KR20230154183A - 화합물 및 방사성 표지 화합물 - Google Patents

화합물 및 방사성 표지 화합물 Download PDF

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요시후미 마야
히로아키 이치카와
유스케 히가키
마사히로 오노
심페이 이이쿠니
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니혼 메디피직스 가부시키가이샤
고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
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Abstract

본 발명의 화합물은 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부, 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단 및 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단을 구조 중에 갖고, 제 1 원자단과 제 2 원자단은 상기 킬레이트부를 개재하여 결합하고 있거나, 또는 제 1 원자단과 제 2 원자단 사이로부터 분기하도록 상기 킬레이트부가 결합하고 있다. 또 본 발명은 화합물이 방사성 금속 이온에 배위되어 이루어지는 방사성 표지 화합물, 및 방사성 표지 화합물의 제조 방법도 제공한다.

Description

화합물 및 방사성 표지 화합물
본 발명은 화합물 및 방사성 표지 화합물에 관한 것이다.
방사성 핵종을 구조 중에 갖는 방사성 표지 화합물은 표적 분자의 검출을 위한 시약, 진단약, 또는 질환의 치료를 위한 의약품으로서 사용되고 있다. 병소의 검출 성능 및 치료 효과의 추가적인 향상을 목적으로 하여, 표적 조직 및 부위에의 특이적인 집적의 향상이나, 표적이 아닌 조직 및 부위에의 집적의 저감에 관한 검토가 진행되고 있다.
특허문헌 1에는 알부민 결합 부위인 요오드페닐부티릴기를 PSMA-617의 구조로부터 분기하도록 부가한 유도체(HTK01169)가 기재되어 있다. 이 유도체는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 표적으로 하여 결합하여, 전립선 암의 검출 및 치료를 목적으로 하여 사용할 수 있는 것도 기재되어 있다.
또 특허문헌 2에는 알부민 결합 PSMA 저해제가 기재되어 있다. 이 저해제도 특허문헌 1과 마찬가지로 PSMA를 표적으로 하여 결합하여, 전립선 암의 검출 및 치료를 목적으로 하여 사용할 수 있는 것도 기재되어 있다.
국제공개 제2019/075583호 국제공개 제2018/098390호
표적 조직 및 부위에의 특이적인 집적의 향상이나, 표적이 아닌 조직 및 부위에의 집적의 저감을 실현하기 위해서는 혈중 체류성 등의 체내 동태의 제어가 중요하며, 체내 동태를 효과적으로 제어하기 위한 방법의 하나로서, 화학 구조의 추가적인 최적화가 요망된다. 일반적으로, 분자량이 작은 화합물은 혈중 체류성이 뒤떨어지고, 그 결과, 표적이 되는 조직에의 집적이 불충분해지거나, 정상 조직에의 의도하지 않은 집적이 생기거나 하는 경우가 있다. 또한, 특허문헌 1 및 2에 기재된 화합물은 신장에 비특이적인 집적이 많아, 이 점에서 개선의 여지가 있었다.
따라서, 본 발명은 표적 조직에의 집적의 향상과, 표적이 아닌 조직에의 집적의 저감, 특히 신장에의 집적의 저감을 양립 가능한 화합물 및 방사성 표지 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부, 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단 및 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단을 구조 중에 갖고,
제 1 원자단과 제 2 원자단은 상기 킬레이트부를 개재하여 결합하고 있는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 일반식(2)으로 나타내어지는 화합물을 제공하는 것이다.
(식(2) 중, A2는 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부이고, B는 알부민 결합부를 포함하는 원자단이며, C는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이고,
A2는 Neunpa 혹은 Octapa 또는 이것들의 유도체이며,
Lc는 링커 구조이고,
A2가 Octapa일 때, Lc는 폴리에틸렌글리콜 구조를 포함한다.)
본 발명은 상기 화합물이 방사성 금속의 이온에 배위되어 이루어지는 방사성 표지 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 화합물을 방사성 금속 이온에 배위시켜, 방사성 표지 화합물을 얻는 방사성 표지 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 실시예 1-1([111In]In-PSMA-DA1) 및 비교예 1-1([111In]In-PSMA-DB)에 있어서의 세포 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 [111In]In-PSMA-DA1 및 [111In]In-PSMA-DB에 있어서의 알부민 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 [111In]In-PSMA-DA1 및 [111In]In-PSMA-DB에 있어서의 체내 방사능 분포 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 [111In]In-PSMA-DA1 및 [111In]In-PSMA-DB에 있어서의 SPECT/CT 화상이다.
도 5는 실시예 1-2([90Y]Y-PSMA-DA1) 및 비교예 1-2([90Y]Y-PSMA-DB)에 있어서의 종양 용적 및 마우스 체중의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 1-3([225Ac]Ac-PSMA-DA1) 및 비교예 1-3([225Ac]Ac-PSMA-DB)에 있어서의 종양 용적 및 마우스 체중의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 2([111In]In-PtDA)에 있어서의 혈장 중 안정성의 결과를 나타내는 HPLC 차트이다.
도 8은 [111In]In-PtDA에 있어서의 세포 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 [111In]In-PtDA에 있어서의 알부민 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 [111In]In-PtDA에 있어서의 SPECT/CT 화상이다.
도 11은 실시예 3-1([111In]In-Octapa-2), 실시예 3-2([111In]In-Octapa-3), 실시예 3-3([111In]In-Neunpa-2), 및 비교예 2-1([111In]In-Octapa-1), 비교예 2-2([111In]In-Neunpa-1)에 있어서의 세포 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 실시예 3-1∼3-3, 및 비교예 2-1∼2-2에 있어서의 알부민 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 실시예 3-1∼3-3 및 비교예 2-1∼2-2에 있어서의 체내 방사능 분포 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 실시예 3-1([111In]In-Octapa-2)에 있어서의 SPECT/CT 화상이다.
도 15는 실시예 4-1([111In]In-PSMA-NAT-DA1)에 있어서의 세포 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 실시예 4-1([111In]In-PSMA-NAT-DA1)에 있어서의 알부민 결합 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 실시예 4-1([111In]In-PSMA-NAT-DA1)에 있어서의 SPECT/CT 화상이다.
이하, 본 발명의 화합물 및 이것을 사용한 방사성 표지 화합물을 그 바람직한 실시형태에 근거하여 설명한다. 이하의 설명에 있어서, 「T∼U[V]」(T 및 U는 임의의 숫자이며, [V]는 단위이다.)라고 기재했을 경우, 특별히 언급하지 않는 한 「T[V] 이상 U[V] 이하」를 의미한다. 또한, 구조 중에 부제 탄소 원자가 존재할 경우에는 특별히 언급하지 않는 한, 각각 독립적으로 S 배치여도 되고, R 배치여도 된다.
본 발명의 화합물은 그 화학 구조를 크게 나누어, 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부, 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단, 및 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen; 이하, PSMA라고도 한다.) 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단의 3개의 원자단을 구조 중에 갖는다.
이러한 화학 구조를 갖고 있음으로써, 본 발명의 화합물에 방사성 금속 이온을 배위시킨 방사성 표지 화합물은 PSMA 분자를 발현한 표적 조직에의 집적의 향상과, 표적이 아닌 조직, 특히 신장에의 집적의 저감이 양립된 것이 된다. 본 발명의 화합물은 방사성 금속 등의 방사성 동위체에 의해 표지하기 위해서 사용되는 전구체 화합물, 즉, 바람직하게는 표지 전구체로서 사용되는 화합물이다. 방사성 금속에 관한 설명은 후술한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단과, PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단은 킬레이트부를 개재하여 결합하고 있다.
이러한 화합물은 이하의 일반식(1)으로 나타내어지는 것이 바람직하다.
식(1) 중, A1은 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부이고, B는 알부민 결합부를 포함하는 원자단이며, C는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이다.
La는 링커 구조이다.
Lb는 La와 동일 또는 상이한 링커 구조이다.
m 및 n은 각각 독립적으로, 0(제로) 또는 1이다.
B 또는 La는 A1의 임의의 부위에 결합하고 있다.
C 또는 Lb는 B 또는 La가 A1에 결합하는 부위와는 상이한 부위에 있어서 A1과 결합하고 있다.
상술한 바와 같이, 본 실시형태에 있어서의 화합물은 그 화학 구조를 거시적으로 보았을 때에, 킬레이트부(일반식(1) 중, 부호 A1로 나타내어진다.)가 구조의 중앙에 위치하고, 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단(일반식(1) 중, 부호 B로 나타내어진다.)와 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단(일반식(1) 중, 부호 C로 나타내어진다.)이 킬레이트부를 개재하여 직선 형상으로 배치되어 있는 것이 바람직하다.
일반식(1) 중, A1과 B 사이, 및 A1과 C 사이는 각각 독립적으로, 링커 구조를 가져 간접적으로 결합되어 있어도 되고, 링커 구조를 갖지 않고 직접 결합되어 있어도 된다. 식(1) 중, A1과 B 사이, 및 A1과 C 사이의 각각에 링커 구조를 가질 경우, 링커 구조는 각각 동일한 것이어도 되고, 상이한 것이어도 된다.
링커 구조의 상세한 것은 후술한다.
본 발명의 화합물은 이것을 방사성 표지 화합물로 했을 때에, PSMA를 발현하는 표적 조직에의 집적의 향상과, 표적이 아닌 조직, 특히 신장에의 집적의 저감을 높은 레벨로 양립시키는 관점에서, 상기 식(1) 중, A1은 환상 구조를 갖고, 상기 환상 구조가 질소 원자를 2개 이상 갖고, 각 질소 원자가 이웃하는 2개 이상의 탄소 원자를 사이에 두고 연결되어 있거나, 또는 A1은 쇄상 구조를 갖고, 상기 쇄상 구조가 질소 원자를 2개 이상 갖고, 각 질소 원자가 이웃하는 2개 이상의 탄소 원자를 사이에 두고 연결되어 있는 것이 바람직하다.
상기 식(1) 중, A1이 환상 구조를 가질 경우, 상기 환상 구조는 그 골격이 질소 원자 및 탄소 원자만으로 구성되어 있어도 되고, 질소 원자 및 탄소 원자에 더하여, 산소 원자를 포함하여 구성되어 있어도 된다. 환상 구조에 있어서의 탄소 원자끼리의 결합은 쇄상이어도 되고, 환상 구조를 형성하고 있어도 된다.
또 상기 식(1) 중, A1이 쇄상 구조를 가질 경우, 상기 쇄상 구조에 있어서의 탄소 원자끼리의 결합은 질소 원자에 의해 분단되어 있어도 된다. 쇄상 구조에 있어서의 탄소 원자끼리의 결합은 쇄상이어도 되고, 환상 구조를 형성하고 있어도 된다.
또한, 상기 식(1) 중, A1이 환상 구조 또는 쇄상 구조를 가질 경우, A1은 상기 환상 구조 또는 상기 쇄상 구조를 구성하는 질소 원자에 직접 결합하는 질소 결합 원자단을 갖는 것이 바람직하다. 질소 결합 원자단의 구체예로서는 카르복시기, 인산기, 아미드기, 벤젠환 및 피리딘환 중 1종 이상을 포함하는 원자단을 바람직하게 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 원자단은 쇄상이다.
또한, 상기 식(1) 중, A1이 환상 구조 또는 쇄상 구조를 가질 경우, B는 A1의 임의의 부위에 결합하고, 또한 C는 B의 결합 부위와는 상이한 A1의 임의의 부위에 결합하고 있는 것을 조건으로 하여, B가 La를 개재하거나 또는 La를 개재하지 않고 상술한 질소 결합 원자단에 결합하고 있을 경우, C는 B가 La를 개재하거나 또는 La를 개재하지 않고 결합하고 있는 질소 결합 원자단 이외의 부위에 결합하고 있는 것이 바람직하다.
구체적으로는 상기 식(1) 중, 부호 A1로 나타내어지는 방사성 금속과 배위 가능한 킬레이트부로서, 하기 식(A1) 또는 (A9) 중 어느 하나로 나타내어지는 화합물에서 유래하는 구조를 갖는 것이 바람직하고, 하기 식(A1)으로 나타내어지는 화합물에서 유래하는 구조를 갖는 것이 더욱 바람직하다. 즉, 본 발명의 화합물은 하기 식(A1) 또는 (A9) 중 어느 하나로 나타내어지는 화합물의 유도체인 것이 바람직하고, 하기 식(A1)으로 나타내어지는 화합물의 유도체인 것이 더욱 바람직하다. 이들 구조는 후술하는 방사성 금속의 종류에 따라, 적절히 선택할 수 있다. 어느 구조를 갖는 킬레이트부라도, PSMA를 발현하는 표적 조직에의 집적의 향상과, 표적이 아닌 조직, 특히 신장에의 집적의 저감이 양립된 것이 된다.
상기 식(1) 중, 부호 A1로 나타내어지는 킬레이트부는 예를 들면 이하의 화합물에서 유래하는 구조를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않고 적용 가능하다.
<DOTA 또는 그 유도체>
·1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)
·1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라프로피온산(DOTPA)
·1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라메틸렌인산(DOTMP)
·히드록시프로필테트라아자시클로도데칸트리아세트산(HP-DO3A)
·(1R,4R,7R,10R)-α,α',α",α'"-테트라메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTAMA)
·1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(DOTAA)
·1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라키스(아세타미드메틸렌)포스폰산(DOTA-A-AMP)
·테트라아자시클로도데칸디메탄포스폰산(DO2P)
·α-(2-카르복시에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라사아세트산(DOTAGA)
<HOPO 또는 그 유도체>
·N,N',N",N'"-테트라(1,2-디히드로-1-히드록시-2-옥소피리딘-6-카르보닐)-1,5,10,14-테트라아자테트라도데칸(1,2-HOPO)
<TETA 혹은 PEPA 또는 이것들의 유도체>
·1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)
·1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라프로피온산(TETPA)
·1,4,7,10,13-펜타아자시클로펜타도데칸-N,N',N",N'",N""-펜타아세트산(PEPA)
<쇄상 구조(octapa, neunpa 또는 이것들의 유도체)>
·에틸렌디아민사아세트산(EDTA)
·6,6'-((에탄-1,2-디일비스((카르복시메틸)아잔디일))비스(메틸렌))디피콜린산(H4octapa)
·6,6'-({9-히드록시-1,5-비스(메톡시카르보닐)-2,4-디(피리딘-2-일)-3,7-디아자비시클로[3.3.1]노난-3,7-디일}비스(-메틸렌))디피콜린산(H2bispa2)
·1,2-[{6-(카르복시)-피리딘-2-일}-메틸아미노]에탄(H2dedpa)
·6-(1,4,10,13-테트라옥사-7,16-디아자시클로옥타데칸-N,N'-,메틸)피콜린산(H2macropa)
·N,N"-비스(6-카르복시-2-피리딜메틸)-디에틸렌트리아민-N,N',N"-트리아세트산(H5decapa)
·N,N'-(메틸렌포스포네이트)-N,N'-[6-(메톡시카르보닐)피리딘-2-일]-메틸-1,2-디아미노에탄(H6phospa)
·6,6'-(((((4-이소티아시아네이트페네틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일))비스((카르복시메틸)아잔디일))비스(메틸렌))디피콜린산(p-SCN-Bn-H4neunpa)
·6,6'-(((((4-니트로페네틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일))비스((카르복시메틸)아잔디일))비스(메틸렌))디피콜린산(p-NO2-Bn-H4neunpa)
·6,6'-(((아잔디일비스(에탄-2,1-디일))비스((카르복시메틸)아잔디일)비스(메틸렌))디피콜린산(H5neunpa)
<NOTA 또는 그 유도체>
·2-[4,7-비스(카르복시메틸)-1,4,7-트리아조난-1-일]아세트산(NOTA)
식(A1) 중, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로, -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H5N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2, -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기 중 어느 하나이며, p는 0 이상 3 이하의 정수이다.
식(A2) 중, R21, R22, R23 및 R24는 각각 독립적으로, 카르복시기 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이다.
식(A3) 중, R31, R32, R33 및 R34는 각각 독립적으로, 수소 원자와, 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단이며, R35는 수소 원자, 카르복시기, 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이다.
식(A4) 중, R41, R42, R43 및 R44는 각각 독립적으로, 수소 원자와, 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단이며, R45는 수소 원자, 카르복시기, 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이다.
식(A5) 중, R48 및 R49는 각각 독립적으로, 수소 원자와, 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단이다.
식(A6) 중, R51, R52, R53, R54 및 R55는 각각 독립적으로, 수소 원자와, 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단이다.
식(A7) 중, R61, R62, R63, R64, R65 및 R66은 각각 독립적으로, 수소 원자와, 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단이며, R67은 수소 원자, 카르복시기, 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이다.
식(A8) 중, R71, R72 및 R73은 각각 독립적으로, 수소 원자와, 2 이상 10 이하의 탄소 원자를 갖고, 질소 원자 또는 산소 원자를 포함하고 있어도 되는 원자단이다.
식(A9) 중, R81 및 R82는 각각 독립적으로, 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이고, 상기 알킬기의 말단이 1 이상의 카르복시기로 치환된 피리딜기로 치환되어 있어도 되고, R87은 수산기 또는 카르보닐기의 산소 원자(=O)이며, R83 및 R84는 치환 또는 무치환의 피리디닐기이고, R85 및 R86은 각각 독립적으로, -COO-Ra이고, Ra는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이다.
식(A1)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A1-1)∼(A1-7)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A2)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A2-1)∼(A2-2)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A3)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A3-1)∼(A3-7)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A4)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 이하의 식(A4-1)∼(A4-2)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A5)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A5-1)∼(A5-3)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A6)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A6-1)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A7)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A7-1)∼(A7-2)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A8)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A8-1)∼(A8-3)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(A9)으로 나타내어지는 구체적인 구조로서는 예를 들면 이하의 식(A9-1)∼(A9-4)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 화합물의 다른 실시형태를 설명한다. 이 실시형태에 대해서는 지금까지 설명해 온 실시형태와 상이한 점을 중심으로 설명하고, 특별히 설명하지 않는 점에 대해서는 지금까지 설명해 온 실시형태에 대한 설명이 적절히 적용된다.
다른 실시형태에 있어서의 본 발명의 화합물은 그 화학 구조를 거시적으로 보았을 때에, 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단과, PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단 사이로부터 분기하도록 킬레이트부가 결합하고 있다.
구체적으로는 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단과, PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단은, 킬레이트부에 결합된 링커 구조를 개재하여 분기하도록 결합하고 있는 것이 바람직하다.
이러한 화합물은 이하의 일반식(2)으로 나타내어지는 것이 바람직하다.
식(2) 중, A2는 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부이고, B는 알부민 결합부를 포함하는 원자단이며, C는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이다.
A2는 Neunpa 혹은 Octapa 또는 이것들의 유도체이다.
Lc는 링커 구조이다.
A2가 Octapa일 때, Lc는 폴리에틸렌글리콜 구조를 포함한다.
또 방사성 표지 화합물로 했을 때의, PSMA를 발현하는 표적 조직에의 집적의 향상과, 표적이 아닌 조직, 특히 신장에의 집적의 저감을 높은 레벨로 양립시키는 관점에서, 식(2) 중, A2는 쇄상 구조를 갖고, 상기 쇄상 구조가 질소 원자를 2개 이상 갖고, 각 질소 원자가 이웃하는 2개 이상의 탄소 원자를 사이에 두고 연결되어 있는 것이 바람직하다.
상기 식(2) 중, A2가 쇄상 구조를 가질 경우, 상기 쇄상 구조에 있어서의 탄소 원자끼리의 결합은 질소 원자에 의해 분단되어 있어도 된다. 쇄상 구조에 있어서의 탄소 원자끼리의 결합은 쇄상이어도 되고, 환상 구조를 형성하고 있어도 된다. 이러한 A2로서는 상술한 식(A3) 또는 식(A4)으로 나타내어지는 화합물 또는 그 유도체인 것이 더욱 바람직하다.
이하에, 상술한 각 실시형태에 적용 가능한 사항을 설명한다.
특별히 언급하지 않는 한, 이하의 설명은 일반식(1) 및 일반식(2)에 관한 설명에 적절히 적용되고, 또한 적절히 조합하여 채용하는 것도 가능하다.
식(1) 또는 식(2) 중, 부호 B로 나타내어지는 부위는 알부민과의 친화성, 바람직하게는 혈청 알부민, 더욱 바람직하게는 인간 혈청 알부민과의 친화성을 갖고, 상기 알부민과 가역적으로 결합 가능한 화학 구조인 알부민 결합부를 포함하는 원자단이다. 본 발명의 화합물에 이러한 구조가 포함되어 있음으로써, 상기 화합물에 방사성 금속을 표지하여 생체에 투여했을 때에, 혈중에서의 체류성을 높이면서, 신장에의 집적을 저감할 수 있다.
상세하게는 알부민 결합부를 분자 중에 갖는 화합물은 혈중 알부민과 결합하기 쉽고, 알부민과 결합한 화합물은 신장에서 사구체 여과를 받지 않게 되므로, 신장이나 뇨로의 이행 및 배설이 저감되어, 혈중에서의 체류성이 향상된다. 그 결과, 정상 조직인 신장에의 집적이 저하하여, 상기 화합물의 PSMA를 발현하는 종양 조직 등의 표적 조직으로의 이행성을 더욱 높일 수 있다.
상기 식(1)으로 나타내어지는 화합물을 사용했을 경우에는 알부민 결합부와 PSMA 분자와의 결합부 사이에 있어서의 거리를 적절히 확보할 수 있으므로, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 겸비할 수 있다. 특히, 알부민 결합부가 본 발명의 화합물의 일방의 구조 말단에 배치되고, 또한 PSMA 분자와의 결합부가 본 발명의 화합물의 타방의 구조 말단에 배치되어 있음으로써, 알부민 결합부 및 PSMA 분자와의 결합부에 있어서의 거리를 충분히 확보할 수 있으므로, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 높은 레벨로 양립시킬 수 있는 점에서 더욱 유리하다.
이에 대신하여, 상기 식(2)으로 나타내어지는 화합물을 사용했을 경우, Lc로 나타내어지는 링커 구조에 의해, 알부민 결합부와 PSMA 분자와의 결합부 사이에 있어서의 거리를 적절히 확보할 수 있기 때문에, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 겸비할 수 있다.
또 후술하는 바와 같이, 식(2) 중, Lc로 나타내어지는 링커 구조로서, 폴리에틸렌글리콜기를 포함하고, 시클로헥실기 및 나프틸기를 포함하지 않는 구조를 채용함으로써, 알부민 결합부 및 PSMA 분자와의 결합부에 있어서의 적절한 거리를 확보함과 아울러, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 높은 레벨로 양립시킬 수 있는 점에서 더욱 유리하다.
상기 식(1) 또는 상기 식(2) 중, 알부민 결합부의 구조로서는 예를 들면, γ글루탐산, 치환 또는 무치환의 페닐부티르산, 지질, 헤마틴, 빌리루빈, 클로피브린산, 클로피브레이트, 카로테노이드, 스테로이드 골격을 갖는 화합물, 이부프로펜 골격을 갖는 화합물, 탄소수 13 이상 20 이하의 직쇄 또는 분기쇄 또한 포화 또는 불포화인 탄화수소, 시아닌 색소, 술폰산기를 갖는 염료, 디아조 염료, 펜타메틴시아닌 색소, 블루 덱스트란, 브로모크레졸 그린, 및 에반스 블루 및 이것들의 유도체, 또는 국제공개 제2005/117984호, 국제공개 제2010/127336호, 또는 국제공개 제2010/172844호에 기재된 구조 중 1종 이상에서 유래하는 구조를 들 수 있다. 또한, 이에 더하여 또는 이에 대신하여, 알부민에 결합 가능한 항체 또는 펩티드(예를 들면, 국제공개 제2007/106120호에 기재된 펩티드 등)를 알부민 결합부로서 사용할 수도 있다.
이들 중, 생체에 적용 가능한 화합물을 얻는 관점, 및 신장 등의 의도하지 않은 정상 장기로의 집적을 저감하는 관점에서, 알부민 결합부의 구조로서, 치환 또는 무치환의 페닐부티르산, 및 에반스 블루 및 이것들의 유도체 중 1종 이상, 또는 알부민에 결합 가능한 항체 혹은 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.
알부민 결합부로서 적용 가능한 치환 또는 무치환의 페닐부티르산으로서는 예를 들면 이하의 식(B1)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(B1) 중, R은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이며, 파선으로 나타내는 부분은 다른 구조와의 결합 부분이다.
식(B1) 중, R은 수소 원자, 요오드 원자, 브롬 원자 또는 메틸기인 것이 바람직하다.
알부민 결합부로서 적용 가능한 에반스 블루 및 그 유도체로서는 예를 들면 이하의 식(B2)으로 나타내어지는 구조를 들 수 있다.
식(B2) 중, Rb1 내지 Rb11은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 수산기, 시아노기, 탄소수가 1 이상 6 이하인 치환 혹은 무치환의 알킬기, 또는 탄소수가 1 이상 6 이하인 치환 혹은 무치환의 알콕시기이며, 파선으로 나타내는 부분은 다른 구조와의 결합 부분이다.
식(B2) 중, Rb1 및 Rb4는 모두 메틸기이며, Rb2 및 Rb3 및 Rb5 내지 Rb11은 모두 수소 원자인 것이 바람직하다.
알부민에 결합 가능한 항체로서는 알부민에 친화성을 갖는 한에 있어서, IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE의 클래스를 갖는 면역 글로불린을 사용해도 되고, 항체 단편(예를 들면, Fab 프래그먼트)을 사용해도 된다. 간장 등의 의도하지 않은 조직에의 집적을 저감하는 관점에서, 알부민에 결합 가능한 항체를 알부민 결합부로서 사용할 경우, 분자량이 적은 Fab 프래그먼트를 사용하는 것이 바람직하다.
알부민에 결합 가능한 펩티드로서는 예를 들면, 국제공개 제2007/106120호에 나타내어지는 서열을 포함하는 펩티드를 들 수 있고, 상세하게는 이하의 펩티드 서열을 포함하는 펩티드를 들 수 있지만, 이들 서열에 한정되지 않는다.
이하의 펩티드 서열은 아미노산을 1 문자 표기로 나타내고, 지면 좌측이 N 말단, 지면 우측이 C 말단을 나타낸다.
·LCLRDWGCLW(서열번호 1)
·DICLPRWGCLWW(서열번호 2)
·MEDICLPRWGCLWGD(서열번호 3)
·QRLMEDICLPRWGCLWEDDE(서열번호 4)
·QGLIGDICLPRWGCLWGRSV(서열번호 5)
·QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK(서열번호 6)
·EDICLPRWGCLWEDD(서열번호 7)
·RLMEDICLPRWGCLWEDD(서열번호 8)
·MEDICLPRWGCLWEDD(서열번호 9)
·MEDICLPRWGCLWED(서열번호 10)
·RLMEDICLARWGCLWEDD(서열번호 11)
·EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG(서열번호 12)
·RAPESFVCYWETICFERSEQ(서열번호 13)
식(1) 또는 식(2) 중, 부호 C로 나타내어지는 PSMA 분자와의 결합부는 암 등의 질환의 원인이 되는 조직에 발현되어 있는 PSMA 분자에 친화성을 갖고, 상기 PSMA 분자와 가역적으로 결합 가능한 화학 구조인 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이다. 본 발명의 화합물에 이러한 구조가 포함되어 있음으로써, 이것을 방사성 금속으로 표지하여 생체에 투여했을 때에, 치료 또는 진단의 대상이 되는 조직에 효율적으로 집적시킬 수 있어, 치료 또는 진단의 효율을 높일 수 있다.
PSMA는 특히 전립선 암에 있어서 발현이 항진하는 막 결합형 단백질이다. PSMA는 전립선을 포함한 정상 조직에서의 발현량은 적지만, 전립선 암의 악성도가 높아짐에 따라 PSMA의 발현량이 항진한다. 따라서, PSMA는 본 발명에 있어서의 유용한 표적 분자의 하나이며, 전립선 암의 진단 및 치료의 표적으로서 특히 유용하다.
PSMA 분자를 발현하는 암으로서는 예를 들면 전립선 암을 들 수 있다. 전립선 암은 원발성이어도 되고 전이성이어도 된다.
PSMA 분자와의 결합부에 있어서의 화학 구조는 목적으로 하는 조직이나 상기 조직에 발현하는 PSMA 분자의 양에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상세하게는 PSMA 분자와의 결합부로서, PSMA 분자에 친화성을 갖는 구조를 채용할 수 있다. PSMA 분자에 친화성을 갖는 구조로서는 예를 들면, 저분자 화합물, 펩티드, 항체 및 Fab 프래그먼트 등의 항체 단편 중 1종 이상을 들 수 있다.
상기 식(1) 또는 식(2) 중, PSMA 분자와의 결합부는 하기 식(C1)으로 나타내어지는 구조를 갖거나, 또는 PSMA 분자에 결합 가능한 항체 또는 펩티드인 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물에 이러한 구조가 포함되어 있음으로써, 여기에 방사성 금속을 표지하여 투여했을 때에, 치료 또는 진단의 대상이 되는 조직에 효율적으로 집적시킬 수 있어, 치료 또는 진단의 효율을 높일 수 있다.
식(C1) 중, a 및 b는 각각 독립적으로, 1 이상 7 이하의 정수이다.
또한, 식(C1) 중, 파선으로 나타내는 부분은 식(1)에 있어서의 A1 또는 La, 또는 식(2)에 있어서의 Lc와의 결합 부분이다.
PSMA 분자에 결합 가능한 항체로서는 PSMA 분자에 친화성을 갖는 한에 있어서, IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE의 클래스를 갖는 면역 글로불린을 사용해도 되고, 항체 단편(예를 들면, Fab 프래그먼트)을 사용해도 된다. 간장 등의 의도하지 않은 조직에의 집적을 저감하는 관점에서, PSMA 분자에 결합 가능한 항체를 PSMA 분자와의 결합부로서 사용할 경우, 분자량이 적은 Fab 프래그먼트를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화합물이 상기 식(1)의 구조를 갖는 것일 경우, 이하의 일반식(1S)으로 나타내어지는 구조를 갖는 것이 보다 바람직하고, 또한, 이하의 일반식(1T)으로 나타내어지는 구조를 갖는 것도 보다 바람직하다.
이러한 구조를 갖고 있음으로써, 방사성 금속을 배위 가능한 헤테로 원자를 구조 중에 충분히 가진 것이 되기 때문에, 본 발명의 화합물에 방사성 금속을 배위시킬 때에 착체 형성 효율을 높일 수 있다. 이에 더하여, 알부민 결합부 및 PSMA 분자와의 결합부에 있어서의 분자의 움직임의 자유도가 높아지기 때문에, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 높은 레벨로 양립할 수 있다. 또한, 간장이나 신장 등의 정상 조직으로의 의도하지 않은 집적이 저감된 것이 된다.
식(1S) 및 식(1T) 중, A1은 각각 독립적으로, 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부이다.
식(1S) 중, C는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이다.
식(1S) 및 식(1T) 중, 각각 독립적으로, La는 링커 구조이다.
식(1S) 및 식(1T) 중, 각각 독립적으로, Lb는 La와 동일 또는 상이한 링커 구조이다.
식(1S) 및 식(1T) 중, m 및 n은 각각 독립적으로, 0(제로) 또는 1이다.
식(1S) 및 식(1T) 중, 상기 식(B1)에서의 설명과 같은 설명이 적절히 적용된다.
식(1S) 및 식(1T) 중, n이 1일 경우, La는 A1의 임의의 부위에 결합하고 있다.
식(1S) 및 식(1T) 중, n이 0일 경우, 페닐알킬기에 결합하는 카르보닐기의 탄소 원자는 A1의 임의의 부위에 결합하고 있다.
식(1S) 및 식(1T) 중, m이 1일 경우, C 또는 Lb는 La가 A1에 결합하는 부위와는 상이한 부위에 있어서 A1과 결합하고 있다.
식(1S) 및 식(1T) 중, m이 0일 경우, C 또는 질소 원자가 A1에 결합하는 부위와는 상이한 부위에 있어서 A1과 결합하고 있다.
본 발명의 화합물이 상기 식(1)의 구조를 갖는 것일 경우, 이하의 일반식(3)으로 나타내어지는 구조를 갖는 것이 더욱 바람직하다.
이러한 구조를 갖고 있음으로써, 방사성 금속을 배위 가능한 헤테로 원자를 구조 중에 충분히 가진 것이 되므로, 본 발명의 화합물에 방사성 금속을 배위시킬 때에 착체 형성 효율을 높일 수 있다. 이에 더하여, 알부민 결합부 및 PSMA 분자와의 결합부에 있어서의 분자의 움직임의 자유도가 높아지므로, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 높은 레벨로 양립시킬 수 있다. 또한, 간장이나 신장 등의 정상 조직으로의 의도하지 않은 집적이 저감된 것이 된다.
식(3) 중, RB1 및 RB2 중 일방은 알부민 결합부를 포함하는 원자단이며, 타방은 수소 원자, 수산기 또는 카르복시기이며, RC1 및 RC2 중 일방은 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이며, 타방은 수소 원자, 수산기, 또는 카르복시기이다.
이들 중, 식(3) 중, RB1은 알부민 결합부를 포함하는 원자단이고, RC1은 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이며, RB2 및 RC2는 모두 수산기인 것이 바람직하다.
이에 대신하여, 식(3) 중, RB2는 알부민 결합부를 포함하는 원자단이고, RC2는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이며, RB1 및 RC1은 모두 수소 원자이거나, 또는 각각 독립적으로 탄소수 1∼5의 카르복시알킬기인 것도 바람직하다.
상술한 어느 형태라도, 알부민 결합부가 화합물의 일방의 구조 말단에 배치되고, 또한 PSMA 분자와의 결합부가 화합물의 타방의 구조 말단에 배치되어 있음으로써, 본 발명의 화합물의 화학 구조를 거시적으로 보았을 경우에, 킬레이트부와, 알부민 결합부와, PSMA 분자와의 결합부가 대략 직선 형상으로 배치되어 있는 것이 바람직하다.
특히, 식(3) 중, 알부민 결합부를 포함하는 원자단은 알부민 결합부로서 상술한 식(B1) 또는 식(B2)으로 나타내어지는 구조를 포함하는 원자단인 것이 바람직하다. 이러한 화학 구조의 구체예를 이하의 식(3-1)∼(3-4)에 나타낸다.
이하의 식(3-1) 및 식(3-2) 중, L1은 각각 독립적으로, 카르복시기를 포함하는 탄소수 1 이상 8 이하의 알킬기이다.
이하의 식(3-3) 및 식(3-4) 중, 각각 독립적으로, g는 1 이상 5 이하의 정수이고, h는 0 또는 1이다.
또한, 이하의 식(3-1)∼식(3-4) 중, R, Rb1 내지 Rb11 및 RC1 및 RC2에 관한 설명은 각각 독립적으로, 상술한 식(B1) 및 (B2), 그리고 식(3)에 관한 설명이 적절히 적용된다.
즉, R은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이고, 바람직하게는 R은 수소 원자, 요오드 원자, 브롬 원자 또는 메틸기이다.
Rb1 내지 Rb11은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 수산기, 시아노기, 탄소수가 1 이상 6 이하인 치환 혹은 무치환의 알킬기, 또는 탄소수가 1 이상 6 이하인 치환 혹은 무치환의 알콕시기이며, 바람직하게는 Rb1 및 Rb4는 모두 메틸기이고, Rb2 및 Rb3 그리고 Rb5 내지 Rb11은 모두 수소 원자인 것이 바람직하다.
RC1 및 RC2 중 일방은 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이며, 타방은 수소 원자, 수산기, 또는 탄소수 1∼5의 카르복시알킬기이다.
이상의 식(1) 및 식(3)에 관한 각 구조를 갖는 본 발명의 화합물은 예를 들면 후술하는 실시예에 기재된 방법 및 합성 경로로 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물이 상기 식(2)의 구조를 갖는 것일 경우, 상기 식(2) 중, B가 상기 식(B1)으로 나타내어지고, 또한 C가 상기 식(C1)으로 나타내어지는 구조를 갖는 것이 더욱 바람직하다. 구체적으로는 이하의 식(2S)의 구조를 갖는 것이 더욱 바람직하다.
이러한 구조를 갖고 있음으로써, 방사성 금속을 배위 가능한 헤테로 원자를 구조 중에 충분히 가진 것이 되기 때문에, 본 발명의 화합물에 방사성 금속을 배위시킬 때에 착체 형성 효율을 높일 수 있다. 이에 더하여, 알부민 결합부 및 PSMA 분자와의 결합부에 있어서의 분자의 움직임의 자유도가 높아지기 때문에, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 높은 레벨로 양립시킬 수 있다. 또한, 간장이나 신장 등의 정상 조직으로의 의도하지 않은 집적이 저감된 것이 된다. 또 착체 형성에 필요로 하는 제조 시간이 적어져, 방사성 표지 화합물의 제조 효율 및 방사 화학적 수율이 더욱 향상된다.
식(2S) 중, A2는 Neunpa 혹은 Octapa 또는 이것들의 유도체이다.
식(2S) 중, Lc는 링커 구조이다.
식(2S) 중, R은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이다.
식(2S) 중, a 및 b는 각각 독립적으로, 1 이상 7 이하의 정수이다.
식(2S) 중, A2가 Octapa일 때, Lc는 폴리에틸렌글리콜 구조를 포함한다.
이상의 식(2) 및 식(2S)에 관련되는 각 구조를 갖는 본 발명의 화합물은 예를 들면 후술하는 실시예에 기재된 방법 및 합성 경로로 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은 이것을 바람직하게는 용매나 완충액 등의 수성액에 용해한 상태에서, 방사성 금속의 이온과 반응시켜, 상기의 각 실시형태의 화합물을 방사성 금속 이온에 배위시켜, 방사성 표지 화합물을 얻을 수 있다. 이 방사성 표지 화합물은 화합물에 있어서의 킬레이트부가 방사성 금속의 이온에 배위되어 이루어지는 방사성 금속 착체이다.
방사성 표지 화합물을 얻는 데에 있어서, 식(1)으로 나타내어지는 화합물을 사용할 경우, 식(1) 중, B가 상기의 식(B1)으로 나타내어지는 구조를 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로는 방사성 표지 화합물을 얻는 데에 있어서, 식(1S)으로 나타내어지는 화합물을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 이에 의해, 착체 형성 효율을 높일 수 있다.
착체 형성 효율을 높이는 관점에서, 화합물과 반응시키는 방사성 금속은 전리 가능한 방사성 금속 화합물의 형태로 사용하는 것이 바람직하고, 방사성 금속 이온의 형태로 사용하는 것이 더욱 바람직하다(이하, 이들 형태를 총칭하여 「방사성 금속원」이라고도 한다.). 방사성 금속원으로서는 예를 들면, 물을 주체로 하는 용매에 방사성 금속 이온이 용해 또는 분산된 방사성 금속 이온 함유액을 사용할 수 있다.
또한, 화합물에 있어서의 킬레이트부와 방사성 금속의 조합에 의존하지 않고, 방사성 금속과의 착체 형성 효율을 높이는 관점에서, 착체 형성에 있어서, 화합물과 방사성 금속을 가열하여 반응시키는 것이 바람직하다. 이러한 반응 조건으로 행함으로써, 검출이 곤란한 저에너지 방사선이나, α선을 방출하는 방사성 금속 핵종을 사용했을 경우라도, 착체 형성을 양호하게 진행시킬 수 있기 때문에, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물을 높은 수율로 얻을 수 있다.
방사성 표지 화합물을 얻는 데에 있어서, 화합물과 방사성 금속 이온의 착체 형성이 가능하면, 화합물과 방사성 금속원의 첨가 순서는 상관없고, 예를 들면, 용매를 수용한 반응 용기에, 화합물 및 방사성 금속원의 일방을 첨가하고, 이어서 타방을 첨가하여 반응시켜도 되고, 화합물 및 방사성 금속원의 일방을 용매에 용해한 용액에 타방을 첨가하여 반응시켜도 된다. 또는, 용매를 수용한 반응 용기에 이것들을 동시에 첨가하여 반응시켜도 된다.
방사성 표지 화합물을 얻기 위한 반응 조건으로서는 예를 들면 이하의 조건으로 할 수 있다. 본 공정에서 사용되는 용매로서는 예를 들면 물, 생리 식염수, 또는 아세트산나트륨 완충액, 아세트산암모늄 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, Tris 완충액, HEPES 완충액, 또는 테트라메틸암모늄아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 반응 온도로서는 예를 들면 실온(25℃)이어도 되고, 가열 조건하여도 된다.
방사성 금속원은 예를 들면, 물을 주체로 하는 용매에 방사성 금속 이온이 분산된 용액을 사용할 수 있다.
본 공정에 있어서의 반응액량은 특별히 한정되지 않지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점에서, 본 공정의 개시시에 있어서 0.01mL∼100mL가 현실적이다. 또한, 화합물 및 방사성 금속 이온의 반응액 중의 농도는 각각 독립적으로, 본 공정의 개시시에 있어서, 1μM∼100μM인 것이 목적으로 하는 방사성 표지 화합물의 수율의 관점에서 바람직하다.
얻어진 방사성 표지 화합물은 이것을 그대로 사용해도 되고, 혹은 여과 필터, 멤브레인 필터, 다양한 충전제를 충전한 칼럼, 크로마토그래피 등을 사용하여 정제해도 된다.
또 필요에 따라, 이후의 공정에 있어서, 방사성 표지 화합물에 물을 주체로 하는 용매 및 약학적으로 허용되는 다른 성분을 첨가하여, 방사성 표지 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 방사성 의약 조성물로 할 수도 있다. 방사성 의약 조성물은 예를 들면 상술한 방법으로 제조된 방사성 표지 화합물을, 물을 주체로 하고, 또한 생체와 대략 등장인 용매에 용해시켜 제조할 수 있다. 방사성 의약 조성물은 경구적으로, 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 근육 내 등의 비경구적으로 생체에 투여되어, 질환의 치료, 질환의 진단, 혹은 병소의 검출 등에 사용할 수 있다.
방사성 표지 화합물에 이온의 상태로 배위되어 있는 방사성 금속은 α선, β선 혹은 γ선 또는 이것들의 조합의 방사선을 방출하는 금속 핵종을 사용할 수 있다. 이러한 방사성 금속의 핵종으로서는 예를 들면 알칼리 금속, 알칼리 토류 금속, 란타노이드, 악티노이드, 변이 금속 또는 이들 금속 이외의 금속의 방사성 동위체 등을 들 수 있다.
이들 중, 상업 이용 가능하고 또한 착체 형성성의 향상을 도모하는 관점에서, 방사성 금속의 핵종으로서, 44Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 60Co, 59Fe, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 89Sr, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Ru, 111In, 153Sm, 165Dy, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 197Hg, 198Au, 201Tl, 203Hg, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac 또는 227Th를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 방사성 금속은 상법에 따라 제조할 수 있다. 이들 방사성 핵종은 방사성 금속이 전리 상태로 함유되는 용액으로서 얻는 것이 바람직하다.
방사성 표지 화합물을 질환의 치료를 목적으로 하여 사용할 경우에는 치료 효과를 높이는 관점에서, 방사성 금속으로서 α선 방출 핵종 또는 β-선 방출 핵종을 사용하는 것이 바람직하다. α선 방출 핵종은 방사성 금속의 괴변 과정에서 α선을 방출하는 핵종이면 되고, 상세하게는 212Bi, 213Bi, 225Ac 또는 227Th 등이 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 227Th 또는 225Ac이며, 더욱 바람직하게는 225Ac이다.
β-선 방출 핵종은 방사성 금속의 괴변 과정에서 β-선을 방출하는 핵종이면 되고, 상세하게는 59Fe, 60Co, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 90Y, 99mTc, 103Ru, 153Sm, 165Dy, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 203Hg, 212Pb, 212Bi 또한 213Bi 등이 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 64Cu, 67Cu, 89Sr, 90Y, 177Lu, 186Re 또는 188Re가 사용되고, 더욱 바람직하게는 90Y가 사용된다.
또한, 방사성 표지 화합물을 질환의 진단이나 병소의 검출을 목적으로 하여 사용할 경우에는 진단 성능을 높이는 관점에서, 방사성 금속으로서 β+선 방출 핵종, 전자 포획 괴변 핵종, 또는 γ선 방출 핵종을 사용하는 것이 바람직하다. β+선 방출 핵종은 방사성 금속의 괴변 과정에서 양전자를 방출하는 핵종이면 되고, 44Sc, 58Co, 68Ga, 64Cu 또는 89Zr 등이 바람직하게 사용되고, 보다 바람직하게는 64Cu 또는 89Zr이다.
전자 포획 괴변 핵종은 방사성 금속의 괴변 과정에서 오제 전자 또는 특성 X선을 방출하는 핵종이면 되고, 51Cr, 57Co, 58Co, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 111In, 186Re, 197Hg 또는 201Tl 등이 바람직하게 사용된다.
γ선 방출 핵종은 γ 붕괴에 의해 γ선을 방출하는 핵종이면 되고, γ붕괴에 의해 γ선을 방출하는 핵종으로서는 68Ga, 99mTc 또는 201Tl이 바람직하게 사용된다.
방사성 금속 착체에 이온의 상태로 배위되어 있는 방사성 금속을, 이온 반경에 근거하여 선택할 경우, 이온 반경이 70∼130pm 정도인 방사성 금속으로서, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99mTc, 103Ru, 111In, 153Sm, 165Dy, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 198Au, 201Tl, 197Hg, 203Hg, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac 등을 들 수 있고, 이것들은 바람직하게는 상기 식(A1)∼(A9)으로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 본 발명의 화합물과 방사성 금속 이온의 착체를 형성할 수 있다.
예를 들면, 방사성 표지 화합물을 질환의 치료를 목적으로 하여 사용할 경우에, 방사성 금속으로서 225Ac를 사용할 경우에는 본 발명의 화합물로서, 바람직하게는 상기 식(A1), (A3)∼(A5) 또는 (A7) 중 어느 하나로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용하고, 더욱 바람직하게는 상기 식(A1), (A3) 또는 (A4)으로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용한다. 또한, 방사성 금속으로서 90Y를 사용할 경우에는 본 발명의 화합물로서, 바람직하게는 상기 식(A1)∼(A3) 또는 (A8) 중 어느 하나로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용하고, 더욱 바람직하게는 상기 식(A1)으로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용한다.
또한, 방사성 표지 화합물을 질환의 진단이나 병소의 검출을 목적으로 하여 사용할 경우에, 방사성 금속으로서 89Zr을 사용할 경우에는 본 발명의 화합물로서, 바람직하게는 상기 식(A1), (A3) 또는 (A4) 중 어느 하나로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용하고, 더욱 바람직하게는 상기 식(A1)으로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용한다. 또한, 방사성 금속으로서 68Ga 또는 111In을 사용할 경우에는 본 발명의 화합물로서, 바람직하게는 상기 식(A1)∼(A4) 또는 (A9) 중 어느 하나로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용하고, 더욱 바람직하게는 상기 식(A1)으로 나타내어지는 구조의 킬레이트부를 갖는 화합물을 사용한다.
킬레이트부와 알부민 결합부를 포함하는 원자단의 결합은 킬레이트부와 알부민 결합부가 후술하는 링커 구조를 개재하지 않고 직접적으로 결합하고 있어도 되고, 혹은 킬레이트부와 알부민 결합부를 포함하는 원자단이 후술하는 링커 구조를 개재하여 간접적으로 결합하고 있어도 된다.
마찬가지로, 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단의 결합은 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부가 후술하는 링커 구조를 개재하지 않고 직접적으로 결합하고 있어도 되고, 혹은 킬레이트부와 알부민 결합부를 포함하는 원자단이 후술하는 링커 구조를 개재하여 간접적으로 결합하고 있어도 된다.
상술한 「직접적으로」 혹은 「간접적으로」 중 어느 형태라도, 아미드 결합을 개재하여 결합하고 있는 것이, 합성의 용이성과 화학 구조의 안정성을 양립하는 관점에서 바람직하다.
식(1)의 La 또는 Lb, 또는 식(2)의 Lc인 링커 구조로서는 각각 독립적으로, 아미드 결합 또는 에테르 결합을 형성 가능한 화합물에서 유래하는 구조인 것이 바람직하다. 그 구체예로서는 글루탐산이나 아스파르트산 등의 산성 아미노산 및 리신 등의 염기성 아미노산 등의 L체 또는 D체의 아미노산, 옥살산이나 말론산 등의 디카르복실산, 에틸렌디아민 등의 디아민, 폴리에틸렌글리콜기, 탄소수 5∼10의 환상 지방족 또는 탄소수 6∼14의 방향족을 구조 중에 갖는 아미노산 등에서 유래하는 구조로 할 수 있다. 이것들은 단독으로, 또는, 아미드 결합 또는 에테르 결합에 의해 복수 연결하여 채용할 수 있다. 또 상술한 구조는 각각 독립적으로, 비치환이어도 되고, 각종 치환기로 치환되어 있어도 된다.
상술한 링커 구조로서 아미노산 등에서 유래하는 구조를 포함할 경우, 예를 들면, 생체 내에서의 동태를 제어할 목적으로, 국제공개 제2017/150549호, 국제공개 제2019/065774호, 국제공개 제2019/221269호, 국제공개 제2020/075746호, 국제공개 제2020/145227호, 국제공개 제2020/145228호 등에 기재된 펩티드 링커를 사용할 수 있다.
상술한 링커 구조로서 에틸렌글리콜에서 유래하는 구조를 포함할 경우, 이하의 식(P)에 나타내는 링커 구조에 의해 간접적으로 결합하고 있는 것도 바람직하다. 상기 구조는 에틸렌글리콜 유래의 구조이며, 식(P) 중, k는 바람직하게는 2 이상 10 이하의 정수, 보다 바람직하게는 2 이상 8 이하의 정수, 더욱 바람직하게는 2 이상 5 이하의 정수이다.
이들 링커 구조는 1종의 링커 구조로 구성되어 있어도 되고, 혹은 1종의 링커 구조를 반복하거나, 또는 복수종의 링커 구조를 조합하여, 이것들을 직쇄상으로 또는 분기쇄상으로 결합시켜서 사용해도 된다.
특히, 식(2)에 나타내어지는 화합물을 사용할 경우, Lc에 있어서의 링커 구조는 식(P)으로 나타내어지는 폴리에틸렌글리콜 구조를 가짐과 아울러, 시클로헥실기 및 나프틸기를 포함하지 않는 구조인 것이 바람직하다. 이러한 구조를 가짐으로써, 화학 구조가 움직이기 쉽고, 또한 알부민 결합부와 PSMA 분자와의 결합부 사이에 있어서의 거리를 적당히 확보할 수 있으므로, 알부민에의 친화성과 PSMA 분자의 친화성을 효과적으로 겸비할 수 있다.
상술한 킬레이트부와 알부민 결합부가 「간접적으로」 결합하고 있는 경우, 또는 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부가 「간접적으로」 결합하고 있는 경우의 다른 형태로서는 공지의 커플링 방법으로 연결시키는 것이어도 되고, 예를 들면 클릭 반응을 사용하여 연결시킬 수 있다. 이들 방법으로 결합된 구조도, 본 명세서에 있어서의 링커 구조에 포함된다.
이하, 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부의 결합에 클릭 반응을 사용하는 경우를 예로 설명한다. 이 경우, 킬레이트부 및 PSMA 분자와의 결합부가 클릭 반응 가능한 원자단을 각각 갖고 있고, 이들 원자단이 서로 반응하여, 킬레이트부와, PSMA 분자와의 결합부를 서로 결합할 수 있도록 되어 있다. 즉, 킬레이트부가 구비하는 제 1 원자단과, PSMA 분자와의 결합부가 구비하는 제 2 원자단 사이에서 실행되는 것이다.
본 발명에 있어서, 클릭 반응 가능한 원자단의 조합으로서는 클릭 반응의 종류에 따라 적절한 것이 선택되고, 예를 들면, 알킨과 아지드의 조합, 1,2,4,5-테트라진과 알켄의 조합 등을 들 수 있다. 이들 원자단은 제 1 원자단이 상기 원자단 중 하나를 갖고, 제 2 원자단이 제 1 원자단의 조합이 되는 원자단을 갖고 있으면 된다. 킬레이트부 및 PSMA 분자와의 결합부의 안정성과, 이것들의 결합 효율의 향상을 양립하는 관점에서, 제 1 원자단이 알킨이고 또한 제 2 원자단이 아지드이거나, 또는 제 1 원자단이 1,2,4,5-테트라진이고 또한 제 2 원자단이 알켄인 것이 바람직하다. 이러한 원자단의 조합에 의한 클릭 반응의 구체예로서, 휘스겐환화 부가 반응, 혹은 역전자 요청형 디일스알더 반응 등을 들 수 있다.
클릭 반응 가능한 원자단의 조합의 구체예로서는 이하의 식에 나타낸 바와 같이, 제 1 원자단의 알킨으로서 디벤질시클로옥틴(DBCO)을 포함하는 원자단(식(11a))과, 제 2 원자단의 아지드로서 아지드기를 포함하는 원자단(식(12a))의 조합, 또는 제 1 원자단이 1,2,4,5-테트라진을 포함하는 원자단(식(1lb))과, 제 2 원자단의 알켄으로서 trans-시클로옥텐(TCO)을 포함하는 원자단(식(12b))의 조합을 들 수 있다.
(식(11a) 중, R1은 킬레이트부를 나타내고, 식(12a) 중, R2는 PSMA 분자와의 결합부를 나타낸다.)
(식(1lb) 중, R3 및 R4 중 일방이 킬레이트부 또는 PSMA 분자와의 결합부를 나타내고, 타방이 수소 원자, 메틸기, 페닐기 또는 피리딜기를 나타내고, 식(12b) 중, R5는 킬레이트부 또는 PSMA 분자와의 결합부를 나타낸다.)
본 발명에서 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부를 클릭 반응으로 결합시킬 경우에는, 클릭 반응이 진행 가능하면 이들 첨가 순서는 상관없고, 예를 들면, 용매를 수용한 반응 용기에 킬레이트부 및 PSMA 분자와의 결합부의 일방을 첨가하고, 이어서 타방을 첨가하여 반응시켜도 되고, 킬레이트부 및 PSMA 분자와의 결합부의 일방을 용매에 분산시킨 분산액에 타방을 첨가하여 반응시켜도 된다. 또는, 용매를 수용한 반응 용기에 이것들을 동시에 첨가하여 반응시켜도 된다.
상술한 각 실시형태에 있어서, 각 원자단, 각 구조, 및 화합물 및 방사성 표지 화합물의 각 화학 구조에 있어서 치환될 수 있는 치환기로서는, 예를 들면 할로겐 원자, 포화 또는 불포화의 알킬기, 히드록시기, 알데히드기, 카르복시기, 아실기, 아미노기, 니트로기, 에스테르기, 이소티오시아네이트기, 티옥시기, 시아노기, 아미드기, 이미드기, 인산기, 페닐기, 벤질기, 피리딜기, 나프틸기 등을 들 수 있다. 이들 치환기는 1종을 단독으로 또는, 2종 이상의 치환기가 조합된 기여도 된다.
이상, 본 발명을 그 바람직한 실시형태에 근거하여 설명했지만, 본 발명은 상술한 실시형태에 한정되지 않는다. 예를 들면, 상술한 각 실시형태에서는 킬레이트부, 알부민 결합부 및 PSMA 분자와의 결합부를 각각 1개씩 갖는 화합물에 대해 설명했지만, 본 발명이 발휘되는 한에 있어서, 알부민 결합부 및 PSMA 분자와의 결합부 중 적어도 하나는 1개의 화학 구조 중에 복수 부위 갖고 있어도 된다.
(실시예)
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명의 범위는 이러한 실시예에 제한되지 않는다.
이하의 실시예에 있어서, 특별히 언급하지 않는 한, NMR은 모두 니혼 덴시 카부시키가이샤의 JNM-AL400 FT-NMR 장치로, 내부 표준 물질로서 테트라메틸실란(TMS)을 사용하고, TMS 공명을 0.00ppm으로 설정하였다. 모든 화학 시프트는 델타 스케일(δ) 상의 ppm이며, 그리고 시그널의 미세 분열에 대해서는 약호(s: 싱글릿, d: 더블릿, t: 트리플릿, m: 멀티플릿, br: 브로드)를 사용하여 나타냈다.
또 질량 분석에 있어서는 MS를 행할 경우에는 LCMS 2020(카부시키가이샤 시마즈 세이사쿠쇼제), HRMS를 행할 경우 LCMS-IT-TOF(카부시키가이샤 시마즈 세이사쿠쇼제)를 사용하여 행하였다.
〔실시예 1-1∼1-4, 및 비교예 1-1∼1-3〕
본 실시예에서는 PSMA를 표적 분자로 하는 2종류의 화합물(PSMA-DA1 및 PSMA-DB)을 합성하였다. 그 다음에, 각 화합물에 방사성 금속으로서 111In 이온, 90Y 이온 또는 225Ac 이온을 각각 배위시킨 방사성 표지 화합물을 얻었다. 이하에 상세를 나타낸다.
실시예 1-1∼1-4에서 사용한 PSMA-DA1은 상기 일반식(1)으로 나타내는 바와 같이, PSMA 분자와의 결합부 및 알부민 결합부를, 킬레이트부를 개재하여 직선 형상으로 포함하는 화학 구조를 갖는 것이다. PSMA-DA1은 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부가 아미드 결합에 의해 직접적으로 결합하고 있고, 또한, 킬레이트부와 알부민 결합부를 포함하는 원자단은, 리신 유래의 링커 구조를 개재하여 간접적으로 결합하고 있다.
비교예 1-1∼1-3에서 사용한 PSMA-DB는 구조 중에 킬레이트부 및 PSMA 분자와의 결합부를 포함하지만, 알부민 결합부를 포함하지 않는 것이다.
<실시예 1-1∼1-4>
실시예 1-1∼1-4에 있어서의 합성 경로의 개략을 합성 경로(V-1) 및 (V-2)로서 이하에 나타낸다.
(1) PSMA-DA1(화합물 1)의 합성
화합물 1은 Chem Commun. 2008, 28, 3248-3250의 방법에 따라, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸으로부터 3단계로 합성하였다. 이 화합물 1(20mg, 0.026mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(2mL)에 용해시켜, 메틸-N6-(4-(4-요오드페닐)부타노일)-L-리지네이트(11mg, 0.0254mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC)염산염(7.0mg, 0.037mmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)(5.0mg, 0.037mmol), 및 트리에틸아민(5μL, 0.036mmol)을 더하고, 실온에서 24시간 교반하였다. 그 후, (S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트(13mg, 0.0267mmol)·EDC 염산염(7.0mg, 0.037mmol), HOAt(5.0mg, 0.037mmol), 및 트리에틸아민(5μL, 0.036mmol)을 더하고, 실온에서 72시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사에 6규정 염산(3mL)을 더하고, 40℃에서 24시간 교반 후, 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하여, 목적으로 하는 화합물(PSMA-DA1)을 얻었다. 수량 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(10×250mm), 이동상: MeCN/H2O/트리플루오로아세트산(TFA)[10/90/0.1(0분)∼100/0/0.1(90분)], 유속: 4mL/min.
수량: 1.0mg(수율: 3%, 화합물 1의 물질량에 대한 얻어진 PSMA-DA1의 물질량으로부터 산출하였다).
MS(ESI): m/z1250.5 [M+H]+.
(2) 111In 표지(실시예 1-1)
아세트산 완충액(0.1M, pH 5.5, 200μL)에 [111In]InCl3 용액(3.7MBq, 100μL)과, PSMA-DA1의 DMSO 용액(1mM, 10μL)을 더해, 90℃에서 30분간 정치하였다. 그 후, 반응액을 역상 HPLC에 의해 이하의 조건으로 정제하여, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([111In]In-PSMA-DA1)을 얻었다.
얻어진 방사성 표지 화합물의 방사능을 퀴리 미터로 측정하고, 반응에 사용한 [111In]InCl3 용액의 방사능에 대한 백분율을 방사 화학적 수율(%)로 하였다.
또한, 방사성 표지 화합물의 HPLC 분취액의 일부를 정제 조건과 같은 HPLC 조건으로 분석하고, 검출된 모든 피크의 면적값에 대한 방사성 표지 화합물의 면적값의 백분율을 방사 화학적 순도(%)로 하였다.
그 결과, 방사 화학적 수율은 61∼90%, 방사 화학적 순도는 95% 이상이었다.
111In 표지에서의 정제 조건: Cosmosil 5C18-PAQ column(4.6×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA[20/80/0.1(0분)∼50/50/0.1(30분) 또는 5/95/0.1(0∼10분), 5/95/0.1(10분)∼35/65/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
또한, PSMA-DA1을 비방사성의 In에 배위시킨 화합물은 예를 들면 이하의 방법으로 제조할 수 있고, 얻어진 In 착체는 방사성 표지 화합물의 HPLC 유지 시간의 동정에 사용하였다.
PSMA-DA1(1mg)과 염화인듐(III) 무수화물(2mg)을 디메틸술폭시드(DMSO)(100μL)에 용해시켜, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충액(0.1M, pH 5.6, 900μL)을 더하였다. 반응액을 60℃에서 12시간 교반 후, 용액을 역상 HPLC에 의해 이하의 방법으로 정제하여, 이하의 MS를 갖는 화합물을 얻었다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(10×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA[10/90/0.1(0분)∼100/0/0.1(90분)], 유속: 4mL/min.
MS(ESI): m/z1362.4[M+H]+.
(3)90Y 표지(실시예 1-2)
아세트산 완충액(0.1M, pH 5.5, 200μL)에 [90Y]YCl3 용액(65-118MBq, 10μL)과 PSMA-DA1의 DMSO 용액(1mM, 10μL)을 더하고, 90℃에서 30분간 정치하였다. 그 후, 반응액을 역상 HPLC에 의해 이하의 조건으로 정제하여, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([90Y]Y-PSMA-DA1)을 얻었다.
방사 화학적 수율은 실시예 1-1과 마찬가지의 방법으로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 분석에 사용한 HPLC 조건은 이하에 나타내는 90Y 표지에서의 정제 조건을 사용하였다.
그 결과, 방사 화학적 수율은 49∼79%, 방사 화학적 순도는 95% 이상이었다.
90Y 표지에서의 정제 조건: Cosmosil 5C18-PAQ column(4.6×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA[20/80/0.1(0분)∼50/50/0.1(30분) 또는 5/95/0.1(0∼10분), 5/95/0.1(10분)∼35/65/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
(4) 225Ac 표지(실시예 1-3)
[225Ac]AcCl3의 0.2M 염산 용액(1.5MBq, 10μL)에 0.1M 아세트산-아세트산암모늄 완충액(pH 5.5, 170μL)과 PSMA-DA1의 DMSO 용액(2.0mM, 10μL)을 더하여, 70℃에서 1시간 정치하였다. 반응액에 H2O(800μL)를 더하고, Oasis HLB Light 칼럼에 통액하였다. 칼럼에 H2O(10mL)를 통액 후, 70% EtOH(0.5mL)를 통액하여, 정제 용액을 얻었다. 정제 용액을 가열 증류 제거로 건고 후, 5% 에탄올 함유 158mM 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 6.5)을 더하여, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([225Ac]Ac-PSMA-DA1)의 투여 용액을 얻었다.
방사 화학적 수율은 다음 방법으로 측정하였다. 얻어진 방사성 표지 화합물의 방사능을 감마선 스펙트럼 미터로 측정하고, 반응에 사용한 [225Ac]AcCl3 용액의 방사능에 대한 백분율을 방사 화학적 수율(%)로 하였다.
얻어진 방사성 표지 화합물의 방사 화학적 순도를 다음 방법으로 측정하였다. 즉 방사성 표지 화합물의 용액의 일부를 TLC(iTLC-SG, 이동상: MeCN/H2O=1:1 혼액)로 분석하고, 검출된 모든 피크의 면적값에 대한 방사성 표지 화합물의 면적값의 백분율을 방사 화학적 순도(%)로 하였다.
그 결과, 방사 화학적 수율은 49%, 방사 화학적 순도는 87%였다.
(5) 89Zr 표지(실시예 1-4)
TypeI Plus 바이알(2R)(SCHOTT사제)에 [89Zr]Zr(Ox)2의 1.0M 염산 용액(2.2MBq, 10μL)을 분주하여, 110℃로 가열하고, 약40분간 Ar 기류하에서 용매 증류 제거하였다. 바이알에 0.1mol/L 염산(100μL)과 300mM 겐티딘산-0.78M 아세트산-아세트산나트륨 완충액(pH 5.5, 50μL)과 PSMA-DA1-DMSO 용액(2mM, 75μL)과 DMSO(75μL)를 더하고, 70℃에서 1시간 정치하여, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([89Zr]Zr-PSMA-DA1)을 얻었다.
얻어진 방사성 표지 화합물의 방사 화학적 순도는 실시예 1-3과 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 방사 화학적 순도는 96%였다.
<비교예 1-1∼2-3>
비교예 1-1∼2-3에 있어서의 합성 경로의 개략을 합성 경로(VI-1) 및 (VI-2)로서 이하에 나타낸다.
(1) PSMA-DB의 합성
실시예1-1∼1-4와 마찬가지의 방법으로 합성한 화합물 1(35mg, 0.045mmol)을 DMF(2mL)에 용해시키고, (S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트(22mg, 0.045mmol), EDC 염산염(10mg, 0.052mmol), HOAt(7.0mg, 0.051mmol), 트리에틸아민(7μL, 0.050mmol)을 첨가하고, 실온에서 24시간 교반하였다. 그 후, 아닐린(5μL, 0.055mmol), EDC 염산염(10mg, 0.052mmol), HOAt(7.0mg, 0.051mmol), 트리에틸아민(7μL, 0.050mmol)을 첨가하고, 실온에서 24시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사에 TFA(1.8mL), 트리이소프로필실란(100μL), 및 H2O(100μL)를 첨가하고, 실온에서 24시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하여, 목적으로 하는 화합물(PSMA-DB)을 얻었다. 수량 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(10×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [5/95/0.1(0∼10분), 5/95/0.1(10분)∼35/65/0.1(40분)], 유속: 4mL/min.
수량: 5.0mg(수율: 12%, 화합물 1의 물질량에 대한 얻어진 PSMA-DB의 물질량으로부터 산출하였다).
MS(ESI)m/z925.3 [M+H]+.
(2) 111In 표지(비교예 1-1)
PSMA-DA1에 대신하여, PSMA-DB를 사용한 것 이외에는 실시예 1-1과 마찬가지의 방법에 의해, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([111In]In-PSMA-DB)을 얻었다.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 정제 조건 및 방사 화학적 순도의 측정에 사용한 HPLC 조건은 이하에 나타내는 조건을 사용하였다.
그 결과, 방사 화학적 수율은 61∼90%, 방사 화학적 순도는 95% 이상이었다.
또한, PSMA-DB를 비방사성의 In에 배위시킨 화합물은 예를 들면 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 얻어진 In 착체는 방사성 표지 화합물의 HPLC 유지 시간의 동정에 사용하였다.
PSMA-DB(1 등량)의 H2O/MeCN/TFA(49.95/49.95/0.1, 300μL) 용액에 염화인듐(III) 무수화물(10 등량)을 더하였다. 실온에서 18시간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [5/95/0.1(0∼10분), 5/95/0.1(10분)∼35/65/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
(3) 90Y 표지(비교예 1-2)
PSMA-DA1에 대신하여, PSMA-DB를 사용한 것 이외에는 실시예 1-2와 마찬가지의 방법에 의해, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([90Y]Y-PSMA-DB)을 얻었다.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 측정은 상술한 PSMA-DB를 비방사성의 In에 배위시킨 화합물의 정제 조건으로 나타낸 HPLC 조건으로 실시하였다.
그 결과, 방사 화학적 수율은 49∼79%, 방사 화학적 순도는 95% 이상이었다.
(4) 225Ac 표지(비교예 1-3)
PSMA-DA1에 대신하여, PSMA-DB를 사용한 것 이외에는 실시예 1-3과 마찬가지의 방법에 의해, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([225Ac]Ac-PSMA-DB)을 얻었다.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-3에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다.
그 결과, 방사 화학적 수율은 48%, 방사 화학적 순도는 83%였다.
<혈장 중 안정성 평가>
마우스 혈장(200μL)에 [111In]In-PSMA-DA1(370kBq) 또는 [90Y]Y-PSMA-DA1(3.7MBq)의 생리 식염수(20μL) 용액을 더하여, 37℃에서 24시간 정치하였다(n=3). 그 후, MeCN(200μL)을 더하여, 10000×g에서 5분간 원심 분리하였다. 상청을 여과하고, 여과액을 역상 HPLC로 이하의 조건에서 분석하였다.
(분석 조건: Cosmosil 5C18-PAQ column(4.6×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA[20/80/0.1(0분)∼50/50/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.)
그 결과, 모든 표지 화합물이 마우스 혈장 중 37℃에서 24시간 정치 후에도 95% 이상이 안정적으로 존재하였다.
<배양 세포를 사용한 결합 평가>
LNCaP 세포(PSMA 양성, 인간 전립선 암) 및 PC-3 세포(PSMA 음성, 인간 전립선 암)를 사용하였다. 이들 세포는 각각 American Type Culture Collection사 및 DS Biomedical사에서 구입하였다. 각 세포는 항생 물질(페니실린 및 스트렙토마이신)과 비동화 소 태아혈청 10%를 포함하는 나카라이 테스크 카부시키가이샤제 RPMI1640 중, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다.
LNCaP 세포와 PC-3 세포를 각각, 4.0×105cells/well로 12웰 플레이트에 파종하고, 37℃, 5% CO2하에서 48시간 정치하였다.
배양 배지를 제거하고, [111In]In-PSMA-DA1 또는 [111In]In-PSMA-DB(37kBq)를 포함하는 어세이용 배지(0.5% FBS 함유 RPMI1640 배지) 용액(1mL)을 더하였다. 그 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2하에서 1시간 정치하였다.
저해 실험에서는 배양 배지를 제거 후, [111In]In-PSMA-DA1 또는 [111In]In-PSMA-DB(37kBq)와 2-(포스포노메틸)펜탄디오산(2-PMPA)(PSMA 저해제, 종농도 100μM)를 포함하는 어세이용 배지(1mL) 용액을 더하였다. 그 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2하에서 1시간 정치하였다.
어세이용 배지를 제거 후, 각 웰을 방사성 표지 화합물 및 2-PMPA를 포함하지 않는 어세이용 배지(1mL)로 세정하고, 1규정 수산화나트륨 수용액(200μL×2)로 세포를 용해시켰다.
어세이용 배지 및 세포 용해액의 각 방사능을 감마 카운터로 측정하였다. 이와는 별도로, 세포 용해액 중의 총 단백질 농도를 Thermo Fisher Scientific사제 BCA Protein Assay Kit를 사용하여 산출하였다. 첨가 방사능량에 대한 샘플의 방사능량의 백분율(%ID)을, 총 단백질량으로 나눈 값(%ID/mg protein)을 샘플별로 산출하였다.
데이터는 평균값±표준 편차로 나타냈다. 유의차 검정은 Student's t-test 및 one-way analysis of variance(ANOVA) test with Dunnet's post-hoc test를 사용하여 행하고, p<0.05를 유의차 있음으로 하였다.
배양 세포에의 결합 평가의 결과를 도 1에 나타낸다. 값이 높을수록, 방사성 표지 화합물의 존재량이 많고, 상기 화합물의 집적이 높은 것을 나타낸다.
[111In]In-PSMA-DA1 및 [111In]In-PSMA-DB는 PC-3세포와 비교하여 LNCaP 세포에 대한 높은 결합성을 나타내고, 그 결합은 과잉량의 PSMA 저해제(2-PMPA)의 첨가에 의해 유의하게 저감되었다. 이들 결과로부터, [111In]In-PSMA-DA1 및 [111In]In-PSMA-DB는 PSMA 고발현 세포에 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
<알부민에의 결합 평가>
[111In]In-PSMA-DA1 또는 [111In]In-PSMA-DB의 PBS 용액(37kBq, 50μL)을, 200μL의 PBS, 마우스 혈장, 인간 혈장, 또는 인간 혈청 알부민(HSA)의 PBS 용액(45mg/mL)에 각각 더하고, 37℃에서 10분간 정치하였다. 그 후, 반응액을 스핀 칼럼(사이티바사제 Sephadex G-100)에 첨가하고, 1500×g, 4℃에서 2분간 원심 분리하였다. 분리 후, 칼럼 및 용출액의 방사능을 각각 감마 카운터로 측정하였다.
데이터는 평균값±표준 편차로 나타냈다. 유의차 검정은 Student's t-test 및 one-way analysis of variance(ANOVA) test with Dunnet's post-hoc test를 사용하여 행하고, p<0.05를 유의차 있음으로 하였다.
알부민에의 결합 평가의 결과를 도 2에 나타낸다. 값이 높을수록, 알부민에의 결합성이 높은 것을 나타낸다.
평가 대상이 되는 화합물이 알부민에 결합하여 복합체를 형성하면, 분자 사이즈의 증가에 의해 칼럼을 통과하지만, 알부민에 결합하지 않았을 때에는 칼럼 내의 겔에 유지된다.
[111In]In-PSMA-DA1 및 [111In]In-PSMA-DB를 PBS 중에서 정치 후, 칼럼에 부여한 결과, 용출액에 있어서 현저한 방사능은 관측되지 않았다. 한편, 마우스 혈장, 인간 혈장, 및 HSA 용액 중에서 정치했을 때에는 [111In]In-PSMA-DB와 비교하여 [111In]In-PSMA-DA1의 용출액에 있어서의 방사능은 유의하게 높아, [111In]In-PSMA-DA1이 혈장 알부민에 결합하는 것이 나타났다.
<LNCaP 또는 PC-3 종양 이식 마우스를 사용한 체내 방사능 분포 평가>
동물 실험은 쿄토 대학 동물 실험 위원회의 지침을 준수하여 행하였다. 웅성 CB17/IcrJcl-Prkdcscid 마우스는 니혼 클레아 카부시키가이샤에서 구입하였다. 동물은 12시간/12시간의 주야 사이클 조건하에서 사육하고, 사료와 물은 자유롭게 주었다. PBS와 Corning Life Sciences사제 Matrigel의 혼합액(1:1, 150μL)에 LNCaP 세포(1.0×107cells/mouse) 또는 PC-3 세포(1.0×107cells/mouse)를 현탁시켜, 이소플루란 마취 하, 마우스의 오른쪽 어깨에 피하 이식하였다. 그 후, 상기 마우스를 40∼60일간 사육하였다.
LNCaP 또는 PC-3 종양 이식 마우스에 [111In]In-PSMA-DA1, 또는 [111In]In-PSMA-DB의 생리 식염수 용액(185kBq, 100μL)을 미정맥으로부터 투여하였다(각 n=3). 투여 1, 4, 24, 48, 96, 및 192시간 후에 마우스를 안락사시켰다. 그 후, 혈액 및 각 장기를 회수하고, 장기의 질량 및 방사능을 측정하였다.
투여 방사능량(injected dose)에 대한 방사능량의 백분율(%ID)을 혈액 질량 또는 장기 질량(g)으로 나눈 값(%ID/g)으로서 나타낸다. %ID/g의 값이 높을수록 방사성 표지 화합물의 존재량이 많아, 상기 화합물의 표적 장기에의 집적이 높은 것을 나타낸다.
LNCaP 종양 이식 마우스 및 [111In]In-PSMA-DA1에 있어서의 결과(평균±표준 편차, 각 n=3)를 이하의 표 1 및 도 3에 나타낸다.
LNCaP 종양 이식 마우스 및 [111In]In-PSMA-DB에 있어서의 결과(평균±표준 편차, 각 n=3)를 이하의 표 2 및 도 3에 나타낸다.
[111In]In-PSMA-DA1은 LNCaP 종양에의 높은 집적을 나타냈다(투여 1∼24시간 후에 9.41∼12.6%ID/g). 또한, 혈액에서의 체류성을 나타내고(투여 24시간 후에 14.0%ID/g), 종양/신장비는 투여 48시간 후 이후에서 1을 상회하였다. 한편, [111In]In-PSMA-DB는 어느 타임 포인트에 있어서도, [111In]In-PSMA-DA1보다 낮은 종양 집적이 확인됨과 아울러, 낮은 종양/신장비가 나타났다.
이들 결과로부터, [111In]In-PSMA-DA1은 PSMA 고발현 종양에 대한 높은 집적성을 가짐과 아울러, [111In]In-PSMA-DB와 비교하여 뛰어난 체내 분포를 갖는 것이 명확해졌다.
[표 1]
[표 2]
PC-3 종양 이식 마우스 및 [111In]In-PSMA-DA1에 있어서의 결과(평균±표준 편차, 각 n=3)를 이하의 표 3에 나타낸다.
PC-3 종양 이식 마우스 및 [111In]In-PSMA-DB에 있어서의 결과(평균±표준 편차, 각 n=3)를 이하의 표 4에 나타낸다.
[111In]In-PSMA-DA1 및 [111In]In-PSMA-DB 모두, PC-3 종양에의 집적은 동타임 포인트에 있어서의 LNCaP 종양에의 집적의 결과보다 낮은 것이며, 양방사성 표지 화합물이 PSMA 양성 종양에 선택적으로 집적하는 것이 나타났다.
[표3]
[표4]
<LNCaP 종양 이식 마우스를 사용한 SPECT/CT>
상술한 방법으로 제작한 LNCaP 종양 이식 마우스에, [111In]In-PSMA-DA1 또는 [111In]In-PSMA-DB의 생리 식염수 용액(1.9∼3.0MBq, 150μL)을 미정맥으로부터 투여하였다. 투여 24시간 및 48시간 후에 Gamma Medica-Ideas사제 FX3300 pre-clinical imaging system으로 SPECT/CT를 행하였다. 이소플루란 마취하, 회전 반경 35mm, 투영 시간 70초, 투영 회수 32회로 직경 1.0mm의 핀홀 콜리메이터를 사용하여 촬상하였다. SPECT 후, CT(관전압: 60kV, 관전류: 350μA)를 행하였다. SPECT의 투영 데이터에 대해 3차원 ordered subset expectation maximization법(8subsets, 5iterations)에 의한 화상 재구성을 행하였다.
SPECT/CT의 결과를 도 4에 나타낸다. 동도면 중, 화살표로 나타내는 부분이 종양의 존재 위치이며, 동그라미 표시로 나타내는 부분이 신장의 존재 위치이다. SUV가 높을수록 방사능 집적이 높다.
[111In]In-PSMA-DA1을 사용한 SPECT/CT 촬상에서는 투여 24시간 및 48시간 후에 있어서 LNCaP 종양(도면중 화살표)에 현저한 방사능 집적이 확인되었다. 신장(도면 중 원)에도 높은 방사능 집적이 확인되었지만, 투여 48시간 후에는 종양과 같은 정도의 방사능 시그널이었다. 한편, [111In]In-PSMA-DB를 사용한 SPECT/CT 촬상에 있어서도 LNCaP 종양(도면 중 화살표)에 방사능 집적이 확인되었지만, 그 집적은 신장(도면 중 원)과 비교하여 낮았다.
이들 결과로부터, [111In]In-PSMA-DA1은 PSMA 고발현 종양을 SPECT에 의해 명료하게 묘출하는 것이 가능함과 아울러, [111In]In-PSMA-DB보다도 뛰어난 것이 나타났다.
<90Y 표지 화합물에 의한 종양 증대 억제의 평가>
상술한 방법으로 얻어진 [90Y]Y-PSMA-DA1(3.7MBq) 또는 [90Y]Y-PSMA-DB(3.7MBq)의 생리 식염수 용액(100μL)을 LNCaP 종양 이식 마우스에 미정맥으로부터 투여하였다(n=7). 대조군으로서, 100μL의 생리 식염수를 LNCaP 종양 이식 마우스에 미정맥으로부터 투여하였다(n=7).
90Y 표지 화합물을 투여 후, 종양 용적 및 체중을 1주일당 3회 측정하였다. 종양 용적은 「(종양 용적)=[(장변)×(단변)2/2]」의 산출식에 근거하여 산출하였다.
90Y 표지 화합물의 투여 개시일에 있어서의 종양 용적은 [90Y]Y-PSMA-DA1, [90Y]Y-PSMA-DB, 및 생리 식염수 투여군에 있어서, 각각 63.1±8.7, 66.1±30.7, 및 66.7±25.7mm3였다.
본 평가의 결과를 도 5에 나타낸다.
LNCaP 종양 이식 마우스에 [90Y]Y-PSMA-DA1 및 [90Y]Y-PSMA-DB를 투여한 결과, 생리 식염수 투여군과 비교하여, 각각 투여 9일 후 및 33일 후 이후에 종양 용적에 유의한 차가 확인되었다. [90Y]Y-PSMA-DB와 비교하여, [90Y]Y-PSMA-DA1은 종양 성장을 억제하는 경향이 관찰되었다. [90Y]Y-PSMA-DA1의 투여에 의해 마우스의 체중이 조금 감소했지만, 그 후, 생리 식염수 투여군과 동등한 값까지 회복하였다.
<225Ac 표지 화합물에 의한 종양 증대 억제의 평가>
상술한 방법으로 얻어진 [225Ac]Ac-PSMA-DA1(20kBq) 또는 [225Ac]Ac-PSMA-DB(20kBq)를 5% 에탄올 함유 아세트산 완충액(158mM, pH 6.5, 100μL)에 용해시켜, LNCaP 종양 이식 마우스에 미정맥으로부터 투여하였다(n=6 또는 5). 대조군으로서, 100μL의 5% 에탄올 함유 아세트산 완충액(158mM, pH 6.5)을 LNCaP 종양 이식 마우스에 미정맥으로부터 투여하였다(n=4).
225Ac 표지 화합물을 투여 후, 종양 용적 및 체중을 1주일당 2회 측정하였다. 225Ac 표지 화합물 투여 개시일에 있어서의 종양 용적은 [225Ac]Ac-PSMA-DA1, [225Ac]Ac-PSMA-DB, 및 5% 에탄올 함유 아세트산 완충액 투여군에 있어서, 각각 75.3±26.0, 80.6±20.8, 및 91.1±15.9mm3였다.
본 평가의 결과를 도 6에 나타낸다.
LNCaP 종양 이식 마우스에 [225Ac]Ac-PSMA-DA1 및 [225Ac]Ac-PSMA-DB를 투여한 결과, 생리 식염수 투여군과 비교하여 종양 성장이 현저하게 억제되었다. 특히 [225Ac]Ac-PSMA-DA1 투여군에서는 종양은 거의 성장하지 않고, 투여 후 6주일까지 계속적인 성장 억제가 확인되었다.
[225Ac]Ac-PSMA-DA1의 투여의 영향이라고 생각되는 체중의 감소는 일과성의 것이었다. [225Ac]Ac-PSMA-DB의 투여의 영향이라고 생각되는 체중의 감소는 일시적으로 가속되었지만, 그 후 회복하는 모양은 확인되지 않았다.
〔실시예 2〕
본 실시예에서는 PSMA를 표적 분자로 하는 (((S)-5-아미노-1-카르복시펜틸)카르바모일)-L-글루탐산(상기 식(C1) 중, a가 2, b가 4인 구조)을 PSMA 분자와의 결합부로서 구조 중에 포함하고, 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부의 결합에, 아지드기와 디벤질시클로옥틴(DBCO)의 클릭 반응을 사용한 화합물(PtDA)을 합성하였다. 그 다음에, 이들 화합물에 방사성 금속으로서 111In 이온을 배위시킨 방사성 표지 화합물을 각각 얻었다. 합성 경로의 개략을 합성 경로(VIII-1)∼(VIII-4)로서 이하에 나타낸다.
실시예 2에서 사용한 화합물은 구조 중에 킬레이트부, PSMA 분자와의 결합부 및 알부민 결합부를 포함하는 것이다. 111In 이온에 배위시키는 데에 있어 2개의 합성 경로(합성 경로(VIII-4) 참조)가 있는데, 어느 경로여도, 얻어지는 방사성 표지 화합물은 동일하다.
PtDA는 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부가, 클릭 반응 유래의 화학 구조와 폴리에틸렌글리콜기를 개재하여 간접적으로 결합하고 있고, 또한, 킬레이트부와 알부민 결합부를 포함하는 원자단은 리신 유래의 링커 구조를 개재하여 간접적으로 결합하고 있다.
<화합물 71의 합성>
N2-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N6-[(4-메틸페닐)디페닐메틸]-L-리신(1000mg, 1.6mmol)을 디클로로메탄(10mL)에 용해시켜, tert-부틸트리클로로아세티미데이트(699.5mg, 3.2mmol)와 BF3·OEt2(25μL)를 더하였다. 반응 용액을 실온에서 42시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 H2O(100mL)로 씻고, 아세트산에틸/헥산(1/5, 100mL×2)으로 추출하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(아세트산에틸/헥산). 수량, NMR 스펙트럼 및 MS는 이하와 같았다.
수량: 569mg(수율: 52%, N2-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N6-[(4-메틸페닐)디페닐메틸]-L-리신의 물질량에 대한 얻어진 화합물 71의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.69(d, J=7.3Hz, 2H), 7.56(d, J=7.8Hz, 2H), 7.45(d, J=7.8Hz, 4H), 7.33(d, J=8.2Hz, 4H), 7.23(m, 6H), 7.13(m, 2H), 7.04(d, J=7.8Hz, 2H), 5.39(d, J=8.2Hz, 1H), 4.35(d, J=6.9Hz, 2H), 4.25(m, 1H), 4.18(t, J=6.9Hz, 1H), 2.26(s, 3H), 2.12(m, 2H), 1.77(m, 1H), 1.59(m, 1H), 1.49(m, 4H), 1.44(s, 9H). 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δ171.6, 155.7, 146.3(2C), 143.7(2C), 143.2,141.1(2C), 135.4, 128.4-128.3(8C), 127.6-127.5(6C), 126.9(2C), 126.0(2C), 125.0(2C), 119.8(2C), 81.7, 70.5, 66.7, 60.2,47.1, 43.2, 32.7, 30.4, 27.8(3C), 22.8, 20.7.
HRMS(ESI): m/z681.3677 [M+H]+.
<화합물 72의 합성>
화합물 71(569mg, 0.84mmol)을 트리플루오로아세트산(TFA)(100μL), 트리이소프로필실란(250μL), 디클로로메탄(4.65mL)의 혼합액에 용해시켜, 실온에서 6시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름). 수량, NMR 스펙트럼 및 MS는 이하와 같았다.
수량: 355mg(수율: 100%, 화합물 71의 물질량에 대한 얻어진 화합물 72의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.71(d, J=7.6Hz, 2H), 7.56(d, J=7.1Hz, 2H), 7.35(t, J=7.6Hz, 2H), 7.27(t, J=7.6Hz, 2H), 5.72(d, J=8.0Hz, 1H), 4.33(d, J=7.1Hz, 2H), 4.16(t, J=6.6Hz, 2H), 3.38(s, 2H), 1.77-1.56(m, 4H), 1.43(s, 9H), 1.27-1.13(m, 2H). 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δ171.5, 156.2,143.6(2C), 141.1(2C), 127.6(2C), 127.0(2C), 125.0(2C), 119.8(2C), 82.3, 66.9, 54.1,50.0, 46.9, 39.5, 31.1, 27.7(3C), 26.8, 22.1.
HRMS(ESI): m/z425.2437 [M+H]+.
<화합물 73의 합성>
4-(4-요오드페닐)부탄산(364mg, 1.25mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(3mL)에 용해시켜, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 염산염(320mg, 1.7mmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)(228mg, 1.7mmol)을 더하여 0℃에서 15분간 교반하였다. 그 후, 화합물 72(355mg, 0.84mmol)와 트리에틸아민(169mg, 1.7mmol)을 더하고, 0℃에서 교반하였다. 15시간 후, 반응 용액을 H2O(100mL)로 씻고, 아세트산에틸/헥산(1/5, 100mL×2)로 추출하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(아세트산에틸/헥산). 수량, NMR 스펙트럼 및 MS는 이하와 같았다.
수량: 226mg(수율: 39%, 화합물 72의 물질량에 대한 얻어진 화합물 73의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.73(d, J=7.3Hz, 2H), 7.60-7.50(m, 6H), 7.37(t, J=7.3Hz, 2H), 7.28(t, J=7.3Hz, 2H), 6.83(d, J=8.2Hz, 2H), 4.38-4.27(m, 2H), 4.25-4.16(m, 2H), 3.21-3.14(m, 2H), 2.48(m, 2H), 2.08(t, J=7.3Hz, 2H), 1.91-1.84(m, 2H), 1.73-1.57(m, 2H), 1.47-1.29(m, 13H). 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δ172.8, 171.5, 156.0, 143.5(2C), 141.0-140.9(3C), 137.1(2C), 130.3(2C), 127.5(2C), 126.9(2C), 124.9(2C), 119.8(2C), 90.8, 82.0, 66.8, 53.9, 46.9, 38.9, 35.4, 34.4, 32.1, 28.6, 27.9(3C), 26.7, 22.2.
HRMS(ESI): m/z697.2130 [M+H]+.
<화합물 74의 합성>
화합물 73의 DMF(4mL) 용액에 피페리딘(1mL)을 더하였다. 실온에서 2시간 교반 후, 용액을 H2O(100mL)로 씻고, 아세트산에틸/헥산(1/5, 100mL×2)로 추출하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름). 수량, NMR 스펙트럼 및 MS는 이하와 같았다.
수량: 133mg(수율: 87%, 화합물 73의 물질량에 대한 얻어진 화합물 74의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.58(d, J=8.2Hz, 2H), 6.92(d, J=8.2Hz, 2H), 3.31-3.27(m, 1H), 3.23(m, 2H), 2.58(m, 2H), 2.13(m, 2H), 1.96-1.88(m, 2H), 1.74-1.65(m, 2H), 1.56-1.48(m, 2H), 1.44(s, 9H), 1.43-1.40(m, 2H). 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δ175.2,172.3, 141.1, 137.3(2C), 130.5(2C), 90.9, 80.9, 54.7, 39.1, 35.6, 34.6, 34.3, 29.2, 28.0(3C), 26.8, 22.9.
HRMS(ESI): m/z475.1453 [M+H]+.
<화합물 75의 합성>
상술한 실시예와 마찬가지로, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸으로부터 3단계로 합성하였다(Chem Commun. 2008, 28, 3248-3250).
<화합물 76의 합성>
화합물 75(317mg, 0.41mmol)의 DMF(2mL) 용액에 N-[1-(시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노(모르폴리노)]우로늄헥사플루오로포스페이트(COMU)(176mg, 0.41mmol)를 더하고, 0℃에서 15분간 교반하였다. 반응액에 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(53mg, 0.41mmol)을 더하여, 0℃에서 15분간 더 교반한 후, 화합물 74(163mg, 0.34mmol)를 더하였다. 실온에서 12시간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다. 수량 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(20×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [30/70/0.1(0분)∼90/10/0.1(40분)], 유속: 5mL/min.
수량: 229mg(수율: 55%, 화합물 75의 물질량에 대한 얻어진 화합물 76의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z1229.6182 [M+H]+.
<화합물 77의 합성>
화합물 76(106mg, 0.086mmol)의 DMF(0.6mL) 용액에 COMU(147mg, 0.34mmol)를 더하여, 0℃에서 15분간 교반하였다. 반응액에 DIPEA(89mg, 0.69mmol)를 더하고, 0℃에서 15분간 더 교반한 후, 디벤조시클로옥틴아민(ADIBO-NH2)(36mg, 0.22mmol)을 더하였다. 실온에서 12시간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다. 수량 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(20×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [20/80/0.1(0분)∼90/10/0.1(35분)], 유속: 5mL/min.
수량: 51mg(수율: 40%, 화합물 76의 물질량에 대한 얻어진 화합물 77의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI): m/z1487.7351 [M+H]+.
<화합물 78(ADA)의 합성>
화합물 76(50mg, 0.041mmol)의 MeCN(0.4mL) 용액에 COMU(70mg, 0.16mmol)를 더하고, 0℃에서 15분간 교반하였다. 반응액에 DIPEA(89mg, 0.69mmol)를 더하고, 0℃에서 15분간 더 교반한 후, N-히드록시숙신이미드(19mg, 0.16mmol)를 더하였다. 실온에서 24시간 교반 후, 용액을 H2O(100mL)로 씻고, 아세트산에틸/헥산(1/5, 100mL×2)으로 추출하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사의 절반량을 TFA/티오아니솔/트리이소프로필실란 혼합액(95/3/2, 2mL)에 용해시켜, 실온에서 11시간 교반하였다. 용매를 제거 후, 잔사를 DMF(0.4mL)와 트리에틸아민(10μL)에 용해시켜, ADIBO-NH2(6.2mg, 0.023mmol)를 더하였다. 반응액을 실온에서 24시간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다. 수량 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼90/10/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
수량: 6.7mg(수율: 27%, 화합물 76의 물질량에 대한 얻어진 화합물 78의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI): m/z1207.4213 [M+H]+.
<화합물 7A의 합성>
(S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트(31mg, 0.064mmol)를 DMF(0.5mL)에 용해시켜, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트1(25mg, 0.064mmol)을 더하였다. 실온에서 12시간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다. 수량, NMR 스펙트럼 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(10×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [30/70/0.1(0분)∼90/10/0.1(30분)], 유속: 4mL/min.
수량: 35mg(수율: 72%, (S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트의 물질량에 대한 얻어진 화합물 7A의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ4.26-4.23(m, 2H), 3.75(t, J=5.2Hz, 2H), 3.69-3.61(m, 14H), 3.41(t, J=5.2Hz, 2H), 3.38-3.16(m, 2H), 2.59(t, J=5.2Hz, 2H), 2.34(dt, J=2.3,7.5Hz, 2H), 2.11-1.60(m, 4H), 1.54(t, J=7.0Hz, 2H), 1.48-1.40(m, 27H), 1.39-1.26(m, 2H). 13C-NMR(100MHz, CDCl3) δ174.3(2C), 172.8(2C), 158.4, 82.7, 82.4, 81.2, 70.4(2C), 70.3,70.1, 70.0(2C), 69.9, 66.8, 53.7, 53.3, 50.5, 39.2, 35.8, 31.5, 31.3, 28.2, 27.9(3C), 27.8(7C), 21.9.
HRMS(ESI): m/z761.4656 [M+H]+.
<화합물 7B의 합성>
화합물 7A(23mg, 0.030mmol)를 TFA(950μL)와 트리이소프로필실란(50μL)에 용해시켜, 실온에서 4시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다. 수량, NMR 스펙트럼 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(10×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼40/60/0.1(30분)], 유속: 4mL/min.
수량: 11mg(수율: 63%, 화합물 7A의 물질량에 대한 얻어진 화합물 7B의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.52(s, 1H), 6.37(s, 2H), 4.39(s, 1H), 4.31(s, 1H), 3.66(m, 16H), 3.40(s, 2H), 2.53-1.23(m, 14H).
HRMS(ESI): 593.2779 [M+H]+.
<화합물 7C(PtDA)의 합성>
화합물 77(20mg, 0.013mmol)을 DMF(0.6mL)에 용해시켜, 화합물 7A(35mg, 0.046mmol)를 더하였다. 실온에서 12시간 교반 후, 용매를 제거하였다. 잔사에 TFA(1.9mL), 티오아니솔(60μL), 트리이소프로필실란(20μL), 및 H2O(20μL)를 더하고, 실온에서 10시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다. 수량 및 MS는 이하와 같았다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼90/10/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
수량: 1.0mg(수율: 4.2%, 화합물 77의 물질량에 대한 얻어진 화합물 7C(PtDA)의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI): m/z900.3488 [M+2H]2+.
<루트 A에 의한 [111In]In-ADA의 합성>
2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액(0.1M, pH 5.7, 100μL)에 [111In]InCl3 용액(9.2MBq, 100μL)과 화합물 78의 디메틸술폭시드(DMSO) 용액(0.60mM, 7μL)을 더하고, 90℃에서 5분간 정치하였다. 그 후, 반응 용액을 역상 HPLC에 의해 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼70/30/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 측정에 사용한 HPLC 조건은 상기 정제 조건과 마찬가지로 하였다.
방사 화학적 전환율([111In]InCl3의 방사능에 대한 [111In]In-ADA의 방사능의 비율) 및 방사 화학적 수율을 이하의 표 5에 나타낸다.
<루트 A에 의한 [111In]In-PtDA의 합성>
인산 완충 생리 식염수(PBS)/DMSO 혼합액(9/1, 200μL) 또는 DMSO(200μL)에 [111In]In-ADA(0.80MBq)를 더하고, 화합물 7B(0, 2mg)을 추가로 더하였다. 37℃에서 10분간 또는 30분간 정치 후, 반응 용액을 역상 HPLC에 의해 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼70/30/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 측정에 사용한 HPLC 조건은 상기 정제 조건과 마찬가지로 하였다.
방사 화학적 전환율([111In]In-ADA의 방사능에 대한 [111In]In-PtDA의 방사능의 비율) 및 방사 화학적 수율을 이하의 표 5에 나타낸다.
<루트 B에 의한 [111In]In-PtDA의 합성>
MES 완충액(0.1M, pH 5.7, 150μL)에 [111In]InCl3 용액(2.1MBq, 100μL)과 화합물 7C의 DMSO 용액(0.56mM, 2μL)을 더하고, 90℃에서 5분간 정치하였다. 그 후, 반응 용액을 역상 HPLC에 의해 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼70/30/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 측정에 사용한 HPLC 조건은 상기 정제 조건과 마찬가지로 하였다.
방사 화학적 순도([111In]InCl3의 방사능에 대한 [111In]In-PtDA의 방사능의 비율) 및 방사 화학적 수율을 이하의 표 5에 나타낸다.
[표 5]
한편, 비방사성의 In을 배위시킨 In-ADA 및 In-PtDA는 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 얻어진 In 착체는 방사성 표지 화합물의 HPLC 유지 시간의 동정에 사용하였다.
<비방사성 In-ADA의 합성>
화합물 78(1등량)을 아세트산 완충액(1.0M, pH 5.0, 100μL)에 용해시켜, 염화인듐(III) 무수화물(10등량)을 더하였다. 반응액을 90℃에서 5분간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/30.1(0분)∼90/10/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
MS(ESI): m/z1319.3 [M+H]+.
<비방사성 In-PtDA의 합성>
화합물 7C(0.5mg, 1.25mmol)의 H2O/MeCN/TFA(49.95/49.95/0.1, 300μL) 용액에 염화인듐(III) 무수화물(0.62mg, 2.8㎛ol)을 더하였다. 실온에서 18시간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼90/10/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
수량: 0.05mg(수율: 9.4%, 화합물 7C의 물질량에 대한 얻어진 비방사성 In-PtDA의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI): m/z956.2893 [M+2H]2+.
<분배 계수의 평가>
PBS(pH 7.4, 3mL) 및 1-옥탄올(3mL)의 혼합액에 [111In]In-PtDA(111kBq)를 더하고, 2분간 보텍스에 의한 분산을 행한 후, 4000×g으로 5분간 원심 분리하였다. 1-옥탄올층 및 PBS층으로부터 1mL씩 회수하고, 각 층의 방사능을 감마 카운터로 측정하였다(n=3).
계산식은 「(분배 계수)=Log10 [(1-옥탄올층의 방사능[kBq])/(PBS층의 방사능[kBq])]」을 사용하였다.
그 결과, [111In]In-PtDA의 LogP는 「-3.08±0.02」였다.
<혈장 중 안정성 평가의 평가>
마우스 혈장(200μL)에 [111In]In-PtDA(259kBq)의 생리 식염수(20μL) 용액을 더하고, 37℃에서 24시간 정치하였다(n=3). MeCN(400μL)을 더하고, 10000×g으로 5분간 원심하였다. 상청을 여과하고, 여과액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 분석하였다.
분석 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼70/30/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, [111In]In-PtDA는 마우스 혈장 중 37℃에서 24시간 정치 후에도 95% 이상이 안정적으로 존재하였다.
<배양 세포주를 사용한 결합 평가>
상술한 실시예 1-1과 마찬가지로, LNCaP 세포 및 PC-3 세포를 배양하고, 세포 결합 실험을 행하였다. [111In]In-PtDA(37kBq)를 포함하는 0.5% FBS 함유 RPMI1640 배지(1mL)를 사용한 것 이외에는 실시예 1-1과 마찬가지의 실험 순서 및 통계 수법으로 평가를 행하였다.
결과를 도 8에 나타낸다.
[111In]In-PtDA는 PC-3 세포(0.15% ID/mg protein)과 비교하여 LNCaP 세포(15% ID/mg protein)에 대한 높은 결합성을 나타내고, 그 결합은 과잉량의 PSMA 저해제(2-PMPA)의 첨가에 의해 유의하게 저감하였다(0.36% ID/mg protein). 이들 결과로부터 [111In]In-PtDA는 PSMA 양성 세포에 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
<알부민에의 결합 평가>
상술한 실시예 1-1과 마찬가지로, PBS, 마우스 혈장, 인간 혈장 및 인간 알부민을 사용하여, 알부민에의 결합 평가를 행하였다. [111In]In-PtDA의 PBS 용액(37kBq, 50μL)을 사용한 것 이외에는 실시예 1-1과 마찬가지의 실험 순서 및 통계 수법으로 평가를 행하였다.
결과를 도 9에 나타낸다.
[111In]In-PtDA를 PBS 중에서 정치 후, 칼럼에 부여한 결과, 용출액에 있어서 방사능이 그다지 검출되지 않았다(6.9%). 한편, 마우스 혈장, 인간 혈장, 및 인간 알부민 용액 중에서 정치했을 때에는 용출액에 높은 방사능이 관측되어(각각 67.2, 79.0, 및 92.4%), [111In]In-PtDA가 혈장 알부민에 결합하는 것이 나타났다.
<LNCaP 종양 이식 마우스를 사용한 체내 방사능 분포 평가>
실시예 1-1과 마찬가지의 방법으로 제작한 LNCaP 종양 이식 마우스에, [111In]In-PtDA의 생리 식염수 용액(241kBq/100μL)을 미정맥으로부터 투여하고(n=3), 투여 1, 24, 및 48시간 후에 마우스를 안락사시켰다. 그 후, 혈액 및 각 장기를 회수하고, 장기의 질량 및 방사능을 측정하였다.
투여 방사능량(injected dose)에 대한 방사능량의 백분율(%ID)을 혈액 질량 또는 장기 질량(g)으로 나눈 값(%ID/g)으로서 나타낸다. %ID/g의 값이 높을수록, 방사성 표지 화합물의 존재량이 많아, 상기 화합물의 표적 장기에의 집적이 높은 것을 나타낸다.
LNCaP 종양 이식 마우스 및 [111In]In-PtDA에 있어서의 결과(평균±표준 편차, 각 n=3)를 이하의 표 6에 나타낸다.
[111In]In-PtDA는 LNCaP 종양에의 높은 집적을 나타내(투여 24 및 48시간 후에 각각 16.0 및 18.7%ID/g), 혈액에서의 체류성을 나타냈다(투여 1∼48시간 후에 6.33∼19.8%ID/g). 또한, 투여 1시간 후에 있어서의 신장 집적은 37.2%ID/g로, 이미 알려진 PSMA를 표적 분자로 한 방사성 표지 화합물인 [111In]In-PSMA-I&T(신장: 191%ID/g), 및 [68Ga]Ga-PSMA-11(신장: 139%ID/g) 보다 현저하게 낮았다(예를 들면, EJNMMI Res, 2012, 2, 23, J Nucl Med, 2017, 58, 235-242).
[표 6]
<종양 이식 마우스를 사용한 SPECT/CT 평가>
실시예 1-1과 마찬가지의 방법으로 사육한 웅성 CB17/IcrJcl-Prkdcscid 마우스에, PBS와 Matrigel의 혼합액(1:1, 150μL)에 LNCaP 세포(1.0×107cells/mouse)를 현탁시키고, 이소플루란 마취하, 마우스의 오른쪽 어깨에 피하 이식하였다. 이에 더하여, 동일한 마우스에, PBS와 Matrigel의 혼합액(1:1, 150μL)에 PC-3 세포(1.0×107cells/mouse)를 현탁시킨 것을 이소플루란 마취하, 마우스의 왼쪽 어깨에 피하 이식하였다. 그 후, 상기 마우스를 40∼60일간 사육하였다. 이렇게 하여, 1마리의 마우스에 LNCaP 세포와 PC-3 세포가 동시에 이식된 종양 이식 마우스를 얻었다.
그 다음에, 이 종양 이식 마우스에 [111In]In-PtDA의 생리 식염수 용액(2.7MBq, 100μL)을 미정맥으로부터 투여하였다. 투여 24 및 48시간 후에 Gamma Medica-Ideas사제 FX3300 pre-clinical imaging system으로 SPECT/CT를 행하였다. 이소플루란 마취하, 회전 반경 35mm, 투영 시간 70초, 투영 회수 32회로 직경 1.0mm의 핀홀 콜리메이터를 사용하여 촬상하였다. SPECT 후, CT(관전압: 60kV, 관전류: 350μA)를 행하였다. SPECT의 투영 데이터에 대해 3차원 ordered subset expectation maximization법(8subsets, 5iterations)에 의한 화상 재구성을 행하였다.
SPECT/CT의 결과를 도 10에 나타낸다. SUV가 높을수록 방사능 집적이 높다.
[111In]In-PtDA를 사용한 SPECT/CT 촬상에서는 투여 24 및 48시간 후에 있어서, LNCaP 종양에 높은 방사능 집적이 확인되었지만, PC-3 종양으로부터는 거의 방사능 시그널이 확인되지 않았다. 이 결과로부터, [111In]In-PtDA는 PSMA 양성 종양의 명료한 묘출이 가능한 것이 나타났다.
〔실시예 3-1∼3-3, 및 비교예 2-1∼2-2〕
본 실시예에서는 PSMA를 표적 분자로 하는 화합물을 합성하였다. 그 다음에, 각 화합물에 방사성 금속으로서 111In 이온을 배위시킨 방사성 표지 화합물을 얻었다. 합성 경로의 개략을 합성 경로(X-1)∼(X-3)로서 이하에 나타낸다.
실시예 3-1∼3-3에서 사용한 화합물(Octapa-2, Octapa-3 및 Neunpa-2)은 상기 일반식(2)으로 나타내는 바와 같이, 킬레이트부, PSMA 분자와의 결합부 및 알부민 결합부가 각각, 링커 구조를 개재하여 분기상으로 결합한 화학 구조를 갖는 것이다.
비교예 2-1 및 2-2에서 사용한 화합물(Octapa-1 및 Neunpa-1)은 킬레이트부 및 PSMA 분자와의 결합부를 갖지만, 알부민 결합부를 구조 중에 갖지 않는 것이었다.
<화합물 101의 합성>
L-페닐알라닌아미드(985mg, 6.0mmol)을 테트라히드로푸란(THF)(20mL)에 용해시키고, LiAlH4(1139mg, 30mmol)의 THF(10mL) 용액을 0℃에서 천천히 더하였다. 반응액을 60℃에서 24시간 교반 후, H2O(1.2mL), 15% 수산화나트륨 수용액(1.2mL), 및 H2O(3.6mL)를 순서대로 더하였다. 실온에서 1시간 교반 후, 셀라이트 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 잔사에 진한 황산(5mL)을 더한 후, 진한 질산(400μL)과 진한 황산(400μL)의 혼합액을 더하였다. 실온에서 5시간 교반 후에 중화하고, 클로로포름(50mL×3)으로 추출하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 830mg(수율: 71%, L-페닐알라닌아미드의 물질량에 대한 얻어진 화합물 101의 물질량으로부터 산출하였다).
MS(ESI)m/z: 196.1 [M+H]+.
<화합물 102의 합성>
기보의 방법에 따라, 화합물 101로부터 3단계로 합성하였다(J Am Chem Soc.2013, 135, 12707-12721, J Chem Soc Dalt Trans.2014, 43,7176-7190).
<화합물 103의 합성>
화합물 102(288mg, 0.36mmol)를 메탄올(5mL)에 용해시키고, 팔라듐탄소(30mg)를 더하였다. 반응액을 수소 분위기하에서 3시간 교반 후, 셀라이트 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 150mg(수율: 54%, 화합물 102의 물질량에 대한 얻어진 화합물 103의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.82(d, J=6.9Hz, 2H), 7.70-7.60(m, 4H), 6.86(d, J=7.6Hz, 2H), 6.54(d, J=7.6Hz, 2H), 4.07(m, 5H), 3.40-3.23(m, 5H), 2.91-2.89(m, 2H), 2.73-2.69(m, 1H), 2.53-2.50(m, 2H), 1.62(s, 18H), 1.40(s, 18H).
MS(ESI)m/z: 806.4 [M+H]+.
<화합물 104의 합성>
기보의 방법에 따라 합성하였다(Bioconjug. Chem. 2017, 28, 2145-2159).
<화합물 105의 합성>
화합물 104(729mg, 1.17mmol)의 MeCN(40mL) 용액에 t-부틸브로모아세트산(396μL, 2.69mmol)과 탄산나트륨(285mg, 2.69mmol)을 더하고, 60℃에서 24시간 교반하였다. 실온으로 되돌린 후, 반응액을 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(헥산/아세트산에틸).
수량: 566mg(수율: 57%, 화합물 104의 물질량에 대한 얻어진 화합물 105의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.14(d, J=8.7Hz, 2H), 8.05-8.02(m, 2H), 7.71-7.67(m, 4H), 7.62-7.58(m, 2H), 7.37(d, J=8.7Hz, 2H), 4.08(s, 4H), 3.41(t, J=7.0Hz, 4H), 2.86-2.77(m, 8H), 1.34(s, 18H).
MS(ESI)m/z: 851.2 [M+H]+.
<화합물 106의 합성>
화합물 105(566mg, 0.67mmol)의 THF(20mL) 용액에 티오페놀(253μL, 1.53mmol)과 탄산칼륨(212mg, 1.53mmol)을 더하고, 50℃에서 50시간 교반하였다. 실온으로 되돌린 후, 반응액을 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 213mg(수율: 66%, 화합물 105의 물질량에 대한 얻어진 화합물 106의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.14(d, J=8.2Hz, 2H), 7.42-7.37(m, 2H), 3.26(s, 4H), 2.91-2.65(m, 12H), 1.47(s, 18H).
MS(ESI)m/z: 481.3 [M+H]+.
<화합물 107의 합성>
화합물 106(213mg, 0.44mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(15mL) 용액에 t-부틸-6-(브로모메틸)피콜리네이트(264mg, 0.97mmol)와 탄산나트륨(103mg, 0.97mmol)을 더하고, 60℃에서 24시간 교반하였다. 실온으로 되돌린 후, 반응액을 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 224mg(수율: 60%, 화합물 106의 물질량에 대한 얻어진 화합물 107의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ8.06(d, J=8.5Hz, 2H), 7.88-7.86(m, 2H), 7.75-7.73(m, 4H), 7.23(d, J=8.7Hz, 2H), 3.99(s, 4H), 3.30(s, 4H), 2.74-2.63(m, 12H), 1.62(s, 18H), 1.45(s, 18H).
MS(ESI)m/z: 863.5 [M+H]+.
<화합물 108의 합성>
화합물 103의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 107로부터 50.7mg(수율 23%, 화합물 107의 물질량에 대한 얻어진 화합물 108의 물질량으로부터 산출하였다)의 화합물 108을 얻었다.
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.86(d, J=7.1Hz, 2H), 7.78-7.72(m, 4H), 6.85(d, J=8.2, 2H), 6.56(d, J=8.2, 2H), 4.00(s, 4H), 3.32(s, 4H), 2.76-2.55(m, 12H), 1.62(s, 18H), 1.44(s, 18H). MS(ESI)m/z:833.4 [M+H]+.
<화합물 109의 합성>
6-(Fmoc-아미노)헥산산(31.1mg, 0.088mmol)의 디클로로메탄(7mL) 용액에 화합물 103(56.6mg, 0.073mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC)염산염(28.8mg, 0.15mmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)(20.4mg, 0.15mmol), 및 트리에틸아민(21μL, 0.15mmol)을 더하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 30.2mg(수율: 37%, 화합물 103의 물질량에 대한 얻어진 화합물 109의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 1111.6170 [M+H]+.
<화합물 110의 합성>
화합물 109의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 108로부터 17.7mg(수율 25%, 화합물 108의 물질량에 대한 얻어진 화합물 110의 물질량으로부터 산출하였다)의 화합물 110을 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 1168.6372 [M+H]+.
<화합물 111의 합성>
화합물 109(30.2mg, 0.027mmol)를 피페리딘(1mL)과 DMF(4mL)의 혼합액에 용해시키고, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸과 H2O를 더한 후, 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사에 THF(5mL)를 더하였다. 무수 숙신산(11mg, 0.11mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(19μL, 0.11mmol)을 더하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 9.7mg(수율: 37%, 화합물 109의 물질량에 대한 얻어진 화합물 111의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 989.5600 [M+H]+.
<화합물 112의 합성>
화합물 111의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 110으로부터 17.7mg(수율 95%)의 화합물 112를 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 1046.6139 [M+H]+.
<화합물 113의 합성>
화합물 111(6.2mg, 6.3㎛ol)의 디클로로메탄(5mL) 용액에 (S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트(6.2mg, 13㎛ol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드헥사플루오로포스페이트(HBTU)(5.0mg, 13㎛ol), 및 DIPEA(10μL, 0.57㎛ol)를 더하고, 실온에서 26시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 4.5mg(수율: 49%, 화합물 111의 물질량에 대한 얻어진 화합물 113의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 729.9404 [M+2H]+.
<화합물 114의 합성>
화합물 112(19.3mg, 0.018mmol)의 디클로로메탄(5mL) 용액에 (S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트(17.6mg, 0.036mmol), EDC 염산염(6.9mg, 0.036mmol), HOAt(4.9mg, 0.036mmol), 및 트리에틸아민(5μL, 0.036mmol)을 더하였다. 반응액을 실온에서 6시간 교반 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 15.6mg(수율: 57%, 화합물 112의 물질량에 대한 얻어진 화합물 114의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 758.4704 [M+2H]+.
<화합물 115(Octapa-1)의 합성>
화합물 113(11.4mg, 7.8㎛ol)을 트리플루오로아세트산(TFA)/H2O/트리이소프로필실란의 혼합액(95/2.5/2.5, 2mL)에 용해시켜, 실온에서 3시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼30/70/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
수량: 2.2mg(수율: 27%, 화합물 113의 물질량에 대한 얻어진 화합물 115의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 1066.4325 [M+H]+.
[0237]
<화합물 116(Neunpa-1)의 합성>
화합물 115의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 114로부터 1.8mg(수율 43%)의 화합물 116을 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 1123.4924 [M+H]+.
<화합물 117의 합성>
N2-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N6-[(4-메틸페닐)디페닐메틸]-L-리신(40.9mg, 0.065mmol)의 디클로로메탄(5mL) 용액에 화합물 103(42.3mg, 0.055mmol), EDC 염산염(21.1mg, 0.11mmol), HOAt(15.0mg, 0.11mmol), 및 트리에틸아민(15μL, 0.11mmol)을 더하였다. 반응액을 실온에서 3시간 교반 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 69.3mg(수율: 91%, N2-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N6-[(4-메틸페닐)디페닐메틸]-L-리신의 물질량에 대한 얻어진 화합물 117의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 1382.7418 [M+H]+.
<화합물 118의 합성>
화합물 117의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 108로부터 123mg(수율 77%, 화합물 108의 물질량에 대한 얻어진 화합물 118의 물질량으로부터 산출하였다)의 화합물 118을 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 1439.8029 [M+H]+.
<화합물 119의 합성>
화합물 117(115mg, 0.083mmol)을 피페리딘(1mL)과 DMF(4mL)의 혼합액에 용해시켜, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸과 H2O를 더한 후, 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 디클로로메탄(5mL)에 용해시켜, 4-(4-요오드페닐)부탄산(49.3mg, 0.17mmol), EDC 염산염(32.6mg, 0.17mmol), HOAt(23.1mg, 0.17mmol), 및 트리에틸아민(20μL, 0.17mmol)을 더하였다. 반응액을 실온에서 7시간 교반 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 62.4mg(수율: 52%, 화합물 117의 물질량에 대한 얻어진 화합물 119의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 1432.6529 [M+H]+.
<화합물 120의 합성>
화합물 119의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 118로부터 84.2mg(수율 66%, 화합물 118의 물질량에 대한 얻어진 화합물 120의 물질량으로부터 산출하였다)의 화합물 120을 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 1489.7260 [M+H]+.
<화합물 121의 합성>
화합물 119(62.4mg, 0.044mmol)를 1% TFA 함유 디클로로메탄(5mL)에 용해시켜, 실온에서 2시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 THF(5mL)에 용해시켜, 무수 숙신산(8.1mg, 0.088mmol)과 DIPEA(15μL, 0.088mmol)를 더하였다. 용액을 실온에서 4시간 교반한 후, 용매를 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 65mg(수율: 100%, 화합물 119의 물질량에 대한 얻어진 화합물 121의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 1276.5478 [M+H]+.
<화합물 122의 합성>
화합물 121의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 120으로부터 39.1mg(수율 35%, 화합물 120의 물질량에 대한 얻어진 화합물 122의 물질량으로부터 산출하였다)의 화합물 122를 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 1333.5464 [M+H]+.
<화합물 123의 합성>
화합물 121(65mg, 0.051mmol)의 디클로로메탄(5mL) 용액에 (S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트(37.3mg, 0.077mmol), EDC 염산염(19.2mg, 0.10mmol), HOAt(13.6mg, 0.10mmol), 및 트리에틸아민(15μL, 0.10mmol)을 더하였다. 반응액을 실온에서 5시간 교반 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 54.3mg(수율: 61%, 화합물 121의 물질량에 대한 얻어진 화합물 123의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 873.4248 [M+2H]+.
<화합물 124의 합성>
화합물 123의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 122로부터 22.3mg(수율 25%, 화합물 122의 물질량에 대한 얻어진 화합물 124의 물질량으로부터 산출하였다)의 화합물 124를 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 902.4312 [M+2H]+.
<화합물 125(Octapa-2)의 합성>
화합물 123(9.6mg, 6.6㎛ol)을 TFA/H2O/트리이소프로필실란의 혼합액(95/2.5/2.5, 1mL)에 용해시켜, 실온에서 2시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [20/80/0.1(0분)∼50/50/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
수량: 1.3mg(수율: 17%, 화합물 123의 물질량에 대한 얻어진 화합물 125의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 677.2144 [M+2H]+.
<화합물 126(Neunpa-2)의 합성>
화합물 125의 합성과 마찬가지의 반응을 행하고, 화합물 124로부터 2.0mg(수율 47%, 화합물 124의 물질량에 대한 얻어진 화합물 126의 물질량으로부터 산출하였다)의 화합물 126을 얻었다.
HRMS(ESI)m/z: 705.74021 [M+2H]+.
<화합물 127의 합성>
N2-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N6-[(4-메틸페닐)디페닐메틸]-L-리신(625mg, 1.0mmol)의 디클로로메탄(20mL) 용액에 tert-부틸트리클로로아세티미데이트(437mg, 2.0mmol)와 BF3·OEt2(20μL, 0.16mmol)를 더하였다. 반응액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(헥산/아세트산에틸).
수량: 322mg(수율: 47%, N2-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N6-[(4-메틸페닐)디페닐메틸]-L-리신의 물질량에 대한 얻어진 화합물 127의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.71-7.69(m, 2H), 7.56(d, J=7.2Hz, 2H), 7.46(d, J=8.1Hz, 4H), 7.35-7.30(m, 4H), 7.26-7.21(m, 6H), 7.15-7.11(m, 2H), 7.04(d, J=8.1Hz, 2H), 5.38(d, J=8.7Hz, 1H), 4.35(d, J=6.4Hz, 2H), 4.28-4.23(m, 1H), 4.18(t, J=7.5Hz, 1H), 2.26(s, 3H), 2.12-2.11(m, 2H), 1.81-1.75(m, 1H), 1.59-1.44(m, 14H).
MS(ESI)m/z: 681.4 [M+H]+.
<화합물 128의 합성>
화합물 127(200mg, 0.47mmol)을 5% TFA 함유 디클로로메탄(10mL)에 용해시켜, 실온에서 3시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름). 얻어진 아민을 DMF(10mL)에 용해시켜, 4-(4-요오드페닐)부탄산(273mg, 0.94mmol), EDC 염산염(180mg, 0.94mmol), HOAt(123mg, 0.94mmol), 및 트리에틸아민(130μL, 0.94mmol)을 더하였다. 반응액을 실온에서 하룻밤 교반 후, 아세트산에틸과 H2O를 더하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 161mg(수율: 50%, 화합물 127의 물질량에 대한 얻어진 화합물 128의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ7.76(d, J=7.5Hz, 2H), 7.60-7.53(m, 4H), 7.39(t, J=7.5Hz, 2H), 7.30(t, J=7.5Hz, 2H), 6.92-6.86(m, 2H), 4.40-4.09(m, 4H), 3.27-3.19(m, 2H), 2.52(t, J=7.8Hz, 2H), 1.93-1.80(m, 3H), 1.71-1.62(m, 1H), 1.52-1.36(m, 13H).
MS(ESI)m/z: 697.2 [M+H]+.
<화합물 129의 합성>
화합물 128(473mg, 0.68mmol)을 피페리딘(2mL)과 DMF(8mL)의 혼합액에 용해시켜, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸과 H2O를 더한 후, 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름). 얻어진 아민을 DMF(10mL)에 용해시켜, 3,6,9-트리옥사운데칸디오산(91.1mg, 0.41mmol), EDC 염산염(78.6mg, 0.41mmol), HOAt(55.8mg, 0.41mmol), 및 트리에틸아민(57μL, 0.41mmol)을 더하였다. 반응액을 실온에서 5시간 교반 후, 아세트산에틸과 H2O를 더하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 87.9mg(수율: 37%, 화합물 128의 물질량에 대한 얻어진 화합물 129의 물질량으로부터 산출하였다).
1H-NMR(400MHz, CD3OD) δ7.58(d, J=8.7Hz, 2H), 6.96(d, J=7.5, 2H)4.41-4.29(m, 2H), 4.09-4.02(m, 2H), 3.85-3.73(m, 8H), 3.60(q, J=7.2Hz, 2H), 3.35(s, 2H), 3.10(t, J=4.0Hz, 2H), 2.55(t, J=7.5Hz, 2H), 2.16-2.14(m, 2H), 1.89-1.81(m, 2H), 1.41(s, 9H), 1.32-1.27(m, 3H), 1.18(t, J=7.0Hz, 2H).
MS(ESI)m/z: 701.2 [M+Na]+.
<화합물 130의 합성>
화합물 117(400mg, 0.29mmol)을 피페리딘(1mL)과 DMF(4mL)의 혼합액에 용해시켜, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸과 H2O를 더한 후, 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름). 얻어진 아민을 DMF(10mL)에 용해시켜, 화합물 129(170mg, 0.25mmol), EDC 염산염(95.9mg, 0.50mmol), HOAt(68.1mg, 0.50mmol), 및 트리에틸아민(69μL, 0.50mmol)을 더하였다. 반응액을 실온에서 2시간 교반 후, 아세트산에틸과 H2O를 더하였다. 유기층을 황화나트륨으로 건조시켜, 여과하였다. 여과액을 감압 증류 제거한 후, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 272mg(수율: 60%, 화합물 117의 물질량에 대한 얻어진 화합물 130의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 911.4302 [M+2H]+.
<화합물 131의 합성>
화합물 130(272mg, 0.15mmol)을 1% TFA 함유 디클로로메탄(3mL)에 용해시켜, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 THF(5mL)에 용해시켜, 무수 숙신산(30mg, 0.30mmol) 및 DIPEA(52μL, 0.30mmol)를 더하였다. 반응액을 실온에서 2시간 교반 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 230mg(수율: 92%, 화합물 130의 물질량에 대한 얻어진 화합물 131의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 832.8701 [M+2H]+.
<화합물 132의 합성>
화합물 131(186mg, 0.11mmol)의 디클로로메탄(5mL) 용액에 (S)-디-tert-부틸 2-(3-((S)-6-아미노-1-tert-부톡시-1-옥소헥산-2-일)우레이도)펜탄디오에이트(63.4mg, 0.13mmol), HBTU(83.4mg, 0.22mmol), 및 DIPEA(38μL, 0.22mmol)를 더하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 중압 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(메탄올/클로로포름).
수량: 80.4mg(수율: 34%, 화합물 131의 물질량에 대한 얻어진 화합물 132의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 1068.0419 [M+2H]+.
<화합물 133(Octapa-3)의 합성>
화합물 132(10mg, 4.7㎛ol)를 TFA/H2O/트리이소프로필실란의 혼합액(95/2.5/2.5, 2mL)에 용해시켜, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔사를 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [20/80/0.1(0분)∼50/50/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
수량: 2.3mg(수율: 29%, 화합물 132의 물질량에 대한 얻어진 화합물 133의 물질량으로부터 산출하였다).
HRMS(ESI)m/z: 843.2900 [M+2H]+.
<111In 표지에 의한 방사성 표지 화합물의 제조(실시예 3-1∼3-2, 비교예 2-1)>
3종류의 Octapa 유도체(Octapa-1∼3)에 대해 각각, 아세트산 완충액(pH 5.5, 10mM, 350μL)에 [111In]InCl3 용액(100μL)을 혼화하고, 표지 전구체(화합물 115, 25, 또는 33)의 수용액(<10％ DMSO, 10μM, 50μL)을 더하였다. 실온에서 15분간 정치한 후, 반응액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-MS-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/아세트산 완충액(pH 4.5, 10mM)[10/90(0분)∼30/70(30분) 또는 20/80(0분)∼50/50(30분)], 유속: 1mL/min.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 측정에 사용한 HPLC 조건은 상기 정제 조건과 마찬가지이다.
그 결과, 이하의 3종류의 방사성 표지 화합물을, 방사 화학적 수율 55∼93%, 방사 화학적 순도 99% 이상으로 얻었다.
·비교예 2-1: [111In]In-Octapa-1
·실시예 3-1: [111In]In-Octapa-2
·실시예 3-2: [111In]In-Octapa-3
<111In 표지에 의한 방사성 표지 화합물의 제조(실시예 3-3, 비교예 2-2)>
2종류의 Neunpa 유도체(Neunpa-1 및 2)에 대해, 아세트산 완충액(pH 4.0, 10mM, 350μL)에 [111In]InCl3 용액(100μL)을 혼화하고, 표지 전구체(화합물 116 또는 26)의 수용액(<10％ DMSO, 10μM, 50μL)을 더하였다. 실온에서 15분간 정치한 후, 반응액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하였다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼30/70/0.1(30분) 또는 20/80/0.1(0분)∼50/50/0.1(30분)], 유속: 1mL/min.
방사 화학적 수율 및 방사 화학적 순도는 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 측정에 사용한 HPLC 조건은 상기 정제 조건과 마찬가지이다.
그 결과, 이하의 2종류의 방사성 표지 화합물을, 방사 화학적 수율 55∼93%, 방사 화학적 순도 99% 이상으로 얻었다.
·비교예 2-2: [111In]In-Neunpa-1
·실시예 3-3: [111In]In-Neunpa-2
<배양 세포를 사용한 결합 평가>
상술한 실시예 1-1과 마찬가지의 방법으로 배양한 LNCaP 세포와, PC-3 세포를 각각, 4.0×105cells/well로 12웰 플레이트에 파종하고, 37℃, 5% CO2하에서 48시간 정치하였다.
배양 배지를 제거하고, 실시예 3-1∼3-3 또는 비교예 2-1∼2-2의 방사성 표지 화합물(각 37kBq) 함유 어세이용 배지(0.5% FBS 함유 RPMI1640 배지) 용액(1mL)을 더하였다. 그 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2하에서 1시간 정치하였다.
저해 실험에서는 배양 배지를 제거 후, 상술한 방사성 표지 화합물과 2-(포스포노메틸)펜탄디오산(2-PMPA)(PSMA 저해제, 종농도 100μM)를 함유하는 어세이용 배지(1mL)를 더하였다. 그 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2하에서 1시간 정치하였다.
어세이용 배지를 제거 후, 각 웰을 어세이용 배지(1mL)로 세정하고, 1규정 수산화나트륨 수용액(200μL×2)으로 세포를 용해시켰다.
세포 용해액의 각 방사능을 감마 카운터로 측정하였다. 이것과는 별도로, 세포 용해액 중의 총 단백질 농도를 Thermo Fisher Scientific사제 BCA Protein Assay Kit를 사용하여 산출하였다. 첨가 방사능량에 대한 샘플의 방사능량의 백분율(%ID)을, 총 단백질량으로 나눈 값(%ID/mg protein)을 샘플별로 산출하였다.
데이터는 평균값±표준 편차로 나타냈다. 유의차 검정은 Student's t-test 및 one-way analysis of variance(ANOVA) test with Dunnet's post-hoc test를 사용하여 행하고, p<0.05를 유의차 있음으로 하였다.
배양 세포에의 결합 평가의 결과를 도 11에 나타낸다. 값이 높을수록, 방사성 표지 화합물의 존재량이 많아, 상기 화합물의 집적이 높은 것을 나타낸다.
실시예 3-1∼3-3 및 비교예 2-1∼2-2의 방사성 표지 화합물은 PSMA 음성인 PC-3 세포와 비교하여, PSMA 양성의 LNCaP 세포에 대한 높은 결합성을 나타내고, 그 결합은 과잉량의 PSMA 저해제(2-PMPA)의 첨가에 의해 유의하게 저하하였다. 따라서, 각 실시예 및 비교예의 방사성 표지 화합물은 PSMA 양성 세포에 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
<알부민에의 결합 평가>
상술한 실시예와 마찬가지로, PBS 및 인간 알부민을 사용하여, 알부민에의 결합 평가를 행하였다. 실시예 3-1∼3-3 및 비교예 2-1∼2-2의 방사성 표지 화합물의 PBS 용액(각 37kBq, 50μL)을 각각 사용한 것 이외에는 실시예 1-1과 마찬가지의 실험 순서 및 통계 수법으로 평가를 행하였다.
결과를 도 12에 나타낸다.
실시예 3-1∼3-3([111In]In-Octapa-2, [111In]In-Octapa-3 및 [111In]In-Neunpa-2)를 사용한 HSA 용액에 있어서의 용출액의 방사능 비율은 PBS에 있어서의 용출액의 방사능 비율에 비해 현저하게 높았다.
한편, 비교예 2-1∼2-2([111In]In-Octapa-1 및 [111In]In-Neunpa-1)의 HSA 용액에 있어서의 용출액의 방사능 비율은 PBS의 경우와 마찬가지로 낮은 값을 나타냈다. 이들 결과로부터, 실시예 3-1∼3-3에서 사용한 각 화합물 및 방사성 표지 화합물은 알부민에 대한 결합성을 갖는 것이 나타났다.
<종양 이식 마우스를 사용한 체내 방사능 분포 평가>
실시예 1-1과 마찬가지의 방법으로 제작한 LNCaP 종양 이식 마우스에, 실시예 3-1∼3-3 또는 비교예 2-1∼2-2의 각 방사성 표지 화합물의 생리 식염수 용액(각 259kBq/100μL)을 미정맥으로부터 투여하고(n=2∼3), 투여 1, 4, 24, 48, 96, 및 192시간 후에 마우스를 안락사시켰다. 그 후, 혈액 및 각 장기를 회수하고, 장기의 질량 및 방사능을 측정하였다.
투여 방사능량(injected dose)에 대한 방사능량의 백분율(%ID)을 혈액 질량 또는 장기 질량(g)으로 나눈 값(%ID/g)으로서 나타낸다. %ID/g의 값이 높을수록, 방사성 표지 화합물의 존재량이 많아, 상기 화합물의 표적 장기에의 집적이 높은 것을 나타낸다.
LNCaP 종양 이식 마우스 및 각 방사성 표지 화합물의 결과(평균±표준 편차, 각 n=2∼3)를 이하의 표 7∼11, 및 도 13에 나타낸다.
실시예 3-1∼3-3의 각 방사성 표지 화합물은 비교예 2-1∼2-2의 것과 비교하여, 신장 집적이 같은 정도로 저감되면서도, 높은 혈중 체류성 및 종양 집적성을 갖는 것이 확인되었다. 이것은 실시예 3-1([111In]In-Octapa-2), 실시예 3-2([111In]In-Octapa-3) 및 실시예 3-3([111In]In-Neunpa-2)에 있어서 특히 현저하였다.
·비교예 2-1([111In]In-Octapa-1; 평균±표준 편차, 각 n=3, 192시간 점만 n=2).
[표 7]
·실시예 3-1([111In]In-Octapa-2; 평균±표준 편차, 각 n=3).
[표 8]
·실시예 3-2([111In]In-Octapa-3; 평균±표준 편차, 각 n=3).
[표 9]
·비교예 2-2([111In]In-Neunpa-1; 평균±표준 편차, 각 n=3, 192시간 점만 n=2).
[표 10]
·실시예 3-3([111In]In-Neunpa-2; 평균±표준 편차, 각 n=3).
[표 11]
<종양 이식 마우스를 사용한 SPECT/CT 평가>
실시예 2와 마찬가지의 방법으로 LNCaP 세포와 PC-3 세포의 종양 동시 이식 마우스를 얻은 후, 실시예 3-1([111In]In-Octapa-2)의 생리 식염수 용액(7.3MBq, 150μL)을 미정맥으로부터 투여하였다. 투여 24시간 후에, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 SPECT/CT를 행하고, 얻어진 화상의 재구성을 행하였다.
SPECT/CT의 결과를 도 14에 나타낸다.
[111In]In-Octapa-2를 사용한 SPECT/CT 촬상에서는 투여 24시간 후에 있어서, LNCaP 종양(도면 중, 실선 화살표)에 높은 방사능 집적이 확인되었지만, PC-3 종양(도면 중, 파선 화살표)에서의 방사능 시그널은 거의 관측되지 않았다. 또한, 신장(도면 중, 원)에 있어서의 방사능 집적도 확인되었다. 이 결과로부터, [111In]In-Octapa-2는 PSMA 고발현 종양의 명료한 묘출이 가능한 것이 나타났다.
<실시예 4-1∼4-2>
실시예 4-1∼4-2에서는 PSMA를 표적 분자로 하는 (((S)-5-아미노-1-카르복시펜틸)카르바모일)-L-글루탐산(상기 식(C1) 중, a가 2, b가 4인 구조)를 PSMA 분자와의 결합부로서 구조 중에 포함하고, 상기 일반식(1)으로 나타내는 바와 같이, PSMA 분자와의 결합부 및 알부민 결합부를, 킬레이트부를 개재하여 직선 형상으로 포함하는 화학 구조를 갖는 화합물(PSMA-NAT-DA1)을 합성하였다. 그 다음에, PSMA-NAT-DA1에 방사성 금속으로서 111In 이온 또는 225Ac 이온을 각각 배위시킨 방사성 표지 화합물을 얻었다. 이하에 상세를 나타낸다.
PSMA-NAT-DA1은 구조 중에 킬레이트부, PSMA 분자와의 결합부 및 알부민 결합부를 포함한다.
PSMA-NAT-DA1은 킬레이트부와 PSMA 분자와의 결합부가, trans-4-아미노시클로헥산-1-카르복실산 및 나프틸글리신 유래의 화학 구조를 개재하여 간접적으로 결합하고 있고, 또한, 킬레이트부와 알부민 결합부를 포함하는 원자단은, 리신 유래의 링커 구조를 개재하여 간접적으로 결합하고 있다.
실시예 4-1∼4-2에 있어서의 합성 경로의 개략을 이하에 나타낸다.
(1) PSMA-NAT-DA1의 합성
이하에 나타내는 순서로, PSMA-NAT-DA1을 합성하였다.
<화합물 202 및 203의 합성>
화합물 1은 실시예 1-1에 기재된 방법과 마찬가지로 합성하였다.
화합물 202는 기보의 방법에 따라, N2-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-N6-[(4-메틸페닐)디페닐메틸]-L-리신으로부터 4단계로 합성하였다(Chem Commun. 2021, 57, 6432-6435).
화합물 1(131mg, 0.17mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(0.4mL) 용액에 N-[1-(시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노(모르폴리노)]우로늄 헥사플루오로포스페이트(COMU)(72.4mg, 0.17mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(95μL, 0.17mmol)을 빙냉하에서 더하고, 15분간 교반하였다. 화합물 202(66.8mg, 0.14mmol)를 더하고, 실온에서 5일간 교반 후, 용액을 역상 HPLC로 정제하고, 화합물 203을 얻었다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(10×250mm), 이동상: MeCN/H2O [3/7(0분)∼9/1(60분)], 유속: 5mL/min.
MS(ESI): m/z1230 [M+H]+.
<화합물 204의 합성>
기보(J. Med. Chem. 2016, 59, 1761-1775, Mol. Pharm. 2018, 15, 3502-3511)의 방법을 참고로, Fmoc-Lys(ivDde)-OH로부터 9단계로 화합물 204를 얻었다.
또한, 화합물 204의 화학식 중, 부호 Gp로 나타내어지는 화학 구조는 수지를 나타낸다.
<화합물 205의 합성>
수지가 결합한 화합물 204에, 화합물 203(49.6mg, 0.044mmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-벤조트리아졸륨3-옥시드헥사플루오로포스파이트(HBTU)(16.7mg, 0.44mmol), 및 DIPEA(188μL, 0.44mmol)를 더하고, DMF 중에서 하룻밤 진탕하였다. DMF로 세정 후, 트리플루오로아세트산(TFA)/트리이소프로필실란/H2O(95:2.5:2.5, 2mL)를 더하고, 3시간 진탕 후, 용액을 역상 HPLC로 이하의 조건으로 정제하여, 목적으로 하는 화합물 205(PSMA-NAT-DA1)를 얻었다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×250mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼90/10/0.1(40분)], 유속: 5mL/min.
수량: 11mg(16%, 화합물 203의 물질량에 대한 얻어진 화합물 205의 물질량으로부터 산출하였다)
MS(ESI)m/z: MS(ESI)m/z793 [M+2H]2+.
(2) 111In 표지(실시예 4-1)
이하에 나타내는 순서로, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([111In]In-PSMA-NAT-DA1)을 얻었다.
2-모르폴리노에탄술폰산 완충액(0.1M, pH 5.7, 150μL)에 [111In]InCl3 용액(3.7MBq, 100μL)과, 화합물 205의 디메틸술폭시드 용액(1μg/μL, 5μL)을 더하고, 90℃에서 30분간 정치하였다. 그 후, 반응액을 역상 HPLC로 정제하고, 방사성 표지 화합물([111In]In-PSMA-NAT-DA1)을 얻었다.
얻어진 [111In]In-PSMA-NAT-DA1의 방사 화학적 순도를 다음의 방법으로 측정하였다. 즉 [111In]In-PSMA-NAT-DA1의 HPLC 분취액의 일부를 이하의 HPLC 조건으로 다시 분석하고, 검출된 모든 피크의 면적값에 대한 [111In]In-PSMA-NAT-DA1의 면적값의 백분율을 방사 화학적 순도(%)로 하였다.
방사 화학적 수율은 실시예 1-1에 기재한 방법과 마찬가지로 측정하였다. 방사 화학적 순도의 측정에 사용한 HPLC 조건을 이하에 나타낸다.
그 결과, 방사 화학적 수율은 9%, 방사 화학적 순도는 95% 이상이었다. 또한, 다시 마찬가지의 합성을 행한 결과, 방사 화학적 수율은 60%로 개선되었다.
정제 조건: Cosmosil 5C18-AR-II column(4.6×150mm), 이동상: MeCN/H2O/TFA [10/90/0.1(0분)∼90/10/0.1(40분)], 유속: 1mL/min.
(3) 225Ac 표지(실시예 4-2)
이하에 나타내는 순서로, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([225Ac]Ac-PSMA-NAT-DA1)을 얻었다.
Protein LoBind Tube 1.5mL(EPPENDORF사제)에 분주한 [225Ac]AcCl3의 0.2mol/L 염산 용액(1.0MBq, 20μL)에, 0.1M 아세트산-아세트산암모늄 완충액(pH 5.5, 170μL)과 PSMA-NAT-DA1의 DMSO 용액(2.0mM/L, 10μL)을 더하고, 70℃에서 1시간 정치하였다. 반응액에 H2O(0.8mL)을 더하고, Oasis HLB Light 칼럼에 통액하였다. 칼럼에 H2O(10mL)를 통액 후, 70% EtOH(0.5mL)를 통액하여, 목적으로 하는 방사성 표지 화합물([225Ac]Ac-PSMA-NAT-DA1) 70% 에탄올 용액을 얻었다.
방사 화학적 수율은 다음의 방법으로 측정하였다. 얻어진 방사성 표지 화합물의 방사능을 감마선 스펙트럼 미터로 측정하고, 반응에 사용한 [225Ac]AcCl3 용액의 방사능에 대한 백분율을 방사 화학적 수율(%)로 하였다.
얻어진 방사성 표지 화합물의 방사 화학적 순도를 다음 방법으로 측정하였다. 즉 방사성 표지 화합물의 용액의 일부를 TLC(iTLC-SG, 이동상: H2O/MeCN=1:1 혼액)로 분석하고, 검출된 모든 피크의 면적값에 대한 방사성 표지 화합물의 면적값의 백분율을 방사 화학적 순도(%)로 하였다. 그 결과, 방사 화학적 수율은 35%, 방사 화학적 순도는 86%였다.
<배양 세포를 사용한 결합 평가>
상술한 실시예 1-1과 마찬가지의 방법으로 배양한 LNCaP 세포와, PC-3 세포를 각각, 4.0×105cells/well로 12웰 플레이트에 파종하고, 37℃, 5% CO2하에서 48시간 정치하였다.
배양 배지를 제거하고, [111In]In-PSMA-NAT-DA1(8.5kBq)을 포함하는 어세이용 배지(0.5% FBS 함유 RPMI1640 배지) 용액(1mL)을 더하였다. 그 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2하에서 1시간 정치하였다.
저해 실험에서는 배양 배지를 제거 후, [111In]In-PSMA-NAT-DA1(37kBq)과 2-(포스포노메틸)펜탄디오산(2-PMPA)(PSMA 저해제, 종농도 100μM)을 포함하는 어세이용 배지(1mL) 용액을 더하였다. 그 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2하에서 1시간 정치하였다.
어세이용 배지를 제거 후, 방사성 표지 화합물 및 2-PMPA를 포함하지 않는 어세이용 배지(1mL)로 각 웰을 세정하고, 1규정 수산화나트륨 수용액(200μL×2)으로 세포를 용해시켰다.
어세이용 배지 및 세포 용해액의 각 방사능을 감마 카운터로 측정하였다. 이것과는 별도로, 세포 용해액 중의 총 단백질 농도를 Thermo Fisher Scientific사제 BCA Protein Assay Kit를 사용하여 산출하였다. 첨가 방사능량에 대한 샘플의 방사능량의 백분율(%ID)을 총 단백질량으로 나눈 값(%ID/mg protein)을 샘플별로 산출하였다.
데이터는 평균값±표준 편차로 나타냈다. 유의차 검정은 Student's t-test 및 one-way analysis of variance(ANOVA) test with Dunnet's post-hoc test를 사용하여 행하고, p<0.05를 유의차 있음으로 하였다.
배양 세포에의 결합 평가의 결과를 도 15에 나타낸다. 값이 높을수록, 방사성 표지 화합물의 존재량이 많아, 상기 화합물의 집적이 높은 것을 나타낸다.
[111In]In-PSMA-NAT-DA1은 PC-3 세포와 비교하여 LNCaP 세포에 대한 높은 결합성을 나타내고, 그 결합은 과잉량의 PSMA 저해제(2-PMPA)의 첨가에 의해 유의하게 저감하였다. 이들 결과로부터, [111In]In-PSMA-NAT-DA1은 PSMA 고발현 세포에 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
<알부민에의 결합 평가>
[111In]In-PSMA-NAT-DA1의 인산 완충 생리 식염수(PBS) 용액(37kBq, 50μL)을, 200μL의 인간 혈청 알부민(HSA)의 PBS 용액(45mg/mL), 마우스 혈장, 인간 혈장, 또는 PBS에 더하고, 37℃에서 10분간 정치하였다. 그 후, 반응액을 스핀 칼럼(사이티바사제 Sephadex G-50)에 첨가하고, 1500×g, 4℃에서 2분간 원심 분리하였다. 분리 후, 칼럼과 용출액의 방사능을 감마 카운터로 측정하였다.
데이터는 평균값±표준 편차로 나타냈다. 유의차 검정은 Student's t-test 및 one-way analysis of variance(ANOVA) test with Dunnet's post-hoc test를 사용하여 행하고, p<0.05를 유의차 있음으로 하였다.
알부민에의 결합 평가의 결과를 도 16에 나타낸다. 값이 높을수록 알부민에의 결합성이 높은 것을 나타낸다.
평가 대상이 되는 화합물이 알부민에 결합하여 복합체를 형성하면, 분자 사이즈의 증가에 의해 칼럼을 통과하지만, 알부민에 결합하지 않았을 때에는 칼럼 내의 겔에 유지되는 것으로 생각된다.
[111In]In-PSMA-NAT-DA1을 PBS 중에서 정치 후, 칼럼에 부여한 결과, 용출액에 있어서 현저한 방사능은 관측되지 않았다. 한편, 마우스 혈장, 인간 혈장, 및 HSA 용액 중에서 정치했을 때에는 [111In]In-PSMA-NAT-DA1의 용출액에 있어서의 방사능은 유의하게 높아, [111In]In-PSMA-NAT-DA1이 혈장 알부민에 결합하는 것이 시사되었다.
<LNCaP 또는 PC-3 종양 이식 마우스를 사용한 체내 방사능 분포 평가>
동물 실험은 쿄토 대학 동물 실험 위원회의 지침을 준수하여 행하였다. 웅성 CB17/IcrJcl-Prkdcscid 마우스는 니혼 클레아 카부시키가이샤에서 구입하였다. 동물은 12시간/12시간의 주야 사이클 조건하에서 사육하고, 사료와 물은 자유롭게 주었다. PBS와 Corning Life Sciences사제 Matrigel의 혼합액(1:1, 150μL)에 LNCaP 세포(4.3×106cells/mouse) 또는 PC-3 세포(3.3×106cells/mouse)를 현탁시켜, 이소플루란 마취하, CB17/IcrJcl-Prkdcscid 마우스의 오른쪽 어깨에 피하 이식하였다. 그 후, 상기 마우스를 40∼60일간 사육하였다.
LNCaP 또는 PC-3 종양 이식 마우스에 [111In]In-PSMA-NAT-DA1의 생리 식염수 용액(259kBq, 100μL)을 미정맥으로부터 투여하였다(각 n=3). 투여 1, 4, 24, 48, 96, 및 192시간 후에 마우스를 안락사시켰다. 그 후, 혈액 및 각 장기를 회수하고, 중량과 방사능을 측정하였다.
LNCaP 종양 이식 마우스에 [111In]In-PSMA-NAT-DA1을 투여하고, 체내 동태(%ID/g)를 평가한 결과를 표 12에 나타낸다(평균±표준 편차, n=3).
[표 12]
[111In]In-PSMA-NAT-DA1은 LNCaP 종양에의 높은 집적을 나타냈다(투여 1-48시간 후에 23.0-131.6%ID/g). 또한, 혈액에서의 체류성을 나타내(투여 48시간 후에 12.3%ID/g), 종양/신장비는 투여 24시간 후 이후에서 1을 상회하였다. 이들 결과로부터, [111In]In-PSMA-NAT-DA1은 PSMA 고발현 종양에 대한 높은 집적성을 갖는 것이 명확해졌다.
PC-3 종양 이식 마우스에 [111In]In-PSMA-NAT-DA1을 투여하고, 체내 동태(%ID/g)를 평가한 결과를 표 13에 나타낸다(평균±표준 편차, n=3).
[표 13]
[111In]In-PSMA-NAT-DA1의 PC-3 종양에의 집적은 동타임 포인트에 있어서의 LNCaP 종양에의 집적보다 유의하게 낮은 값을 나타내, 방사성 표지 화합물이 PSMA 양성 종양에 선택적으로 집적하는 것이 나타났다.
<LNCaP 종양 이식 마우스를 사용한 SPECT/CT>
상술한 방법으로 제작한 LNCaP 종양 이식 마우스에, [111In]In-PSMA-NAT-DA1의 생리 식염수 용액(1.57-2.59MBq, 150μL)을 미정맥으로부터 투여하였다. 투여 24, 48 및 96시간 후에 Gamma Medica-Ideas사제 FX3300 pre-clinical imaging system으로 SPECT/CT를 행하였다. 이소플루란 마취하, 회전 반경 35mm, 투영 시간 70초, 투영 회수 32회로 직경 1.0mm의 핀홀 콜리메이터를 사용하여 촬상하였다. SPECT 후, CT(관전압: 60kV, 관전류: 350μA)를 행하였다. SPECT의 투영 데이터에 대해 3차원 ordered subset expectation maximization법(8subsets, 5iterations)에 의한 화상 재구성을 행하였다.
SPECT/CT의 결과를 도 17에 나타낸다. 동 도면 중, 화살표로 나타내는 부분이 종양의 존재 위치이며, 동그라미 표시로 나타내는 부분이 신장의 존재 위치이다. SUV가 높을수록 방사능 집적이 높다.
본 SPECT/CT 촬상에서는 투여 24 및 48시간 후에 있어서 LNCaP 종양(도면 중 화살표)에 현저한 방사능 집적이 확인되었다. 투여 24 및 48시간 후에 있어서 신장(도면 중 실선 원)에도 방사능 집적이 확인되었지만, 투여 96시간 후(도면 중 파선 원)에 있어서는 거의 확인되지 않았다. 이들 결과로부터, [111In]In-PSMA-NAT-DA1은 PSMA 고발현 종양을 SPECT에 의해 명료하게 묘출하는 것이 가능함과 아울러, [111In]In-PSMA-DB보다도 뛰어난 것이 나타났다.

Claims (14)

  1. 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부, 알부민 결합부를 포함하는 제 1 원자단 및 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 제 2 원자단을 구조 중에 갖고,
    제 1 원자단과 제 2 원자단은 상기 킬레이트부를 개재하여 결합하고 있는 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    하기 일반식(1)으로 나타내어지는 화합물.

    (식(1) 중, A1은 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부이고, B는 알부민 결합부를 포함하는 원자단이고, C는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이며,
    La는 링커 구조이고,
    Lb는 La와 동일 또는 상이한 링커 구조이고,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
    B 또는 La는 A1의 임의의 부위에 결합하고 있고,
    C 또는 Lb는 B 또는 La가 A1에 결합하는 부위와는 상이한 부위에 있어서 A1과 결합하고 있다.)
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 식(1) 중, C가 하기 식(C1)으로 나타내어지는 화합물.

    (식(C1) 중, 파선으로 나타내는 부분은 상기 식(1)에 있어서의 A1 또는 Lb와의 결합 부분이며, a 및 b는 각각 독립적으로 1 이상 7 이하의 정수이다.)
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식(1) 중, A1은 환상 구조를 갖고, 상기 환상 구조가 질소 원자를 2개 이상 갖고, 각 질소 원자가 이웃하는 2개 이상의 탄소 원자를 사이에 두고 연결되어 있거나, 또는
    A1은 쇄상 구조를 갖고, 상기 쇄상 구조가 질소 원자를 2개 이상 갖고, 각 질소 원자가 이웃하는 2개 이상의 탄소 원자를 사이에 두고 연결되어 있고,
    A1은 상기 환상 구조 또는 상기 쇄상 구조를 구성하는 질소 원자에 직접 결합하는 질소 결합 원자단을 갖고,
    상기 질소 결합 원자단은 카르복시기, 인산기, 아미드기, 벤젠환 및 피리딘환 중 1종 이상을 포함하고,
    B가 상기 질소 결합 원자단에 결합하고 있을 경우, C는 B가 결합하고 있는 상기 원자단 이외의 상기 질소 결합 원자단에 결합하고 있는 화합물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식(1) 중, A1은 DOTA, HOPO, Octapa, Macropa 또는 이것들의 유도체인 화합물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식(1) 중, 상기 제 1 원자단에 포함되는 상기 알부민 결합부는 γ글루탐산, 치환 또는 무치환의 페닐부티르산, 지질, 헤마틴, 빌리루빈, 클로피브린산, 클로피브레이트, 카로테노이드, 스테로이드 골격을 갖는 화합물, 이부프로펜 골격을 갖는 화합물, 탄소수 13 이상 20 이하의 직쇄 혹은 분기쇄 또한 포화 혹은 불포화인 탄화수소, 시아닌 색소, 술폰산기를 갖는 염료, 디아조 염료, 펜타메틴시아닌 색소, 블루 덱스트란, 브로모크레졸 그린, 및 에반스 블루 및 이것들의 유도체 중 1종 이상에서 유래하는 구조를 갖거나, 또는 알부민에 결합 가능한 항체 혹은 펩티드인 화합물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식(1) 중, 상기 제 1 원자단에 포함되는 상기 알부민 결합부는 하기 식(B1) 또는 식(B2)으로 나타내어지는 구조를 갖는 화합물.

    (식(B1) 중, R은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이고, 파선으로 나타내는 부분은 상기 식(1)에 있어서의 A1 또는 La와의 결합 부분이며,
    식(B2) 중, Rb1 내지 Rb11은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 수산기, 시아노기, 탄소수가 1 이상 6 이하인 치환 혹은 무치환의 알킬기, 또는 탄소수가 1 이상 6 이하인 치환 혹은 무치환의 알콕시기이며, 파선으로 나타내는 부분은 상기 식(1)에 있어서의 A1 또는 La와의 결합 부분이다.)
  8. 하기 일반식(2)으로 나타내어지는 화합물.

    (식(2) 중, A2는 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부이고, B는 알부민 결합부를 포함하는 원자단이고, C는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이고,
    A2는 Neunpa 혹은 Octapa 또는 이것들의 유도체이며,
    Lc는 링커 구조이고,
    A2가 Octapa일 때, Lc는 폴리에틸렌글리콜 구조를 포함한다.)
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 식(2) 중, B가 하기 식(B1)으로 나타내어지고, 또한 C가 하기 식(C1)으로 나타내어지는 화합물.

    (식(B1) 중, R은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이고, 파선으로 나타내는 부분은 Lc와의 결합 부분이다.)

    (식(C1) 중, 파선으로 나타내는 부분은 식(2)에 있어서의 Lc와의 결합 부분이고, a 및 b는 각각 독립적으로 1 이상 7 이하의 정수이다.)
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물이 방사성 금속의 이온에 배위되어 이루어지는 방사성 표지 화합물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 방사성 금속이 68Ga, 64Cu, 67Cu, 89Zr, 90Y, 99mTc, 111In, 177Lu, 186Re, 188Re 또는 225Ac인 방사성 표지 화합물.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 기재된 방사성 표지 화합물을 유효 성분으로 하는 방사성 의약 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물을 방사성 금속 이온에 배위시켜, 방사성 표지 화합물을 얻는 방사성 표지 화합물의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    하기 일반식(1S)으로 나타내어지는 상기 화합물을 사용하는 방사성 표지 화합물의 제조 방법.

    (식(1S) 중, A1은 방사성 금속 이온과 배위 가능한 킬레이트부이고, C는 PSMA 분자와의 결합부를 포함하는 원자단이고,
    La는 링커 구조이고,
    Lb는 La와 동일 또는 상이한 링커 구조이고,
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1이며,
    R은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 탄소수 1 이상 5 이하의 알킬기이다.)
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