CN112839683B - 含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含有标记部‑抗人抗体Fab片段复合物的稳定的药物组合物等。在含有标记部‑抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物中，配合有柠檬酸、磷酸、2‑[4‑(2‑羟基乙基)‑1‑哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂，配合有蔗糖或甘油作为稳定剂，而且配合有非离子型表面活性剂，并且将pH调节到6.5～7.5。由此，能够抑制保存标记部‑抗人抗体Fab片段复合物时多聚体、不溶性微粒的产生。

Description

含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物
技术领域
本发明涉及含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的稳定的药物组合物。特别是，本发明涉及含有标记部-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物或标记部-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的稳定的药物组合物。另外，本发明还涉及含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物的制造方法、以及稳定地保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物的方法。
背景技术
随着基因重组技术的发展，已能够利用免疫球蛋白、单克隆抗体、人源化抗体等抗体作为药品。例如，为了诊断、治疗癌症而使用结合有抗癌剂、金属放射性同位素、荧光色素等的抗体。另外，已知使用抗体的靶向对肿瘤细胞的特异性高、副作用少。在这样的背景下，迄今为止已开发出用金属放射性同位素标记的单克隆抗体等(专利文献1)。
另一方面，通常抗体的血浆半衰期长，在给药到体内之后需要4～5天的较长时间才能达到提供足以使癌症可视化的信背比的肿瘤与血液之比(Clin.Pharmacol.Ther.；2010；87：586-592)。另外，抗体的Fc区会引起抗体依赖性细胞毒性(Antibody-DependentCellular Cytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒性(Complement-DependentCytotoxicity：CDC)之类的药理作用(Glycoconj.J.；2013；30：227-236、Curr.Opin.Biotechnol.；2002；13：609-614)。此外，抗体由于在肝脏中被代谢而无关靶标地在肝脏中高度蓄积，但由于大肠癌的早期转移局限于肝脏，因此难以通过抗体来检测大肠癌的肝转移病灶(Clin.Pharmacol.Ther.；2010；87：586-592)。
与此相对，Fab这样被低分子化后的重组抗体片段由于组织渗透性高而容易到达病灶，能够期待使用大肠杆菌、酵母等表达系统以低成本进行制造，并且由于具有血浆半衰期短、经肾脏排泄的特征，因而可期待作为诊断药来利用(Nat.Biotechnol.；2005；23：1126-1136)。
在这样的背景下，出于癌症诊断的目的，研究了配位有金属放射性同位素的Fab片段复合物、结合有荧光色素的Fab片段的利用。
另外，关于稳定地保存抗体的方法，迄今为止已经进行了很多研究。例如，专利文献2记载了通过向含有人源化C4C1 Fab片段的制剂中添加非离子型表面活性剂、糖类并且将pH调节到特定范围来实现稳定化的方法。另外，专利文献3记载了通过向含有针对IL-1β的人抗体的制剂中添加缓冲剂并且将pH调节到特定范围来实现稳定化的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2013-510093号公报
专利文献2：国际公开第00/66160号公报
专利文献3：日本特表2012-511540号公报
发明内容
发明所要解决的问题
一价的Fab片段的分子量为约50kDa，小于分子量为约150kDa的抗体，经肾脏排泄，血浆半衰期也短。另外，由于没有Fc区，因此也不会引起ADCC和CDC。由于这样的优点，可期待配位有金属放射性同位素的Fab片段、结合有荧光色素的Fab片段作为诊断药比抗体更有效。
但是，结合有配体、荧光色素的Fab片段存在如下问题：容易由于保存时的热应力、光应力而生成多聚体、不溶性微粒；在使用前的融化/搅拌过程中生成不溶性微粒。另外，若为了稳定化而向保存溶液中配合各种化合物，则还担心产生配位效率、荧光褪色之类的问题等。
本发明的课题在于，提供能够抑制保存时多聚体、不溶性微粒的产生的、含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物等。另外，本发明的课题还在于，提供：在使用配体作为标记部时能够抑制金属放射性同位素向配体的配位效率的下降的、含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物；以及，在使用荧光色素作为标记部时能够抑制荧光色素褪色的含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物。
用于解决问题的方法
本发明人对含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物的配方反复进行了深入研究，结果发现，通过制成配合有柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂、配合有蔗糖或甘油作为稳定剂、还配合有非离子型表面活性剂、并且pH为6.5～7.5的药物组合物，能够抑制保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物时多聚体、不溶性微粒的产生，并且还能够抑制金属放射性同位素向配体的配位效率的下降和荧光色素的褪色，从而完成了本发明。
即，本发明提供标记部-抗人抗体Fab片段复合物的保存稳定性优良、并且还能够抑制金属向标记部的配位效率的下降和标记荧光色素的褪色的含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物，一个方式中，本发明可以如下。
[1]一种药物组合物，其为含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物、缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂并且pH为6.5～7.5的药物组合物，其中，
缓冲剂包含柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷，
稳定剂包含蔗糖或甘油。
[2]根据上述[1]所述的药物组合物，其中，抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有重链片段和轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)含有重链片段和轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段，所述重链片段包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区，
标记部为下式(I)所示的基团，
[式中，波浪线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段键合，在此，抗人CEACAM5抗体Fab片段通过抗人CEACAM5抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子键合]。
[3]根据上述[2]所述的药物组合物，其中，抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
[4]根据上述[1]所述的药物组合物，其中，抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有重链片段和轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，所述重链片段包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)含有重链片段和轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，所述重链片段包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成并且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区，
标记部为下式(I)所示的基团，
[式中，波浪线表示与抗人MUC1抗体Fab片段键合，在此，抗人MUC1抗体Fab片段通过抗人MUC1抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子键合]。
[5]根据上述[4]所述的药物组合物，其中，抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成并且序列号6或序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的药物组合物，其中，非离子型表面活性剂包含聚山梨酯80。
[7]根据上述[2]～[6]中任一项所述的药物组合物，其中，标记部-抗人抗体Fab片段复合物还含有89Zr。
[8]根据上述[7]所述的药物组合物，其用于大肠癌或大肠癌转移后的癌症的诊断。
[9]根据上述[7]所述的药物组合物，其用于乳腺癌或乳腺癌转移后的癌症的诊断。
[10]根据上述[1]所述的药物组合物，其中，抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有重链片段和轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，所述重链片段包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区，所述轻链包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区；以及
(b)含有重链片段和轻链的抗人MUC1抗体Fab片段，所述重链片段包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成并且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区，所述轻链包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区，
标记部为下式(II)所示的基团，
[式中，波浪线表示与抗人MUC1抗体Fab片段键合，在此，抗人MUC1抗体Fab片段通过抗人MUC1抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝O)的碳原子键合]。
[11]根据上述[10]所述的药物组合物，其中，抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成并且序列号6或序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
[12]根据上述[10]或[11]所述的药物组合物，其中，非离子型表面活性剂包含聚山梨酯80。
[13]根据上述[10]～[12]中任一项所述的药物组合物，其用于乳腺癌或乳腺癌转移后的癌症的诊断。
[14]根据上述[13]所述的药物组合物，其为术中诊断药。
[15]根据上述[1]～[14]中任一项所述的药物组合物，其中，缓冲剂的浓度为10～30mmol/L。
[16]根据上述[1]～[15]中任一项所述的药物组合物，其中，稳定剂的浓度为5～30w/v％。
[17]根据上述[1]～[16]中任一项所述的药物组合物，其中，非离子型表面活性剂的浓度为0.02～0.2w/v％。
[18]根据上述[1]～[17]中任一项所述的药物组合物，其为溶液制剂、冷冻制剂或冷冻干燥制剂。
[19]一种含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物的制造方法，其包括：
(a)制造并配合标记部-抗人抗体Fab片段复合物的步骤；
(b)配合柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂的步骤；
(c)配合蔗糖或甘油作为稳定剂的步骤；
(d)配合非离子型表面活性剂的步骤；和
(e)将pH调节到6.5～7.5的步骤。
[20]一种稳定地保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物的方法，其包括：
(a)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中配合柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂的步骤；
(b)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中配合蔗糖或甘油作为稳定剂的步骤；
(c)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中配合非离子型表面活性剂的步骤；和
(d)将含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液的pH调节到6.5～7.5的步骤。
发明效果
本发明的药物组合物能够抑制保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物时多聚体、不溶性微粒的产生，并且还能够抑制金属放射性同位素向配体的配位效率的下降和荧光色素的褪色，因此在储藏、运输和使用时的稳定性方面有用。另外，本发明的药物组合物是从稳定性的角度出发而使用了药学上可接受的缓冲剂、药品添加物的药物组合物，在给药于人时的安全性方面也有用。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明，但是本发明不受这些说明限定。只要本说明书中没有特别进行定义，则本发明中关联使用的科学术语和技术术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
1.药物组合物
一个方式中，本发明涉及一种药物组合物，其为含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物、缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂并且pH为6.5～7.5的药物组合物，上述缓冲剂包含柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷，上述稳定剂包含蔗糖或甘油。通过制成上述药物组合物，能够抑制保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物时多聚体、不溶性微粒的产生，并且还能够抑制金属放射性同位素向配体的配位效率的下降、荧光色素的褪色。因此，本发明的药物组合物能够抑制标记部-抗人抗体Fab片段复合物在储藏、运输和使用时的凝集等。
1-1.抗人抗体Fab片段
抗体分子的基本结构对于各类型而言是共同的，由分子量5万～7万的重链和2～3万的轻链构成。重链通常由含有约440个氨基酸的多肽链构成，每一类型具有特征性结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE相对应地被称为γ、μ、α、δ、ε链。并且，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分别被称为γ1、γ2、γ3、γ4。轻链通常由含有约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L型和K型这两种，分别被称为λ、κ链。就作为抗体分子的基本结构的肽构成而言，分别相同的2条重链和2条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键键合，分子量为15万～19万。两种轻链与任何重链都能配对。各抗体分子通常由相同的2条轻链和相同的2条重链形成。
重链中有四个(μ、ε链中为五个)链内S-S键，轻链中有两个链内S-S键，每100～110个氨基酸残基形成一个环，其立体结构在各环之间是类似的，被称为结构单元或结构域。不论重链还是轻链，位于N末端侧的结构域即使在来自于同种动物的同一类型(亚型)的标本中其氨基酸序列也不恒定，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。与此相对地，C末端侧的氨基酸序列在各类型或亚型中基本恒定，被称为恒定区，各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL。
抗体与抗原的结合的特异性取决于由重链可变区和轻链可变区构成的部分氨基酸序列。另一方面，与补体、各种细胞结合之类的生物学活性反映了各类型Ig的恒定区的结构差异。已知重链和轻链的可变区的可变性基本受重链和轻链中均存在的3个小的高变区限制，将这些区域称为互补决定区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余部分被称为框架区(FR)，相对恒定。
处于抗体的重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间的区域被称为铰链区，该区域含有较多的脯氨酸残基，含有用于连接2条重链的多个链间S-S键。例如，在人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各铰链区中，分别含有构成重链间的S-S键的2个、4个、11个、2个半胱氨酸残基。铰链区为对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白水解酶的敏感性高的区域。在用木瓜蛋白酶消化抗体时，重链在比铰链区的重链间S-S键更靠N末端侧的位置被切断，被分解为2个Fab片段和1个Fc片段。Fab片段由轻链以及含有重链可变区、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成。Fab片段含有可变区，具有抗原结合活性。
在一个方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人抗体Fab片段为抗人CEACAM5抗体Fab片段。另外，在一个方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人抗体Fab片段为抗人MUC1抗体Fab片段。
1-1-1.抗人CEACAM5抗体Fab片段
CEACAM5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，癌胚抗原相关细胞粘附分子5)为肿瘤标志物之一，在正常组织中几乎观察不到表达，但在胎儿的消化道、大肠癌中表达(BBA；1990；1032：177-189、Mol.Pathol.；1999；52：174-178)。另外，已知CEACAM5在乳腺癌等中也表达(Diagn.Cytopathol.；1993；9：377-382、CancerRes.；1990；50：6987-6994、Histopathology；2000；37：530-535)。另外，大肠癌患者与健康人相比，血中CEACAM5的浓度高(J.Exp.Med.；1965；121：439-462)，CEACAM5已被作为肿瘤标志物使用。在大肠癌患者的组织学研究中，CEACAM5在90％以上的组织中高表达(BritishJ.Cancer；2013；108：662-667)。
本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段含有具有以下特征的Fab片段：含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段。
作为本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链恒定区，Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等的任一恒定区均可选择。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
作为本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链恒定区，Igλ或Igκ的任一恒定区均可选择。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为以下的Fab片段：含有由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段。
已知：使含有Fab片段的抗体在细胞中表达时，抗体会在翻译后受到修饰。作为翻译后修饰的例子，可列举重链C末端的赖氨酸被羧肽酶切断、重链和轻链N末端的谷氨酰胺或谷氨酸通过焦谷氨酰化而被修饰为焦谷氨酸、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等，已知各种抗体会发生这样的翻译后修饰(J.Pharm.Sci.；2008；97：2426-2447)。
本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段中还可含有通过翻译后修饰而产生的Fab片段。作为可通过翻译后修饰而产生的、本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的例子，可列举重链N末端被焦谷氨酰化的抗人CEACAM5抗体Fab片段。本领域中已知这类基于N末端的焦谷氨酰化的翻译后修饰不会给抗体活性造成显著影响(Anal.Biochem.；2006；348：24-39)。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段。
在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为具有下述特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：含有由序列号2所示的氨基酸序列构成并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段。
本发明的药物组合物还含有具有以下特征的抗人CEACAM5抗体Fab片段：一种含有重链片段和轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段，所述重链片段包含含有由序列号2的氨基酸编号31～35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸编号50～66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号2的氨基酸编号99～110的氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区，所述轻链包含含有由序列号4的氨基酸编号24～38的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸编号54～60的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号4的氨基酸编号93～101的氨基酸序列构成的CDR3的轻链可变区。
本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段与人CEACAM5结合。作为测定所得到的抗人CEACAM5抗体Fab片段对人CEACAM5的结合活性的方法，有利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance；SPR)法的分析、ELISA等方法。例如，在使用利用SPR法的分析时，可以使用Biacore T200(GE Healthcare Japan公司)，在传感器芯片上固相化Biotin CAPture Kit(生物素捕获试剂盒，GE Healthcare Japan公司)和生物素化的人CEACAM5，添加连续稀释后的Fab片段，由此测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)。
本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段对于本领域技术人员来说可以基于本说明书公开的、本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段和轻链的序列信息使用该领域中公知的方法容易地制作。虽然没有特别限定，但本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段例如可以按照后述的“4-4.抗人抗体Fab片段的制造方法”中记载的方法来制造。
1-1-2.抗人MUC1抗体Fab片段
黏蛋白1(Mucin1：MUC1)是在构成乳腺、气管和消化道等的上皮组织的上皮细胞的内腔侧表达的膜结合型糖蛋白(Nat.Rev.Cancer；2004Jan；4(1)：45-60)。MUC1在乳腺癌、大肠癌等的癌细胞中过表达(Mod.Pathol.；2005Oct；18(10)：1295-1304、Int.J.Oncol.；2000Jan；16(1)：55-64)，MUC1作为用于检测癌病灶的靶分子有用(Nat.Rev.Cancer；2004Jan；4(1)：45-60、Pathol.Res.Pract.；2010Aug15；206(8)：585-589.)。
本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段为具有以下特征的Fab片段：含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段为含有包含由序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
作为本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的重链恒定区，Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4等的任一恒定区均可选择。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的重链恒定区为人Igγ1恒定区。
作为本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链恒定区，Igλ或Igκ的任一恒定区均可选择。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段为以下的Fab片段：含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段为含有由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段。
如上所述，已知：使含有Fab片段的抗体在细胞中表达时，抗体会在翻译后受到修饰。因此，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段还可含有通过翻译后修饰而产生的Fab片段。作为可通过翻译后修饰而产生的、本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的例子，可列举重链N末端被焦谷氨酰化的抗人MUC1抗体Fab片段。如上所述，本领域中已知这类基于N末端的焦谷氨酰化的翻译后修饰不会给抗体活性造成影响。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成并且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：含有包含由序列号14所示的氨基酸序列构成并且序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：含有包含由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成并且序列号6或序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中所含的抗MUC1抗体Fab片段为具有下述特征的抗人MUC1抗体Fab片段：含有由序列号8所示的氨基酸序列构成并且序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段与人癌特异性MUC1结合。作为测定所得到的抗人MUC1抗体Fab片段对人癌特异性MUC1的结合活性的方法，有ELISA、FACS等方法。例如，在使用ELISA的情况下，将人癌特异性MUC1阳性细胞(例如T-47D细胞)固定于ELISA平板，对其添加Fab片段而进行反应后，使被辣根过氧化物酶等标记的抗Igκ抗体等反应，之后使用检测其活性的试剂(例如，在用辣根过氧化物酶标记时，为化学发光辣根过氧化物酶底物)等进行活性测定，由此鉴定第二抗体的结合。
本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段对于本领域技术人员来说可以基于本说明书公开的、本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段和轻链的序列信息使用该领域中公知的方法容易地制作。虽然没有特别限定，但是本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段例如可以按照后述的“4-4.抗人抗体Fab片段的制造方法”中记载的方法来制造。
1-2.标记部
1-2-1.含有配体的标记部
作为一个实施方式，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物是标记部为配体和接头的复合物。需要说明的是，本说明书中，“配体”是指在复合物中能够与金属形成螯合物的部分，表示由螯合剂构成的基团。另外，“构成的基团”是指从螯合剂中除去质子而具有结合键的基团，“螯合剂”是指能够与金属形成配位键的化合物。
作为一个实施方式，在本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中的标记部为配体和接头时，作为构成配体的螯合剂，可列举铁载体和非铁载体。作为另一个方式，可列举MAG3(巯基乙酰基-甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸、CAS号：66516-09-4)及其公知的反应性衍生物。作为铁载体，可列举异羟肟酸型、儿茶酚型、或混合配体型。作为异羟肟酸型铁载体，可列举例如铁色素(ferrichrome)、下式：
所示的去铁胺(DFO)、镰孢氨酸C(fusarinine C)、鸟氨酸菌素(ornibactin)、红酵母酸(rhodotorulic acid)、和这些的公知的反应性衍生物。作为儿茶酚型铁载体，可列举例如肠杆菌素(enterobactin)、嗜铁素(bacillibactin)、弧菌素(vibriobactin)、和这些的公知的反应性衍生物。作为混合配体型铁载体，可列举例如固氮菌素(azotobactin)、脓菌素(pyoverdine)、耶尔森杆菌素(yersiniabactin)、和这些的公知的反应性衍生物。需要说明的是，在上述铁载体的情况下，DFO可以介由作为其反应性官能团的-NH2与接头或Fab片段反应，DFO以外的铁载体的情况下，也可以介由羧基、羟基、氨基等反应性官能团通过本领域技术人员通常使用的方法与接头或Fab片段反应。
作为非铁载体，可列举DTPA(二亚乙基三胺五乙酸、CAS号：67-43-6)、DTPA-BMA(1，7-双(甲基氨甲酰基甲基)-1，4，7-三氮杂庚烷-1，4，7-三乙酸、CAS号：119895-95-3)、EOB-DTPA(乙氧基苄基DTPA、2-[[(2S)-2-[双(羧甲基)氨基]-3-(4-乙氧基苯基)丙基]-[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙酸)、TTHA(三亚乙基四胺六乙酸、CAS号：869-52-3)、DO3A(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸、CAS号：217973-03-0)、HP-DO3A(10-(2-羟丙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸、CAS号：120041-08-9)、DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸、CAS号：60239-18-1)、和这些的公知的反应性衍生物。
本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，标记部为配体和接头时，构成配体的“螯合剂”优选为DFO。
“接头”是指使抗人抗体Fab片段与配体之间产生距离的基团。作为一个实施方式，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，标记部为配体和接头时，作为使抗人抗体Fab片段与配体之间产生距离的接头，可列举下式：
(以下表述为-C(＝S)-NH-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝S)-)、-CH2-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝S)-、-C(＝O)-(C1-20亚烷基)-C(＝O)-。在此，“C1-20亚烷基”是指直链或支链的碳原子数1～20的亚烷基。作为C1-20亚烷基的一个方式，可列举C1-10亚烷基、C1-2亚烷基。作为C1-20亚烷基的一个方式，可列举亚乙基。作为可以用于形成接头的试剂，可列举HO-C(＝O)-(C1-20亚烷基)-C(＝O)-OH、琥珀酸、对亚苯基二异硫氰酸酯等。
本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，标记部为配体和接头时，“接头”优选为-C(＝S)-NH-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝S)-。
本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，标记部为配体和接头时，可以通过使形成配体的螯合剂与使抗人抗体Fab片段和接头反应而得到的物质进行反应而制造。也可以通过使抗人抗体Fab片段与使接头和形成配体的螯合剂反应而得到的物质进行反应来制造。作为反应例，可列举使螯合剂的氨基和接头反应所得到的物质与抗人抗体Fab片段的1个以上氨基(例如N末端氨基、赖氨酸侧链的氨基)进行反应。在标记部为配体时，也可以使抗人抗体Fab片段与形成配体的螯合剂进行反应来制造。作为反应例，可列举使螯合剂与抗人抗体Fab片段的1个以上氨基(例如N末端氨基、赖氨酸侧链的氨基)进行反应。在制造本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物时，可以使用向胺中加入异硫氰酸酯来合成硫脲的反应、向胺中加入羧酸来合成酰胺的反应等。该反应可以通过使用本领域技术人员公知的方法来进行。需要说明的是，作为原料，也可以使用预先使配体和接头键合而成的化合物。作为配体和接头键合而成的化合物的例子，可列举下式所示的p-SCN-Bn-DFO(对异硫氰基苯基氨基硫代羰基取代的DFO、CAS号：1222468-90-7)：
对异硫氰基苄基取代的DTPA(p-SCN-Bn-DTPA、CAS号：102650-30-6)、对异硫氰基苄基取代的DOTA(p-SCN-Bn-DOTA、CAS号：127985-74-4)、和p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA([(R)-2-氨基-3-(4-异硫氰酸根合苯基)丙基]-反式-(S，S)-环己烷-1，2-二胺-五乙酸、CAS号：157380-45-5)。
作为一个实施方式，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物是标记部为下式(I)所示的配体和接头的复合物。
式中，波浪线表示与抗人抗体Fab片段键合，在此，抗人抗体Fab片段通过抗人抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子键合。
如上所述，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，标记部为配体和接头时，构成配体的螯合剂可与金属放射性同位素形成螯合物。本说明书中，金属放射性同位素例如是指用于PET示踪剂等的金属放射性同位素，可列举89Zr、51Mn、52Fe、60Cu、67Ga、68Ga、72As、99mTc、或111In等，优选为89Zr。即，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物可以为不含金属放射性同位素的类型，也可以为含有89Zr作为金属放射性同位素的类型。
另外，作为提供本发明的药物组合物时的形态，可以以不含金属放射性同位素的形态来提供并且在即将使用前用金属放射性同位素进行标记而使用，也可以以含有金属放射性同位素的用于诊断的药物组合物形态来提供。例如，在使用半衰期短的金属放射性同位素(例如89Zr(半衰期3.3天))的情况下，优选以不含金属放射性同位素的形态提供并且在即将使用前用金属放射性同位素进行标记。
1-2-2.含有荧光色素的标记部
作为一个实施方式，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，标记部为荧光色素时，作为荧光色素，可以使用通常用于光成像的在近红外波长(650～1000nm)处具有极大吸收和极大发光的色素。作为荧光色素的一个方式，可列举花青或吲哚花青化合物。作为一个方式，可列举IRDye800CW(LI-COR公司)、Cy(Molecular Probe公司)、Alexa Fluor、BODIPY、和DyLight(Thermo Fisher Scientific公司)、CF790(Biotium公司)、DY(DYOMICS GMBH公司)、HiLyte Fluor680、和HiLyte Fluor750(Anaspec公司)、PULSAR650、和QUASAR670(Biosearch Technologies公司)等。
本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，标记部为荧光色素时，荧光色素优选为下式所示的IRDye800CW(LI-COR Biosciences公司)。
需要说明的是，上述的荧光色素可以介由其羧基、羟基、氨基等或通过本领域技术人员通常使用的方法导入活化基团后与抗人抗体Fab片段或结合于抗人抗体Fab片段的接头进行反应。作为导入有活化基团的荧光色素的一个方式，可列举用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基酯化的荧光色素。例如，IRDye800CW的NHS酯有市售，可利用这些。
作为一个实施方式，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物是标记部为下式(II)所示的荧光色素的复合物。
式中，波浪线表示与抗人抗体Fab片段键合，在此，抗人抗体Fab片段通过抗人抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝O)的碳原子键合。
药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物中，抗人抗体Fab片段与标记部的键合可通过公知的方法由本领域技术人员适当地进行。例如，可以使标记部与抗人抗体Fab片段的1个以上氨基(例如N末端氨基、氨基酸侧链的氨基)、1个以上硫醇基(例如氨基酸侧链的硫醇基)、或1个以上羧基(例如C末端、氨基酸的侧链的羧基)键合。作为一个方式，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物是标记部与抗人抗体Fab片段的1个以上氨基键合的复合物。
1-3.标记部-抗人抗体Fab片段复合物
本发明的药物组合物含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物。一个方式中，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物为标记部-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物，其中，抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段；以及
(b)含有包含由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段，
上述标记部为下式(I)所示的基团，
[式中，波浪线表示表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段键合，在此，抗人CEACAM5抗体Fab片段通过抗人CEACAM5抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子键合]。
在一个方式中，标记部-抗人抗体Fab片段复合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人CEACAM5抗体Fab片段。
另外，在一个方式中，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物是标记部-抗人MUC1抗体Fab片段复合物，其中，上述抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成并且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段，
上述标记部为下式(I)所示的基团，
[式中，波浪线表示表示与抗人MUC1抗体Fab片段键合，在此，抗人MUC1抗体Fab片段通过抗人MUC1抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子键合]。
一个方式中，标记部-抗人抗体Fab片段复合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成并且序列号6或序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
另外，在一个方式中，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物为标记部-抗人MUC1抗体Fab片段复合物，其中，上述抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成并且序列号12或序列号14的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链可变区的重链片段和包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段，
上述标记部为下式(II)所示的基团，
[式中，波浪线表示与抗人MUC1抗体Fab片段键合，在此，抗人MUC1抗体Fab片段通过抗人MUC1抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝O)的碳原子键合]。
在一个方式中，标记部-抗人抗体Fab片段复合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人MUC1抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成并且序列号6或序列号8的氨基酸编号1的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的、抗人MUC1抗体Fab片段。
本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物为在抗人CEACAM5抗体Fab片段上键合有1个以上标记部的复合物。本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的一个方式为键合有1～25个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有1～23个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有1～16个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有1～11个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有1～10个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有1～9个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有4～23个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有4～16个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有4～10个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有4～9个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有3～23个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有3～16个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有3～10个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段，一个方式为键合有3～9个标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段。作为一个方式，为还含有金属的键合有1个以上标记部的抗人CEACAM5抗体Fab片段。
本发明的药物组合物中所含的复合物为含有1个以上标记部和抗人MUC1抗体Fab片段的复合物。一个方式为键合有1～27个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段，一个方式为键合有1～23个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段，一个方式为键合有1～15个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段，一个方式为键合有1～11个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段，一个方式为键合有1～9个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段，一个方式为键合有1～7个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段，一个方式为键合有1～5个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段，进而，一个方式为键合有1～4个标记部的抗人MUC1抗体Fab片段。作为一个方式，为还含有金属的键合有1个以上标记部的抗人MUC1抗体Fab片段。
需要说明的是，只要没有特别记载，则本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物还含有游离体及其盐。在此，“其盐”是指：根据该复合物的取代基的种类而有酸加成盐或形成与碱的盐的情况，是该化合物和复合物所能够形成的盐。具体而言，可列举与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、苦杏仁酸、酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二(甲苯甲酰)酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐，与钠、钾、镁、钙、铝等无机碱、甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸等有机碱的盐，与乙酰基亮氨酸等各种氨基酸和氨基酸衍生物的盐和铵盐等。例如，DFO可以以去铁胺甲磺酸盐形式存在，也可以以其它盐形式存在。
本发明的药物组合物中的标记部-抗人抗体Fab片段复合物的浓度只要为诊断上或治疗上有效地发挥作用的量就没有特别限制，优选为1～100mg/mL，更优选为5～20mg/mL。
1-4.缓冲剂
从使pH维持在后述范围、抑制给金属放射性同位素向配体的配位效率造成的影响的观点出发，本发明的药物组合物中的缓冲剂可以使用柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、或三羟甲基氨基甲烷。另外，本发明的药物组合物中的缓冲剂的浓度根据缓冲剂的种类和目标pH而改变，优选为10～30mmol/L。
在一个方式中，本发明的药物组合物中的缓冲剂为柠檬酸，其浓度为10～30mmol/L、优选为15～25mmol/L。另外，在一个方式中，本发明的药物组合物中的缓冲剂为磷酸，其浓度为10～30mmol/L、优选为15～25mmol/L。
1-5.稳定剂
从抑制因保存时的热应力、光应力或振荡应力等而引起的多聚体、酸性电荷变体(acidic charge variants)或不溶性微粒的产生、而且还抑制金属放射性同位素向配体的配位效率的下降、荧光色素的褪色的观点出发，本发明的药物组合物中的稳定剂可以使用蔗糖或甘油。另外，本发明的药物组合物中的稳定剂的浓度根据所使用的稳定剂的种类而改变，优选为5～30w/v％。
在一个方式中，本发明的药物组合物中的稳定剂为蔗糖，其浓度为5～30w/v％、优选为15～25w/v％。另外，在一个方式中，本发明的药物组合物中的缓冲剂为甘油，其浓度为5～30w/v％、优选为15～25w/v％。
1-6.非离子型表面活性剂
本发明的药物组合物中可以使用非离子型表面活性剂。本发明的药物组合物中，从抑制不溶性微粒的产生而且还抑制金属放射性同位素向配体的配位效率的下降、荧光色素的褪色的观点出发，非离子型表面活性剂可以使用聚山梨酯80、聚山梨酯20、聚山梨酯60、泊洛沙姆188。需要说明的是，聚山梨酯80也被称为聚氧乙烯(20)失水山梨醇油酸酯，为失水山梨醇的部分羟基被油酸酯化而成的多乙氧基醚，具有约20摩尔的氧亚乙基相对于1摩尔单油酸失水山梨醇形成醚键的结构。另外，本发明的药物组合物中的非离子型表面活性剂的浓度根据其种类而改变，优选为0.02～0.2w/v％。
在一个方式中，本发明的药物组合物中的非离子型表面活性剂为聚山梨酯80，其浓度为0.02～0.2w/v％、优选为0.04～0.1w/v％。
1-7.pH
从抑制因保存时的热应力、光应力或振荡应力等而引起的多聚体、酸性电荷变体或不溶性微粒的产生、而且还抑制金属放射性同位素向配体的配位效率下降、荧光色素褪色的观点出发，本发明的药物组合物的pH为6.5～7.5，更优选为6.5～7.0。
在一个方式中，本发明的药物组合物优选含有5～20mg/mL的浓度的上述抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物或抗人MUC1抗体Fab片段作为标记部-抗人抗体Fab片段复合物，含有15～25mmol/L的柠檬酸作为缓冲剂，含有15～25w/v％的蔗糖作为稳定剂，含有0.04～0.1w/v％的聚山梨酯80作为非离子型表面活性剂，且pH为6.5～7.0。
1-8.用于诊断的药物组合物
在一个方式中，本发明涉及含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的、用于诊断的药物组合物。本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物含有配体作为标记部的情况下，通过使金属放射性同位素(例如89Zr)进行配位而成为可检测的复合物。另外，本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物含有荧光色素作为标记部的情况下，该复合物为可检测的复合物。这些可检测的复合物能够作为早期诊断药、发病期诊断药或术中诊断药(特别是癌症诊断药)来利用。术中诊断药是指：在外科手术、内窥镜手术等手术中能够确定病变部并检查其性质的诊断药。在将本发明的用于诊断的药物组合物作为术中诊断药使用时，该用于诊断的药物组合物例如可在手术前2～32小时给药于患者，作为一个方式，可在手术前6～24小时给药于患者，另外，作为另一个方式，可在手术前2小时给药于患者。
早期诊断药是指以在未观察到病情或疾病分期较早的阶段进行诊断为目的的诊断药。例如对于癌症而言，是指在未观察到病情或者疾病分期为0或疾病分期为1的阶段使用的诊断药。
发病期诊断药是指能够检查病情发展到何种程度的诊断药。例如对于癌症而言，是指能够检测其疾病分期的诊断药。
本发明的药物组合物含有标记部-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的情况下，能够用于表达人CEACAM5的癌症的诊断。在一个方式中，在本发明的药物组合物含有标记部-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的情况下，优选用于大肠癌、乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、或这些转移后的癌症的诊断，特别优选用于大肠癌或大肠癌转移后的癌症的诊断。大肠癌转移后的癌症没有特别限定，可列举例如转移性肝癌。
本发明的药物组合物含有标记部-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的情况下，能够用于表达人MUC1的癌症的诊断。在一个方式中，在本发明的药物组合物含有标记部-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的情况下，能够用于乳腺癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、皮肤癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、或宫颈癌的诊断，特别优选用于乳腺癌或膀胱癌的诊断。
1-9.药物组合物的剂型和添加物
本发明的药物组合物的剂型没有特别限定，在一个方式中为液体制剂、冷冻制剂、或冷冻干燥制剂。另外，本发明的药物组合物可以制成例如注射剂、滴注剂等非经口剂使用，优选通过静脉内注射、对靶标局部的肌肉内注射、或者皮下注射等进行给药。本发明的药物组合物中的可检测的标记部-抗人抗体Fab片段复合物的用量根据患者的年龄、体重、所使用的制剂的剂型、或Fab片段的结合效价等而不同，例如，以患者的每单位体重的Fab片段的质量基准计，可以使用0.001mg/kg至100mg/kg左右。
本发明的药物组合物中，可以根据期望适当添加悬浮剂、增溶剂、等渗剂、防腐剂、防吸附剂、赋形剂、舒缓剂、含硫还原剂、抗氧化剂等药品添加物。
作为悬浮剂，可列举例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、黄芪胶粉末、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯等。
作为增溶剂，可列举例如聚氧乙烯氢化蓖麻油、烟酰胺、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。
作为等渗剂，可列举例如氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
作为防腐剂，可列举例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚、苯甲醇等。
作为防吸附剂，可列举例如人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷/环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇等。
作为赋形剂，可列举例如木糖醇等。
作为舒缓剂，可列举例如肌醇、利多卡因等。
作为含硫还原剂，可列举例如N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基高半胱氨酸、硫辛酸、硫代二乙二醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、碳原子数1～7的硫代链烷酸等具有硫氢基(sulfhydryl)的物质等。
作为抗氧化剂，可列举例如异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯、或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。
2.用于诊断的药物组合物的应用和诊断方法
本发明还涉及标记部-抗人抗体Fab片段复合物在制造用于癌的早期诊断的药物组合物、用于发病期诊断的药物组合物或用于术中诊断的药物组合物中的应用。在一个方式中，本发明为用于癌症的早期诊断、发病期诊断或术中诊断的、含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物。
本发明还涉及一种癌症的诊断方法，其包括在手术前或手术中将含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物给药于对象。在此，“对象”是指需要接受该诊断的人或其它哺乳动物，作为一个方式，为需要接受该诊断的人。上述诊断方法中的含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的本发明的药物组合物的有效量根据患者的年龄、体重、所使用的制剂的剂型、或Fab片段的结合效价等而不同，例如以患者的每单位体重的Fab片段的质量基准计，可以使用0.001mg/kg至100mg/kg左右。在上述诊断方法中，含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的本发明的药物组合物优选通过对靶组织局部的肌肉内注射、或皮下注射等进行给药。在上述诊断方法中，在手术前给药本发明的药物组合物时，例如在手术前2～48小时、一个方式为手术前6～24小时、另一个方式为手术前2小时将该复合物给药于患者。
在另一个实施方式中，本发明还涉及标记部-抗人抗体Fab片段复合物的用于制造本发明的药物组合物的应用。
3.含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物的制造方法、稳定地保存标 记部-抗人抗体Fab片段复合物的方法
在一个方式中，本发明涉及含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物的制造方法。具体而言，在一个方式中，本发明涉及含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物的制造方法，其包括：(a)制造并配合标记部-抗人抗体Fab片段复合物的步骤；(b)配合柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂的步骤；(c)配合蔗糖或甘油作为稳定剂的步骤；(d)配合聚山梨酯80作为非离子型表面活性剂的步骤；和(e)将pH调节到6.5～7.5的步骤。需要说明的是，配合的顺序没有特别限定。
另外，在一个方式中，本发明涉及稳定地保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物的方法。本说明书中“稳定地保存”是指抑制保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物时多聚体、不溶性微粒的产生。另外，在一个方式中，本说明书中“稳定地保存”为还包括抑制金属放射性同位素向配体的配位效率的下降、荧光色素的褪色的概念。具体而言，在一个方式中，本发明为稳定地保存标记部-抗人抗体Fab片段复合物的方法，其包括：(a)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中配合柠檬酸、磷酸、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸或三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂的步骤；(b)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中配合蔗糖或甘油作为稳定剂的步骤；(c)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中配合聚山梨酯80作为非离子型表面活性剂的步骤；和(d)将含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液的pH调节到6.5～7.5的步骤。需要说明的是，配合的顺序没有特别限定。
在上述的制造方法和稳定地保存的方法中，抗人抗体Fab片段、标记部的结构、标记部-抗人抗体Fab片段复合物的结构等如上述的“1.药物组合物”的项目中所记载。另外，缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂的浓度范围、pH的范围等也如上述的“1.药物组合物”的项目中所记载。另外，上述步骤可以以任意顺序进行。
另外，在上述的制造方法和方法中，在标记部-抗人抗体Fab片段复合物含有配体作为标记部的情况下，一个方式中可以包括使金属放射性同位素进行配位的步骤。需要说明的是，金属放射性同位素的种类等也如上述的“1.药物组合物”的项目中所记载。
进一步地，在上述的制造方法和方法中，一个方式中可包括进行冷冻的步骤、进行冷冻干燥的步骤。需要说明的是，冷冻方法、冷冻干燥方法可以使用公知的方法。
4.标记部-抗人抗体Fab片段复合物的制造方法
4-1.编码抗人抗体Fab片段的多核苷酸
在本发明的药物组合物中所含的复合物含有抗人CEACAM5抗体Fab片段的情况下，在一个方式中，编码抗人抗体Fab片段的多核苷酸含有：包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，编码上述该抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸为：含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或含有编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为含有编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号1的碱基号1～363的碱基序列的多核苷酸。另外，作为包含编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号3的碱基号1～336的碱基序列的多核苷酸。
在优选的实施方式中，编码上述该抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸为：包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸；或者包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸。作为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号3所示的碱基序列的多核苷酸。
在本发明的药物组合物中所含的复合物含有抗人MUC1抗体Fab片段的情况下，在一个方式中，编码抗人抗体Fab片段的多核苷酸含有：包含编码该抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸。
在一个方式中，编码上述该抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸为：含有编码包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或含有编码包含由序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸。
作为含有编码包含由序列号12所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号11所示的碱基序列的多核苷酸。作为含有编码包含由序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸序列号，可列举例如包含序列号13所示的碱基序列的多核苷酸。
在优选的实施方式中，编码上述该抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸为：包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸、或包含编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号5所示的碱基序列的多核苷酸。作为包含编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号7所示的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，编码上述该抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸为：包含编码包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号15所示的碱基序列的多核苷酸。
在优选的实施方式中，编码上述该抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸为：包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。
作为包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸，可列举例如包含序列号9所示的碱基序列的多核苷酸。
编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸能够基于依据上述抗人CEACAM5抗体Fab片段或上述抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段和轻链的氨基酸序列设计的碱基序列、并且利用该技术领域中公知的基因合成方法来合成。作为这样的基因合成方法，可使用国际公开第90/07861号中记载的抗体基因的合成方法等本领域技术人员公知的各种方法。
4-2.编码抗人抗体Fab片段的多核苷酸的表达载体
编码本发明的药物组合物中所含的复合物中的抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸的表达载体包括：含有包含编码上述抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码上述抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码上述抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
作为优选的表达载体，包括：含有包含下述碱基序列的多核苷酸的表达载体，所述碱基序列编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段；含有包含下述碱基序列的多核苷酸的表达载体，所述碱基序列编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链；以及含有下述多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸为包含编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸、和包含编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸。
更优选的编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的表达载体包括：含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
编码本发明的药物组合物中所含的复合物中的抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸的表达载体包括：含有包含编码上述抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码上述抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码上述抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码上述抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
优选的表达载体包括：含有包含编码由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
更优选的表达载体包括：含有包含编码由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及含有包含编码由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
这些表达载体只要能够在原核细胞和/或真核细胞之类的各种宿主细胞中产生由上述多核苷酸编码的多肽就没有特别限制。作为这样的表达载体，可列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等，可以优选使用pEE6.4、pEE12.4(Lonza公司)。
这些表达载体可含有启动子，所述启动子以能够发挥功能的方式连接于编码本发明的药物组合物中所含的抗人抗Fab片段的多核苷酸的编码重链片段和/或轻链的基因。作为用于在宿主细胞中表达本发明的药物组合物中所含的Fab片段的启动子，在宿主细胞为埃希氏菌属菌的情况下，可列举例如Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、tac启动子等。作为酵母中的表达用启动子，可列举例如PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等，作为芽孢杆菌属菌中的表达用启动子，可列举SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞时，可列举CMV、RSV、SV40等病毒来源的启动子、逆转录病毒的启动子、肌动蛋白启动子、EF(elongation factor，延伸因子)1α启动子、热休克启动子等。
在使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，这些表达载体可以进一步含有起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制单元。另一方面，在使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情况下，编码本发明的药物组合物中所含的抗人抗Fab片段的表达载体可含有起始密码子和终止密码子。另外，在这种情况下，可以含有增强子序列、编码本发明的药物组合物中所含的重链片段和/或轻链的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接接合部、聚腺苷酸化位点、或可复制单元等。另外，根据目的，可以含有通常使用的选择标志物(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
4-3.用表达载体转化的宿主细胞
用编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸的上述表达载体转化的宿主细胞包括用选自由以下的(a)～(d)组成的组中的表达载体转化而得到的宿主细胞。
(a)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(b)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(c)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；以及
(d)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人CEACAM5抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞。
在一个实施方式中，用编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸的上述表达载体转化而得到的宿主细胞为选自由以下的(a)～(d)组成的组中的宿主细胞：
(a)用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(b)用含有包含编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(c)用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；以及
(d)用含有包含编码包含由序列号2的氨基酸编号1～121所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码包含由序列号4的氨基酸编号1～112所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞。
在一个实施方式中，用编码抗人CEACAM5抗体Fab片段的多核苷酸的上述表达载体转化而得到的宿主细胞为选自由以下的(a)～(d)组成的组中的宿主细胞：
(a)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(b)用含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(c)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；以及
(d)用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞。
另外，用编码抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸的上述表达载体转化而得到的宿主细胞包括用选自由以下的(a)～(d)组成的组中的表达载体转化而得到的宿主细胞。
(a)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(b)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(c)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；以及
(d)用含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码本发明的药物组合物中所含的抗人MUC1抗体Fab片段的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞。
在一个实施方式中，用编码抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸的上述表达载体转化而得到的宿主细胞为选自由以下的(a)～(d)组成的组中的宿主细胞：
(a)用含有下述多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞，所述多核苷酸包含编码包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列；
(b)用含有下述多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞，所述多核苷酸包含编码包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列；
(c)用含有下述多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞，所述多核苷酸为包含编码包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及
(d)用下述两种表达载体转化而得到的宿主细胞，所述两种表达载体分别含有：包含编码包含由序列号12或序列号14所示的氨基酸序列构成的重链可变区的重链片段的碱基序列的多核苷酸、和包含编码包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的轻链可变区的轻链的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，用编码抗人MUC1抗体Fab片段的多核苷酸的上述表达载体转化而得到的宿主细胞为选自由以下的(a)～(d)组成的组中的宿主细胞：
(a)用含有包含编码由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(b)用含有包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；
(c)用含有包含编码由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸和包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞；以及
(d)用含有包含编码由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列构成的重链片段的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化而得到的宿主细胞。
作为所要转化的宿主细胞，只要适合于所使用的表达载体、用该表达载体转化后能够表达Fab片段就没有特别限定，可例示本发明所属的技术领域通常使用的天然细胞或人工构建的细胞等各种细胞(例如细菌(埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌)、酵母(酵母菌属、毕赤酵母属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如Sf9)等)、哺乳动物细胞株(例如CHOK1SV细胞、CHO-DG44细胞、293细胞等培养细胞)。转化本身可通过例如磷酸钙法、电穿孔法等公知的方法来进行。
4-4.抗人抗体Fab片段的制造方法
上述抗人抗体Fab片段的制造方法、优选抗人CEACAM5抗体Fab片段或抗人MUC1抗体Fab片段的制造方法包括如下步骤：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段。
在抗人抗体Fab片段的制造方法中，转化后的宿主细胞可以在营养培养基中进行培养。营养培养基优选含有转化后的宿主细胞生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源之类的营养源。作为碳源，可例示例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可例示例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、大豆粕、马铃薯提取液等。另外，可以根据期望含有其它营养素(例如无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
转化后的宿主细胞的培养本身可通过公知的方法来进行。培养条件、例如温度、培养基的pH和培养时间可适当地进行选择。例如，在宿主为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使用含有约5～20％的胎牛血清的MEM培养基(Science；1952；122：501)、DMEM培养基(Virology；1959；8：396-397)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.；1967；199：519-524)、199培养基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.；1950；73：1-8)等。培养基的pH优选为约6～8，培养通常在约30～40℃下进行约15～336小时，可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可列举例如含有胎牛血清的Grace’s培养基(PNAS；1985；82：8404-8408)等，其pH优选为约5～8。培养通常在约20～40℃下进行15～100小时，可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为细菌、放线菌、酵母、丝状菌时，例如含有上述营养源的液体培养基是合适的。优选pH为5～8的培养基。在宿主为大肠埃希氏杆菌(E.coli)的情况下，作为优选的培养基，可例示LB培养基、M9培养基(Miller等、Exp.Mol.Genet，Cold Spring Harbor Laboratory；1972：431)等。这种情况下，可以根据需要一边进行通气、搅拌一边在通常14～43℃下培养约3～24小时。在宿主为芽孢杆菌属菌的情况下，可以根据需要一边进行通气、搅拌一边在通常30～40℃下培养约16～96小时。在宿主为酵母时，作为培养基，可列举例如Burkholder基本培养基(PNAS；1980；77：4505-4508)，优选pH为5～8。通常在约20～35℃下进行约14～144小时的培养，还可根据需要进行通气、搅拌。
上述抗人抗体Fab片段的制造方法中，可以在对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤的基础上进一步包括对所表达的抗人抗体Fab片段进行回收、优选进行分离、纯化的步骤。作为分离、纯化方法，可列举例如：盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差异的方法；离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法等利用电荷的方法；亲和色谱法等利用特异亲和性的方法；反相高效液体色谱法等利用疏水性差异的方法；等电聚焦电泳法法等利用等电点差异的方法；等。
4-5.标记部-抗人抗体Fab片段复合物的制造方法
本发明的药物组合物中所含的标记部-抗人抗体Fab片段复合物的制造方法包括使上述抗人抗体Fab片段与标记部进行共价键合的步骤。制造该复合物的方法可以包括：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、和使该Fab片段与标记部进行共价键合的步骤。制造该复合物的方法可以包括：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、回收所表达的该Fab片段的步骤、和使该Fab片段与标记部进行共价键合的步骤。所使用的接头、配体、或荧光色素等可以使用“1.药物组合物”的项目中记载的物质。
作为一个方式，制造该复合物的方法为包括下述步骤的方法：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、和使该Fab片段通过接头与配体键合的步骤。作为一个方式，制造该复合物的方法为包括下述步骤的方法：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、回收所表达的该Fab片段的步骤、和使该Fab片段通过接头与配体键合的步骤。
作为一个方式，制造该复合物的方法为包括下述步骤的方法：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、和使该Fab片段i)通过接头与配体键合或ii)与配体直接共价键合的步骤。作为一个方式，制造该复合物的方法为包括下述步骤的方法：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、回收所表达的该Fab片段的步骤、和使该Fab片段i)通过接头与配体键合或ii)与配体直接共价键合步骤。
作为一个方式，制造该复合物的方法为包括下述步骤的方法：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、和使该Fab片段i)通过接头与荧光色素键合或ii)与荧光色素直接共价键合的步骤。作为一个方式，制造该复合物的方法为包括下述步骤的方法：对转化后的上述宿主细胞进行培养而使其表达抗人抗体Fab片段的步骤、回收所表达的该Fab片段的步骤、和使该Fab片段i)通过接头与荧光色素键合或ii)与荧光色素直接共价键合的步骤。
全面地对本发明进行了记载，但是在此提供用于参考而得到进一步的理解的特定实施例。但是，这些是出于例示目的的例子，不对本发明进行限定。
实施例
实验1-1：抗人CEACAM5抗体Fab片段的制作
对于作为小鼠来源的抗人CEACAM5抗体的T84.66，参考文献(ProteinEng.Des.Sel.；2004；17：481-489)中记载的方法而人源化后，使用基于文献(Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics；2014；82：1624-1635)构建的人源化抗体的分子模型，设计具有可预期到即使键合标记部也不会降低亲和性的可变区的抗体。
在上述抗体的重链片段基因(序列号1)的5’侧连接编码信号序列(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(序列号17))的基因，将该重链片段基因插入GS载体pEE6.4(Lonza公司)。另外，在抗体的轻链基因(序列号3)的5’侧连接编码信号序列(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(序列号18))的基因，将该轻链基因插入GS载体pEE12.4(Lonza公司)。将分别插入了抗体的重链片段和轻链的基因的上述的pEE载体用NotI和PvuI进行限制酶切断，使用连接用试剂盒TAKARA Ligation Kit Ver2.1(Takara公司)进行连接，构建插入有重链片段和轻链这两个基因的GS载体。
使用上述插入有重链片段和轻链这两个基因的GS载体，通过瞬时表达和稳定表达这两种方法进行抗体表达。关于瞬时表达，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(ThermoFisher Scientific公司)使上述插入有重链片段和轻链这两个基因的GS载体转染用Expi293表达培养基(Thermo Fisher Scintific公司)以约300万个/mL培养的Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific公司)，培养5～7天。将培养上清用KappaSelect(GEHealthcare Japan公司)纯化，得到Fab片段。关于稳定表达，通过使用Gene Pulser(Bio-Rad公司)的电穿孔法使以PvuI直链化的插入有上述的重链片段和轻链这两个基因的GS载体转染CHOK1SV细胞(Lonza公司)。转染次日添加甲硫氨酸磺酰亚胺，培养5～7天。将细胞播种到含有甲基纤维素的半固体培养基中，在形成集落后用ClonePix FL(MolecularDevices公司)获得Fab片段的表达量多的细胞。将该细胞的培养上清用Capto L(GEHealthcare Japan公司)、Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare Japan公司)、和BioProS75(YMC公司)进行纯化，得到Fab片段。
将编码所制作的抗人CEACAM5抗体Fab片段(称为PB009-1)的重链片段的碱基序列示于序列号1，将其所编码的氨基酸序列示于序列号2，将编码PB009-1的轻链的碱基序列示于序列号3，将其所编码的氨基酸序列示于序列号4。PB009-1的重链可变区由序列号2的氨基酸编号1～121的氨基酸序列构成，重链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号2的氨基酸编号31～35、50～66、99～110的氨基酸序列构成。PB009-1的轻链可变区由序列号4的氨基酸编号1～112的氨基酸序列构成，轻链的CDR1、CDR2、CDR3分别由序列号4的氨基酸编号24～38、54～60、93～101的氨基酸序列构成。
需要说明的是，可变区和CDR序列遵循Kabat编号来确定(Kabat等；1991；Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、United StatesPublicHealth Service、National Institute of Health、Bethesda)。
实验1-2：抗人CEACAM5抗体Fab片段的螯合剂标记化
在作为螯合剂的DFO与抗人CEACAM5抗体Fab片段PB009-1的键合中，使用p-SCN-Bn-DFO(对异硫氰基苯基氨基硫羰基取代的DFO)(Macrocyclics公司)。向用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)制备为1mg/mL的Fab片段溶液中添加1/5量的0.1M碳酸钠溶液(pH9.0)。以使终浓度达到1mg/mL的方式向其中添加p-SCN-Bn-DFO，在37℃下反应1.5小时。反应后，使用Amicon Ultra 3K-0.5mL离心式过滤器(Merck Millipore公司)来纯化通过接头(-C(＝S)-NH-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝S)-)而键合有DFO的DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物(称为PB009-2)。
对于PB009-2，通过质谱法确认由DFO构成的配体的键合数。将PB009-2用MassPREPMicro Desalting Column(Waters公司)脱盐，使用SYNAPT G2质谱仪(Waters公司)实施测定。其结果是，确认到在1个PB009-1上键合有至少3个至10个由DFO构成的配体的分子。
实验1-3：pH对DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的稳定化的影响的研究(对多 聚体的生成和酸性电荷变体的生成的影响)
对于含有PB009-2的液剂，评价pH对PB009-2的稳定化的影响。本试验中，以使PB009-2的最终浓度达到10mg/mL的方式向含有PB009-2的液剂中配合缓冲剂和非离子型表面活性剂，由此制备表1所示的试样A-1～A-6。需要说明的是，通过添加适量的盐酸或氢氧化钠来调节pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表1]
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样正向放置状态下的热稳定性试验。在热稳定性试验中，基于利用尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)测定的多聚体量和利用成像毛细管等电聚焦电泳法法(icIEF法)测定的酸性电荷变体量评价了在25℃保管1周后的PB009-2的稳定性。分析条件如下所述。
[尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)]
SE-HPLC测定中，将G3000SWXL(TOSOH公司)与HPLC系统连接，以0.5mL/分钟的流量流通具有20mmol/L磷酸/400mmol/L氯化钠pH7.0的组成的流动相。试样设为以PB009-2换算计达到50μg的注入量(例：5mg/mL时，为10μL)。柱温设为30℃，试样温度设为5℃，在UV280nm下实施检测。
成像毛细管等电聚焦电泳法法(icIEF法)]
icIEF测定中，将cIEF Cartridge(Protein Simple公司)与iCE3系统连接而进行测定。用由尿素、甲基纤维素、Pharmalyte3-10、pI标志物5.12、pI标志物9.77构成的样品基质188μL与用超纯水将PB009-2浓度稀释为5mg/mL的样品12μL混和，作为测定试样。以1500V实施1分钟预聚焦，以3000V实施6分钟聚焦。
SE-HPLC测定后，通过自动分析法测定检测到的多聚体的面积，求出多聚体的量(％)。关于多聚体量(％)，通过自动分析法测定在SE-HPLC法中检测到的多聚体峰的总面积，除以包括主峰在内的全部峰面积的总和，由此确定百分率(％)。在此，主峰是指活性主体(未多聚体化的PB009-2)的峰。
通过自动分析法来测定用icIEF法检测到的酸性电荷变体的面积，求出酸性电荷变体的量(％)。对于酸性电荷变体量(％)，通过自动分析法测定用icIEF法检测到的酸性电荷变体峰的总面积，除以包括主峰在内的全部峰面积的总和，由此确定百分率(％)。在此，主峰是指活性主体(未变体化的PB009-2)的峰。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法和icIEF法的评价结果示于表2。其结果是，在25℃保管1周后的SE-HPLC多聚体量(％)有pH越低越增加的倾向，在pH7.0附近达到最小。另外，在25℃保管1周后的酸性电荷变体量(％)有pH越低越减少的倾向。对以上结果进行综合判断，确认了：从稳定性的观点出发，含有PB009-2的液剂的最佳pH在7.0附近。
[表2]
实验1-4：稳定剂、非离子型表面活性剂对DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的 稳定化的影响的研究(对多聚体的生成和酸性电荷变体的生成的影响)
对于含有PB009-2的液剂，评价各种稳定剂或非离子型表面活性剂对PB009-2的稳定性的影响。本试验中，以使PB009-2的最终浓度达到10mg/mL的方式向含有PB009-2的液剂中配合缓冲剂和添加剂，由此制备表3所示的试样B-1～B-10。需要说明的是，添加适量的盐酸或氢氧化钠而调节pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表3]
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样正向放置状态下的热稳定性试验。在热稳定性试验中，基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量、和利用icIEF法测定的酸性电荷变体量评价在25℃保管1周后的PB009-2的稳定性。SE-HPLC法的实验法如下所述。
[尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)]
SE-HPLC测定中，将AdvanceBio SEC 300A色谱柱(Agilent公司)与HPLC系统连接，以0.5mL/分钟的流量流通具有20mmol/L磷酸/400mmol/L氯化钠pH7.0的组成的流动相。试样设为以PB009-2换算计达到50μg的注入量(例：5mg/mL时，为10μL)。柱温设为30℃，试样温度设为5℃，在UV280nm下实施检测。
SE-HPLC测定后，通过自动分析法测定检测到的多聚体的面积，求出多聚体的量(％)。关于多聚体量(％)，通过自动分析法测定在SE-HPLC法中检测到的多聚体峰的总面积，除以包括主峰在内的全部峰面积的总和，由此确定百分率(％)。在此，主峰是指活性主体(未多聚体化的PB009-2)的峰。
icIEF法的分析条件与实验1-3相同。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法和icIEF法的评价结果示于表4。首先，在25℃保管1周后的SE-HPLC多聚体量(％)在添加组氨酸、蔗糖和甘油的试样中有增加抑制倾向。另外，在25℃保管1周后的酸性电荷变体量(％)在添加组氨酸、天冬氨酸的试样中确认到增加。对以上结果进行综合判断，确认了：从稳定性的观点出发，蔗糖或甘油作为含有PB009-2的液剂的稳定剂是优选的。
[表4]
实验1-5：表面活性剂对DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的稳定化的影响的 研究(对不溶性微粒的生成的影响)
对于配方为含有10mg/mL的PB009-2、20mmol/L的柠檬酸且pH7.0的液剂，使其以0～0.6w/v％的范围含有作为表面活性剂的聚山梨酯80，由此制备试样(试样No.C-1～C-7：参照表5)。需要说明的是，添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表5]
对于各试样，用遮光颗粒计数法测定振荡后和冷冻融化后的不溶性微粒数。将试样以150rpm振荡24小时来进行振荡试验。另外，冷冻融化试验通过实施总计3次的将试样在-80℃下经过4小时以上而冷冻、之后在5℃经过4小时以上而融化的过程来进行。遮光颗粒计数法的分析条件如下所述。
[遮光颗粒计数法]
将样品0.2mL注入HIAC系统(Pacific Scientific公司)，实施试样1mL中所含的粒径1.2μm以上的不溶性微粒的颗粒数的测定。
将本实验中得到的基于遮光颗粒计数法的评价结果示于表6。表明了：不溶性微粒数由于振荡和冷冻融化而增加，但是通过以0.02w/v％以上的浓度添加聚山梨酯80可抑制该增加。并且确认了：从抑制不溶性微粒的生成的观点出发，向含有PB009-2的液剂中加入0.05w/v％的聚山梨酯80是优选的。
[表6]
实验1-6：用于使DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物稳定化的最佳pH的选定
对于含有10mg/mL的PB009-2且含有20mmol/L的柠檬酸或20mmol/L的HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪]乙磺酸)作为缓冲剂、含有10w/v％的蔗糖作为稳定剂、含有0.05w/v％的聚山梨酯80作为非离子型表面活性剂的配方(试样No.D-1～D-8)，在pH6.1～7.9的范围内制备试样。需要说明的是，添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。然后，对于各试样，基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量评价在正向放置的状态下在25℃保管1周后的PB009-2的稳定性。SE-HPLC法与实验1-4同样地进行。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法的评价结果示于表7。在25℃保管1周后的SE-HPLC多聚体量(％)在低pH和高pH试样中均有增加的倾向，在pH6.7附近达到最低。因此可知：pH6.7为最佳pH，作为适当地维持最佳pH的缓冲剂，特别优选20mmol/L的柠檬酸。
[表7]
实验1-7：用于使DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物稳定化的稳定剂浓度的最 优化研究
对于含有10mg/mL的PB009-2且设为20mmol/L柠檬酸、0.05w/v％聚山梨酯80、pH6.7的配方的液剂(试样No.E-1～E-5)，制备成以0～20w/v％的范围含有蔗糖或甘油的试样。在制备成各配方组成后，用0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备试样。需要说明的是，为了达到规定的pH，根据需要在制备缓冲液时添加盐酸和/或氢氧化钠作为pH调节剂。然后，对于各试样，基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量来评价在正向放置的状态下在25℃保管1周后的PB009-2的稳定性。SE-HPLC法与实验1-4同样地进行。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法的评价结果示于表8。其结果是，确认了：在25℃保管1周后，SE-HPLC多聚体量(％)的生成随着蔗糖或甘油的添加浓度的增加而得到抑制。另外，关于蔗糖和甘油，在对稳定性的影响方面未观察到差异。基于以上结果可知：从渗透压比的观点出发，作为含有PB009-2的液剂的药品添加剂，特别优选10w/v％的蔗糖。
[表8]
实验1-8：含有DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的稳定化溶液制剂的89Zr标记 化的研究
对于含有10mg/mL的PB009-2的下述表9所记载的配方的液剂，评价在-80℃保管后的89Zr的标记效率。
关于89Zr，以溶解于1M草酸水溶液的89Zr-草酸盐形态使用在国立大学法人冈山大学自然生命科学研究支援中心光·放射线信息分析部门鹿田施设中制造的89Zr，将40μL的89Zr-草酸盐用20μL的2M碳酸钠水溶液中和，用190μL的超纯水稀释。接着，添加含有0.05w/v％聚山梨酯80、10w/v％蔗糖或30w/v％甘油、和20mmol/L柠檬酸的PB009-2(10mg/mL)液剂150μL，在室温下反应30分钟。将得到的反应混合物用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器(Merck Millipore公司)进行纯化，由此得到目标PB009-2的89Zr标记体。将该89Zr-DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物称为PB009-3。利用TLC(thin-layerchromatography，薄层层析)和SE-HPLC法对纯化前后的PB009-3溶液进行测定而确认89Zr的反应率。分析条件如下所述。
在TLC铝片(Merck公司、1-05560-0001)上涂布少量的样品，使用0.1M EDTA溶液(pH7.0)作为展开液而实施TLC。89Zr的反应率如下计算。
(原点附近的放射线量a)/(整体的放射线量b)×100
[尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)]
SE-HPLC测定中，将G3000SWXL(TOSOH公司)与HPLC系统连接，以0.5mL/分钟的流量流通具有20mmol/L磷酸/150mmol/L氯化钠/5％乙腈pH7.0的组成的流动相。柱温设为30℃，用UV280nm和RI实施检测。
试验的结果是，所研究的任意配方的反应率(纯化前)均为90％左右，显示出较高的值(表9)，将用UV检测器和RI检测器确认到的PB009-3的峰和用UV检测器确认到的PB009-2的峰进行比较，各自的保持时间相同，由此确认了DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物被89Zr标记。另外表明了：不论是蔗糖配方还是甘油配方，都不用担心抑制89Zr标记反应。
[表9]
表9：由TLC结果求出的反应率
实验1-9：含有DFO-抗人CEACAM5抗体Fab片段复合物的制剂的保管时的稳定性的 研究
向含有PB009-2的液剂中以使PB009-2的最终浓度达到10mg/mL的方式配合柠檬酸、蔗糖和聚山梨酯80，由此制备表10所示的试样F-1。需要说明的是，添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。另外，用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充于玻璃药瓶(3mL容积)，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备该试样。
[表10]
试样No. 缓冲剂 pH 稳定剂 非离子型表面活性剂
F-1 20mmol/L柠檬酸 6.7 10w/v％蔗糖 0.05w/v％聚山梨酯80
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样的正向放置的状态的保管稳定性试验。保管稳定性试验中，基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量来评价在-20℃或5℃保管1～6个月后的PB009-2的稳定性。SE-HPLC法与实验1-4同样地进行。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法的评价结果示于表11。其结果是，确认了：在-20℃下保管时，至少6个月时保管稳定性没有问题。并且确认了：在5℃下保管时，1个月时的保管稳定性与同时期的-20℃下的保管稳定性为同等。
[表11]
实验2-1：抗人MUC1抗体Fab片段的制作
制作称为P10-1 Fab和P10-2 Fab的两种抗人MUC1抗体Fab片段。关于P10-1 Fab和P10-2 Fab的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，具体而言，将作为小鼠来源的抗人癌特异性MUC1抗体的1B2抗体参考文献(Front Biosci.；2008Jan 1；13：1619-33)中记载的方法人源化后，使用基于文献(Proteins；2014Aug；82(8)：1624-35)构建的人源化抗体的分子模型，设计可预期到亲和性提高且即使键合标记部也不减弱亲和性的序列。
制作插入有在P10-1 Fab和P10-2 Fab的各重链片段基因(分别为序列号5和序列号7)的5’侧连接编码信号序列(MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(序列号17))的基因而成的重链片段基因的GS载体pEE6.4(Lonza公司)。另外，制作插入有在P10-1 Fab和P10-2 Fab共同的轻链基因(序列号9)的5’侧连接编码信号序列(MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(序列号18))的基因而成的轻链基因的GS载体pEE12.4(Lonza公司)。
通过瞬时表达方法进行Fab片段的表达。用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)使上述的重链片段和轻链的GS载体转染用Expi293表达培养基(Thermo Fisher Scientific公司)以约250万个/mL培养的Expi293F细胞(ThermoFisher Scientific公司)，培养8天。使其表达后，用KappaSelect(GE Healthcare公司)对培养上清进行纯化，得到各Fab片段。
将P10-1 Fab的重链片段的碱基序列示于序列号5，将其所编码的氨基酸序列示于序列号6。将P10-1 Fab的重链可变区的碱基序列示于序列号11，将其所编码的氨基酸序列示于序列号12。
将P10-2 Fab的重链片段的碱基序列示于序列号7，将其所编码的氨基酸序列示于序列号8。将P10-2 Fab的重链可变区的碱基序列示于序列号13，将其所编码的氨基酸序列示于序列号14。
P10-1 Fab和P10-2 Fab的轻链的共同的，将其碱基序列示于序列号9，将其所编码的氨基酸序列示于序列号10。将P10-1 Fab和P10-2 Fab的轻链可变区的碱基序列示于序列号15，将其所编码的氨基酸序列示于序列号16。
对纯化后的P10-2 Fab的氨基酸修饰进行分析，结果表明，纯化抗体的大部分中，重链N末端的谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸。
实验2-2：抗人MUC1抗体Fab片段的螯合剂标记化
作为螯合剂的DFO与抗人MUC1抗体Fab片段P10-2的键合中，使用p-SCN-Bn-DFO(对异硫氰基苯基氨基硫羰基取代的DFO)(Macrocyclics公司)。向用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)制备为12.5mg/mL的Fab片段溶液中，以达到10mmol/L的方式添加100mmol/L碳酸钠溶液，调节为pH9.0。以使终浓度达到1mmol/L的方式向其中添加p-SCN-Bn-DFO，在37℃下反应2小时。p-SCN-Bn-DFO具有异硫氰酸酯基，因此与Fab片段的Lys迅速反应。用AmiconUltra 10K-0.5mL离心式过滤器对其进行回收，纯化通过接头(-C(＝S)-NH-(1，4-亚苯基)-NH-C(＝S)-)键合有DFO的DFO-抗人MUC1抗体Fab片段复合物(称为PB010-3)。
实验2-3：pH对DFO-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的稳定化的影响的研究(对多聚 体的生成和不溶性微粒的生成的影响)
对于含有PB010-3的液剂，评价pH对PB010-3的稳定化的影响。本试验中，以使PB010-3的最终浓度达到10mg/mL的方式向含有PB010-3的液剂中配合缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，由此制备表12所示的试样G-1～G-6。添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表12]
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样正向放置状态下的热稳定性试验。热稳定性试验中，基于利用尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)测定的多聚体量和利用遮光颗粒计数法测定的不溶性微粒数来评价在40℃保管1周后的PB010-3的稳定性。分析条件如下所述。
[SE-HPLC法]
SE-HPLC测定中，将BioSep SEC s3000(Phenomenex公司)与HPLC系统连接，试样PBS(pH7.4)作为流动相，使其以0.5mL/分钟的流量流通。试样设为以PB010-3换算计达到20μg的注入量(例：2mg/mL时，为10μL)。柱温设为30℃，试样温度设为10℃，在UV280nm下实施检测。
[遮光颗粒计数法]
将样品0.2mL注入HIAC系统(Pacific Scientific公司)，实施1.2μm以上的不溶性微粒数的测定。
通过自动分析法测定用SE-HPLC法检测到的多聚体的面积，求出多聚体的量(％)。关于多聚体量，通过自动分析法测定用SE-HPLC法检测到的多聚体峰的面积，除以包括主峰在内的全部峰面积的总和，由此确定百分率(％)。在此，主峰是指活性主体(未多聚体化的PB010-3)的峰。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法、遮光颗粒计数法的评价结果示于表13。其结果是，在40℃保管1周后的SE-HPLC多聚体量(％)有pH越高越增加的倾向。另外，在40℃保管1周后的1.2μm以上的不溶性微粒数有pH越低越增加的倾向。对以上结果进行综合判断，确认了：从稳定性的观点出发，含有PB010-3的液剂的最佳pH在6.5～7.0附近。
[表13]
实验2-4：稳定剂、非离子型表面活性剂对DFO-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的稳 定化的影响的研究(对多聚体的生成和不溶性微粒的生成的影响)
对于含有PB010-3的液剂，评价各种稳定剂对PB010-3的稳定性的影响。本研究中，以使PB010-3的最终浓度达到10mg/mL的方式向含有PB010-3的液剂中配合缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，由此制备表14所示的试样H-1～H-4。需要说明的是，添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表14]
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样的保管试验和振荡试验。保管试验通过在5℃和-20℃条件下静置保管各试样来进行。另外，振荡试验通过将试样以150rpm振荡24小时来进行。基于利用尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)测定的多聚体量、和利用遮光颗粒计数法测定的不溶性微粒数来评价各试验前后的PB010-3的稳定性。
分析条件与实验2-3相同。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法、遮光颗粒计数法的评价结果示于表15、表16。其结果是，未添加聚山梨酯80的配方和添加聚山梨酯80且添加蔗糖或甘油的配方在于5℃或-20℃保管3个月的情况下，均确认到抑制多聚体量增加的效果。另一方面，未添加聚山梨酯80的配方在振荡试验后观察到不溶性微粒数的显著增加。基于以上结果可知：在聚山梨酯80的基础上添加蔗糖或甘油的配方是优选的，进而从渗透压比的观点出发，作为含有PB010-3的液剂的药品添加剂，特别优选10w/v％的蔗糖。
[表15]
[表16]
实验2-5：表面活性剂对DFO-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的稳定化的影响的研究 (对不溶性微粒的生成的影响)
对于含有PB010-3的液剂，评价表面活性剂对PB010-3的稳定性的影响。本试验中，以使PB010-3的最终浓度达到10mg/mL的方式向含有PB010-3的液剂中配合缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，调节pH，由此制备表17所示的试样I-1～I-4。需要说明的是，添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表17]
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样的振荡试验和冷冻融化试验。振荡试验通过将试样以150rpm振荡24小时来进行。冷冻融化试验通过实施总计3次的将试样在-80℃下经过4小时以上而冷冻、之后在5℃经过4小时以上而融化的过程来进行。并且，基于利用遮光颗粒计数法测定的不溶性微粒数来评价各试验前后的PB010-3的稳定性。分析条件与实验2-3相同。
将本实验中得到的基于遮光颗粒计数法的评价结果示于表18。其结果是，确认了：通过使聚山梨酯80为0.02w/v％以上的浓度，有抑制振荡时和冷冻融化时不溶性微粒数增加的效果。
[表18]
实验2-6：含有DFO-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的稳定化溶液制剂的89Zr标记化 的研究
对于含有10mg/mL的PB010-3的下述表19中记载的配方的液剂，评价在-80℃保管后的89Zr的标记效率。
关于89Zr，以溶解于1M草酸水溶液的89Zr-草酸盐形态使用在国立大学法人冈山大学自然生命科学研究支援中心光·放射线信息分析部门鹿田施设中制造的89Zr，将40μL的89Zr-草酸盐用20μL的2M碳酸钠水溶液中和，用190μL的超纯水稀释。接着，添加含有0.05w/v％聚山梨酯80、10w/v％蔗糖或30w/v％甘油、和20mmol/L柠檬酸的PB010-3(10mg/mL)液剂150μL，在室温下反应60分钟。将得到的反应混合物用Amicon Ultra-0.5mL离心式过滤器(Merck Millipore公司)进行纯化，由此得到目标PB010-3的89Zr标记体。将该经89Zr标记的P10-2 Fab DFO(PB010-3)称为PB010-4。利用TLC(thin-layer chromatography)和SE-HPLC法对纯化前后的PB010-4溶液进行测定，由此确认89Zr的反应率。TLC和SE-HPLC法的分析条件与实验1-8相同。
试验的结果是，所研究的任意配方的反应率(纯化前)均为90％左右，显示出较高的值(表19)，将用UV检测器和RI检测器确认到的PB010-4的峰和用UV检测器确认到的PB010-3的峰进行比较，各自的保持时间相同，由此确认了PB010-3被89Zr标记。表明了：实施研究的配方均不用担心抑制89Zr标记反应。
[表19]
表19：由TLC结果求出的反应率
实验2-7：含有DFO-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的制剂的保管时的稳定性的研究
对于含有PB010-3的液剂，评价冷蒇和冷冻保管时的稳定性。本试验中，以使PB010-3的最终浓度达到10mg/mL的方式向含有PB010-3的液剂中配合缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，基于表20制备试样J-1。添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表20]
为了评价液剂的稳定性，将各试样在5℃和-20℃条件下进行静置保管。基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量、利用反相色谱法(RP-HPLC法)测定的游离Fab体量(％)、和利用遮光颗粒计数法测定的不溶性微粒数，评价保管后的PB010-3的稳定性。分析条件如下所述。
[SE-HPLC法]
在与实验2-3相同的条件下实施。
[RP-HPLC法]
RP-HPLC测定中，将Intrada WP-RP(Imtakt公司)与HPLC系统连接而进行测定。将0.1％TFA与流动相A流路连接，将0.1％TFA/乙腈与流动相B流路连接，以下表所示的比例以1.0mL/分钟的流量来流通。试样设为以PB010-3换算计达到20μg的注入量(例：1mg/mL时，为20μL)，应用表21的RP-HPLC梯度程序。柱温设为60℃，试样温度设为10℃，以UV214nm实施检测。
[表21]
时间(分钟) A％ B％
0.0 76 24
39.0 63 37
39.1 0 100
41.5 0 100
41.6 76 24
45.0 76 24
通过自动分析法测定用RP-HPLC法检测到的多聚体的面积，求出游离Fab体量(％)。关于游离Fab体量，通过自动分析法测定用RP-HPLC法检测到的游离Fab片段的峰的面积，除以包括主峰在内的全部峰面积的总和，由此确定百分率(％)。在此，主峰是指活性主体的峰。
[遮光颗粒计数法]
在与实验2-3相同的条件下实施。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法、RP-HPLC法、遮光颗粒计数法的评价结果示于表22。其结果是，确认了保管3个月时稳定性没有问题。
[表22]
实验3-1：抗人MUC1抗体Fab片段的荧光标记化
对实验2-1中制备的P10-2Fab进行荧光色素的导入。具体而言，向用磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)制备为约1mg/mL的Fab片段溶液中添加1/10量的1M磷酸氢二钾溶液(pH9)，调节为pH8.5。以使终浓度达到310.8μg/mL的方式向其中添加IRDye800CW NHS Ester(LI-CORBiosciences公司)，在室温和遮光下搅拌2小时。IRDye800CW NHS Ester具有N-羟基琥珀酰亚胺基，因此与Fab片段的Lys快速反应。用Amicon Ultra 3K-0.5mL离心式过滤器(MerckMillipore公司)对其进行回收，纯化IRDye800CW-抗人MUC1抗体Fab片段复合物(称为PB010-2)。
实验3-2：pH对IRDye800CW-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的稳定化的影响
对于含有PB010-2的液剂，评价pH对PB010-2的稳定化的影响。本试验中，将PB010-2的浓度设为10mg/mL，基于表23制备试样K-1～K-5。添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表23]
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样正向放置状态下的热稳定性试验。热稳定性试验中，基于利用尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)测定的多聚体量和利用微流路成像法测定的不溶性微粒数，评价了在40℃保管1周后的PB010-2的稳定性。分析条件如下所述。
[尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)]
SE-HPLC测定中，将G2000SWXL(TOSOH公司)与HPLC系统连接，使具有20mmol/L磷酸/1000mmol/L氯化钠pH7.0的组成的流动相以0.5mL/分钟的流量流通。试样设为以PB010-2换算计达到50μg的注入量(例：5mg/mL时，为10μL)。柱温设为30℃，试样温度设为5℃，在UV280nm下实施检测。
通过自动分析法测定用SE-HPLC法检测到的多聚体的面积，求出多聚体量(％)。关于多聚体量，通过自动分析法测定用SE-HPLC法检测到的多聚体峰的面积，除以包括主峰在内的全部峰面积的总和，由此确定百分率(％)。在此，主峰是指活性主体的峰。
[微流路成像法]
向微流路成像系统(Protein Simple公司)中注入样品650μL，实施1mL试样中所含的粒径1.2μm以上的不溶性微粒的颗粒数的测定。
将本试验中得到的基于SE-HPLC法、微流路成像法的评价结果示于表24。其结果是，在40℃保管1周后的SE-HPLC多聚体有pH越高越增加的倾向。另外，在40℃保管1周后的1.2μm以上的不溶性微粒数有pH越低越增加的倾向。对以上结果进行综合判断，确认了pH6.5～7.5附近为最佳pH。
[表24]
实验3-3：稳定剂或非离子型表面活性剂对IRDye800CW-抗人MUC1抗体Fab片段复 合物的稳定化的影响
对于含有PB010-2的液剂，评价了各种稳定剂对PB010-2的稳定性的影响。本试验中，以使PB010-2的最终浓度达到10mg/mL的方式向含有PB010-2的液剂中配合缓冲剂和添加剂，基于表25而制备试样L-1～L-6。添加适量的盐酸或氢氧化钠来调整pH。用孔径0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充到玻璃药瓶(3mL容积)中，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备各试样。
[表25]
为了评价液剂的稳定性，进行了各试样的振荡试验、冷冻融化试验、热稳定性试验和光暴露试验。振荡试验通过将试样以150rpm振荡24小时来进行。冷冻融化试验通过实施总计3次的将试样在-80℃下经过4小时以上而冷冻、之后在5℃经过4小时以上而融化的过程来进行。热稳定性试验通过将试样在40℃保管2周而进行。光暴露试验通过将试样在水平放置的状态下保管、并且用白色荧光灯照射1000lx的光96小时而进行。并且，基于利用尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)测定的多聚体量、利用反相色谱法(RP-HPLC法)测定的染料抗体比、和利用微流路成像法测定的不溶性微粒数来评价各试验前后的PB010-2的稳定性。分析条件如下所述。
[尺寸排阻层析法(SE-HPLC法)]
SE-HPLC测定中，将AdvanceBio SEC 300A(Agilent公司)与HPLC系统连接，使具有20mmol/L磷酸/1000mmol/L氯化钠pH7.0的组成的流动相以0.5mL/分钟的流量流通。试样设为以PB010-2换算计达到50μg的注入量(例：5mg/mL时，为10μL)。柱温设为30℃，试样温度设为5℃，在UV280nm下实施检测。
通过自动分析法测定用SE-HPLC法检测到的多聚体的面积，求出多聚体量(％)。关于多聚体量，通过自动分析法测定用SE-HPLC法检测到的多聚体峰的面积，除以包括主峰在内的全部峰面积的总和，由此确定百分率(％)。在此，主峰是指活性主体的峰。
[反相色谱法(RP-HPLC法)]
RP-HPLC测定中，将Intrada WP-RP(Imtakt公司)与HPLC系统连接而进行测定。将0.1％三氟乙酸/水与流动相A流路连接，将0.1％三氟乙酸/乙腈与流动相B流路连接，以1.0mL/min的流速来流通。试样设为以PB010-2换算计达到10μg的注入量(例：1mg/mL时，为10μL)，应用表26的RP-HPLC梯度程序。分析时间设为45分钟，以UV波长280；780nm实施检测。柱温设为75℃，试样温度设为5℃。
[表26]
时间(分钟) 流动相B％
0.0 20
39.0 60
39.1 100
41.5 100
41.6 20
45.0 20
使用RP-HPLC法中检测到的UV波长780nm处的峰的总面积、UV波长280nm处的峰的总面积、PB010-1的吸光系数(1.42mL/mg·cm-1)、PB010-1的分子量(47527.43)和IRDye800CW的PBS中的摩尔吸光系数(240000mL/mmol·cm-1)代入以下的计算式来求出染料抗体比(Dye Antibody Ratio)。
[微流路成像法]
向微流路成像系统(Protein Simple公司)注入样品650μL，实施1mL试样中所含的粒径1.0μm以上的不溶性微粒的颗粒数的测定。
将本实验中得到的基于SE-HPLC法、RP-HPLC法和微流路成像法的评价结果示于表27～29。添加精氨酸的配方和添加蔗糖的配方中，观察到在40℃保管2周后的多聚体量增加得到抑制的倾向。另外，添加精氨酸的配方中，观察到在40℃保管2周后染料抗体比的下降。另外，在添加氯化钠的配方和不添加添加剂的配方中，观察到与其他配方相比冷冻融化后的不溶性微粒数增加的倾向。对以上结果进行综合判断，确认了：从稳定性的观点出发，蔗糖作为含有PB010-2的液剂的稳定剂和等渗剂是优选的。
[表27]
[表28]
[表29]
实验3-4：用于使IRDye800CW-抗人MUC1抗体Fab片段复合物稳定化的最佳pH的选 定
对于含有PB010-2的液剂且以20mmol/L柠檬酸或20mmol/L磷酸为缓冲剂的配方(试样No.M-1～M-10)，在pH6.6～7.4的范围内制备试样。试样中，PB010-2最终浓度为10mg/mL，根据需要在制备缓冲液时添加盐酸和/或氢氧化钠作为pH调节剂，以达到规定的pH。用0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充于玻璃药瓶(3mL容积)，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备试样。基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量和利用RP-HPLC测定的染料抗体比来评价各试样的振荡试验、冷冻融化试验、热稳定性试验、和光暴露试验后的稳定性。需要说明的是，SE-HPLC法和RP-HPLC法与实验3-3同样地进行测定。
将结果示于表30～31。
从多聚体量和染料抗体比的观点出发，pH越低越稳定(高pH下由于热/光应力而不稳定)。另一方面，由于接近pH6.0附近时有因溶解度下降而生成微粒的风险，由此可知特别优选设为pH6.8。
[表30]
[表31]
实验3-5：缓冲剂和表面活性剂对IRDye800CW-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的稳 定化的影响
对于含有PB010-2且添加有20mmol/L柠檬酸(pH6.8)或20mmol/L磷酸(pH6.8)、280mmol/L蔗糖的配方，制备以0.05w/v％添加作为表面活性剂的聚山梨酯80的试样和不添加作为表面活性剂的聚山梨酯80的试样(试样No.N-1～N-4)。PB010-2的最终浓度设为10mg/mL。制备成各配方组成后，用0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充于玻璃药瓶(3mL容积)，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固而制备试样。需要说明的是，根据需要在制备缓冲液时添加盐酸和/或氢氧化钠作为pH调节剂，以达到规定的pH。
将试样在-20℃或5℃保管1个月，另外，热稳定性试验通过在40℃保管2周或在25℃保管1个月且以正向放置的状态来保管的方式进行。光暴露试验通过以水平状态保管试样、且用白色荧光灯照射1000lx的光96小时来进行。并且，基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量、利用微流路成像法测定的不溶性微粒数、和利用SE-HPLC法测定的荧光强度、利用酶联免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)法测定的抗原结合活性来评价各试验前后的PB010-2的稳定性。需要说明的是，SE-HPLC法和微流路成像法基于实验3-3的方法来测定。关于荧光强度，通过将检测到的主峰的荧光强度代入下式来进行评价。
[ELISA法]
将含有0.8nM hMUC-1(PEPTIDE INSTITUTE公司)抗原的磷酸缓冲液添加到分析用平板，在2-8℃下处理18小时后，用含有20％Blocking One(NACALAI TESQUE公司)和0.05w/v％的Tween-20的Tris缓冲生理盐水(TBS)固定抗原。在0-100000ng/mL的浓度范围内，将PB010-2溶液用含有5％Blocking One和0.05w/v％的Tween-20的TBS连续稀释，添加到固定有抗原的平板上。将平板在25℃孵育60分钟后，将4000倍稀释的山羊抗人Kappa-HRP(Southern Biotech公司)添加于平板。将平板在25℃孵育60分钟后，实施3次洗涤。向平板添加100μLTMB+Substrate-Chromogen(Dako公司)后，在25℃孵育20分钟，添加1mol/L硫酸而使反应停止。然后用Spectra Max 190(Molecular Devices公司)评价450nm的UV吸收，由此评价结合活性。需要说明的是，将PB010-2标准品的活性设为100％而计算相对结合活性形式。
将结果示于表32～35。
添加了聚山梨酯80的配方中，热稳定性试验和光暴露试验后的不溶性微粒的增加得到抑制，由此可知特别优选使用0.05w/v％聚山梨酯80作为非离子型表面活性剂。另外，添加了柠檬酸的配方与添加了磷酸的配方相比，在40℃保管后的多聚体增加的倾向小，由此可知特别优选使用柠檬酸作为缓冲剂。另外，任一配方和保管条件下均确认到了抗原结合活性和荧光强度的下降。
[表32]
[表33]
[表34]
[表35]
实验3-6：含有IRDye800CW-抗人MUC1抗体Fab片段复合物的制剂的保管时的稳定 性的研究
对用20mmol/L柠檬酸调节为pH6.8的配方溶液进行添加以使PB010-2浓度为10mg/mL、蔗糖浓度为280mmol/L、聚山梨酯80浓度为0.05w/v％，由此制备表36所示的配方，用0.22μm的过滤器进行无菌过滤，分别以1.2mL填充于玻璃药瓶(3mL容积)。对试样进行冷冻干燥，用橡胶塞封口后，盖上铝盖并紧固。然后评价热稳定性试验后或光暴露试验后的PB010-2的稳定性。
[表36]
热稳定性试验通过将试样在40℃下以正向放置的状态保管2周来进行。光暴露试验通过将试样以水平放置的状态进行保管、并且用白色荧光灯照射1000lx的光96小时来进行。并且，基于利用SE-HPLC法测定的多聚体量和荧光强度、利用RP-HPLC法测定的染料抗体比来评价各试验前后的PB010-2的稳定性。需要说明的是，SE-HPLC法和RP-HPLC法基于实验3-3来进行测定。另外，荧光强度的评价与实验3-5同样地进行测定。
将结果示于表37～39，表明了：通过设为上述配方，不论是在40℃保管2周后还是在光暴露后，PB010-2均得到了稳定地维持。
[表37]
[表38]
[表39]
序列表白由文本
序列号1：编码PB009-1 Fab重链片段的DNA的碱基序列
序列号2：PB009-1 Fab重链片段的氨基酸序列
序列号3：编码PB009-1 Fab轻链的DNA的碱基序列
序列号4：PB009-1 Fab轻链的氨基酸序列
序列号5：编码P10-1 Fab重链片段的DNA的碱基序列
序列号6：P10-1 Fab重链片段的氨基酸序列
序列号7：编码P10-2 Fab重链片段的DNA的碱基序列
序列号8：P10-2 Fab重链片段的氨基酸序列
序列号9：编码P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链的DNA的碱基序列
序列号10：P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链的氨基酸序列
序列号11：编码P10-1 Fab重链可变区的DNA的碱基序列
序列号12：P10-1 Fab重链可变区的氨基酸序列
序列号13：编码P10-2 Fab重链可变区的DNA的碱基序列
序列号14：P10-2 Fab重链可变区的氨基酸序列
序列号15：编码P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链可变区的DNA的碱基序列
序列号16：P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链可变区的氨基酸序列
序列号17：用于PB009-1 Fab、P10-1 Fab和P10-2 Fab的重链信号序列
序列号18：用于PB009-1 Fab、P10-1 Fab和P10-2 Fab的轻链信号序列
序列号19：MUC1的胞外结构域的串联重复序列
序列表
<110> 安斯泰来制药株式会社
<120> 含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物
<130> FA1535-19221
<150> JP 2018-191605
<151> 2018-10-10
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PB009-1 Fab重链片段的DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(678)
<400> 1
gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
gac tga 678
Asp
225
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PB009-1 Fab重链片段
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp
225
<210> 3
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码PB009-1 Fab轻链的DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(657)
<400> 3
gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PB009-1 Fab轻链
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab重链片段的DNA
<400> 5
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 6
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-1 Fab重链片段
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 7
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-2 Fab重链片段的DNA
<400> 7
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-2 Fab重链片段
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 9
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链的DNA
<400> 9
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab重链可变区的DNA
<400> 11
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-1 Fab重链可变区
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-2 Fab重链可变区的DNA
<400> 13
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-2 Fab重链可变区
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链可变区的DNA
<400> 15
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P10-1 Fab和P10-2 Fab轻链可变区
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PB009-1 Fab、P10-1 Fab和P10-2 Fab的重链信号序列
<400> 17
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PB009-1 Fab、P10-1 Fab和P10-2 Fab的轻链信号序列
<400> 18
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1的胞外结构域的串联重复序列
<400> 19
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala
20

Claims (13)

1.一种药物组合物，其为含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物、缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂并且pH为6.5～7.5的药物组合物，其中，
所述抗人抗体Fab片段为选自由以下的(a)和(b)组成的组中的1种以上：
(a)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段；以及
(b)含有由序列号2所示的氨基酸序列构成并且序列号2的氨基酸编号1的谷氨酸被修饰为焦谷氨酸的重链片段和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人CEACAM5抗体Fab片段，
所述标记部为下式(I)所示的基团，
式中，波浪线表示与抗人CEACAM5抗体Fab片段键合，在此，抗人CEACAM5抗体Fab片段通过抗人CEACAM5抗体Fab片段中的氨基与标记部末端的C(＝S)的碳原子键合，
所述非离子型表面活性剂包含聚山梨酯80，
所述非离子型表面活性剂的浓度为0.02～0.2w/v％，
所述缓冲剂包含柠檬酸，
所述缓冲剂的浓度为10～30mmol/L，
所述稳定剂包含蔗糖或甘油，并且
所述稳定剂的浓度为5～30w/v％。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，
所述标记部-抗人抗体Fab片段复合物的浓度为5～20mg/mL，
pH的范围为6.5～7.0，
所述非离子型表面活性剂的浓度为0.04～0.1w/v％，
所述缓冲剂的浓度为15～25mmol/L。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述稳定剂为蔗糖。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，
所述标记部-抗人抗体Fab片段复合物的浓度为10mg/mL，
pH为6.7，
所述非离子型表面活性剂的浓度为0.05w/v％，
所述缓冲剂的浓度为20mmol/L，
所述稳定剂的浓度为10w/v％。
5.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述稳定剂为甘油。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，
所述标记部-抗人抗体Fab片段复合物的浓度为10mg/mL，
pH为6.7，
所述非离子型表面活性剂的浓度为0.05w/v％，
所述缓冲剂的浓度为20mmol/L，
所述稳定剂的浓度为30w/v％。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的药物组合物，其中，标记部-抗人抗体Fab片段复合物还含有89Zr。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其用于大肠癌或大肠癌转移后的癌症的诊断。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其用于乳腺癌或乳腺癌转移后的癌症的诊断。
10.根据权利要求1～6、8和9中任一项所述的药物组合物，其为溶液制剂、冷冻制剂或冷冻干燥制剂。
11.根据权利要求7所述的药物组合物，其为溶液制剂、冷冻制剂或冷冻干燥制剂。
12.一种权利要求1所述的药物组合物的制造方法，其包括：
(a)制造并配合标记部-抗人抗体Fab片段复合物的步骤；
(b)以达到10～30mmol/L的方式配合柠檬酸作为缓冲剂的步骤；
(c)以达到5～30w/v％的方式配合蔗糖或甘油作为稳定剂的步骤；
(d)以达到0.02～0.2w/v％的方式配合聚山梨酯80作为非离子型表面活性剂的步骤；和
(e)将pH调节到6.5～7.5的步骤。
13.一种稳定地保存权利要求1所述的药物组合物中所含有的标记部-抗人抗体Fab片段复合物的方法，其包括：
(a)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中以达到10～30mmol/L的方式配合柠檬酸作为缓冲剂的步骤；
(b)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中以达到5～30w/v％的方式配合蔗糖或甘油作为稳定剂的步骤；
(c)向含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液中以达到0.02～0.2w/v％的方式配合聚山梨酯80作为非离子型表面活性剂的步骤；和
(d)将含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的溶液的pH调节到6.5～7.5的步骤。
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