JPWO2020075746A1 - 標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物 - Google Patents

標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物 Download PDF

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Abstract

標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む安定な医薬組成物等の提供。標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物において、緩衝剤としてクエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを配合し、安定化剤としてスクロース又はグリセリンを配合し、及び非イオン性界面活性剤を配合し、ｐＨを６．５〜７．５に調整する。これにより、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を保存する際の多量体や不溶性微粒子の発生を抑制できる。

Description

本発明は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含有する安定な医薬組成物に関する。特に、本発明は、標識部−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体、又は標識部−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含有する安定な医薬組成物に関するものである。また、本発明は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物の製造方法、及び標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を安定に保存する方法に関するものでもある。
遺伝子組換え技術の発達によって、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ヒト型化抗体等の抗体を医薬品として利用することが可能となっている。例えば、癌を診断、治療するために抗癌剤や金属放射性同位元素、蛍光色素等を結合させた抗体が用いられている。また、抗体を用いたターゲッティングは腫瘍細胞に対する特異性が高く、副作用が少ないことが知られている。このような背景の下、現在までに金属放射性同位元素で標識されたモノクローナル抗体等が開発されている（特許文献１）。
一方で、一般に抗体は血中半減期が長く、体内に投与後、癌を可視化するのに十分なシグナル対バックグラウンド比を与える腫瘍対血液比に達するのに４日〜５日の長い期間を必要とする（Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．；２０１０；８７：５８６−５９２）。また、抗体のＦｃ領域は、抗体依存性細胞障害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）の薬理作用を引き起こす（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．；２０１３；３０：２２７−２３６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；２００２；１３：６０９−６１４）。さらに、抗体は肝臓で代謝されるため標的に関わらず肝臓に高集積するが、大腸癌の早期の転移は肝臓に限局しているため、抗体によって大腸癌の肝転移の病巣を検出することは難しい（Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．；２０１０；８７：５８６−５９２）。
これに対して、Ｆａｂのように低分子化された組換え抗体フラグメントは、組織浸透性が高いため病巣に届きやすく、大腸菌や酵母での発現系を用いた低コストでの製造が期待でき、血中半減期が短く、腎排泄される特徴を有することから、診断薬としての利用が期待されている（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；２００５；２３：１１２６−１１３６）。
このような背景の下、癌の診断を目的として、金属放射性同位元素を配位させたＦａｂフラグメント複合体や蛍光色素を結合させたＦａｂフラグメントの利用が検討されている。
また、抗体を安定に保存する方法については、これまでに多くの検討がなされている。例えば、特許文献２には、ヒト型化Ｃ４Ｃ１ Ｆａｂフラグメントを含む製剤に、非イオン性界面活性剤、糖類を添加し、ｐＨを特定の範囲に調整することで安定化する方法が記載されている。また、特許文献３には、ＩＬ−１βに対するヒト抗体を含む製剤に、緩衝剤を添加し、ｐＨを特定の範囲に調整することで安定化する方法が記載されている。
特表２０１３−５１００９３号公報 国際公開第００／６６１６０号公報 特表２０１２−５１１５４０号公報
一価のＦａｂフラグメントは、分子量約５０ｋＤａであり、分子量約１５０ｋＤａの抗体より小さく、腎排泄され、血中半減期も短い。また、Ｆｃ領域がないためＡＤＣＣやＣＤＣを引き起こすこともない。このような特長から、抗体と比べ、金属放射性同位元素を配位させたＦａｂフラグメントや蛍光色素を結合させたＦａｂフラグメントは、診断薬としてより有効であると期待される。
しかしながら、配位子や蛍光色素を結合させたＦａｂフラグメントは、保存時の熱ストレスや光ストレスによって、多量体や不溶性微粒子を生成しやすいという課題や、使用前の融解・攪拌過程で不溶性微粒子が生成するという課題がある。また、安定化のために保存溶液中に様々な化合物を配合すると、配位効率や蛍光退色といった問題などが生じることも懸念されている。
本発明の課題は、保存時における多量体や不溶性微粒子の発生を抑制できる、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体含有医薬組成物等を提供することにある。また、標識部として配位子を用いた場合に、配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下を抑制できる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体含有医薬組成物を提供することや、標識部として蛍光色素を用いた場合に、蛍光色素の退色を抑制できる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体含有医薬組成物を提供することも本発明の課題である。
本発明者らは、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体含有医薬組成物の処方について鋭意検討を重ねた結果、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝剤として配合し、スクロース又はグリセリンを安定化剤として配合し、さらに非イオン性界面活性剤を配合し、ｐＨが６．５〜７．５である医薬組成物とすることで、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の保存時における多量体や不溶性微粒子の発生を抑制でき、かつ配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下や蛍光色素の退色も抑制できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の保存安定性に優れ、かつ標識部への金属配位効率や標識蛍光色素の退色も抑制できる、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を提供するものであり、一態様において、本発明は以下の通りであってよい。
［１］標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体、緩衝剤、安定化剤、及び非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨが６．５〜７．５である医薬組成物であって、
緩衝剤が、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含むものであり、
安定化剤が、スクロース、又はグリセリンを含むものである、前記医薬組成物。
［２］抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものであり、
標識部が、下式（Ｉ）：
Figure 2020075746
 ［式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している］で示される基である、上記［１］に記載の医薬組成物。
［３］抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものである、上記［２］に記載の医薬組成物。
［４］抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものであり、
標識部が、下式（Ｉ）：
Figure 2020075746
 ［式中、波線は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している］で示される基である、上記［１］に記載の医薬組成物。
［５］抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものである、上記［４］に記載の医薬組成物。
［６］非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０を含むものである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体が、さらに８９Ｚｒを含む、上記［２］〜［６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］大腸癌又は大腸癌が転移した癌の診断に用いる、上記［７］に記載の医薬組成物。
［９］乳癌又は乳癌が転移した癌の診断に用いる、上記［７］に記載の医薬組成物。
［１０］抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものであり、
標識部が、下式（ＩＩ）：
Figure 2020075746
 ［式中、波線は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｏ）の炭素原子と結合している］で示される基である、上記［１］に記載の医薬組成物。
［１１］抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものである、上記［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０を含むものである、上記［１０］又は［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］乳癌又は乳癌が転移した癌の診断に用いる、上記［１０］〜［１２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１４］術中診断薬である、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］緩衝剤の濃度が、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１６］安定化剤の濃度が、５〜３０ｗ／ｖ％である、上記［１］〜［１５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１７］非イオン性界面活性剤の濃度が、０．０２〜０．２ｗ／ｖ％である、上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１８］溶液製剤、凍結製剤、又は凍結乾燥製剤である、上記［１］〜［１７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１９］標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物の製造方法であって、
（ａ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を製造し、配合する工程、
（ｂ）クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝剤として配合する工程、
（ｃ）スクロース、又はグリセリンを安定化剤として配合する工程、
（ｄ）非イオン性界面活性剤を配合する工程、及び
（ｅ）ｐＨを６．５〜７．５に調整する工程、
を含む、前記製造方法。
［２０］標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を安定に保存する方法であって、
（ａ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝剤として配合する工程、
（ｂ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、スクロース、又はグリセリンを安定化剤として配合する工程、
（ｃ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、非イオン性界面活性剤を配合する工程、及び
（ｄ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液のｐＨを６．５〜７．５に調整する工程、
を含む、前記方法。
本発明の医薬組成物は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の保存時における多量体や不溶性微粒子の発生を抑制でき、かつ配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下や蛍光色素の退色も抑制できるため、貯蔵、輸送、及び使用の際の安定性の点で有用である。また、本発明の医薬組成物は、安定性の点から、製薬学的に許容される緩衝剤や医薬品添加物を使用したものであり、ヒト投与の際の安全性の点でも有用である。
以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
１．医薬組成物
ある態様では、本発明は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体、緩衝剤、安定化剤、及び非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨが６．５〜７．５である医薬組成物であって、前記緩衝剤が、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含むものであり、前記安定化剤が、スクロース、又はグリセリンを含むものである、前記医薬組成物に関する。前記医薬組成物とすることにより、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の保存時における多量体や不溶性微粒子の発生を抑制でき、かつ配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下や蛍光色素の退色も抑制することが可能になる。そのため、本発明の医薬組成物では、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の貯蔵、輸送、及び使用の際の凝集等を抑制できる。
１−１．抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端側に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される。
抗体と抗原との結合の特異性は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって構成される部分のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
抗体の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ−Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ−Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。Ｆａｂフラグメントは可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは、ある態様では抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである。また、ある態様では、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは、ある態様では抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである。
１−１−１．抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント
ＣＥＡＣＡＭ５（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５）は腫瘍マーカーの１つであり、正常組織でほとんど発現が認められないが、胎児の消化管や大腸癌で発現している（ＢＢＡ；１９９０；１０３２：１７７−１８９、Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．；１９９９；５２：１７４−１７８）。また、ＣＥＡＣＡＭ５は乳癌などでも発現していることが知られている（Ｄｉａｇｎ．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ．；１９９３；９：３７７−３８２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；１９９０；５０：６９８７−６９９４、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ；２０００；３７：５３０−５３５）。また、大腸癌患者では健常人に比べ血中ＣＥＡＣＡＭ５の濃度が高く（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；１９６５；１２１：４３９−４６２）、ＣＥＡＣＡＭ５は腫瘍マーカーとして使用されている。大腸癌患者の組織学的な検討では９０％以上の組織でＣＥＡＣＡＭ５が高発現している（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ；２０１３；１０８：６６２−６６７）。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントには、以下の特徴を有するＦａｂフラグメントが含まれる：
配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域としては、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４等のいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域は、ヒトＩｇγ１定常領域である。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域である。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、以下のＦａｂフラグメントである：
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
Ｆａｂフラグメントを含め、抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．；２００８；９７：２４２６−２４４７）。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントには、翻訳後修飾により生じたＦａｂフラグメントも含まれ得る。翻訳後修飾により生じ得る本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、重鎖Ｎ末端がピログルタミル化された抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化による翻訳後修飾は、抗体の活性に顕著な影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；２００６；３４８：２４−３９）。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
別の実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
本発明の医薬組成物には、以下の特徴を有する抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントも含まれる：
配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から３８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４から６０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９３から１０１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合する。得られた抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体ＦａｂフラグメントのヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する結合活性を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法による解析やＥＬＩＳＡ等の方法がある。例えば、ＳＰＲ法による解析を用いる場合、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて、センサーチップにＢｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）とビオチン化したヒトＣＥＡＣＡＭ５を固相化し、段階希釈したＦａｂフラグメントを添加することで結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を測定できる。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、本明細書に開示される、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の「４−４．抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの製造方法」に記載の方法に従い製造することができる。
１−１−２．抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント
ムチン１（Ｍｕｃｉｎ１：ＭＵＣ１）は、乳腺、気管及び消化管等の上皮組織を構成する上皮細胞の内腔側に発現する膜結合型糖タンパク質である（Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ；２００４ Ｊａｎ；４（１）：４５−６０）。ＭＵＣ１は乳癌や大腸癌等の癌細胞で過剰に発現しており（Ｍｏｄ． Ｐａｔｈｏｌ．；２００５ Ｏｃｔ；１８（１０）：１２９５−１３０４、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．；２０００ Ｊａｎ；１６（１）：５５−６４）、ＭＵＣ１は癌病巣を検出するための標的分子として有用である（Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ；２００４ Ｊａｎ；４（１）：４５−６０、Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ．；２０１０ Ａｕｇ１５；２０６（８）：５８５−５８９．）。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、以下の特徴を有するＦａｂフラグメントである：
配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域としては、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４等のいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域は、ヒトＩｇγ１定常領域である。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域である。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、以下のＦａｂフラグメントである：
配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである。
前述の通り、Ｆａｂフラグメントを含め、抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。そのため、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントには、翻訳後修飾により生じたＦａｂフラグメントも含まれ得る。翻訳後修飾により生じ得る本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、重鎖Ｎ末端のピログルタミル化した抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化による翻訳後修飾は、抗体の活性に影響を及ぼすものではないことが当該分野で知られていることは前述の通りである。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
ある実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
別の実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
ある実施形態において、本発明の医薬組成物に含まれる抗ＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に結合する。得られた抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントのヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒト癌特異的ＭＵＣ１陽性細胞（例えば、Ｔ−４７Ｄ細胞）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してＦａｂフラグメントを添加して反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等で標識した抗Ｉｇκ抗体等を反応させた後、その活性を検出する試薬（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の場合、化学発光ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質）等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定する。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、本明細書に開示される、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の「４−４．抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの製造方法」に記載の方法に従い製造することができる。
１−２．標識部
１−２−１．配位子を含む標識部
ある実施形態として、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が配位子及びリンカーである複合体である。なお、本明細書において、「配位子」とは、複合体において、金属とキレート錯体を形成しうる部分であり、キレート剤から構成される基を意味する。また、「構成される基」とは、キレート剤からプロトンが除かれて、結合手を有する基であり、「キレート剤」とは、金属と配位結合できる化合物である。
ある実施形態として、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が配位子及びリンカーである場合、配位子を構成するキレート剤としては、シデロホアと非シデロホアが挙げられる。さらにある態様としては、ＭＡＧ３（メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン、ＣＡＳ番号：６６５１６−０９−４）、及びその公知の反応性誘導体が挙げられる。シデロホアとしては、ヒドロキサム酸型、カテコール型、又は、混合配位子型が挙げられる。ヒドロキサム酸型シデロホアとしては、例えば、フェリクローム、下式：
Figure 2020075746
 で示されるデフェロキサミン（ＤＦＯ）、フサリニンＣ、オルニバクチン、ロドトルル酸、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。カテコール型シデロホアとしては、例えば、エンテロバクチン、バチリバクチン、ビブリオバクチン、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。混合配位子型シデロホアとしては、例えば、アゾトバクチン、ピオベルジン、エルシニアバクチン、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。なお、上記シデロホアの場合、ＤＦＯはその反応性官能基である−ＮＨ２を介してリンカー又はＦａｂフラグメントと反応させることができ、ＤＦＯ以外のシデロホアの場合には、カルボキシ基、水酸基、アミノ基等の反応性官能基を介して、当業者が通常用いる方法でリンカー又はＦａｂフラグメントと反応させることもできる。
非シデロホアとしては、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸、ＣＡＳ番号：６７−４３−６）、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ（１，７−ビス（メチルカルバモイルメチル）−１，４，７−トリアザヘプタン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：１１９８９５−９５−３）、ＥＯＢ−ＤＴＰＡ（エトキシベンジルＤＴＰＡ、２−［［（２Ｓ）−２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−３−（４−エトキシフェニル）プロピル］−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］アミノ］酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸、ＣＡＳ番号：８６９−５２−３）、ＤＯ３Ａ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：２１７９７３−０３−０）、ＨＰ−ＤＯ３Ａ（１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：１２００４１−０８−９）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸、ＣＡＳ番号：６０２３９−１８−１）、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。
本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が配位子及びリンカーである場合の配位子を構成する「キレート剤」は、好ましくはＤＦＯである。
「リンカー」とは、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントと配位子の間に距離をつくる基である。ある実施形態として、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が配位子及びリンカーである場合、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントと配位子の間に距離をつくるリンカーとしては、下式：
Figure 2020075746
 （以下−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−と表記する）、−ＣＨ２−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ１−２０ アルキレン）−Ｃ（＝Ｏ）−、が挙げられる。ここで「Ｃ１−２０ アルキレン」とは、直鎖又は分岐の炭素数１〜２０のアルキレンである。Ｃ１−２０ アルキレンのある態様としては、Ｃ１−１０ アルキレン、Ｃ１−２アルキレンが挙げられる。Ｃ１−２０ アルキレンのある態様としては、エチレンが挙げられる。リンカーを形成するために用いることができる試薬としては、ＨＯ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ１−２０ アルキレン）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、コハク酸、ｐ-フェニレンジイソチオシアナート等が挙げられる。
本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が配位子及びリンカーである場合の「リンカー」は、好ましくは−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−である。
本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が配位子及びリンカーである場合、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントとリンカーを反応させて得られた物質に配位子を形成するキレート剤を反応させて製造することができる。配位子を形成するキレート剤にリンカーを反応させて得られた物質に抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを反応させて製造することもできる。反応例としては、キレート剤のアミノ基とリンカーとを反応させて得られた物質を、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基やリジン側鎖のアミノ基）と反応させることが挙げられる。標識部が配位子である場合、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントと配位子を形成するキレート剤を反応させて製造することもできる。反応例としては、キレート剤を、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基やリジン側鎖のアミノ基）と反応させることが挙げられる。本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の製造には、アミンにイソチオシアネートを加えてチオウレアを合成する反応や、アミンにカルボン酸を加えてアミドを合成する反応等を用いることができる。当該反応は、当業者に公知の方法を適用することにより行うことができる。なお、原料として予め配位子とリンカーが結合した化合物を用いることもできる。配位子とリンカーが結合した化合物の例としては、以下の式で示されるｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ（ｐ−イソチオシアノフェニルアミノチオカルボニル基置換ＤＦＯ、ＣＡＳ番号：１２２２４６８−９０−７）：
Figure 2020075746
 、ｐ−イソチオシアノベンジル基置換ＤＴＰＡ（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ、ＣＡＳ番号：１０２６５０−３０−６）、ｐ−イソチオシアノベンジル基置換ＤＯＴＡ（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ、ＣＡＳ番号：１２７９８５−７４−４）、及び、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ（［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアナートフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸、ＣＡＳ番号：１５７３８０−４５−５）が挙げられる。
ある実施形態として、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が下式（Ｉ）で表される配位子及びリンカーである複合体である：
Figure 2020075746
 式中、波線は抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している。
前述の通り、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が配位子及びリンカーである場合、配位子を構成するキレート剤が金属放射性同位元素とキレート錯体を形成しうる。本明細書において、金属放射性同位元素は例えば、ＰＥＴトレーサー等に用いられるものをいい、８９Ｚｒ、５１Ｍｎ、５２Ｆｅ、６０Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎ等が挙げられるが、好ましくは８９Ｚｒである。すなわち、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、金属放射性同位元素を含まないものであっても、金属放射性同位元素として８９Ｚｒを含むものであってもよい。
また、本発明の医薬組成物が提供される際の態様としては、金属放射性同位元素を含まない態様で提供し、使用の直前に金属放射性同位元素で標識して使用しても、金属放射性同位元素を含む診断に用いる医薬組成物として提供されてもよい。例えば、短半減期の金属放射性同位元素（例えば、８９Ｚｒ（半減期３．３日））を用いる場合には、金属放射性同位元素を含まない態様で提供し、使用の直前に金属放射性同位元素で標識することが好ましい。
１−２−２．蛍光色素を含む標識部
ある実施形態として、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が蛍光色素である場合、蛍光色素としては、光イメージングに通常用いられる近赤外波長（６５０〜１０００ｎｍ）に吸収極大及び発光極大がある色素を用いることができる。蛍光色素のある態様としては、シアニン又はインドシアニン化合物が挙げられる。ある態様としては、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ社）、Ｃｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＢＯＤＩＰＹ、及びＤｙＬｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＣＦ７９０（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）、ＤＹ（ＤＹＯＭＩＣＳ ＧＭＢＨ社）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６８０、及びＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ７５０（Ａｎａｓｐｅｃ社）、ＰＵＬＳＡＲ６５０、及びＱＵＡＳＡＲ６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられる。
本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が蛍光色素である場合の蛍光色素は、好ましくは下式で表されるＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）：
Figure 2020075746
 である。なお、上記の蛍光色素は、そのカルボキシ基、水酸基、アミノ基等を介して、あるいは当業者が通常用いる方法で活性化基を導入し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントあるいは抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントに結合したリンカーと反応させることができる。活性化基が導入された蛍光色素のある態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基でエステル化された蛍光色素が挙げられる。例えば、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷのＮＨＳエステルは市販されており、それらを利用可能である。
ある実施形態として、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が下式（ＩＩ）で表される蛍光色素である複合体である：
Figure 2020075746
 式中、波線は抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｏ）の炭素原子と結合している。
医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体において、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントと、標識部との結合は、公知の手法により、当業者が適宜行うことができる。例えば、標識部を抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基やアミノ酸側鎖のアミノ基）、１以上のチオール基（例えば、アミノ酸側鎖のチオール基）、又は１以上のカルボキシル基（例えば、Ｃ末端やアミノ酸の側鎖のカルボキシル基）に結合させることができる。ある態様として、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、標識部が抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基に結合した、複合体である。
１−３．標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体
本発明の医薬組成物は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含むものである。ある態様では、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものであり、
前記標識部が、下式（Ｉ）：
Figure 2020075746
 ［式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している］で示される基である、標識部−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体である。
ある態様では、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものである。
また、ある態様では、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、前記抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものであり、
前記標識部が、下式（Ｉ）：
Figure 2020075746
 ［式中、波線は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している］で示される基である、標識部−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体である。
ある態様では、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものである。
また、ある態様では、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、前記抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものであり、
前記標識部が、下式（ＩＩ）：
Figure 2020075746
 ［式中、波線は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｏ）の炭素原子と結合している］で示される基である、標識部−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体である。
ある態様では、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
（ｂ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される１以上のものである。
本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントに１以上の標識部が結合した複合体である。本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、ある態様としては１〜２５の標識部と結合した、ある態様としては１〜２３の標識部と結合した、ある態様としては１〜１６の標識部と結合した、ある態様としては１〜１１の標識部と結合した、ある態様としては１〜１０の標識部と結合した、ある態様としては１〜９の標識部と結合した、ある態様としては４〜２３の標識部と結合した、ある態様としては４〜１６の標識部と結合した、ある態様としては４〜１０の標識部と結合した、ある態様としては４〜９の標識部と結合した、ある態様としては３〜２３の標識部と結合した、ある態様としては３〜１６の標識部と結合した、ある態様としては３〜１０の標識部と結合した、ある態様としては３〜９の標識部と結合した、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである。ある態様としては、更に金属を含む、１つ以上の標識部と結合した抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである。
本発明の医薬組成物に含まれる複合体は、１以上の標識部と、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体である。ある態様としては、１〜２７の標識部と結合した、ある態様としては、１〜２３の標識部と結合した、ある態様としては１〜１５の標識部と結合した、ある態様としては１〜１１の標識部と結合した、ある態様としては１〜９の標識部と結合した、ある態様としては１〜７の標識部と結合した、ある態様としては１〜５の標識部と結合した、更に、ある態様としては１〜４の標識部と結合した、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである。ある態様としては、更に金属を含む、１つ以上の標識部と結合した抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである。
なお、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体は、特に記載がない限りフリー体及びその塩も包含する。ここで「その塩」とは、その複合体の置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合があり、その化合物及び複合体が形成しうる塩である。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩及びアンモニウム塩等が挙げられる。例えば、ＤＦＯは、デフェロキサミンメタンスルホン酸塩としても存在し、他の塩としても存在する。
本発明の医薬組成物における標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の濃度は、診断上又は治療上有効な作用を発揮する量であれば特に制限されないが、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５〜２０ｍｇ／ｍＬである。
１−４．緩衝剤
本発明の医薬組成物における緩衝剤は、後述の範囲にｐＨを維持し、配位子への金属放射性同位元素の配位効率への影響を抑えるという観点から、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを用いることができる。また、本発明の医薬組成物における緩衝剤の濃度は、緩衝剤の種類と目的のｐＨに応じて変動するが、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
ある態様では、本発明の医薬組成物における緩衝剤はクエン酸であり、その濃度は１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌである。また、ある態様では、本発明の医薬組成物における緩衝剤はリン酸であり、その濃度は１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌである。
１−５．安定化剤
本発明の医薬組成物における安定化剤は、保存時における熱ストレス、光ストレス又は振盪ストレス等による多量体、酸性側電荷類縁体、又は不溶性微粒子の発生を抑制しつつ、かつ配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下や蛍光色素の退色も抑制するという観点から、スクロース又はグリセリンを用いることができる。また、本発明の医薬組成物における安定化剤の濃度は、用いる安定化剤の種類に応じて変動するが、５〜３０ｗ／ｖ％であることが好ましい。
ある態様では、本発明の医薬組成物における安定化剤はスクロースであり、その濃度は５〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは１５〜２５ｗ／ｖ％である。また、ある態様では、本発明の医薬組成物における緩衝剤はグリセリンであり、その濃度は５〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは１５〜２５ｗ／ｖ％である。
１−６．非イオン性界面活性剤
本発明の医薬組成物では、非イオン性界面活性剤を用いることができる。本発明の医薬組成物において非イオン性界面活性剤は、不溶性微粒子の発生を抑制しつつ、かつ配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下や蛍光色素の退色も抑制するという観点から、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポロキサマー１８８を用いることができる。なお、ポリソルベート８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンオレイン酸エステルとも呼ばれ、無水ソルビトールの水酸基の一部をオレイン酸でエステル化したもののポリオキシエチレンエーテルであり、モノオレイン酸ソルビタン１モルに対して約２０モルの酸化エチレン基がエーテル結合した構造を有するものである。また、本発明の医薬組成物における非イオン性界面活性剤の濃度は、その種類に応じて変動するが、０．０２〜０．２ｗ／ｖ％であることが好ましい。
ある態様では、本発明の医薬組成物における非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０であり、その濃度は０．０２〜０．２ｗ／ｖ％、好ましくは０．０４〜０．１ｗ／ｖ％である。
１−７．ｐＨ
本発明の医薬組成物では、保存時における熱ストレス、光ストレス又は振盪ストレス等による多量体、酸性側電荷類縁体、又は不溶性微粒子の発生を抑制しつつ、かつ配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下や蛍光色素の退色も抑制するという観点から、ｐＨは６．５〜７．５であり、より好ましくは６．５〜７．０である。
ある態様では、本発明の医薬組成物は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体として前述の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体又は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを５〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、緩衝剤として１５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸を含み、安定化剤として１５〜２５ｗ／ｖ％のスクロースを含み、非イオン性界面活性剤として０．０４〜０．１ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含み、ｐＨが６．５〜７．０であることが好ましい。
１−８．診断に用いる医薬組成物
本発明は、ある態様では、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む、診断に用いる医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体が、標識部として配位子を含む場合、金属放射性同位元素（例えば、８９Ｚｒ）を配位させることで、検出可能な複合体となる。また、本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体が、標識部として蛍光色素を含む場合、当該複合体が検出可能な複合体である。これらの検出可能な複合体は、早期診断薬、病期診断薬又は術中診断薬（特に癌の診断薬）として利用することできる。術中診断薬とは、外科手術や内視鏡手術等の手術中に、病変部を特定し、その性質を検査することが可能な診断薬を意味する。本発明の診断に用いる医薬組成物を術中診断薬として使用する場合、当該診断に用いる医薬組成物は、例えば手術の２〜３２時間前、ある態様としては６〜２４時間前、また別の態様としては２時間前、に患者に投与される。
早期診断薬とは、病状が観察されない、又は病期の早い段階で診断を行うことを目的とする診断薬を意味する。例えば、癌においては、病状が観察されないか、ステージ０又はステージ１の段階で用いる診断薬を意味する。
病期診断薬とは、病状がどの程度進行しているかを検査することが可能な診断薬を意味する。例えば、癌については、そのステージを検査することが可能な診断薬を意味する。
本発明の医薬組成物が標識部−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む場合、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する癌の診断に使用できる。ある態様では、本発明の医薬組成物が標識部−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む場合、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌、又はこれらが転移した癌の診断に使用することが好ましく、特に大腸癌又は大腸癌が転移した癌の診断に使用することが好ましい。大腸癌が転移した癌は特に限定されないが、例えば、転移性肝癌が挙げられる。
本発明の医薬組成物が標識部−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む場合、ヒトＭＵＣ１を発現する癌の診断に使用できる。ある態様では、本発明の医薬組成物が標識部−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む場合、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、又は子宮頚癌の診断に使用でき、特に乳癌又は膀胱癌の診断に使用することが好ましい。
１−９．医薬組成物の剤形・添加物
本発明の医薬組成物の剤形は特に限定されないが、ある態様では、液体製剤、凍結製剤、又は凍結乾燥製剤である。また、本発明の医薬組成物は、例えば、注射剤や点滴用剤等の非経口剤として用いることができ、静脈内注射、標的局所への筋肉内注射、又は皮下注射等により投与することが好ましい。本発明の医薬組成物における検出可能な標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の用量は、患者の年齢や体重、使用する製剤の剤型、あるいはＦａｂフラグメントの結合力価等により異なるが、例えば、患者の単位体重あたりＦａｂフラグメントの質量ベースで０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
本発明の医薬組成物には、所望により、懸濁剤、溶解補助剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、賦形剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の医薬品添加物を適宜添加することができる。
懸濁剤としては、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を挙げることができる。
保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール等を挙げることができる。
吸着防止剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
賦形剤としては、例えば、キシリトール等を挙げることができる。
無痛化剤としては、例えば、イノシトール、リドカイン等を挙げることができる。
含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。
酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、あるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることができる。
２．診断に用いる医薬組成物の使用・診断方法
本発明はまた、癌の早期診断に用いる医薬組成物、病期診断に用いる医薬組成物又は術中診断に用いる医薬組成物の製造のための、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の使用に関する。本発明は、ある態様では、癌の早期診断、病期診断又は術中診断において使用するための、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物である。
本発明は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物を、手術前又は手術中に対象に投与することを含む癌の診断方法にも関する。ここにおいて、「対象」とは、その診断を受けることを必要とするヒト又はその他の哺乳動物であり、ある態様としては、その診断を受けることを必要とするヒトである。前記診断方法における標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む本発明の医薬組成物の有効量は、患者の年齢や体重、使用する製剤の剤型、あるいはＦａｂフラグメントの結合力価等により異なるが、例えば、患者の単位体重あたりＦａｂフラグメントの質量ベースで０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。前記診断方法において、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む本発明の医薬組成物は、標的組織局所への筋肉内注射、又は皮下注射等により投与することが好ましい。前記診断方法において、本発明の医薬組成物を手術前に投与する場合、当該複合体は、例えば手術の２〜４８時間前、ある態様としては６〜２４時間前、また別の態様としては２時間前、に患者に投与される。
別の実施形態において、本発明は、本発明の医薬組成物の製造のための、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の使用にも関する。
３．標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物の製造方法、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を安定に保存する方法
ある態様では、本発明は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物の製造方法に関するものである。具体的には、本発明は、ある態様では、（ａ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を製造し、配合する工程、（ｂ）クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝剤として配合する工程、（ｃ）スクロース又はグリセリンを安定化剤として配合する工程、（ｄ）ポリソルベート８０を非イオン性界面活性剤として配合する工程、及び（ｅ）ｐＨを６．５〜７．５に調整する工程、を含む、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物の製造方法である。なお、配合の順番は特に限定されない。
また、ある態様では、本発明は、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を安定に保存する方法に関するものである。本明細書において「安定に保存する」とは、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の保存時における多量体や不溶性微粒子の発生を抑制することをいう。また、ある態様では、本明細書において「安定に保存する」は、配位子への金属放射性同位元素の配位効率の低下や蛍光色素の退色を抑制することも含む概念である。具体的には、本発明は、ある態様では、（ａ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝剤として配合する工程、（ｂ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、スクロース又はグリセリンを安定化剤として配合する工程、（ｃ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、ポリソルベート８０を非イオン性界面活性剤として配合する工程、及び（ｄ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液のｐＨを６．５〜７．５に調整する工程、を含む、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を安定に保存する方法である。なお、配合の順番は特に限定されない。
前述の製造方法及び安定に保存する方法において、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントや標識部の構造や、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の構造等については、前述の「１．医薬組成物」の項に記載した通りである。また、緩衝剤、安定化剤及び非イオン性界面活性剤の濃度範囲やｐＨの範囲等についても、前述の「１．医薬組成物」の項に記載した通りである。また、前記工程はいずれの順序で行ってもよい。
また、前述の製造方法及び方法において、標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体が標識部として配位子を含む場合、ある態様では、金属放射性同位元素を配位させる工程を含めることができる。なお、金属放射性同位元素の種類等についても、前述の「１．医薬組成物」の項に記載した通りである。
さらに、前述の製造方法及び方法において、ある態様では、凍結させる工程や凍結乾燥する工程を含めることができる。なお、凍結方法や凍結乾燥方法については、公知の方法を用いることができる。
４．標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の製造方法
４−１．抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチド
抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドには、本発明の医薬組成物に含まれる複合体が抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む場合、ある態様では、当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
ある実施形態において、前記当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基番号１から３６３までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基番号１から３３６までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
好ましい実施形態において、前記当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドには、本発明の医薬組成物に含まれる複合体が抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを含む場合、ある態様では、当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
ある態様において、前記当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
好ましい実施形態において、前記当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
ある実施形態において、前記当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１５に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
好ましい実施形態において、前記当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、前記抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント又は前記抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該技術分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開第９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
４−２．抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現ベクター
本発明の医薬組成物に含まれる複合体中の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターには、前記抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに前記抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び前記抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
好ましい発現ベクターとしては、配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
より好ましい本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードする発現ベクターには、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
本発明の医薬組成物に含まれる複合体中の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターには、前記抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに前記抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び前記抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
好ましい発現ベクターとしては、配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
より好ましい発現ベクターとしては、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
これらの発現ベクターは、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中において前記ポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。
これらの発現ベクターは、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒト抗Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの重鎖フラグメント及び／又は軽鎖をコードする遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。宿主細胞中で本発明の医薬組成物に含まれるＦａｂフラグメントを発現させるためのプロモーターとしては、宿主細胞がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
これらの発現ベクターは、宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞又は昆虫細胞を用いる場合、本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒト抗Ｆａｂフラグメントをコードする発現ベクターは、開始コドン、及び終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の医薬組成物に含まれる重鎖フラグメント及び／又は軽鎖をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
４−３．発現ベクターで形質転換される宿主細胞
抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
１つの実施形態において、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される宿主細胞である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
１つの実施形態において、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される宿主細胞である：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
また、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の医薬組成物に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
１つの実施形態において、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される宿主細胞である：
（ａ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
１つの実施形態において、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される宿主細胞である：
（ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、Ｆａｂフラグメントを発現しうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属等）、動物細胞又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）等）、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞）が例示される。形質転換自体は、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等、公知の方法により行われ得る。
４−４．抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの製造方法
前記抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの製造方法、好ましくは抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント又は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの製造方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を包含する。
抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの製造方法において、形質転換された宿主細胞は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源のような栄養源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）等）を含んでいてもよい。
形質転換された宿主細胞の培養自体は、公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９５２；１２２：５０１）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９５９；８：３９６−３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．；１９６７；１９９：５１９−５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；１９５０；７３：１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜３３６時間行われ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（ＰＮＡＳ；１９８５；８２：８４０４−８４０８）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；１９７２：４３１）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（ＰＮＡＳ；１９８０；７７：４５０５−４５０８）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
前記抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントの製造方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程に加えて、発現させた抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを回収、好ましくは単離、精製する工程を含むことができる。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
４−５．標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の製造方法
本発明の医薬組成物に含まれる標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体の製造方法は、前記抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを標識部と共有結合させる工程を含む。当該複合体を製造する方法はまた、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントと標識部とを共有結合させる工程を含んでいてもよい。当該複合体を製造する方法はまた、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントと標識部とを共有結合させる工程を含んでいてもよい。使用されるリンカー、配位子、又は蛍光色素等は、「１．医薬組成物」の項に記載のものを使用することができる。
ある態様としては、当該複合体を製造する方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを配位子とリンカーを介して結合させる工程を含む方法である。ある態様としては、当該複合体を製造する方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを配位子とリンカーを介して結合させる工程を含む方法である。
ある態様としては、当該複合体を製造する方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントをｉ）配位子とリンカーを介して結合させる又はｉｉ）配位子と直接共有結合させる工程を含む方法である。ある態様としては、当該複合体を製造する方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントをｉ）配位子とリンカーを介して結合させる又はｉｉ）配位子と直接共有結合させる工程を含む方法である。
ある態様としては、当該複合体を製造する方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントをｉ）蛍光色素とリンカーを介して結合させる又はｉｉ）蛍光色素と直接共有結合させる工程を含む方法である。ある態様としては、当該複合体を製造する方法は、形質転換された前記宿主細胞を培養し、抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントをｉ）蛍光色素とリンカーを介して結合させる又はｉｉ）蛍光色素と直接共有結合させる工程を含む方法である。
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
実験１−１：抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの作製
マウス由来の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体であるＴ８４．６６を文献（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．；２００４；１７：４８１−４８９）に記載の方法を参考にしてヒト化後、文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；２０１４；８２：１６２４−１６３５）に準じて構築したヒト化抗体の分子モデルを用いて、標識部を結合させても親和性が減弱しないことが期待される可変領域を有する抗体を設計した。
前記抗体の重鎖フラグメント遺伝子（配列番号１）の５’側にシグナル配列（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１７））をコードする遺伝子を繋げ、この重鎖フラグメント遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ社）に挿入した。また、抗体の軽鎖遺伝子（配列番号３）の５’側にシグナル配列（ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１８））をコードする遺伝子を繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）に挿入した。抗体の重鎖フラグメントと軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のｐＥＥベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ライゲーション用キットＴＡＫＡＲＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（Ｔａｋａｒａ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。
前述の重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗体発現を行った。一過性発現については、Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｎｔｉｆｉｃ社）で約３００万個／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対し、前述の重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクトし、５〜７日間培養した。培養上清をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて精製し、Ｆａｂフラグメントを得た。恒常的発現については、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にＰｖｕＩで直鎖にした前述の重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターをＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いたエレクトロポレーション法にてトランスフェクトした。トランスフェクト翌日にメチオニンスルホキシミンを添加し、５〜７日間培養した。メチルセルロース含有半固形培地に細胞を播種し、コロニー形成後にＣｌｏｎｅＰｉｘ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＦａｂフラグメントの発現量が多い細胞を取得した。当該細胞の培養上清をＣａｐｔｏ Ｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）、及び、ＢｉｏＰｒｏ Ｓ７５（ワイエムシィ社）を用いて精製し、Ｆａｂフラグメントを得た。
作製した抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント（ＰＢ００９−１と称する。）の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、ＰＢ００９−１の軽鎖をコードする塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。ＰＢ００９−１の重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１１０までのアミノ酸配列からなる。ＰＢ００９−１の軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２４から３８、５４から６０、９３から１０１までのアミノ酸配列からなる。
なお、可変領域及びＣＤＲ配列はＫａｂａｔ番号付けに従って決定した（Ｋａｂａｔら；１９９１；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、 ５ｔｈ Ｅｄ．、 Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。
実験１−２：抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントのキレート剤標識化
キレート剤であるＤＦＯの抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体ＦａｂフラグメントＰＢ００９−１への結合には、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ（ｐ−イソチオシアノフェニルアミノチオカルボニル基置換ＤＦＯ）（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社）を使用した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にて１ｍｇ／ｍＬに調製したＦａｂフラグメント溶液に、１／５量の０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）を添加した。これに終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるようにｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯを添加し、３７℃で１時間半反応させた。反応後、アミコンウルトラ３Ｋ−０．５ｍＬ遠心式フィルター（メルクミリポア社）を用いて、ＤＦＯがリンカー（−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−）を介して結合したＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体（ＰＢ００９−２と称する。）を精製した。
ＰＢ００９−２について、質量分析でＤＦＯから構成される配位子の結合数を確認した。ＰＢ００９−２を、ＭａｓｓＰＲＥＰ Ｍｉｃｒｏ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて脱塩し、ＳＹＮＡＰＴ Ｇ２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて測定を実施した。その結果、１個のＰＢ００９−１にＤＦＯから構成される配位子が少なくとも３個から１０個結合した分子が確認された。
実験１−３：ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼすｐＨの影響の検討（多量体生成及び酸性側電荷類縁体生成への影響）
ＰＢ００９−２を含む液剤について、ｐＨがＰＢ００９−２の安定化に及ぼす影響を評価した。本試験では、ＰＢ００９−２を含む液剤に対して、ＰＢ００９−２の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝剤及び非イオン性界面活性剤を配合し、表１に示す試料Ａ−１〜Ａ−６を調製した。なお、ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加して調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の正置状態における熱安定性試験を行った。熱安定性試験では、２５℃１週間保管後におけるＰＢ００９−２の安定性を、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）によって測定される多量体量、及び画像化キャピラリー等電点電気泳動法（ｉｃＩＥＦ法）によって測定される酸性側電荷類縁体量に基づいて評価した。分析条件は以下の通りである。
［サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）］
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、Ｇ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社）を接続し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／４００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。試料はＰＢ００９−２換算で５０μｇとなる注入量（例：５ｍｇ／ｍＬの場合は１０μＬ）とした。カラム温度は３０℃、試料温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
［画像化キャピラリー等電点電気泳動法（ｉｃＩＥＦ法）］
ｉｃＩＥＦ測定は、ｉＣＥ３システムに、ｃＩＥＦ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ社）を接続し、測定を行った。尿素、メチルセルロース、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ３−１０、ｐＩマーカー５．１２、ｐＩマーカー９．７７から成るサンプルマトリックス１８８μＬと、超純水でＰＢ００９−２濃度５ｍｇ／ｍＬに希釈したサンプル１２μＬを混和し、測定試料とした。Ｐｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇは１５００Ｖで１分、Ｆｏｃｕｓｉｎｇは３０００Ｖで６分実施した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定後、検出された多量体の面積を自動分析法により測定し、多量体の量（％）を求めた。多量体量（％）については、ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体ピークの総面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として規定した。ここでメインピークとは、活性本体（多量体化されていないＰＢ００９−２）のピークを指す。
ｉｃＩＥＦ法で検出された酸性側電荷類縁体の面積を自動分析法により測定し、酸性側電荷類縁体の量（％）を求めた。酸性側電荷類縁体量（％）については、ｉｃＩＥＦ法で検出された酸性側電荷類縁体ピークの総面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として規定される。ここでメインピークとは、活性本体（類縁化されていないＰＢ００９−２）のピークを指す。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法による評価結果を、表２に示す。その結果、２５℃１週間保管後におけるＳＥ−ＨＰＬＣ多量体量（％）は、ｐＨが低いほど増加傾向にあり、ｐＨ７．０付近で最小となった。また、２５℃１週間保管後における酸性側電荷類縁体量（％）は、ｐＨが低いほど減少傾向となった。以上の結果を総合的に判断し、安定性の観点から、ＰＢ００９−２を含む液剤のｐＨは７．０付近が最適であると確認された。
Figure 2020075746
実験１−４：ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼす安定化剤、非イオン性界面活性剤の影響の検討（多量体生成及び酸性側電荷類縁体生成への影響）
ＰＢ００９−２を含む液剤について、各種安定化剤又は非イオン性界面活性剤がＰＢ００９−２の安定性に及ぼす影響を評価した。本試験では、ＰＢ００９−２を含む液剤に対して、ＰＢ００９−２の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝剤及び添加剤を配合し、表３に示す試料Ｂ−１〜Ｂ−１０を調製した。なお、ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の正置状態における熱安定性試験を行った。熱安定性試験では、２５℃１週間保管後におけるＰＢ００９−２の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量、及びｉｃＩＥＦ法によって測定される酸性側電荷類縁体量に基づいて評価した。ＳＥ−ＨＰＬＣ法の実験法は以下の通りである。
［サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）］
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を接続し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／４００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。試料はＰＢ００９−２換算で５０μｇとなる注入量（例：５ｍｇ／ｍＬの場合は１０μＬ）とした。カラム温度は３０℃、試料温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定後、検出された多量体の面積を自動分析法により測定し、多量体の量（％）を求めた。多量体量（％）については、ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体ピークの総面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として規定した。ここでメインピークとは、活性本体（多量体化されていないＰＢ００９−２）のピークを指す。
ｉｃＩＥＦ法の分析条件は実験１−３と同じである。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法、及びｉｃＩＥＦ法による評価結果を表４に示す。まず、２５℃１週間保管後におけるＳＥ−ＨＰＬＣ多量体量（％）は、ヒスチジン、スクロース、及びグリセリン添加試料において増加抑制傾向にあった。また、２５℃１週間保管後における酸性側電荷類縁体量（％）は、ヒスチジン、アスパラギン酸添加試料において増加が認められた。以上の結果を総合的に判断し、安定性の観点から、スクロース又はグリセリンがＰＢ００９−２を含む液剤の安定化剤として望ましいことが確認された。
Figure 2020075746
実験１−５：ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼす界面活性剤の影響の検討（不溶性微粒子生成への影響）
ＰＢ００９−２を１０ｍｇ／ｍＬ含み、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、ｐＨ７．０とした処方の液剤について、界面活性剤であるポリソルベート８０を０〜０．６ｗ／ｖ％の範囲で含有する試料を調製した（試料Ｎｏ．Ｃ−１〜Ｃ−７：表５参照）。なお、ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
各試料について、振盪後及び凍結融解後における不溶性微粒子数を、光遮蔽粒子計数法を用いて測定した。振盪試験は、試料を１５０ｒｐｍで２４時間振盪させることによって行った。また、凍結融解試験は、試料を−８０℃で４時間以上かけて凍結させ、その後５℃で４時間以上かけて融解させるというプロセスを計３回実施することによって行った。光遮蔽粒子計数法の分析条件は以下の通りである。
［光遮蔽粒子計数法］
サンプル０．２ｍＬをＨＩＡＣシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に注入し、試料１ｍＬ中に含まれる粒径１．２μｍ以上の不溶性微粒子の粒子数の測定を実施した。
本実験で得られた光遮蔽粒子計数法による評価結果を表６に示す。振盪及び凍結融解によって不溶性微粒子数は増加するが、ポリソルベート８０を０．０２ｗ／ｖ％以上の濃度で添加することでその増加が抑制されることが示された。そして、ＰＢ００９−２を含む液剤に０．０５ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を加えることが不溶性微粒子の生成を抑制する観点で望ましいことが確認された。
Figure 2020075746
実験１−６：ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化のための至適ｐＨ選定
ＰＢ００９−２を１０ｍｇ／ｍＬ含み、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、又は２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を緩衝剤として、１０ｗ／ｖ％スクロースを安定化剤として、及び０．０５ｗ／ｖ％ポリソルベート８０を非イオン性界面活性剤として含む処方（試料Ｎｏ．Ｄ−１〜Ｄ−８）について、ｐＨ６．１〜７．９の範囲で試料を調製した。なお、ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。その後、各試料について正置状態での２５℃１週間保管後のＰＢ００９−２の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量に基づいて評価した。ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実験１−４と同様にして行った。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法による評価結果を表７に示す。２５℃１週間保管後におけるＳＥ−ＨＰＬＣ多量体量（％）は、低ｐＨ及び高ｐＨ試料のどちらにおいても増加傾向にあり、ｐＨ６．７付近で最も小さくなった。従って、ｐＨ６．７が至適ｐＨであり、至適ｐＨを適切に維持する緩衝剤として２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸が特に好ましいことが判明した。
Figure 2020075746
実験１−７：ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化のための安定化剤濃度の最適化検討
ＰＢ００９−２を１０ｍｇ／ｍＬ含み、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、０．０５ｗ／ｖ％ポリソルベート８０、ｐＨ６．７とした処方の液剤（試料Ｎｏ．Ｅ−１〜Ｅ−５）について、スクロース又はグリセリンを０〜２０ｗ／ｖ％の範囲で含有する試料を調製した。試料は、各処方組成に調製後、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。その後、各試料について正置状態での２５℃１週間保管後のＰＢ００９−２の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量に基づいて評価した。ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実験１−４と同様にして行った。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法による評価結果を表８に示す。その結果、２５℃１週間保管後では、スクロース又はグリセリンの添加濃度の増加に伴ってＳＥ−ＨＰＬＣ多量体量（％）の生成が抑制されることが確認された。また、スクロースとグリセリンでは安定性に及ぼす影響に差は認められなかった。以上の結果を踏まえると、浸透圧比の観点より１０ｗ／ｖ％スクロースがＰＢ００９−２を含む液剤のための医薬品添加剤として特に好ましいことが判明した。
Figure 2020075746
実験１−８：ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む安定化溶液製剤における ８９ Ｚｒ標識化の検討
ＰＢ００９−２を１０ｍｇ／ｍＬ含む、下記表９に記載の処方の液剤において、−８０℃保管後における８９Ｚｒによる標識効率を評価した。
８９Ｚｒは１Ｍシュウ酸水溶液に溶解した８９Ｚｒ−Ｏｘａｌａｔｅとして国立大学法人岡山大学自然生命科学研究支援センター 光・放射線情報解析部門鹿田施設にて製造したものを使用し、４０μＬの８９Ｚｒ−Ｏｘａｌａｔｅを２０μＬの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で中和し、１９０μＬの超純水で希釈した。続いて、０．０５ｗ／ｖ％ポリソルベート８０、１０ｗ／ｖ％スクロース又は３０ｗ／ｖ％グリセリン、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸を含むＰＢ００９−２（１０ｍｇ／ｍＬ）液剤を１５０μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。得られた反応混合物は、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ遠心式フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて精製することで目的のＰＢ００９−２の８９Ｚｒ標識体を得た。この８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体をＰＢ００９−３と称する。精製前後のＰＢ００９−３溶液をＴＬＣ（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定することで、８９Ｚｒの反応率を確認した。分析条件は以下の通りである。
ＴＬＣはＴＬＣアルミニウムシート（Ｍｅｒｃｋ社、１−０５５６０−０００１）にサンプルを少量塗布し、展開液として０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．０）を用いて実施した。８９Ｚｒの反応率は以下のように算出した。
（原点付近の放射線量ａ）／（全体の放射線量ｂ）×１００
［サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）］
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、Ｇ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社）を接続し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム／５％アセトニトリルｐＨ７．０の組成をもつ移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。カラム温度は３０℃、検出はＵＶ２８０ｎｍ及びＲＩで実施した。
試験の結果、検討したどちらの処方も反応率（精製前）は９０％前後と高い値を示し（表９）、ＵＶ検出器及びＲＩ検出器で認められるＰＢ００９−３のピークとＵＶ検出器で認められるＰＢ００９−２のピークを比較し、それぞれの保持時間が同等であったことからＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体が８９Ｚｒによって標識されていることを確認した。また、スクロース処方もグリセリン処方も、８９Ｚｒ標識反応を阻害する懸念は小さいことが示された。
Figure 2020075746
実験１−９：ＤＦＯ−抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む製剤における保管時の安定性の検討
ＰＢ００９−２を含む液剤に対して、ＰＢ００９−２の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにクエン酸、スクロース及びポリソルベート８０を配合し、表１０に示す試料Ｆ−１を調製した。なお、ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。また、当該試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の正置状態における保管安定性試験を行った。保管安定性試験は、−２０℃又は５℃で１〜６ヵ月間保管後におけるＰＢ００９−２の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量に基づいて評価した。ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実験１−４と同様に行った。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法による評価結果を表１１に示す。その結果、−２０℃での保管において、少なくとも６ヵ月間の保管安定性に問題がないことが確認された。５℃での保管においては、１ヵ月間までの保管安定性が同時期の−２０℃での保管安定性と同等であることが確認された。
Figure 2020075746
実験２−１：抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの作製
Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂと称する２種類の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを作製した。Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、具体的には、マウス由来の抗ヒト癌特異的ＭＵＣ１抗体である１Ｂ２抗体を文献（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．； ２００８ Ｊａｎ １；１３：１６１９−３３）に記載の方法を参考にしてヒト化後、文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；２０１４ Ａｕｇ；８２（８）：１６２４−３５）に準じて構築したヒト化抗体の分子モデルを用いて、親和性の向上及び標識部を結合させても親和性が減弱しないことが期待される配列を設計した。
Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂの各重鎖フラグメント遺伝子（それぞれ配列番号５及び配列番号７）の５’側にシグナル配列（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１７））をコードする遺伝子を繋げてできる重鎖フラグメント遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ社）を作製した。また、Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂ共通の軽鎖遺伝子（配列番号９）の５’側にシグナル配列（ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１８））をコードする遺伝子を繋げてできる軽鎖遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を作製した。
一過性発現の方法でＦａｂフラグメントの発現を行った。Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で約２５０万個／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対し、前述の重鎖フラグメント及び軽鎖のＧＳベクターをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクトし、８日間培養した。発現させた後、培養上清をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製し、各Ｆａｂフラグメントを得た。
Ｐ１０−１ Ｆａｂの重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。Ｐ１０−１ Ｆａｂの重鎖可変領域の塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１２にそれぞれ示す。
Ｐ１０−２ Ｆａｂの重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号７に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。Ｐ１０−２ Ｆａｂの重鎖可変領域の塩基配列を配列番号１３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１４にそれぞれ示す。
Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂの軽鎖は共通で、その塩基配列は配列番号９に、それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１０にそれぞれ示す。Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂの軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号１５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
精製したＰ１０−２ Ｆａｂのアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、重鎖Ｎ末端のグルタミンがピログルタミン酸に修飾されていることが示唆された。
実験２−２：抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントのキレート剤標識化
キレート剤であるＤＦＯの抗ヒトＭＵＣ１抗体ＦａｂフラグメントＰ１０−２への結合には、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ（ｐ−イソチオシアノフェニルアミノチオカルボニル基置換ＤＦＯ）（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社）を使用した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にて１２．５ｍｇ／ｍＬに調整したＦａｂフラグメント溶液に、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように１００ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム溶液を添加してｐＨ９．０に整えた。これに終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯを添加し、３７℃で２時間反応させた。ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯはイソチオシアネート基を有しているので、ＦａｂフラグメントのＬｙｓと速やかに反応する。これをアミコンウルトラ１０Ｋ−０．５ｍＬ 遠心式フィルターで回収し、ＤＦＯがリンカー（−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−）を介して結合したＤＦＯ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体（ＰＢ０１０−３と称する。）を精製した。
実験２−３：ＤＦＯ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼすｐＨの影響の検討（多量体生成及び不溶性微粒子生成への影響）
ＰＢ０１０−３を含む液剤について、ｐＨがＰＢ０１０−３の安定化に及ぼす影響を評価した。本試験では、ＰＢ０１０−３を含む液剤に対して、ＰＢ０１０−３の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝剤、安定化剤及び非イオン性界面活性剤を配合し、表１２に示す試料Ｇ−１〜Ｇ−６を調製した。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の正置状態における熱安定性試験を行った。熱安定性試験は、４０℃１週間保管後におけるＰＢ０１０−３の安定性を、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）によって測定される多量体量、及び光遮蔽粒子計数法によって測定される不溶性微粒子数に基づいて評価した。分析条件は以下の通りである。
［ＳＥ−ＨＰＬＣ法］
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＢｉｏＳｅｐ ＳＥＣ ｓ３０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を接続し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を移動相として用い、０．５ｍＬ／分の流量で流した。試料はＰＢ０１０−３換算で２０μｇとなる注入量（例：２ｍｇ／ｍＬの場合は１０μＬ）とした。カラム温度は３０℃、試料温度は１０℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
［光遮蔽粒子計数法］
サンプル０．２ ｍＬをＨＩＡＣシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に注入し、１．２μｍ以上の不溶性微粒子数の測定を実施した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体の面積を自動分析法により測定し、多量体の量（％）を求めた。多量体量については、ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体ピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として規定される。ここでメインピークとは、活性本体（多量体化されていないＰＢ０１０−３）のピークを指す。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法、光遮蔽粒子計数法による評価結果を表１３に示す。その結果、４０℃１週間保管後におけるＳＥ−ＨＰＬＣ多量体量（％）は、ｐＨが高いほど増加傾向となった。また、４０℃１週間保管後における１．２μｍ以上の不溶性微粒子数はｐＨが低いほど増加傾向となった。以上の結果を総合的に判断し、安定性の観点から、ＰＢ０１０−３を含む液剤のｐＨは６．５〜７．０付近が最適であると確認された。
Figure 2020075746
実験２−４：ＤＦＯ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼす安定化剤、非イオン性界面活性剤の影響の検討（多量体生成及び不溶性微粒子生成への影響）
ＰＢ０１０−３を含む液剤について、各種安定化剤がＰＢ０１０−３の安定性に及ぼす影響を評価した。本検討では、ＰＢ０１０−３を含む液剤に対して、ＰＢ０１０−３の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝剤、安定化剤及び非イオン性界面活性剤を配合し、表１４に示す試料Ｈ−１〜Ｈ−４を調製した。なお、ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の保管試験及び振盪試験を行った。保管試験は、各試料を５℃及び−２０℃条件下で静置保管することで行った。また、振盪試験は、試料を１５０ｒｐｍで２４時間振盪させることで行った。各試験前後におけるＰＢ０１０−３の安定性を、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）によって測定される多量体量、及び光遮蔽粒子計数法によって測定される不溶性微粒子数に基づいて評価した。
分析条件は実験２−３と同じである。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法、光遮蔽粒子計数法による評価結果を表１５、表１６に示す。その結果、ポリソルベート８０を加えていない処方、及びポリソルベート８０に加えてスクロース又はグリセリンを添加した処方では、５℃又は−２０℃で３ヵ月保管した場合でも、多量体量の増加抑制効果が認められた。一方、ポリソルベート８０を加えていない処方では、振盪試験後において、不溶性微粒子数の顕著な増加が認められた。以上の結果を踏まえ、ポリソルベート８０に加えてスクロース又はグリセリンを添加した処方が望ましく、さらには浸透圧比の観点より１０ｗ／ｖ％スクロースがＰＢ０１０−３を含む液剤のための医薬品添加剤として特に好ましいことが判明した。
Figure 2020075746
Figure 2020075746
実験２−５：ＤＦＯ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼす界面活性剤の影響の検討（不溶性微粒子生成への影響）
ＰＢ０１０−３を含む液剤について、界面活性剤がＰＢ０１０−３の安定性に及ぼす影響を評価した。本試験では、ＰＢ０１０−３を含む液剤に対して、ＰＢ０１０−３の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝剤、安定化剤及び非イオン性界面活性剤を配合し、ｐＨを調整して表１７に示す試料Ｉ−１〜Ｉ−４を調製した。なお、ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の振盪試験及び凍結融解試験を行った。振盪試験は、試料を１５０ｒｐｍで２４時間振盪させて行った。凍結融解試験は、試料を−８０℃で４時間以上かけて凍結し、その後、５℃で４時間以上かけて融解するというプロセスを計３回実施して行った。そして、各試験前後におけるＰＢ０１０−３の安定性を、光遮蔽粒子計数法によって測定される不溶性微粒子数に基づいて評価した。分析条件は実験２−３と同じである。
本実験で得られた光遮蔽粒子計数法による評価結果を、表１８に示す。その結果、ポリソルベート８０は０．０２ｗ／ｖ％以上の濃度にすることで、振盪時及び凍結融解時の不溶性微粒子数増加抑制効果があることが確認された。
Figure 2020075746
実験２−６：ＤＦＯ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む安定化溶液製剤における ８９ Ｚｒ標識化の検討
ＰＢ０１０−３を１０ｍｇ／ｍＬ含む、下記表１９に記載の処方の液剤において、−８０℃保管後における８９Ｚｒによる標識効率を評価した。
８９Ｚｒは１Ｍシュウ酸水溶液に溶解した８９Ｚｒ−Ｏｘａｌａｔｅとして国立大学法人岡山大学自然生命科学研究支援センター 光・放射線情報解析部門鹿田施設にて製造したものを使用し、４０μＬの８９Ｚｒ−Ｏｘａｌａｔｅを２０μＬの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で中和し、１９０μＬの超純水で希釈した。続いて、０．０５ｗ／ｖ％ポリソルベート８０、１０ｗ／ｖ％スクロース又は３０ｗ／ｖ％グリセリン、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸を含むＰＢ０１０−３（１０ｍｇ／ｍＬ）液剤を１５０μＬ添加し、室温で６０分間反応させた。得られた反応混合物を、アミコンウルトラ−０．５ｍＬ遠心式フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて精製することで目的のＰＢ０１０−３の８９Ｚｒ標識体を得た。この８９Ｚｒ標識したＰ１０−２ Ｆａｂ ＤＦＯ（ＰＢ０１０−３）をＰＢ０１０−４と称する。精製前後のＰＢ０１０−４溶液をＴＬＣ（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定することで、８９Ｚｒの反応率を確認した。ＴＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣ法の分析条件は実験１−８と同じである。
試験の結果、検討したどちらの処方も反応率（精製前）は９０％前後と高い値を示し（表１９）、ＵＶ検出器及びＲＩ検出器で認められるＰＢ０１０−４のピークとＵＶ検出器で認められるＰＢ０１０−３のピークを比較し、それぞれの保持時間が同等であったことからＰＢ０１０−３が８９Ｚｒによって標識されていることを確認した。検討を実施した処方は、どちらも８９Ｚｒ標識反応を阻害する懸念は小さいことが示された。
Figure 2020075746
実験２−７：ＤＦＯ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む製剤における保管時の安定性の検討
ＰＢ０１０−３を含む液剤について、冷蔵及び冷凍保管時の安定性を評価した。本試験では、ＰＢ０１０−３を含む液剤に対して、ＰＢ０１０−３の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝剤、安定化剤及び非イオン性界面活性剤を配合し、表２０に基づいて試料Ｊ−１を調製した。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料を５℃及び−２０℃条件下で静置保管した。保管後のＰＢ０１０−３の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量、逆相クロマトグラフ法（ＲＰ−ＨＰＬＣ法）によって測定されるフリーＦａｂ体量（％）、及び光遮蔽粒子計数法によって測定される不溶性微粒子数に基づいて評価した。分析条件は以下の通りである。
［ＳＥ−ＨＰＬＣ法］
実験２−３と同じ条件で実施した。
［ＲＰ−ＨＰＬＣ法］
ＲＰ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、Ｉｎｔｒａｄａ ＷＰ−ＲＰ（Ｉｍｔａｋｔ社）を接続し、測定を行った。移動相Ａラインに０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂラインに０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを接続し、下表に示す割合で１．０ｍＬ／分の流量で流した。試料はＰＢ０１０−３換算で２０μｇとなる注入量（例：１ｍｇ／ｍＬの場合は２０μＬ）とし、表２１のＲＰ−ＨＰＬＣグラジエントプログラムを適用した。カラム温度は６０℃、試料温度は１０℃に設定し、検出はＵＶ２１４ｎｍで実施した。
Figure 2020075746
ＲＰ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体の面積を自動分析法により測定し、フリーＦａｂ体量（％）を求めた。フリーＦａｂ体量については、ＲＰ−ＨＰＬＣ法で検出されたフリーＦａｂフラグメントのピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として規定される。ここでメインピークとは、活性本体のピークを指す。
［光遮蔽粒子計数法］
実験２−３と同じ条件で実施した。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法、ＲＰ−ＨＰＬＣ法、光遮蔽粒子計数法による評価結果を表２２に示す。その結果、３ヵ月までの保管安定性に問題がないことが確認された。
Figure 2020075746
実験３−１：抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの蛍光標識化
実験２−１で調製したＰ１０−２ Ｆａｂに対して蛍光色素の導入を行った。具体的には、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にて約１ｍｇ／ｍＬに調整したＦａｂフラグメント溶液に、１／１０量の１Ｍリン酸水素二カリウム溶液（ｐＨ９）を添加してｐＨ８．５に整えた。これに終濃度３１０．８μｇ／ｍＬとなるようにＩＲＤｙｅ８００ＣＷ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、室温及び遮光で２時間撹拌した。ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ ＮＨＳ ＥｓｔｅｒはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有しているので、ＦａｂフラグメントのＬｙｓと速やかに反応する。これをアミコンウルトラ３Ｋ−０．５ｍＬ 遠心式フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で回収し、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体（ＰＢ０１０−２と称する。）を精製した。
実験３−２：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼすｐＨの影響
ＰＢ０１０−２を含む液剤について、ｐＨがＰＢ０１０−２の安定化に及ぼす影響を評価した。本試験では、ＰＢ０１０−２の濃度を１０ｍｇ／ｍＬとし、表２３に基づいて試料Ｋ−１〜Ｋ−５を調製した。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の正置状態における熱安定性試験を行った。熱安定性試験は、４０℃１週間保管後におけるＰＢ０１０−２の安定性を、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）によって測定される多量体量、及びマイクロフローイメージング法によって測定される不溶性微粒子数より評価した。分析条件は以下の通りである。
［サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）］
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、Ｇ２０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社）を接続し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／１０００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。試料はＰＢ０１０−２換算で５０μｇとなる注入量（例：５ｍｇ／ｍＬの場合は１０μＬ）とした。カラム温度は３０℃、試料温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体の面積を自動分析法により測定し、多量体量（％）を求めた。多量体量については、ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体ピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として規定される。ここでメインピークとは、活性本体のピークを指す。
［マイクロフローイメージング法］
マイクロフローイメージングシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ社）にサンプル６５０μＬを注入し、試料１ｍＬ中に含まれる粒径１．２μｍ以上の不溶性微粒子の粒子数の測定を実施した。
本試験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法、マイクロフローイメージング法による評価結果を表２４に示す。その結果、４０℃１週間保管後のＳＥ−ＨＰＬＣ多量体は、ｐＨが高いほど増加傾向となった。また、４０℃１週間保管後における１．２μｍ以上の不溶性微粒子数は、ｐＨが低いほど増加傾向となった。以上の結果を総合的に判断し、ｐＨ６．５〜７．５付近が至適ｐＨであると確認できた。
Figure 2020075746
実験３−３：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼす安定化剤、又は非イオン性界面活性剤の影響
ＰＢ０１０−２を含む液剤について、各種安定化剤がＰＢ０１０−２の安定性に及ぼす影響を評価した。本試験では、ＰＢ０１０−２を含む液剤に対して、ＰＢ０１０−２の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝剤及び添加剤を配合し、表２５に基づいて試料Ｌ−１〜Ｌ−６を調製した。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムを適量添加し調整した。各試料は、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。
Figure 2020075746
液剤の安定性を評価するために、各試料の振盪試験、凍結融解試験、熱安定性試験、及び光暴露試験を行った。振盪試験は、試料を１５０ｒｐｍで２４時間振盪させて行った。凍結融解試験は、試料を−８０℃で４時間以上かけて凍結し、その後、５℃で４時間以上かけて融解するというプロセスを計３回実施して行った。熱安定性試験は、試料を４０℃で２週間保管して行った。光暴露試験は、試料を横置状態で保管し、白色蛍光ランプを用いて１０００ｌｘの光を９６時間照射することにより行った。そして、各試験前後におけるＰＢ０１０−２の安定性を、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）によって測定される多量体量、逆相クロマトグラフ法（ＲＰ−ＨＰＬＣ法）によって測定されるＤｙｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ、及びマイクロフローイメージング法によって測定される不溶性微粒子数に基づいて評価した。分析条件は以下の通りである。
［サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）］
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を接続し、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／１０００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ７．０の組成をもつ移動相を０．５ｍＬ／分の流量で流した。試料はＰＢ０１０−２換算で５０μｇとなる注入量（例：５ｍｇ／ｍＬの場合は１０μＬ）とした。カラム温度は３０℃、試料温度は５℃に設定し、検出はＵＶ２８０ｎｍで実施した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体の面積を自動分析法により測定し、多量体量（％）を求めた。多量体量については、ＳＥ−ＨＰＬＣ法で検出された多量体ピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として規定される。ここでメインピークとは、活性本体のピークを指す。
［逆相クロマトグラフ法（ＲＰ−ＨＰＬＣ法）］
ＲＰ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムにＩｎｔｒａｄａ ＷＰ−ＲＰ（Ｉｍｔａｋｔ社）を接続し、測定を行った。移動相Ａラインに０．１％トリフルオロ酢酸／水、移動相Ｂラインに０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルを接続し、１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した。試料はＰＢ０１０−２換算で１０μｇとなる注入量（例：１ｍｇ／ｍＬの場合は１０μＬ）とし、表２６のＲＰ−ＨＰＬＣグラジエントプログラムを適用した。分析時間は４５分間、検出はＵＶ波長２８０；７８０ｎｍで実施した。カラム温度は７５℃、試料温度は５℃に設定した。
Figure 2020075746
ＲＰ−ＨＰＬＣ法で検出されたＵＶ波長７８０ｎｍにおけるピークの総面積、ＵＶ波長２８０ｎｍにおけるピークの総面積、ＰＢ０１０−１の吸光係数（１．４２ ｍＬ／ｍｇ・ｃｍ−１）、ＰＢ０１０−１の分子量（４７５２７．４３）及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷのＰＢＳ中でのモル吸光係数（２４００００ ｍＬ／ｍｍｏｌ・ｃｍ−１）を用いて、以下の計算式に適用することで、Ｄｙｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏを求めた。
Figure 2020075746
［マイクロフローイメージング法］
マイクロフローイメージングシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ社）にサンプル６５０μＬを注入し、試料１ｍＬ中に含まれる粒径１．０μｍ以上の不溶性微粒子の粒子数の測定を実施した。
本実験で得られたＳＥ−ＨＰＬＣ法、ＲＰ−ＨＰＬＣ法、及びマイクロフローイメージング法による評価結果を表２７〜２９に示す。アルギニン添加処方及びスクロース添加処方においては、４０℃２週間保管後の多量体量の増加が抑制される傾向が認められた。また、アルギニン添加処方では、４０℃２週間保管後、Ｄｙｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏの低下が認められた。さらに、塩化ナトリウム添加処方及び添加剤無添加処方においては、凍結融解後の不溶性微粒子数が他処方と比較して増加する傾向が認められた。以上の結果を総合的に判断し、安定性の観点から、スクロースがＰＢ０１０−２を含む液剤の安定化剤及び等張化剤として望ましいことが確認された。
Figure 2020075746
Figure 2020075746
Figure 2020075746
実験３−４：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化のための至適ｐＨ選定
ＰＢ０１０−２を含む液剤について、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸又は２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸を緩衝剤とした処方（試料Ｎｏ．Ｍ−１〜Ｍ−１０）について、ｐＨ６．６〜７．４の範囲で試料を調製した。試料は、ＰＢ０１０−２最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬであり、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。各試料は０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。各試料の振盪試験、凍結融解試験、熱安定性試験、及び光暴露試験後の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量及びＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるＤｙｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏに基づいて評価した。なお、ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＲＰ−ＨＰＬＣ法は実験３−３と同様にして測定した。
結果を表３０〜３１に示す。
多量体量及びＤｙｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏの観点では、ｐＨが低いほど安定（高ｐＨでは熱・光ストレスにより不安定）となった。一方で、ｐＨ６．０に近づく程、溶解度低下による微粒子生成のリスクがある事から、ｐＨ６．８とすることが特に好ましいことが判明した。
Figure 2020075746
Figure 2020075746
実験３−５：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の安定化に及ぼす緩衝剤及び界面活性剤の影響
ＰＢ０１０−２を含み、２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ６．８）又は２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸（ｐＨ６．８）、２８０ｍｍｏｌ／Ｌスクロースを添加した処方に、界面活性剤であるポリソルベート８０を０．０５ｗ／ｖ％で添加した試料と添加していない試料（試料Ｎｏ．Ｎ−１〜Ｎ−４）を調製した。ＰＢ０１０−２の最終濃度は１０ｍｇ／ｍＬとした。試料は、各処方組成に調製後、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填して、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めして調製した。なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調整剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
試料を−２０℃あるいは５℃で１ヵ月保管し、また、熱安定性試験は、４０℃で２週間又は２５℃で１ヵ月間、正置状態で保管して行った。光暴露試験は、試料を横置状態で保管し、白色蛍光ランプを用いて１０００ｌｘの光を９６時間照射することにより行った。そして、各試験前後におけるＰＢ０１０−２の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量、マイクロフローイメージング法によって測定される不溶性微粒子数、及びＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される蛍光強度、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法によって測定される抗原結合活性に基づいて評価した。なお、ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びマイクロフローイメージング法は実験３−３の方法に準じて測定した。蛍光強度については、検出されたメインピークの蛍光強度を下記の式に当てはめる事により、評価した。
Figure 2020075746
［ＥＬＩＳＡ法］
ｈＭＵＣ−１（ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ社）抗原を０．８ｎＭ含むリン酸緩衝液をアッセイプレートに添加し２−８℃で１８時間処理した後、２０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社）及び０．０５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて、抗原を固定した。ＰＢ０１０−２溶液を０−１０００００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ及び０．０５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳで段階希釈し、抗原が固定されたプレート上に添加した。プレートを２５℃６０分インキュベートしたのち、４０００倍に希釈されたｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）をプレートに添加した。プレートを２５℃６０分インキュベートした後、ウォッシュを３回実施した。プレートに１００ μＬ ＴＭＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｄａｋｏ社）を添加後、２５℃２０分インキュベートし、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加することで反応を停止させた。その後、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ １９０ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて４５０ｎｍのＵＶ吸収を評価することで、結合活性を評価した。なお、ＰＢ０１０−２標準品の活性を１００％とし、相対結合活性として算出した。
結果を表３２〜３５に示す。
ポリソルベート８０を添加した処方において、熱安定性試験及び光暴露試験後の不溶性微粒子の増加が抑制されたことから、非イオン性界面活性剤として０．０５ｗ／ｖ％ポリソルベート８０を用いることが特に好ましいことが判明した。また、クエン酸を添加した処方では、リン酸を添加した処方と比較して４０℃保管後の多量体増加傾向が小さいことから、緩衝剤としてクエン酸を用いることが特に好ましいことが判明した。また、いずれの処方及び保管条件においても、抗原結合活性及び蛍光強度の低下は認められなかった。
Figure 2020075746
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実験３−６：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む製剤における保管時の安定性の検討
２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸を用いてｐＨ６．８に調製した処方溶液に、ＰＢ０１０−２濃度が１０ｍｇ／ｍＬ、スクロース濃度が２８０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポリソルベート８０濃度が０．０５ｗ／ｖ％となるように添加した表３６に示す処方を調製し、０．２２μｍのフィルターで無菌ろ過し、ガラスバイアル（３ｍＬ容量）に１．２ｍＬずつ充填した。試料は凍結乾燥を行い、ゴム栓で打栓後、アルミニウムキャップを被せ巻き締めた。その後，熱安定性試験後又は光暴露試験後におけるＰＢ０１０−２の安定性を評価した。
Figure 2020075746
熱安定性試験は、試料を４０℃で２週間、正置状態で保管することで行った。光暴露試験は、試料を横置状態で保管し、白色蛍光ランプを用いて１０００ｌｘの光を９６時間照射することにより行った。そして、各試験前後におけるＰＢ０１０−２の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣ法によって測定される多量体量及び蛍光強度と，ＲＰ−ＨＰＬＣ法によって測定されるＤｙｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏに基づいて評価した。なお、ＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＲＰ−ＨＰＬＣ法は実験３−３に準じて測定した。また、蛍光強度の評価は実験３−５と同様にして測定した。
結果を表３７〜３９に示すが、上記処方とすることで、４０℃２週間保管後においても、光暴露後においても、ＰＢ０１０−２が安定に維持されることが示された。
Figure 2020075746
Figure 2020075746
Figure 2020075746
配列番号１：ＰＢ００９−１ Ｆａｂ重鎖フラグメントをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号２：ＰＢ００９−１ Ｆａｂ重鎖フラグメントのアミノ酸配列
配列番号３：ＰＢ００９−１ Ｆａｂ軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号４：ＰＢ００９−１ Ｆａｂ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号５：Ｐ１０−１ Ｆａｂ重鎖フラグメントをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号６：Ｐ１０−１ Ｆａｂ重鎖フラグメントのアミノ酸配列
配列番号７：Ｐ１０−２ Ｆａｂ重鎖フラグメントをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号８：Ｐ１０−２ Ｆａｂ重鎖フラグメントのアミノ酸配列
配列番号９：Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂ軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１０：Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｐ１０−１ Ｆａｂ重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１２：Ｐ１０−１ Ｆａｂ重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｐ１０−２ Ｆａｂ重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１４：Ｐ１０−２ Ｆａｂ重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１６：Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂ軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７：ＰＢ００９−１ Ｆａｂ、Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂのための重鎖シグナル配列
配列番号１８：ＰＢ００９−１ Ｆａｂ、Ｐ１０−１ Ｆａｂ及びＰ１０−２ Ｆａｂのための軽鎖シグナル配列
配列番号１９：ＭＵＣ１の細胞外ドメインのタンデムリピート配列

Claims (20)

  1. 標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体、緩衝剤、安定化剤、及び非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨが６．５〜７．５である医薬組成物であって、
    緩衝剤が、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含むものであり、
    安定化剤が、スクロース、又はグリセリンを含むものである、前記医薬組成物。
  2. 抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、
    からなる群より選択される１以上のものであり、
    標識部が、下式（Ｉ）：
    Figure 2020075746
     ［式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している］で示される基である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、
    からなる群より選択される１以上のものである、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
    （ｂ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
    からなる群より選択される１以上のものであり、
    標識部が、下式（Ｉ）：
    Figure 2020075746
     ［式中、波線は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している］で示される基である、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
    （ｂ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
    からなる群より選択される１以上のものである、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０を含むものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体が、さらに８９Ｚｒを含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 大腸癌又は大腸癌が転移した癌の診断に用いる、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 乳癌又は乳癌が転移した癌の診断に用いる、請求項７に記載の医薬組成物。
  10. 抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
    （ｂ）配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１２又は配列番号１４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
    からなる群より選択される１以上のものであり、
    標識部が、下式（ＩＩ）：
    Figure 2020075746
     ［式中、波線は抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表し、ここで抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｏ）の炭素原子と結合している］で示される基である、請求項１に記載の医薬組成物。
  11. 抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメントが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
    （ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；並びに、
    （ｂ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号６又は配列番号８のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
    からなる群より選択される１以上のものである、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０を含むものである、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
  13. 乳癌又は乳癌が転移した癌の診断に用いる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 術中診断薬である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 緩衝剤の濃度が、１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 安定化剤の濃度が、５〜３０ｗ／ｖ％である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 非イオン性界面活性剤の濃度が、０．０２〜０．２ｗ／ｖ％である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 溶液製剤、凍結製剤、又は凍結乾燥製剤である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. 標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む医薬組成物の製造方法であって、
    （ａ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を製造し、配合する工程、
    （ｂ）クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝剤として配合する工程、
    （ｃ）スクロース、又はグリセリンを安定化剤として配合する工程、
    （ｄ）非イオン性界面活性剤を配合する工程、及び
    （ｅ）ｐＨを６．５〜７．５に調整する工程、
    を含む、前記製造方法。
  20. 標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を安定に保存する方法であって、
    （ａ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、クエン酸、リン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝剤として配合する工程、
    （ｂ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、スクロース、又はグリセリンを安定化剤として配合する工程、
    （ｃ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液に対して、非イオン性界面活性剤を配合する工程、及び
    （ｄ）標識部−抗ヒト抗体Ｆａｂフラグメント複合体を含む溶液のｐＨを６．５〜７．５に調整する工程、
    を含む、前記方法。
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