correspondiente que tiene la misma secuencia de aminoácidos (y, si procede, uno o más restos bloqueantes) pero que no comprende un resto reactivo con células. La actividad molar del análogo de compstatina reactivo con células puede ser al menos aproximadamente 10 %, 20 % o 30 %, p. ej., entre 30 % y 40 %, entre 30 % y 50 %, entre 30 % y 60 %, entre 30 % y 70 %, entre 30 % y 80 %, entre 30 % y 90 %, o más, de la suma de las actividades de dichos restos análogos de compstatina.
El resto reactivo con células A puede comprender cualquiera de diversos grupos funcionales diferentes reactivos con células J. En general, un grupo funcional reactivo con células puede seleccionarse en función al menos en parte de factores tales como (a) el grupo funcional particular que va a ser diana; (b) la capacidad del grupo funcional reactivo para reaccionar con el grupo funcional diana en condiciones ex vivo fisiológicamente aceptables (p. ej., pH y osmolaridad fisiológicamente aceptables) y/o condiciones in vivo (p. ej., en sangre); (c) la especificidad de la reacción entre el grupo funcional reactivo y el grupo funcional diana en condiciones ex vivo fisiológicamente aceptables y/o in vivo; (d) la estabilidad (p. ej., en condiciones in vivo) del enlace covalente que resultaría de la reacción del grupo funcional reactivo con su grupo funcional diana; (e) la facilidad de sintetizar un análogo de compstatina reactivo con células que comprende el grupo funcional reactivo, etc. Se puede seleccionar un grupo funcional reactivo que reacciona con su grupo químico diana sin liberar un grupo saliente. Se puede seleccionar un grupo funcional reactivo que da como resultado la liberación de un grupo saliente tras la reacción con una diana. Los compuestos que contienen dichos grupos pueden ser útiles, p. ej., para supervisar el progreso y/o el alcance de una reacción. Un grupo saliente puede ser fisiológicamente aceptable para células, tejidos u órganos en la cantidad generada (p. ej., en función de la concentración y/o la cantidad absoluta generada) y/o ser médicamente aceptable para un sujeto en la cantidad generada in vivo (p. ej., en función de la concentración en un líquido corporal relevante tal como sangre y/o en función de la cantidad absoluta generada). Un grupo saliente generado ex vivo puede eliminarse al menos en parte, p. ej., lavando células o lavando o perfundiendo un tejido u órgano, p. ej., con solución salina.
Un grupo funcional reactivo con células puede reaccionar con una cadena lateral de un residuo de aminoácido y/o con un grupo amino N-terminal o un grupo carboxilo C-terminal de una proteína. El grupo funcional reactivo con células puede ser reactivo con grupos sulfhidrilo (-SH), que se encuentran en las cadenas laterales de residuos de cisteína. Se puede usar un grupo maleimida. Los grupos maleimida reaccionan con grupos sulfhidrilo de residuos de cisteína de proteínas a pH fisiológico y forman un enlace tioéter estable. Se puede usar un grupo haloacetilo, tal como un grupo yodoacetilo o bromoacetilo. Los haloacetilos reaccionan con grupos sulfhidrilo a pH fisiológico. La reacción del grupo yodoacetilo se produce por sustitución nucleófila de yodo con un átomo de azufre de un grupo sulfhidrilo que da como resultado un enlace tioéter estable. Se puede usar un grupo de yodoacetamida. El grupo funcional reactivo con células puede reaccionar con grupos amino (-NH2), que están presentes en los extremos N de las proteínas y en la cadena lateral de los residuos de lisina (grupo £-amino). Se puede usar un éster activado, p. ej., un éster succinimidílico (es decir, éster de NHS). Por ejemplo, se puede usar N-hidroxisuccinimida (NHS) o su análogo soluble en agua (sulfo-NHS) en la síntesis, de modo que el análogo de compstatina reactivo con células resultante comprende un éster de NHS. El grupo funcional reactivo con células puede reaccionar con grupos carboxilo (-COOH), que están presentes en los extremos C de las proteínas y en las cadenas laterales de diversos residuos de aminoácidos. El análogo de compstatina reactivo con células puede ser reactivo con grupos hidroxilo (-OH), que están presentes en las cadenas laterales de diversos aminoácidos y en restos de carbohidratos de proteínas glucosiladas.
En general, la parte de unión L puede comprender uno cualquiera o más restos alifáticos y/o aromáticos compatibles con la formación de un compuesto estable que une los restos unidos. El término "estable", como se usa en el presente documento, se refiere preferentemente a compuestos que poseen estabilidad suficiente para permitir la fabricación y que mantienen la integridad del compuesto durante un periodo de tiempo suficiente, p. ej., para ser útil para uno o más fines descritos en el presente documento. L puede comprender una cadena alifática saturada o insaturada, sustituida o no sustituida, ramificada o no ramificada que tiene una longitud de entre 1 y 30, entre 1 y 20, entre 1 y 10, entre 1 y 6 o 5 o menos átomos de carbono, donde la longitud se refiere al número de átomos de C en la cadena principal (la más larga). La cadena alifática puede comprender uno o más heteroátomos (O, N, S), que se pueden seleccionar de manera independiente. Al menos 50 % de los átomos en la cadena principal de L pueden ser átomos de carbono. L puede comprender un resto alquilo saturado (CH2)n, en donde n está entre 1 y 30.
L puede comprender uno o más heteroátomos y tener una longitud de entre 1 y 1000, entre 1 y 800, entre 1 y 600, entre 1 y 400, entre 1 y 300, entre 1 y 200, entre 1 y 100, entre 1 y 50, entre 1 y 30 o entre 1 y 10 átomos de carbono totales en una cadena. L puede comprender un resto de oligo(etilenglicol) (-(O-CH2-CH2-)n) en donde n está entre 1 y 500, entre 1 y 400, entre 1 y 300, entre 1 y 200, entre 1 y 100, entre 10 y 200, entre 200 y 300, entre 100 y 200, entre 40 y 500, entre 30 y 500, entre 20 y 500, entre 10 y 500, entre 1 y 40, entre 1 y 30, entre 1 y 20 o entre 1 y 10.
L puede comprender un resto insaturado tal como -CH=CH- o -CH2-CH=CH-; un resto que comprende un sistema de anillo cíclico no aromático (p. ej., un resto de ciclohexilo), un resto aromático (p. ej., un sistema de anillo cíclico aromático tal como un resto de fenilo); un resto de éter (-C-O-C-); un resto de amida (-C(=O)-N-); un resto de éster (-CO-O-); un resto de carbonilo (-C(=O)-); un resto de imina (-C=N-); un resto de tioéter (-C-S-C-); un residuo de aminoácido; y/o cualquier resto que pueda formarse por la reacción de dos grupos funcionales reactivos compatibles. Uno o más restos de una parte de unión o resto reactivo con células pueden sustituirse mediante reemplazo independiente de uno o más de los átomos de hidrógeno (u otros) sobre el mismo con uno o más restos incluyendo, pero sin limitación, alifático; aromático, arilo; alquilo, aralquilo, alcanoílo, aroílo, alcoxi; tio; F; Cl; Br; I; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCb; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; - o -GRG1 en donde G es -O-, -S-, -NRG2-, -C(=O)-, -S(=O)-, -SO2-, -C(=O)O-, -C(=O)NRG2-, -OC(=O)-, -NRG2C(=O)-, -OC(=O)O-, -OC(=O)NRG2-, -NRG2C(=O)O-, -NRG2C(=O)NRG2-, -C(=S)-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)S-, -C(=NRG2)-, -C(=NRG2)O-, -C(=NRG2)NRG3-, -OC(=NRG2)-, -NRG2C(=NRG3)-, -NRG2SO2-, -NRG2SO2NRG3- o -SO2NRG2-, en donde cada aparición de RG1, RG2 y RG3 incluye de manera independiente, pero sin limitación, hidrógeno, halógeno o un resto alifático, aromático o arilo opcionalmente sustituido. Se apreciará que los sistemas de anillos cíclicos cuando están presentes como sustituyentes pueden unirse opcionalmente a través de un resto lineal. Las combinaciones de sustituyentes y variables previstas por la presente invención son preferentemente las que dan como resultado la formación de compuestos estables útiles en uno cualquiera o más de los métodos descritos en el presente documento, p. ej., útiles para el tratamiento de uno o más trastornos y/o para entrar en contacto con una célula, tejido u órgano, como se describe en el presente documento, y/o útiles como intermedios en la fabricación de uno o más de dichos compuestos.
L puede comprender uno o más de cualquiera de los restos descritos en el párrafo anterior. L puede comprender dos o más restos diferentes unidos entre sí para formar una estructura que normalmente tiene una longitud de entre 1 y aproximadamente 60 átomos, entre 1 y aproximadamente 50 átomos, p. ej., entre 1 y 40, entre 1 y 30, entre 1 y 20, entre 1 y 10 o entre 1 y 6 átomos, donde la longitud se refiere al número de átomos en la cadena principal (la más larga). L puede comprender dos o más restos diferentes unidos entre sí para formar una estructura que normalmente tiene entre 1 y aproximadamente 40, p. ej., entre 1 y 30, p. ej., entre 1 y 20, entre 1 y 10 o entre 1 y 6 átomos de carbono en la cadena principal (la más larga). En general, la estructura de dicho análogo de compstatina reactivo con células se puede representar mediante la fórmula A-(LPj)jM, en donde j es normalmente entre 1 y 10 y cada LPj se selecciona de manera independiente entre los restos descritos en el párrafo anterior. L puede comprender una o más cadenas que contienen carbono tales como -(CH2)m- y/o -(O-CH2-CH2-)n, que están unidos covalentemente entre sí y/o con un grupo funcional reactivo con células o análogo de compstatina, p. ej., por restos (p. ej., restos de amida, éster o éter) que resultan de la reacción de dos grupos funcionales reactivos compatibles. L puede comprender un resto oligo(etilenglicol) y/o una cadena de alquilo saturada. L puede comprender -(CH2)m-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n(CH2)pC(=O)- o -(CH2)m-C(=O)-NH-(CH2)p(OCH2CH2)nC(=O)-. Normalmente, m, n y p se seleccionan de modo que el número de carbonos en la cadena esté entre 1 y 500, p. ej., entre 2 y 400, entre 2 y 300, entre 2 y 200, entre 2 y 100, entre 2 y 50, entre 4 y 40, entre 6 y 30 o entre 8 y 20. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 500 y/o p es entre 2 y 10. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 400 y/o p es entre 2 y 10. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 300 y/o p es entre 2 y 10. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 200 y/o p es entre 2 y 10. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 100 y/o p es entre 2 y 10. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 50 y/o p es entre 2 y 10. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 25 y/o p es entre 2 y 10. Normalmente, m es entre 2 y 10, n es entre 1 y 8 y/o p es entre 2 y 10. Opcionalmente, al menos un -CH2- se reemplaza por CH-R, en donde R puede ser cualquier sustituyente. Opcionalmente, al menos un -CH2- se reemplaza por un resto de heteroátomo, sistema de anillo cíclico, amida, éster o éter. Normalmente, L no comprende un grupo alquilo que tiene más de 3 átomos de carbono en la cadena más larga. Normalmente, L no comprende un grupo alquilo que tiene más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 átomos de carbono en la cadena más larga.
A puede comprender un grupo funcional reactivo con células J y un conector L1 que comprende una parte de unión LP1 y un grupo funcional reactivo que reacciona con el análogo de compstatina para generar A-M. Se puede usar un conector bifuncional L2 que comprende dos grupos funcionales reactivos y una parte de unión LP2. Los grupos funcionales reactivos de L reaccionan con grupos funcionales reactivos adecuados de A y M para producir un análogo de compstatina reactivo con células A-L-M. El análogo de compstatina puede comprender un conector L3 que comprende una parte de unión LP3. Por ejemplo, como se analiza más adelante, un conector que comprende un grupo funcional reactivo puede estar presente en el extremo N o C o un resto que comprende un grupo funcional reactivo puede estar unido con el extremo N o C a través de un conector. Por tanto, L puede contener múltiples partes de unión LP a las que contribuyen, p. ej., A, conector(es) usado(s) para unir A y M y/o el análogo de compstatina. Se entenderá que, cuando están presentes en la estructura A-L-M, determinado(s) grupo(s) funcional(es) reactivo(s) presente(s) antes de la reacción en L1, L2, L3, etc., habrán experimentado reacción, de modo que solo una parte de dicho(s) grupo(s) funcional(es) reactivo(s) estará presente en la estructura final A-L-M y el compuesto contendrá restos formados por reacción de dichos grupos funcionales. En general, si un compuesto contiene dos o más partes de unión, las partes de unión pueden ser iguales o diferentes y pueden seleccionarse de manera independiente. Múltiples partes de unión LP se pueden unir entre sí para formar una parte de unión L mayor y al menos algunas de dichas partes de unión pueden tener uno o más análogos de compstatina y/o grupos funcionales reactivos con células unidos con los mismos. Los análogos de compstatina pueden ser iguales o diferentes y, si son diferentes, se pueden seleccionar de manera independiente. Lo mismo es válido para las partes de unión y grupos funcionales reactivos. La invención abarca el uso de análogos de compstatina multivalentes que comprenden uno o más grupos funcionales reactivos con células y el uso de concatámeros de análogos de compstatina que comprenden uno o más grupos funcionales reactivos con células. Al menos un enlace puede ser un enlace estable no covalente, tal como un enlace de biotina/(estrept)avidina u otro enlace no covalente de fuerza aproximadamente equivalente.
Un análogo de compstatina reactivo con células puede comprender un análogo de compstatina en el que cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 71, 72, 73, 74 o 75 se extiende en uno o más aminoácidos en el extremo N, extremo C o ambos, en donde al menos uno de los aminoácidos tiene una cadena lateral que comprende un grupo funcional reactivo tal como una amina primaria o secundaria, un grupo sulfhidrilo, un grupo carboxilo (que puede estar presente como un grupo carboxilato), un grupo guanidino, un grupo fenol, un anillo de indol, un tioéter o un anillo de imidazol. El o los aminoácidos pueden ser L-aminoácidos. Uno cualquiera o más del o los aminoácidos puede ser un D-aminoácido. Si se añaden múltiples aminoácidos, los aminoácidos pueden seleccionarse de manera independiente. El grupo funcional reactivo (p. ej., una amina primaria o secundaria) puede usarse como una diana para la adición de un resto que comprende un grupo funcional reactivo con células. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral que comprende una amina primaria o secundaria incluyen lisina (Lys) y ácidos diaminocarboxílicos de estructura general NH2(CH2)nCH(NH2)COOH tales como ácido 2,3-diaminopropiónico (dapa), ácido 2,4-diaminobutírico (daba) y ornitina (orn), en donde n = 1 (dapa), 2 (daba) y 3 (orn), respectivamente. Al menos un aminoácido puede ser cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, tirosina, triptófano, metionina o histidina. La cisteína tiene una cadena lateral que comprende un grupo sulfhidrilo. El ácido aspártico y el ácido glutámico tienen una cadena lateral que comprende un grupo carboxilo (ionizable a un grupo carboxilato). La arginina tiene una cadena lateral que comprende un grupo guanidino. La tirosina tiene una cadena lateral que comprende un grupo fenol (ionizable a un grupo fenolato). El triptófano tiene una cadena lateral que comprende un anillo de indol que incluye, p. ej., triptófano. La metionina tiene una cadena lateral que comprende un grupo tioéter que incluye, p. ej., metionina. La histidina tiene una cadena lateral que comprende un anillo de imidazol. Hay disponible una amplia diversidad de aminoácidos no convencionales que tienen cadenas laterales que comprenden uno o más de dichos grupos funcionales reactivos, incluyendo aminoácidos de origen natural y aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza. Véase, p. ej., Hughes, B. (ed.), Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry, volúmenes 1-4, Wiley-VCH (2009-2011); Blaskovich, M., Handbook on Syntheses of Amino Acids General Routes to Amino Acids, Oxford University Press, 2010. Se pueden usar uno o más aminoácidos no convencionales para proporcionar una diana para la adición de un resto que comprende un grupo funcional reactivo con células. Uno cualquiera o más de los aminoácidos se pueden proteger según sea adecuado durante la síntesis del compuesto. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden estar protegidos durante la(s) reacción(ones) que implica(n) la cadena lateral de aminoácido diana. En donde un aminoácido que contiene sulfhidrilo se usa como diana para la adición de un resto que comprende un grupo funcional reactivo con células, el sulfhidrilo puede protegerse mientras que el compuesto se cicla mediante la formación de un enlace disulfuro intramolecular entre otros aminoácidos tales como cisteínas.
En el análisis en este párrafo, se usa como ejemplo un aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo amina. De manera análoga, se puede usar un aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo funcional reactivo diferente. Un aminoácido que tiene una cadena lateral que comprende una amina primaria o secundaria puede unirse directamente con el extremo N o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 71,72, 73, 74 o 75 o mediante un enlace peptídico. Un aminoácido que tiene una cadena lateral que comprende una amina primaria o secundaria puede unirse con el extremo N o C de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75 o mediante una parte de unión, que puede contener uno cualquiera o más de los restos de unión descritos anteriormente. Se pueden adjuntar al menos dos aminoácidos a uno o ambos extremos. Los dos o más aminoácidos adjuntos pueden unirse entre sí mediante enlaces peptídicos o al menos algunos de los aminoácidos adjuntos pueden unirse entre sí mediante una parte de enlace, que puede contener uno cualquiera o más de los restos de unión descritos en el presente documento. Por tanto, un análogo de compstatina reactivo con células puede comprender un resto análogo de compstatina M de fórmula B1-R1-M1-R2-B2, en donde M1 representa cualquiera de las Se Q ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75, bien R1 o bien R2 pueden estar ausentes, al menos uno de R1 y R2 comprende un aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene una amina primaria o secundaria y B1 y B2 son opcionalmente restos bloqueantes presentes. R1 y/o R2 pueden unirse con M1 mediante un enlace peptídico o un enlace no peptídico. R1 y/o R2 pueden comprender una parte de unión LP3. Por ejemplo, R1 puede tener la fórmula M2-LP3 y/o r 2 puede tener la fórmula LP3-M2 en donde LP3 es una parte de unión y M2 comprende al menos un aminoácido que tiene una cadena lateral que comprende una amina primaria o secundaria. Por ejemplo, M2 puede ser Lys o una cadena de aminoácidos que comprende Lys. LP3 puede comprender o consistir en uno o más aminoácidos. Por ejemplo, LP3 puede tener entre 1 y aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, p. ej., entre 4 y 20 aminoácidos de longitud. LP3 puede comprender o consistir en múltiples residuos de Gly, Ser y/o Ala. En ocasiones, LP3 no comprende un aminoácido que comprende un grupo SH reactivo, tal como Cys. En ocasiones, LP3 comprende un resto de oligo(etilenglicol) y/ o una cadena de alquilo saturada. En ocasiones, LP3 está unido al aminoácido N-terminal de M1 a través de un enlace amida. En ocasiones, LP3 está unido al aminoácido C-terminal de M1 a través de un enlace amida. El compuesto puede extenderse adicionalmente en uno o ambos extremos mediante la adición de parte(s) de unión y/o aminoácido(s) adicional(es). Los aminoácidos pueden ser iguales o diferentes y, si son diferentes, se pueden seleccionar de manera independiente. Se pueden usar dos o más aminoácidos que tengan cadenas laterales que comprenden grupos funcionales reactivos, en donde los grupos funcionales reactivos pueden ser iguales o diferentes. Los dos o más grupos funcionales reactivos pueden usarse como dianas para la adición de dos o más restos. En ocasiones, se añaden dos o más restos reactivos con células. En ocasiones, se añaden un resto reactivo con células y un resto de direccionamiento. En ocasiones, un conector y/o resto reactivo con células se unen con una cadena lateral de aminoácidos después de la incorporación del aminoácido en una cadena peptídica. En ocasiones, un conector y/o un resto reactivo con células ya está unido con la cadena lateral de aminoácidos antes del uso del aminoácido en la síntesis de un análogo de compstatina reactivo con células. Por ejemplo, se puede usar un derivado de Lys que tenga un conector unido con su cadena lateral. El conector puede comprender un grupo funcional reactivo con células o puede modificarse posteriormente para comprender un grupo funcional reactivo con células.
Determinados análogos de compstatina reactivos con células se describen con más detalle a continuación. En el siguiente análisis, un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr (SEQ ID NO: 37) (correspondiente al análogo de compstatina de SEQ ID NO: 28, en donde los asteriscos en la SEQ ID NO: 37 representan cisteínas unidas por un enlace disulfuro en el compuesto activo y (1Me)Trp representa 1-metil-triptófano), se usa como un resto análogo de compstatina ilustrativo; maleimida (abreviado Mal) se usa como un ejemplo de un grupo funcional reactivo con células; (CH2)m y (O-CH2-CH2)n se usan como ejemplos de partes de unión; la lisina se usa como ejemplo de un aminoácido que comprende un grupo funcional reactivo (en algunos compuestos) y acetilación y amidación de los extremos N y C, respectivamente, se usan como restos bloqueantes ilustrativos opcionalmente presentes en algunos compuestos y se representan en cursiva, es decir, como Ac y NH2 respectivamente. Se apreciará que los compuestos se pueden preparar usando diversos enfoques sintéticos y usando diversos precursores.
El resto reactivo con células puede ser proporcionado por un compuesto reactivo con células que comprende un grupo maleimida (como un grupo funcional reactivo con células) y un ácido alcanoico (RCOOH), donde R es un grupo alquilo. Por ejemplo, se puede usar ácido 6-malemeidocaproico (Mal-(CH2)5-COOH), representado a continuación.
El resto reactivo con células puede ser proporcionado por un derivado de un ácido alcanoico en el que se ha activado el resto de ácido carboxílico, p. ej., el resto OH se ha convertido en un grupo saliente mejor. Por ejemplo, el grupo carboxilo del compuesto I puede reaccionar con EDC, seguido de reacción con NHS (que opcionalmente se puede proporcionar como sulfo-NHS soluble en agua), dando como resultado un derivado de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-maleimidocaproico, es decir, éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de ácido 6-maleimidohexanoico (representado a continuación).
Figure imgf000027_0001
El compuesto de la SEQ ID NO: 37 puede modificarse en el extremo N y/o C para generar un análogo de compstatina reactivo con células. Por ejemplo, el compuesto II puede usarse para generar el siguiente análogo de compstatina reactivo con células mediante reacción con el grupo amino N-terminal de Ile.
Maleimida-(CH2)5-C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 38). Se apreciará que en la SEQ ID NO: 38 el resto -C(=O) está unido al aminoácido C-terminal inmediato (Ile), a través de un enlace C-N, en donde el N es parte del aminoácido y no se muestra.
Un grupo maleimida puede estar unido a Thr en el extremo C, lo que da como resultado el siguiente análogo de compstatina reactivo con células:
Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(C=O)-(CH2)5-maleimida (SEQ ID NO: 39).
Se puede sintetizar un análogo de compstatina reactivo con células usando un conector bifuncional (p. ej., un conector heterobifuncional). Se muestran a continuación un conector heterobifuncional ilustrativo que comprende restos de (CH2-CH2-O)n y (CH2)m (donde m=2):
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El compuesto III comprende un grupo maleimida como grupo funcional reactivo con células y un resto de éster de NHS que reacciona fácilmente con un grupo amino (p. ej., un grupo amino N-terminal o un grupo amino de una cadena lateral de aminoácidos).
Se puede usar una realización de compuesto III en la que n = 2 para generar el siguiente análogo de compstatina reactivo con células usando el análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 37:
Maleimida-(CH2)2-C(=O)-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 40)
Se apreciará que en el compuesto de la SEQ ID NO: 40 un resto -C(=O) está unido con el aminoácido N-terminal (residuo Ile a través de un enlace C-N, en donde el N es parte del aminoácido y no se muestra. Un conector puede tener la fórmula del compuesto III en donde n > 1. Se proporcionan en el presente documento valores ilustrativos para n en un resto (CH2-CH2-O)n.
La cadena de alquilo que une el resto de maleimida con el resto de la molécula puede contener más o menos unidades de metileno, el resto de oligo(etilenglicol) puede contener más o menos unidades de etilenglicol y/o puede haber más o menos unidades de metileno que flanquean uno o ambos lados del resto de oligo(etilenglicol), en comparación con el compuesto de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 40. A continuación se presentan ejemplos de análogos de compstatina reactivos con células que ilustran algunas de dichas variaciones (s Eq ID NO: 41-46):
Maleimida-(CH2)2-C(=O)-NH-CH2CH2OCH2CH2C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 41)
Maleimida-(CH2)3-C(=O)-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 42)
Maleimida-(CH2)5-C(=O)-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2C(=O)-Ne-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 43)
Maleimida-(CH2)4-C(=O)-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2C(=O)-Ne-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 44)
Maleimida-(CH2)2-C(=O)-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2C(=O)-Ne-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 45)
Maleimida-(CH2)5-C(=O)-NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2C(=O)-Ne-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 46)
La SEQ ID NO: 37 puede extenderse para comprender un residuo de Lys en el extremo N o C del péptido, p. ej., como se ilustra a continuación para un enlace C-terminal:
Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 47).
Se puede unir un residuo de Lys con el extremo N o C de la SEQ ID NO: 37 a través de un conector peptídico, p. ej., como se ilustra a continuación para un enlace C-terminal:
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)5-Lys-
NH2 (SEQ ID NO: 48).
Se puede añadir un conector que comprende una amina primaria o secundaria al extremo N o C de un análogo de compstatina. El conector puede comprender una cadena de alquilo y/o un resto de oligo(etilenglicol). Por ejemplo, se puede usar NH2(CH2CH2O)nCH2C(=O)OH (p. ej., ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (AEEAc) o ácido 11-amino-3,6,9-trioxaundecanoico) o un éster de NHS del mismo (p. ej., un éster de NHS de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico o ácido 11-amino-3,6,9-trioxaundecanoico). El compuesto resultante es el siguiente (en donde la parte aportada por el conector se muestra en negrita):
NH2(CH2)5C(=0)-Ile-Cys-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-
Thr-M /2 (SEQ ID NO: 49)
NH2(CH2CH20)2CH2C(=0)-Ile-Cys-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-
Arg-Cys-Thr-Mft (SEQ ID NO: 50)
Se puede unir un residuo de Lys con el extremo N o C de la SEQ ID NO: 37 a través de un conector que comprende una parte no peptídica. Por ejemplo, el conector puede comprender una cadena de alquilo, cadena de oligo(etilenglicol) y/o sistema de anillo cíclico. Se puede usar 8-AEEAc o un éster de NHS del mismo, que da como resultado (en el caso de la unión de Lys en el extremo C) el siguiente compuesto (en donde la parte aportada por 8-AEEAc se muestra en negrita):
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr -NEL
CH2CH20CH2CH20CH2-C(=0)-Lys-iVH2 (SEQ ID NO: 51)
Se apreciará que en las SEQ ID NO: 49 y 50, un resto -C(=O) está unido con el residuo de Ile adyacente a través de un enlace C-N, en donde el N es parte del aminoácido y no se muestra. De manera similar, en la SEQ ID NO: 51, un resto -C(=O) está unido con el residuo de Lys adyacente a través de un enlace C-N, en donde el N es parte del aminoácido y no se muestra. También se apreciará que en la SEQ ID NO: 51 el resto de NH está unido con el aminoácido N-terminal inmediato (Thr), a través de un enlace C-N, en donde el C es el carbono carbonílico del aminoácido y no se muestra.
Los compuestos de las SEQ ID NO: 47-51 pueden modificarse fácilmente en el grupo de amina primaria para producir un análogo de compstatina reactivo con células. Por ejemplo, los compuestos de las SEQ ID NO: 47-51 (u otros compuestos que comprenden una amina primaria o secundaria y un resto análogo de compstatina) pueden hacerse reaccionar con éster N-succinimidílico del ácido 6-maleimidocaproico para producir los siguientes análogos de compstatina reactivos con células:
AoIle-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-
(C(=0)-(CH2)5-Mal)-jVH2 (SEQ ID NO: 52).
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)5-Lys-
-(C(=0)-(CH2)5-Mal)-jVH2 (SEQ ID NO: 53).
Mal-(CH2)5-(C(=0)-NH(CH2)5C(=0)-Ile-Cys-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-
Ala-His-Arg-Cys-Thr-iVík (SEQ ID NO: 54)
Mal-(CH2)5-(C(=0)NH(CH2CH20)2CH2C(=0)-Ile-Cys-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp
Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-Aft (SEQ ID NO: 55)
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr -NH-
CH2CH20CH2CH20CH2-C(=0)-Lys-(C(=0)-(CH2)5-Mal)-AH2 (SEQ ID NO: 56)
Un análogo de compstatina reactivo con células se puede representar como: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O)-CH2(OCH2CH2)2NH(C(=O)-(CH2)5-Mal)-WH2 (SEQ ID NO: 57).
Se describen en el presente documento variantes de las SEQ ID NO: 38-57 en las que -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- se reemplaza por una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquier otro análogo de compstatina, p. ej., de cualquiera de las s Eq ID NO 3-27 o 29-36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75, con la condición de que el(los) resto(s) bloqueante(s) presente(s) en los extremos N y/o C de un análogo de compstatina puede(n) estar ausente(s), reemplazado por un conector (que puede comprender un resto bloqueante) o unido con un aminoácido N o C-terminal diferente presente en la(s) variante(s) correspondiente(s).
Otros reticuladores bifuncionales que comprenden una maleimida como un resto reactivo con células y un éster de NHS como un resto reactivo con amina incluyen, p. ej., 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB); 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC); éster de N-Y-maleimidobutiril-oxisuccinimida (GMBS). La adición de un sulfonato al anillo de NHS da como resultado análogos solubles en agua, tales como (4-yodoacetil)-aminobenzoato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SlAB), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SMPB), éster de sulfo-N-Y-maleimidobutiril-oxisuccinimida (sulfo-GMBS), etc., que puede evitar la necesidad de un disolvente orgánico. Se puede usar una versión de cadena larga de cualquiera de los anteriores, que comprende una rama espaciadora entre el resto de éster de NHS y el resto de la molécula. El espaciador puede comprender, p. ej., una cadena de alquilo. Un ejemplo es succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi-[6-amidocaproato].
Se puede usar un conector bifuncional que comprende un éster de NHS (como un resto reactivo con amina) y un grupo de yodoacetilo (reactivo con grupos sulfhidrilo). Dichos conectores incluyen, p. ej., (4-yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB); 6-[(yodoacetil)-amino]hexanoato de succinimidilo (SIAX); 6-[6-(((yodoacetil)amino)-hexanoil)amino]hexanoato de succinimidilo (SIAXX); 4-((yodoacetil)amino)metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SIAC); 6-((((4-(yodoacetil)amino)metil-ciclohexano-1-carbonil)amino)hexanoato de succinimidilo (SIACX);
Se puede usar un conector bifuncional que comprende un éster de NHS (como un resto reactivo con amina) y un grupo de piridil disulfuro (como un resto reactivo con células con grupos sulfhidrilo). Los ejemplos incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP); succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno (SMPT) y versiones que comprenden un sulfonato en el anillo de NHS y/o un espaciador que comprende una cadena de alquilo entre el resto de éster de NHS y el resto de la molécula (p. ej., 6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato de succinimidilo) (LC-SPDP). Podrían usarse variaciones de dichos conectores que incluyen restos adicionales o diferentes. Por ejemplo, se podría usar una cadena de alquilo más larga o más corta en un espaciador o un resto de oligo(etilenglicol) en lugar de una cadena de alquilo.
En general, se puede sintetizar un análogo de compstatina reactivo con células usando diversos enfoques. Los compuestos reactivos con células que comprenden un grupo funcional reactivo con células y un conector se puede obtener con frecuencia como componentes básicos preformados. Por ejemplo, el ácido 6-maleimidocaproico y el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-maleimidocaproico se pueden comprar de diversos proveedores. Como alternativa, dichos compuestos pueden sintetizarse usando métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Keller O, Rudinger J. Helv Chim Acta. 58 (2): 531-41, 1975 y Hashida S, et al., J Appl Biochem., 6 (1-2): 56-63, 1984. Véase también, Hermanson, G., mencionado anteriormente, y referencias en el mismo, para análisis de métodos y reactivos de uso para sintetizar conjugados. En general, la divulgación abarca cualquier método de producción de un compuesto que comprenda un resto análogo de compstatina y un grupo funcional reactivo con células y los compuestos resultantes.
Un aminoácido que tiene un conector unido con una cadena lateral se puede usar en la síntesis de un péptido lineal. El péptido lineal puede sintetizarse usando métodos convencionales para la síntesis de péptidos conocidos en la técnica, p. ej., síntesis convencional de péptidos de fase sólida. El péptido lineal se cicla después (p. ej., por oxidación de los residuos de Cys para formar un disulfuro intramolecular). El compuesto cíclico puede hacerse reaccionar después con un conector que comprende un grupo funcional reactivo con células. Un resto que comprende un grupo funcional reactivo con células puede hacerse reaccionar con un compuesto lineal antes de la ciclación del mismo. En general, los grupos funcionales reactivos pueden protegerse adecuadamente para evitar reacciones indeseadas entre sí durante la síntesis de un análogo de compstatina reactivo con células. El grupo funcional reactivo con células, cualquiera de las cadenas laterales de aminoácidos y/o uno o ambos extremos del péptido pueden protegerse durante la reacción y desprotegerse posteriormente. Por ejemplo, los grupos SH de residuos de Cys y/o restos reactivos con SH tales como maleimidas pueden protegerse hasta después de la ciclación para evitar la reacción entre ellos. Las condiciones de reacción se seleccionan en función de, al menos en parte, los requisitos del (de los) grupo(s) funcional(es) reactivo(s) particular(es) para lograr rendimiento razonable en un periodo de tiempo razonable. La temperatura, el pH y la concentración de los reactivos se pueden ajustar para lograr el grado o la velocidad de reacción deseados. Véase, p. ej., Hermanson, mencionado anteriormente. El producto deseado se puede purificar, p. ej., para eliminar el compuesto que no ha reaccionado que comprende el grupo funcional reactivo con células, análogo de compstatina que no ha reaccionado, conector(es), productos distintos del análogo de compstatina reactivo con células deseado que pueden haberse generado en la reacción, otras sustancias presentes en la mezcla de reacción, etc. Se desvelan en el presente documento composiciones y métodos para fabricar los análogos de compstatina reactivos con células e intermedios en la síntesis.
En la invención, el análogo de compstatina de acción prolongada comprende un resto reductor de la eliminación que comprende un polímero y unido con dos restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida. El (los) conector(es) descrito(s) anteriormente puede(n) usarse en la producción de dichos análogos de compstatina. Los análogos de compstatina de acción prolongada comprenden un resto tal como una cadena de polietilenglicol (PEG) u otro(s) polímero(s) que, p. ej., estabiliza el compuesto, aumenta su vida útil en el cuerpo, aumenta su solubilidad, disminuye su inmunogenicidad y/o aumenta su resistencia a la degradación. Sin limitar la invención de ninguna manera, dicho resto se denomina en el presente documento "resto reductor de la eliminación" (CRM) y un análogo de compstatina que comprende dicho resto se denomina, por lo tanto, un "análogo de compstatina de acción prolongada". En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada tiene una semivida plasmática promedio de al menos 1 día, p. ej., 1 - 3 días, 3 - 7 días, 7 - 14 días o 14 - 28 días, cuando se administra IV a una dosis de 10 mg/kg a seres humanos o a primates no humanos, o una dosis de aproximadamente 1-3 mg/kg, 3-5 mg/kg, 5­ 10 mg/kg, p. ej., 7 mg/kg. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada tiene una semivida plasmática promedio de al menos 1 día, p. ej., 1 - 3 días, 3 - 7 días, 7 - 14 días o 14 - 28 días, cuando se administra por vía subcutánea a, p. ej., una dosis de aproximadamente 1-3 mg/kg, 3-5 mg/kg, 5-10 mg/kg, p. ej., 7 mg/kg a seres humanos o primates no humanos. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada tiene una semivida promedio en plasma (p. ej., una semivida terminal) de entre aproximadamente 4-10, 5­ 9, 5-8, 6-9, 7-9 u 8-9 días, p. ej., aproximadamente 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 días cuando se administra por vía intravenosa a, p. ej., una dosis de aproximadamente 1-3 mg/kg, 3-5 mg/kg o 5-10 mg/kg, p. ej., 7 mg/kg a seres humanos o primates no humanos. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada tiene una semivida promedio en plasma (p. ej., una semivida terminal) de entre aproximadamente 4-10, 5­ 9, 5-8, 6-9, 7-9 u 8-9 días, p. ej., aproximadamente 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 días, cuando se administra por vía subcutánea a, p. ej., una dosis de aproximadamente 1-3 mg/kg, 3-5 mg/kg, 5-10 mg/kg, p. ej., 7 mg/kg a seres humanos o primates no humanos. En determinadas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada se caracteriza por que se absorbe ampliamente desde el sitio de administración durante el periodo de tiempo después de la inyección subcutánea y proporciona, p. ej., en el momento de administración o aproximadamente después de 1-2 días tras la administración, un nivel en sangre similar al que se alcanzaría si se administrara la misma cantidad de compuesto por vía intravenosa. En algunas realizaciones, el nivel en sangre en el momento de administración o después de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más días tras la administración de una dosis subcutánea está en a una distancia de aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % del nivel en sangre que se alcanzaría si se administrara la misma cantidad de compuesto por vía intravenosa. Véase, p. ej., figura 11, que muestra la farmacocinética de una dosis administrada por vía intravenosa y por vía subcutánea de un compuesto ilustrativo descrito en el presente documento después de aproximadamente 1-2 días después de la administración. En algunas realizaciones, la semivida promedio en plasma de un análogo de compstatina de acción prolongada después de la administración IV a una dosis de 10 mg/kg a seres humanos o primates no humanos aumenta en al menos un factor de 2, p. ej., en un factor de 2-5, 5-10, 10-50 o 50-100 veces o 100-150 veces o 150-200 veces en comparación con la de un análogo de compstatina correspondiente que tiene la misma secuencia de aminoácidos (y, si procede, uno o más restos bloqueantes) pero que no comprende el CRM. Se entenderá que en diversas realizaciones se puede observar dicho aumento de la semivida después de la administración a través de otras vías, tales como la administración subcutánea y/o usando otras dosis, p. ej., otras dosis descritas en el presente documento, p. ej., 20 mg/kg. Como se ha observado anteriormente, en algunas realizaciones, un análogo de compstatina de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 37A, 38A, 39A, 40A o 41A se extiende en uno o más aminoácidos en el extremo N, extremo C o ambos, en donde al menos uno de los aminoácidos tiene una cadena lateral que comprende un grupo funcional reactivo tal como una amina primaria o secundaria, un grupo sulfhidrilo, un grupo carboxilo (que puede estar presente como un grupo carboxilato), un grupo guanidino, un grupo fenol, un anillo de indol, un tioéter o un anillo de imidazol, que facilitan la conjugación con un grupo funcional reactivo para unir un CRM con el análogo de compstatina. Se entenderá que un análogo de compstatina correspondiente que no comprende el CRM también puede carecer de uno o más de dichos aminoácidos que están presentes en el análogo de compstatina de acción prolongada al que corresponde. Por tanto, se entenderá que un análogo de compstatina correspondiente que comprenda cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 37A, 38A, 39A, 40A o 41A y que carezca de un CRM "tiene la misma secuencia de aminoácidos" que las SEQ ID NO: 3-36, 37, 37A, 38A, 39A, 40A o 41A, respectivamente. Por ejemplo, se entenderá que un análogo de compstatina correspondiente que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 o 36 y que carece de un CRM "tiene la misma secuencia de aminoácidos" que las SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 o 36, respectivamente. En algunas realizaciones, una semivida en plasma es una semivida terminal después de la administración de una sola dosis IV. En algunas realizaciones, una semivida en plasma es una semivida terminal después de haberse alcanzado el estado estacionario después de la administración de múltiples dosis IV. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada logra una Cmáx en plasma al menos 5 veces mayor que la de un análogo de compstatina correspondiente que no comprende el CRM, p. ej., entre 5 y 50 veces mayor, después de la administración de una sola dosis IV a un primate o después de la administración de múltiples dosis IV. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada logra una Cmáx en plasma entre 10 y 20 veces mayor que la de un análogo de compstatina correspondiente que no comprende el CRM después de la administración de una sola dosis IV a un primate o después de la administración de múltiples dosis IV. En algunas realizaciones, un primate es humano. En algunas realizaciones, un primate es un primate no humano, p. ej., un mono, tal como un mono cinomolgo o un mono Rhesus. En algunas realizaciones, el aclaramiento renal de un análogo de compstatina de acción prolongada durante las primeras 24 horas después de la administración IV a una dosis de 10 mg/kg o 20 mg/kg a seres humanos o a primates no humanos se reduce en al menos un factor de 2, p. ej., en un factor de 2-5, 5-10, 10-50 o 50-100 veces o 100-150 veces o 150-200 veces en comparación con la eliminación renal de un análogo de compstatina correspondiente. Se entenderá que en diversas realizaciones se puede observar dicha reducción de la eliminación renal después de la administración a través de otras vías, tales como la administración subcutánea y/o usando otras dosis, p. ej., otras dosis descritas en el presente documento, p. ej., 20 mg/kg. La concentración de análogo de compstatina se puede medir en muestras de sangre y/u orina usando, p. ej., UV, HPLC, espectrometría de masas (MS) o anticuerpo para el CRM, o combinaciones de dichos métodos, tales como LC/MS o lC/MS/MS. Los parámetros farmacocinéticos tales como la semivida y el aclaramiento se pueden determinar usando métodos conocidos por los expertos habituales en la materia. Se puede realizar análisis farmacocinético, p. ej., con el software WinNonlin v 5.2 (Pharsight Corporation, San Luis, MO) u otros programas adecuados.
En determinadas realizaciones, un CRM es estable en condiciones fisiológicas durante al menos 24 horas o más. En determinadas realizaciones, un CRM es estable en plasma o suero de mamíferos, p. ej., primates, p. ej., seres humanos o primates no humanos (p. ej., mono), durante al menos 24 horas. En diversas realizaciones, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, de las moléculas de CRM permanecen intactas tras la incubación en condiciones fisiológicas durante 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 144 horas, 168 horas o más. En diversas realizaciones, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más, de las moléculas de CRM permanecen intactas tras su incubación en sangre, plasma o suero a 37 grados C durante 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 144 horas, 168 horas o más. La incubación se puede realizar usando un CRM a una concentración de entre 1 microgramo/ml y aproximadamente 100 mg/ml en diversas realizaciones. Las muestras pueden analizarse en diversos puntos temporales. El tamaño o la integridad se pueden evaluar usando, p. ej., cromatografía (p. ej., HPLC), espectrometría de masas, transferencia de Western o cualquier otro método adecuado. Dichas características de estabilidad pueden conferirse a un resto conjugado con el CRM. En diversas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada que comprende un CRM puede tener cualquiera de las características de estabilidad mencionadas anteriormente. En algunos aspectos, intacto con respecto a un análogo de compstatina de acción prolongada significa que el resto de análogo de compstatina permanece conjugado con el CRM y el tamaño del CRM permanece aproximadamente igual al inicio de la incubación o la administración.
En algunas realizaciones, un análogo de compstatina de acción prolongada tiene una actividad molar de al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, p. ej., entre 30 % y 40 %, entre 30 % y 50 %, entre 30 % y 60 %, entre 30 % y 70 %, entre 30 % y 80 %, entre 30 % y 90 %, o más, de la actividad de un análogo de compstatina correspondiente que tiene la misma secuencia de aminoácidos (y, si procede, uno o más restos bloqueantes) pero que no comprende CRM. En algunas realizaciones en donde un análogo de compstatina de acción prolongada comprende múltiples restos análogos de compstatina, la actividad molar del análogo de compstatina de acción prolongada es de al menos aproximadamente 10 %, 20 % o 30 %, p. ej., entre 30 % y 40 %, entre 30 % y 50 %, entre 30 % y 60 %, entre 30 % y 70 %, entre 30 % y 80 %, entre 30 % y 90 %, o más, de la suma de las actividades de dichos restos análogos de compstatina. En algunas realizaciones, un polietilenglicol (PEG) comprende un resto de (CH2CH2O)n que tiene un peso molecular de al menos 500 daltons. En algunas realizaciones, un conector descrito anteriormente comprende un resto de (CH2CH2O)n que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 500; 1.000; 1.500; 2.000; 5.000; 10.000; 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 60.000; 70.000; 80.000; 90.000; y 100.000 daltons. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio de un PEG es de al menos 20.000 daltons, hasta aproximadamente 100.000; 120.000; 140.000; 160.000; 180.000; o 200.000 daltons. El "peso molecular promedio" se refiere al peso molecular promedio en número. En algunas realizaciones, la polidispersidad D de un resto (CH2CH2O)n está entre 1,0005 y 1,50, p. ej., entre 1,005 y 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,40 o 1,50, o cualquier valor entre 1,0005 y 1,50.
En algunas realizaciones, un resto de (CH2CH2O)n es monodisperso y la polidispersidad de un resto (CH2CH2O)n es 1,0. Dichos restos de (CH2CH2O)n monodispersos son conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado de Quanta BioDesign (Powell, OH) e incluyen, a modo de ejemplo no limitante, restos monodispersos donde n es 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 o 24.
En algunas realizaciones, un compuesto comprende múltiples restos de (CH2CH2O)n en donde el peso molecular total de dichos restos de (CH2CH2O)n está entre aproximadamente 1.000; 5.000; 10.000; 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 60.000; 70.000; 80.000; 90.000; y 100.000 daltons. En algunas realizaciones, el peso molecular total promedio del compuesto o los restos de (CH2CH2O)n es de al menos 20.000 daltons, hasta aproximadamente 100.000; 120.000; 140.000; 160.000; 180.000; o 200.000 daltons. En algunas realizaciones, el compuesto comprende múltiples restos (CH2CH2O)n que tienen longitudes definidas, p. ej., n = 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 o 30 o más. En algunas realizaciones, el compuesto comprende un número suficiente de restos de (CH2CH2O)n que tienen longitudes definidas para dar como resultado un peso molecular total de dichos restos de (CH2CH2O)n de entre aproximadamente 1.000; 5.000; 10.000; 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 60.000; 70.000; 80.000; 90.000; y 100.000 daltons. En algunas realizaciones, el peso molecular total promedio del compuesto o los restos de (CH2CH2O)n es de al menos 20.000 daltons, hasta aproximadamente 100.000; 120.000; 140.000; 160.000; 180.000; o 200.000 daltons. En algunas realizaciones, n está entre aproximadamente 30 y aproximadamente 3000. En algunas realizaciones, un resto análogo de compstatina está unido a cada extremo de un PEG lineal. Se puede usar un PEG bifuncional que tenga un grupo funcional reactivo en cada extremo de la cadena, p. ej., como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, los grupos funcionales reactivos son idénticos, mientras que en algunas realizaciones están presentes diferentes grupos funcionales reactivos en cada extremo. Los restos de (CH2CH2O)n pueden tener una estructura ramificada. Las ramas pueden estar unidas con una cadena principal polimérica lineal (p. ej., como una estructura en forma de peine) o pueden emanar de uno o más grupos principales centrales, p. ej., como una estructura de estrella. Una molécula ramificada desvelada tiene de 3 a 10 cadenas (CH2CH2O)n. Una molécula ramificada desvelada tiene de 4 a 8 cadenas (CH2CH2O)n. Una molécula ramificada desvelada tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 cadenas (CH2CH2O)n. Una molécula en forma de estrella desvelada tiene 10-100, 10-50, 10-30 o 10-20 cadenas (CH2CH2O)n que emanan de un grupo principal central. Un análogo de compstatina de acción prolongada desvelado puede comprender, por tanto, p. ej., 3­ 10 restos análogos de compstatina, p. ej., 4-8 restos análogos de compstatina, cada uno unido con una cadena (CH2CH2O)n a través de un grupo funcional en el extremo de la cadena. Un análogo de compstatina de acción prolongada desvelado puede comprender, p. ej., 10-100 restos análogos de compstatina, cada uno unido con una cadena (CH2CH2O)n a través de un grupo funcional en el extremo de la cadena. Normalmente, las ramas (en ocasiones denominadas "brazos") de un PEG ramificado o en forma de estrella contienen aproximadamente el mismo número de restos (CH2CH2O). En ocasiones, al menos algunas de las longitudes de las ramas pueden diferir. Se entenderá que en algunos aspectos divulgados una o más de cadenas (CH2CH2O)n no tienen un resto análogo de compstatina unido a las mismas. En algunos aspectos divulgados, al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de las cadenas tienen un resto análogo de compstatina unido con las mismas.
En general y los compuestos representados en el presente documento, se extrae un resto de polietilenglicol con el átomo de oxígeno en el lado derecho de la unidad repetida o el lado izquierdo de la unidad repetida. En los casos en los que solo se dibuja una orientación, la presente invención abarca ambas orientaciones (es decir, (CH2CH2O)n y (OCH2CH2)n) de restos de polietilenglicol para un compuesto o género dado o en los casos en los que un compuesto o género contiene múltiples restos de polietilenglicol, todas las combinaciones de orientaciones están abarcadas por la presente divulgación.
A continuación se ilustran fórmulas de algunos PEG monofuncionales ilustrativos que comprenden un grupo funcional reactivo. Para fines ilustrativos, se representan fórmulas en las que el (los) grupo(s) funcional(es) reactivo(s) comprende(n) un éster de NHS, pero podrían usarse otros grupos funcionales reactivos, p. ej., como se ha descrito anteriormente. Los (CH2CH2O)n se representan terminando en el extremo izquierdo con un grupo metoxi (OCH3) pero se entenderá que las cadenas representadas a continuación y en cualquier otro lugar del presente documento pueden terminar con un resto OR diferente (p. ej., un grupo alifático, un grupo alquilo, un grupo alquilo inferior o cualquier otro grupo terminal PEG adecuado) o un grupo OH. También se apreciará que restos distintos de los representados pueden conectar los restos de (CH2CH2O)n con el grupo NHS.
Un PEG monofuncional ilustrativo es de fórmula A:
R10 ------(CH2CH20)n-------T Grupo funcional reactivo
Fórmula A
en donde "grupo funcional reactivo" y n son como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases en el presente documento;
R1 es hidrógeno, alifático o cualquier grupo final adecuado; y
T es un enlace covalente o una cadena de hidrocarburo C1 -12 lineal o ramificada en donde una o más unidades de carbono de T se reemplazan opcionalmente y de manera independiente por -O-, -S-, -N(Rx)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(Rx)C(O)-, -C(O)N(Rx)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(Rx)SO2- o -SO2 N(Rx)-; y cada RX es de manera independiente hidrógeno o C1 -6 alifático.
Los PEG monofuncionales ilustrativos de fórmula A incluyen:
Figure imgf000033_0001
Fórmula I
En la fórmula I, el resto que comprende el grupo funcional reactivo tiene la estructura general -CO-(CH2 )m-COO-NHS, donde m=2. Un PEG monofuncional puede tener la estructura de la fórmula I, donde m está entre 1 y 10, p. ej., entre 1 y 5. Por ejemplo, m puede ser 3, como se muestra a continuación:
Figure imgf000033_0002
Fórmula II
En la fórmula II, el resto que comprende el grupo funcional reactivo tiene la estructura general -(CH2 )m-COO-NHS, donde m=1. Un PEG monofuncional puede tener la estructura de la fórmula II, donde m está entre 1 y 10 (p. ej., en donde m es 5 como se muestra en la fórmula III a continuación) o en donde m es 0 (como se muestra a continuación en la fórmula IIIa).
Figure imgf000034_0001
Formula Illa
Un PEG lineal bifuncional comprende un resto que comprende un grupo funcional reactivo en cada uno de sus extremos. Los grupos funcionales reactivos pueden ser iguales (homobifuncionales) o diferentes (heterobifuncionales). La estructura de un PEG bifuncional puede ser simétrica, en donde se usa el mismo resto para conectar el grupo funcional reactivo con átomos de oxígeno en cada extremo de la cadena -(CH2 CH2 O)n. Se pueden usar diferentes restos para conectar los dos grupos funcionales reactivos con la parte de PEG de la molécula. Las estructuras de los PEG bifuncionales ilustrativos se representan a continuación. Para fines ilustrativos, se representan fórmulas en las que el (los) grupo(s) funcional(es) reactivo(s) comprende(n) un éster de NHS, pero podrían usarse otros grupos funcionales reactivos.
Un PEG lineal bifuncional puede ser de fórmula B:
Grupo funcional reactivo
Figure imgf000034_0002
Grupo funcional reactivo
Fórmula B
en donde cada T y "grupo funcional reactivo" es de manera independiente como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases del presente documento, y n es como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases del presente documento.
Los PEG bifuncionales ilustrativos de fórmula B incluyen:
Figure imgf000034_0003
Fórmula IV
En la fórmula IV, el resto que comprende el grupo funcional reactivo tiene la estructura general -(CH2 )m-COO-NHS, donde m=1. Un PEG bifuncional puede tener la estructura de la fórmula IV, donde m está entre 1 y 10, p. ej., entre 1 y 5. Cuando m es 0, el resto que comprende el grupo funcional reactivo tiene la estructura general -COO-NHS. Por ejemplo, Un PEG bifuncional puede tener la estructura de la fórmula IVa, como se muestra a continuación:
Figure imgf000035_0001
Fórmula V
En la fórmula V, el resto que comprende el grupo funcional reactivo tiene la estructura general -CO-(CH2 )m-COO-NHS, donde m=2. Dichos PEG bifuncionales tienen la estructura de la fórmula V, donde m está entre 1 y 10, p. ej., entre 1 y 5. Por ejemplo, m puede ser 2, como se muestra a continuación:
Figure imgf000035_0002
Fórmula Va
La presente invención proporciona un análogo de compstatina conjugado con un polímero. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona conjugados análogos de compstatina de compuestos que contienen PEG como se representa en el presente documento. Como se desvela en el presente documento, un grupo funcional (por ejemplo, un grupo amina, hidroxilo o tiol) en un análogo de compstatina puede hacerse reaccionar con un compuesto que contiene PEG que tiene un "grupo funcional reactivo" como se describe en el presente documento, para generar dichos conjugados. A modo de ejemplo, las fórmulas III y IV, respectivamente, puede formar conjugados análogos de compstatina que tienen la estructura:
Figure imgf000035_0004
en donde,
Figure imgf000035_0003
representa el punto de unión de un grupo amina en un análogo de compstatina. En determinadas realizaciones, un grupo amina es un grupo de cadena lateral de lisina.
Se apreciará que se pueden formar conjugados correspondientes con cualquiera de los compuestos que contienen PEG representados en el presente documento, dependiendo de la elección del grupo funcional reactivo y/o grupo funcional de compstatina. Por ejemplo, las fórmulas IVa y Va, respectivamente, pueden formar conjugados análogos de compstatina que tienen las siguientes estructuras
Figure imgf000036_0001
En determinadas realizaciones, el componente de PEG de dichos conjugados tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 20 kD-100 kD, aproximadamente 20 kD-90 kD, aproximadamente 20 kD-80 kD, aproximadamente 20 kD-70 kD, aproximadamente 20 kD-60 kD, aproximadamente 20 kD-50 kD, aproximadamente 30 kD-80 kD, aproximadamente 30 kD-70 kD, aproximadamente 30 kD-60 kD, aproximadamente 30 kD-50 kD, aproximadamente 30 kD-45 kD, aproximadamente 35 kD-50 kD, aproximadamente 35 kD-45 kD, aproximadamente 36 kD-44 kD, aproximadamente 37 kD-43 kD, aproximadamente 38 kD-42 kD o aproximadamente 39 kD-41 kD. En determinadas realizaciones, el componente de PEG de dichos conjugados tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kD. El término "bifuncional" o "bifuncionalizado" se usa en ocasiones en el presente documento para hacer referencia a un compuesto que comprende dos restos análogos de compstatina unidos con un CRM. Dichos compuestos pueden designarse con las letras "BF". En algunas realizaciones, un compuesto bifuncionalizado es simétrico. En algunas realizaciones, los enlaces entre el CRM y cada uno de los restos análogos de compstatina de un compuesto bifuncionalizado son iguales. En algunas realizaciones, cada enlace entre un CRM y un análogo de compstatina de un compuesto bifuncionalizado comprende un carbamato. En algunas realizaciones, cada enlace entre un CRM y un análogo de compstatina de un compuesto bifuncionalizado comprende un carbamato y no comprende un éster. En algunas realizaciones, cada análogo de compstatina de un compuesto bifuncionalizado está unido directamente con un CRM a través de un carbamato. En algunas realizaciones, cada análogo de compstatina de un compuesto bifuncionalizado está unido directamente con un CRM a través de un carbamato y el compuesto bifuncionalizado tiene la estructura:
Figure imgf000036_0002
En algunas realizaciones de fórmulas y realizaciones descritas en el presente documento,
Figure imgf000036_0003
representa el punto de unión de un grupo de cadena lateral de lisina en un análogo de compstatina que tiene la estructura:
en donde el símbolo " " indica el punto de unión de un resto químico con el resto de una molécula o fórmula química.
En algunos aspectos desvelados, un PEG ramificado, en peine o en forma de estrella comprende un resto que comprende un grupo funcional reactivo en el extremo de cada una de múltiples cadenas -(CH2 CH2 O)n. Los grupos funcionales reactivos pueden ser iguales o puede haber al menos dos grupos diferentes. Un PEG ramificada, en peine o en forma de estrella desvelado puede ser de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
en donde cada R2 es de manera independiente un "grupo funcional reactivo" o R1, y cada T, n y "grupo funcional reactivo" es de manera independiente como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases del presente documento. La estructura de los PEG ramificados ilustrativos (que tienen 8 brazos o ramas) que comprenden restos de NHS como grupos funcionales reactivos se representa a continuación:
Figure imgf000039_0001
Fórmula VII
La estructura de los PEG ramificados ilustrativos (que tienen 4 brazos o ramas) que comprenden restos de NHS como grupos funcionales reactivos se representa a continuación:
Figure imgf000039_0002
Fórmula IX
El número de ramas que emanan de la cadena principal puede variar. Por ejemplo, el número 4 en las fórmulas VI y VII anteriores puede cambiarse a cualquier otro número entero entre 0 y 10 en diversas realizaciones.
Un PEG ramificado desvelado tiene la estructura de la fórmula VII, VIII o IX (o variantes de las mismas con diferentes números de ramas) con la condición de que x sea
Figure imgf000040_0001
Un PEG ramificado desvelado tiene la estructura de la fórmula VII, VIII o IX (o variantes de las mismas con diferentes números de ramas) con la condición de que x sea
Figure imgf000040_0002
Por supuesto, el grupo metileno (CH2 ) en el resto x anterior puede comprender en su lugar una cadena de alquilo más larga (CH2 )m, donde m es hasta 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 o 30, o puede comprender uno o más restos adicionales descritos en el presente documento.
Se representan a continuación PEG ramificados desvelados que tienen grupos reactivos con NHS o maleimida:
Figure imgf000040_0003
En una variante desvelada de la fórmula X u XI, 3 o cada una de las 4 ramas comprenden un grupo funcional reactivo. Otros ejemplos más de PEG pueden representarse de la siguiente manera:
Figure imgf000041_0001
Fórmula XIII
Como se desvela aquí, se puede incorporar cualquiera de diversos restos entre el componente peptídico y el resto de (CH2CH2O)n-R de un análogo de compstatina de acción prolongada, tales como un alquilo lineal, éster, amida, anillo aromático (p. ej., un fenilo sustituido o no sustituido), una estructura de cicloalquilo sustituido o no sustituido, o combinaciones de los mismos. Dicho(s) resto(s) puede(n) hacer que el compuesto sea más susceptible a la hidrólisis, que puede liberar la parte peptídica del compuesto del CRM. Dicha liberación puede mejorar la penetración tisular in vivo y/o actividad del compuesto. La hidrólisis puede ser hidrólisis general (p. ej., ácido-base). La hidrólisis puede ser catalizada por enzimas, p. ej., catalizada por esterasa. Por supuesto, pueden producirse ambos tipos de hidrólisis. Los ejemplos de PEG que comprenden uno o más de dichos restos y un éster de NHS como grupo funcional reactivo son los siguientes:
Figure imgf000041_0002
Fórmula XVI
Un PEG ramificado (multi-rama) o PEG en forma de estrella desvelado puede comprender un núcleo de pentaeritritol, núcleo de hexaglicerina o núcleo de tripentaeritritol. Se entenderá que las ramas pueden no emanar de un solo punto.
Se pueden obtener PEG monofuncionales, bifuncionales, ramificados y otros que comprenden uno o más grupos funcionales reactivos de, p. ej., NOF America Corp. White Plains, NY o BOC Sciences 45-16 Ramsey Road Shirley, NY 11967, Estados Unidos, entre otros, o pueden prepararse usando métodos conocidos en la técnica.
En la invención, cada extremo del polímero reductor de la eliminación está unido con uno de los análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida. En algunas realizaciones, un enlace entre un CRM y un análogo de compstatina comprende un carbamato. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina está unido directamente con un CRM a través de un carbamato. En algunas realizaciones, un enlace entre un CRM y un análogo de compstatina no comprende un éster. En algunas realizaciones, un enlace entre un CRM y un análogo de compstatina comprende un carbamato y no comprende un éster. En algunas realizaciones, un enlace entre un CRM y un análogo de compstatina comprende un carbamato y no comprende un enlace que sea más susceptible a la hidrólisis en medio acuoso que un carbamato. En algunas realizaciones, el CRM comprende o consiste en un resto de PEG. En algunas realizaciones, un enlace entre un CRM y un análogo de compstatina comprende una amida. En algunas realizaciones, un análogo de compstatina está unido directamente con un CRM a través de una amida. En algunas realizaciones, un enlace entre un CRM y un análogo de compstatina comprende una amida y no comprende un éster. En algunas realizaciones, un enlace entre un CRM y un análogo de compstatina comprende una amida y no comprende un enlace que sea más susceptible que la hidrólisis en medio acuoso que una amida. En algunas realizaciones, el CRM comprende o consiste en un resto de PEG.
En algunas realizaciones, uno o más análogos de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido con un CRM mediante un enlace que comprende un carbamato. En algunas realizaciones, uno o más análogos de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido con un CRM mediante un enlace que no comprende un éster. En algunas realizaciones, uno o más análogos de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido con un CRM mediante un enlace que comprende un carbamato y no comprende un éster. En algunas realizaciones, uno o más análogos de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido con un CRM mediante un enlace que comprende un carbamato y no comprende un enlace que sea más susceptible a la hidrólisis en medio acuoso que un carbamato. En algunas realizaciones, cada análogo de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido directamente con un CRM a través de un carbamato.
En algunas realizaciones, el CRM comprende o consiste en un resto de PEG. En algunas realizaciones, uno o más análogos de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido con un CRM mediante un enlace que comprende una amida. En algunas realizaciones, uno o más análogos de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido con un CRM mediante un enlace que comprende una amida y no comprende un éster. En algunas realizaciones, uno o más análogos de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido con un CRM mediante un enlace que comprende una amida y no comprende un enlace que sea más susceptible a hidrólisis en medio acuoso que una amida. En algunas realizaciones, cada análogo de compstatina de un compuesto multifuncionalizado (p. ej., un compuesto bifuncionalizado, trifuncionalizado o funcionalizado más ampliamente) está unido directamente con un CRM a través de una amida. En algunas realizaciones, el CRM comprende o consiste en un resto de PEG.
En algunas realizaciones, el polímero comprendido en el análogo de compstatina de acción prolongada de la invención es distinto de PEG. En algunas realizaciones, un polímero es una polioxazolina (POZ). Se representan a continuación derivados de polioxazolina mono y polifuncionalizados ilustrativos para conjugación directa o para conjugación a través de un conector:
Z-T-[N(CORx)CH2CH2]n-T-R1;
R1-{[N(CO-T-Z)CH2CH2]m-[N(CORx)CH2CH2]n}a-T-R1;
R1-{[N(CO-T-Z1)CH2CH2]p-[N(CORx)CH2CH2]n-[N(CO-T-Z2)CH2CH2]m}a-T-R1;
R1-{[N(CO-T-Z1)CH2CH2]p-[N(CORx)CH2CH2]n-[N(CO-T-Z2)CH2CH2]m}a-T-Z;
R1-[N(CORx)CH2CH2]n-T-B(-R1)(-T-Z)-T-[N(CORx)CH2CH2]m-R1;
en donde:
cada uno de Z, Z1 y Z2 es de manera independiente un grupo funcional reactivo como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases del presente documento;
cada uno de T, RX y R1 es de manera independiente como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases del presente documento;
cada uno de m, n y p es de manera independiente un número entero de 0-1000, con la limitación de que la suma de m, n y p para cada fórmula no es 0;
a es "al", que indica un copolímero aleatorio o "bloque", que indica un copolímero en bloque;
B es un resto ramificado que está unido con o sin un conector con las otras partes del polímero.
Otros ejemplos de derivados de polioxazolina funcionalizados para conjugación se describen ampliamente en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en las publicaciones de solicitud de patente PCT n.° WO/2010/006282, WO/2009/089542, WO/2009/043027 y WO/2008/106186.
Se representan a continuación conjugados de análogos de compstatina ilustrativos con polímeros de polioxazolina:
A n á lo g o d e c o m p s ta tin a |----T-[N(CORX)CH2CH2]n-T-R1 *
Figure imgf000043_0001
en donde cada variable es de manera independiente como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases del presente documento.
Se desvela en el presente documento un análogo de compstatina conjugado con un polímero, en donde el análogo de compstatina está conectado con el polímero a través de uno o más conectores. El polímero puede seleccionarse de compuestos que contienen PEG descritos anteriormente y en las clases y subclases del presente documento. También se describen en el presente documento conjugados de análogos de compstatina de compuestos que contienen PEG representados en el presente documento, en donde el análogo de compstatina está conectado con los restos que contienen PEG a través de uno o más conectores. Los PEG mono y polifuncionales que comprenden uno o más grupos funcionales reactivos para la conjugación se han definido anteriormente y se describen en las clases y subclases del presente documento, incluyendo, pero sin limitación, los de fórmula A, I, la, II, III, Illa, B, IV, IVa, V, Va, C, D, E, F, G, H, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV o XVI.
Los conectores adecuados para conectar un análogo de compstatina y un resto polimérico tal como PEG o polioxazolina se han descrito ampliamente anteriormente y en las clases y subclases del presente documento. Habitualmente, un conector tiene múltiples grupos funcionales, en donde un grupo funcional está conectado con un análogo de compstatina y otro está conectado a un resto polimérico. Normalmente, un conector es un compuesto bifuncional. En algunas realizaciones, un conector tiene la estructura de NH2 (CH2 CH2 O)nCH2 C(=O)OH, en donde n es de 1 a 1000. En algunas realizaciones, un conector es el ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (AEEAc). En algunas realizaciones, se activa un conector para la conjugación con un resto polimérico o un grupo funcional de un análogo de compstatina. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grupo carboxilo de AEEAc se activa antes de la conjugación con el grupo amina de la cadena lateral de un grupo lisina.
Como se desvela en el presente documento, un grupo funcional adecuado (por ejemplo, un grupo amina, hidroxilo, tiol o ácido carboxílico) en un análogo de compstatina se puede usar para la conjugación con un resto polimérico, directamente o a través de un conector. Un análogo de compstatina puede conjugarse mediante un grupo amina con un resto de PEG a través de un conector. El grupo amina puede ser el grupo a-amino de un residuo de aminoácido. Un grupo amina puede ser el grupo amina de la cadena lateral de lisina. Un análogo de compstatina se puede conjugar con un resto de PEG mediante el grupo amino de una cadena lateral de lisina (grupo £-amino) a través de un conector que tiene la estructura de NH2 (CH2 CH2 O)nCH2 C(=O)OH, en donde n es de 1 a 1000. Un análogo de compstatina puede conjugarse con el resto de PEG mediante el grupo amino de una cadena lateral de lisina a través de un conector AEEAc. El conector NH2 (CH2 CH2 O)nCH2 C(=O)OH puede introducir un resto -NH(CH2 CH2 O)nCH2 C(=O)- en una cadena lateral de lisina de compstatina después de la conjugación. El conector AEEAc puede introducir un resto -NH(CH2 CH2 O)2 CH2 C(=O) en una cadena lateral de lisina de compstatina después de la conjugación.
Un análogo de compstatina puede conjugarse con un resto polimérico a través de un conector, en donde el conector comprende un resto de AEEAc y un residuo de aminoácido o en donde el conector comprende un resto de AEEAc y un residuo de lisina. Un polímero puede ser PEG. El extremo C de un análogo de compstatina puede estar conectado con el grupo amino de AEEAc y el extremo C de AEEAc puede estar conectado con un residuo de lisina. El extremo C de un análogo de compstatina puede estar conectado con el grupo amino de AEEAc y el extremo C de AEEAc puede estar conectado con el grupo a-amino de un residuo de lisina. El extremo C de un análogo de compstatina puede estar conectado con el grupo amino de AEEAc, el extremo C de AEEAc puede estar conectado con el grupo aamino del residuo de lisina y un resto polimérico, tal como un resto de PEG, se conjuga a través del grupo £-amino de dicho residuo de lisina. El extremo C del residuo de lisina puede modificarse, por ejemplo, mediante amidación. El extremo N de un análogo de compstatina puede modificarse, por ejemplo, el extremo N de un análogo de compstatina puede acetilarse.
A continuación se representan conjugados ilustrativos que comprenden un conector AEEAc y un polímero, en donde
Figure imgf000044_0001
representa el punto de unión de un grupo amina en un análogo de compstatina,
Figure imgf000044_0002
representa un análogo de compstatina que se une a través de su extremo C y en donde cada una de las otras variables es de manera independiente como se ha definido anteriormente y se describe en las clases y subclases con la presente. Un grupo amina puede ser el grupo amino de una cadena lateral de lisina.
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Un análogo de compstatina puede representarse como M-AEEAc-Lys-62, en donde B2 es un resto bloqueante, p. ej., NH2, M representa cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75, con la condición de que el aminoácido C-terminal de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75 se unen mediante un enlace peptídico con AEEAc-Lys-62. El resto de NHS de un PEG multifuncional (p. ej., bifuncional) reacciona con la amina libre de la cadena lateral de lisina para generar un análogo de compstatina de acción prolongada multifuncionalizado (múltiples restos análogos de compstatina). Como se desvela en el presente documento, cualquier aminoácido que comprenda una cadena lateral que comprenda un grupo funcional reactivo puede usarse en lugar de Lys (o además de Lys). Un PEG monofuncional o multifuncional que comprende un grupo funcional reactivo adecuado puede hacerse reaccionar con dicha cadena lateral de manera análoga a la reacción de PEG activados con éster de NHS con Lys.
Con respecto a cualquiera de las fórmulas y estructuras anteriores, debe entenderse que cuando el componente análogo de compstatina comprende cualquier análogo de compstatina descrito en el presente documento, p. ej., cualquier análogo de compstatina de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74, 75, se divulga expresamente. Por ejemplo, y sin limitación, un análogo de compstatina puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28. Un análogo de compstatina de acción prolongada ilustrativo en el que el componente análogo de compstatina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 se representa en la figura 10(C). Se entenderá que el resto de PEG puede tener diversos pesos moleculares diferentes o pesos moleculares promedio en diversas realizaciones, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, las cadenas individuales de PEG dentro de una preparación pueden variar en peso molecular y/o diferentes preparaciones pueden tener diferentes pesos moleculares promedio y/o polidispersidad, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el resto de p Eg en el compuesto de la figura 10(C) tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 20 kD -100 kD, aproximadamente 20 kD-90 kD, aproximadamente 20 kD-80 kD, aproximadamente 20 kD-70 kD, aproximadamente 20 kD-60 kD, aproximadamente 20 kD-50 kD, aproximadamente 30 kD-80 kD, aproximadamente 30 kD-70 kD, aproximadamente 30 kD-60 kD, aproximadamente 30 kD-50 kD, aproximadamente 30 kD-45 kD, aproximadamente 35 kD-50 kD, aproximadamente 35 kD-45 kD, aproximadamente 36 kD-44 kD, aproximadamente 37 kD-43 kD, aproximadamente 38 kD-42 kD o aproximadamente 39 kD-41 kD. En algunas realizaciones, el resto de PEG en el compuesto de la figura 10(C) tiene un peso molecular promedio entre aproximadamente 30 kD y aproximadamente 50 kD, p. ej., entre aproximadamente 35 kD y aproximadamente 45 kD, entre aproximadamente 37,5 kD y aproximadamente 42,5 kD. En determinadas realizaciones en las que el resto de PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kD, p. ej., 37,5 kD - 42,5 kD, 38 kD, 39 kD, 40 kD, 41 kD, 42 kD, el compuesto se denomina en ocasiones en el presente documento CA28-2TS-BF. En determinadas realizaciones, un compuesto que comprende un CRM, p. ej., un resto de PEG, que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 40 kD, p. ej., 37,5 kD - 42,5 kD, 38 kD, 39 kD, 40 kD, 41 kD, 42 kD, el compuesto tiene una semivida terminal de al menos aproximadamente 5 días, p. ej., aproximadamente 5-10 días, p. ej., aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 días, cuando se administra IV o por vía subcutánea a primates no humanos o seres humanos, p. ej., a una dosis de aproximadamente 1-3 mg/kg, 3-5 mg/kg o 5-10 mg/kg.
En algunas realizaciones de la invención, un análogo de compstatina comprende tanto un grupo funcional reactivo con células como un CRM. En el presente documento se desvelan variantes de las moléculas de cualquiera de los análogos de compstatina reactivos con células anteriormente mencionados en donde un grupo o resto funcional reactivo con células se reemplaza por un resto (CH2 CH2 O)n que tiene un peso molecular de al menos 500 daltons, p. ej., al menos 1.500 daltons hasta aproximadamente 100.000 daltons (p. ej., un peso molecular promedio de aproximadamente 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 60.000; 70.000; 80.000; 90.000; o 100.000 daltons). El peso molecular promedio del compuesto o los restos (CH2 CH2 O)n puede ser de al menos 20.000 daltons, hasta aproximadamente 100.000; 120.000; 140.000; 160.000; 180.000; o 200.000 daltons.
A continuación se exponen análogos de compstatina de acción prolongada ilustrativos, en donde n es suficiente para proporcionar un peso molecular promedio de entre aproximadamente 500; 1.000; 1.500; 2.000; 5.000; 10.000; 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 60.000; 70.000; 80.000; 90.000; y 100.000 daltons. Normalmente, n es suficiente para proporcionar un peso molecular promedio de entre aproximadamente 20.000 daltons, hasta aproximadamente 100.000; 120.000; 140.000; 160.000; 180.000; o 200.000 daltons.
(CH2CH20)nC(=0)-Ile-Cys-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-
Thr- NH2) (SEQ ID NO: 58)
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr -NH-
CH2CH20CH2CH20CH2-C(=0)-Lys-C(=0)-(CH2CH20)n-jVtf2 (SEQ ID NO: 59)
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=0)-
(CH2CH20)n -NH2 (SEQ ID NO: 60).
AoIle-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)5-Lys-
C(=0)-(CH2CH20)n-AH2 (SEQ ID NO: 61)
Ac-(CH2CH20)nC(=0)Lys-(Gly)5-Ile- Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-
Ala-His-Arg-Cys*-Thr - NH2) (SEQ ID NO: 62)
Ac-(CH2CH20)nC(=0)Lys-Ile- Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-
Arg-Cys*-Thr - NH2) (SEQ ID NO: 63)
En la SEQ ID NO: 58, el (CH2 CH2 O)n está acoplado mediante un enlace amida con el aminoácido N-terminal. En las SEQ ID NO: 59-63, el resto de (CH2 CH2 O)n se acopla mediante un enlace amida con una cadena lateral de Lys; por tanto, se entenderá que el NH2 en el extremo C en las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, representa la amidación del extremo C del péptido y se entenderá que en las SEQ ID NO: 62 y 63, el Ac en el extremo N representa la acetilación del extremo N del péptido, como se ha descrito anteriormente. Los expertos en la materia también apreciarán que un extremo libre de un resto de (CH2 CH2 O)n normalmente termina con un (OR) donde la O subrayada representa el átomo de O en el grupo (CH2 CH2 O) terminal. (OR) es con frecuencia un resto tal como un grupo hidroxilo (OH) o metoxi (-OCH3 ) aunque se podrían usar otros grupos (p. ej., otros grupos alcoxi). Por tanto, la SEQ ID NO: 59, por ejemplo, puede representarse como Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH2 CH2 OCH2 CH2 OCH2 -C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH2 CH2 O)n-R)-NH2 (SEQ ID NO: 64) en donde R es, p. ej., H o CH3 en el caso de un PEG lineal. En el caso de un PEG bifuncional, ramificado o en forma de estrella, R representa el resto de la molécula. Además, se entenderá que el resto que comprende el grupo funcional reactivo puede variar, como se describe en el presente documento (p. ej., según cualquiera de las fórmulas descritas en el presente documento). Por ejemplo, los análogos de compstatina de acción prolongada que comprenden la misma secuencia peptídica que la SEQ ID NO: 64, en los que el resto que comprende el grupo funcional reactivo comprende un éster y/o una cadena alquílica, puede representarse de la siguiente manera
AoIle-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-
CH2CH20CH2CH20CH2-C(=0 )-Lys-(C(=0 )-(CH2)m-(CH2CH20 )n-R)-M72 (SEQ ID NO:
65);
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-
CH2CH20CH2CH20CH2-C(=0 )-Lys-(C(=0 MCH2)m-C(=0 )-(CH2CH20 )n-R)-M72 (SEQ ID
NO: 66)
Ac-Ile-Cys*-Val-(lMe)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-
CH2CH20CH2CH20CH2-C(=0)-Lys-(C(=0)-(CH2)m-C(=0)-(CH2)j (CH2CH20)n-R)-iVH2
(SEQ ID NO: 67)
En las SEQ ID NO: 65-67 m pueden variar desde 1 hasta aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 o 30.
En las SEQ ID NO: 67 j puede variar desde 1 hasta aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 o 30.
También se apreciará que, como se describe en el presente documento, se pueden incorporar otros restos entre Lys-(C(=O)- y (CH2 CH2 O)n-R, tales como una amida, anillo aromático (p. ej., un fenilo sustituido o no sustituido) o una estructura de cicloalquilo sustituido o no sustituido.
Se desvelan en el presente documento variantes de las SEQ ID NO: 58-67 en las que -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- se reemplaza por una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquier otro análogo de compstatina, p. ej., de cualquiera de las SEQ ID NO 3-27 o 29-36, 37, 71, 72, 73, 74 o 75, con la condición de que el(los) resto(s) bloqueante(s) presente(s) en los extremos N y/o C de un análogo de compstatina puede(n) estar ausente(s), reemplazado por un conector (que puede comprender un resto bloqueante) o unido con un aminoácido N o C-terminal diferente presente en la(s) variante(s) correspondiente(s).
Cualquier análogo de compstatina, p. ej., cualquier compuesto que comprenda cualquiera de las SEQ ID NO: 3-37, 71, 72, 73, 74 o 75 se puede unir a través de o cerca de su extremo N-terminal o C-terminal (p. ej., a través de una cadena lateral de un aminoácido en o cerca de su aminoácido N-terminal o C-terminal) directa o indirectamente con cualquier resto que comprenda un grupo funcional reactivo, p. ej., cualquier compuesto de las fórmulas I - XVI o fórmulas A-H.
En la invención, el CRM es un polímero. En algunas realizaciones, el CRM comprende un polipéptido que se produce en suero humano o un fragmento del mismo o una variante sustancialmente similar del polipéptido o fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el polipéptido, fragmento o variante tiene un peso molecular de entre 5 kD y 150 kD, p. ej., al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 kd o más, p. ej., entre 100 y 120 o 120 y 150 kD. Se puede producir un análogo de compstatina de acción prolongada haciendo reaccionar un análogo de compstatina que comprende un grupo funcional reactivo con una o más cadenas laterales de aminoácidos del polipéptido, en donde la cadena lateral comprende un grupo funcional compatible. Se puede producir un análogo de compstatina de acción prolongada haciendo reaccionar un análogo de compstatina que comprende un grupo funcional reactivo con la amina N-terminal y/o el grupo carboxilo C-terminal del polipéptido. Se puede producir un análogo de compstatina de acción prolongada haciendo reaccionar un análogo de compstatina que comprende un grupo funcional reactivo con amina con aminoácidos que tienen una cadena lateral que comprende una amina primaria (p. ej., lisina) y/o con la amina N-terminal del polipéptido. En la invención, un resto análogo de compstatina se une en cada extremo del polipéptido.
Se puede introducir al menos un grupo funcional reactivo en el polipéptido. Por ejemplo, se puede modificar al menos una cadena lateral del polipéptido para convertir un primer grupo funcional reactivo en un grupo funcional reactivo diferente antes de la reacción con el análogo de compstatina. Se puede introducir un tiol. Existen varios métodos disponibles para introducir tioles en biomoléculas, incluida la reducción de disulfuros intrínsecos, así como la conversión de grupos amina, aldehído o ácido carboxílico en grupos tiol. Las reticulaciones de disulfuro de cistinas en proteínas pueden reducirse a residuos de cisteína mediante ditiotreitol (DTT), tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP) o tris-(2-cianoetil)fosfina. Las aminas se pueden tiolar indirectamente mediante reacción con 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP) seguido de la reducción del conjugado de 3-(2-piridilditio)propionilo con DTT o TCEP. Las aminas pueden tiolarse indirectamente mediante reacción con acetiltioacetato de succinimidilo seguido de la eliminación del grupo acetilo con hidroxilamina o hidracina 50 mM a pH casi neutro. Las aminas se pueden tiolar directamente mediante reacción con 2-iminotiolano, lo que conserva la carga general de la molécula e introduce un tiol libre. Los residuos de triptófano en proteínas sin tiol pueden oxidarse a residuos de mercaptotriptófano, que después pueden modificarse mediante yodoacetamidas o maleimidas. Un polipéptido que comprende uno o más tioles puede hacerse reaccionar con un análogo de compstatina que comprende un grupo maleimida, tal como Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-(C(=O)-(CH2)5-Mal)-WH2 (SEQ ID NO: 68) para generar un análogo de compstatina de acción prolongada.
El polipéptido se puede producir de manera recombinante. El polipéptido se puede producir al menos en parte de manera recombinante (p. ej., en bacterias o en células hospedadoras eucariotas tales como fúngicas, de insectos, vegetales o de vertebrados) y/o al menos en parte producirse mediante síntesis química. El polipéptido se puede purificar. Por ejemplo, el polipéptido se puede purificar a partir de un lisado de células hospedadoras o del medio de cultivo en el que ha sido secretado por las células hospedadoras. El polipéptido puede estar glucosilado. El polipéptido puede no estar glucosilado. El polipéptido puede ser seroalbúmina humana (HSA). Una variante sustancialmente similar del polipéptido puede ser suficientemente similar al polipéptido del que es una variante para que no sea reconocida como extraña por un sistema inmunitario normal de un sujeto, p. ej., un sujeto humano. Se pueden seleccionar alteraciones en la secuencia de una variante sustancialmente similar en comparación con el polipéptido del que es una variante para evitar generar epítopos del MHC de clase I. Se pueden usar diversos métodos conocidos en la técnica para predecir si una secuencia comprende un epítopo del MHC de clase I.
Uno o más aminoácidos en un polipéptido o conector o composición pueden seleccionarse para ser hidrófobos o hidrófilos o seleccionarse para conferir mayor hidrofilia o, en algunas realizaciones, mayor hidrofobicidad, a un compuesto que lo contenga. Como se conoce en la técnica, los términos "hidrófilo" e "hidrófobo" se usan para hacer referencia al grado de afinidad que una sustancia tiene con el agua. En algunos aspectos, una sustancia hidrófila tiene fuerte afinidad por el agua, tendiendo a disolverse en, mezclarse con o humedecerse con agua, mientras que una sustancia hidrófoba carece sustancialmente de afinidad por el agua, tendiendo a repeler y no absorber agua y tendiendo a no disolverse en, mezclarse con o humedecerse con agua. Los aminoácidos se pueden clasificar en función de su hidrofobicidad como se conoce bien en la técnica. Son ejemplos de "aminoácidos hidrófilos" arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, serina y glicina. Son ejemplos de "aminoácidos hidrófobos" triptófano, tirosina, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina y valina. En determinadas realizaciones, se usa un análogo de un aminoácido convencional, en donde el análogo tiene mayor o menor carácter hidrófilo o hidrófobo en comparación con el aminoácido del que es análogo.
El análogo de compstatina de acción prolongada de la invención comprende un CRM unido a dos restos análogos de compstatina. Además se desvelan multímeros, p. ej., concatámeros, que comprenden dos o más (p. ej., entre 2 y 10) análogos de compstatina que comprenden un Cr M, en donde el peso molecular promedio de la molécula resultante (o los componentes CRM de la misma) es de entre 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 60.000; 70.000; 80.000; 90.000; y 100.000 daltons. El peso molecular promedio de la molécula resultante (o los componentes CRM de la misma) puede ser de al menos 20.000 daltons, hasta aproximadamente 100.000; 120.000; 140.000; 160.000; 180.000; o 200.000 daltons. Los análogos de compstatina que comprenden un CRM pueden unirse usando cualquiera de los restos de unión descritos anteriormente. Se describen en el presente documento composiciones y métodos para fabricar análogos de compstatina de acción prolongada e intermedios en la síntesis.
Una amplia diversidad de métodos y ensayos útiles para la detección de polímeros, p. ej., PEG, POZ y/o polipéptidos y/o útiles para la medición de propiedades físicas y/o estructurales de polímeros, p. ej., PEG, POZ y/o polipéptidos son conocidos en la técnica y pueden, si se desea, usarse para detectar un análogo de compstatina, p. ej., un análogo de compstatina dirigido, de acción prolongada, reactivo con células, o un resto análogo de compstatina. Por ejemplo, están disponibles métodos y ensayos útiles para determinar propiedades como la agregación, la solubilidad, el tamaño, la estructura, las propiedades de fusión, la pureza, la presencia de productos de degradación o los contaminantes, el contenido de agua, el radio hidrodinámico, etc.,. Dichos métodos incluyen, p. ej., centrifugación analítica, diversos tipos de cromatografía, tales como cromatografía líquida (p. ej., HPLC-intercambio iónico, HPLC-exclusión por tamaño, HPLC-fase inversa), dispersión de luz, electroforesis capilar, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, fluorescencia, infrarrojo (IR), resonancia magnética nuclear (RMN), espectroscopia Raman, refractometría, espectroscopia UV/visible, espectrometría de masas, métodos inmunológicos, etc. Se entenderá que los métodos pueden combinarse. Un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido (o composición que comprende un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido) puede tener una o más propiedades descritas en el presente documento, según lo evaluado usando cualquiera de los métodos anteriores. Se describen en el presente documento métodos útiles para detectar y/o cuantificar un análogo de compstatina de acción prolongada.
VII. Análogos de compstatina dirigidos
También se desvelan análogos de compstatina dirigidos que comprenden un resto de direccionamiento y un resto análogo de compstatina, en donde el resto de direccionamiento se une de manera no covalente con una molécula diana. El resto de direccionamiento puede comprender, p. ej., un anticuerpo, polipéptido, péptido, ácido nucleico (p. ej., un aptámero), hidrato de carbono, molécula pequeña o complejo supramolecular, que se une específicamente con la molécula diana. La afinidad (medida por la constante de disociación en equilibrio, Kd) del resto de direccionamiento para la molécula diana (medida por la constante de disociación en equilibrio, Kd) puede ser 10'3 M o menos, p. ej., 10' 4 M o menos, p. ej., 10-5 M o menos, p. ej., 10-6 M o menos,
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10-9 M o condiciones probadas, p. ej., en condiciones fisiológicas.
Cuando el resto de direccionamiento es un anticuerpo, el anticuerpo puede ser cualquier inmunoglobulina o un derivado de la misma, que mantiene la capacidad de unión o cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo o en gran parte homólogo de un dominio de unión a inmunoglobulina. Dichas proteínas pueden obtenerse de fuentes naturales o producirse de manera parcial o completamente sintética (p. ej., usando técnicas de
ADN recombinante, síntesis química, etc.). El anticuerpo puede ser de cualquier especie, p. ej., ser humano, roedor, conejo, cabra, pollo, etc. El anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. El anticuerpo puede ser un fragmento de un anticuerpo tal como un Fab', F(ab').sub.2, scFv (variable de cadena sencilla) u otro fragmento que conserva un sitio de unión a antígeno o un fragmento scFv producido de manera recombinante, incluyendo fragmentos producidos de manera recombinante. Véase, p. ej., Allen, T., Nature Reviews Cancer, Vol. 2, 750-765, 2002 y referencias en la misma. Se pueden usar anticuerpos monovalentes, bivalentes o multivalentes. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico en el que, por ejemplo, un dominio variable de origen de roedores se fusiona con un dominio constante de origen humano, conservando de este modo la especificidad del anticuerpo de roedor. Se puede generar un anticuerpo humano o parte del mismo, por ejemplo, en roedores cuyo genoma incorpora genes de inmunoglobulina humana, usando una tecnología de presentación tal como presentación en fagos, etc. Se puede generar un anticuerpo humanizado injertando una o más regiones determinantes de complementariedad de una especie no humana (p. ej., ratón) en una secuencia de anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser parcial o completamente humanizado. Véase, p. ej., Almagro JC, Fransson J. Humanization of antibodies. Front Biosci. 13: 1619-33 (2008) para la revisión de diversos métodos para obtener anticuerpos humanizados que pueden usarse para obtener un resto de direccionamiento. Un anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, aunque se prefieren en general anticuerpos monoclonales. Se usa normalmente un fragmento F(ab')2 o F(ab'). También se usan normalmente anticuerpos que comprenden un dominio Fc. Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos que se unen específicamente con prácticamente cualquier molécula de interés. Por ejemplo, se pueden purificar anticuerpos monoclonales o policlonales de fuentes naturales, p. ej., de sangre o líquido ascítico de un animal que produce el anticuerpo (p. ej., después de la inmunización con la molécula o un fragmento antigénico de la misma) o puede producirse de manera recombinante, en cultivo celular. Se conocen en la técnica métodos para generar fragmentos de anticuerpos, p. ej., por digestión, reducción de disulfuro o síntesis.
Un resto de direccionamiento puede ser cualquier molécula que se una específicamente con una molécula diana a través de un mecanismo distinto de una interacción de antígeno-anticuerpo. Dicho resto de direccionamiento se denomina "ligando". Por ejemplo, un ligando puede ser un polipéptido, péptido, ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN), hidrato de carbono, lípido o fosfolípido, o molécula pequeña. En algunas realizaciones, una molécula pequeña es un compuesto orgánico, ya sea de origen natural o creado artificialmente, que tiene un peso molecular relativamente bajo y no es una proteína, polipéptido, ácido nucleico o lípido, normalmente con un peso molecular de menos de aproximadamente 1500 g/mol y que tiene normalmente múltiples enlaces de carbono-carbono. En general, un aptámero es un oligonucleótido (p. ej., ARN o ADN, que comprende opcionalmente uno o más nucleósidos modificados
(p. ej., bases o azúcares distintas de la 5 bases convencionales (A, G, C, T, U) o azúcares (ribosa y desoxirribosa) que se encuentran más habitualmente en ARN y ADN) o enlaces internucleósidos modificados (p. ej., enlaces no fosfodiéster) que, p. ej., estabilizan la molécula, p. ej., al hacerlo más resistente a la degradación por nucleasas) que se une con una proteína particular. Los aptámeros se pueden obtener usando un proceso de evolución in vitro denominado SELEX y se conocen en la técnica métodos para obtener aptámeros específicos para una proteína de interés. Véase, p. ej., Brody E N, Gold L. J Biotechnol. marzo de 2000; 74 (1): 5-13.
Un resto de direccionamiento puede comprender un péptido.
Se pueden usar moléculas pequeñas como ligandos. Se conocen en la técnica métodos para identificar dichos ligandos. Por ejemplo, la exploración in vitro de bibliotecas de moléculas pequeñas, incluyendo bibliotecas combinatorias y exploración por ordenador, p. ej., para identificar compuestos orgánicos pequeños que se unen con superficies cóncavas (bolsas) de proteínas, puede identificar ligandos de moléculas pequeñas para numerosas proteínas de interés (Huang, Z., Pharm. & Ther. 86: 201-215, 2000).
Normalmente, los restos de direccionamiento no son proteínas o moléculas que se usen normalmente como vehículos y se conjugan con antígenos con el fin de inducir anticuerpos. Los ejemplos son proteínas o moléculas transportadoras tales como seroalbúmina bovina, hemocianina de lapa californiana, gammaglobulina bovina y toxina diftérica. El resto de direccionamiento normalmente no es una parte Fc de una molécula de inmunoglobulina. Un resto de direccionamiento puede ser parte de un complejo que comprende uno o más restos adicionales con los que está unido de manera covalente o no covalente.
Una molécula diana puede ser cualquier molécula producida por una célula (incluyendo cualquier forma expresada en la superficie celular o formas modificadas de la misma que resulten al menos en parte de la modificación extracelular).
Una molécula diana puede ser una sustancia extracelular presente en o sobre un tejido. Una molécula diana puede ser característica de un estado enfermo o fisiológico particular o característica de uno o más tipos celulares o tipos tisulares. Una molécula diana es con frecuencia una molécula presente al menos parcialmente en la superficie celular
(p. ej., una proteína transmembrana o unida a membrana de otro modo) de modo que al menos una parte de la molécula sea accesible para la unión por un agente de unión extracelular tal como un anticuerpo. Una molécula diana puede ser, pero no es necesariamente, específica de tipo celular. Por ejemplo, una molécula diana específica de tipo celular es con frecuencia una proteína, un péptido, un ARNm, un lípido o un hidrato de carbono que está presente a un nivel mayor sobre o en un tipo celular particular o tipos celulares que sobre o en muchos otros tipos celulares. En algunos casos, una molécula diana específica de tipo celular está presente a niveles detectables solo sobre o en un tipo celular particular de interés. Sin embargo, se apreciará que no es necesario que una molécula diana específica de tipo de célula útil sea absolutamente específica para el tipo celular de interés para ser considerada específica de tipo celular. Una molécula diana específica de tipo celular para un tipo celular particular se expresa normalmente a niveles al menos 3 veces mayores en ese tipo celular que en una población de referencia de células que puede consistir, por ejemplo, en una mezcla que contiene células de una pluralidad (p. ej., 5-10 o más) de diferentes tejidos u órganos en cantidades aproximadamente iguales. La molécula diana específica de tipo celular está presente con frecuencia a niveles al menos 4-5 veces, entre 5-10 veces o más de 10 veces mayor que su expresión promedio en una población de referencia. La detección o medición de una molécula diana específica de tipo celular puede permitir a un experto habitual en la materia distinguir un tipo de célula o tipos de interés de células de muchos, la mayoría o todos los demás tipos. En general, la presencia y/o abundancia de la mayoría de moléculas diana puede determinarse usando una o más técnicas convencionales tales como transferencia de Northern, hibridación in situ, RT-PCR, secuenciación, métodos inmunológicos tales como inmunotransferencia, inmunodetección (p. ej., por inmunohistoquímica) o detección de fluorescencia después de tinción con anticuerpos marcados con fluorescencia (p. ej., usando FACS), oligonucleótido o micromatriz de ADNc o matriz de membrana, análisis de micromatrices de proteínas, espectrometría de masas, etc.
Una molécula diana puede ser un canal, transportador, receptor u otra molécula al menos en parte expuesta en la superficie celular. Una molécula diana puede ser un transportador de aniones o un canal de agua (p. ej., una proteína acuaporina).
La molécula diana puede ser una proteína al menos en parte expuesta en la superficie de glóbulos rojos, tal como una glucoforina (p. ej., glucoforina A, B, C o D) o banda 3.
La molécula diana puede ser una proteína al menos en parte expuesta en la superficie de células endoteliales. La molécula diana puede estar presente en la superficie de vasculatura normal, sana. La molécula diana puede estar presente en la superficie de células endoteliales activadas. La molécula diana puede estar presente en la superficie de células endoteliales activadas pero no en la superficie de células endoteliales no activadas. Una molécula diana es normalmente una molécula cuya expresión o exposición es inducida por un estímulo tal como lesión o inflamación. Una molécula diana sería reconocida habitualmente como "no propia" por un receptor que recibe un trasplante que contiene células que expresan la molécula diana. La molécula diana es en ocasiones un xenoantígeno de hidrato de carbono para el que se encuentran habitualmente anticuerpos en seres humanos. En ocasiones, el hidrato de carbono comprende un antígeno del grupo sanguíneo. En ocasiones, el hidrato de carbono comprende un xenoantígeno, p. ej., un epítopo alfa-gal (Galalfa1-3Galbeta1-(3)4GlcNAc-R) (véase, p. ej., Macher BA y Galili U. The Galalpha1,3Galbeta1, 4GlcNAc-R (alpha-Gal) epitope: a carbohydrate of unique evolution and clinical relevance. Biochim Biophys Acta. 1780 (2): 75-88 (2008).
En algunas realizaciones de la invención, un análogo de compstatina comprende tanto un resto de direccionamiento como un CRM.
Un análogo de compstatina dirigido puede comprender múltiples restos de direccionamiento, que pueden ser iguales o diferentes. Diferentes restos de direccionamiento pueden unirse con la misma molécula diana o con diferentes moléculas diana. Un análogo de compstatina dirigido puede ser multivalente con respecto al resto de direccionamiento, el análogo de compstatina o ambos.
Se puede producir un análogo de compstatina dirigido usando métodos en general similares a los descritos en la sección VI, en donde se usa un resto de direccionamiento en lugar de, o además de, un resto reactivo de células. Un análogo de compstatina dirigido que comprende un péptido como un resto de direccionamiento puede sintetizarse como una cadena polipeptídica que comprende un resto análogo de compstatina y un resto de direccionamiento al péptido. Opcionalmente, la cadena polipeptídica comprende uno o más péptidos espaciadores entre el resto análogo de compstatina y el resto de direccionamiento.
Un análogo de compstatina dirigido puede tener una actividad molar de al menos aproximadamente 10 %, 20 % o 30 %, p. ej., entre 30 % y 40 %, entre 30 % y 50 %, entre 30 % y 60 %, entre 30 % y 70 %, entre 30 % y 80 %, entre 30 % y 90 %, o más, de la actividad de un análogo de compstatina correspondiente que tiene la misma secuencia de aminoácidos (y, si procede, uno o más restos bloqueantes) pero que no comprende un resto de direccionamiento. En donde un análogo de compstatina dirigido comprende múltiples restos análogos de compstatina, la actividad molar del análogo de compstatina dirigido es normalmente al menos aproximadamente 10 %, 20 % o 30 %, p. ej., entre 30 % y 40 %, entre 30 % y 50 %, entre 30 % y 60 %, entre 30 % y 70 %, entre 30 % y 80 %, entre 30 % y 90 %, o más, de la suma de las actividades de dichos restos análogos de compstatina. También se proporcionan en el presente documento composiciones y métodos para fabricar análogos de compstatina dirigidos e intermedios en la síntesis.
VIII. Usos
Los análogos de compstatina reactivos con células, de acción prolongada o dirigidos tienen una amplia diversidad de usos. Sin limitar la invención de ninguna manera, determinados usos de análogos de compstatina reactivos con células, de acción prolongada o dirigidos, y aspectos relacionados se describen en el presente documento. Un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención puede administrarse a un sujeto que padece o está en riesgo de daño mediado por el complemento a un órgano, tejido o células. Un análogo de compstatina reactivo con células puede ponerse en contacto con un órgano, tejido o células ex vivo y se unen covalentemente con los mismos. El órgano, tejido o células pueden introducirse en un sujeto y están protegidos contra daño que de otro modo sería provocado por el sistema del complemento del receptor.
Pueden usarse análogos de compstatina que no se unen de manera covalente con células para fines descritos en el presente documento. Por ejemplo, un análogo de compstatina puede modificarse con un resto que aumenta la vida útil del compuesto en el cuerpo y/o un análogo de compstatina que comprende un resto que dirige el análogo de compstatina a un tipo celular o ubicación susceptible de activación del complemento.
El análogo de compstatina de acción prolongada de la invención puede usarse para: (1) proteger los glóbulos rojos (RBC) del daño mediado por complemento en individuos con trastornos tales como hemoglobinuria paroxística nocturna o síndrome urémico hemolítico atípico u otros trastornos caracterizados por lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento; (2) proteger órganos, tejidos y células trasplantados del daño mediado por el complemento; (3) reducir la lesión por isquemia/reperfusión (I/R) (p. ej., en individuos que padecen traumatismo, obstrucción vascular, infarto de miocardio u otras situaciones en las que puede producirse una lesión I/R); y (4) proteger diversas estructuras corporales (p. ej., la retina) o membranas (p. ej., membrana sinovial) que pueden estar expuestas a componentes del complemento del daño mediado por el complemento en cualquiera de diversos trastornos diferentes mediados por el complemento. Los efectos beneficiosos de inhibir la activación del complemento en la superficie de las células u otras estructuras corporales no se limitan a los que resultan directamente de la protección de las células o las estructuras en sí mismas contra el daño directo mediado por el complemento (p. ej., prevención de la lisis celular). Por ejemplo, inhibir la activación del complemento usando un análogo de compstatina reactivo con células puede reducir la generación de anafilotoxinas y el flujo de entrada/activación resultante de neutrófilos y otros acontecimientos proinflamatorios y/o reducir la liberación potencialmente perjudicial de contenidos intracelulares, teniendo de este modo potencialmente efectos beneficiosos en sistemas de órganos remotos o en todo el cuerpo.
A. Protección de células sanguíneas
Se puede usar un análogo de compstatina de acción prolongada (opcionalmente un análogo de compstatina reactivo con células o análogo de compstatina dirigido a células) para proteger las células sanguíneas contra el daño mediado por el complemento. Las células sanguíneas pueden ser cualquier componente celular de la sangre, p. ej., glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y/o plaquetas. Un análogo de compstatina dirigido a células puede dirigirse a una molécula diana expuesta en la superficie celular de glóbulos rojos, tal como una glucoforina o banda 3. Diversos trastornos están asociados con el daño mediado por el complemento en células sanguíneas. Dichos trastornos pueden resultar, por ejemplo, de deficiencias o defectos en uno o más de las PRC celulares o solubles de un individuo, p. ej., debido a una mutación(ones) en el(los) gen(es) que codifica(n) dicha(s) proteína(s); (b) mutación(ones) en genes necesarios para la producción o función adecuada de una o más PRC y/o (c) presencia de autoanticuerpos para una o más PRC. La lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento puede resultar de la presencia de autoanticuerpos contra antígenos de glóbulos rojos que pueden surgir debido a un conjunto diverso de causas (que son, con frecuencia, idiopáticas). Los individuos que tienen dicha(s) mutación(ones) en genes que codifican PRC y/o que tienen anticuerpos contra PRC o contra sus propios glóbulos rojos tienen mayor riesgo de trastornos que implican daño de glóbulos rojos mediado por el complemento. Los individuos que han tenido uno o más episodios característicos de un trastorno tienen mayor riesgo de recaída.
La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es un trastorno relativamente poco habitual que comprende una anemia hemolítica adquirida caracterizada por hemólisis intravascular mediada por el complemento, hemoglobinuria, insuficiencia de la médula ósea y trombofilia (propensión a desarrollar coágulos sanguíneos). Afecta a una estimación de 16 individuos por millón en todo el mundo, aparece en ambos sexos y puede surgir a cualquier edad, aquejando con frecuencia a adultos jóvenes (Bessler, M. y Hiken, J., Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 104-110 (2008); Hillmen, P. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 116-123 (2008)). La HPN es una enfermedad crónica y debilitante jalonada de episodios hemolíticos agudos y da como resultado morbilidades significativas y reducción de la esperanza de vida. Además de anemia, muchos pacientes experimentan dolor abdominal, disfagia, disfunción eréctil e hipertensión pulmonar, y tienen mayor riesgo de insuficiencia renal y acontecimientos tromboembólicos.
La HPN se describió por primera vez como una entidad definida en el siglo XIX, pero no fue hasta la década de 1950, con el descubrimiento de la ruta alternativa de activación del complemento, que se estableció firmemente la causa de la hemólisis en la HPN (Parker CJ. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an historical overview. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 93-103 (2008)). CD55 y CD59 normalmente están unidos a la membrana celular a través de anclajes de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (estructuras de glucolípidos que anclan determinadas proteínas a la membrana plasmática). La HPN surge como consecuencia de la expansión clonal no maligna de células madre hematopoyéticas que han adquirido una mutación somática en el gen de PIGA, que codifica una proteína implicada en la síntesis de anclajes de GPI (Takeda J, et al. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell. 73: 703-711 (1993)). La descendencia de dichas células madre es deficiente en proteínas ancladas por GPI, incluyendo CD55 y CD59. Este defecto hace que estas células sean susceptibles a la lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento. Se usa con frecuencia análisis por citometría de flujo usando anticuerpos para proteínas ancladas por GPI para el diagnóstico. Detecta la deficiencia de proteínas ancladas por GPI en la superficie celular y permite la determinación del grado de deficiencia y la proporción de células afectadas (Brodsky RA. Advances in the diagnosis and therapy of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood Rev. 22 (2): 65-74 (2008). Los glóbulos rojos de HPN de tipo III son completamente deficientes en proteínas unidas a GPI y son muy sensibles al complemento, mientras que los glóbulos rojos de HPN de tipo II tienen una deficiencia parcial y son menos sensibles. FLAER es una variante inactiva marcada con fluorescencia de proaerolisina (una toxina bacteriana que se une a anclajes de GPI) y se usa cada vez más junto con citometría de flujo para el diagnóstico de HPN. La falta de unión de FLAER con granulocitos es suficiente para el diagnóstico de HPN. Los análogos de compstatina reactivos con células pueden proteger los glóbulos rojos de HPN de la deposición de C3b.
Un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido puede administrarse a un sujeto que padece síndrome hemolítico atípico (SHUa). SHUa es un trastorno crónico caracterizado por anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e insuficiencia renal aguda y está provocado por la activación inadecuada del complemento, con frecuencia debido a mutaciones en genes que codifican proteínas reguladoras del complemento (Warwicker, P., et al. Kidney Int 53, 836-844 (1998); Kavanagh, D. y Goodship, T. Pediatr Nephrol 25, 2431-2442 (2010). Las mutaciones en el gen del factor H del complemento (FHC) son la anomalía genética más común en pacientes con SHUa, y 60-70 % de estos pacientes mueren o alcanzan la etapa final de insuficiencia renal en un periodo de un año después del inicio de la enfermedad (Kavanagh y Goodship, mencionado anteriormente.) También se han descrito mutaciones en el factor I, el factor B, C3, las proteínas 1-5 relacionadas con el factor H y la trombomodulina. Otras causas de SHUa incluyen autoanticuerpos contra proteínas reguladoras del complemento tales como FHC. Un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido puede administrarse a un sujeto que se ha identificado que tiene una mutación en el factor I, el factor B, C3, proteínas 1-5 relacionadas con el factor H o trombomodulina o se ha identificado que tiene anticuerpos contra una proteína reguladora del complemento, p. ej., FHC.
Se produce hemólisis mediada por el complemento en un grupo diverso de otras afecciones, incluyendo anemias hemolíticas autoinmunitarias que implican anticuerpos que se unen con glóbulos rojos y conducen a hemólisis mediada por el complemento. Por ejemplo, dicha hemólisis puede producirse en la enfermedad de aglutinina fría crónica primaria y determinadas reacciones a fármacos y otras sustancias extrañas (Berentsen, S., et al., Hematology 12, 361­ 370 (2007); Rosse, W. F., Hillmen, P. y Schreiber, A. D. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 48-62 (2004)). Se puede administrar un análogo de compstatina reactivo con células a un sujeto que padece o está en riesgo de enfermedad de aglutinina fría crónica. Por lo tanto, la invención proporciona un análogo de compstatina reactivo con células para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de síndrome HELLp , que se define por la existencia de hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y bajo recuento plaquetario y se asocia con mutaciones en proteína(s) reguladora(s) del complemento en al menos algunos sujetos (Fakhouri, F., et al., 112: 4542-4545 (2008)).
Como alternativa, se usan análogos de compstatina reactivos con células para proteger los glóbulos rojos u otros componentes celulares de la sangre para transfundir a un sujeto. Determinados ejemplos de dichos usos se analizan adicionalmente a continuación. Como se ha observado anteriormente, pueden usarse análogos de compstatina dirigidos y/o de acción prolongada como se ha descrito anteriormente para inhibir la hemólisis mediada por el complemento y/o el daño a glóbulos rojos. Un análogo de compstatina de acción prolongada que comprende un resto (CH2CH2O) puede usarse para tratar HPN o SHUa.
B. Trasplante
El trasplante es un enfoque terapéutico de creciente importancia, que proporciona un medio para reemplazar órganos y tejidos que han sido dañados por traumatismo, enfermedad u otras afecciones. Los riñones, el hígado, los pulmones, el páncreas y el corazón se encuentran entre los órganos que se pueden trasplantar con éxito. Los tejidos que se trasplantan con frecuencia incluyen huesos, cartílago, tendones, córnea, piel, válvulas cardíacas y vasos sanguíneos. El trasplante de islotes pancreáticos o células de islotes pancreáticos es un enfoque prometedor para el tratamiento de la diabetes, p. ej., diabetes de tipo I. Para los fines de la invención, un órgano, tejido o célula (o población de células) que se va a trasplantar, se está trasplantando o se ha trasplantado puede denominarse "injerto". Para los fines del presente, una transfusión de sangre se considera un "injerto".
El trasplante somete al injerto a diversos acontecimientos y estímulos perjudiciales que pueden contribuir a la disfunción del injerto y, potencialmente, su fracaso. Por ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión (I/R) es una causa habitual y significativa de morbilidad y mortalidad en el caso de muchos injertos (en particular órganos sólidos) y puede ser un determinante importante de la probabilidad de supervivencia del injerto. El rechazo de trasplante es uno de los principales riesgos asociados con los trasplantes entre individuos genéticamente diferentes y puede conducir al fracaso del injerto y la necesidad de retirar el injerto del receptor.
Un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente, un análogo de compstatina reactivo con células o un análogo de compstatina dirigido a células se puede usar para proteger un injerto del daño mediado por el complemento. Un análogo de compstatina reactivo con células reacciona con células del injerto, se une covalentemente con las mismas e inhibe la activación del complemento. Un análogo de compstatina dirigido a células se une a una molécula diana en el injerto (p. ej., expresada por células endoteliales u otras células en el injerto) e inhibe la activación del complemento. Una molécula diana puede ser, p. ej., es una molécula cuya expresión es inducida o estimulada por un estímulo tal como lesión o inflamación, molécula que sería reconocida como "no propia" por el receptor, un xenoantígeno de hidrato de carbono para el que se encuentran habitualmente anticuerpos en seres humanos tales como un antígeno del grupo sanguíneo o un xenoantígeno, p. ej., una molécula que comprende un epítopo alfa-gal. En algunas realizaciones, se puede demostrar una reducción en la activación del complemento mediante una reducción en el depósito promedio de C4d en los vasos sanguíneos de injertos que han entrado en contacto con un análogo de compstatina, p. ej., un análogo de compstatina reactivo con células, en comparación con el nivel promedio de depósito de C4d en injertos que no han entrado en contacto con un análogo de compstatina (p. ej., en sujetos que coinciden con respecto a los injertos y otras terapias que reciben).
Se puede poner en contacto un injerto con un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido antes, durante y/o después del trasplante. Por ejemplo, antes del trasplante, un injerto extraído de un donante puede ponerse en contacto con un líquido que comprende un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido. Por ejemplo, el injerto puede bañarse y/o perfundirse con la solución. Un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido puede administrarse a un donante antes de la extracción del injerto. Un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido puede administrarse a un receptor durante y/o después de la introducción del injerto. El análogo de compstatina puede administrarse localmente al injerto trasplantado.
Se desvela en el presente documento una composición que comprende: (a) un injerto aislado; y (b) un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido. La composición desvelada puede comprender además una solución líquida adecuada para poner en contacto (p. ej., adecuado para aclarar, lavar, bañar, perfundir, mantener o almacenar) un injerto (p. ej., un órgano) tal como un injerto aislado que se ha extraído de un donante y está esperando el trasplante a un receptor. Se desvela en el presente documento una composición que comprende: (a) una solución líquida adecuada para poner en contacto un injerto (p. ej., un órgano); y (b) un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido. La solución líquida puede ser cualquier solución líquida que sea fisiológicamente aceptable para el injerto (p. ej., composición osmótica adecuada, no citotóxica) y médicamente aceptable en vista de la introducción posterior del injerto en el receptor (p. ej., preferentemente estéril o al menos razonablemente exento de microorganismos u otros contaminantes) y compatible con el análogo de compstatina reactivo con células (es decir, no destruirá la reactividad del análogo de compstatina) o compatible con el análogo de compstatina de acción prolongada o dirigido. La solución puede ser cualquier solución conocida en la técnica para tal fin, por ejemplo, citrato de Marshall o hiperosmolar (Soltran®, Baxter Healthcare), Solución de la Universidad de Wisconsin (UW) (ViaSpan™, Bristol Myers Squibb), solución de cetoglutarato de triptófano de histidina (HTK) (Custodial®, Kohler Medical Limited), EuroCollins (Fresenius) y Celsior® (Sangstat Medical), Polisol, IGL-1 o AQIX® RS-1. Por supuesto, podrían usarse otras soluciones, p. ej., que contengan ingredientes equivalentes o similares en las mismas o diferentes concentraciones dentro del alcance de composiciones fisiológicamente aceptables. Una solución normalmente no contiene ingrediente(s) con el(los) que se esperaría que el análogo de compstatina reactivo con células reaccionara de manera significativa y cualquier solución puede modificarse o diseñarse para que carezca de dichos ingredientes. El análogo de compstatina reactivo con células puede estar presente en la solución compatible con injertos a una concentración de, p. ej., entre 0,01 mg/ml y 100 mg/ml o se pueden añadir a la solución para lograr dicha concentración.
También se desvela un equipo que comprende: (a) un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido; y (b) una solución compatible con injerto o componentes sólidos (p. ej., polvo) de la misma. El análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede proporcionarse en forma sólida (p. ej., polvo) o al menos en parte disuelto en una solución. El análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido y/o solución compatible con injerto se puede proporcionar en cantidades predeterminadas, de modo que, cuando se combinen, se produzca una solución de concentración adecuada para poner en contacto un injerto con el análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido. El análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido y solución compatible con injerto o componentes sólidos (p. ej., polvo) de los mismos pueden estar en contenedores separados dentro del equipo. En aspectos desvelados, el análogo de compstatina reactivo con células y los componentes de una solución compatible con injerto se proporcionan ambos en forma sólida (p. ej., en polvo), ya sea en recipientes separados o mezclados. En aspectos desvelados, el equipo comprende instrucciones de uso, p. ej., instrucciones para añadir un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido a una solución compatible con injerto y/o instrucciones para poner en contacto un injerto con un análogo de compstatina reactivo con células. Opcionalmente, el equipo contiene una etiqueta aprobada por una agencia gubernamental responsable de regular los productos usados en el trasplante, la terapia celular y/o transfusión de sangre.
También se desvela en el presente documento un análogo de compstatina para su uso en unión covalente con un injerto aislado, comprendiendo el uso poner en contacto el injerto aislado con un análogo de compstatina reactivo con células. También se desvela en el presente documento un injerto aislado que tiene un análogo de compstatina unido covalentemente al mismo. Normalmente, el injerto aislado tiene muchas moléculas de análogo de compstatina unidas al mismo. En algunos aspectos desvelados, un injerto es o comprende un órgano sólido tal como un riñón, hígado, pulmón, páncreas o corazón. En algunos aspectos desvelados, un injerto es o comprende hueso, cartílago, fascia, tendón, ligamento, córnea, esclerótica, pericardio, piel, válvula cardíaca, vaso sanguíneo, membrana amniótica o duramadre. En algunos aspectos desvelados, un injerto comprende múltiples órganos, tales como un injerto de corazón-pulmón o páncreas-riñón. En algunos aspectos desvelados, un injerto comprende un órgano o tejido incompleto. Por ejemplo, un injerto puede contener una parte de un órgano o tejido, p. ej., un lóbulo hepático, sección de vaso sanguíneo, colgajo cutáneo o válvula cardíaca. En algunos aspectos desvelados, un injerto comprende una preparación que comprende células aisladas o fragmentos tisulares que se han aislado de su tejido de origen pero que conservan al menos algo de arquitectura tisular, p. ej., islotes pancreáticos. En algunos aspectos desvelados, una preparación comprende células aisladas que no están unidas entre sí a través de tejido conectivo, p. ej., células madre hematopoyéticas o células progenitoras procedentes de sangre periférica y/o del cordón umbilical, o sangre completa o cualquier producto sanguíneo que contenga células, tales como glóbulos rojos (RBC) o plaquetas. En algunos aspectos desvelados, se obtiene un injerto de un donante fallecido (p. ej., un donante de "donación después de la muerte encefálica" (DME) o donante de "donación después de la muerte cardíaca"). En algunos aspectos desvelados, dependiendo del tipo particular de injerto, se obtiene un injerto de un donante vivo. Por ejemplo, los riñones, secciones del hígado, células sanguíneas, se encuentran entre los tipos de injertos que con frecuencia se pueden obtener de un donante vivo sin riesgo excesivo para el donante y de acuerdo con la práctica médica razonable.
En algunos aspectos desvelados, un injerto es un xenoinjerto (es decir, el donante y el receptor son de especies diferentes). En algunos aspectos desvelados, un injerto es un autoinjerto (es decir, un injerto de una parte del cuerpo a otra parte del cuerpo en el mismo individuo). En algunos aspectos desvelados, un injerto es un isoinjerto (es decir, el donante y el receptor son genéticamente idénticos). En la mayoría de los aspectos desvelados, el injerto es un aloinjerto (es decir, el donante y el receptor son miembros genéticamente diferentes de la misma especie). En el caso de un aloinjerto, el donante y el receptor pueden estar o no genéticamente relacionados (p. ej., ser parientes). Normalmente, el donante y el receptor tienen grupos sanguíneos compatibles (al menos compatibilidad ABO y opcionalmente Rh, Kell y/u otra compatibilidad de antígenos de células sanguíneas). La sangre del receptor puede haber sido explorada con respecto a aloanticuerpos para el injerto y/o el receptor y el donante, ya que la presencia de dichos anticuerpos puede conducir al rechazo hiperagudo (es decir, el rechazo comienza casi de inmediato), p. ej., en un periodo de varios minutos después de que el injerto entre en contacto con la sangre del receptor). Se puede usar un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) para explorar el suero de un sujeto con respecto a anticuerpos anti-HLA. El suero se incuba con un panel de linfocitos de fenotipo HLA conocido. Si el suero contiene anticuerpos contra moléculas de HLA en las células diana, se produce la muerte celular debido a lisis mediada por el complemento. El uso de un panel seleccionado de células diana permite asignar especificidad al anticuerpo detectado. Otras técnicas útiles para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos anti-HLA y, opcionalmente, determinar su especificidad HLA, incluyen ensayos ELISA, ensayos de citometría de flujo, tecnología de matriz de microperlas (p. ej., tecnología Luminex). La metodología para realizar estos ensayos es bien conocida y están disponibles en el mercado diversos equipos para realizarlos.
Un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede inhibir el rechazo mediado por el complemento. Por ejemplo, un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede usarse para inhibir el rechazo hiperagudo. El rechazo hiperagudo está provocado, al menos en parte, por la activación mediada por anticuerpos del sistema del complemento del receptor a través de la ruta clásica y el depósito de MAC resultante en el injerto. Normalmente, resulta de la presencia en el receptor de anticuerpos preexistentes que reaccionan con el injerto. Aunque es deseable intentar evitar el rechazo hiperagudo mediante correspondencia adecuada antes del trasplante, puede que no siempre sea posible hacerlo debido, p. ej., a las limitaciones de tiempo y/o recursos. Asimismo, algunos receptores (p. ej., individuos con múltiples transfusiones, individuos que han recibido trasplantes previamente, mujeres que han tenido múltiples embarazos) pueden tener ya tantos anticuerpos preformados, incluyendo potencialmente anticuerpos para antígenos que normalmente no se prueban, que puede ser difícil o casi imposible obtener con confianza un injerto compatible de manera oportuna. Dichos individuos tienen mayor riesgo de rechazo hiperagudo.
Un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede usarse para inhibir el rechazo agudo o el fracaso del injerto. Como se usa en el presente documento, "rechazo agudo" se refiere al rechazo que se produce entre al menos 24 horas, normalmente al menos de varios días a una semana, después de un trasplante, hasta 6 meses después del trasplante. El rechazo agudo mediado por anticuerpos (RMA) implica con frecuencia un aumento agudo del aloanticuerpo específico de donante (AED) en las primeras semanas después del trasplante. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, es posible que las células plasmáticas preexistentes y/o la conversión de linfocitos B de memoria en células plasmáticas nuevas desempeñen un papel en el aumento de producción de AED. Dichos anticuerpos pueden dar como resultado daño mediado por el complemento al injerto, que puede inhibirse poniendo en contacto el injerto con un análogo de compstatina reactivo con células. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la inhibición de la activación del complemento en el injerto puede reducir la infiltración de leucocitos (p. ej., neutrófilos), otro contribuyente al fracaso agudo del injerto.
Un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede usarse para inhibir la lesión I/R mediada por el complemento en un injerto. Como se analiza adicionalmente más adelante, se puede producir lesión I/R tras la reperfusión de tejido cuyo aporte sanguíneo se ha interrumpido temporalmente, como sucede en órganos trasplantados. La reducción de la lesión I/R reduciría la probabilidad de disfunción aguda del injerto o reduciría su gravedad, y reduciría la probabilidad de fracaso agudo del injerto.
Un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede usarse para inhibir el rechazo crónico y/o el fracaso crónico del injerto. Como se usa en el presente documento, "rechazo crónico o fracaso del injerto" se refiere al rechazo o fracaso que se produce al menos 6 meses después del trasplante, p. ej., entre 6 meses y 1, 2, 3, 4, 5 años o más después del trasplante, con frecuencia después de meses o años de buena función del injerto. Está provocado por una respuesta inflamatoria e inmunitaria crónica contra el injerto. Para los fines del presente, el rechazo crónico puede incluir vasculopatía crónica de aloinjerto, una expresión usada para hacer referencia a la fibrosis de los vasos sanguíneos internos del tejido trasplantado. Ya que los regímenes inmunosupresores han reducido la incidencia del rechazo agudo, el rechazo crónico se está volviendo más prominente como causa de disfunción y fracaso del injerto. Cada vez hay más pruebas de que la producción de aloanticuerpos por linfocitos B es un elemento importante en la génesis del rechazo crónico y el fracaso del injerto (Kwun J. y Knechtle SJ, Transplantation, 88 (8): 955-61 (2009). El daño anterior al injerto puede ser un factor contribuyente que conduce a procesos crónicos tales como fibrosis que en última instancia puede conducir al rechazo crónico. Por tanto, la inhibición de dicho daño anterior usando un análogo de compstatina reactivo con células puede retardar y/o reducir la probabilidad o gravedad del rechazo crónico del injerto.
En el presente documento se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en la administración a un receptor de injerto para inhibir el rechazo del injerto y/o el fracaso del injerto.
C. Lesión por isquemia/reperfusión
La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) es una causa importante del daño tisular después de traumatismo y en otras afecciones asociadas con la interrupción temporal del flujo sanguíneo, tal como infarto de miocardio, ictus, infección grave, enfermedad vascular, reparación de aneurismas, derivación cardiopulmonar y trasplante.
En la situación de traumatismo, hipoxemia sistémica, hipotensión e interrupción local del aporte sanguíneo resultante de contusiones, síndrome compartimental y lesiones vasculares provocan isquemia que daña los tejidos metabólicamente activos. La restauración del aporte sanguíneo desencadena una reacción inflamatoria sistémica intensa que con frecuencia es más perjudicial que la isquemia en sí misma. Una vez que se reperfunde la región isquémica, los factores que se producen y liberan localmente entran en el sistema circulatorio y alcanzan ubicaciones remotas, provocando en ocasiones daño significativo a órganos no aquejados por la lesión isquémica original, tales como los pulmones y el intestino, lo que conduce a la disfunción de órganos individuales y múltiples. Se produce activación del complemento poco después de la reperfusión y es un mediador clave del daño postisquémico, tanto directamente como a través de sus efectos quimioatrayentes y estimulantes sobre los neutrófilos. Se activan las tres rutas principales del complemento y, actuando de manera cooperativa o independiente, están implicadas en acontecimientos adversos relacionados con I/R que afectan a numerosos sistemas de órganos. Por lo tanto, la invención proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido para su uso en el tratamiento del traumatismo en un sujeto que recientemente (p. ej., en las 2, 4, 8, 12, 24 o 48 horas anteriores) ha experimentado traumatismo, p. ej., traumatismo que pone al sujeto en riesgo de lesión I/R, p. ej., debido a hipoxemia sistémica, hipotensión y/o interrupción local del aporte sanguíneo. El análogo de compstatina reactivo con células puede administrarse por vía intravascular, opcionalmente en un vaso sanguíneo que suministra a una parte del cuerpo lesionada o directamente a la parte del cuerpo. El sujeto puede padecer una lesión de la médula espinal, lesión cerebral traumática, quemadura y/o choque hemorrágico.
En el presente documento se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en la administración a un sujeto antes, durante o después de un procedimiento quirúrgico, p. ej., un procedimiento quirúrgico que se espera que interrumpa temporalmente el flujo sanguíneo a un tejido, un órgano o una parte del cuerpo. Los ejemplos de dichos procedimientos incluyen derivación cardiopulmonar, angioplastia, reparación/reemplazo de válvula cardíaca, reparación de aneurismas u otras cirugías vasculares. El análogo de compstatina reactivo con células puede administrarse antes, después y/o durante un periodo de tiempo solapante con el procedimiento quirúrgico.
En el presente documento se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de IM, ictus tromboembólico, trombosis venosa profunda o embolia pulmonar en un sujeto. El análogo de compstatina reactivo con células puede administrarse en combinación con un agente trombolítico tal como activador de plasminógeno tisular (tPA) (p. ej., alteplasa (Activase), reteplasa (Retavase), tenecteplasa (TNKase)), anistreplasa (Eminase), estreptocinasa (Kabikinase, Streptase) o urocinasa (Abbokinase). El análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido se puede administrar antes, después y/o durante un periodo de tiempo solapante con el agente trombolítico.
En el presente se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de lesión I/R en un sujeto.
D. Otros trastornos mediados por el complemento
En este documento se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente, reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno ocular tal como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinopatía diabética, glaucoma o uveítis mediante la introducción del análogo de compstatina en el ojo. Por ejemplo, se puede introducir un análogo de compstatina reactivo con células en la cavidad vítrea (p. ej., mediante inyección intravítrea), para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de DMAE. Un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede introducirse en la cámara anterior, p. ej., para tratar la uveítis anterior.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de una enfermedad autoinmunitaria, p. ej., una enfermedad autoinmunitaria mediada al menos en parte por anticuerpos contra uno o más autoantígenos.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece artritis (p. ej., artritis reumatoide). El análogo de compstatina puede introducirse en la cavidad sinovial. Por supuesto, puede administrarse de manera sistémica.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de una hemorragia intracerebral.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de miastenia grave. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de neuromielitis óptica (NMO).
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de glomerulitis membranoproliferativa (GNMP), p. ej., GNMP de tipo I, GNMP de tipo II o GNMP de tipo III.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de una enfermedad neurodegenerativa. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece dolor neuropático o está en riesgo de desarrollar dolor neuropático. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de rinosinusitis o poliposis nasal. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de cáncer. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de septicemia. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de síndrome de dificultad respiratoria del adulto.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de anafilaxia o reacción a la infusión. Por ejemplo, el análogo de compstatina puede administrarse al sujeto antes, durante o después de recibir un fármaco o un vehículo que puede provocar anafilaxia o reacción a la infusión. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto en riesgo o que padece anafilaxia por un alimento (p. ej., cacahuete, marisco u otros alérgenos alimentarios), picadura de insecto (p. ej., abeja, avispa).
El análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido puede administrarse de manera local o sistémica.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad respiratoria, p. ej., asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). El análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido puede, por ejemplo, administrarse al tracto respiratorio por inhalación, p. ej., como polvo seco o mediante nebulización, o puede administrarse por inyección, p. ej., por vía intravenosa, por vía intramuscular o por vía subcutánea. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención para su uso en el tratamiento de asma grave, p. ej., asma que no está suficientemente controlada por broncodilatadores y/o corticoesteroides inhalados.
También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno mediado por el complemento, p. ej., un trastorno crónico mediado por el complemento en un sujeto que lo necesite. También se proporciona un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con Th17 en un sujeto que lo necesite.
Un "trastorno crónico" puede ser un trastorno que persiste durante al menos 3 meses y/o es aceptado en la técnica como un trastorno crónico. Un trastorno crónico puede persistir durante al menos 6 meses, p. ej., al menos 1 año o más, p. ej., de manera indefinida. Un experto habitual en la materia apreciará que al menos algunas manifestaciones de diversos trastornos crónicos pueden ser intermitentes y/o su gravedad puede aumentar y disminuir con el tiempo. Un trastorno crónico puede ser progresivo, p. ej., tener una tendencia a ser más grave o afectar a áreas mayores con el tiempo. Se analizan en el presente documento varios trastornos crónicos mediados por el complemento. Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser cualquier trastorno crónico en el que esté implicada la activación del complemento (p. ej., activación excesiva o inadecuada del complemento), p. ej., como un factor contribuyente y/o al menos parcialmente causante. Por conveniencia, los trastornos se agrupan en ocasiones por referencia a un órgano o sistema que con frecuencia se ve particularmente afectado en sujetos que padecen el trastorno. Se apreciará que varios trastornos pueden afectar a múltiples órganos o sistemas y dicha(s) clasificación(ones) no es(son) de ninguna manera limitantes. Asimismo, pueden producirse varias manifestaciones (p. ej., síntomas) en sujetos que padecen cualquiera de varios trastornos diferentes. Se puede encontrar información no limitante acerca de trastornos de interés en el presente documento, p. ej., en los libros de texto convencionales de medicina interna tales como Cecil Textbook of Medicine (p. ej., 23a edición), Harrison's Principles of Internal Medicine (p. ej., 17a edición) y/o libros de texto convencionales centrados en áreas particulares de la medicina, sistemas u órganos particulares del cuerpo y/o trastornos particulares.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser un trastorno asociado a Th2. Como se usa en el presente documento, un trastorno asociado a Th2 es un trastorno caracterizado por un número excesivo y/o actividad excesiva o inadecuada de linfocitos T adyuvantes CD4+ del subtipo Th2 ("linfocitos Th2") en el cuerpo o una parte del mismo, p. ej., en al menos un tejido, órgano o estructura. Por ejemplo, puede haber un predominio de linfocitos Th2 en relación con linfocitos T auxiliares CD4+ del subtipo Th1 ("linfocitos Th1"), p. ej., en al menos un tejido, órgano o estructura afectada por un trastorno. Como se conoce en la técnica, los linfocitos Th2 normalmente secretan citocinas características tales como interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5) e interleucina-13 (IL-13), mientras que los linfocitos Th1 normalmente secretan interferón-y (IFN-y) y factor de necrosis tumoral p (TNF p). Un trastorno asociado a Th2 puede caracterizarse por producción y/o cantidad excesiva de IL-4, IL-5 y/o IL-13, p. ej., en relación con IFN-y y/o TNF p, p. ej., en al menos algunos de al menos un tejido, órgano o estructura.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser un trastorno asociado a Th17. En algunos aspectos, como se describe en más detalle en el documento PCT/US2012/043845, presentado el 22 de junio de 2012, titulado "Methods of Treating Chronic Disorders with Complement Inhibitors", la activación del complemento y los linfocitos Th17 participan en un ciclo que implica células dendríticas y anticuerpos y que contribuye al mantenimiento de un microambiente inmunológico patológico subyacente a una serie de trastornos. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, el microambiente inmunológico patológico, una vez establecido, es autosuficiente y contribuye a la lesión celular y tisular. Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de trastorno asociados a Th17.
Como se usa en el presente documento, un trastorno asociado a Th17 es un trastorno caracterizado por un número excesivo y/o actividad excesiva o inadecuada de linfocitos T adyuvantes CD4+ del subtipo Th17 ("linfocitos Th17") en el cuerpo o una parte del mismo, p. ej., en al menos un tejido, órgano o estructura. Por ejemplo, puede haber un predominio de linfocitos Th17 en relación con las linfocitos Th1 y/o Th2, p. ej., en al menos un tejido, órgano o estructura afectada por un trastorno. Un predominio de linfocitos Th17 puede ser un predominio relativo, p. ej., la relación de linfocitos Th17 con respecto a linfocitos Th1 y/o la relación de linfocitos Th17 con respecto a linfocitos Th2, está incrementada en relación con los valores normales. La relación de linfocitos Th17 con respecto a linfocitos T reguladores (linfocitos T reguladores CD4+CD25+, también denominados "linfocitos Treg"), puede estar incrementada en relación con los valores normales. La formación de linfocitos Th17 y/o la activación de linfocitos Th17 es promovida por diversas citocinas, p. ej., interleucina 6 (IL-6), interleucina 21 (IL-21), interleucina 23 (IL-23) y/o interleucina 1p (IL-1p). La formación de linfocitos Th17 abarca la diferenciación de linfocitos T precursores, p. ej., linfocitos T CD4+ vírgenes, hacia un fenotipo Th17 y su maduración en linfocitos Th17 funcionales. La formación de linfocitos Th17 puede abarcar cualquier aspecto del desarrollo, la proliferación (expansión), la supervivencia y/o la maduración de linfocitos Th17. Un trastorno asociado a Th17 puede caracterizarse por producción y/o cantidad excesiva de IL-6, IL-21, IL-23 y/o IL-1p. Los linfocitos Th17 normalmente secretan citocinas características tales como interleucina-17A (IL-17A), interleucina-17F (IL-17F), interleucina-21 (IL-21) e interleucina-22 (IL-22). Un trastorno asociado a Th17 puede caracterizarse por producción y/o cantidad excesiva de una citocina efectora de Th17, p. ej., IL-17A, IL-17F, IL-21 y/o IL-22. La producción o cantidad excesiva de una citocina puede ser detectable en la sangre. La producción o cantidad excesiva de una citocina puede ser detectable localmente, p. ej., en al menos un tejido, órgano o estructura. Un trastorno asociado a Th17 puede estar asociado con un número disminuido de Treg y/o una cantidad disminuida de una citocina asociada a Treg. Un trastorno de Th17 puede ser cualquier enfermedad inflamatoria crónica, abarcando dicha expresión una gama de dolencias caracterizadas por lesiones inmunitarias que se perpetúan a diversos tejidos y que parecen estar disociadas de la lesión inicial que provocó la dolencia (que puede ser desconocida). Un trastorno asociado a Th17 puede ser cualquier enfermedad autoinmunitaria. De hecho, muchas, si no la mayoría de las "enfermedades inflamatorias crónicas" pueden ser enfermedades autoinmunitarias. Los ejemplos de trastornos asociados a Th17 incluyen enfermedades cutáneas inflamatorias tales como psoriasis y dermatitis atópica; esclerodermia sistémica y esclerosis; enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); enfermedad de Behcet; dermatomiositis; polimiositis; esclerosis múltiple (EM); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; artrosis; nefritis lúpica; artritis reumatoide (AR), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, vasculitis; trastornos inflamatorios del sistema nervioso central (SNC), hepatitis crónica; pancreatitis crónica, glomerulonefritis; sarcoidosis; tiroiditis, respuestas inmunitarias patológicas al trasplante de tejido/órgano (p. ej., rechazo de trasplante); EPOC, asma, bronquiolitis, neumonitis por hipersensibilidad, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), periodontitis y gingivitis. Una enfermedad de Th17 puede ser una enfermedad autoinmunitaria conocida clásicamente, tal como diabetes de tipo I o psoriasis. Un trastorno asociado con Th17 puede ser una degeneración macular asociada a la edad.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser un trastorno asociado a IgE. Como se usa en el presente documento, un "trastorno asociado a IgE" es un trastorno caracterizado por producción y/o cantidad excesiva y/o inadecuada de IgE, actividad excesiva o inadecuada de células productoras de IgE (p. ej., linfocitos B productores de IgE o células plasmáticas) y/o actividad excesiva o inadecuada de células sensibles a IgE tales como eosinófilos o mastocitos. Un trastorno asociado a IgE puede caracterizarse por niveles elevados de IgE total y/o IgE específica de alérgenos, en el plasma de un sujeto y/o localmente.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede caracterizarse por la presencia de autoanticuerpos y/o complejos inmunitarios en el cuerpo, que pueden activar el complemento a través de, p. ej., la ruta clásica. Los autoanticuerpos pueden, por ejemplo, unirse con antígenos propios, p. ej., en células o tejidos en el cuerpo. Los autoanticuerpos pueden unirse con antígenos en vasos sanguíneos, piel, nervios, músculo, tejido conjuntivo, corazón, riñón, tiroides, etc. Un trastorno crónico mediado por el complemento puede no estar caracterizado por autoanticuerpos y/o complejos inmunitarios.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser un trastorno respiratorio. Un trastorno respiratorio crónico puede ser asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Un trastorno respiratorio crónico puede ser fibrosis pulmonar (p. ej., fibrosis pulmonar idiopática), lesión pulmonar inducida por radiación, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonitis por hipersensibilidad (también conocida como alveolitis alérgica), neumonía eosinófila, neumonía intersticial, sarcoide, granulomatosis de Wegener o bronquiolitis obliterante. Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno respiratorio crónico, p. ej., asma, EPOC, fibrosis pulmonar, lesión pulmonar inducida por radiación, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonitis por hipersensibilidad (también conocida como alveolitis alérgica), neumonía eosinófila, neumonía intersticial, sarcoide, granulomatosis de Wegener o bronquiolitis obliterante, en un sujeto que lo necesite.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser rinitis alérgica, rinosinusitis o poliposis nasal. Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de la rinitis alérgica, rinosinusitis o poliposis nasal en un sujeto que lo necesite.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser un trastorno que afecta al sistema musculoesquelético. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen afecciones inflamatorias de las articulaciones (p. ej., artritis, tal como artritis reumatoide o artritis psoriásica, artritis juvenil crónica, espondiloartropatías, síndrome de Reiter, gota). Un trastorno del sistema musculoesquelético puede provocar síntomas tales como dolor, rigidez y/o limitación del movimiento de la(s) parte(s) del cuerpo afectada(s). Las miopatías inflamatorias incluyen dermatomiositis, polimiositis y diversos otros son trastornos de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que provocan debilidad muscular. Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser miastenia grave. Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de cualquiera de los trastornos anteriores que afectan al sistema musculoesquelético en un sujeto que lo necesite.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser un trastorno que afecte al sistema tegumentario. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen, p. ej., dermatitis atópica, psoriasis, pénfigo, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, esclerodermia, esclerodermatomiositis, síndrome de Sjogren y urticaria crónica. Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de cualquiera de los trastornos anteriores que afectan al sistema tegumentario en un sujeto que lo necesite.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede afectar al sistema nervioso, p. ej., el sistema nervioso central (SNC) y/o sistema nervioso periférico (SNP). Los ejemplos de dichos trastornos incluyen, p. ej., esclerosis múltiple, otras enfermedades crónicas desmielinizantes, esclerosis lateral amiotrófica, dolor crónico, ictus, neuritis alérgica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de la invención para su uso en el tratamiento de cualquiera de los trastornos anteriores que afectan al sistema nervioso en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el uso administrar el análogo de compstatina según un programa de dosificación descrito en el presente documento al sujeto.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede afectar al sistema circulatorio. Por ejemplo, el trastorno puede ser una vasculitis u otro trastorno asociado con la inflamación de los vasos, p. ej., inflamación de los vasos sanguíneos y/o vasos linfáticos. Una vasculitis puede ser poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, arteritis de células gigantes, síndrome de Churg-Strauss, poliangeítis microscópica, púrpura de Henoch-Schonlein, arteritis de Takayasu, enfermedad de Kawasaki o enfermedad de Behcet. Un sujeto, p. ej., un sujeto que necesite tratamiento para vasculitis, puede ser positivo para el anticuerpo citoplasmático antineutrófilos (ANCA).
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede afectar al sistema gastrointestinal. Por ejemplo, el trastorno puede ser enfermedad inflamatoria intestinal, p. ej., enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno crónico mediado por el complemento que afecta al sistema gastrointestinal en un sujeto que lo necesite.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser una tiroiditis (p. ej., tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, tiroides postparto), miocarditis, hepatitis (p. ej., hepatitis C), pancreatitis, glomerulonefritis (p. ej., glomerulonefritis membranoproliferativa o glomerulonefritis membranosa) o paniculitis.
Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de acción prolongada de la invención para su uso en el tratamiento de dolor crónico en un sujeto que lo necesite. Un sujeto puede padecer dolor neuropático. El dolor neuropático se ha definido como dolor iniciado o provocado por una lesión primaria o disfunción en el sistema nervioso, en particular, dolor que surge como consecuencia directa de una lesión o enfermedad que afecta el sistema somatosensorial. Por ejemplo, el dolor neuropático puede surgir de lesiones que implican las rutas somatosensoriales con daño a fibras pequeñas en nervios periféricos y/o al sistema espino-talamocortical en el SNC. El dolor neuropático puede surgir de enfermedad autoinmunitaria (p. ej., esclerosis múltiple), enfermedad metabólica (p. ej., diabetes), infección (p. ej., enfermedad vírica tal como herpes zóster o VIH), enfermedad vascular (p. ej., ictus), traumatismo (p. ej., lesión, cirugía) o cáncer. Por ejemplo, el dolor neuropático puede ser un dolor que persiste después de la curación de una lesión o después de la interrupción de un estímulo de terminaciones nerviosas periféricas o dolor que surge debido al daño a los nervios. Las condiciones ilustrativas de o asociadas con dolor neuropático incluyen neuropatía diabética dolorosa, neuralgia postherpética (p. ej., dolor persistente o recurrente en el sitio del herpes zóster agudo 3 o más meses después del episodio agudo), neuralgia del trigémino, dolor neuropático relacionado con el cáncer, dolor neuropático asociado a quimioterapia, dolor neuropático relacionado con el VIH (p. ej., de neuropatía por VIH), dolor neuropático central/posterior al ictus, neuropatía asociada con dorsalgia, p. ej., lumbalgia (p. ej., por radiculopatía, tal como compresión de la raíz espinal, p. ej., compresión de la raíz lumbar, pudiendo surgir dicha compresión debido a hernia de disco), estenosis espinal, dolor de lesión nerviosa periférica, dolor de miembro fantasma, polineuropatía, dolor relacionado con la lesión de la médula espinal, mielopatía y esclerosis múltiple. El análogo de compstatina puede administrarse según un programa de dosificación de la invención para tratar el dolor neuropático en un sujeto con una o más de las afecciones mencionadas anteriormente.
Un trastorno crónico mediado por el complemento puede ser un trastorno ocular crónico. El trastorno ocular crónico puede caracterizarse por degeneración macular, neovascularización coroidea (CNV), neovascularización retiniana (RNV), inflamación ocular o cualquier combinación de los anteriores. La degeneración macular, CNV, RNV y/o inflamación ocular pueden ser una característica definitoria y/o diagnóstica del trastorno. Los trastornos ilustrativos que se caracterizan por una o más de estas características incluyen, pero sin limitación, afecciones relacionadas con la degeneración macular, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, vitrorretinopatía proliferativa, uveítis, queratitis, conjuntivitis y escleritis. Las afecciones relacionadas con la degeneración macular incluyen, p. ej., degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Un sujeto puede necesitar tratamiento para DMAE húmeda. Un sujeto puede necesitar tratamiento para DMAE seca. Un sujeto puede necesitar tratamiento para atrofia geográfica (AG). Un sujeto puede necesitar tratamiento para inflamación ocular. La inflamación ocular puede afectar a una gran cantidad de estructuras oculares tales como la conjuntiva (conjuntivitis), córnea (queratitis), epiesclerótica, esclerótica (escleritis), úvea, retina, vasculatura y/o nervio óptico. Las pruebas de inflamación ocular pueden incluir la presencia de células asociadas a inflamación tales como glóbulos blancos (p. ej., neutrófilos, macrófagos) en el ojo, la presencia de mediador(es) inflamatorio(s) endógeno(s), uno o más síntomas tales como dolor ocular, enrojecimiento, sensibilidad a la luz, visión borrosa y moscas volantes, etc. La uveítis es un término general que se refiere a la inflamación en la úvea del ojo, p. ej., en cualquiera de las estructuras de la úvea, incluyendo el iris, cuerpo ciliar o coroides. Los tipos específicos de uveítis incluyen iritis, iridociclitis, ciclitis, pars planitis y coroiditis. Un sujeto puede necesitar tratamiento para atrofia geográfica (AG). El trastorno ocular crónico puede ser un trastorno ocular caracterizado por daño del nervio óptico (p. ej., degeneración del nervio óptico), tal como glaucoma.
Como se ha observado anteriormente, la enfermedad respiratoria crónica puede ser asma. Puede encontrarse información acerca de factores de riesgo, epidemiología, patogenia, diagnóstico, tratamiento actual del asma, etc., p. ej., en "Expert Panel Report 3: Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma". Instituto Nacional del Corazón, el Pulmón y la Sangre. 2007. http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.pdf. ("NHLBI Guidelines"; www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.htm), Global Initiative for Asthma, Global Strategy for Asthma Management and Prevention 2010 "Informe GINA") y/o libros de texto convencionales de medicina interna tales como el Cecil Textbook of Medicine (20a edición), Harrison's Principles of Internal Medicine (17a edición) y/o libros de texto convencionales centrados en la medicina pulmonar. El asma es un trastorno inflamatorio crónico de las vías respiratorias en el que muchas células y elementos celulares desempeñan una función, tales como, mastocitos, eosinófilos, linfocitos T, macrófagos, neutrófilos y células epiteliales. Los individuos asmáticos experimentan episodios recurrentes asociados con síntomas tales como sibilancia, disnea (también denominada falta de aliento), opresión en el pecho y tos. Estos episodios están asociados habitualmente con obstrucción generalizada pero variable del flujo de aire que con frecuencia es reversible, ya sea espontáneamente o con tratamiento. La inflamación también provoca un aumento asociado en la hiperreactividad bronquial existente a diversos estímulos. La hiperreactividad de las vías respiratorias (una respuesta broncoconstrictora exagerada a los estímulos) es una característica típica del asma. En general, la limitación del flujo de aire resulta de la broncoconstricción y el edema de las vías respiratorias. La reversibilidad de la limitación del flujo de aire puede ser incompleta en algunos pacientes con asma. Por ejemplo, la remodelación de las vías respiratorias puede conducir a un estrechamiento fijo de las vías respiratorias. Los cambios estructurales pueden incluir engrosamiento de la membrana subbasal, fibrosis subepitelial, hipertrofia e hiperplasia del músculo liso de las vías respiratorias, proliferación y dilatación de los vasos sanguíneos e hiperplasia de las glándulas mucosas e hipersecreción.
Los individuos con asma pueden experimentar agravamientos, que se identifican como acontecimientos caracterizados por un cambio del estado anterior del individuo. Los agravamientos graves del asma se pueden definir como acontecimientos que requieren una acción urgente por parte del individuo y su médico para evitar un resultado grave, tal como hospitalización o muerte por asma. Por ejemplo, un agravamiento grave del asma puede requerir uso de corticoesteroides sistémicos (p. ej., corticoesteroides orales) en un sujeto cuyo asma está habitualmente bien controlado sin CEO o puede requerir un aumento de una dosis de mantenimiento estable. Los agravamientos moderados del asma pueden definirse como acontecimientos que son problemáticos para el sujeto y que provocan la necesidad de un cambio en el tratamiento, pero que no son graves. Estos acontecimientos se identifican clínicamente por estar fuera del intervalo habitual de variación de asma diaria del sujeto.
Los medicamentos actuales para el asma se clasifican normalmente en dos clases generales: medicamentos de control a largo plazo ("medicamentos controladores") tales como corticoesteroides inhalados (CEI), corticoesteroides orales (CEO), broncodilatadores de acción prolongada (BAAP), modificadores de leucotrienos (p. ej., antagonistas de receptores de leucotrienos o inhibidores de la síntesis de leucotrienos, anticuerpos anti-IgE (omalizumab (Xolair®)), cromoglicato y nedocromilo, que se usan para lograr y mantener el control del asma persistente y medicamentos de alivio rápido, tales como broncodilatadores de acción corta (BAAC), que se usan para tratar síntomas agudos y agravamientos. Para fines de la presente invención, estos tratamientos pueden denominarse "terapia convencional". El tratamiento de los agravamientos también puede incluir aumentar la dosis y/o intensidad de la terapia con medicamentos controladores. Por ejemplo, se puede usar una tanda de CEO para recuperar el control del asma. Las pautas actuales exigen la administración diaria de medicamentos controladores o, en muchos casos, la administración de múltiples dosis de medicamentos controladores cada día para sujetos con asma persistente (con la excepción de Xolair, que se administra cada 2 o 4 semanas).
En general, se considera que un sujeto tiene asma persistente si el sujeto padece síntomas en promedio más de dos veces por semana y/o normalmente usa un medicamento de alivio rápido (p. ej., BAAC) más de dos veces por semana para el control de los síntomas. La "gravedad del asma" puede clasificarse en función de la intensidad del tratamiento necesario para controlar el asma del sujeto una vez que se han tratado las comorbilidades relevantes y se han optimizado la técnica del inhalador y la adherencia (véase, p. ej., Informe GINA; Taylor, DR, Eur Respir J 2008; 32: 545-554). La descripción de la intensidad del tratamiento se puede basar en los medicamentos y las dosis recomendadas en el algoritmo de tratamiento escalonado que se encuentra en pautas tales como NHLBI Guidelines 2007, Informe GINA y sus predecesores y/o en libros de texto médicos convencionales. Por ejemplo, el asma puede clasificarse como intermitente, leve, moderado o grave como se indica en la tabla X, donde "tratamiento" se refiere al tratamiento suficiente para lograr el mejor nivel de control del asma del sujeto. (Se entenderá que las categorías de asma leve, moderada y grave en general implican asma persistente en lugar de intermitente). Un experto habitual en la materia apreciará que la tabla X es ilustrativa y que no todos estos medicamentos estarán disponibles en todos los sistemas de atención sanitaria, lo que puede afectar la evaluación de la gravedad del asma en algunos entornos. También se apreciará que otros enfoques emergentes o nuevos pueden afectar a la clasificación del asma leve/moderada. Sin embargo, el mismo principio, de asma leve que se define por la capacidad de lograr un buen control usando tratamiento de muy baja intensidad y asma grave que se define por el requisito de tratamiento de alta intensidad, todavía se puede aplicar. La gravedad del asma se puede clasificar además, o como alternativa, en función de la intensidad intrínseca de la enfermedad en ausencia de tratamiento (véase, p. ej., NHBLI Guidelines 2007). La evaluación puede realizarse basándose en la espirometría actual y el recuerdo del paciente de los síntomas durante las 2-4 semanas anteriores. Los parámetros de deterioro actual y riesgo futuro pueden evaluarse e incluirse en una determinación del nivel de gravedad del asma. La gravedad del asma se puede definir como se muestra en la figura 3.4(a), 3.4(b), 3.4(c) de las NHBLI Guidelines, para individuos de 0-4, 5-11 o > 12 años de edad, respectivamente.
______________________ Tabla X: Clasificación del asma basada en el tratamiento______________________ I Clasificación del asma I Tratamiento I
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El "control del asma" se refiere a la medida en que las manifestaciones del asma se han reducido o eliminado mediante tratamiento (ya sea farmacológico o no farmacológico). El control del asma se puede evaluar en función de factores tales como la frecuencia de los síntomas, síntomas nocturnos, medidas objetivas de la función pulmonar, tales como parámetros de espirometría (p. ej., % VEF1 del predicho, variabilidad de VEF1 , necesidad de uso de BAAC para el control de los síntomas. Los parámetros de deterioro actual y riesgo futuro pueden evaluarse e incluirse en una determinación del nivel de control del asma. El control del asma se puede definir como se muestra en la figura 4.3(a), 4.3(b) o 4.3(c) de las NHBLI Guidelines, para individuos de 0-4, 5-11 o > 12 años de edad, respectivamente.
En general, un experto habitual en la materia puede seleccionar un medio adecuado para determinar el nivel de gravedad del asma y/o el grado de control, y se puede usar cualquier esquema de clasificación que los expertos habituales en la materia consideren razonable.
Se proporciona en el presente documento un análogo de compstatina de la invención para su uso en el tratamiento del asma persistente en un sujeto que lo necesite, el uso comprende la administración del inhibidor del complemento según un régimen de dosificación de la invención. El sujeto puede padecer asma leve o moderada. El sujeto puede padecer asma grave. Un sujeto puede tener asma que no está bien controlada usando terapia convencional. Un sujeto puede tener asma que, cuando se trata usando terapia convencional, requiere el uso de CEI para estar bien controlada. Un sujeto puede tener asma que no se controla bien a pesar del uso de CEI. Un sujeto puede tener asma que, si se trata usando terapia convencional, requeriría el uso de CEO para estar bien controlada. Un sujeto puede tener asma que no se controla bien a pesar del uso de terapia convencional de alta intensidad que incluye CEO. Se puede administrar un inhibidor del complemento de acción prolongada como medicamento controlador o permitir que el sujeto evite usar o reducir su dosis de un medicamento controlador convencional.
El sujeto puede padecer asma alérgica, que es el caso de la mayoría de los individuos asmáticos. Se puede considerar que un sujeto asmático tiene asma alérgica si un desencadenante no alérgico del asma (p. ej., frío, ejercicio) se desconoce y/o no se identifica en una evaluación de diagnóstico convencional. Se puede considerar que un sujeto asmático tiene asma alérgica si el sujeto (i) desarrolla de manera reproducible síntomas de asma (o empeoramiento de síntomas de asma) después de la exposición a un alérgeno o alérgenos a los que el sujeto es sensible; (ii) presenta IgE específica para un alérgeno o alérgenos a los que el sujeto es sensible; (iii) presenta una prueba de punción cutánea positiva a un alérgeno o alérgenos a los que el sujeto es sensible; y/o (iv) presenta otro(s) síntoma(s) de característica(s) compatibles con la atopia tales como rinitis alérgica, eccema o IgE total en suero elevada. Se apreciará que un desencadenante alérgico específico puede no identificarse, pero puede sospecharse o inferirse si el sujeto experimenta empeoramiento de los síntomas en ambientes particulares, por ejemplo.
La exposición a alérgenos por inhalación es una técnica que se usa ampliamente en la evaluación de enfermedades alérgicas de las vías respiratorias. La inhalación del alérgeno conduce a la reticulación de IgE específica de alérgeno unida a receptores de IgE en, p. ej., mastocitos y basófilos. A continuación se produce activación de rutas secretoras, lo que da como resultado la liberación de mediadores de la broncoconstricción y la permeabilidad vascular. Los individuos con asma alérgica pueden desarrollar diversas manifestaciones después de la exposición a alérgenos, p. ej., respuesta asmática temprana (RAE), respuesta asmática tardía (RAT), hiperreactividad de las vías respiratorias (HRVR) y eosinofilia de las vías respiratorias, cada una de las cuales puede detectarse y cuantificarse como se conoce en la técnica. Por ejemplo, puede detectarse eosinofilia de las vías respiratorias como un aumento de los eosinófilos en el esputo y/o el líquido del lavado broncoalveolar. La RAE, en ocasiones denominada respuesta asmática inmediata (RAI), es una respuesta a la exposición a alérgeno por inhalación que se vuelve detectable poco después de la inhalación, normalmente en un periodo de 10 minutos (min) desde la inhalación, p. ej., como una disminución del VEF1. La RAE alcanza normalmente un máximo en 30 minutos y se resuelve en 2-3 horas (h) después de la exposición. Por ejemplo, se puede considerar que un sujeto presenta una RAE "positiva" si su VEF1 disminuye en al menos 15 %, p. ej., al menos 20 %, dentro de esta ventana temporal en relación con el VEF1 basal (donde "basal" en este contexto se refiere a las condiciones antes de la exposición, p. ej., condiciones equivalentes a la condición habitual del sujeto cuando no experimenta un agravamiento del asma y no se expone a estímulos alérgicos a los que el sujeto es sensible). La respuesta asmática tardía (RAT) normalmente comienza entre 3 h y 8 h después de la exposición y se caracteriza por inflamación celular de las vías respiratorias, aumento de la permeabilidad broncovascular y secreción de moco. Normalmente, se detecta como una disminución del VEF1 , que puede ser mayor en magnitud que la asociada con la RAE y potencialmente más importante desde el punto de vista clínico. Por ejemplo, se puede considerar que un sujeto presenta una RAT "positiva" si su VEF1 disminuye en al menos 15 %, p. ej., al menos 20 %, en relación con el VEF1 basal dentro del periodo de tiempo relevante en comparación con el VEF1 basal. Puede producirse una respuesta retardada de las vías respiratorias (RRVR) que comienza entre aproximadamente 26 y 32 h, alcanzando un máximo entre aproximadamente 32 y 48 h y resolviéndose en un periodo de aproximadamente 56 h después de la exposición (Pelikan, Z. Ann Allergy Asthma Immunol. 2010, 104 (5): 394-404).
El trastorno respiratorio crónico puede ser enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La EPOC abarca un espectro de afecciones caracterizadas por la limitación del flujo de aire que no es completamente reversible incluso con terapia y habitualmente es progresiva. Los síntomas de la EPOC incluyen disnea (falta de aliento), disminución de la tolerancia al ejercicio, tos, producción de esputo, sibilancias y opresión en el pecho. Las personas con EPOC pueden experimentar episodios de empeoramiento agudo (p. ej., que se desarrolla en el transcurso de menos de una semana y, con frecuencia, en el transcurso de 24 horas o menos) de los síntomas (denominados agravamientos de la EPOC) que pueden variar en su frecuencia y duración y se asocian con morbilidad. Pueden desencadenarse por acontecimientos tales como infección respiratoria, exposición a partículas nocivas o pueden tener una etiología desconocida. Fumar es el factor de riesgo más habitual para la EPOC y otras exposiciones por inhalación también pueden contribuir al desarrollo y la progresión de la enfermedad. El papel de los factores genéticos en la EPOC es un área de investigación activa. Un pequeño porcentaje de pacientes con EPOC tienen una deficiencia hereditaria de antitripsina alfa-1, un importante inhibidor circulante de las serina proteasas, y esta deficiencia puede conducir a una forma rápidamente progresiva de la enfermedad.
Los elementos fisiopatológicos característicos de la EPOC incluyen estrechamiento y cambios estructurales en las vías respiratorias pequeñas y destrucción del parénquima pulmonar (en particular alrededor de los alvéolos), más habitualmente debido a inflamación crónica. La limitación crónica del flujo de aire observada en la EPOC normalmente implica una mezcla de estos factores y su importancia relativa para contribuir a la limitación del flujo de aire y los síntomas varía entre personas. El término "enfisema" se refiere a la dilatación de los espacios aéreos (alvéolos) distales a los bronquiolos terminales, con destrucción de sus paredes. Debería observarse que el término "enfisema" se usa con frecuencia clínicamente para hacer referencia a la afección médica asociada con dichos cambios patológicos. Algunos individuos con EPOC tienen bronquitis crónica, que se define en términos clínicos como una tos con producción de esputo la mayoría de los días durante 3 meses al año, durante 2 años consecutivos. Puede encontrarse más información con respecto a factores de riesgo, epidemiología, patogenia, diagnóstico y tratamiento actual de la EPOC, p. ej., en "Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease" (actualizado en 2009) disponible en el sitio web de la Iniciativa global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica, Inc. (GOLD) (www.goldcopd.org), también denominado en el presente documento "informe GOLD", las Directrices de la Sociedad Torácica Estadounidense/Sociedad Respiratoria Europea (2004) disponibles en el sitio web de la ATS en www.thoracic.org/clinical/copd-guidelines/resources/copddoc.pdf, denominadas en el presente documento "directrices de EPOC ATC/ERS" y libros de texto convencionales de medicina interna, tales como Cecil Textbook of Medicine (20a edición), Harrison's Principles of Internal Medicine (17a edición) y/o libros de texto convencionales centrados en la medicina pulmonar.
Los usos desvelados en el presente documento pueden inhibir (interferir con, interrumpir) el ciclo de DC-Th17-B-Ab-C-DC analizado anteriormente. Por ejemplo, la administración de un inhibidor del complemento puede romper el ciclo por el que el complemento estimula células DC para promover el fenotipo Th17. Como resultado, el número y/o la actividad de los linfocitos Th17 disminuye, lo que a su vez reduce la cantidad de estimulación mediada por Thl7 de linfocitos B y la producción de anticuerpos policlonales. Estos efectos pueden dar como resultado el "restablecimiento" el microambiente inmunológico a un estado más normal, menos patológico. Como se describe en el ejemplo 1, se obtuvieron pruebas que respaldan la capacidad de la inhibición del complemento para tener un efecto inhibidor prolongado sobre la producción de citocinas asociadas a Th17 en un modelo animal de asma.
La inhibición del ciclo de DC-Th17-B-Ab-C-DC puede tener un efecto modificador de la enfermedad. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, en lugar de simplemente tratar los síntomas de un trastorno, la inhibición del ciclo de DC-Th17-B-Ab-C-DC puede interferir con los mecanismos patológicos fundamentales que pueden contribuir al daño tisular continuado incluso cuando los síntomas están bien controlados y/o pueden contribuir a agravamientos de la enfermedad. La inhibición del ciclo de DC-Th17-B-Ab-C-DC puede provocar que un trastorno crónico entre en remisión. La remisión puede referirse a un estado de ausencia o ausencia sustancial de actividad de la enfermedad en un sujeto con un trastorno crónico, con posibilidad de retorno de la enfermedad. La remisión puede mantenerse durante un periodo prolongado de tiempo (p. ej., al menos 6 meses, p. ej., 6-12 meses, 12-24 meses o más) en ausencia de terapia continua o con una dosis reducida o un intervalo de dosificación aumentado. La inhibición del complemento puede cambiar el microambiente inmunológico de un tejido que es rico en linfocitos Th17 y modificarlo en un microambiente que es rico en linfocitos T reguladores (Treg). Hacerlo podría permitir que el sistema inmunitario se "reinicie" y entre en un estado de remisión. Por ejemplo, la remisión puede mantenerse hasta la aparición de un acontecimiento desencadenante. Un acontecimiento desencadenante puede ser, por ejemplo, una infección (que puede dar como resultado la producción de anticuerpos policlonales que reaccionan tanto con un agente infeccioso como con una proteína propia), exposición a condiciones ambientales particulares (p. ej., altos niveles de contaminantes atmosféricos tales como ozono o materia en partículas o componentes del humo tal como humo de cigarrillos, alérgenos), etc. Los factores genéticos pueden desempeñar un papel. Por ejemplo, los individuos que tienen alelos particulares de genes que codifican componentes del complemento pueden tener un nivel basal mayor de actividad del complemento, un sistema del complemento más reactivo y/o un nivel basal menor de actividad proteica reguladora del complemento endógena. Un individuo puede tener un genotipo asociado con mayor riesgo de DMAE. Por ejemplo, el sujeto puede tener un polimorfismo en un gen que codifica una proteína del complemento o una proteína reguladora del complemento, p. ej., FHC, C3, factor B, en donde el polimorfismo está asociado con un mayor riesgo de DMAE.
Un microambiente inmunológico puede volverse progresivamente más polarizado hacia un estado patológico con el tiempo, p. ej., en un sujeto que aún no ha desarrollado síntomas de un trastorno crónico o en un sujeto que ha desarrollado el trastorno y se ha tratado con un análogo de compstatina para su uso como se describe en el presente documento. Dicha transición puede producirse de manera estocástica (p. ej., debido al menos en parte a fluctuaciones aparentemente aleatorias en los niveles y/o afinidad de anticuerpos) y/o como resultado de acontecimientos desencadenantes acumulados "por debajo del umbral" que no son de intensidad suficiente para desencadenar un brote sintomático de un trastorno.
Se contempla que una tanda relativamente corta de un análogo de compstatina de acción prolongada, p. ej., entre 1 semana y 6 semanas, p. ej., aproximadamente 2-4 semanas, puede proporcionar un beneficio duradero. Se puede lograr una remisión durante un periodo prolongado de tiempo, p. ej., 1-3 meses, 3-6 meses, 6-12 meses, 12-24 meses o más. El análogo de compstatina de acción prolongada puede administrarse a un sujeto que se ha supervisado y/o tratado de manera profiláctica antes de la reaparición de los síntomas. Por ejemplo, el análogo de compstatina de acción prolongada puede administrarse antes o después de la exposición del sujeto a un acontecimiento desencadenante. Un sujeto puede supervisarse, p. ej., para determinar un aumento de un biomarcador, p. ej., un biomarcador que comprende un indicador de linfocitos Th17 o actividad de linfocitos Th17, o activación del complemento, y el análogo de compstatina de acción prolongada puede administrarse a dicho sujeto tras aumentar el nivel de dicho biomarcador. Véase, p. ej., documento PCT/US2012/043845 para análisis adicional.
IX. Composiciones y administración
También se proporcionan composiciones que comprenden un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención.
Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden comprender un análogo de compstatina purificado de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido de la invención. Se puede lograr purificación usando diversos enfoques que pueden ser seleccionados por un experto habitual en la materia basándose en lograr un grado deseado de pureza con respecto a diversos componentes presentes en la composición antes de la purificación. Por ejemplo, se pueden usar filtración, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de afinidad y/u otros enfoques y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la composición comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido como porcentaje del análogo de compstatina total en peso. En algunas realizaciones, la composición comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido como porcentaje del análogo de compstatina total en molaridad. En algunas realizaciones, una composición consiste o consiste esencialmente en un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido.
Una composición que comprende un análogo de compstatina reactivo con células y un compuesto que comprende un grupo funcional reactivo con células puede caracterizarse por que la relación del análogo de compstatina reactivo con células con respecto al compuesto que comprende el grupo funcional reactivo con células en molaridad es de al menos 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 500:1, 1.000:1 o más. La composición puede comprender al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de análogo de compstatina reactivo con células como porcentaje del análogo de compstatina total en peso. La composición puede comprender al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de análogo de compstatina reactivo con células como porcentaje del análogo de compstatina total en molaridad. Una composición puede comprender al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de análogo de compstatina reactivo con células en peso. Una composición puede comprender al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de análogo de compstatina de acción prolongada en peso. Una composición puede comprender al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más de análogo de compstatina dirigido en peso. El peso puede ser peso seco.
La invención proporciona una composición de uso farmacéutico que comprende un análogo de compstatina de acción prolongada, reactivo con células o dirigido de la invención. La composición de uso farmacéutico puede tener cualquiera de las características mencionadas anteriormente con respecto a pureza en diversas realizaciones. La composición de uso farmacéutico está suficientemente exenta de endotoxina, metales pesados y sustancias no identificadas y/o no caracterizadas para que sea aceptable, sin purificación adicional, como composición farmacéutica adecuada para su administración a un sujeto humano o para la fabricación de una composición farmacéutica para administrar a un sujeto humano. En algunas realizaciones, la composición de uso farmacéutico es estéril.
Las preparaciones adecuadas, p. ej., preparaciones sustancialmente puras de un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido u otro agente activo, pueden combinarse con transportadores o vehículos farmacéuticamente aceptables, etc., para producir una composición farmacéutica adecuada. La expresión "transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un transportador o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. Un experto en la materia entenderá que un transportador o vehículo es "no tóxico" si es compatible con la administración a un sujeto en una cantidad adecuada para administrar el compuesto sin provocar toxicidad indebida. Los transportadores o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina fisiológica, solución de Ringer, solución de acetato de sodio o acetato de potasio, dextrosa al 5 % y similares. La composición puede incluir otros componentes según sea adecuado para la formulación deseada, p. ej., como se analiza en el presente documento. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos complementarios, p. ej., compuestos útiles de manera independiente para tratar a un sujeto que padece un trastorno mediado por el complemento. La invención proporciona dichas composiciones farmacéuticas que comprenden un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido y, opcionalmente, un segundo agente activo útil para tratar a un sujeto que padece un trastorno mediado por el complemento.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para su administración a seres humanos, envasada junto con una etiqueta aprobada por una agencia gubernamental responsable de regular los agentes farmacéuticos, p. ej., la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos. También se desvela un equipo o envase farmacéutico que comprende: (a) un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido farmacéuticamente aceptable en forma sólida; (b) un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, el equipo o envase desvelado contiene instrucciones para disolver el análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada o dirigido en el transportador. También se desvela un equipo o envase farmacéutico. El envase o equipo comprende suficiente cantidad de composición farmacéutica para al menos 1 dosis, p. ej., entre 1 y 200 dosis o cualquier número o subintervalo intermedio. Un envase o equipo farmacéutico desvelado comprende una o más agujas y, opcionalmente, una o más jeringas. También se desvela al menos una jeringa precargada. También se desvelan una o más formas farmacéuticas unitarias o alícuotas previamente medidas. También se desvelan instrucciones para la administración, que puede comprender instrucciones para la autoadministración, p. ej., a través de inyección subcutánea.
Se puede administrar una composición farmacéutica a un sujeto por cualquier vía de administración adecuada incluyendo, pero sin limitación, intravenosa, intramuscular, por vía subcutánea, por inhalación, por administración nasal, por vía intratecal, por vía intracraneal, por vía intraarterial, por vía oral, por vía rectal, por vía transdérmica, por vía intradérmica, por vía subdérmica, etc. En algunas realizaciones, una composición que comprende un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, una composición que comprende un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido se administra por vía intraarterial. La composición puede administrarse por vía local, ya sea en el sistema vascular que suministra a un órgano o tejido, o por vía extravascular en las cercanías de un órgano o tejido. Se entenderá que "administración" abarca administrar directamente un compuesto o una composición a un sujeto, instruir a un tercero para que administre un compuesto o una composición a un sujeto, recetar o sugerir un compuesto o una composición a un sujeto (p. ej., para autoadministración), autoadministración y, según sea adecuado, otros medios para poner un compuesto o una composición a disposición de un sujeto.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable (p. ej., administración intravenosa) o mediante bomba o catéter incluyen normalmente soluciones acuosas estériles (cuando sean hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Se pueden preparar soluciones estériles incorporando el compuesto en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado, opcionalmente con uno o una combinación de ingredientes tales como tampones tales como acetatos, citratos, lactatos o fosfatos; agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico, glutatión o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; y otros ingredientes adecuados, etc., según se desee, seguido de esterilización basada en filtro. Un experto en la materia será consciente de numerosos compuestos fisiológicamente aceptables que pueden incluirse en una composición farmacéutica. Otros compuestos útiles incluyen, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como glucosa, sacarosa, lactosa; dextranos; aminoácidos tales como glicina; polioles tales como manitol. Estos compuestos pueden, por ejemplo, actuar como agentes de carga y/o estabilizadores, p. ej., en un polvo y/o cuando parte del proceso de fabricación o almacenamiento implique liofilización. Pueden incluirse en una composición tensioactivo(s) tal(es) como Tween-80, Pluronic-F108/F68, ácido desoxicólico, fosfatidilcolina, etc., p. ej., para aumentar la solubilidad o para proporcionar microemulsión para administrar fármacos hidrófobos. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, si se desea. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o bolsas de infusión o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico. Preferentemente, las soluciones para inyección son estériles y aceptablemente exentas de endotoxina.
En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes adecuados de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación pueden incluir secado al vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado, p. ej., de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.
Se puede usar administración oral en determinadas realizaciones. Las composiciones orales incluyen en general un diluyente inerte o un transportador comestible. Con el fin de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas, p. ej., cápsulas de gelatina. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja. Una composición líquida también se puede administrar por vía oral. Las formulaciones para administración oral pueden incorporar agentes para mejorar la estabilidad dentro del tubo digestivo y/o mejorar la absorción.
Para administración por inhalación, se puede administrar un análogo de compstatina en forma de una pulverización de aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, p. ej., un gas tal como dióxido de carbono. Se puede usar un inhalador o nebulizador de dosis medida. El aerosol puede comprender partículas líquidas o aerosol seco (p. ej., polvos secos, partículas porosas grandes, etc.).
Para aplicación tópica, se puede formular un análogo de compstatina en una pomada adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Los vehículos adecuados para administración tópica incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse como una loción o crema adecuada que contiene un análogo de compstatina suspendido o disuelto en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se pueden usar en la formulación penetrantes adecuados para la barrera que se va a atravesar. Dichos penetrantes se conocen en general en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Se puede realizar administración transmucosa, p. ej., mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan normalmente en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (p. ej., con bases para supositorios convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal. Se puede preparar un análogo de compstatina u otro compuesto activo con vehículos que protejan el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Por ejemplo, un análogo de compstatina puede incorporarse o encapsularse en una formulación de micropartículas o nanopartículas. Se pueden usar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, poliéteres, ácido poliláctico, PLGA, etc. Se pueden usar liposomas u otras partículas a base de lípidos como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 4.522.811 y/u otras referencias enumeradas en el presente documento. Se pueden usar formulaciones de liberación prolongada que contengan un análogo de compstatina. El análogo de compstatina se libera del depósito a lo largo del tiempo, p. ej., para proporcionar una concentración terapéutica durante más tiempo que si el compuesto se administrara por vía intravenosa. El CRM puede conferir propiedades de liberación prolongada en un análogo de compstatina de la invención. Un experto habitual en la materia apreciará que los materiales y métodos seleccionados para la preparación de una formulación de liberación controlada, implante, etc., deberían ser tales que conserven la actividad del compuesto.
Se apreciará que el análogo de compstatina y/o el(los) agente(s) activo(s) adicional(es) se pueden proporcionar como una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las procedentes de bases y ácidos inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de sales ácidas adecuadas incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, malonato, metansulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Además, se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables como sales de metales alcalinos o alcalinotérreas, tales como sales de sodio, potasio o calcio, si es adecuado dependiendo de la identidad del agente activo.
Se entenderá que los vehículos, compuestos y métodos de preparación farmacéuticamente aceptables mencionados en el presente documento son ilustrativos y no limitantes. Véase, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21a edición. Filadelfia, PA. Lippincott Williams y Wilkins, 2005, para análisis adicional de compuestos farmacéuticamente aceptables y métodos de preparación de composiciones farmacéuticas de diversos tipos.
Se puede administrar una composición farmacéutica en una cantidad eficaz para lograr un efecto beneficioso deseado.
Una cantidad eficaz puede ser suficiente para proporcionar uno o más de los siguientes beneficios: (i) reducción en al menos un síntoma o signo de un trastorno mediado por el complemento; (ii) aumento de la calidad de vida; (iii) reducción de la hospitalización; (iv) reducción de la mortalidad. Un experto habitual en la materia apreciará que el efecto beneficioso particular dependerá al menos en parte de diversos factores, tales como el trastorno particular que trata. Un experto habitual en la materia será consciente de los síntomas y signos que pueden aparecer en sujetos con trastornos mediados por el complemento. Se describen en el presente documento ejemplos de síntomas y signos de diversos trastornos del complemento. Por ejemplo, p. ej., en donde un sujeto padece HPN o SHUa, un efecto beneficioso puede ser una reducción de la lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento. Un efecto beneficioso puede ser estadísticamente significativo y/o terapéuticamente significativo dentro del criterio de un experto en la materia.
Una composición farmacéutica que comprende un análogo de compstatina reactivo con células, de acción prolongada 0 dirigido puede administrarse por vía parenteral. La composición puede administrarse por vía intravenosa. La composición puede administrarse por inyección intravenosa. La composición puede administrarse como una embolada IV o una infusión IV. La composición puede administrarse como un gotero IV. La composición puede administrarse como una embolada IV seguido de una infusión IV o un gotero IV. Se puede administrar una infusión IV durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 15, 20, 30, 60 o 120 minutos. Se puede administrar un gotero IV durante más de aproximadamente 60 minutos, p. ej., durante aproximadamente 1,2, 3 o más horas. Se puede administrar una cantidad total de entre aproximadamente 0,1 mg/kg/día y aproximadamente 2.000 mg/kg/día de análogo de compstatina, p. ej., entre aproximadamente 1 mg/kg/día y aproximadamente 1.000 mg/kg/día, p. ej., entre aproximadamente 5 mg/kg/día y aproximadamente 500 mg/kg/día. Se puede administrar una cantidad total de entre aproximadamente 10 mg/kg/día y aproximadamente 100 mg/kg/día de análogo de compstatina, p. ej., entre aproximadamente 10 mg/kg/día y aproximadamente 50 mg/kg/día p. ej., entre aproximadamente 10 mg/kg/día y aproximadamente 20 mg/kg/día. Se pueden administrar entre aproximadamente 0,5 mg/kg/día y aproximadamente 10 mg/kg/día de análogo de compstatina. Se pueden administrar entre aproximadamente 1 mg/kg/día y aproximadamente 5 mg/kg/día de análogo de compstatina. Se pueden administrar entre aproximadamente 1 mg/kg/día y aproximadamente 3 mg/kg/día de análogo de compstatina. Se pueden administrar entre aproximadamente 3 mg/kg/día y aproximadamente 5 mg/kg/día de análogo de compstatina. Se pueden administrar entre aproximadamente 5 mg/kg/día y aproximadamente 7.5 mg/kg/día de análogo de compstatina. Se pueden administrar entre aproximadamente 7,5 mg/kg/día y aproximadamente 10 mg/kg/día de análogo de compstatina. Se apreciará que podrían usarse diversos regímenes de dosificación diferentes para administrar una cantidad diaria total deseada. Por ejemplo, se podría administrar una cantidad deseada de análogo de compstatina en una sola administración o en múltiples administraciones, p. ej., durante un periodo de 24 horas. Por ejemplo, un sujeto podría recibir dos o más dosis en un periodo de 24 horas, dosis que podrían administrarse durante el mismo periodo de tiempo o durante diferentes periodos de tiempo. Un análogo de compstatina de acción prolongada, opcionalmente reactivo con células o dirigido puede administrarse a intervalos temporales superiores a 24 horas. Por ejemplo, las dosis se podrían administrar en promedio cada dos días, cada 3-4 días, semanalmente, cada dos semanas, etc. Los análogos de compstatina unidos covalentemente, de acción prolongada o dirigidos pueden proteger células, tejidos, órganos, durante un periodo de semanas o meses sin necesidad de volver a tratar. Por ejemplo, los sujetos pueden mantenerse con nuevo tratamiento a intervalos de entre 1 y 2 semanas, 2-4 semanas, 4-6 semanas, 6-8 semanas o incluso más. Se puede usar administración subcutánea para administrar al menos algunas dosis. Por ejemplo, se contempla administración de aproximadamente 0,1­ 5 mg/kg/día, p. ej., aproximadamente 0,5-2 mg/kg/día, p. ej., en un volumen de aproximadamente 0,25 ml-2 ml, p. ej., un volumen de aproximadamente 1 ml. La concentración puede ser de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, p. ej., aproximadamente 50 mg/ml - aproximadamente 100 mg/ml o aproximadamente 100 mg/ml - aproximadamente 200 mg/ml. La administración puede ser diaria. La administración puede ser 1 o 2 veces al día. Como se describe adicionalmente en los ejemplos, la administración subcutánea diaria de un análogo de compstatina de acción prolongada ilustrativo logró fácilmente niveles en sangre muy superiores a 5 micromolar. Puede usarse administración intramuscular para administrar cantidades similares de compuesto. Se puede administrar un análogo de compstatina de acción prolongada usando una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto, en donde dicha administración da como resultado concentraciones en sangre del compuesto que alcanzan un nivel superior a al menos 1 pM, al menos 2 pM, al menos 2,5 pM, , al menos 3 pM, al menos 4 pM, al menos 5 pM, al menos 6 pM, al menos 7 pM, al menos 8 pM, al menos 9 pM, al menos 10 pM, al menos 11 pM, al menos 12 pM o al menos 13 pM, al menos 14 pM, al menos 15 pM, al menos 16 pM, al menos 18 pM, o al menos aproximadamente 20 pM, o al menos aproximadamente 25 pM o dentro de cualquier intervalo entre 4 pM y aproximadamente 15 pM o aproximadamente 20 pM o aproximadamente 25 pM. Dicho nivel puede mantenerse durante al menos aproximadamente 24 horas, o al menos aproximadamente 48 horas, o al menos aproximadamente 72 horas, o al menos aproximadamente 96 horas, o al menos aproximadamente 120 horas o al menos aproximadamente 144 horas después de una sola inyección IV o después de inyecciones subcutáneas diarias durante aproximadamente 5-7 días. Se pueden alcanzar niveles constantes durante más tiempo, p. ej., hasta aproximadamente 10 días, 12 días, 14 días o más. Un sujeto puede ser tratado para mantener un nivel en equilibrio de aproximadamente 1,0 pM, aproximadamente 2,0 pM, aproximadamente 2.5 pM, aproximadamente 3,0 pM, aproximadamente 3,5 pM, aproximadamente 4,0 pM, aproximadamente 4,5 pM, aproximadamente 5,0 pM, aproximadamente 5,5 pM, aproximadamente 6,0 pM, aproximadamente 6,5 pM, aproximadamente 7,0 pM, aproximadamente 7,5 pM, aproximadamente 8,0 pM, aproximadamente 8,5 pM, aproximadamente 9,0 pM, aproximadamente 9,5 pM o aproximadamente 10 pM. Un nivel en equilibrio puede tener un valor entre aproximadamente 1,0 pM y aproximadamente 10,0 pM, p. ej., entre aproximadamente 2,0 pM y aproximadamente 5,0 pM, entre aproximadamente 2,5 pM y aproximadamente 5,0 pM, entre aproximadamente 5,0 |jM y aproximadamente 7,5 j M o entre aproximadamente 7,5 j M y aproximadamente 10 j M, o cualquier valor intermedio dentro de cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente. Una concentración puede ser suficiente para inhibir sustancialmente la lisis de glóbulos rojos de pacientes con HPN expuestos al suero humano in vitro, p. ej., usando un ensayo de Ham modificado usando suero humano (véase, p. ej., ejemplo 8). Una concentración puede ser suficiente para reducir al menos en 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, la lisis de glóbulos rojos de pacientes con HPN expuestos al suero humano in vitro, p. ej., usando un ensayo de Ham modificado usando suero humano (véase, p. ej., ejemplo 8). Se puede realizar un ensayo de Ham usando suero humano ajustado a un nivel de magnesio a aproximadamente 0,005 mol/l y un pH reducido a aproximadamente 6,2 para activar el complemento. Los ejemplos 18 y 19 presentan datos que confirman la capacidad de los análogos de compstatina descritos en el presente documento para inhibir la lisis de glóbulos rojos de pacientes con HPN.
Los análogos de compstatina de acción prolongada pueden proteger a los glóbulos rojos de pacientes con HPN de la acumulación de cantidades significativas de C3 y/o productos de activación de C3 en su superficie. Por ejemplo, los glóbulos rojos de HPN que están protegidos de la lisis mediada por el complemento por análogos de compstatina de acción prolongada, también pueden estar protegidos contra la acumulación de cantidades significativas de C3 y/o productos de activación de C3 en su superficie. Como se conoce en la técnica, eculizumab (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals. Inc.), es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-C5 que está aprobado para el tratamiento de HPN y SHUa en varios países (véase, p. ej., Dmytrijuk A, FDA report: eculizumab (Soliris) for the treatment of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Oncologist. septiembre de 2008; 13 (9): 993-1000. doi: 10.1634/theoncologist.2008-0086. Epub 10 de septiembre de 2008; Westra D., A new era in the diagnosis and treatment of atypical haemolytic uraemic syndrome. Neth J Med. abril de 2012; 70 (3): 121-9). Se ha informado de que cuando los glóbulos rojos de HPN se exponen a eculizumab, pueden presentar acumulación de cantidades significativas de C3 y/o productos de activación de C3 en su superficie, lo que puede contribuir a la eliminación y/o hemólisis extravascular de estas células (p. ej., en el bazo) y pueden, por tanto, explicar al menos en parte las anomalías hematológicas persistentes, p. ej., anemia persistente, observas en algunos pacientes con HPN a pesar del tratamiento con eculizumab. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, esto se puede producir debido a la inhibición de la formación del MAC por eculizumab, que protege las células de la lisis mediada por MAC pero no inhibe la activación de C3 o el depósito de C3 y/o productos de la activación de C3 y deja a las células de HPN vulnerables a la activación de C3 en la superficie y al depósito de C3 y/o productos de la activación de C3 debido a su falta de proteínas inhibidoras del complemento ancladas por GPI. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la capacidad de los análogos de compstatina descritos en el presente documento para inhibir la activación de C3 y, de este modo, inhibir la producción de productos de activación de C3 puede proporcionar una ventaja significativa. Se puede usar un análogo de compstatina para tratar a un sujeto que ha sido o está siendo tratado con eculizumab y continúa presentando pruebas de hemólisis, p. ej., hemólisis clínicamente significativa, tal como que provoca anemia y/o que requiere transfusión. Se puede usar un análogo de compstatina a una concentración suficiente para que el nivel de C3 y/o productos de activación de C3 en glóbulos rojos de HPN expuestos al análogo de compstatina (in vitro (p. ej., en un ensayo de Ham) o in vivo) esté dentro del intervalo presentado por glóbulos rojos normales de sujetos sanos. El nivel de C3 y/o productos de activación de C3 en glóbulos rojos de HPN expuestos al análogo de compstatina (in vitro (p. ej., en un ensayo de Ham) o in vivo) puede estar en un intervalo de aproximadamente 1,2, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 del nivel promedio o límite superior de lo normal. El nivel de C3 y/o productos de activación de C3 en glóbulos rojos de HPN expuestos a un análogo de compstatina (in vitro (p. ej., en un ensayo de Ham) o in vivo) puede ser inferior al nivel de C3 y/o productos de activación de C3 en glóbulos rojos de HPN expuestos a Soliris a una concentración que proporciona protección equivalente contra lisis mediada por el complemento. El nivel de C3 y/o productos de activación de C3 en glóbulos rojos de HPN expuestos a un análogo de compstatina (in vitro o in vivo) puede no ser superior a aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 % o 50 % del nivel de C3 y/o productos de activación de C3 en glóbulos rojos de HPN expuestos a eculizumab a una concentración que proporciona protección equivalente contra lisis mediada por el complemento. El nivel de C3 y/o productos de activación de C3 en glóbulos rojos de HPN expuestos al análogo de compstatina (in vitro o in vivo) puede estar en un intervalo de aproximadamente 1,2, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 del nivel promedio o límite superior de un intervalo normal. Las células de HPN pueden comprender o consistir en células de HPN de tipo II, células de HPN de tipo III o una mezcla de las mismas. Los glóbulos rojos pueden ser al menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más glóbulos rojos de tipo III y/o tipo II. Las células pueden comprender algunas células de tipo I. Los glóbulos rojos se pueden clasificar como tipo I, II o III en función del nivel de una proteína anclada a GPI tal como CD59 en su superficie, que puede medirse usando citometría de flujo, inmunofluorescencia o ELISA, p. ej., usando un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo monoclonal) u otro agente de unión que se une con dicha proteína anclada a GPI. La inhibición del depósito de C3 y/o productos de activación de C3 en células o superficies puede usarse como un indicador de eficacia de un análogo de compstatina en otras enfermedades mediadas por el complemento, tales como SHUa, otras enfermedades hemolíticas mediadas por el complemento u otras enfermedades mediadas por el complemento. Por ejemplo, un análogo de compstatina puede inhibir dicha deposición en células endoteliales en un sujeto con SHUa. El nivel de C3 y/o producto(s) de activación C3 puede medirse usando citometría de flujo, inmunofluorescencia o ELISA, p. ej., usando un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo monoclonal) u otro agente de unión que se une con C3 y/o con uno o más productos de activación de C3. Un producto de activación de C3 puede ser C3b, C3c o C3d. Un agente de unión puede unirse con C3d. Un agente de unión puede unirse con C3d y al menos a otro producto de activación de C3. Los glóbulos rojos de pacientes con HPN que han entrado en contacto con un análogo de compstatina in vitro (p. ej., en un ensayo de Ham) pueden protegerse del complemento activado de modo que la proporción relativa (porcentajes) de células de tipo I, tipo II y tipo III o la proporción relativa o porcentajes de tipo III y tipo I, tipo II y tipo I o tipo III y tipo II, son aproximadamente iguales que en un ensayo de control en el que se usa complemento inactivado (p. ej., complemento inactivado por calor). Los glóbulos rojos de pacientes con HPN que han entrado en contacto con un análogo de compstatina in vitro (p. ej., en un ensayo de Ham) pueden protegerse del complemento activado de modo que la proporción relativa o porcentajes de células de tipo I, tipo II y tipo III o la proporción relativa o porcentajes de tipo III y tipo I, tipo II y tipo I o tipo III y tipo II, están en un intervalo de 5 % de las proporciones o porcentajes obtenidos en un ensayo de control en el que se usa complemento inactivado (p. ej., complemento inactivado por calor). El complemento puede inactivarse mediante inactivación por calor, que puede realizarse calentando componentes del complemento o suero o plasma que contiene componentes del complemento a 56 grados C o más.
Pueden usarse adicionalmente o como alternativa mediciones de LDH (una enzima que es abundante en glóbulos rojos y puede actuar como un marcador de hemólisis), uno o más parámetros hematológicos tales como hematocrito, mediciones de hemoglobina y/o reticulocitos para determinar la cantidad de lisis. Se pueden usar uno o más de dichos métodos para determinar la cantidad de lisis de los glóbulos rojos, p. ej., glóbulos rojos que son susceptibles a la lisis mediada por el complemento, p. ej., células de pacientes con HPN, células de pacientes con SHUa, células de sujetos con otros trastornos hematológicos mediados por el complemento, células expuestas a niveles anormalmente altos de activación del complemento. Se puede usar un análogo de compstatina en un método que comprende poner en contacto una o más células in vitro o in vivo con el análogo de compstatina y medir el efecto del análogo de compstatina en uno o más indicadores de daño celular mediado por el complemento y/o activación o depósito del complemento de la superficie celular. Poner en contacto la o las células durante un tiempo suficiente a una concentración suficiente puede dar como resultado una reducción de un valor anormalmente alto o un aumento de un valor anormalmente bajo dentro de un intervalo normal o a una distancia de 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % del límite inferior o superior de un intervalo normal.
Se puede usar un análogo de compstatina para tratar una enfermedad hemolítica mediada por el complemento, tal como HPN, en donde dicho uso comprende seleccionar o modificar un régimen de dosificación o uno o más componentes de un régimen de dosificación para un paciente que lo necesite. El o los componentes de un régimen de dosificación pueden comprender una dosis, intervalo de dosificación, vía de administración (p. ej., IV o subcutánea) o combinación de los mismos. Una dosis puede ser una dosis de carga, dosis de mantenimiento o ambas. Se pueden obtener una o más muestras de sangre de un paciente y un régimen de dosificación o componente del mismo para un análogo de compstatina de acción prolongada, se pueden seleccionar o modificar para lograr un nivel deseado de protección de los glóbulos rojos del paciente contra la lisis y/o contra la acumulación de C3 y/o productos de activación de C3 in vitro. Una o más dosis de un análogo de compstatina de acción prolongada, se pueden administrar a un paciente y posteriormente se pueden obtener una o más muestras de sangre de un paciente y evaluar el nivel de C3 y/o producto(s) de activación de C3 en su superficie. Un régimen de dosificación o componente del mismo, p. ej., una dosis, intervalo de dosificación o vía de administración, puede seleccionarse o modificarse para lograr un nivel deseado de protección de los glóbulos rojos del paciente contra la lisis y/o la acumulación de C3 y/o productos de activación de C3 in vitro o in vivo. Un régimen de dosificación o componente del mismo, p. ej., dosis, intervalo de dosificación o vía de administración, puede seleccionarse o modificarse para lograr un nivel deseado de protección de los glóbulos rojos del paciente contra la eliminación extravascular y/o la lisis extravascular in vivo. Un nivel deseado puede ser, p. ej., un nivel que se acepta en la técnica que proporciona un beneficio clínicamente significativo, un nivel que proporciona un beneficio clínicamente significativo para un paciente en particular, un nivel que está dentro del intervalo normal, un nivel seleccionado por un facultativo o cualquier otro nivel seleccionado. Un intervalo normal para un parámetro puede ser conocido en la técnica y/o puede ser un intervalo de referencia establecido por un laboratorio, p. ej., un laboratorio clínico, en donde el valor del parámetro relevante medido en al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la población general o al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los individuos sanos (que opcionalmente se pueden ajustar para una o más variables demográficas tales como sexo, edad, etc.) o muestras biológicas de ensayo obtenidas de los mismos (tales como muestras de sangre) quedarían dentro del intervalo de referencia. Se puede establecer un intervalo de referencia usando una población de muestras representativa de la población general o representativa de individuos sanos.
Un análogo de compstatina de acción prolongada que comprende un CRM puede diseñarse para conferir una velocidad de absorción sistémica más lenta después de la administración subcutánea o intramuscular a un sujeto en comparación con un análogo de compstatina que no comprende un CRM. Las propiedades particulares de CRM, p. ej., longitud, pueden seleccionarse para conferir una velocidad deseada de absorción sistémica después de la administración subcutánea o intramuscular en comparación con al menos algunos otros CRM. La Cmáx puede reducirse en comparación con una dosis comparable de un análogo de compstatina no ligado a un CRM, lo que puede contribuir de este modo a mantener la concentración en plasma dentro de una ventana deseada, p. ej., la ventana terapéutica, para el compuesto. Una composición análoga de compstatina de acción prolongada puede caracterizarse por que una dosis, cuando se administra por vía subcutánea, parece completamente absorbida en un periodo de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 15, 30, 45, 60, 90 o 120 horas después de la administración en función de la observación visual en el sitio de inyección.
Se entenderá que puede haber una fase de tratamiento inicial durante la que el tratamiento es más frecuente y/o en la que se administran dosis mayores. Por ejemplo, en un sujeto con HPN o SHUa, pueden ser necesarias varias dosis para lograr la protección de una fracción sustancial de los glóbulos rojos del sujeto. A continuación, se podrían usar dosis más bajas y/o dosificación menos frecuente, p. ej., para proteger los glóbulos rojos recién formados y/o para reponer la protección de los glóbulos rojos existentes. Por supuesto, se pueden seguir enfoques similares para el tratamiento de cualquier enfermedad cuando sea adecuado. El tratamiento puede iniciarse usando administración IV y después cambiarse a subcutánea, intramuscular o intradérmica para terapia de mantenimiento. Dependiendo de la enfermedad, el tratamiento puede continuar a intervalos durante, p. ej., meses, años o indefinidamente. Las dosis y el régimen de dosificación adecuados dependen, al menos en parte, de la potencia y la semivida del análogo de compstatina (u otro agente activo) y, opcionalmente, pueden adaptarse al receptor particular, por ejemplo, mediante la administración de dosis crecientes hasta lograr una respuesta deseada preseleccionada, tal como un grado deseado de inhibición del complemento y/o protección celular. Si se desea, el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular puede seleccionarse en función al menos en parte de diversos factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la afección particular que se trate, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, la vía de administración, la velocidad de secreción, cualquier combinación de fármacos y/o el grado de expresión o actividad de la proteína del complemento medido en una o más muestras obtenidas del sujeto.
La invención abarca un análogo de compstatina de la invención para su uso en combinación con terapia adicional. Dicha terapia adicional puede incluir la administración de cualquier agente o agentes usados en la técnica o potencialmente útiles para tratar a un sujeto que padece la enfermedad.
Cuando dos o más terapias (p. ej., compuestos o composiciones) se usan o administran "en combinación" entre sí, se pueden proporcionar al mismo tiempo, en periodos de tiempo solapantes o secuencialmente (p. ej., separados por hasta 2 semanas en el tiempo). Se pueden administrar a través de la misma vía o vías diferentes. Los compuestos o las composiciones pueden administrarse en un intervalo de 48 horas entre sí. Se puede proporcionar un análogo de compstatina antes o después de la administración del(de los) compuesto(s) adicional(es), p. ej., suficientemente cerca en el tiempo para que el análogo de compstatina y el(los) compuesto(s) adicional(es) estén presentes en niveles útiles dentro del cuerpo al menos una vez. Los compuestos o las composiciones pueden administrarse suficientemente cerca en el tiempo para que no más del 90 % de la primera composición administrada se haya metabolizado a metabolitos inactivos o se haya eliminado, p. ej., secretado, del cuerpo, en el momento en que se administra el segundo compuesto o composición.
Se puede administrar una composición que incluye tanto el análogo de compstatina reactivo con células como compuesto(s) adicional(es).
Se proporcionan ejemplos que quedan fuera del alcance de las reivindicaciones adjuntas solo como referencia. Ejemplo de referencia 1: Desarrollo de análogos de compstatina PEGilados que conservan actividad inhibidora del complemento sustancial
Se sintetizó un análogo de compstatina que tiene la secuencia de aminoácidos del análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 28, pero que incorpora un resto de AEEAc-Lys ubicado en dirección C-terminal del residuo Thr de la SEQ ID NO: 28 para fines de conjugación posterior de un p Eg activado con éster de NHS con el grupo amino de la cadena lateral de Lys. El compuesto se sintetizó usando métodos convencionales. En resumen, se obtuvieron aminoácidos (incluyendo AEEAc) como aminoácidos protegidos por Fmoc, en los que el grupo a-amino de cada aminoácido estaba protegido con Fmoc. Los grupos funcionales de cadena lateral también se bloquearon con diversos grupos protectores adecuados. Se realizó síntesis siguiendo la metodología de fase sólida descrita por Merrifield (J. Amer. Chem. Soc.
85, 2149 (1963)). Se realizó ensamblaje de cadena en fase sólida, a cuyo término se acetiló el extremo N; después el péptido se escindió de la fase sólida y se desprotegió simultáneamente mediante acidólisis usando TFA y se amidó. Después el péptido lineal se oxidó y se purificó. El análogo de compstatina resultante se representa de la siguiente manera Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 51), abreviado como CA28-AEEAc-Lys. Obsérvese que, por razones de brevedad, el grupo acetilo N-terminal y los grupos amino C-terminales se omiten en esta abreviatura. Se acoplaron PEG monofuncionales, lineales activados con éster de NHS con pesos moleculares de 30 kD y 40 kD (NOF America Corp. White Plains, NY, Cat. n.° SUNBRIGHT® ME-300GS y Cat. n.° SUNBRIGHT® ME-400GS), respectivamente, a la cadena lateral de lisina de CA28-AEEAc-Lys, dando como resultado análogos de compstatina de acción prolongada representados de la siguiente manera: CA28-AEEAc-Lys-(PEG30k) y CA28-AEEAc-Lys-(PEG40k), y se purificaron. Obsérvese que el número después del término "PEG" y que precede a la letra "k" representa el peso molecular del resto de PEG en kilodaltons y la "k" es una abreviatura de kD). CA28-AEEAc-Lys-(PEG30k) también se denomina CA28-1. CA28-AEEAc-Lys-(PEG40k) también se denomina CA28-2.
Se evaluó la actividad inhibidora de los compuestos sintetizados midiendo el efecto de los compuestos sobre la activación del complemento a través de la ruta clásica usando un ensayo de inhibición del complemento convencional. El protocolo mide el depósito de C3b en un formato ELISA. Se genera depósito de C3b supervisado usando este método a través del complemento activado por la ruta clásica. En resumen, se recubren placas de 96 pocillos con BSA. Se añaden plasma humano, ovoalbúmina de pollo (OVA), anticuerpos policlonales anti-OVA y el compuesto que se prueba (denominado "fármaco") y se incuban, seguido de la adición de anticuerpo anti-C3 humano conjugado con HRP. Después de una incubación adicional, se añade sustrato y se detecta la señal. Los detalles del protocolo son los siguientes:
Protocolo para el ensayo de inhibición del complemento clásico
Materiales:
Placa de noventa y seis pocillos (placa de poliestireno, Thermo Scientific, 9205)
OVA de pollo (Sigma A5503-5G)
Conejo anti-OVA pollo (Abcam ab1221)
Tampón de bloqueo (tampón Startingblock, Thermo Scientific 37538)
Tampón Veronal (concentración 5X, Lonza 12-624E)
Plasma humano (recogido con lepirudina a una concentración final de 50 ug/ml)
Ab de cabra conjugado con HRP anti-C3 humano (MP Biomedicals, 55237)
Tampón de lavado de Tween-20 (tampón de PBS-Tween 200,05 %)
TMB (sustrato de peroxidasa, BD 555214) - mezcla 1:1 de BD 51-2607KC y 51-2606KC.
H2 SO4 1 M
Protocolo:
1. Añadir 100 ul/pocillo de OVA de pollo al 1 % (en PBS)
2. Incubar durante una noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
3. Retirar agitando y golpeando la placa.
4. Bloquear añadiendo 200 ul de tampón de bloqueo
5. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente
6. Retirar agitando y golpeando la placa
7. Añadir 100 ul de dilución 1:1000 de policlonal anti-OVA de pollo en tampón de bloqueo 8. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente
9. Lavar dos veces con tampón de lavado
10. Añadir 50 ul de VB++ a los pocillos n.° 2 a 12
11. Añadir 100 ul de dilución inicial del fármaco (2X en VB++) al pocillo 1.
12. Diluir en serie (1:2) el fármaco de los pocillos 1 a 10 de la siguiente manera
a. Tomar 50 ul de solución del pocillo de origen
b. Añadir esta al siguiente pocillo
c. Mezclar pipeteando varias veces
d. Repetir hasta el pocillo n.° 10
Nota: del pocillo n.° 10 retirar 50 ul y desechar.
13. Añadir 50 ul de dilución de plasma 2X (dilución 1:37,5 del plasma original) a los pocillos 1 a 11 14. Incubar durante 1 hora
15. Lavar con tampón de lavado
16. Añadir 100 ul de dilución 1/1000 de Ab anti-C3-HRP en tampón de bloqueo
17. Incubar durante 1 hora
18. Lavar con tampón de lavado
19. Añadir 100 ul de TMB a todos los pocillos
20. Incubar durante 5-10 minutos en la oscuridad
21. Añadir 50 ul de H2 SO4 1 M
22. Leer la placa a 450 nm
VB++
Fórmula:
Barbital 5 mM
NaCl 72,5 mM
MgCl2 0,5 mM
CaCl2 0,15 mM
pH 7,4
Soluciones de reserva:
Tam ón Veronal 5X
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
-
Figure imgf000074_0002
CaCl2 500x
Figure imgf000074_0003
Para preparar 50 ml de tampón de trabajo:
Pesar 210 mg de NaCI
Añadir 10 ml de VB 5X
Añadir 100 ul de CaCl2 (500X)
Añadir 250 ul de MgCI (200X)
Ajustar el volumen a 50 ml con H2 O
Ajustar el pH a 7,4
Los datos se analizaron usando el software GraphPad Prism5. Los conjuntos de datos de cada experimento se normalizaron con respecto al porcentaje de activación en comparación con el control de activación del 100 % correspondiente al pocillo al que no se añade ningún compuesto. Los valores de concentración de fármaco (valores X) se transformaron a sus logaritmos y el porcentaje de activación (Pa) (valores Y) se transformó en porcentaje de inhibición (Pi) usando la siguiente fórmula Pi=100-Pa (Yi=100-Ya). El porcentaje de inhibición se representó frente a la concentración del fármaco y el conjunto de datos resultante se ajustó a una función de respuesta a la dosis sigmoidea [Y=Inferior+(Superior-Inferior)/(1 10((Log EC-X)))]. Se obtuvieron valores de CI50 de los parámetros de ajuste.
Los resultados se presentan en la figura 1 y los valores de CI50 se muestran en la tabla 2 (en el ejemplo 2). Como se indica, CA28-1 y CA28-2 presentaron aproximadamente 30 % de la actividad de CA28 en molaridad.
Ejemplo de referencia 2: Desarrollo de análogos de compstatina de acción prolongada que demuestran mayor actividad molar
PEG activado con éster de NHS de ocho ramas con peso molecular de 40 kD (NOF America Corp. White Plains, NY, Cat. n.° SUNBRIGHT® HGEO-400GS; fórmula química: hexaglicerol octa(succinimidiloxiglutaril)polioxietileno) se acopló a la cadena lateral de lisina de CA28-AEEAc-Lys, dando como resultado análogos de compstatina de acción prolongada representados de la siguiente manera: (CA28-AEEAc)s-PEG40k, también denominado CA28-3. La actividad inhibidora del complemento de CA28-3 se probó usando el ensayo descrito en el ejemplo 1. Los resultados se representan en la figura 1 y el valor de CI50 se enumera en la tabla 2, ambos en función de la concentración de CA28. La concentración de cA28 se calculó usando el coeficiente de extinción de CA28 a 283 nm (10208,14 lmol-1 cm-1). Basándose en otro análisis (absorción UV frente a masa de material y análisis elemental del % de CHN) se concluyó que hay 7,5 restos de CA28 por molécula de CA28-3. Por tanto, la actividad de CA28-3 en molaridad es 7,5 veces mayor que la mostrada en la figura 1 y la tabla 2. Por tanto, el valor de CI50 en la tabla 2 es 7,5 veces mayor que la Cl50 real de CA28-3 en molaridad. La CI50 de CA28-3 en molaridad se calcula como aproximadamente 0,26 (menor que la del compuesto original CA28). La figura 2 muestra el porcentaje de actividad inhibidora de la activación del complemento de CA28 y los análogos de compstatina de acción prolongada CA28-2 y CA28-3, en función de la concentración de CA28-3 (pM), es decir, la actividad de CA28-3 se ha corregido para tener en cuenta el hecho de que el compuesto contiene 7,5 restos de CA28. En molaridad, la actividad inhibidora del complemento de CA28-3 supera la de CA28.
Tabla 2
Figure imgf000074_0004
Se observó que la solubilidad de CA28-1, CD28-2 y CA28-3 en agua con o sin diversas sustancias tamponantes y/o excipientes superaba la del compuesto original CA28.
Ejemplo de referencia 3: Análogos de compstatina de acción prolongada que demuestran aumento drástico de semivida y Cmáx en plasma
Este ejemplo describe la determinación de parámetros farmacocinéticos de análogos de compstatina de acción prolongada CA28-2 y CA28-3 después de su administración a monos cinomolgos.
Dosificación y recogida de muestras
Se administraron CA28-2 y CA28-3 en el momento 0 mediante inyección intravenosa en monos cinomolgos hembra (tres por grupo, 2-5 años de edad, 2,9-3,5 kg). Los compuestos se administraron a 50 mg/kg en dextrosa al 5 % en agua a una concentración de 25 mg/ml. Se recogieron muestras de ensayo de sangre (~1 ml cada una) de la vena femoral en los siguientes puntos temporales: Predosis, 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora (h), 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h (4 días) y 192 h (8 días) después de la dosis. Se recogieron muestras de ensayo mediante venopunción directa y se colocaron en un tubo de suero de tapón rojo que no contenía anticoagulante y se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Las muestras de sangre se centrifugaron a una temperatura de 4 °C a 3000 x g durante 5 minutos. Las muestras se mantuvieron refrigeradas durante todo el procesamiento. Se recogieron muestras de suero después de la centrifugación y se colocaron en tubos de muestra. Las muestras se almacenaron en un congelador ajustado para mantener de -60 °C a -80 °C. Todos los animales mostraron actividad normal durante todo el estudio. No se observaron anomalías relacionadas con los compuestos en los animales durante todo el estudio.
Análisis de las muestras. Las muestras de plasma obtenidas como se ha descrito anteriormente se analizaron mediante LC/MS/MS usando los siguientes métodos para determinar la concentración del compuesto: se mezclaron 50 |jl de muestra con patrón interno (CA28-AEEAc-Arg) y después se añadieron 100 j l de NH4OAc 1 M, pH 3,5 con HOAc y se mezclaron. Después se añadieron 250 j l de acetonitrilo y se mezclaron. La muestra se centrifugó y el sobrenadante se vertió en otro tubo y se secó. La muestra se reconstituyó y se inyectó en el sistema de LC/MS/MS. La fase móvil A fue NH4OAc 5 mM con FA al 0,1 % y la fase móvil B fue 90:10 (ACN:NH4OAc 50 mM) con FA al 0,1 %. La columna LC fue la Intrada WP-RP de 2x150 mm, 3 j . La cuantificación se realizó en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo API-4000 de Applied Biosystems operado en modo de ion positivo. Se usó disociación inducida por colisión en la fuente (CID) para fragmentar el compuesto en la fuente del espectrómetro de masas y el ion m/z 144 se seleccionó por masa en Q1, se fragmentó y la masa de iones m/z 77 se seleccionó en Q3 y se detectó. Los datos se procesaron usando el software Analyst 1.4.2.
Resultados. Las concentraciones en suero en microgramos/ml de CA28-2 y CA28-3 en cada punto temporal se presentan en la tabla 3 a continuación. Se muestran datos para cada uno de 3 monos que recibieron el compuesto indicado. Los valores promedio y las desviaciones típicas se calculan fácilmente. Hubo notable uniformidad entre los animales. CA28 son datos históricos obtenidos en un estudio previo en el que se administró CA28 por vía intravenosa a monos cinomolgos. En ese estudio, se detectó CA28 en muestras usando HPLC.
Tabla 3
Concentración en suero en ug/ml
Tiempo CA28-3 (PEG 40k de 8 ramas)
(días) (50 mg/kg) CA28 (200 mg/kg) CA28-2 (PEG 40k lineal) (50 mg/kg)
0,0035 1600 1330 1300 1460 1660 1610
0,01 1600 1220 1480 1360 1430 1530
0,02 1510 1170 1270 34 1310 1510 1500
0,042 1270 1030 1220 17 1290 1340 1540
(continuación)
Concentración en suero en ug/ml
Tiempo CA28-3 (PEG 40k de 8 ramas)
(días) (50 mg/kg) CA28 (200 mg/kg) CA28-2 (PEG 40k lineal) (50 mg/kg)
0,167 926 893 934 9 1200 1210 1390
0,333 797 714 792 5 1190 1180
1 621 479 558 1,5 927 853 881
2 384 355 360 612 733 760
4 280 252 262 461 458 424
8 151 136 136 268 282 293
Los resultados para cada compuesto se promediaron y se representan en la figura 3. Se observó un aumento notable de la semivida y la Cmáx tanto para CA28-2 como para CA28-3 en comparación con CA28. Las semividas terminales de CA28-2 y CA28-3 fueron de aproximadamente 4 - 4,5 días. Según estos datos, se espera que la administración intravenosa a intervalos de dosificación de aproximadamente 1-2 semanas proporcione niveles constantes de compuesto e inhiba eficazmente la activación del complemento en sujetos humanos, aunque pueden usarse intervalos de dosificación más cortos o más largos.
Ejemplo de referencia 4: Análogo de Compstatina de acción prolongada que comprende HSA como un resto reductor de la eliminación
Se convirtieron lisinas de cadena lateral de seroalbúmina humana (HSA) en tioles usando 2-iminotiolano y se hicieron reaccionar con un análogo de compstatina que comprendía una maleimida como grupo funcional reactivo: Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-(C(=O)-(CH2)5-Mal)-WH2 (SEQ ID NO: 68). Se probó el análogo de compstatina de acción prolongada resultante (CA28-4) in vitro para determinar la actividad inhibidora del complemento (figura 4) como se ha descrito en el ejemplo 1 e in vivo para determinar las propiedades farmacocinéticas como se ha descrito en el ejemplo 3. Los parámetros farmacocinéticos de CA28-4 después de la administración a monos cinomolgos se determinaron como se ha descrito en el ejemplo anterior. Los resultados se muestran en la figura 5 (junto con los resultados para CA28, CA28-1, CA28-2 y CA28-3). Los datos de PK para CA28-4 se presentan en la tabla 4.
Tabla 4
Concentración en suero en ug/ml
Tiempo
(h)
0,0035 1790,0 1445,00 1395,00
0,0100 1195,0 915,50 885,00
0,0200 900,0 504,50 553,50
0,0420 449,0 267,50 295,00
0,1670 194,0 164,00 158,50
0,3330 150,0 163,00 119,50
1,0000 97,2 86,00 78,05
2,0000 73,3 51,55 57,40
4,0000 43,1 29,20 34,15
8,0000 24,1 16,25 20,00
Ejemplo de referencia 5: Síntesis y actividad de análogos de compstatina basados en PEG usando diferentes PEG activados por NHS
Un análogo de compstatina que tiene la secuencia de aminoácidos del análogo de compstatina de la SEQ ID NO: 28, pero que incorpora un resto de AEEAc-Lys ubicado en dirección C-terminal al residuo Thr de la SEQ ID NO: 28 para fines de conjugación posterior de un PEG activado por éster de NHS con el grupo amino de la cadena lateral de Lys se sintetizó como se ha descrito en el ejemplo 1. El análogo de compstatina resultante se representa de la siguiente manera Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 51), abreviado como CA28-AEEAc-Lys. Se acoplaron PEG de éster/carbonato monofuncionales, activados por monometoxi-NHS lineales con pesos moleculares de 40 kD y diferentes con respecto a la química de unión de carboxilato de NHS (NOF America Corp. White Plains, NY, Cat. n.° SUNBRIGHT® ME-400CS, SUNBRIGHT® ME-400GS, SUNBRIGHT® ME-400HS, SUNBRIGHT® ME-400TS) con la cadena lateral de lisina de CA28-AEEAc-Lys a través de un enlace amida. (El residuo Lys es Lys15 ya que el conector AEEAc contiene un residuo de aminoácido). Todos los compuestos estaban acetilados en el extremo N, amidados en el extremo C y ciclados a través de un enlace disulfuro entre Cys2 y Cys12. (La acetilación, amidación y ciclación se realizaron antes del acoplamiento con el PEG). Los compuestos se prepararon como sales de trifluoroacetato y se purificaron. Los compuestos se representan como se muestra en la siguiente tabla (tabla 5). Las letras CS, GS, HS y TS representan los diferentes restos conectores entre el resto de PEG y el resto de NHS como se indica con más detalle en la tabla 5. Se entenderá que diversos nombres y abreviaturas para cada compuesto pueden usarse indistintamente. Obsérvese que CA28-2 (véase el ejemplo i ) es el mismo que CA28-2GS.
Tabla 5: Análo os de com statina basados en PEG ue contienen un resto análo o de com statina
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Los compuestos se analizaron mediante HPLC de fase inversa. La figura 6 muestra un cromatograma representativo para uno de los compuestos. Se usó una columna VariTide RPC. El eluyente A fue TFA al 0,1 % en agua; El eluyente B fue TFA al 0,1 % en 50 % de CAN/40 % de agua. El caudal fue de 1.000 ml/min con un gradiente de 0 % de B a 100 % de B durante 40 minutos. El pico con un tiempo de retención de 33,68 minutos representa el compuesto PEGilado y tiene un área relativa de 96,50 %.
Se evaluó la actividad inhibidora de los compuestos midiendo el efecto de los compuestos sobre la activación del complemento a través de la ruta clásica usando un ensayo de inhibición del complemento convencional como se ha descrito en el ejemplo 1. Los resultados se representan en la figura 7. Estos resultados representan una combinación de dos experimentos separados. Los compuestos mostraron actividad inhibidora del complemento notablemente similar.
Ejemplo 6: Síntesis y actividad de análogos de compstatina bifuncionalizados basados en PEG
Se obtuvieron PEG de éster/carbonato bifuncionales, activados con monometoxi-NHS lineales con pesos moleculares de 40 kD y que difieren con respecto a la química de unión de carboxilato de NHS de NOF America Corp. (White Plains, NY). Los PEG activados se acoplaron con la cadena lateral de lisina de CA28-AEEAc-Lys a través de un enlace de amida de modo que se acoplaron dos restos de CA28-AEEAc-Lys a cada cadena de PEG. Todos los compuestos se acetilaron en el extremo N y se amidaron en el extremo C de los restos de CA28-AEEAc-Lys y se ciclaron mediante un enlace disulfuro entre Cys2 y Cys12. (La acetilación, amidación y ciclación se realizaron antes del acoplamiento con el PEG). Los compuestos se prepararon como sales de acetato y se purificaron. Los compuestos se representan como se muestra en la siguiente tabla (tabla 6).
Tabla 6: Análo os de com statina bifuncionalizados basados en PEG
Figure imgf000077_0002
continuación
Figure imgf000078_0001
La actividad inhibidora de CA28-2GS-BF se evaluó midiendo el efecto del compuesto sobre la activación del complemento mediante la ruta clásica usando un ensayo de inhibición del complemento convencional como se ha descrito en el ejemplo 1 y analizado como se ha descrito en el ejemplo 1. Los resultados se representan en la figura 8. Como se ha descrito anteriormente, CA28-2GS-BF contiene dos restos análogos de compstatina por molécula. Aunque la actividad por resto análogo de compstatina de CA28-2GS-BF es menor que la actividad de una molécula de CA28 individual, la actividad de los dos compuestos en molaridad es prácticamente idéntica en un amplio intervalo de concentraciones.
Ejemplo 7: Administración subcutánea de análogo de compstatina bifuncionalizada basada en PEG
Este ejemplo describe la determinación de parámetros farmacocinéticos del análogo de compstatina CA28-2GS-BF de acción prolongada después de la administración a monos cinomolgos, ya sea a través de una única inyección intravenosa (IV) o con la administración subcutánea repetida (una vez al día) durante siete días.
Dosificación y recogida de muestras Se administró CA28-2GS en el momento 0 mediante inyección intravenosa o mediante inyección subcutánea repetida (diariamente, durante siete días) en monos cinomolgos machos. Se usaron en el estudio seis monos cinomolgos machos previamente expuestos, de edad 1-5 años, cuyo peso varía entre 4,6 y 5,3 kilogramos (tres por grupo). Los animales estaban sanos al comienzo de la prueba. Siete días. El estudio no tuvo ocultación. Se proporcionó a los animales agua a voluntad y una dieta comercial dos veces al día antes del inicio del estudio. Se proporcionó comida a los animales según el PNT de la instalación antes del estudio. Los animales no se sometieron a ayunas. Los animales se dosificaron mediante administración intravenosa y subcutánea en el momento 0 el día adecuado. Se usó una aguja de calibre de tamaño 22 para la administración subcutánea. El compuesto se administró a 50 mg/kg en dextrosa al 5 % en agua a una concentración de 25 mg/ml. Se recogieron muestras de ensayo de sangre (~1 ml cada una) de la vena femoral en los siguientes puntos temporales: Día 1: Predosis, 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora (h), 4 h, 8 h. Días 2 - 9: 0 min. Día 16: Muestra final basada en la dosificación del día 1. Cada muestra de sangre (-1,0 ml) se recogió de la vena femoral o safena del mono mediante venopunción directa y se colocó en un tubo de suero de tapón rojo que no contenía anticoagulante y se mantuvo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Las muestras de sangre se centrifugaron a una temperatura de 4 °C a 3000 x g durante 5 minutos. Las muestras se mantuvieron refrigeradas durante todo el procesamiento. Se recogieron muestras de suero después de la centrifugación y se colocaron en tubos de muestra. Las muestras se almacenaron en un congelador ajustado para mantener de -60 °C a -80 °C. Las muestras de suero y las soluciones de dosificación sobrantes se enviaron congeladas en hielo seco para su análisis.
Se observó el sitio de cada administración subcutánea para ver lo rápido que se absorbió el volumen de inyección y también para ver si la formulación dejó un bulto o desapareció por completo. Los sitios de dosis se observaron en cada punto temporal de recogida y en la tarde de los días 2-7. Todas las dosis se absorbaron durante la duración del estudio. En función de las observaciones, se estima que las dosis se absorbieron en los primeros quince minutos después de la administración. Todos los animales mostraron actividad normal durante todo el estudio. No se observaron anomalías relacionadas con los compuestos en los animales durante todo el estudio.
Análisis de las muestras. Las muestras de plasma obtenidas como se ha descrito anteriormente se analizaron mediante LC/MS/MS aprovechando la DIC (degradación inducida por colisión) de manera similar al método descrito en el ejemplo 3.
Resultados. La concentración en suero frente al tiempo para CA28-2GS-BF cuando se administra por vía IV o por vía subcutánea como se ha descrito anteriormente se representa en la figura 9, Los puntos de datos representan todos los compuestos de CA28 PEGilados detectados. Los datos de CA28 mostrados en la figura 9 son datos históricos obtenidos en un estudio previo en el que CA28 se administró por vía intravenosa a monos cinomolgos. En ese estudio, se detectó CA28 en muestras usando HPLC.
Se logró una concentración máxima en suero de 500 pg/ml (11 pM) mediante administración subcutánea de CA28-2GS-BF. La semivida terminal de CA28-2GS-BF fue de aproximadamente 5 días cuando se administró por vía IV o por vía subcutánea. Los resultados se resumen en las tablas a continuación:
Tabla 7
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Tabla 8
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Ejemplo 8: Inhibición de la lisis mediada por el complemento de glóbulos rojos de pacientes con HPN
Se realiza una prueba de Ham modificada para medir la capacidad de los análogos de compstatina para inhibir la lisis mediada por el complemento de glóbulos rojos de pacientes con HPN in vitro. El complemento se activa mediante suero acidificado con magnesio añadido para lisar los glóbulos rojos de HPN. La incubación se realiza durante 90 minutos. La lectura es citometría de flujo para glóbulos rojos de HPN usando marcadores convencionales. El suero inactivado por calor se usa como control (no produce hemólisis). El suero acidificado en ausencia de inhibidor del complemento añadido produce lisis máxima. El experimento se realiza con diluciones dobles en serie de los análogos de compstatina CA28, CA28-2, CA28-2CS, CA28-2CS-BD, CA28-2GS, CA28-2GS-BF, CA28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS, CA28-2GS-BF y CA28-3. Se determina la concentración de cada compuesto necesaria para bloquear completamente la hemólisis in vitro. Los glóbulos rojos también se tiñen para depósito de fragmentos C3 usando anticuerpos policlonales anti-C3 que no contienen ningún enlace que conduzca a la aglutinación (p. ej., Ab4214 o Ab14396, ambos Abcam conjugados con FITC disponibles en el mercado, Cambridge, Reino Unido) para medir la capacidad de los compuestos para inhibir la deposición de fragmentos C3 en glóbulos rojos de HPN. Los resultados se comparan con los obtenidos con eculizumab usando los mismos ensayos.
Ejemplo de referencia 9: Análogos de compstatina de acción prolongada en pacientes con HPN
Una cohorte de sujetos a los que se ha diagnosticado HPN se divide en 4 grupos. Los sujetos en los grupos 1 y 2 se tratan con administración intravenosa de CA28-2 o CA28-3, respectivamente, a una dosis de entre 5 mg/kg y 20 mg/kg, a intervalos temporales de entre 1 y 2 semanas. Opcionalmente, el tratamiento se inicia a intervalos temporales más frecuentes y después se reduce su frecuencia para terapia de mantenimiento. Los sujetos en el grupo 3 se tratan con eculizumab según el régimen de dosificación recomendado. El grupo 4 actúa como control (sin terapia inhibidora del complemento). Hemólisis intravascular (basada en la medición de LDH y/o mareaje con (51)Cr de glóbulos rojos), reticulocitosis (un indicador de anemia), hematocrito, concentración de hemoglobina en la sangre, opsonización de glóbulos rojos (depósito de productos de activación de C3, tales como C3b, en glóbulos rojos, que puede detectarse usando citometría de flujo), síntomas de HPN, requisitos de transfusión, acontecimientos tromboembólicos, agotamiento del óxido nítrico asociado a la hemólisis, mediciones de hipertensión pulmonar, calidad de vida y supervivencia se supervisan a lo largo del tiempo. Los resultados se comparan entre grupos y con datos históricos de pacientes con HPN de control obtenidos en ensayos clínicos de eculizumab. Una mejora en la anemia persistente (p. ej., como lo demuestra la reducción de la reticulocitosis, reducción de las pruebas de hemólisis, aumento del hematocrito, aumento de la hemoglobina), mejora de la calidad de vida, reducción de los síntomas de HPN, reducción de los requisitos de transfusión, reducción de los acontecimientos tromboembólicos, reducción del agotamiento del óxido nítrico asociado a la hemólisis, reducción de las medidas de hipertensión pulmonar, mejora de la calidad de vida y/o aumento de la supervivencia, en sujetos que reciben CA28-2 (grupo 1) o CA28-3 (grupo 2), en comparación con los sujetos en el grupo 4, son indicativas de eficacia.
Ejemplo de referencia 10: Análogos de compstatina de acción prolongada en pacientes con HPN
El ejemplo 9 se repite con la modificación de que los sujetos son individuos con HPN que siguen siendo dependientes de transfusión y/o continúan teniendo una hemoglobina por debajo de un límite (tal como 9,0 g/dl) a pesar del tratamiento con eculizumab. Los resultados se comparan entre los grupos.
Ejemplo de referencia 11: Análogos de compstatina de acción prolongada en pacientes con SHUa
Una cohorte de sujetos a los que se ha diagnosticado SHUa se divide en 4 grupos. Los sujetos en los grupos 1 y 2 se tratan con administración intravenosa de CA28-2 o CA28-3, respectivamente, a una dosis de entre 5 mg/kg y 20 mg/kg, a intervalos temporales de entre 1 y 2 semanas. Opcionalmente, el tratamiento se inicia a intervalos temporales más frecuentes y después se reduce su frecuencia para terapia de mantenimiento. Los sujetos en el grupo 3 se tratan con eculizumab según el régimen de dosificación recomendado. La hemólisis intravascular (basada en la medición de LDH), opsonización de glóbulos rojos (depósito de productos de activación de C3, tales como C3b, en glóbulos rojos), síntomas de SHUa, función renal, necesidad de intercambio de plasma o diálisis, calidad de vida y supervivencia se supervisan a lo largo del tiempo. Los resultados se comparan entre grupos y con datos históricos de pacientes con SHUa de control obtenidos en ensayos clínicos de eculizumab. La reducción de las pruebas de hemólisis, mejora de la calidad de vida, reducción de los síntomas de SHUa, reducción de la necesidad de intercambio de plasma o diálisis, aumento de la calidad de vida y/o aumento de la supervivencia, en sujetos que reciben CA28-2 o CA28-3, en comparación con los sujetos en el grupo 4 son indicativos de eficacia.
Ejemplo 12: Los ejemplos 8-11 se repiten usando CA28-2GS-BF, CA28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS y CA28-2GS-TS-BF.
Ejemplo 13: Los ejemplos 9-12 se repiten usando CA28-2GS-BF, CA28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS y CA28-2GS-TS-BF administrados diariamente mediante inyección subcutánea.
Ejemplo 14: Los ejemplos 8-11 se repiten usando análogos de compstatina de acción prolongada adicionales.
Ejemplo 15: Los ejemplos 8-11 se repiten usando análogos de compstatina reactivos con células.
Ejemplo 16: Actividad inhibidora de la activación del complemento de un análogo de compstatina de acción prolongada
CA28 y CA28-AEEAc-Lys se sintetizaron como se ha descrito anteriormente. CA28-2TS-BF se sintetizó usando un PEG bifuncional reactivo del tipo TS con respecto a la química de unión de carboxilato de NHS, que se unió con dos moléculas de CA28-AEEAc-Lys a través de la amina primaria de la cadena lateral de lisina. La actividad inhibidora de la activación del complemento de CA28 y CA28-2TS-BF se evaluó midiendo el efecto de los compuestos sobre la activación del complemento a través de la ruta clásica y a través de las rutas alternativas usando ensayos de inhibición del complemento convencionales. El protocolo para el ensayo de activación de la ruta clásica se ha descrito en el ejemplo 1. El protocolo para la activación de las rutas alternativas también mide la deposición de C3b en un formato de ELISA y se describe a continuación. Se genera depósito de C3b supervisado usando este método a través del complemento activado por la ruta clásica mediante lipopolisacárido (LPS). En resumen, se recubren placas de 96 pocillos con LPS. Se añade el compuesto que se está probando (denominado "fármaco"), seguido de la adición de plasma o suero como fuente de complemento, y se incuba. Esto se sigue de la adición de anticuerpo anti-C3 humano conjugado con HRP. Después de una incubación adicional, se añade sustrato y se detecta la señal. Los detalles del protocolo son los siguientes:
Ensayo basado en ELISA para la activación de la ruta del complemento alternativa
Materiales:
• Placa ELISA de noventa y seis pocillos (Corning 3590)
• LPS de Salmonella typhosa - Sigma L7136 (40 ug/ml en PBS)
• BSA 1 % en PBS - Calbiochem n.° 126626 dilución 1/30
Tampón Veronal MgCh 10 mM EGTA 10 mM (VB-Mg EGTA) Plasma humano (recogido con lepirudina a una concentración final de 5 ug/ml) Ab anti-C3 humano conjugado con HRP (Ab poli para C3-HRP, Cappel 55237) Tampón de lavado Tween-20 (0,05 % en Pb S)
TMB (sustrato de peroxidasa) - mezcla 1:1 de BD 51-2607KC y 51-2606KC. H2 SO43 M
Lector de microplacas
Protocolo:
1. Añadir 50 ul/pocillo de LPS a 40 ug/ml (en PBS)
2. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente
3. Retirar agitando y golpeando la placa.
4. Bloquear añadiendo 200 ul de BSA/PBS al 1 %
5. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente
6. Retirar agitando y golpeando la placa
7. Añadir 50 ul de VB-Mg EGTA a los pocillos n.° 2 a 12
8. Añadir 100 ul de dilución inicial del fármaco (2x en VB-Mg EGTA) al pocillo 1.
9. Diluir en serie (1:2) el fármaco de los pocillos 1 a 10 de la siguiente manera a. Tomar 50 ul de solución del pocillo de origen
b. Añadir esta al siguiente pocillo
c. Mezclar pipeteando varias veces
d. Repetir hasta el pocillo n.° 10
Nota: del pocillo n.° 10 retirar 50 ul y desechar.
10. Añadir 50 ul de dilución de plasma 2x a los pocillos 1 a 11
11. Incubar durante 1 hora
12. Lavar dos veces con tampón de lavado
13. Añadir 50 ul de dilución 1/1000 de Ab C3-HRP en BSA/PBS 1 %
14. Incubar durante 1 hora
15. Añadir 100 ul de TMB a todos los pocillos
16. Incubar durante 30 minutos
17. Añadir 50 ul de H2 SO43 M
18. Leer la placa a 450 nm
Fórmula para VB Mg EGTA
Barbital 5 mM
NaC1 72,5 mM
MgC12 10 mM
EGTA 10 mM
pH 7,3-7,4 Soluciones de reserva:
Tam ón Veronal 5X
Figure imgf000081_0001
M - 12 1 X
Figure imgf000081_0002
EGTA 10x
Figure imgf000081_0003
Para preparar 20 ml de tampón de trabajo:
Pesar 84 mg de NaCI
Añadir 4 ml de VB 5X
Añadir 2 ml de EDTA 10X
Añadir 2 ml de MgCl 10X
Ajustar el volumen a 20 ml con H2 O
Ajustar el pH a 7,4
Resultados
La figura 10(A) muestra el porcentaje de inhibición de la actividad inhibidora de la activación del complemento clásica por CA28 y CA28-2TS-BF en función de la concentración molar de los compuestos. La figura 10(B) muestra el porcentaje de inhibición de la actividad inhibidora de la activación del complemento alternativa por CA28 y CA28-2TS-BF en función de la concentración molar de los compuestos. Los datos sin procesar se tabulan en la tabla 9 a continuación (4 repeticiones de cada condición). Según las curvas de inhibición mostradas en las figuras y los datos subyacentes, la actividad inhibidora del complemento de CA28-2TS-BF es al menos tan grande como la de CA28 en molaridad dentro del error experimental del ensayo. Estos resultados confirman adicionalmente la idoneidad de los análogos de compstatina de acción prolongada descritos en el presente documento, p. ej., con fines terapéuticos.
Tabla 9
Inhibición de AP
% de inhibición
Conc uM CA28 CA28-2TS-BF
25 90,07908 89,9353 90,65421 89,21639 90,25768 91,10484 90,68126 90,96365 12,5 88,92883 89,21639 89,21639 90,94177 90,11649 89,12814 89,26933 88,56336 6,25 87,05967 89,07261 88,20992 88,64127 88,28098 87,29263 87,43382 87,43382 3,125 85,62186 87,49101 87,49101 86,77211 84,04518 84,46877 85,17473 85,03353 1,5625 70,81236 81,30841 82,02732 70,38102 77,40911 69,5023 79,80939 81,08012 0,78125 58,01582 55,57153 57,15313 61,73668 66,39605 72,74974 61,3131 0,390625 18,04458 12,4371 23,65205 24,94608 56,79492 44,9347 56,65372 40,69891 0,1953 15,02516 15,31273 15,31273 22,34381 23,89693 26,01483 20,6495 0,09766 2,803741 14,30625 6,685844 5,823158 13,87222 6,953766 10,62479 0,3176956 0,0488 -1,365921 5,679367 0,790802 -2,803734 0,6000748 2,012009 0,3176956 -2,929749 0 -2,803734 -1,509697 1,078362 3,235085 0,6000748 7,094963 2,153198 -0,5294724
Inhibición de CP
% de inhibición
Conc uM CA28 CA28-2TS-BF
25 83,89539 79,90365 81,00482 82,09877 81,32716 77,31482 12,5 78,66483 67,24019 81,69305 83,75774 83,48766 80,70988 78,54939 76,08025 6,25 84,58362 84,03304 80,45423 81,28011 81,94444 78,39507 79,93827 74,84568 3,125 83,62009 81,69305 79,90365 81,8307 79,93827 77,9321 77,46913 7669753 1,5625 76,04955 76,60014 79,76601 78,94012 71,60493 70,52469 74,53703 75,61728 0,78125 71,50723 69,85547 73,98486 72,33311 72,37654 68,20988 72,0679 71,14198 0,390625 58,84377 72,05782 68,89195 63,11081 79,16666 70,37037 712963 62,19136 0,1953 42,60152 44,39091 66,51234 47,68519 50,92593 0,09766 24,7075 24115692 23,05575 35,03098 41,66667 35,03086 48,91975 42,12963 0,0488 15,7605 12,59464 15,20992 27,04749 12,50001 26,23457 26,23457 23,61111 0 -20,99105 7,088783 12,04405 1,858231 5,09259 -0,1543198 -0,9259262 -4012352
Ejemplo 17: Propiedades farmacocinéticas del análogo de compstatina de acción prolongada administrado por vía intravenosa o subcutánea
Este ejemplo describe la determinación de parámetros farmacocinéticos del análogo de compstatina de acción prolongada CA28-2TS-BF después de su administración a monos cinomolgos con una sola inyección intravenosa (IV), una sola administración subcutánea o con administración subcutánea una vez al día durante siete días. CA28-2TS-BF se sintetizó usando un PEG bifuncional reactivo del tipo TS con respecto a la química de unión de carboxilato de NHS, que se unió con dos moléculas de CA28-AEEAc-Lys a través de la amina primaria de la cadena lateral de lisina. Dosificación y recogida de muestras
Se administró CA28-2TS-BF a monos cinomolgos en el momento 0 mediante inyección intravenosa en la vena safena o mediante inyección subcutánea individual o inyección subcutánea repetida (una vez al día, durante siete días). Se usaron en este estudio seis monos cinomolgos hembra previamente expuestos, de edad 2-5 años, cuyo peso varía entre 2,6 y 3,9 kilogramos (tres por grupo). Los animales estaban sanos al comienzo de la prueba. El estudio no tuvo ocultación. Se proporcionó a los animales agua a voluntad y una dieta comercial dos veces al día antes del inicio del estudio. Se proporcionó comida a los animales según el PNT de la instalación antes del estudio. Los animales no se sometieron a ayunas. Los animales se dosificaron a 7 mg/kg mediante administración intravenosa o subcutánea en el momento 0 el(los) día(s) adecuado(s). La concentración de la solución de dosificación fue de 3,5 mg/ml para la administración IV y 25 mg/ml para la administración subcutánea. El volumen de dosificación fue de 2 ml/kg para IV y 0,28 ml/kg para la administración subcutánea. Se usó una aguja de calibre de tamaño 23G3/4 para la administración subcutánea. El compuesto se administró en dextrosa al 5 % en agua.
Se recogieron muestras de ensayo de sangre (~0,5-1 ml) de la vena femoral en los siguientes puntos temporales: Día 1: Antes de la dosis, 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora (h), 4 h, 8 h. Días 2 - 9: 0 min. Día 15: Muestra final basada en la dosificación del día 1. Cada muestra de sangre se recogió de la vena femoral del mono mediante venopunción directa y se colocó en un tubo de suero de tapón rojo que no contenía anticoagulante y se mantuvo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Las muestras de sangre se centrifugaron a una temperatura de 4 °C a 3000 x g durante 5 minutos. Las muestras se mantuvieron refrigeradas durante todo el procesamiento. Se recogieron muestras de suero después de la centrifugación y se colocaron en tubos de muestra. Las muestras se almacenaron en un congelador ajustado para mantener de -60 °C a -80 °C. Las muestras de suero y las soluciones de dosificación sobrantes se enviaron congeladas en hielo seco para su análisis.
Se observó el sitio de cada administración subcutánea para ver lo rápido que se absorbió el volumen de inyección y también para ver si la formulación dejó un bulto o desapareció por completo. Los sitios de dosis para los animales que recibieron inyecciones subcutáneas se observaron en la tarde de cada día de dosificación. El sitio de dosis no parecía tener un bulto y se absorbió por completo en ese momento según la inspección visual. Todos los animales se observaron dos veces al día y mostraron actividad normal durante todo el estudio. No se observaron anomalías relacionadas con los compuestos en los animales durante todo el estudio.
Análisis de las muestras. Las muestras de plasma obtenidas como se ha descrito anteriormente se analizaron mediante LC/MS/MS aprovechando la DIC (degradación inducida por colisión) de manera similar al método descrito en el ejemplo 3.
Resultados.
Las concentraciones en suero frente al tiempo para CA28-2TS-BF cuando se administra por vía IV o por vía subcutánea como se ha descrito anteriormente se representan en la figura 11. Los puntos de datos representan todos los compuestos de CA28 PEGilados detectados. Los datos de CA28 mostrados en la figura 11 son datos históricos obtenidos en un estudio previo en el que CA28 se administró por vía intravenosa a monos cinomolgos. En ese estudio, se detectó CA28 en muestras usando HPLC/MS.
Se logró una concentración máxima en suero de aproximadamente 500 microgramos/ml mediante la administración subcutánea de CA28-2TS-BF una vez al día durante 7 días. La semivida terminal de CA28-2TS-BF fue de aproximadamente 8 días cuando se administró por vía IV o por inyección subcutánea individual. Se proporcionan datos sin procesar en las tablas 10(A) (administración IV) y 10(B) (administración subcutánea) a continuación. (En la figura 11 y las tablas 10(A) y 10(B), el día de dosificación se considera el día 0).
Tabla 10(A)
CA28 (IV) CA28-2TS-BF (dosis individual IV) días) 200 mg/kg 7 mg/kg
0,0035 232 190 214 0,01 216 190 209 0,02 34 221 177 199 0,042 17 211 175 183 0,167 9 190 152 185 0,333 5 212 191 154
1 1,5 180 130 150 2 141 116 126 3 128 98,7 113 4 114 89,1 95,8 5 105 75 87,1 6 95,1 67 74,4 7 83,3 61,4 69,9 8 86 52,8 68,4 14 51 30,8 39,7
Tabla 10(B)
CA28-2TS-BF (dosis individual SC) CA28-2TS-BF (7 x SC diarias) (días) 7 mg/kg 7 mg/kg/día
0,0035 BQL BQL BQL BQL BQL BQL 0,01 1,42 BQL 1,7 BQL BQL BQL 0,02 3,55 1,64 3,8 BQL BQL BQL 0,042 6.1 3,46 7,05 2,32 1,14 2,44 0,167 15 12.2 20,6 14,7 5,76 12,1 0,333 25 25.8 32,9 32,9 18 25,8 1 70 76,5 76 80,5 80 66,5 2 107 101 96,6 196 185 169 3 111 103 99,8 391 286 292 4 108 98,9 99,5 455 377 405 5 99,4 97,6 101 427 404 486 6 86,8 87 81,6 490 483 568 7 75,2 83,2 78,6 607 502 564 8 67,5 73,4 72,2 495 481 570 14 38,3 44,5 40,7 322 298 397
BQL = por debajo del límite de cuantificación
Como se ha observado anteriormente, CA28-2TS-BF se sintetizó usando un PEG bifuncional reactivo del tipo TS, lo que da como resultado la formación de un carbamato después de reacción con la amina primaria de lisina. CA28-2GS-Bf se sintetizó usando un PEG bifuncional reactivo del tipo GS con respecto a la química de unión de carboxilato de NHS, lo que da como resultado la formación de una amida después de reacción con la amina primaria de lisina. El compuesto también contiene un enlace éster, que está ausente en CA28-2TS-BF. Es notable que la semivida terminal de aproximadamente 8 días alcanzada con CA28-2TS-BF en este experimento fue considerablemente mayor que la de CA28-2GS-BF, que se descubrió que tenía una semivida de aproximadamente 5 días en un experimento similar (véase ejemplo 8).
Ejemplo 18: Los análogos de compstatina inhiben la deposición de C3 en glóbulos rojos de pacientes con HPN y protegen contra la lisis mediada por el complemento
Se realizó una prueba de Ham modificada para evaluar la capacidad de los análogos de compstatina para proteger los glóbulos rojos de HPN de la lisis mediada por el complemento. Los glóbulos rojos de un paciente con HPN se expusieron a suero humano acidificado (como fuente de componentes del complemento) y magnesio (Mg2+, necesario para la activación de rutas alternativas) en ausencia de inhibidores del complemento o en presencia de diversas cantidades de análogos de compstatina CA28 o CA28-2GS-BF. La exposición al suero humano inactivado por calor se usó como un control que no representa lisis mediada por el complemento significativa ya que el complemento se inactiva por calor. Se usó exposición a suero humano acidificado y magnesio (Mg2+) en ausencia de inhibidores del complemento (panel marcado con Mg2+) como control que representa la lisis máxima.
T ras la incubación, las células se tiñeron con anticuerpos contra CD59 y C3d. El nivel de Cd59 permitió la clasificación de los glóbulos rojos de HPN como tipo I, tipo II o tipo III. Se usó tinción para C3d, un producto de activación y escisión de C3, como marcador del depósito (carga) de C3 y producto de activación de C3. Se realizó análisis de citometría de flujo para evaluar CD59 y C3d en superficies de glóbulos rojos y para cuantificar los porcentajes de células de tipo I, tipo II y tipo III presentes en diversas muestras.
Los resultados de un experimento de dilución que demuestra el efecto de diferentes concentraciones de CA28 sobre el depósito de C3 y los porcentajes celulares se muestran en la fig. 12(A). Los resultados de un experimento de dilución que demuestra el efecto de diferentes concentraciones de CA28-2GS-BF sobre el depósito de C3 y los porcentajes celulares se muestran en la fig. 12(B). Los resultados se presentan de manera cuantitativa en la tabla 11 a continuación. Las células de tipo I (que se muestran en naranja en la fig. 12) tienen niveles normales de CD59. Las células de tipo III (que se muestran en azul en la fig. 12) esencialmente no tienen CD59 detectable. Estas células son muy susceptibles a la lisis mediada por el complemento. Las células de tipo II (mostradas en morado en la fig. 12) tienen niveles reducidos de CD59 en comparación con células normales o de tipo I y tienen una sensibilidad intermedia a la lisis mediada por el complemento. En presencia de activación del complemento, las células de tipo III se lisan rápidamente. La reducción o ausencia de lisis puede demostrarse por la mayor presencia de células de tipo III, como resulta evidente como un mayor porcentaje de células de tipo III en el panel sin lisis en comparación con el panel en (presencia de Mg2+ (lisis máx.)) en las figuras tanto 12(A) como 12(B). En otras palabras, hay relativamente menos células de tipo III en el control positivo que en el control negativo. Las células de tipo II pueden lisarse con el tiempo en presencia de complemento activado, pero pueden acumular una cantidad considerable de productos de activación de C3, tales como C3d, antes de hacerlo. La reducción o ausencia de lisis puede demostrarse por el aumento de los niveles de C3 o productos de activación de C3 en células de tipo II, como resulta evidente al comparar el nivel de C3d en células de tipo II en el panel sin lisis con el nivel de C3d en células de tipo II en el panel de lisis máxima en las figuras tanto 12(A) como 12(B). En otras palabras, hay más C3d en las células en el panel de lisis máxima que en el panel sin lisis. Las células de tipo I tienen CD59 funcional, de modo que desactivan la convertasa y, por lo tanto, no acumulan tanto C3d como las células de tipo II. Sin embargo, la cantidad de C3d que acumulan se puede usar como un indicador sustituto de la cantidad de lisis de las células más vulnerables (tipo II y III). Por tanto, la reducción de C3d en células de tipo I es indicativa de protección contra la lisis. Un cambio en los porcentajes relativos de células de tipo I, II y III de los porcentajes presentes en los paneles de control de lisis máxima (Mg2+) hacia los porcentajes presentes en los paneles de control sin lisis (suero inactivado por calor) es indicativo de protección contra la lisis mediada por el complemento. Estos porcentajes se muestran en la tabla a continuación. La columna marcada como % C'3 en la tabla 11 se refiere al porcentaje de células consideradas "positivas" para la presencia de C3 y productos de activación de C3 ("carga de C3"). Como se puede ver en las figuras 12(A) y (B) y en la tabla 11, CA28 y CA28-2GS-BF demostraron protección similar de la lisis de glóbulos rojos de HPN sobre las concentraciones probadas, prácticamente sin carga de C3 en glóbulos rojos de HPN a 100 microgramos/ml de compuesto o concentraciones mayores. Obsérvese que los porcentajes de células de tipo III, II y I en presencia de 100 ug/ml o más de análogo de compstatina fueron esencialmente iguales que en el control sin lisis, lo que indica protección completa contra la lisis mediada por el complemento según lo determinado por este ensayo. Concentraciones inferiores a 100 ug/ml pero superiores a 60 ug/ml, p. ej., al menos 70 ug/ml, al menos 80 mg/ml o al menos 90 ug/ml, pero inferiores a 100 ug/ml no se probaron en este experimento, pero también pueden proporcionar protección significativa. 100 microgramos/ml de CA28-2GS-BF representa una concentración de aproximadamente 2,5 micromolar, que se puede alcanzar fácilmente in vivo como se describe en el presente documento.
Tabla 11: Porcentajes y carga de C3 de glóbulos rojos de HPN de tipo I, II y III en ausencia o presencia de análogos de compstatina (se muestran las concentraciones en microgramos/ml)
% de % de C3 % de % de C3 % de % de C3 tipo III tipo II tipo 1
Inactivado por calor (sin lisis) 37,09 0,29 51,79 122 11,12 0,09 Magnesio añadido
(lisis máxima) 15,75 0,90 64,7 13,46 19,55 33
CA281 19,42 u 64,81 iooe 15,77 1,7
CA284 18,43 0,83 64,9 10,42 16,68 1,78
CA288 17,83 0,7 66 11,12 16,17 .1,86:
CA2815 22,11 0,90 62,9 8,53 15 1,93
CA2825 20,53 0,75 64.51 93 14,96 1,84
CA28100 37,96 0,1 51,5 0,92 10,64 0,08
CA28500 37,29 0,09 52,06 063 10,64 3,14
CA28-2GS-8F 20 19,19 0,99 65,35 12,28 15,46 2,18
CA28-2GS-8F 40 15,15 1,21 68,96 15,12 15,89 2 ,S 4
CA28-2GS-8F 50 13,87 1,29 69,46 1594 16,67 236
CA28-2GS-8F 60 17,94 1,44 66,97 13,04 15,09 2,05
CA28-2GS-BF 100 35,32 0,11 53,93 0,88 10,75 0,07
CA28-2GS-8F 200 37,43 0,02 51,99 0,28 10,59 0.02
CA28-2GS-BF 500 37,87 0,05 51,87 0.3 10,26 0,04
Ejemplo 19: Efecto del análogo de compstatina y Soliris en el depósito de C3 en glóbulos rojos del paciente con HPN
Se realizó un experimento similar al descrito en el ejemplo 18 para demostrar adicionalmente el efecto protector del análogo de compstatina CA28-2GS-BF y compararlo con el del anticuerpo anti-C5 Soliris. Se realizó un ensayo de Ham modificado como en el ejemplo 18 usando glóbulos rojos de HPN incubados en presencia de complemento activado ya sea en ausencia de inhibidor del complemento (panel izquierdo) o en presencia de Soliris (panel central) 0 CA28-2GS-BF (50 ug/ml) (panel derecho). Se realizó citometría de flujo después de la tinción de anticuerpos usando anticuerpos contra CD59 y C3d. Los resultados se muestran en la figura 13. En esta figura, el cuadrante 1 (Q1) y el cuadrante 3 (Q3) representan células de tipo III. El cuadrante 2 (Q2) y el cuadrante 4 (Q4) representan células de tipos 1 y II. Q1 y Q2 representan células con una cantidad significativa y anormalmente alta de depósito del producto de activación de C3 (p. ej., C3d). Q3 y Q4 representan células sin depósito significativo de C3d o nivel algo elevado (parte derecha de Q4) pero menos que las células Q2. Los porcentajes de células en los diferentes cuadrantes se presentan debajo de cada panel en la figura 13 y en la tabla 12 a continuación.
Tabla 12
Figure imgf000086_0001
Como se puede observar, en ausencia de inhibidores, la gran mayoría de las células se encuentran en Q4 (tipo I o tipo II con niveles bajos de depósito del producto de activación de C3). Las células de tipo III principalmente se habrían lisado, de modo que sus porcentajes (Q1 y Q3) son bajos. Las células Q2 que acumulan productos de depósito de C3 se lisan con el tiempo, de modo que su número se mantiene relativamente bajo. En presencia de eculizumab, las células de tipo III están protegidas de la lisis al menos inicialmente, pero acumulan productos de activación de C3 (p. ej., C3d) como se muestra por el alto porcentaje de células Q1 en comparación con el panel sin inhibidor (36,79 % frente a 0,09 %). La proporción relativa de células Q2+Q4 (tipo I y II) es menor como resultado del aumento de la supervivencia de células de tipo III. Sin embargo, resulta evidente que se produce depósito significativo de productos de activación de C3 (p. ej., C3d) en células de tipo III, lo que puede conducir con el tiempo a lisis o a eliminación (in vivo). Los glóbulos rojos de HPN tratados con CA28-2GS-BF (panel derecho) no presentan esencialmente depósito de C3d, independientemente de si son de tipo I, II o III, a diferencia de los resultados con eculizumab. El porcentaje de células en Q1 y Q2 es insignificante. Hay un aumento dramático en el porcentaje de células de tipo III (61,55 %) en comparación con los resultados sin inhibidor o con eculizumab, lo que indica (junto con la falta de depósito de C3d) mejor protección contra la lisis por CA28-2GS-BF.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un análogo de compstatina de acción prolongada que comprende un resto reductor de la eliminación unido con dos restos análogos de compstatina, en donde
cada resto análogo de compstatina comprende un péptido cíclico extendido por un residuo de lisina o una secuencia que comprende un residuo de lisina en el extremo N, extremo C o ambos, en donde el residuo de lisina está separado de la parte cíclica del péptido por un espaciador rígido o flexible que comprende un resto de oligo(etilenglicol);
el resto reductor de la eliminación comprende un polímero, en donde cada extremo del polímero está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida; y
el espaciador comprende ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (AEEAc) o ácido 11-amino-3,6,9-trioxaundecanoico.
2. El análogo de compstatina de acción prolongada de la reivindicación 1, en donde cada resto análogo de compstatina comprende un péptido cíclico extendido por un residuo de lisina o una secuencia que comprende un residuo de lisina en el extremo N, extremo C o ambos, en donde el residuo de lisina está separado de la parte cíclica del péptido por un espaciador rígido o flexible que comprende un resto de oligo(etilenglicol); y el resto reductor de la eliminación comprende un polímero, en donde cada extremo del polímero está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato o una amida y en donde el péptido cíclico comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 71, 72, 73 o 74.
3. El análogo de compstatina de acción prolongada de la reivindicación 1 o 2, en donde el polímero es polietilenglicol (PEG) o polioxazolina (POZ).
4. El análogo de compstatina de acción prolongada de la reivindicación 3, en donde el polímero es PEG que tiene un peso molecular promedio de 40 kD.
5. El análogo de compstatina de acción prolongada de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una semivida terminal de al menos aproximadamente 5 días, cuando se administra por vía intravenosa a un primate.
6. El análogo de compstatina de acción prolongada de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una actividad en molaridad de al menos 90 % de, o preferentemente al menos igual a, la de un análogo de compstatina que comprende la misma secuencia análoga de compstatina que el resto análogo de compstatina pero no unido con el resto reductor de la eliminación.
7. El análogo de compstatina de acción prolongada de la reivindicación 1, en donde cada extremo del polímero está unido con uno de los restos análogos de compstatina por medio de un carbamato.
8. Una composición de uso farmacéutico que comprende el análogo de compstatina de acción prolongada de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. La composición de uso farmacéutico de la reivindicación 8 para su uso como un medicamento.
10. La composición de uso farmacéutico de la reivindicación 8 o 9 para su uso para administración subcutánea o intravenosa a un sujeto o para administración al ojo de un sujeto.
11. La composición de uso farmacéutico de la reivindicación 10 para reducir la sensibilidad de una célula u órgano al daño dependiente del complemento o para tratar un trastorno mediado por el complemento.
12. La composición de uso farmacéutico de la reivindicación 10 u 11 para su administración en el ojo de un sujeto que padece o está en riesgo de degeneración macular asociada a la edad.
13. La composición de uso farmacéutico de la reivindicación 10, 11 o 12, en donde la administración es mediante inyección intravítrea.
14. Un método para realizar un análogo de compstatina de acción prolongada, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula IVa
Figure imgf000087_0001
con un resto análogo de compstatina, en donde el resto análogo de compstatina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73 o 74.
15. Un método para realizar un análogo de compstatina de acción prolongada, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula B:
Grupo funcional reactivo
Figure imgf000088_0001
Grupo funcional reactivo
en donde T es un enlace covalente o una cadena de hidrocarburo C1 -12 lineal o ramificada en donde una o más unidades de carbono de T se reemplazan opcionalmente y de manera independiente por -O-, -S-, -N(Rx)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(Rx)C(O)-, -C(O)N(Rx)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(Rx)SO2- o SO2 N(Rx)-; y cada RX es de manera independiente hidrógeno o C1 -6 alifático, preferentemente de fórmula IV:
Figure imgf000088_0002
fórmula IVa:
Figure imgf000088_0003
fórmula V:
Figure imgf000088_0004
o
fórmula Va:
Figure imgf000088_0005
con un resto análogo de compstatina, en donde el resto análogo de compstatina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 74.
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